RS59057B1 - Formulacije rastvora konstruisanih anti-il-23p19 antitela - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se uopšteno na formulacije rastvora sa visokim koncentracijama terapeutskih antitela i njihovu upotrebu u lečenju različitih poremećaja.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Interleukin-23 (IL-23) je heterodimerni citokin sačinjen od dve subjedinice, p19 koja je jedinstvena za IL-23, i p40, koja je zajednička i za interleukin-12 (IL-12). Subjedinica p19 je strukturno slična sa IL-6, faktorom stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), i p35 subjedinicom IL-12. IL-23 posreduje u prenošenju signala tako što se vezuje za heterodimerni receptor koji sadrži dve subjedinice, IL-23R, koja je jedinstvena za IL-23 receptor i IL-12Rβ1, koja je zajednička i za IL-12 receptor. Izvestan broj ranih studija pokazao je da su posledice genetskog nedostatka p40 (miš sa isključenim p40; p40 KO miš) bile teže od posledica koje se uočavaju za nedostatak p35, npr. kod p35KO miša. Ovi rezultati konačno su objašnjeni sa otkrićem IL-23, i uviđanjem da p40KO sprečava ne samo ekspresiju IL-12, već i IL-23. Videti, npr., Oppmann et al. (2000) Immunity 13:715-725; Wiekowski et al. (2001) J. Immunol. 166:7563-7570; Parham et al. (2002) J. Immunol. 168:5699-708; Frucht (2002) Sci STKE 2002, E1-E3; Elkins et al. (2002) Infection Immunity 70:1936-1948).

[0003] Nedavne studije su pokazale, kroz upotrebu miševa kod kojih je isključen p40, da je blokada i IL-23 i IL-12 efikasan tretman za različite inflamatorne i autoimune poremećaje. Međutim, izgleda da blokada IL-12 preko p40 ima neželjene sistemske posledice kao što je povećana podložnost oportunističkim mikrobijalnim infekcijama ili povećan rizik od tumora. Bowman et al. (2006) Curr. Opin. Infect. Dis. 19:245; Langowski et al. (2006) Nature 442:461. U skladu s tim, specifična blokada p19 subjedinice IL-23 poželjna je u lečenju humanih bolesti zbog toga što ometa patogenu inflamatornu aktivnost IL-23, a ne ometa korisne aktivnosti IL-12. npr. u borbi sa infekcijama ili pri imunološkom nadzoru.

[0004] Terapeutska antitela mogu da se koriste za blokiranje aktivnosti citokina. Značajno ograničenje za upotrebu antitela kao sredstva za lečenje in vivo je imunogenost antitela. Za monoklonska antitela dobijena iz ne-humanih vrsta, ponavljana upotreba kod ljudi dovodi do stvaranja imunog odgovora na terapijsko antitelo. Takav imuni odgovor dovodi u najmanju ruku do gubitka terapijske efikasnosti, a potencijalno i do fatalnog anafilaktičkog odgovora. U skladu sa tim, antitela smanjene imunogenosti kod ljudi, kao što su humanizovana ili potpuno humana antitela, poželjna su za lečenje humanih subjekata. Primeri terapeutskih antitela na IL-23p19 opisani su u objavi SAD patentne prijave br. 2007/0009526, i u međunarodnim patentnim objavama br. WO 2007/076524, WO 2007/024846, WO 2007/147019 i WO 2009/043933. Dodatna humanizovana anti-IL-23p19 antitela opisana su u prijavama istog nosioca patenta objavljenim kao međunarodne patentne objave br. WO 2008/103432 i WO 2008/103473, i u objavi SAD patentne prijave br.2007/0048315 istog nosioca patenta.

