TR201907488T4 - Besinsel ve medikal uygulamalar için bir probiyotik olarak kullanıma yönelik bakteri. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluşun bir birinci görünümü, bir kişinin immün sisteminin düzenlenmesi; bir immün bozukluğun tedavi edilmesi; bir bağırsak bozukluğunun tedavi edilmesi; bağırsak mikrobiyotasının iyileştirilmesi; bir kişinin doğuştan gelen immün sisteminin düzenlenmesi; bir kişinin adaptif immün sisteminin düzenlenmesi; bir kişideki iştahın düzenlenmesi; Treg?ler ve immün toleransın desteklenmesi; bir kişideki bağırsak sağlığının desteklenmesi; ve/veya bir kişideki immün homeostazın sürdürülmeside kullanıma yönelik olarak Roseburia hominis bakteriyel türleri ile ilgilidir. Mevcut buluşun başka görünümleri, Roseburia hominisi içeren bileşimler ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME BESINSEL VE MEDIKAL UYGULAMALAR IÇIN BIR PROBIYOTIK OLARAK KULLANIMA YÖNELIK BAKTERI BULUSUN ALT YAPISI Rahimde baslangiçta steril oldugu düsünülen insan bagirsagi, dogumdan hemen sonra anneye ve çevreye ait çok çesitli mikroplara maruz kalmaktadir. Bagirsaktaki sonraki koloni haline gelme ve yerine geçme durumlari, mikrobiyota yetiskin benzeri ve nispeten kararli olmasinin ardindan yasamin ilk yillari süresince hareketli kalir (1). Insan bagirsak mikrobiyotasi, esas olarak iki ana bakteri bölümüne, Bakteroidler ve Firmicutes, ait olan 500'den fazla farkli filotip ihtiva etmektedir (2). Insan bagirsaginin bakteriyel kolonilesmesinden kaynaklanan basarili simbiyotik› iliskiler, genis çesitlilikte metabolik, yapisal, koruyucu ve diger faydali islevler kazanmistir. Koloni haline gelmis bagirsagin artan metabolik aktiviteleri, aksi halde sindirimi zor olan beslenmeyle ilgili bilesiklerin, konak için önemli bir besin kaynagi saglayarak salinan yan ürünler ile parçalanmasini saglamaktadir. Benzer sekilde, bagirsak mikrobiyotasinin immünolojik önemi iyi bilinmekte ve ortak yasayan bakterinin (3 - 5) uygulanmasini takiben islevsel olarak yeniden olusturulan bozulmus bir bagisiklik sistemine sahip mikropsuz hayvanlarda örneklenmektedir. Kendi basina mikrobik koloni haline getirme ile etkilenen bagirsak, IgA salgisi üretiminin tam, aksine (6, 7) T hücre gelisimi ve farklilasma, ortak yasayan özel mikroorganizmalarin koloni haline gelmesi gerektigini göstermektedir. Klostridyum türü, özellikle spor - olusturan parçalara ayrilmis ipliksi bakteri (SFB), bagirsak Thl, Th17 ve Treglerinin olgunlasmasi için önemli bir etmen olarak görünmektedir (8, 9). Son çalismalar, bununla birlikte, Bacteroides fragilis ile tek koloni haline gelme Treglerin (5, 10) genislemesinin arttirilmasi ile mikropsuz farelerde Thl/Th2 oransizligini dogrulayabilirken, artik degistirilmis Schaedler florasininkileri içeren diger bagirsak bakterisinin Treglerin yeni bastan üretilmesini tetikleyebildigini göstermistir. Mevcut bulus, bagirsaktaki metabolik aktiviteyi modüle edebilen ve / veya bagisikligi düzenleyici proseslerde bir rol oynayan diger yerlesik bagirsak bakterilerini açikliga kavusturmak için arastirmaktadir. BULUSUN AÇIKLAMASI Mevcut bulus, Firmicutes filumun bir mensubu olan bakteri türü Roseburia hominis'in aktivitesi üzerinde yogunlasmaktadir. Basvuru sahibi tarafindan yapilan çalismalar, bu bakteri türünün istah ve tokluk genleri üzerinde bir etkiye sahip olmasinin yani sira bagirsaktaki bagisikligi düzenlemede ve metabolik aktivitede önemli bir rol oynadigini göstermistir. Bu bakteri ile koloni haline getirmeye tepki veren konak genlerinin yani sira koloni haline getirmede ve mürin bagirsagina uyumda görev alan bakteri genlerinin rolleri, asagida daha detayli açiklanacaktir. Tercih edilen yapilanmalar ile birlikte bulusun durumlari ekteki istemlerde ortaya koyulmaktadir. Mevcut bulusun bir birinci görünümü, tipta kullanim için sunlara sahip bir bakteri susu ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir % NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisi. Mevcut bulusun bir baska bir görünümü, sunlara sahip olan bir bakteriyel susu içeren bir farmasötik bilesim ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99,5 168 rRNA özdesligi veya (b) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisi; ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir yardimci madde, tasiyici veya seyreltici. Mevcut bulusun bir baska bir görünümü, sunlara sahip olan bir bakteriyel susu içeren bir gida takviyesi ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99,5 168 rRNA özdesligi veya (b) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisi; ve besinsel olarak kabul edilebilir bir yardimci madde, tasiyici veya seyreltici. Mevcut bulusun bir baska bir görünümü, sunlari içeren bir probiyotik bilesim, besin maddesi, yiyecek ürünü, gida takviyesi veya yiyecek katki maddesi ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99,5 168 rRNA özdesligine sahip olan bir bakteri susu veya (b) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisi. Mevcut bulusun bir baska bir görünümü, (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99,5 168 rRNA özdesligine sahip olan bir bakteri susu veya (b) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisini içeren bir farmasötik bilesim veya bir gida takviyesi ile ilgilidir, bahsedilen süreç, bakteriyel sus ile farmasötik olarak kabul edilebilir bir yardimci madde, tasiyici veya seyreltici veya bir besinsel olarak kabul edilebilir yardimci madde, tasiyici veya seyrelticinin karistirilmasini BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Mevcut bulusun bir görünümü, asagidakilerin biri veya daha fazlasinda kullanima yönelik olarak sunlara sahip bir bakteri susu ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99,5 NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir - bir bagisiklik rahatsizliginin tedavisinde; - bir denegin dogustan gelen bagisiklik sistemini düzenlemede; ° bir denegin uyarlamali bagisiklik sistemini düzenlemede; ° Tregleri ve bagisiklik toleransini arttirmada; - bir denegin istahini düzenlemede; - bir denekteki bagirsak sagligini arttirmada ve / veya - bir denekteki bagisiklik homeostazisini korumada. Roseburia hominis Roseburia hominis, Firmicutes filumun içindeki filogenetik öbek XIVa'nin son zamanlarda açiklanmis bir ortak yasani bagirsak anaerobu, insan bagirsaginda bir dominant gruba aittir ve ayrica bir majör bütrat üreticisidir (ll). Mevcut basvuru sahibi bu bakteri için tam genom. sekansini ve ek açiklamayi açikliga kavusturmustur. Daha ileri çalismalar, R. hominis ile tek - koloni haline getirilmis mikropsuz farelerde hem bakteriyel hem de konak transkriptom tepkilerini kesfetmistir. Kolonilesmeye ve mürin bagirsagina uyum saglamaya katilan bakteriyel genlerin rolleri, buna ek olarak bu bakteri ile koloni haline gelmeye tepki veren konak genleri burada açiklanmaktadir. Basvuru sahibi tarafindan yapilan deneyler, Roseburia hominis'in aktivitesinin çok yüksek oranda spesifik oldugunu göstermistir. Çalismalar, Roseburia türünün önemli genomlarinin çok farkli oldugunu, çesitli fonksiyonellikleri belirttigini göstermistir. Aslinda, deneyler Roseburia intestinalis, Roseburia hominis ve Eubacterium rectale (bunlarin tamami bütrat üreticileridir) içeren Clostridium Kümesi XIVa'dan bakteri sasirtici sekilde bagirsak hücreleri üzerinde çok farkli ve ayri etkileri tetikler. Tercih edilen bir yapilanmada, bakteri türleri NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Ingiltere, AB21 9YA'da (21 Ekim 2004) Sinai, Gida› ve Deniz Bakterilerinin Ulusal Koleksiyonlarinda (NCIMB) Budapeste Anlasmasi'nin sartlari altinda Aberdeen Üniversitesi, Beslenme ve Saglik Rowett Arastirma Enstitüsü'nün (Greenburn Road, Aberdeen, AB21 9SB, Scotland, Ingiltere) adina NCIMB 14029T Roseburia hominis A2-l83T (DSM = 16839T) adi altinda saklanan Bakteri türü, tercihen Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T. B., & Flint, H. J. (2006) Int. J. Roseburia hoministir. Tercih edilen bir yapilanmada, bakteri türü yasayan bir bakteri popülasyonu, bir liyofilize bakteri popülasyonu, bir cansiz bakteri popülasyonu ya da bunlarin hücresel bilesikleri biçimindedir. Tercihen, bakteri türünün cansiz bir bakteri preparati biçiminde oldugu durumda, bu isi ile öldürülen bakteri, radyasyona maruz kalmis bakteri ve çözünmüs bakteriden seçilmektedir. Tercih edilen bir yapilanmada, bakteri türü yasayan bakteri veya bunun hücresel bilesenleri biçimindedir. Tercih edilen bir yapilanmada, bakteri türü izole edilmis biçimdedir. Burada kullanildigi gibi "izole edilmis" terimi bunun kendi dogal ortamindan izole edilmesi anlamina gelmektedir. Tercih edilen bir yapilanmada, bakteri türü biyolojik olarak saf yapidadir. Burada kullanildigi gibi "biyolojik olarak saf" terimi bir laboratuvar kültürünü ifade etmekte olup, bu büyük ölçüde organizmanin diger türleri bakimindan serbesttir. Tercihen bakteri türü, organizmanin bir tek türüne ait bir kültürün yapisindadir. Bulus ayrica burada açiklanan bakteri türünün mutantlarinin ya da suslarin kullanimini da kapsamaktadir. Burada kullanildigi gibi "mutant" terimi, referans olarak alinmis bir susun polinükleotid sekansi ile en az 6 96 benzerlige, daha çok tercihen % 98 benzerlige sahip türetilmis bakteri suslari içermekte, ancak. aksi durumda. bakteriye ait genomdaki diger sekanslarda mutasyonlar içermektedir. Mutantlar, bulusun suslarinin genetik malzemesinin degisimi anlamina gelen genetik isleme teknikleri ile elde edilebilmektedir. Tipik olarak, bu tip mutant suslarin elde edilmesi için teknikte uzman bir kisi, UV isima ya da mutasyona yol açan kimyasal ürünlere maruziyet gibi standart mutajenez tekniklerini kullanabilir. Burada kullanildigi gibi "mutasyonlar" terimi, silmeleri, eklemeleri, dönüsümleri ve ana sekans ile en az %95 benzerlik korunurken bir ana nükleotide veya amino asit sekansina uygulanan genetik degisimin de dahil oldugu teknikte uzman kisiler tarafindan 'bilinen diger` degisimleri ihtiva eden en azindan tek baz degisimlerini içeren dogal ya da tetiklenmis mutasyonlari içerir. Burada kullanildigi sekilde, sekans teknikler kullanilarak belirlenebilir. Örnegin, benzerlik çevrim içi benzerlik algoritmasi "BLAST" programi kullanilarak belirlenebilir (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ sitesinde halka açiktir). Bulus ayrica burada açiklanan bakteri türünün veya suslarin benzerlerinin kullanimlarini da kapsamaktadir. Burada kullanildigi gibi "homolog" terimi, ana bakteriye ait susun nükleotid sekansi ile sekans ayniliginin ya da sekans benzerliginin bir derecesine sahip bir nükleotid sekansina sahip olan bir bakteri susunu ifade etmektedir (burada sonra bir homolojiye sahip bir entiti anlamina gelmektedir. Burada Mevcut içerikte, bir homolog sekans ana bakteriye ait susun (söz konusu sekans) nükleotid sekansi ile en az % 95, % 97, % 98 ya da % 99 ayni olabilen bir nükleotid sekansini içermek üzere Homoloji karsilastirmalari göz ile ya da daha genel olarak hali hazirda mevcut olan sekans karsilastirma programlarinin yardimi ile yürütülebilmektedir. Bu piyasada bulunan bilgisayar programlari iki ya da daha fazla sekans arasindaki 6 'ce homolojiyi hesaplayabilmektedir. örnegin, bir sekans diger sekans ile hizalanir ve bir sekans içindeki her amino asit dogrudan diger sekans içinde karsilik geldigi amino asit ile karsilastirilir. Bu, bir "bosluksuz" hizalama olarak adlandirilir. Tipik olarak, bu tip bosluksuz hizalama yalnizca kalintilarin nispeten kisa bir sayisi üzerinde gerçeklestirilir. Bunun çok basit ve istikrarli bir yöntem olmasina ragmen, örnegin, sekanslarin bir baska çiftindeki bir eklemenin ya da silmenin takip eden amino asit kalintilarinin diziye katilmamasina neden olacagini, bu nedenle global bir dizilim gerçeklestirildiginde, potansiyel olarak homoloji %'sinde büyük bir azalmaya sebep oldugunu hesaba katmakta basarisiz olmaktadir. Bundan dolayi maksimum homoloji % 'sinin hesaplanmasi ilk olarak, bosluk cezalarini da dikkate alarak en uygun bir dizilimin üretimini gerektirmektedir. Bu tip bir dizilimi gerçeklestirmek için uygun bir bilgisayar programi Vektör NTI'dir (Invitrogen Corp.). Sekans karsilastirmalarini gerçeklestirebilen yazilim örnekleri, mesela BLAST paketini (bakiniz, Ausubel ve ark 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4. baski - Bölüm. 18), BLAST 2'yi (bakiniz, FEMS - 410) ve Alian'i içermekte, ancak bunlarla sinirli tutulmamaktadir. En azindan BLAST, BLAST 2 ve FASTA çevrimdisi ve çevrim içi arastirma için uygundur (bakiniz, Ausubel ve ark Tercihen, bir nükleotid sekansina göre benzerligin derecesi en az 20 sürekli nükleotid üzerinden, tercihen en az 30 sürekli nükleotid üzerinden, tercihen en az 40 sürekli nükleotid üzerinden, tercihen en az 50 sürekli nükleotid üzerinden, tercihen en az 60 sürekli nükleotid üzerinden, tercihen en az 100 sürekli nükleotid üzerinden belirlenmektedir. Tercihen, bir nükleotid sekansina göre benzerligin derece tüm sekans üzerinden belirlenebilir. Fenotipik karakteristiklere dayanarak bakterinin geleneksel tanimlanmasi genellikle, genotipik yöntemlere dayanarak tanimlama kadar dogru olmamaktadir. Bakteriye ait 168 rRNA gen sekansinin karsilastirmasi, tercih edilen bir genetik yöntem olarak ortaya çikmis ve BLAST kullanarak, bilinen bakteriye ait DNA sekanslari ile sekanslarin karsilastirilmasi ile tanimlanacak yeni suslara olanak tanimaktadir (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 168 rRNA gen sekansi bakteride genel olgudur ve böylece iliskiler birçok farkli bakteri boyunca Ölçülebilmektedir. Genelde, 168 rRNA sekansinin karsilastirmasi, türler ve alt - türler seviyesi dahil suslarin çoklu seviyelerde siniflandirilmasina ek olarak organizmalar arasinda bakterinin tüm majör filasi boyunca cins seviyesinde farklilasmaya olanak› tanimaktadir. 