[0005] Lekovi sa antitelima za upotrebu kod ljudi mogu unekoliko da se razlikuju po aminokiselinskoj sekvenci svojih konstantnih domena, ili po svojoj okvirnoj sekvenci unutar varijabilnih domena, ali se obično najdramatičnije razlikuju po CDR sekvencama. Čak i antitela koja se vezuju za isti protein, isti polipeptid, ili čak potencijalno za isti epitop, mogu da sadrže potpuno različite CDR sekvence. Terapeutska antitela za upotrebu kod ljudi mogu takođe da se dobiju i iz humane sekvence antitela klicine linije ili ne-humane (npr. glodarske) sekvence antitela klicine linije, kao u humanizovanim antitelima, dovodeći do još veće raznovrsnosti potencijalne CDR sekvence. Ove razlike u sekvenci dovode do različitih stabilnosti u rastvoru i različite sposobnosti odgovora na parametre rastvora. Osim toga, male izmene u rasporedu aminokiselina ili promene u jednom ili nekoliko aminokiselinskih ostataka mogu da dovedu do dramatično različite stabilnosti antitela i podložnosti putevima razgradnje specifičnim za sekvencu. Usled toga, trenutno nije moguće predvideti uslove rastvora neophodne kako bi se optimizovala stabilnost antitela. Svako antitelo mora da se proučava pojedinačno kako bi se odredila optimalna formulacija rastvora. Bhambhani et al. (2012) J. Pharm. Sci.101:1120.

[0006] Antitela su takođe proteini relativno visoke molekulske težine (∼150000 Da), na primer u poređenju sa drugim terapeutskim proteinima kao što su hormoni i citokini. Usled toga, često je neophodno koristiti doze lekova sa antitelom, koje imaju relativno velike težinske količine, kako bi se postigla željena molarna koncentracija leka. Osim toga, često je poželjno da se lekovi sa antitelima primenjuju potkožno, pošto to omogućava samostalnu primenu. Samostalnom primenom izbegavaju se vreme i troškovi povezani sa posetama medicinskim ustanovama zarad primene, npr., intravenske. Potkožno isporučivanje je ograničeno zapreminom rastvora koja se praktično može isporučiti na mestu injeciranja, u jednoj injekciji, što je u principu oko 1 do 1,5 ml. Potkožna lična primena obično se ostvaruje upotrebom prethodno napunjenog šprica ili autoinjektora koji su napunjeni formulacijom tečnog rastvora leka, pre nego u liofilizovanom obliku, kako bi se izbegla potreba da pacijent resuspenduje lek pre injeciranja. Za isporučivanje viših doza leka, ograničenje zapremine daje veliki značaj razvoju formulacija rastvora visoke koncentracije. Ovako visoke koncentracije antitela, međutim, pokazuju efekte nagomilavanja makromolekula i povećane protein-protein interakcije, što dovodi do fizičkih nestabilnosti kao što su opalescencija, auto-asocijacija, agregacija, odmotavanje i odvajanje faza. Ovako visoke koncentracije rastvora antitela mogu takođe da pokazuju visoku viskoznost (npr. >10 centipoaza), što smanjuje mogućnost istiskivanja iz prethodno napunjenih špriceva ili autoinjektorskih uređaja. Lekovi sa antitelima moraju da budu stabilni tokom čuvanja kako bi se obezbedila efikasnost i konzistentno doziranje, tako da je od kritičnog značaja da formulacija koja se odabere, koja god ona bila, podržava poželjna svojstva, kao što su visoka koncentracija, bistrina, prihvatljiv viskozitet, a da takođe zadržava ova svojstva i efikasnost leka tokom prihvatljivo dugog roka trajanja pod tipičnim uslovima skladištenja.

[0007] Usled toga, postoji potreba za stabilnim formulacijama rastvora visokih koncentracija terapeutskih antitela, kao što su antitela koja se vezuju za humani IL-23p19. Ovakve stabilne formulacije rastvora će poželjno pokazivati stabilnost tokom meseci do godina pod uslovima koji su tipični za čuvanje lekova za samoprimenu, tj. na temperaturi frižidera, u špricu, što dovodi do dugog roka trajanja za odgovarajući proizvod leka. Ovakve stabilne formulacije rastvora visoke koncentracije bi trebalo da omoguće pakovanje leka sa antitelom za potkožno injeciranje za ličnu primenu.