168 rRNA› gen sekansi çok genis sayida sus için belirlenmistir. Nükleotid sekanslarinin en genis veri bankasi GenBank, 90,000'inin üzerindekilerin 168 rRNA genleri oldugu 20 milyonun üzerinde saklanmis sekansa sahiptir. Bunun anlami, bilinmeyen bir susun sekansina karsi var olan çok önceden saklanmis sekanslarin karsilastirilabilmesidir. Burada kullanildigi gibi "168 rRNA benzerligi" terimi, bilinen bir bakteriye ait sus ile benzerlik yüzdesini ifade etmektedir. Tercih edilen bir yapilanmada, bakteri susu yukaridaki erisim numarasi altinda saklanan sus ile en az % 99.5'lik bir 168 rRNA benzerligine sahiptir. Bulus ayrica mutasyona ugramis suslari da kapsamakta olup, bunlar yukarida - bahsedilen saklanmis sustan› ve yukaridaki erisim numarasi altinda saklanan sus ile en az %95'lik bir DNA - DNA homolojisi ve/veya en az %99,5'lik bir 168 RNA benzerligi gösteren suslardan elde edilebilmektedir. Mevcut bulusun baglaminda, "DNA - DNA homolojisi", nükleotid sekansina bagli olarak DNA'larin iki ya da daha fazla ayri seritlerinin birbiri ile nasil yakindan iliskili oldugunu ifade etmektedir. Tipik olarak bu, bunlarin benzerlik % 'si ile ölçülmektedir. Tercih edilen bir yapilanmada, bakteriye ait sus yukaridaki erisim numarasi altinda saklanan sus ile en azindan Çokça tercih edilen bir yapilanmada, bakteriye ait sus yukaridaki erisim numarasi altinda saklanan sus ile en azindan benzerligine sahiptir. Terapötik Uygulamalar Mevcut bulusun bir baska görünümü, tipta kullanim için sunlara sahip bir bakteri susu ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir % NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisi. Daha özel olarak, bakteri susu, bir denekte bir enflamatuvar rahatsizlik, bir bagisiklik rahatsizligi ve bir intestinal rahatsizliktan seçilen bir rahatsizligin tedavisinde kullanmak Burada kullanildigi gibi "ilaç" terimi, insan ve hayvan hastaliklari ile ilgili ilaçta, hem insan hem de hayvansal kullanim için ilaçlari kapsamaktadir. Ek olarak, "ilaç" terimi burada kullanildigi gibi bir terapötik ve / veya yararli etki saglayan herhangi bir madde anlamina gelmektedir. "Ilaç" terimi burada kullanildigi gibi maddelerle mutlaka sinirlanmamakta olup, Pazarlama Onayi'na ihtiyaç duymakta ancak kozmetiklerde, hastaliklari önleyici ve tedavi edici özelligi olan gidalarda, yiyeceklerde (örnegin, gidalar ve içecekler dahil), probiyotik kültürlerde, besin takviyelerinde ve dogal tedavilerde kullanilabilen maddeleri içerebilir. Ek olarak, "ilaç" terimi burada kullanildigi gibi örnegin, çiftlik hayvani yemi ve / veya evcil hayvan yiyecegi gibi hayvan yemine dahil edilmesi için tasarlanan bir ürünü kapsamaktadir. Bulusun tercih edilen bir yapilanmasinda rahatsizlik, hassas bagirsak sendromu (IBS), kolit, Crohn hastaligi ve ülseratif kolit dahil enflamatuvar bagirsak rahatsizliklari (IBD), pouchitis, islevsel dispepsi, fonksiyonel kabizlik, fonksiyonel ishal (antibiyotikle iliskili ishal, gezgin ishali ve pediatrik ishal dahil), fonksiyonel karin agrisi, fonksiyonel siskinlik, Epigastrik Agri Sendromu, Tokluk Zorlugu Sendromu, gastrointestinal reflü hastaligi (GERD), diyabet, artrit, çoklu skleroz ve sedef hastaligi alerjileri gibi otoimmün hastaliklar, atopik dermatit, nekrotizan enterokolit gibi atopik hastaliklar, diger enfeksiyonlar ve bunlarin kombinasyonlarindan seçilmektedir. Özellikle tercih edilen bir yapilanmada, rahatsizlik bir inflamatuar rahatsizliktir. Tercihen pro-inflamatuar genlerin sentezlenmesi konak denekte asagi dogru düzenlenmistir. Bu çalismalarin ilave detaylari asagida sunulmaktadir. Daha çok tercihen, enflamatuvar rahatsizlik kolittir, hatta daha çok tercihen Crohn hastaligi, ülseratif kolit veya pouchitistir. Özellikle tercih edilen bir uygulamada, bagirsak rahatsizligi lBS'dir. IBS'nin kesin patofizyolojisi açikliga kavusturulmamistir. Son çalismalar, IBS hastalarindaki mukozal iltihaplanmayi ve bagirsak mikrobiyotasindaki degisimleri ve bagirsak enfeksiyonlari ile iliskili bir hastaligi açiklamistir. Özellikle tercih edilen bir uygulamada, bagirsak rahatsizligi lBS'dir. Tercihen, bariyer genlerin ekspresyonu, konak denekte arttirilir. Bu çalismalarin ilave detaylari asagida sunulmaktadir. Özellikle tercih edilen bir yapilanmada, bagirsak rahatsizligi Crohn hastaligidir. Özellikle tercih edilen bir yapilanmada, rahatsizlik bir bagisiklik rahatsizligidir. Tercihen, bu bagisiklik rahatsizligi ülseratif kolit, pouchitis, eklem iltihabi, sedef hastaligi, çoklu skleroz da dahil diger otoimmün kosullar, çölyak hastaligi, atopik dermatit ve rinitin dahil oldugu alerjilerden seçilmektedir. Bir uygulamada bakteri susu, bir denegin bagisiklik sistemini düzenlemede kullanmak içindir. Bakteri türü tarafindan bagisikligin düzenlenmesi, yüksek. oranda türe - özgü olarak bilinmektedir (8). Özellikle, Küme XlVa ve VI bakterilerinin bagisikligi düzenleyici etkisi çok karmasiktir ve bütrat üretiminden bagimsizdir (41). Tercih edilen bir yapilanmada, denegin dogustan gelen bagisiklik sistemi degistirilmektedir. Bir baska tercih edilen yapilanmada, denegin uyarlamali bagisiklik sistemi bagisiklik düzenlemesine dogru degistirilmektedir (ve bagisiklik aktivasyonu degil, bundan dolayi iltihaplanma azalir). Bulusun bir baska görünümü, bir denekteki bagirsak mikrobiyotasini gelistirmeye yönelik olan bakteri susu ile Bagirsak mikrobiyotasi, konak hayvanlarin sindirim sisteminde yasayan mikroorganizmalari ifade etmektedir. Bu mikroorganizmalar çok büyük bir çesitlilikteki metabolik, yapisal, koruyucu ve diger faydali islevleri yerine getirmektedir. Burada kullanildigi gibi "bagirsak mikrobiyotasini gelistirmek" bir konagin bagirsaginda bulunan mikroorganizmalarin sayisini ve / veya türünü arttirmayi ve / veya bunlarin metabolik, yapisal, koruyucu ve diger faydali özellikleri bakimindan bahsedilen mikroorganizmalarin aktivitesini arttirmayi ifade etmektedir. Tercihen bakteri susu, kalin bagirsagi ve/Veya ileumu, daha çok tercihen kalin bagirsagi koloni haline getirmektedir. Tercih edilen bir uygulamada, bakteri susu hareketsizlik veya kemotaksis geninden en az birinin sentezlenmesini düzenlemektedir. Daha çok tercihen, bakteri susu, hareketsizlik veya kemotaksis geninden en az birinin sentezlenmesini yukari dogru düzenlemektedir. Daha çok tercihen hala hareketsizlik veya kemotaksis geni MobA ve MobL'den seçilmektedir. Bir baska tercih edilen uygulamada, bakteri susu, FlaAl, FlaA2, Fla3 ve FlaB'den seçilen en az bir genin sentezlenmesini düzenlemektedir. FLA tipi proteinlere özgü serum antikorlari enflamatuvar bagirsak hastaliginda bulunmaktadir. Bundan dolayi, tercih edilen bir uygulamada, bakteri susu enflamatuvar bagirsak hastaligini tedavi etmede kullanmak içindir. Tercih edilen bir baska yapilanmada, bakteri susu, belirtilenlerden birinin veya daha fazlasinin sentezlenmesini düzenlemektedir: asetil-COA asetiltransferaz, 3-hidroksiasil- COA dehidrojenaz, bütril-COA dehidrojenaz, elektron transferi flavoproteini beta alt birimi ve elektron transferi Mevcut bulusun bir baska görünümü, bir denegin dogustan gelen immün sistemini regüle etmek için sunlara sahip bir bakteri susu ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99, NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisi. Burada kullanildigi gibi "dogustan gelen bagisiklik sistemi" terimi, ayrica spesifik olmayan bagisiklik sistemi olarak da bilinmekte olup, spesifik - olmayan bir sekilde diger organizmalardan kaynaklanan enfeksiyona karsi hizli savunmaya sahip konak saglayan hücreleri ve mekanizmalari içermektedir. Bu, dogustan gelen sistemin hücrelerinin jenerik bir yolda patojenleri tanimasi ve bunlara tepki göstermesi, ancak uyarlamali bagisiklik sisteminin aksine, konak için uzun süreli ya da koruyucu bagisiklik sunmamasi anlamina gelmektedir. Burada kullanildigi gibi "dogustan gelen bagisiklik sistemini düzenleme" terimi, dogustan gelen bagisiklik sisteminin aktivitesini tetikleme ve / veya bagisiklik homeostazisini arttiracak sekilde aktivitenin temel seviyesine göre aktivite seviyesini arttirma anlamina gelmektedir. Ya epitelyal bariyerin, defensinlerin, kemokinlerin ve sitokinlerin dogustan gelen bagisiklik peptitlerinin kaybindan ya da arizali TLR sinyallesmesinden kaynaklanan dogustan gelen bagisiklik fonksiyonunun kaybi ya da bozulmasi, bagirsak dahil birkaç Vücut organindaki inflamatuar hastaliklarin artan riski ile iliskilidir. Bu hastaliklar, inflamatuar bagirsak hastaligini içermektedir. Böylelikle, oldukça yüksek oranda tercih edilen bir yapilanmada, Roseburia hominis enflamatuvar bagirsak hastaliginin tedavisinde kullanmak içindir. Tercih edilen bir yapilanmada, bakteri susu, Tlr5, Tlrl, Vnnl, Defb37, PlaZg, Mucl6, ltln, Sprrla, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, DefcrZO, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 ve Tcfe2a'dan seçilen› en az bir genin sentezlenmesini düzenlemektedir. Bu genlerin bir çogu bagirsak bariyeri genleri ve antimikrobiyallerdir` ve dolayisi ile bagirsak patojenlerinin yayilabilirligini azaltmak ve ayrica yasayabilen patojenlerin sayisini azaltmak için çalismaktadir. Mevcut bulusun bir baska görünümü, bir denegin adaptif immün sistemini regüle etmek için sunlara sahip bir bakteri susu ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99, NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisi. Burada kullanildigi gibi "uyarlamali bagisiklik sistemi" terimi, aksi sekilde "spesifik bagisiklik sistemi" olarak da bilinmek de olup, yüksek oranda özellestirilmis, sistemik hücreleri ve patojenik büyümeyi ortadan kaldiran ya da önleyen prosesleri ifade etmektedir. Uyarlamali bagisiklik tepkisi, (bagisikligi üretmek için) özel patojenleri tanima ve hatirlama kabiliyetine ve patojenin karsilastirildigi her defasinda daha güçlü ataklarin çogalmasina sahip omurgali bagisiklik sistemi saglamaktadir. Burada kullanildigi gibi "uyarlamali bagisiklik sisteminin düzenlenmesi" terimi, uyarlamali bagisiklik sisteminin aktivitesini tetikleme ve / veya aktivitenin temel seviyesine göre aktivite seviyesini arttirma ile bagisiklik homeostatik mekanizmalarinin desteklenmesi anlamina gelmektedir. Tercihen, uyarlamali bagisiklik sistem, bagisiklik düzenlemesine dogru modüle edilmektedir (ve bagisiklik aktivasyonu degil, bundan dolayi iltihaplanma azalir). Uyarlamali bagisiklik sistemi ile iliskili bozukluklar ve rahatsizliklar özellikle de T hücrelerinin fonksiyonu ile iliskili olanlar, birçok inflamatuar ve otoimmün hastalik ile baglantilidir. Thl, Th2 ve Thl7 ile iliskili T hücresi tepkileri atopik, inflamatuar ve otoimmün hastaliklar ile iliskilidir. T düzenleyici (Tregler) hücre popülasyonlarini gelistiren veya arttiran terapiler, asiri Thl, Th2 ve Th17 hücre tepkileri tarafindan isleyen hastaliklarin kontrol edilmesinde önemlidir. Tercih edilen bir yapilanmada bakteri susu, kalin bagirsak veya ileumumdaki en az bir bagisiklik tepkisi genini harekete geçirmektedir. Tercih edilen bir yapilanmada bakteri susu, daha çok tercihen kalin bagirsaktaki, T hücresi düzenleme ile iliskili genlerin sentezlenmesi ile uyarlamali bagisiklik sistemini düzenlemektedir. Daha çok tercihen, bakteri susu, T düzenleyici hücreleri (Tregler) tetiklemektedir. Treg sayilarindaki bir artis, iltihaplanmayi, otoimmüniteyi ve alerjik / atopik durumlari sürdüren Thl, Thl7 ve Th2 gibi diger efektör T hücrelerinin etkileriyle savasacaktir. Dolayisiyla bakteri susunun bu özelligi, mesela Crohn hastaligi ve ülseratif kolit gibi Teff/Treg hücre dengesinin kayboldugu birçok hastaligi adreslemede faydali olabilmektedir. Özellikle tercih edilen bir yapilanmada, bakteri susu, artan kolonda Ly6g6c ve Ly6g6e'den seçilen en az bir genin sentezlenmesini yukari dogru düzenlemektedir. Ly6g6c ve Ly6g6e'nin tüketilmesi hem bagirsak hem de solunum sisteminde enfeksiyon riskini arttirmakta› ve bu tip Ibir nötropeni gibi hastaliklar ile iliskilidir. Bundan dolayi, tercih edilen bir uygulamada, bakteri susu, nötropeninin tedavi edilmesinde kullanim içindir. Mevcut bulusun bir baska görünümü, bir denekteki bagisiklik homeostazisini korumada kullanim için, sunlara sahip bir bakteri susu ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99,5 NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir homeostazisini koruma", degisen kosullara karsilik oral toleransi ya da bagisiklik istikrarini korumak için vücudun bagisiklik sisteminin kendi kendini düzenlemesini ifade etmektedir. Oral tolerans, besinlere ve saglikli bir bagirsaktaki ortak yasam bakterisine karsi normal bagisiklik tepkilerini ifade etmektedir. Bunlar, çölyak hastaliginda ve Crohn hastaligi ve ülseratif kolit gibi Inflamatuar Bagirsak Hastaliklarinda kaybolmaktadir. Bu sayede, özellikle tercih edilen bir yapilanmada, bakteri susu çölyak. hastaliginin ve Crohn hastaligi ve ülseratif kolit gibi Inflamatuar Bagirsak Hastaliklarinin tedavisinde kullanmak içindir. Mevcut bulusun bir baska görünümü, bir denegin istahini düzenlemede kullanim için, sunlara sahip bir bakteri susu ile ilgilidir: (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99, NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisi. Burada kullanildigi gibi "istahin düzenlenmesi" bir konak için yemek yeme istegini (örn., arttirma ya da azaltma) degistirme kabiliyetini ifade etmektedir. Tercihen bakteri susu, istahin bastirilmasi ile iliskili genlerin sentezlenmesini asagi dogru düzenleyerek konagin istahi üzerinde uyarici bir etki ortaya koymaktadir. Tercihen bakteri susu, Agt, Cartpt, Cck, CxcllZ ve Gcg'den seçilen en az bir genin› sentezlenmesini asagi dogru düzenlemektedir. Daha çok tercih edileni ise bakteri susunun, doygunluk hormonlari Cck ve Gcg'nin sentezlenmesini asagi dogru düzenlemesidir. Bulusa uygun bu bakteri susu ayrica profilaktik uygulamalarda kullanilabilmektedir. Profilaktik uygulamalarda, bulusa uygun olarak bakteri türü ya da kompozisyonlari, bir hastaligin gelisme riskini en azindan kismi olarak azaltmak için yeterli olan bir miktarda özel bir hastaliga karsi direnci olmayan ya da bunun riskini tasiyan bir hastaya uygulanmaktadir. Bu tip bir miktar "bir profilaktik etkili doz" olarak tanimlanmaktadir. Kesin miktarlar hastanin saglik durumu ve agirligi gibi bir grup hastaya özgü faktörlere baglidir. Mevcut bulus artik asagidaki sekiller araciligi ile açiklanmakta olup, bunlar: Sekil 1, artan kolondaki. R. hominisin, miktarini. ve konumunu göstermektedir. (A) R. hominis koloni hali getirilmis fare artan kolonu, A2-l83 FISH incelemesi kullanilarak konak epitelyumu ile bakterinin yakin iliskisini göstermektedir. Orijinal büyütme X630. (B) Herhangi bir bakterinin varligi için GF hayvanlarinin diskilari negatif iken, PCR kullanarak R. hominis'e özgü primerler, diskiya ait DNA'da güçlü bir pozitif sinyal göstermistir. (C) Gerçek zamanli PCR. analizi, R. hominis/mg diskinin koloni haline getirme seviyelerini göstermektedir. Sekil 2, R. hominis genomunun sekansini ve ek açiklamasini göstermektedir. (A) Primerler tarafindan hedeflenen bölgelerde belirtilen PCR deneylerinin konumu ile R. hominis dairesel genom haritasi. Genom haritasindaki izler, distaki iz O'dan baslayarak: iz 0 - (mavi) numaralandirilmis tik isaretleri ile gösterilen Gerçek - zamanli PCT deneyleri; iz 1 - (soluk mavi) Sonraki CDS; iz 2 - (soluk mavi) Ters CDS; iz 3 - (mavi) rRNA; iz 4 - (yesil) tRNA; iz 5 - (kirmizi) Gerçek - zamanli PCR tarafindan hedeflenen STS eslestirme bölgeleri; garif l - GC içerigi; grafik 2 - GC egilimi. (B) R. hominis genomunun islevsel kisa açiklamasi. Sekil 3, kolonizasyondan ve fare bagirsagina adaptasyondan sonra R. hominis'te farklilasmis olarak eksprese edilen transkriptleri tanimlar. (A) Bakteriye ait RNA fare kör bagirsaginin içeriklerinden izole edilmis, cDNA sentezi süresince ya dCTP- Cy3 ya da dCTP-Cy5 ile etiketlenmis ve bir boya degisimine katilarak mikrodizi lamelleri halinde hibritlenmistir; Veri, katli degisim 2 ve P<0,05 oldugunda büyük olarak degerlendirilmistir. 50 farkli sekilde eksprese edilmis gen (in Vivo veya in vitro), mikrodizi analizi ile açiga çikarilmistir. (B) Konjügasyon/mobilizasyon transferinde rol alan genlerin gerçek zamanli PCR validasyonu. (C) Motilite ve Kemotakside yer alan genlerin gerçek zamanli PCR validasyonu. (D) 14d'de afinite ile saflastirilmis Fla2 antikoru ile immüno lekelenmis yükselen bagirsak içeriginin Western blotlamasi (serit 1: merdiven, seritler 2-6: hayvanlar l-5'in bagirsak içerigi, seritler 7-8: bos, seritler 9-10: R. hominis biyokütlesi (pozitif kontrol)). R. hominis'in kamçilarini (siyah oklar) ve (E) butirat metabolizmasinda yer alan genlerin gerçek zamanli PCR validasyonunu gösteren resim. (F) R. hominis transkriptlerinin insan intestinal epitel hücrelerine in vitro maruz birakilmasi sirasinda gerçek zamanli PCR analizi. Gerçek - zamanli PCR sonuçlari üç kopyanin (*P<0,05, **P<0,0l, *** P<0,00l) ortalamasidir. Sekil 4, R. hominis ile mono-birlesmeden sonra siçangil bagirsaginda farklilasmis olarak eksprese edilen transkriptleri tanimlar. (A) GF'ye göre R. hominis ile kolonilestirilmis farelere eksprese edilmis genlerin affimetriks mikrodizi analizi. Çubuk grafikler, 14 ve 28 gün sonra eksprese edilen yüksek ve düsük gen sayisini temsil eder. (B) 14 ve 28'inci günlerde GF ve R. hominis ile kolonize fareler arasinda fonksiyonel öneme sahip diferansiyel olarak eksprese edilmis genlerden üretilen isi haritasi. Sütunlar, bireysel dizileri temsil eder ve ilgili spesifik genleri siralar. Z - skoru standart sapmalarda ortalamadan uzak sekilde mesafenin bir ölçümünü göstermektedir. Her gen için göreceli deger, renk yogunluguyla gösterilir; yesil, daha yüksek ekspresyonu ve kirmizi daha düsük ekspresyonu gösterir. (C) R. Hominis ile kolonize edilmis ve GF fareleri arasinda Önemli ölçüde farkli oldugu gösterilen genlerin gerçek zamanli PCR validasyonu. Gerçek - zamanli PCR sonuçlari üç kopyanin (*P<0,05, **P<0,0l, Sekil 5, kalin bagirsaktaki T hücresi isaretçilerinin sentezlenmesini ve konumunu göstermektedir. GF farelerinin ve R. hominis ile tedavi edilmis farelerdeki lamina propria içindeki immünofloresan ve anti-Ly6G (A), anti-CD3 (B) ve anti-CDllb (C) ile etiketlenmis lamina propria hücrelerinin analizi. *P < 0,05. Sekil 6, kolitin bir deneysel modelinde R. hominisin iltihaplanmayi - önleyici etkilerini göstermektedir. IL-lOKO fareleri 14 hafta boyunca bir haftada üç defa dozlanmistir. (A) Tedavi edilmemis IL-lOKO fareleri yabani tip fareler ile karsilastirildiginda, farkli gen sentezlenmesi R. hominis ile tedavi edilen hayvanlarin tüm genlerin güçlü sekilde yükselmesine sahiptir. Gerçek i zamanli PCR sonuçlari üç kopyanin (*P<0,05, **P<0,0l, *** P<0,001) ortalamasidir. (B) Çalismanin sonunda tedavi edilmemis IL-lOKO ve R. hominis ile tedavi edilmis IL-lOKO hayvanlarinin vücut agirliklari. (C) IL- lOKO'nun ve R. hominis ile tedavi edilmis IL- IOKO hayvanlarinin yükselen kolonu (hematoksilin/eozin lekeli). Orijinal büyütme Sekil 7, IL-lO, IL-l7 ve IFN-v'nin mRNA seviyelerinin gerçek zamanli PCR analizini göstermektedir. T hücresi markörlerinin ölçümü için yükselen kolon dokusu üzerinde gerçek zamanli PCR yapilmistir. Gerçek - zamanli PCR sonuçlari, üç kopyanin ortalamasidir, *P<0.0S, **P<0.0l. Sekil 8, vücut agirligi kompozisyonu üzerinde R. hominise sahip GF farelerinin tekli - iliskisinin etkilerini göstermektedir. Kuru vücut agirligi ve lipid ceset analizi gerçeklestirilmistir. (A) R. hominis ile iliskili farelerin kuru ceset agirliklari, GF hayvanlari ile karsilastirildiginda büyük ölçüde daha agirdir. (B) Daha sonra ceset sivi analizi, toplam yagliligin R. hominis ile tedavi edilen hayvanlarda l4'üncü günde büyük ölçüde daha da yüksek oldugunu göstermistir. Sekil 9, Küme XIVa'dan bakterilerin (Firmucute'lar) üç susu için yani Roseburia hominis, E.rectale ve Roseburia intestinalis için gen sentezleme verilerinin bir karsilastirmasini göstermektedir. Sekil 10, diger bakteri suslari hiçbir etkiye sahip degilken, Roseburia hominis'in AZO'yi, tesirli anti-enflamatuvar aktivite ile NF-KB sinyallemesinin negatif bir düzenleyicisini tetikledigini göstermektedir. Roseburia hominis'in (R. hominisin FLAl'i) kamçi parçasi ayrica iliskili bir bakteri, Eubacterium rectale'ninkinin aksine A20'yi uyarir. Daha detayli olarak, Sekil 10 kontrollerle iliskili E.rectale, R. hominis, E rectale'nin FLA'si, R. hominisin FLAl'i, EAV9, SV1400'ün FLA'si için A20'nin katli indüksiyonunu göstermektedir. Sekil 11, RAST ile belirlendigi gibi her alt kategorideki genlerin sayisini. ve fonksiyonel alt sistemleri gösteren 1& Hominis A2 - 183 için Alt Sistem Kategori Dagilimini göstermektedir. Sekil 12, RAST ile belirlendigi gibi her alt kategorideki genlerin sayisini ve fonksiyonel alt sistemleri gösteren 1& inulinivorans DSM 16841 A2 -183 için Alt Sistem Kategori Dagilimini göstermektedir. Sekil 13, RAST ile belirlendigi gibi her alt kategorideki genlerin sayisini ve fonksiyonel alt sistemleri gösteren EL intestinalis L1-82 için Alt Sistem Kategori Dagilimini göstermektedir. Sekil 14, RAST ile belirlendigi gibi her alt kategorideki genlerin sayisini ve fonksiyonel alt sistemleri gösteren R. intestinalis MSO/l için Alt Sistem Kategori Dagilimini göstermektedir. Sekil 15, RAST ile belirlendigi gibi her alt kategorideki genlerin sayisini ve fonksiyonel alt sistemleri gösteren Eubacterium rectale ATCC 33656 için Alt Sistem Kategori Dagilimini göstermektedir. R. hominis tercihen kolonu koloni haline getirir Saglikli yetiskin C3H/HeN mikropsuz (GF) fareler birbirini izleyen günlerde R. hominisin üç beslemesi ile asilanmistir. Basarili koloni haline getirmeye, oksijen maruziyetinden bakteriyi korumak için % 3 askorbik asit ve % 2 sistein ihtiva eden bir asilama ortami kullanilarak ulasilmistir. Bagirsak dokusunun yerinde hibridizasyon floresan (FISH) ile analizi R. hominisin. heni ileumda heni de kalin. bagirsakta. koloni haline geldigini, ancak. kalin bagirsakta çok. daha yüksek. sayilarda bulundugunu açiklamistir. Bakteri ayrica kalin bagirsak mukozasi ile çok yakindan iliskili bulunmustur (Sekil 1A). Koloni haline getirme ayrica dogrulanmis ve 1 x10lo bakteri/g diskiya yaklasan sayilarla R. hominise özgü primerler kullanarak PCR ile kantifiye edilmistir (Sekil lB ve lC). GF hayvanlarinin diskilari herhangi bir bakterinin varligi için negatif test edilmistir. R. hominis genomu, konak etkilesimlerini destekleyen özgün genleri ortaya çikarmaktadir R. hominis A2 i 183'ün tam genom sekansi açiklanmis (Sekil 2A) olup, tek bir 3,592,125 - bp kromozomu ile temsil edilmektedir (Sekil 2B). Genomun otomatik ve manuel bilgi notu RAST platformu kullanarak, dört ribozomal kalitin, 66 RNA'nin ve 3,273 ön görülmüs proteinin varligini ortaya çikarmistir. Genlerin en genis grubu, Alt Sistem Kategorisi Karbonhidratlari'na (271 gen) ait olmus, kodlayan. proteinler karbonhidrat metabolizmasinda ihtiva edilmis, bunu Protein Metabolizmasi (197) ve Amino asitler ve Türevleri (175) (Sekil 2B) izlemistir. Diger önemli kategoriler, Hareketlilik ve Kemotaksi (49) ve Uyusukluk ve Sporlanma'yi (12) içermistir. Karsilastirmali genomla ilgili analiz, toplam bakteriye ait genomlar arasinda genomik yapi ve fonksiyon bakimindan en yakin iliskinin Eubacterium rectale (12) oldugunu tespit etmis, bu da bu organizmalarin yakin cinse göre tasniflenmis iliskiyi sasirtici olmayan bir sekilde vermistir (11, 13). 1,095 gen ile bu iki genomun karsilastirmali yeniden yapilandirilmasi, bunlarin genlerin yaklasik % 25'i ile farklilastirildigini ortaya çikarmistir. Özellikle bu farkliliklar, konak ile etkilesim. için önemli fonksiyonlari kodlayan genleri kapsamistir. Örnegin, kamçili bazal-vücut rot proteini FlgC, kamçili kanca-bazal vücut kompleks proteini FliE, kamçi protein FlaB ve kamçili motor anahtar proteini FliG R. hominis için özelken, tip IV fimbrial düzenegi proteinleri PilB ve PilC'yi kodlayan Hareketlilik ve Kemotaksi genleri E. rectale'de bulunmus, ancak R. hominis içinde bulunmamistir. Bakteriye ait iki genom ayrica 42 karbonhidrat geni tarafindan farklilasmis, bunlarin farkli besinsel gereksinimlerini yansitmistir. R. hominis hareketlilik ve kemotaksi genlerini yukari dogru - düzenleyerek bagirsak ortamina tepki vermektedir Konak ve beslenme ile iliskiye cevaben R. hominis tarafindan farkli olarak sentezlenmis genleri belirlemek için bir mikro dizi küçük - ara sokma - boyutlu siralama kütüphanesinden 6,000 PCR fragmani kullanarak yapilandirilmistir. Sonrasinda Gerçek zamanli PCR dogrulamasi, Sekil 2B'de gösterildigi gibi R. hominis genomunun spesifik bölgelerindeki kümelenen farkli olarak sentezlenmis 42gen üzerinde gerçeklestirilmistir. Bagirsak çevresinin ve diyet bilesenlerinin etkilerini ayirt etmek için bakteriyel RNA, dört farkli deney kosulundan izole edilmistir: (i) canli içinde, tek iliskilendirilmis farelerin kör bagirsagindan; (ii) canli disinda, kültür ortaminda büyütülen bakteriden; (iii) canli disinda, besin bilesiklerinin varliginda büyütülen bakteriden ve (iv) birlesen Caco-2 ve HT- 29 hücrelerinin yüzeyi üzerinde enkübe edilen bakteriden. Farkli olarak sentezlenmis elli gen, tanimlanmistir (canli içinde karsi canli disinda) (Sekil 3A). En sasirtici kesif, konjugasyon / hareketliligin transferinde, mobA- ve mobL- benzeri genler, ihtiva edilen genlerin canli içinde oldukça yüksek bir yukari dogru düzenlemesi olmustur (Sekil BB). Transkripsiyonel çalismalarda bu tip genlerin varligi, Alt Sistem Kategori özelliginde Fajlar, Profajlar, Dönüstürülebilir Elemanlar ve Plazmidlere atanmis tanimlayici genler olmadigi için sasirtici olmustur. Gen tespitindeki ve paylastirmasindaki bu fark benzer sekilde Alt Sistem Kategorisi ek açiklamasinin bilinen sinirlarindan kaynaklanmaktadir. Besinsel bilesiklerin uyarici etkisi daha az telaffuz edilmis, bagirsak çevresinin kendi basina yatay gen transferinde ihtiva edilen genlerin büyük bir uyaricisi oldugu öne sürülmüstür. Diger bagirsak - uyarimli alt sistemler Membran Naklini, özellikle nagnezyum naklini ve çok sayida metil- kabul eden kemotaksi proteinlerini ve kamçili kalitinin genlerini içeren Hareketlilik ve Kemotaksi'yi içermistir (Sekil 3C). R. hominis, çok sayida kamçi geni flaAl, flaAZ, flaA3 ve flaB'yi elinde tutmakta ve ilginç bir sekilde R. hominise özgü kamçi antikorlari kullanarak canli içinde koloni haline gelmis farelerden izole edilmis