[0008] Formulacije terapeutskih antitela koje sadrže histidinski pufer, pH 6, polisorbat 80 i saharozu, opisane su u WO2008/157409, WO2012/135408 i kod Nicholas Warne ED-Lehr Claus-Michael et al., (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, Vol 78, No 2, 208-212), liofilizovane formulacije anti-IL-23p19 antitela su opisane u US2011/0229490.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0009] Predmetni pronalazak obezbeđuje formulacije u vidu rastvora visoke koncentracije humanizovanog anti-IL-23p19 antitela 13B8-b ("hum13B8-b"). Antitelo hum13B8-b sadrži dva identična laka lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 2 i dva identična laka lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 1.

U jednom primeru izvođenja formulacija rastvora sadrži a) najmanje 50 mg/ml anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b; b) 10 mM histidinskog pufera, pH 6,0; c) 0,05% polisorbata 80; i d) 7% saharoze, pri čemu navedeno antitelo hum13B8-b sadrži:

i) polipeptid lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 2; i

ii) polipeptid teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1.

[0010] U različitim primerima izvođenja, formulacije rastvora prema predmetnom pronalasku sadrže najmanje 50, 80, 90, 100, 110 ili 120 mg/ml antitela hum13B8-b. U drugim primerima izvođenja, formulacije rastvora prema predmetnom pronalasku sadrže oko 80 - 120 mg/ml antitela hum13B8-b, 80 - 120 mg/ml antitela hum13B8-b, oko 100 mg/ml antitela hum13B8-b, i 100 mg/ml antitela hum13B8-b.

[0011] U drugom aspektu pronalazak se odnosi na formulacije rastvora visoke koncentracije anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b prema predmetnom pronalasku za upotrebu u lečenju poremećaja koji uključuju, ali nisu ograničeni na, inflamatorne bolesti, autoimune bolesti, proliferativne poremećaje, kancer, infektivne bolesti (npr. bakterijske, mikobakterijske, virusne ili gljivične infekcije, uključujući hronične infekcije), artritis, psorijazu, psorijazni artritis, entezopatije, ankilozirajući spondilitis, inflamatornu bolest creva, uključujući Kronovu bolest i ulcerozni kolitis, multiplu sklerozu, uveitis, bolest kalema protiv domaćina, sistemski lupus eritematozus i dijabetes. U još jednom dodatnom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu formulacija rastvora visoke koncentracije anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b za upotrebu u proizvodnji medikamenata za upotrebu u lečenju ovih istih poremećaja.

KARATAK OPIS CRTEŽA

[0012]

SL. 1 prikazuje podatke korišćene za određivanje optimalnih puferskih i pH uslova za formulacije koje sadrže hum13B8-b.

SL. 1A prikazuje temperaturu odmotavanja, izmerenu diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC), i procentom čistoće, koji je izmeren pomoću RP-HPLC, za različite 1 mg/mL formulacije antitela, i SL. 1B prikazuje procenat monomera i procenat kasno eluirajućih pikova, izmerene pomoću HP-SEC, kao funkciju pH, za nekoliko različitih pufera (acetat, citrat, fosfat i Tris). Kratka razmatranja DSC i HP-SEC su obezbeđena u Primerima 2 i 3, redom.

SL. 1C - 1E prikazuju različita svojstva formulacija sa 10 mM citratom kao funkciju pH, uključujući opalescenciju (OD350), distribuciju hidrodinamičke veličine (nm) merenu dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS), i temperaturu topljenja, određenu pomoću DSC, redom. Kratka razmatranja DLS i DSC su obezbeđena u primerima 4 i 2, redom.

SL. 1F i 1G prikazuju procenat kasno eluirajućih pikova, i procenat glavnog pika, redom, kroz vreme, što je određeno jonoizmenjivačkom hromatografijom visokih performansi (HP-IEX). Kratko razmatranje HP-IEX obezbeđeno je u primeru 5.