bakterinin western - blot teknigi tarafindan gösterildigi gibi bu bakteride kamçi sentezlenmesini destekleyen fare bagirsak ortaminda büyümüstür (Sekil 3D). Bu, Firmicute'lerin yalnizca belirli alt gruplarinin canli içinde flagella ürettigini belirten önceki raporlar ile uyumludur (14). Sasirtici olmayan sekilde, bagirsak ortamindaki R. hominis içinde katabolik netabolizma genlerinin sentezlenmesi en çok besinsel bilesikler tarafindan etkilenmistir (Sekil BE). Ihtiva edilen genler, asetil - CoA asetiltransferaz, 3 - hidroksiasil - CoA dehidrojenaz, bütril - CoA dehidrojenaz ve fosfoenolpiruvat karboksikinaz [ATP] içermistir- Bu genlerin düzenlenmesi, en çok beslenmeyle - çalismasina ragmen, en son örnekleme noktasinda konak etkisi de görülmüstür. Beklenmedik bir sekilde konak ortami, mukozal proteoglikanlarin karbonhidrat zincirlerinde yaygin olan glikuronat gibi konak - türevi maddelerin metabolizmasina katarak bazi genleri asagi - dogru düzenlemistir. Ayrica R. hominis transkriptomu üzerindeki konak uyumunun etkilerini kesfetmek için insan intestinal epitel hücrelerinin (Caco-2 ve HT-29) canli disinda uyarilmasi gerçeklestirilmistir. Bu, fare bagirsagina uyum ile uyarilan konjugasyon/hareketlilik transfer geni mobA/mobL proteinl'in ayrica her iki hücre dizisinde arttirilmis oldugunu göstermistir (Sekil 3F). Canli içi verisi ile uyumlu olan kamçi geni MotA, Caco-2 hücreleri içinde yukari dogru düzenlenmistir. Bütrat metabolizmasinda ihtiva edilen genler, iki hücre dizisi arasindaki farkliliklari Caco - 2 hücrelerinde görülen asagi dogru düzenleme ve HT - 29 hücrelerindeki yukari dogru düzenleme ile göstermistir. R. hominis T hücre yollarini, en çok da kalin bagirsaktakileri etkilemektedir GF farelerinin R. hominis ile kolonilesmesi, en yüksek kalin bagirsakta olan artan bagirsak geni sentezlemesi ile iliskili olmustur. (Sekil 4A). Ayrimsal sentezleme, en siddetli kolonilesmenin ardindan 159 genin yukari dogru düzenlenmesi ve 143 genin asagi dogru düzenlenmesi ile 28. günde olmustur. Ileumda farkli olarak sentezlenen genlerin sayisi 14. günde 79 genin yukari dogru düzenlenmesi ve 119 genin asagi dogru düzenlenmesi ile artan kolona benzer olmustur. Ileumda ayrimsal sentezleme 28. günde çok düsük, azalan kolonilesme seviyeleri ile uyumlu olmustur. Transkriptomik tepki, isi haritasi analizi ile önemli transkriptlerin açikça ayrilmasi ile gösterildigi gibi iki zaman - noktasinda farklilasmistir (Sekil 4B). Affymetrix verisinin pozitif Gerçek - zamanli PCR onayi Sekil 4C'de gösterilmektedir. Yollarin büyüklügü 14. günde ileumda etkilenmis ve artan kolon hücre farklilasmasi, hücre döngüsü düzenleme ve doku yeniden modelleme kategorilerine gruplanmistir. Önemli sekilde, bagisiklik tepkisi artan kolonda 28. günde uyarilmis en önemli yol grubu olmustur. Bu kategorideki 36 önemli etkilenmis yol en çok T hücre fonksiyonunda ihtiva edilmis ve IL - 10 sinyallesme yolunu, T - yardimci hücresinde ICOS yolunu ve T hücre fonksiyonunun CTLA - 4 tarafindan düzenlenmesini içermistir. Bu yollarda ihtiva edilen genler, hem yukari dogru düzenleme hem de asagi dogru. düzenleme göstermistir, böylelikle bu yollar R. hominis'in varligi ile önemli ölçüde etkilenmisken, T hücre farklilasmasi üzerindeki kesin net fonksiyonel etkiler ayrica arastirmayi gerektirmektedir. Bununla birlikte, artmis IL-lO, CD38 ve IL-l3 ve IFN-y'nin degismis sentezi gerçek zamanli PCR (Sekil 7) tarafindan kabul edilmis, R. hominis kolonilesmesinin Treg ve Th2 hücre farklilastirma yollarini destekleyebildigi öne sürülmüstür. Gen Ontoloji analizi farkli sekilde düzenlenmis genlerin fonksiyonel siniflandirmasi üzerindeki ek bilgiyi elde etmek için uygulanmistir. Capg, Cdc42ep5 ve Rhoc) R. hominis kolonilestirilmis farelerdeki kolonda 28'inci günde yukari dogru düzenlenmistir (Sekil 8). Bagisiklik sinapsindaki aktin polimerizasyonu T hücre aktivasyonu ve efektör fonksiyonu için gereklidir. Gen uyarimi ayrica Gerçek - zamanli PCR tarafindan onaylanmistir (Sekil 4C). Genel olarak, bu veri R. hominisin, T hücresi düzenlemesini pozitif olarak etkileyerek kalin bagirsaktaki uyarlamali bagisiklik tepkisini aktif olarak etkiledigini belirtmektedir. Bu sonuçlar ile iliskili, artan kolondaki Ly6 ailesi üyelerinin uyarilmasi olmustur. Özellikle, Ly6g6c'nin GPI ankrajli gen ürünü, 25 kat yukari regüle edilmis ve ilgili gen Ly6g6e, 28'inci günde iki kat yukari regüle edilmistir. Çogu hematopoetik hücre, nötrofiller ve plazmasitoid dendritik hücreler dahil olmak üzere, Ly6 ailesinin bir veya daha fazla üyesini eksprese eder. Dahasi, T hücre aktivasyonunda, farklilasmasinda ve olgunlasmasinda Ly6'nin olasi bir rolü önerilmistir (l5). Immünositokimya, R. hominis-kolonilesmis farelerdeki Ly6Gh CDllb*'ve CD3+ hücrelerinin artan varligini kabul etmistir (Sekil ). Temel olarak Treg tepkileri tarafindan yön verilen T hücre yollarini gösteren veriye uygun olarak, R. hominis ile asilanmis farelerin kolonundaki çift-pozitif CD3+ FoxP3+ T hücrelerinde istatistiksel olarak önemli bir artis olmustur. Açikçasi, tek bir bakteri türü olarak R. hominisin kolonilesmesi, özellikle bu farelerin kalin bagirsagindaki CD3+ FoxP3+ hücrelerinin bir popülasyonunda önemli bir artisi tetiklemistir. R. hominis dogustan gelen bagisiklik tepkisi genlerini hem ileumda hem de kalin bagirsakta degistirir ve IL10KO farelerinde koliti hafifletir Dogustan gelen bagisiklikta ve bagirsak bariyeri islevi yükselen kolonda büyük ölçüde R. hominisin varligi ile uyarilmistir. GO- prosesi "dogustan gelen bagisiklik tepkisi" (GO: 0045087) yukariya dogru düzenlenmis ve TLR ile iliskili genler Tlr5, Tlrl ve Vnnl'i içermistir. Tlr5'in yukari dogru düzenlenmesi, ilginç olmus, özellikle kamçili genlerinin uygun uyarimini ve R. hominis'deki kamçi proteininin varliginda bagirsak kolonilesmesi süresince verilmistir ve bu dogustan gelen sinyallesme yolu için diger dogustan gelen ve uyarlamali bagisiklik tepkilerine aracilik etmede bir rol anlamina gelebilir. TLR5 sinyallesmesi ve CD4+ T hücre tepkileri son zamanlarda kamçili patojenler için gösterilmektedir (16). Benzer sekilde, Bacteroides fragilis'in koloni haline getirilmesini, Treg yayilimini ve bagisiklik homeostazisini kolaylastirmada TLR2'nin rolü gösterilmistir (17). R. hominis tarafindan kalin bagirsakta etkilenmis diger dogustan gelen bagisiklik genleri antimikrobiyal peptitler Defb37, Pla2g3, Mucl6 ve Itln'yi ve bagirsak bariyer fonksiyonu genleri Sprrla, Cldn4, Pmp22, Crb3 ve Magi3'ü içermistir. R. hominise karsi ileumda yukari düzenleme gösteren dogustan gelen bagisiklik genleri Defcr20, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 ve Tcfe2a içermistir. Ilginç bir sekilde, Pcng negatif olarak farkli sitokinlerin, kemokinlerin ve kemokin reseptörlerinin sentezlenmesini düzenlemekte ve bu ortak yasam bakterisine cevaben bagirsak dokusundaki enflamatuvar tepkileri kontrol etmede önemli bir rol oynayabilmektedir. Ilginç bir sekilde, B. thetaiotaomicron (19) gibi bu enflamatuvar kaskadi asagi dogru düzenleyerek bagisiklik homeostazisine katkida bulunabilen R. hominis tarafindan NF-KB yolunun (GO: 0043124) negatif düzenlemesini göstermistik. üzerindeki pozitif etkilerin yani sira enflamatuvar yollarin kontrolünden kaynaklanan R. hominisin terapötik etkisini test etmek için kullanilmistir. Fareler, 14 haftalik bir periyot süresince 20 günde sütten kesilmeden itibaren bir haftada üç defa dozlanmistir (~50 ul, 10NCFU). Proinflamatuar biyoisaretçilerin bir paneline ait gen sentezi, tedavi edilmemis uyarilmasina sahip yabani tipte fareler ile karsilastirildiginda arastirilan tüm genlerin güçlü yükselmeye sahip oldugunu göstermistir (Sekil 6A). Pro-enflamatuvar gen uyarilmasi tedavi edilmemis fareler ile karsilastirildiginda R- hominis ile tedavi edilmis olanlarda büyük ölçüde daha düsüktür. R. hominis ile tedavi edilmis hayvanlarin vücut agirliklari ayrica tedavi edilmemis hayvanlar ile karsilastirildiginda çalismanin sonunda daha agirdir ve bu etki istatistiksel olarak erkeklerde daha büyüktür (Sekil 6B). Nihai olarak, histolojik analiz, TR. hominis ile tedavi edilmis hayvanlar nispeten saglikli görünen kolonik bir mukozaya sahipken, tedavi edilmemis IL-lOKO'nun yükselen kolonunda siddetli iltihaplanmanin varligini göstermistir. R. hominis kolonilesmesi tokluk genlerini ve vücut kompozisyonunu etkilemektedir Tek-baglantili farelerde R. hominisin önemli metabolik etkileri, ayrica asikardir. GO-prosesleri "besine karsi tepkinin negatif düzenlemesi" (GO: 0032096), "istahin negatif düzenlemesi" (GO: 0032099) ve "katekolamin salgilanmasinin düzenlenmesi" (GO: 0050433) R. hominis ile kolonilesmenin ardindan yükselen kolonda tamamen asagi düzenlenmistir. Bu veriler, R. hominis'in, konakçi istahi üzerinde uyarici bir etki yarattigini gösterir. Bu proseslerde ihtiva edilen 2-`den 12- kata kadar degisen katli- degisimlere sahip genler, Agt, Cartpt, Cck ve Cxcl12 olmustur. Cok, özellikle bir açlik baskilayici olarak sindirimde ve doygunlukta önemli bir rol oynamaktadir. Gcg ayrica bu bagirsak alaninda asagi dogru düzenleme göstermistir. Bu gen degisikliklerinin besin alimi ve vücut kompozisyonu ile ilgili fizyolojik iliskiye sahip olup olmadigini saptamak için kuru ceset agirligi ve kompozisyon analizleri gerçeklestirilmistir. Ilginçtir ki, R. hominis ile iliskili farelerin kuru karkas agirliklari, GF hayvanlarina kiyasla önemli ölçüde daha agir olmus ve farkliliklar en çok l4'üncü günde belirgin olmustur. Daha sonra ceset sivi analizi, toplam yagliligin R. hominis ile tedavi edilen hayvanlarda l4'üncü günde büyük ölçüde daha da yüksek oldugunu göstermistir. Bu bulgular besinsel fermantasyon yoluyla toplanan enerjideki Firmicutes'in rolünü ortaya çikaran son veriler ile uyumludur, ancak ayrica bagirsak bakterisinin aslinda beyin - bagirsak eksenini ve istah düzenleme hormonlarini degistirebilmesi düsüncesini desteklemektedir. Tartisma Konak mikrobu mutualizminin uzun vadede birlikte gelisimi, bagirsaktaki fonksiyonel olarak önemli bakteri türünün seçimine benzer sekilde çalismaktadir, bunun büyüklügü diger ekosistemlerde yüksek ölçüde gösterilmemektedir. Su anda, burada bagirsak fonksiyonlarina karsi mikrobiyal toplulugun bagimsiz üyelerinin katkisina göre özellikle de mukozal bagisiklik sisteminin gelisimi ile ilgili olarak sinirli bilgi bulunmaktadir. E. coli'ye (HA 107) dayanarak tersinebilen bir kolonilesme modeli kullanan son çalismalar, IgA üzerindeki bagisiklik- uyarimli etkiler için içerigin grami basina yasayan bakterilerin Son zamanlarda, SFB ve Bacteroides fragilis'in spesifik fonksiyonlari, T hücre biyolojisine münferit katkilarini tanimlamak için fare bagirsaginda incelenmistir ve bu her iki bakteri Treglerin ve Thl7 hücrelerinin tesirli uyaricilari olarak gösterilmistir (5, 8, 9). T hücresi farklilasmasini da etkileyen ASF içindeki varliklar not edilmis olmasina ragmen, küme XIVa Firmicutes'in ayri elemanlarinin etkileri önceden raporlanmamistir (10). Basvuru sahibi burada mikropsuz fare bagirsaginin, Firmicutes filumun bir elemani olan bir anaerobik bakteri, R. hominis, ile birinci basarili tek - baglantisini göstermistir. Roseburia benzeri bakterilerin ekstrem oksijen hassasiyeti fonksiyonel karakterizasyonunu gerçeklestirmeyi zorlastiran mutlak anaerobik kültür tekniklerini gerektirmektedir. Basvuru sahibi mikropsuz farelerde R. hominisin kararli tekli kolonilesmesini tesis etmis ve bunun metabolik organizasyonunu, fizyolojisini ve simbiyotik özelliklerini ortaya çikarmak için tam serhli genomik sekansi üretilmistir. Takip eden kolonilesme R. hominisin transkripsiyonel tepkilerinin hem konak bagirsak ortamina hem de beslenme sekline dayandirilabildigi bulunmustur. Konakçi kaynakli etkiler, tekli-baglantiyi izleyerek R. hominisin tepkisini baskilamistir. Bu, gen transferini, membran naklini, kemotaksiyi ve hareketlilik alt sistemlerini içermistir. Hareketlilik transferinde ihtiva edilen genlerin yukari - dogru güçlü düzenlenmesi, bagirsak ortaminin bagirsak mikrobiyotasinin elemanlari arasinda yüksek oranda yatay gen degisimine yol açmasi görüsünü desteklemektedir. Böylece, bu ortam bagirsak ekosistemi içinde bakterilerin yasamasi, kolonilesmeyi ve islevi için önemli olan genlerin yayilmasini hizlandirabilir. Konak kolonilesmesinde hareketliligin ve kamçili aletlerin rolü patojenik bakteriler için iyice detaylandirilmakta ancak ortak yasayan bakterideki kamçili proteinlerin rolü hakkinda daha az bilinmektedir. Canli içi deneyler, kamçi genlerinin sentezlenmesi hakkindaki konak bagirsak ortaminin bir uyarici etkisini ortaya çikarmistir. Kamçi sinyalleri konak TLR5 reseptörleri (24) tarafindan algilanmakta ve birkaç patojenik kamçi yapisi güçlü pro-enflamatuvar tepkilerini tetiklemektedir (24). Kalici kamçili ortak yasayanlar tarafindan TLR5 üzerinden sinyallesme, TLR5'in silinmesi farelerde spontane kolite sebep oldugundan homeostazi için önemli olabilir (25). R. hominis kamçinin canli içinde artan sentezi bundan dolayi potansiyel ilgi alanidir. Diger çalisma, E. coli kamçi mutantlarinin, muhtemelen TLR5 sinyallesmesi ile dogustan gelen tanimanin olmamasindan dolayi yabani - tip kamçili suslarin üzerinde bir kolonilesme avantajina sahip oldugunu göstermistir (26, 27). Basvuru sahibi, belirli Firmicutes'ler için kamçinin yukariya dogru düzenlenmesinin bagirsak kolonilesmesine karsi dogal bir tepki oldugunu