SL. 1H i 1I prikazuju opalescenciju (OD350) i hidrodinamičku veličinu (nm), izmerenu dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS), redom, za formulacije sa niskom koncentracijom antitela (1 mg/ml) u nekoliko pufera na različitim pH vrednostima, dok SL. 1J prikazuje distribuciju hidrodinamičke veličine (nm) za koncentrovanije formulacije antitela (50 i 100 mg/ml), što je određeno DLS-om. Kratko razmatranje DLS-a obezbeđeno je u primeru 4. SL. 1K prikazuje procenat kasno eluirajućih pikova u različitim puferima na različitim pH vrednostima, tokom vremena, što je određeno pomoću HP-SEC. Kratko razmatranje HP-SEC obezbeđeno je u primeru 3.

SL. 2A i 2B prikazuju temperaturu odmotavanja, određenu DSC-om i promene opalescencije, redom za formulacije hum13B8-b koje sadrže različite ekscipijense (100 mM NaCl, 7% saharozu, 7% trehalozu i 6% manitol). SL se odnosi na supstancu leka. Kratko razmatranje DSC-a obezbeđeno je u primeru 2.

SL. 3A i 3B prikazuju procenat antitela i procenat rano eluirajućih pikova, što je određeno pomoću HP-SEC, redom, i SL. 3C prikazuje opalescenciju pre i posle 5 dana mućkanja, u funkciji prisustva ili odsustva surfaktanta (0,05% polisorbat 20, 0,05% polisorbat 80, ili pluronik F-68). Vrednost mućkanja od 5 dana za uzorak bez surfaktanta (NS) je zapravo preko 3, i time dosta van skale. Kratko razmatranje HP-SEC obezbeđeno je u primeru 3. SL. 4 prikazuje stabilnost formulacija antitela sa acetatom i histidinom, koje sadrže 10 mM pufer, 7% saharozu i 0,05% polisorbat 80, kada se čuvaju u različitim uslovima. Uzorci su čuvani u vidu uzoraka od 1,5 ml u staklenim bočicama od 2,0 ml. SL.4A prikazuje stabilnost preparata antitela od 50 i 100 mg/ml, koja se ogleda u procentu monomera antitela koji je izmeren pomoću HP-SEC, kada se čuva na 5°C (relativna vlažnost sredina) ili pod RH4 uslovima (40°C, 75% relativne vlažnosti). Kratko razmatranje HP-SEC obezbeđeno je u primeru 3.

SL. 4B - 4D su grafikoni procenta monomera, HMW vrsta i LMW vrsta, redom, što je određeno pomoću HP-SEC, pod nizom različitih uslova čuvanja "25H" se odnosi na čuvanje na 25°C, 60% relativne vlažnosti. Zapaziti da ordinate (vremenska osa) na SL. 4B - 4D nisu linearne. Kratko razmatranje HP-SEC obezbeđeno je u primeru 3.

SL. 4E i 4F grafikoni su rezultati HP-IEX eksperimenata kojima se nadgleda stabilnost antitela putem merenja procenata glavnog pika i kiselih varijanti, redom. Kratko razmatranje HP-IEX obezbeđeno je u primeru 5.

SL. 4G - 4I su grafikoni opalescencije nakon čuvanja na 5°C, 25°C (25H) i 40°C (RH4), redom. SL. 4J i 4K prikazuju oksidaciju, izmerenu mapiranjem peptida nakon čuvanja na RH4 (40°C, 75% relativna vlažnost) i 5°C, i na 40°C i 5°C, redom. Kratko razmatranje mapiranja peptida obezbeđeno je u primeru 6.

SL. 4L i 4M su grafikoni DSC eksperimenata na formulacijama sa acetatom i histidinom, redom, za početne uzorke i uzorke čuvane 4,5 meseca na 5°C ili u RH4 uslovima. Kratko razmatranje DSC obezbeđeno je u primeru 2.

Stabilnosti formulacija sa 10 mM acetatom i 10 mM histidinom merene su kao procenat monomera i kao procenat vrsta visoke molekulske težine, što je mereno pomoću HP-SEC. Stabilnost je merena za uzorke koji su čuvani na 5°C (±3°C), 25H (25°C, 60% relativna vlažnost), ili RH4 (40°C, 75% relativna vlažnost). Rezultati su predstavljeni na SL.4A i 4B. Kratko razmatranje HP-SEC obezbeđeno je u primeru 3.

SL. 5 predstavlja podatke o stabilnosti formulacija antitela prema predmetnom pronalasku kada se čuvaju kao supstanca leka u etilen-vinil-acetatnim (EVA) Celsius® Pak kesama od 30 mL sa fluidnim kontaktnim slojem. Predstavljeni su podaci za formulacije koje sadrže 10 mM histidinski pufer (pH 6,0), 7% saharozu, 0,05% polisorbat 80 i antitelo hum13B8-b. SL.

5A - 5C su grafikoni koncentracija proteina, biološke potencije (merene ćelijskim funkcionalnim testom), i biološke potencije (merene ELISA testom), redom, za tri različite preparacije hum13B8-b (lotovi A, B i C). Kratko razmatranje određivanja koncentracije proteina, ćelijskih funkcionalnih testova i ELISA testova obezbeđeno je u primerima 7, 8 i 9, redom.

SL. 5D - 5G su grafikoni rezultata HP-IEX eksperimenata kojima se nadgleda stabilnost antitela preko merenja procenata kiselih varijanti, vrsta glavnog pika, post-glavnog pika i baznih varijanti, redom. Kratko razmatranje HP-IEX obezbeđeno je u primeru 5.

SL. 5H prikazuje procenat monomera, mereno pomoću HP-SEC. Kratko razmatranje HP-SEC obezbeđeno je u primeru 3.

SL. 5I i 5J prikazuju čistoću merenjem procenta glavnog pika pomoću neredukujuće CE-SDS, ili procenat teških i lakih lanaca pomoću redukujuće CE-SDS, redom. Kratko razmatranje CE-SDS obezbeđeno je u primeru 10.

SL. 5K i 5L prikazuje procenat HMW i LMW vrsta, redom, što je mereno pomoću HP-SEC. Kratko razmatranje HP-SEC obezbeđeno je u primeru 3.

SL. 6 predstavlja dodatne podatke o stabilnosti formulacija antitela prema predmetnom pronalasku (lotovi antitela A i B) kao supstanca leka u etilen-vinil-acetatnim (EVA) Celsius® Pak kesama od 30 mL sa fluidnim kontaktnim slojem. Predstavljeni su podaci za formulacije koje sadrže 10 mM histidinski pufer (pH 6,0), 7% saharozu, 0,05% polisorbat 80 i antitelo hum13B8-b. SL. 6A i 6B su grafikoni biološke potencije merene pomoću ELISA testa i merene pomoću ćelijskog funkcionalnog testa, redom. Kratka razmatranja ELISA testa i ćelijskih funkcionalnih testova obezbeđena su u primerima 9 i 8, redom.

SL. 6C - 6E su grafikoni procenta monomera, HMW vrsta i LMW vrsta, redom, što je određeno pomoću HP-SEC, pod nizom različitih uslova čuvanja. Kratko razmatranje HP-SEC obezbeđeno je u primeru 3.

SL. 6F i 6G prikazuju čistoću prema merenju procenta glavnog pika pomoću neredukujuće CE-SDS, ili procenta teških i lakih lanaca pomoću CE-SDS, redom. Kratko razmatranje CE-SDS obezbeđeno je u primeru 10.

SL. 6H - 6K su grafikoni rezultata HP-IEX eksperimenata kojima se prati stabilnost antitela preko merenja procenata kiselih varijanti, vrsta glavnog pika, post-glavnog pika i baznih varijanti, redom. Kratko razmatranje HP-IEX obezbeđeno je u primeru 5.

SL. 7 predstavlja podatke o stabilnosti formulacija antitela prema predmetnom pronalasku kada se čuvaju na 5°C (3°C) u vidu proizvoda sa lekom, u jediničnim dozama, u prethodno napunjenim špricevima, pri koncentraciji antitela od 100 mg/ml i zapremini punjenja od 1,0 ml. SL. 7A je grafikon koncentracija proteina za četiri različite preparacije hum13B8-b (lotovi D, E, F, G i H), što je određeno UV-apsorbancijom. Kratko razmatranje određivanja koncentracije proteina obezbeđeno je u primeru 7.