göstermektedir. R. hominis kamçi proteini, canli içinde sentezlenmis olarak kalmakta ve açikça görülen iltihaplanmanin ve düzenleyici fenotipe ait T hücrelerinde büyüme olmadiginda araliksiz koloni haline gelme ile uyum saglamaktadir. Dolayisi ile TLR5 üzerinden ortak yasam kamçi yapilari dogrudan bagisiklik toleransi tepkilerine yardimci olabilmektedir. TLRSKO ve R. hominisin kamçi mutantlarina dayanan ek veriler daha sonra bagisiklik homeostazisi ile iliskili kamçilarin önemini açikliga kavusturacaktir, ancak bütrat gibi diger sinyallesme parçalari ayrica bagisiklik düzenlemesine katilabilmesine ragmen, R. hominisin IL-lO KO farelerinde gözlenen korucu etkisi bu hipotezi desteklemektedir. R. hominis için fare kalin bagirsaginda, bagirsak bariyer fonksiyonunu ve dogustan gelen bagisikligi arttirmada net bir görev olusturulmustur. Siki baglantilar, bosluk baglantilari ve adherens baglantilar alt epitel katmana translokasyonu sinirlamak için çalismaktadir (28). Hem Crohn hastaligi hem de ülseratif kolit, bariyer fonksiyonunun ve siki baglanti bütünlügünün kaybi ile karakterize edilmektedir. Ilginç bir sekilde, IBD'deki bagirsak mikrobiyotasinin disbiyozu Firmicutes'teki bir azalma ile iliskilidir (1,29). R. hominisin aktif sekilde bariyer genlerini sentezlemeyi arttirmasi gözlemi, olabildigini öne sürmektedir. Siki baglanti komplekslerinin aktivasyonu, yalnizca R. hominisin ayricaligi degildir; Bacteroides thetaiotaomicron ve Lactobacillus acidophilus gibi diger ortak yasayanlar da ayrica mukozal bariyer fonksiyonunu (18, 30) arttirmakta, insan IBD'si içinde bu bakteriler ile probiyotik firsatlar anlamina gelmektedir. Bagirsak bagisiklik sistemi üzerinde R. hominisin etkileri merak uyandirici olmustur. En güçlü etkileri, artan kolonda not edilmis ve Ly6g6c gibi genler kuvvetli sekilde yukari dogru düzenlenmis, bununla birlikte T hücresi düzenlemesinde ve farklilasmasinda ve bagisiklik sinapsinda aktin polimerizasyonunda ihtiva edilmis olup, T hücre aktivasyonuna ve efektör fonksiyonlarini kapsamaktadir. R. hominis kolonilesmesine karsilik Treg genlerin sentezlenmesi çok güçlü olmamasina ragmen, en çok etkilenmis T hücresi yollari tamami Treg farklilasmasini desteklemede ihtiva edilen IL - 10, ICOS ve CTLA - 4 ile iliskili olanlari içermistir. Basvuru sahibi önemli sekilde, bu farelerin kalin bagirsaklarindaki CD3+FoxP3+ hücrelerinde önemli artislari gösterebilmistir. Bu bulgular, Treg farklilasmasini yürüten Clostridium türü hakkindaki son verileri tamamlamistir. Açik bir sekilde, R. hominis mukozal T hücresi büyümesini ve T hücre farklilasmasi üzerindeki etkileri arttirabilir. Ileum ile karsilastirildiginda özellikle 28. günde R. hominis ile tekli-kolonilesmenin ardindan kalin bagirsaktaki kuvvetli bagisiklik etkilerini fark etmek ilginçti. 14. gündeki transkriptomik veri bir takim bagisiklik çalistirmanin bu zaman - noktasinda ileumda baslatilabildigini öne sürmektedir. 28. günde artan kolondaki farkli T hücresi alt gruplari üzerindeki etkiler böylelikle bir trafigi ve hücrelerin ileumdan mezenterik lenf dügümüne kolona yuvalanmasini yansitabilir. R. hominis kolonilesmesinin ilginç bir ilave biyolojik etkisi, besine ve istahin kontrolüne karsi tepkileri etkileyen genlerin düzenlenmesi olmustur. Özellikle, doygunluk hormonlari Cck ve Gcg büyük ölçüde azaltilmistir. Gida aliminda Cck'nin etkilerine bir vagal getirici yol vasitasi ile aracilik edilmektedir. Bu, yenilmis besinler hakkinda bilgi vasitasi ile hem bagirsak fonksiyonunu hem de besleme davranisini etkilemek için merkezi sinir sistemine ulasan en önemli nöral yoldur. Cck, istahi ve beslenmeyi uyaran moleküllerin sentezlenmesini azaltmaya yönelik ve beslenmeyi engelleyen ve istahi arttiran moleküllerin sentezlenmesini arttirmaya yönelik vagal sistemi etkilemektedir (NpyZr ve Cartpt, her ikisi de mevcut çalismada iki kat asagi dogru düzenlenir). Cck, Gcg ve ortak yasam bakterileri arasinda hiçbir baglanti bu zamana kadar rapor edilmemistir, ancak hem yag asitleri heni de proteinler Cck'nin ve Gcg'nin kuvvetli uyaricilaridir (31). R. hominis, alti karbondan daha azina sahip alifatik kuyruklu bütrat gibi kisa Zincirli yag asitleri üretmektedir; bu metabolik. aktivite, daha uzun Zincirli yag asitleri ile gözlenen plazma Cck üzerindeki uyarici etkiyi azaltmak için raporlanmistir (32). Ilginç bir sekilde, ceset agirligi analizi heni vücut agirliginin heni de sivi içerigin aslinda R. hominis ile büyük ölçüde arttirildigini ortaya çikarmis, vücut agirligi artislari ile birbirini tutma mikropsuz farelerin yayginlastirilmasinda gözlenmistir (33). Bu, mevcut çalismada görüldügü gibi doygunluk hormonlarindaki bir azalmanin dogrudan etkisi olsun ya da olmasin, Cck ve Gcg'nin dahil edilmesi önceden raporlanmadigi için görülecek olarak kalmaktadir. Bununla birlikte, mikrobiyota kolonilesmesi ve besinden SCFA'larin salinimi yoluyla kismen enerji toplama arasindaki bir baglantinin önceden gösterilmis oldugunu kabul etmek önemlidir (34). R. hominisin büyük bir bütrat üreticisi oldugunu farz edelinu bu mekanizma. benzer sekilde asagidaki gözlenmis R. hominis tedavisinin metabolik verimine de katkida bulunmaktadir. Özetle, R. hominisli mürin bagirsaginin tek - iliskisi bakteriye ait membran naklindeki, kemotaksideki ve bu bagirsaga uyumlu bakterinin hareketliligindeki degisikliklerle ve konagin dogustan gelen ve uyarlamali bagisiklik sisteminin beraberinde gelen bir aktivasyonuna uyumlu kuvvetli iki yönlü gen sentezleme durumlarini uyarmistir. Metabolik olarak aktif bu bakteri ayrica koloni haline getirilmis farelerdeki artan iliskili olan Vücut agirligi kazanci ile istah ve doygunluk genleri üzerinde önemli etkiler ortaya koymustur. Kompozisyonlar Bulusun bir baska görünümü, istemlerde tanimlanan sekildeki bir bakteri susunu içeren bir bilesim ve farmasötik olarak kabul edilebilen bir eksipiyan, tasiyici veya seyreltici ile ilgilidir. Uygun ilaç katkilari, seyrelticiler, tasiyicilar asagida açiklanmaktadir. Kompozisyon herhangi bir kompozisyon olabilir, ancak tercihen oral olarak, bagirsak araciligi ile veya anüs yolu ile uygulanacak olan bir kompozisyondur. Örnegin, kompozisyon yenilebilen bir kompozisyon olabilir. "Yenilebilen", insan ya da hayvan tüketimi için onayli bir materyal anlamina gelmektedir. Bulusun bir baska görünümü, yukarida açiklandigi gibi bir bakteri susunu içeren bir probiyotik bilesim ile ilgilidir. Burada kullanildigi gibi "probiyotik" terimi, mikrobiyal hücre preparatlari veya konagin sagligi ya da iyiligi üzerinde yararli bir etkiye sahip mikrobik hücrelerin bilesenleri anlamina gelmektedir. (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. ve digerleri, Technol. l999:lO lO7-10). Tercihen, probiyotik kompozisyon netabolik olarak aktif oral yolla uygulanabilen bir kompozisyondur, örnegin canli ve / veya dondurularak kurutulmus ya da cansiz isi ile öldürülmüs, radyasyonlu ya da parçalanmis probiyotik bakteriler. Probiyotik kompozisyon baska içerikler de ihtiva edebilir. Bulusun probiyotik kompozisyonu örnegin, bir tablet, kapsül ya da toz biçiminde oral olarak uygulanabilir. Kapsüllenmis ürünler, R. hominisin bir anaerob olmasindan dolayi tatlandirilir. Diger içerikler (örnegin, vitamin C gibi) oksijen tutucular olarak ihtiva edilebilir. Bunlar gibi prebiyotik substratlar koloni haline gelmeyi ve canli içinde hayatta kalmayi gelistirmektedir. Alternatif olarak, bulusa ait probiyotik kompozisyon oral yolla bir besin ya da süt veya peynir alti suyu tabanli fermente edilmis süt ürünü gibi gida ürünü olarak veya bir farmasötik ürün olarak uygulanabilir. Probiyotik bakterilerin uygun bir günlük dozu, yaklasik 1 x 103 ila yaklasik 1 X , daha tercihen yaklasik 1 x 107 ila yaklasik 1 x lO10 CFU, daha tercihen, yaklasik 1 x 106 ila yaklasik l x 1010 CFU arasindadir. Tercih edilen bir uygulamada, bilesim bakteri susunu ve / veya aktif içerikler olarak, yaklasik 1 x 106 ila yaklasik 1 x 1011 CFU/g arasindaki bir miktarda bilesimin agirligina göre tercihen 1 x 108 ila yaklasik 1 x lO10 CFU/g arasinda, hücresel bilesenlerini ihtiva etmektedir. Bahsedilen doz 1 gr, 3 gr, 5 gr ve 10 gr olabilir. Tipik olarak, bir probiyotik en az bir uygun prebiyotik bilesik ile birlestirilmektedir. Bir prebiyotik genellikle bir oligo- ya da polisakkarit gibi sindirilemeyen bir karbonhidrat veya üst sindirim yolunda parçalanmayan ya da emilmeyen bir seker alkolüdür. Bilinen prebiyotikler inülin ve transgalakto - oligosakkaritler gibi ticari ürünler içermektedir. Tercihen mevcut bulusun kompozisyonu agirlikça yaklasik % l'den yaklasik '6 30'e. kadar, kompozisyonun toplam agirligina göre tercihen agirlikça 6 5'ten % 20'ye kadar bir miktarda bir prebiyotik içermektedir. Tercih edilen karbonhidratlar: frukto- oligosakkaritlerden (ya da FOS), kisa-Zincirli frukto- oligosakkaritlerden, inülinden, izomalt-oligosakkaritlerden, pektinlerden, ksilo-oligosakkaritlerden (ya da XOS), kitosan- oligosakkaritlerden (ya da COS), beta-glukanlardan, islenebilir sakiz ile degistirilmis ve dayanikli nisastalardan polidekstrozdan, D-tagatozdan, akasya liflerinden, keçiboynuzundan, yulaftan ve turunçgil liflerinden seçilmektedir. Özellikle tercih edilen prebiyotikler kisa- zincirli frukto-oligosakkaritlerdir (sadelik maksadiyla buradan sonra FOS'lar-c.c. olarak. gösterilmektedir): bahsedilen FOS- cc'ler sindirilebilen karbonhidratlar degildir, genel olarak pancar sekerinin dönüstürülmesi ile elde edilir ve üç glikoz molekülünün baglandigi bir sakkaroz molekülü içerir. Hayvan yemleri / ürünleri Bulusun bir baska durumu yukarida tanimlanan gibi bir bakteri susunu ihtiva eden gida ürünleri, besin takviyeleri, bir hastaligin tedavisinde tibbi yarari bulunan gidalar, içecekler ve ilaçlar ve bunlarin kullanimi ile ilgilidir. Tercih edilen bir yapilanmada, kompozisyon ek olarak en az bir adet baska türde gidada kullanilabilen baska bakteri içermekte, burada bahsedilen gidada kullanilabilen bakteri tercihen laktik asit bakterileri, bifidobakterileri, propiyonibakterileri ya da bunlarin karisimlarindan olusan gruptan seçilmektedir. Bulusun bir görünümü, yukarida tanimlanan bakteri susunu içeren bir gida ürünü ile ilgilidir- "Gida ürünü" terimi, kati, jöleli ya da sivi olabilen tüm tüketilebilir ürünleri kapsamayi hedeflemektedir. Uygun gida ürünleri örnegin, fonksiyonel gida ürünlerini, gida bilesimlerini, evcil hayvan yemlerini, besi hayvani yemlerini, dogal besinleri, hayvan yemlerini ve benzerlerini içerebilir. Tercih edilen bir uygulamada, gida Burada kullanildigi gibi "fonksiyonel gida ürünü" terimi yalnizca besinsel bir etki saglayabilen degil ayni zamanda tüketici için bunun ötesinde bir faydali etki verebilen besin anlamina gelmektedir. Bu dogrultuda, islevsel besinler siradan besinler olup, tamamen saf besinsel etkiye nazaran besine özel bir fonksiyon - örnegin, medikal ya da fizyolojik fayda gibi - katan bunlarin içine uygulanan bilesenlere ya da içeriklere (burada açiklananlar gibi) sahiptir. Mevcut bulus için uygulanabilir olan spesifik gida ürünlerine ait örnekler, süt - tabanli ürünleri, tüketime hazir tatlilari, örnegin süt ya da su ile yeniden - olusturmak için tozlari, çikolatali sütlü içecekleri, malt içeceklerini, tüketime hazir yemekleri, insanlar için hizli yemekleri ya da içecekleri ya da evcil hayvanlar ya da çiftlik hayvanlarini hedefleyen bir tam veya kismi bir besin düzenini temsil eden gida kompozisyonlarini içermektedir. Tercih edilen bir yapilanmada mevcut bulusa uygun kompozisyon, insanlari, evcil hayvanlari veya çiftlik hayvanlarini hedefleyen bir gida ürünüdür. Kompozisyon, köpekler, kediler, domuzlar, sigirlar, atlar, keçiler, koyunlar ve kümes hayvanlarindan olusan gruptan seçilen hayvanlara yöneliktir. Tercih edilen bir yapilanmada, kompozisyon yetiskin türlere, özellikle insan yetiskinlere yönelik bir gida ürünüdür. Mevcut bulusta, "süt - tabanli ürün" herhangi bir sivi ya da yari - kati süt ya da degisen bir yag içerigine sahip peynir alti suyu tabanli ürün anlamina gelmektedir. Süt - tabanli ürün örnegin, inek sütü, keçi sütü, koyun sütü, az yagli süt, tam yagli süt, tozlastirilan sütten yeniden olusturulan süt ve herhangi bir isleme olmaksizin peynir alti suyu ya da yogurt, kesilmis süt, lor, eksi süt, eksi tam yagli süt, tereyagi ve diger eksi süt ürünleri gibi islenmis bir ürün olabilir. Diger bir önemli grup, peynir alti suyu içecekleri, femente edilmis sütler, koyulastirilmis süt, küçük çocuk ya da bebek Sütleri, tatlandirilmis sütler, dondurma gibi sütlü içecekleri, tatlilar gibi süt ihtiva eden besinleri içermektedir. Bulusun bir görünümü, yukarida açiklanan bakteri susunu içeren bir hayvan yemi ya da hayvan besini ile ilgilidir. Mevcut bulusun kompozisyonlari besin takviyeleri olabilir ya da bunlara eklenebilir, ayrica burada beslenmeyle ilgili ya da gida takviyeleri veya besin katkilari olarak ifade edilmektedir. Bundan dolayi, bulusun bir baska durumu bulusa göre bir veya daha fazla bakteriyel sus içeren beslenmeyle ilgili bir takviye ya da besin katkisi ile ilgilidir. Bulusa uygun bakteri susu ile ilgili tür ve probiyotik bilesimler hayvan gidasinda (örnegin, domuz gidasi) da özellikle erken sütten kesilmis dönemde ve büyüyen besi döneminde kullanilabilir. Probiyotiklerin bagisiklik fonksiyonunu arttirmasi, enfeksiyonlu hastaliklari azaltmasi ve önlemesi, faydali sekilde mikrobiyota kompozisyonunu degistirmesi ve mesela, artmis besin dönüsümü verimi ile hayvanlarin büyümesini ve performansini arttirmasi beklenmektedir. Seyrelticiler, ilaç katkilari ve tasiyicilar Yukarida bahsedildigi gibi, bulus bilesikleri, daha çok tercihen yukarida tanimlanan bakteri susunu içeren farmasötik bilesimler veya gida takviyeleri ve bunlarin kullanimi ile ilgilidir. Bakteri susu genel olarak bir farmasötik olarak ya da besinsel olarak kabul edilebilen bir tasiyici, ilaç katkisi ya da seyreltici ile karisim içinde, özellikle insan tedavisi için uygulanir. Farmasötik kompozisyonlar, insan ve hayvansal ilaçlardaki insan ya da hayvansal kullanim için olabilir. Burada açiklanan farmasötik kompozisyonlarin çesitli farkli biçimlerine yönelik bu tip uygun ilaç katkilarina ait örnekler A Wade ve PJ Weller tarafindan düzenlenen "Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2. Baski, (1994)" içinde bulunabilir. Terapötik kullanima yönelik kabul edilebilen tasiyicilar ve seyrelticiler farmasötik alaninda iyi bilinmekte ve mesela Remington's pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro tarafindan düzenlendi, 1985)'te açiklanmaktadir. Uygun tasiyicilarin örnekleri laktoz, nisasta, glikoz, metil selüloz, magnezyum stearat, manitol, sorbitol ve benzerini içermektedir. Uygun seyreltilerin örnekleri etanol, gliserol ve su içermektedir. Farmasötik tasiyici, ilaç katkisi ya da seyreltici seçimi, uygulamanin hedeflenen yoluna ve standart farmasötik uygulamaya dayanarak seçilebilir. Farmasötik kompozisyonlar, tasiyici, ilaç katkisi ya da seyreltici olarak ya da bunlara ek olarak herhangi bir uygun baglayici (lari), kayganlastirici (lar), askida tutma ajani (lari), kaplama ajani (lari), çözülebilen ajani (lari) içerebilir. Uygun baglayicilara ait örnekler, nisasta, jelatin, glikoz, susuz laktoz, serbest akisli laktoz, beta laktoz, misir tatlandiricilari gibi dogal sekerler, akasya, agaç sakizi ya da sodyum alginat gibi dogal ve sentetik sakizlari, karboksimetil selüloz ve polietilen glikolleri içerir. Uygun kayganlastiricilara ait örnekler, sodyum oleat, sodyum stearat, magnezyum stearat, sodyum benzoat, sodyum asetat, sodyum klorür ve benzerini içerir. Koruyucular, dengeleyiciler, boyalar ve hatta tatlandirma ajanlari farmasötik kompozisyonda temin edilebilir. Koruyucularin örnekleri, sodyum benzoat, sorbik asit ve 5) - hidroksibenzoik asidin esterlerini içerir. Antioksidanlar ve askida tutan ajanlar ayrica kullanilabilmektedir. Besinsel olarak kabul edilebilen tasiyicilar, seyrelticiler ve ilaç katkilari insan ya da hayvan tüketimi için uygun olanlari içerir ve bunlar gida endüstrisinde standart olarak kullanilir. Tipik besinsel olarak kabul edilebilen tasiyicilar, seyrelticiler` ve ilaç katkilari teknikte uzman kisiler için tanidik olacaktir. Uygulama Mevcut bulusun kompozisyonlari, uygulamanin oral, rektal, vajinal, parenteral, kas içine, intraperitonal, atar damar içine, intratekal, introbronsiyal, deri altina, deri içine, damar içine, nasal, yanaga ya da dil alti yollari için uyarlanabilir. Tercihen, mevcut bulusun kompozisyonlari uygulamanin oral, rektal, vajinal, parenteral, nasal, yanaga ya da dil alti yollari için uyarlanmaktadir. Oral uygulama için özel kullanim, sikistirilmis tabletlerden, haplardan, tabletlerden, jellerden, damlalardan ve kapsüllerden yapilmaktadir. Uygulamanin diger biçimleri, damar içine, atar damar içine, intratekal olarak, deri altina, deri içine, intraperitoneal olarak ya da kas içine olarak enjekte edilebilen solüsyonlari ya da emülsiyonlari içermekte ve bunlar steril ya da steril edilebilir solüsyonlardan hazirlanmaktadir. Mevcut bulusun farmasötik kompozisyonlari ayrica fitiller, peserler, süspansiyonlar, emülsiyonlar, losyonlar, merhemler, kremler, jeller, Spreyler, çözeltiler ya da pudra tozlari biçiminde de olabilmektedir. Transdermal uygulamanin alternatif bir araci, bir deri bandinin kullanimidir. Örnegin, aktif içerik polietilen glikollerin ya da sivi parafinin sulu bir emülsiyonundan olusan bir kremin içine uygulanabilir. Bakteriye ait sus ayrica, beyaz bir vakstan olusan ya da bu tip dengeleyiciler ve koruyucular ile birlikte gerektigi gibi beyaz yumusak parafin tabanli bir merhemin için uygulanabilir. Kompozisyonlar ayrica birim dozaj formundadir, örnegin, bir birim doz ya da bir birim dozun alt - birimini bir çoklu veya alt - birim dozunu ihtiva eden ayrik bölümler biçimindedir. Teknikte ortalama bilgiye sahip bir kisi, uygunsuz deney olmaksizin bir denege uygulanmasi için çabuk hazirlanan kompozisyonlardan birinin uygun bir dozunu kolaylikla belirleyebilir. Tipik olarak, bir doktor münferit bir hasta için en uygun olacak gerçek dozaji belirleyecek ve bu kullanilan spesifik bakteriyel susun aktivitesini, bu susun metabolik kararliligini ve hareketin uzunlugunu, yasi, Vücut agirligini, genel sagligini, cinsiyetini, beslenme seklini, uygulama modunu ve süresini, bosaltim hizini, ilaç kombinasyonunu, özel durumun siddetini ve bireysel altta yatan tedaviyi de içeren çesitli faktörlere bagli olacaktir. Burada açiklanan dozajlar ortalama durumun örnekleyicileridir. Elbette, daha yüksek veya daha düsük dozaj araliklarinin gerekli oldugu münferit durumlar olabilir. Insanlarda olagan etkili günlük doz, yaklasik 1 x 103 ila10 yaklasik lx 10", daha tercihen, yaklasik 1 x 107 ila yaklasik 1 x lOn, daha da tercihen, yaklasik 1 x 106 ila yaklasik lx 1010 CFU arasindadir. Kombinasyonlar Özellikle tercih edilen bir yapilanmada, bulusun kompozisyonlari bir ya da daha fazla aktif ajan ile kombinasyon halinde uygulanabilmektedir. Bu tip durumlarda, bulusun kompozisyonlari art arda, es zamanli olarak ya da sirali olarak bir ya da daha fazla baska aktif ajan ile uygulanabilmektedir. Mevcut bulus ayrica asagidaki sinirlayici olmayan örnekler vasitasi ile açiklanmaktadir. ÖRNEKLER Materyaller ve Yöntemler Bakteriyel büyüme kosullari sentetik. YCFA veya kompleks MZGSC ortamlarda büyütülmüstür. Kültür donmus yigindan Hungate tüplerinin içine asilanmis ve gece boyunca 37°C'de enkübe edilmistir. Bakteriler daha sonra MZGSC agar plakalarinin üzerinde 48 saat boyunca bir MACS-MG- lOOO anaerobik çalisma istasyonu (Don Whitley Scientific) içinde Müsinin etkisi, domuz benzeri mide tipi III'den (Sigma - Aldrich) alinan % 0,5 (w/v) müsinin YCFA ortamina eklenmesi ile incelenmistir. Mikropsuz farelerin kolonizasyonu için R. Hominis, gece boyunca 37 °C'de YCFA ortaminda büyütülmüstür. Kültür, asagi bükülmüs ve pelet bir mL'lik YCFA ortaminda askiya alinmistir, %2 sistein (w/V, Sigma-Aldrich) ve % 3 askorbik asit (w/v, Sigma-Aldrich) ile arttirilmistir. Hayvan deneyleri Mikropsuz hayvan deneyleri, Jouy - en - Josas'taki INRA gnotobiyotik kemirgen üreme tesisinde gerçeklestirilmistir (ANAXEM platformu, Institut Micalis, INRA, Jouy-en-Josas, Fransa). Tüm. hayvan deneyleri yerel etik komite tarafindan onaylanmistir. On sekiz mikropsuz C3H/HeN erkek faresi kontrol (N=8) ve tedavi (N=lO) gruplari olarak atanmis ve plastik izolatörlerin içinde ayri olarak kafeslenmistir. Fareler sterilize edilmis ticari bir diyetle (R ad libitum beslenmistir. 0'inci günde, tedavi grubundaki hayvanlara, 100 uL R. hominis kültürü gavaj yoluyla verilirken, kontrol hayvanlarina lOO uL YCFA ortami verilmistir. l4'üncü ve 28'inci günde, dört kontrol hayvani ve bes R. hominis ile tedavi edilmis hayvan sakrifiye edilmistir. C57 / BL6 IL-lOKO deneyleri Beslenme ve Saglik Rowett Enstitüsü'nde (Aberdeen, Iskoçya, UK) gerçeklestirilmistir. Yabani tipte fareler (N:8), IL-lOKO (N:12) ve lL-lOKO + R. hominis (N=11) deneyin baslatilmasindan itibaren 14 hafta analiz edilmistir. Özetle, R. hominis haftada 3 defa 109 cfu/gün olarak uygulanmistir. Ileum artan kolon ve azalan kolon dört esit parçaya bölünmüs ve RNAlater'e (Ambion), nötral tamponlu formaline (Sigma - Aldrich) ya da sivi azota transfer edilmistir. Tam kör bagirsak ve enine kolon RNAlater'a transfer edilmistir. Histopatoloji ayrica IL - lOKO farelerinde degerlendirilmistir. Doku kültürü deneyleri Tüm hücre kültürü reaktifleri, aksi belirtilmedigi sürece, Sigma-Aldrich tarafindan saglanmaktadir. Isi ile etkisiz hale getirilmis fetal bovin serumu (Gibco), penisilin, streptomisin, amfoterisin B ve L-glutamin ile arttirilmis 1,5 mL DMEM (yüksek glikoz, HEPES) ortamindaki 2 x 105 Caco-2 ya da HT29 hücreleri bir alti oyuklu transwell plakasinin (Corning) üst bölmelerinin içine ekilmistir. Alt bölmeler ayni ortamin 3.0 mL'sini içermistir. Hücreler 37°C'de, bir %5 COZ atmosferinde birlesme sonrasi 3 güne kadar inkübe edilmis, antibiyotikleri FCS'yi çikartmak için Hanks solüsyonu ile yikanmis ve L-glutamin, sodyum selenit ve transferin ile arttirilan DMEM içinde 24 saat boyunca antibiyotikler olmaksizin azaltilmistir. Transwell ekleri daha sonra 37 °C'de anaerobik is istasyonu içindeki bir anaerobik kültür kutusuna aktarilmistir. Her bir ekin üst bölümü anaerobik DMEM hücre ortami ile doldurulurken, alt bölüm oksijenize DMEM ile doldurulmustur. R. hominis A2-l83 kültürü, üstel fazda, 3.500xg'de 5 dakika süreyle santrifüjleme yoluyla toplanmistir. Pelet yikanmis ve 0,8 ml anaerobik DMEM'de yeniden süspanse edilmistir. Bakteriye ait süspensiyonun ( yüz mikrolitresi deneysel oyuklara eklenmistir. Kontrol oyuklari, bakteriye ait hücreler içermeyen ortamin ayni miktarini almistir. Ilave kontrol, Caco - 2 ya da HT29 hücreleri olmaksizin inkübe edilmis bakteri hücreleri içermistir. Bakteriyel ve ökaryotik hücreler 2 saat ve 4 saat inkübasyonun ardindan toplanmistir. Hem. bagli olmayan hem, de bagli olan bakteriler emilmis ve RNAlater içinde saklanmistir. R. hominis hücrelerinin yasama yetenegi YCFA plakalarinin üzerine kaplanmasi ile test edilmistir. Caco - 2 hücreleri ya da HT - 29 hücreleri oyuklardan toplanmis ve ayrica RNAlateri içinde saklanmistir. R. hominis kütüphanesi yapimi Küçük boyutlu kütüphane yapisi için R. hominis kromozomal DNA'si ve pirosekanslama bir UltraCleanTM Microbial DNA Izolasyon Kiti (Mo Bio Laboratories Inc) kullanilarak izole edilmis ve fosmid kütüphaneleri için yüksek-moleküler-agirlikli DNA. bir Wizard Genomic DNA Saflastirma Kiti (Promega) kullanilarak izole edilmistir. DNA bütünlügü jel elektroforezi ile kontrol edilmistir. DNA mekanik olarak bir Nebulizer kit (Invitrogen) kullanarak paylasilmis ve jel elektroforezi ile parçalara ayrilmistir. Istenilen boyuttaki DNA fragmanlari jelden alinmis ve bir Wizard® SV Jeli ve PCR Temizleme Sistemi (Promega) kullanilarak saflastirilmistir. Uç bakimi, bir DNA Sonlandirici Uç Bakim Kiti (Lucigen) ile yapilmistir. 1,5 - 3,5 kb'lik fragmanlar, CloneSmart® LCAmp kiti (Lucigen) kullanarak klonlanmis ve bir 4 - 8 kb kütüphane pJAZZ® - OC vektörü (Lucigen) kullanarak yapilandirilmistir. Fosmid kütüphanleri CopyControlTM Fosmid Kütüphasesi Üretim Kiti (Epicentre Biotechnologies) kullanarak olusturulmustur. Koloniler bir otomatiklestirilmis koloni toplayici (BioRobotics BioPick, Genomic Solutions) kullanarak toplanmis ve %10 gliserol ve karsilik gelen antibiyotik ile arttirilan 70 uL 2 x LB ortam ihtiva eden 384 oyuklu mikrotiter plakalarinin içine arsivlenmistir. Hücreler gece boyunca 37°C'de sallayarak büyütülmüs ve -80°C'de depolanmistir. Sekanslama, düzenek ve ek açiklama Küçük boyutlu kütüphanelerin dizilimine yönelik sablonlar klon biyokütlesinin ve pSMART-LCAmp'nin klonlama alanini çevreleyen SLl ve SR2 primerlerinin bir uL'si kullanarak PCR ile üretilmistir. PCR ürünleri, Multiscreen PCR Temizleme filtre plakalari (Millipore) kullanilarak saflastirilmistir. pJAZZ®-OC klonlarindan alinan rekombinant DNA, Wizard® SV 96 Plasmid DNA Saflastirma sistemi (Promega) kullanilarak izole edilmistir. Fosmid DNA, FosmidMAXTM DNA Saflastirma Kiti (Epicentre) kullanarak izole edilmistir. Farkli ek boyutlarina sahip R. hominis WGS kütüphanelerinden alinan DNA fragmanlarinin son Okumalari CEQ ve ABI 3770 (Apllied Biosystems) DNA sekanslayicilari kullanarak elde edilmistir. R. hoministen alinan genomik DNA ayrica 454 G820 (454 Life Sciences) ve kullanarak sekanslanmistir. Sanger ve 454 verileri MIRA versiyon 3 ile birlestirilmistir (http://chevreux.org/proiects mira.html; (35). RAST ek açiklama iletisim hatti (http://rast.nmpdr.org (36)) genomün otomatik ve manuel ek açiklamasi için ve karsilastirmali genomik analizler için kullanilmistir. R. hominis A2-183'ün açiklanmis genomik sekansi CPOO304O erisim numarasi altinda GenBank'a sunulmustur. Mikrodizi analizleri Bakteriyel mikro dizi Bakteriye ait RNA, RNeasy mini kit kullanilarak fare kör bagirsagi içeriklerinden izole edilmis ve daha sonra MICROBEnrichm-kit (Ambion), MICROBExpressTM bakteriyel mRNA zenginlestirme kiti (Ambion) ve MessageAmpTM II - bakteri RNA'si kuvvetlendirme kiti (Applied biosystems) ile islenmistir. RNA, cDNA sentezi süresince ya dCTP - Cy3 ya da dCTP - Cy5 ile etiketlenmistir (CyScribe Birinci Sarmal cDNA etiketleme kiti; Amersham). Etiketlenmis ürünler CyScribe GFX saflastirma kiti (Amersham) kullanilarak saflastirilmistir. RA8 kütüphanesindeki 6000 klondan kuvvetlendirilen PCR ürünleri aminosilan - kaplanmis mikroskop lamlarinin (Corning) üzerine bir MicroGrid Referans genler rpoD ve gyrA'nin kuvvetlendirilen fragmanlari, kontroller olarak rastgele bir sekilde dizi üzerine dagitilmistir. Mikrodizi hibridizasyonu GeneTAC hibritlestirme istasyonunda (Genomic Solutions) gerçeklestirilmistir. Boya ile isaretleme ikinci bir