SL. 7B i 7C su grafikoni biološke potencije merene ćelijskim funkcionalnim testovima, i meren ELISA testom, redom, za četiri različite preparacije hum13B8-b (lotovi E, F, G i H). Kratka razmatranja ćelijskih funkcionalnih testova i ELISA testa obezbeđena su u primerima 8 i 9, redom.

SL. 7D - 7F su grafikoni procenta HMW vrsta, monomera, i LMW vrsta, redom, što je određeno pomoću HP-SEC. Kratko razmatranje HP-SEC obezbeđeno je u primeru 3.

SL. 7G - 7J su grafikoni rezultata HP-IEX eksperimenata kojima se prati stabilnost antitela merenjem procenata glavnog pika, kiselih varijanti, baznih varijanti i vrsta post-glavnog pika, redom. Kratko razmatranje HP-IEX obezbeđeno je u primeru 5.

SL. 7K i 7L prikazuju čistoću merenjem procenta glavnog pika neredukujućom CE-SDS, ili procenta teških i lakih lanaca redukujućom CE-SDS, redom. Kratko razmatranje CE-SDS obezbeđeno je u primeru 10.

DETALJAN OPIS

[0013] Kako je ovde korišćeno, uključujući i priložene patentne zahteve, oblici jednine imenica uključuju i njihove referentne reči u množini, osim ako kontekst jasno nalaže drugačije. Tabela 10 u daljem tekstu daje spisak identifikacija sekvenci koje se koriste u ovoj prijavi. Osim ako nije drugačije naznačeno, proteini i subjekti koji se ovde pominju su humani proteini i humani subjekti, pre nego neke druge vrste. Kako je ovde korišćeno, "SL. X" odnosi se kolektivno na sve pojedinačne SL. XA - XZ.

I. Definicije

[0014] "Proliferativna aktivnost" obuhvata aktivnost koja pospešuje, koja je neophodna za, ili koja je specifično povezana sa, npr., normalnom ćelijskom deobom, kao i kancerom, tumorima, displazijom, ćelijskom transformacijom, metastazama i angiogenezom.

[0015] Kako je ovde korišćeno, izraz "hipervarijabilni region" odnosi se na aminokiselinske ostatke antitela koji su odgovorni za vezivanje antigena. Hipervarijabilni region sadrži aminokiselinske ostatke iz „regiona koji određuje komplementarnost“ ili "CDR" (npr. ostaci 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) i 89-97 (CDRL3) u varijabilnom domenu lakog lanca i ostaci 3135 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) i 95-102 (CDRH3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) i/ili oni ostaci iz "hipervarijabilne petlje" (tj. ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (HI), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Kako je ovde korišćeno, izraz "okvirni" ili "FR" ostaci odnosi se ostatke varijabilnog domena koji nisu oni ostaci hipervarijabilnog domena koji su ovde definisani kao CDR ostaci. Numeracija ostataka u prethodnom tekstu odnosi se na Kabat sistem numeracije i ne odgovara nužno u svim detaljima numeraciji sekvence u pratećoj Listi sekvenci.

[0016] "Imuno stanje" ili "imuni poremećaj" obuhvata, npr., patološku infalamaciju, inflamatorni poremećaj i autoimuni poremećaj ili bolest. "Imuno stanje" takođe se odnosi na infekcije, uporne infekcije i proliferativna stanja, kao što su kancer, tumori i angiogeneza, uključujući infekcije, tumore i kancere koji se odolevaju iskorenjivanju putem imunog sistema. "Kancerozna stanja" uključuju, npr., kancer, ćelije kancera, tumore, angiogenezu i prekancerozna stanja kao što je displazija.

[0017] "Inflamatorni poremećaj" znači poremećaj ili patološko stanje gde patologija nastaje, sasvim, ili delimično, usled, npr., promene broja, promene u stepenu migracije ili promene u aktivaciji ćelija imunog sistema. Ćelije imunog sistema uključuju, npr., T ćelije, B ćelije, monocite ili makrofage, antigen prezantujuće ćelije (APCs), dendritične ćelije, mikrogliju, NK ćelije, NKT ćelije, neutrofile, eozinofile, mastocite, ili bilo koju drugu ćeliju specifično povezanu sa imunologijom, na primer, endotelne ćelije koje proizvode citokine ili epitelne ćelije.