hibritlestirme için degistirilmis ve ayri bir RNA saflastirmasi ayrica etiketlenmis ve yeniden üretilebilirligi saglamak ve istatistiksel olarak önemli sonuçlar almak için iki kez hibritlestirilmistir. Toplamda, dört deney plakasi kuvvetlendirilmis klon basina toplamda 12 hibritlesmeye yönelik her karsilastirma için hibritlestirilmistir. Bir GeneTAC LS IV (Genomic Solutions) ile GeneTac Integrator versiyon 3.0.1 yazilimini kullanarak iki kanalda floresan ölçülmüstür. Benek hassasiyetleri log dönüsümlüdür ve Loess normalizasyonu prob etiketlemedeki ve hibritlesme etkinliklerindeki farkliliklari çikartmak için uygulanmistir. Bir - örnekli t - testleri, ayrimsal sentezlemeyi yönelik test etmek için log - orani degerleri üzerinde kullanilmistir. Veri, katli degisim 2 ve P<0,05 oldugunda büyük olarak degerlendirilmistir. Fare mikro dizi analizi Ileum ve artan kolon dokusu RNAlaterdan Çikartilmis ve Trizol (Invitrogen) içinde çözülmüstür. RNA, standart kloroform / izopropanol adimlari kullanilarak izole edilmistir. ToplamRNA ayrica bir RNase - içermeyen DNase I (Qiagen) parçalama adimi dahil, RNeasy kit (Qiagen) ile saflastirilmistir. RNA bütünlügü, Agilent 2100 Biyoanaliz edici (Agilent Technologies) kullanilarak tespit edilmistir. Toplam RNA biyotin - etiketli cRNA içinde Tek - Çevrimli Hedef Etiketleme Kiti (Affymetrix) kullanarak islenmistir. Bir GeneChip Fluidics Station üzerindeki GeneChip Fare Genom Dizisine (Affymetrix) hibritlesme Saglik Bilimleri Mikro Dizi Çekirdek Tesisi Enstitüsü'nde (Aberdeen Üniversitesi, UK) gerçeklestirilmistir. Çipler, bir Affymetrix GeneChip Scanner ile taranmistir. Görüntü kalitesi analizi Gene Chip Çalistirma Yazilimi (GCOS) (Affymetrix) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Ayrica veri analizi serbest sekilde ulasilabilen yazilim paketleri R (http://www.r-proiect.org) ve Bioconductor (http://www.bioconductor.org) ile gerçeklestirilmistir. Bioconductor paketi limma tarafindan saglanan hafifletilmis F - testi ayrimsal sentezlemeye yönelik test için kullanilmitir. Benjamini ve Hochberg hata bulma yöntemi kullanilarak, P < 0.05 oldugunda verinin büyük oldugu kabul edilmistir. Istatistiksel analiz, iki zaman - noktasindan her biri için ayri ayri gerçeklestirilmistir. Tüm ayrimsal olarak sentezlenen genler (P < 0.05) yol haritalarini üretmek için MetaCore analitik yazilimina (GeneGo, St Joseph, MI) verilmistir. Birlesik yol zenginlestirme analizi bilgiye - dayali kanonik yollar ve endojen metabolik yollar kullanilarak gerçeklestirilmistir. Ilgili birlesik yollarin siralamasi, hipergeometrik dagilim kullanarak hesaplanmis p - degerlerine dayandirilmistir. P - degerleri, haritadaki tüm genlerin tam grubu içindeki haritadaki genlerin sayisina karsi deneydeki genlerin sayisi dikkate alinarak giris listesinden belirli sayidaki genlerin gelisi güzel olarak haritadaki belirli bir sayidaki gen ile eslesme olasiligini göstermistir. Verinin fonksiyonel yorumlanmasina dayanan Gen Ontolojisi (GO) DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov), orijinal webten erisilebilen programin genisletilmis bir versiyonu (37) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Büyük ölçüde farkli transkriptler (P<0,05), spesifik GO terimleri için önemli ölçüde zenginlestirilmis gen sentezlemenin örneklerini ortaya çikarmak için GO kategorisi "Biyolojik Proses"'e atanmistir. Mikro dizi verileri, Biyoteknoloji Bilgisi için Ulusal Merkez (NCBI) Gen Sentezleme Tanitim Kitabina (erisim numarasi: GSE25544; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) ibraz edilmistir. RT - PCR analizi Bakteriyel PCR primerleri, çevrini içi araç Primer3Plus (38) kullanarak tasarlanmis ve Sigma-Aldriçh'ten satin alinmistir. Gerçek - zamanli PCR analizi, bir 7500 Hizli Gerçek - Zamanli PCR Sistemi (Applied Biosystems) ile Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) kullanilarak gerçeklestirilmistir. PCR asagidaki gibi gerçeklestirilmistir: 10 dakika süresince 95°C'de bir çevrim, bunu takiben 15 saniye süresince 95°C'de ve 1 dakika süresince 60°C'de 40 çevrim, bir çözülme adimi ile sona ermistir. Tüm örnekler üç kopyaya katilmistir. Örnekleri arasindaki düsük çesitlilikten dolayi GyrA normallestirmeye yönelik bir referans gen olarak kullanilmistir. Konak geni sentezlemesi için ileuni ve artan kolondan izole edilmis 2 ug'lik toplam ökaryotik RNA, Yüksek Kapasiteli cDNA Tersine Transkripsiyon Kiti (Applied Biosystems) kullanarak rasgele primeler ile CDNA içine tersine uyarlanmistir. Gerçek - Zamanli PCR analizi, 7500 Hizli Gerçek - Zamanli PCR Sistemi (Applied Biosystems) ile QuantiFast SYBR Green PCR Kiti (Applied Biosystems) ve QuantiTect Primer Analizleri (Qiagen) kullanilarak gerçeklestirilmistir. PCR döngü kosullari asagidaki gibi olmustur: 5 dakika süresince 95°C'de bir çevrim, bunu takiben 10 saniye süresince 95°C'de ve 30 saniye süresince 60°C'de 40 çevrim, bir çözülme adimi ile sona ermistir. Tüm örnekler üç kopyaya katilmistir. Örnekleri arasindaki düsük çesitlilikten dolayi Hprt normallestirmeye yönelik bir referans gen olarak seçilmistir. Tüm RT - PCR verileri bir logaritmik ölçekte, P < 0.05'in büyük bir kesilmesi ile esit olmayan varyanslara olanak taniyan bir baz 2 Student'in t testi ile analiz edilmistir. Farkliliklar, katli degisimleri hesaplamak için geriye - dönüstürülmüstür. Western blot Roseburia hominis Fla2'ye karsi immüno-saflastirilmis tavsan poliklonal antikorlari Duck ve digerleri (39) tarafindan açiklandigi gibi üretilmistir. Kisaca, Yeni Zelanda beyaz disi tavsanlarina eksiksiz olarak Freund adjuvani içinde sentetik peptit ile bagisiklik kazandirilmis ve birkaç defa arttirilmistir. R. hominis fla2 peptidi 261 - 275 (C- AQYNDDAKSVLEILK-COOH) ve peptit 58 - 71 (C-GLNKASRNSQDGIS-CONHZ) için kullanilmistir. Bagisiklik kazandirmayi takiben, antikorlar peptitlerin l mL'lik aktiflestirilmis sefaroz boncuklarina bilestirilmesi ile hazirlanmis bir immünoafinite kolonu üzerinde saflastirilmistir. Western blot için artan kolon bagirsak içerikleri, 8M üre ihtiva eden laemmli tampon içinde askiya alinmistir. R. hominis biyokütlesi (pozitif kontrol) ayni tampon içinde seyreltilmistir. Her örnegin otuz uL'si bir NuPAGE® Novex® % 4- 12 Bis-Tris jelin (Invitrogen) oyuklari içine yüklenmis ve elektroforez uygulanmistir, bunu WesternBreeze Chemiluminescent isleme takip etmistir. Fla2 antikoru lleOO oraninda antikor seyrelticisinin içinde seyreltilmis ve gece boyunca 4°C'de inkübe edilmis, bunu 1 saat oda sicakliginda alkalin fosfataz ile baglanan anti-tavsan izlemistir. Tespit, Fuji LASBOOO görüntüleme sistemi kullanilarak tamamlanmistir. Kuru vücut agirligi ve sivi ceset analizi Bagirsaklari çikartilmis fare cesedi tartilmis, sabit agirlik için dondurularak kurutulmus ve daha sonra analiz için Ögütülmüstür. Sivi içerik, kloroform / netanol (2:l h/h) ile önceden açiklandigi gibi (40) ekstraksiyon (lleOO a/h) ile belirlenmistir. FISH analizi FISH analizi, genel bir bakteri probu Eub338 ve yeni tasarlanmis bir R. hominis A2-l83'e özgü prob kullanilarak bagirsak dokusu bölümleri üzerinde gerçeklestirilmistir. Nötral tamponlanmis formalinde sabitlenmis dokular Techovit 8lOO (Heraeus Kulzer) içine gömülmüstür. Iki - Hdkronluk bölümler döner bir mikrotom (Leica / Reichert Autocut) kullanarak kesilmistir. Dokunun içindeki lOO pm, 200 pm ve 300 um'deki deney plakalari basina üç bölüm alinmis, hayvan basina dokuz bölüme yol açmistir.10 Lameller, sirasiyla %50 (h/h), %80 ve %96 etanol içinde enkübasyon ile dehidre edilmis ve oda sicakliginda kurutulmustur. Kullanilan 168 rRNA FISH problari genel bir bakteri probu Eub ve yeni olarak tasarlanmis R. hominis A2-l83'e özgü prob (GTACATTACATACTCTGTCAGTG; FITC) olup, bagirsak bakteriye ait izolatlarin bir paneline karsi özgüllük bakimindan genis sekilde test edilmistir. lOO uL hibridizasyon tamponu içindeki on mikrolitre prob (30 ng/uL) susuzlastirilmis örnege uygulanmis ve proba özgü sicaklikta enkübe edilmistir. Deney plakalari, 50°C'de 30 dk süresince yikama tamponunun içinde yikanmis, kalan yikama tamponunu çikartmak için buzlu - soguk suya daldirilmis ve sikistirilmis hava akisi altinda kurutulmustur. Karsit boyama 4', 6- diamidino- 2- fenilindon (DAPI; Vector Laboratories Inc) ile gerçeklestirilmis ve deney plakalari floresan için solmayi önlemek üzere Vectashield Birlestirme Ortami (Vector Laboratories Inc) ile birlestirilmistir. Bakteriler bir Leica DM RBE floresan mikroskobu (Leitz GMBH) kullanarak görsellestirilmis ve bir Penguin 600CL kamera (Pixera) ve Viewfinder 3.0 yazili (Studio Lite) ile fotograflanmistir. Yüksek büyütmeli görüntüler (x 63) Apochromatics sistemi (Leica) kullanarak yeniden elde edilmistir. Immünofloresan T hücre isaretçilerinin immünolokalizasyonu sirali kriyobölümler (8 um) üzerinde incelenmistir. Bölümler ya 30 dakika boyunca - °C'de önceden sogutulmus metanol içinde (Ly6G FITC, CD3 FITC, CD11 b FITC, tamami 1:50'de (BD Biosciences)) ya da CD3 FITC'ye (1:100, BD Biosciences) sahip çift etiketli FoxP3 (1:500, Abcam) için %1 paraformaldehit (PFA) içinde 2 dakika süreyle oda sicakliginda, bunu takiben PBS'de %0,0l Triton X içinde 3 dakika süreyle sabitlenmistir. Tüm bölümler, PBS içinde (pH 7.4) % 10 iliskili pre-immün serum ihtiva eden % lO BSA (Sigma) ile bloke edilmistir. Metalün - sabitlendigi dokular, 1 saat boyunca RT'de birincil antikorlar ile inkübe edilmistir. PFA ile sabitlenmis bölümler gece boyunca 4°C'de antikorlar ile inkübe edilmistir. FoxP3 alexa keçi anti tavsan 594 (1:1000, Molecular Probes) kullanarak görsellestirilmistir. Kesitler, DAPI ile karsi etiketlenmis ve Vectashield (Vector Laboratories) ile monte edilmistir. Pozitif hücrelerin nicemlenmesi için her fare bölümünden görüntünün. minimuni bes alani görüntüleme yazilimi kullanarak. incelenmistir ve mikroskop ayarlari yukarida açiklanmistir. Histoloji Doku örnekleri üç saat boyunca Carnoy'un sabitleyicisi (% 60 (v/v) etanol, % 30 (V/v) kloroform ve 6 10 (v/v)) içinde, oda sicakliginda sabit çalkalama ile sabitlenir. Örnekler % 70 etanole transfer edilir ve oda sicakliginda enine bölme için yönlendirilene kadar saklanir ve üreticinin talimatlarina göre Technovit kullanarak soguk - isleme reçinesinin içine gömülmüstür. Gömülen doku Histoblocs üzerine Technovit 3040 (heraeus Kulzer) kullanarak yerlestirilmistir. Dört mikron bölümler, cam bir biçak ile sabitlenen (TAAB Laboratories Equipment Ltd) dönen bir mikrotom (Leica Autocut)) kullanarak kesilmistir Doku kesitleri, standart haemotoksilin/eozin yöntemleri kullanilarak lekelenmis ve x10 ve x20 objektifler ile donatilmis bir Zeiss Axioskop mikroskopu ile incelenmistir. Görüntüler, bir leaging kamera ve Image Pro Plus yazilimi kullanilarak alinmistir. Roseburia ile iliskili türün ve suslarin genomlarinin karsilastirmasi Basvuru sahibi tek bir 3,592,125-bp kromozomu tarafindan gösterilen R. hominis A2-183'ün tam bir genom sekansini üretmistir. Genomun otomatik ve manuel bilgi notu RAST platformu kullanarak, dört ribozomal kalitin, 66 RNA'nin ve 3,273 ön görülmüs proteinin varligini ortaya çikarmistir. R. hominis A2- intestinalis M50/1 ve Eubacterium rectale ATCC 33656 için Alt Sistem Kategori Dagilimi sirasiyla, Sekiller 11 - 15'te gösterilmektedir. Bu bilgi, her fonksiyonel alt sistemdeki genlerin sayilarindaki (parantez içinde verilmektedir) farkliliklari göstermektedir. Bu genler konagin her münferit bakteriye karsi tepkisine aracilik etmede çok önemlidir. Önemli sekilde bu genler hem sayi hem de fonksiyon olarak, çesitli suslar arasinda farklidir. Sonuçlar asagida özetlenmektedir. R. hominis A2-l83 Hücre Duvari ve Kapsül (57) Membran Nakli (24) Düzenleme ve Hücre sinyallesmesi (16) Uyusukluk ve Sporlanma (12) Karbonhidratlar (271) E. rectale ATCC 33656 Hücre Duvari ve Kapsül (41) Membran Nakli (13) Düzenleme ve Hücre sinyallesmesi (9) Uyusukluk ve Sporlanma (6) Karbonhidratlar (172) R. intestinalis Ll - 82 Hücre Duvari ve Kapsül (35) Membran Nakli (36) Düzenleme ve Hücre sinyallesmesi (lO) Uyusukluk ve Sporlanma (17) R. intestinalis M5 Hücre Duvari ve Kapsül (28) Membran Nakli (37) Düzenleme ve Hücre sinyallesmesi (10) Uyusukluk ve Sporlanma (17) Karbonhidratlar (201) R. inulinovorans DSM 16841 Hücre Duvari ve Kapsül (69) Membran Nakli (26) Düzenleme ve Hücre sinyallesmesi (9) Uyusukluk ve Sporlanma (17) Karbonhidratlar (160) Contig 1. içinde bulunan 3000'den fazla genin yüzdece sekans benzerligi, R. hominis'in bakteriyel genomu ve E. rectale, R. intestinalis ve R. inulinivorans'in bakterileri arasindaki farkliliklari vurgulamaktadir Çesitli Roseburia türü ve iliskili tür Eubacterium rectale'nin genomlari arasinda karsilastirmalar yapilmis, en yakini R. hominis ile ilgilidir. hominis referans genomu 585394.12 R intestinalis Ll-82l66486.4 Çesitli Roseburia genomlarinin arasindaki potansiyel genlerin benzerlik yüzdesi % O'dan % 90 sekans benzerligine kadar bir aralikta degismektedir. Birçok gen varsayima dayalidir ve suslar arasinda degismektedir. Genlerin çok büyük sayilari, digerlerinin Roseburia türünün genomlarindan bulunmayan R. hominis genomlarinda bulunmaktadir. Roseburia hominis, kendi genomunun neredeyse %25'inin R. hominis için özgü olan diger Roseburia türünün (%0 benzerlik) diger genomlarinda bulunmayan 924 gene sahiptir. Diger genler arasindaki düsük homoloji ayrica ( TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (18)

ISTEMLER

1. Bir bakteriyel sus olup, özelligi; (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99,5 168 rRNA özdesligi, veya (b) tipta kullanim için, NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türlerine ait bakteri susuna en az %95'lik bir DNA-DNA homolojisine sahip olmasidir.

2.Bir farmasötik bilesim olup, özelligi; (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir % NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisine sahip bir bakteri susu; ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir yardimci madde, tasiyici veya seyreltici içermesidir.

3.Bir gida takviyesi olup, özelligi; (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir % NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA-DNA homolojisine sahip bir bakteri susu; ve besinsel olarak kabul edilebilir bir yardimci madde, tasiyici veya seyreltici içermesidir.

4.Bir probiyotik bilesim, besin maddesi, yiyecek ürünü, gida takviyesi veya yiyecek katki maddesi olup, özelligi; (a) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %99,5 168 rRNA özdesligine veya (b) NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türüne ait olan sus ile en az bir %95 DNA- DNA homolojisine sahip olan bir bakteri susu içermesidir.

5.Istem 1'in kullanimi için bakteri susu veya Istemler 2-4'ün farmasötik bilesimi, besin destegi, probiyotik bilesim, besin maddesi, yiyecek ürünü, gida takviyesi veya yiyecek katki maddesi olup, özelligi; burada bakteriyel susun, NCIMB 14029 erisim sayisi altinda tevdi edilen Roseburia hominis türlerine ait olan sus olmasidir.

6.Istem l'in kullanimi için bakteri susu veya Istemler 2-4'ün farmasötik bilesimi, besin destegi, probiyotik bilesim, besin maddesi, yiyecek ürünü, gida takviyesi veya yiyecek katki maddesi olup, özelligi; burada bakteriyel susun, dört ribozomal operonlu, 66 RNA ve 3,273 tahmini proteinli tek bir 3,592,125-bp kromozomundan olusan bir genoma sahiptir.

7.Istem 1'in kullanimi için bakteri susu veya Istemler 2-4'ün farmasötik bilesimi, besin destegi, probiyotik bilesim, besin maddesi, yiyecek ürünü, gida takviyesi veya yiyecek katki maddesi olup, özelligi; burada bakteriyel susun, liyofilize edilmis bir bakteriyel popülasyon formunda olmasidir.

8.Istem 1 veya Istem 5'e göre kullanim için bakteri susu olup, özelligi; burada susun, bir kisinin immün sisteminin düzenlenmesinde kullanmak için olmasidir.

9.Istem 8'e göre kullanim için bakteri susu olup, özelligi; burada immün sistemin regülasyonunun, bir kisinin adaptif immün sisteminin düzenlenmesi veya bir kisinin dogustan gelen immün sisteminin düzenlenmesi olmasidir.

10. Istem 1 veya Istem 5'e göre kullanim için bakteri susu olup, özelligi; burada susun, bir immün bozuklugu ve bir bagirsak bozuklugu, örnegin, irritabl bagirsak sendromu (IBS), kolit, enflamatuvar bagirsak bozuklugu (IBD), örnegin Crohn's hastaligi ve ülseratif kolit, pouchitis, fonksiyonel dispepsi, fonksiyonel konstipasyon, fonksiyonel diyare, örnegin antibiyotikle iliskili diyare, turist diyaresi ve pediyatrik diyare, fonksiyonel abdominal agri, fonksiyonel siskinlik, Epigastrik Agri Sendromu, Postprandial Distres Sendromu, gastrointestinal reflü hastaligi (GERD), otoimmün hastaliklar, örnegin diyabet, artrit, multipl skleroz ve psöriyazis, sedef hastaligi, alerjiler, atopik hastaliklar, örnegin atopik dermatit, nekrotize edici enterokolit, diger enfeksiyonlar, çölyak hastaligi ve rinit ve bunlarin kombinasyonlarindan seçilen bir enflamatuvar bozuklugun tedavi edilmesinde kullanima yönelik olmasidir.

11. Istem l veya Istem 5'e göre kullanim için bakteri susu olup, özelligi; burada susun, bir denekteki bagirsak mikrobiyotasini iyilestirmede kullanima yönelik olmasi, bir kisideki bagirsak sagligini arttirmada kullanima yönelik olmasi, T düzenleyici hücreleri ve immün toleransi tesvik etmede kullanima yönelik olmasi veya bir kisideki immün homeostazin muhafaza edilmesinde kullanima yönelik olmasidir.

12. Istem 1 veya Istem 5'e göre kullanim için bakteri susu olup, özelligi; burada susun, bir denegin istahini arttirmada kullanim için olmasidir.

13. Istem 1 veya Istem 5'e göre kullanim için bakteri susu olup, özelligi; burada susun, istahin bastirilmasiyla iliskili genlerin ekspresyonunun asagi regüle edilmesinde kullanim için olmasi, tercihe göre burada genin, NpyZr veya Cartpt olmasidir.

14. Istem 1 veya Istem 5'e göre kullanim için bakteri susu olup, özelligi; burada susun, bir kisinin Vücut agirliginin arttirilmasinda kullanima yönelik olmasidir.

15. Istemler 1 ila 5-14'e göre kullanim için bakteri susu olup, özelligi; burada susun: (i) en az bir harekete geçme ve kimyasal yönelme geninin indüklemesini ve/Veya sentezlenmesini düzenlemesi, daha çok tercihen MobA ve MobL'den seçilmis bir genin sentezlenmesini yukari dogru düzenlemesi; veya (ii)F1aAl, FJaZ, EÜaA3 ve EJaB'den seçilmis en az bir geni düzenlemesi; ya da (iii) asagidakilerden en az birinin sentezlenmesini düzenlemesi: asetil- CoA asetiltransferaz, 3- hidrosilasil- CoA dehidrojenaz, bütril- CoA dehidrojenaz, elektron transferi flavoprotein beta alt birimi, elektron transferi flavoprotein alfa alt birimi (iV)Agt, Cartpt, Cck, CXCllZ ve Gcg'den seçilen en az birinin sentezlenmesinin asagi dogru regüle edilmesi; Ün kalin bagirsaktaki veya ince bagirsagin alt yarisindaki en az bir bagisiklik tepkisini harekete geçirmesi veya (Vi)l` hücresi regülasyonu ile iliskili genlerin indüklenmesi ve / veya sentezlemesi ayarlanarak uyarlamali bagisiklik tepkisini harekete geçirmesi ya da (vii) yükselen kalin bagirsaktaki Ly6g60 ve Ly6g6e'den seçilen genin sentezlenmesi; veya (Viii) Tlr5, Tlrl, Vnnl, Defb37, Pla2g, Muc16, ltln, Sprrla, Cldn4, Pmp22, Crb3, Magi3, Marveld3, Mpp7, DefcrZO, Pcgf2, Ltbp4, Igsf8 ve Tcfe2a'dan seçilmis en az bir genin sentezlenmesinin düzenlenmesidir.

16. Istem 1 ila 5-15'in herhangi birine göre kullanim için bakteri susu olup, özelligi; denegin bir memeli, tercihen bir insan olmasidir.

17. Istem 2'nin farmasötik bilesimi olup, özelligi; burada bilesimin, oral uygulama için adapte edilmis olmasidir.

18.Istem 2'ye göre bir farmasötik bilesim veya Istem 3'e göre bir gida takviyesi olup, özelligi; bahsedilen sürecin, bakteriyel susun farmasötik olarak kabul edilebilir bir yardimci madde, tasiyici veya seyreltici veya bir besinsel olarak kabul edilebilir yardimci madde, tasiyici veya seyreltici ile karistirilmasini içermesidir.