[0018] Kako je ovde korišćeno, koncentracije treba smatrati približnim u okvirima koji su uobičajeno povezani sa takvim koncentracijama u proizvodnji farmaceutskih formulacija. Specifično, koncentracije ne moraju da budu tačne, već mogu da se razlikuju od navedenih koncentracija u okvirima tolerancija koje se uobičajeno očekuju za lekove proizvedene pod GMP uslovima. Slično tome, pH vrednosti su približne u okviru tolerancija koje se uobičajeno očekuju za lekove koji su proizvedeni pod GMP uslovima i koji se čuvaju u tipičnim uslovima čuvanja. Na primer, o formulacijama sa histidinom prema predmetnom pronalasku govori se kao da imaju pH od 6,0 ali je tipična tolerancija pH 6,0 (± 0,3). Osim ako nije drugačije naznačeno, procentne koncentracije su koncentracije izražene kao težina/težina.

II. Formulacije rastvora antitela visoke koncentracije

[0019] Tipična terapeutska monoklonska antitela sastoje se od četiri peptida: dva laka lanca (npr. duga 214 aminokiselina) i dva teška lanca (npr. duga 446 aminokiselina). Svaki lanac se zatim sastoji iz varijabilnog domena i konstantnog domena. Varijabilni domeni za anti-IL-23p19 hum13B8-b imaju 108 i 116 aminokiselina za lake i teške lance, redom, a konstantni domeni imaju 106 i 330 aminokiselina. Specifičnost nekog antitela za sopstveni ciljni molekul u velikoj meri je određena time da li sekvence spadaju u takozvane "hipervarijabilne", ili regione "koji određuju komplementarnost" (CDR), od kojih se po tri nalaze u varijabilnim domenima svakog od teških i lakih lanaca. Kod različitih antitela CDR regioni mogu da variraju po dužini, ali kod hum13B8-b, CDR regioni sadrže 44 aminokiseline na teškim lancima i 27 aminokiselina na lakom lancu. CDR ostaci veoma variraju kod različitih antitela i mogu da potiču od humane sekvence klicine linije (u slučaju kompletno humanih antitela), ili od ne-humane (npr. glodarske) sekvence klicine linije. Okvirni regioni takođe mogu značajno da se razlikuju od antitela do antitela. Konstantni regioni razlikovaće se u zavisnosti od toga da li odabrano antitelo ima lambda (λ) ili kapa (κ) laki lanac, i u zavisnosti od klase (ili izotipa) antitela (IgA, IgD, IgE, IgG, ili IgM) i potklase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Ukupan zbir je molekul antitela od približno 150 000 Da, sastavljen od 650 aminokiselina, od kojih je 224 u varijabilnim domenima, uključujući 71 aminokiselinu u "hipervarijabilnim" regionima, sa konstantnim regionima koji se razlikuju po klasi, potklasi i konstantnim domenima lakog lanca.

[0020] Antitelo prema predmetnom pronalasku (anti-IL-23p19 mAb hum13B8-b) takođe se razlikuje od mnogih nedavno razvijenih terapeutskih antitela po tome što je humanizovano pre nego potpuno humano. Usled toga, CDR sekvenca je izvedena iz ne-humanih (u ovom slučaju mišijih) sekvenci klicine linije, pre nego iz humanih sekvenci klicine linije. Sekvence klicine linije sadrže repertoar sekvenci iz kojih su izvedene CDR sekvence antitela, osim promena izvedenih iz somatskih hipermutacija, i kao posledica moglo bi se očekivati da se CDR sekvence dobijene pošavši od mišije klicine linije sistematski razlikuju od sekvenci koje polaze od humane klicine linije. Ovo je zapravo osnova za korišćenje imunih sistema različitih vrsta za uzgajanje antitela, pošto korišćenje različitih vrsta povećava potencijalnu raznovrsnost dobijene CDR sekvence. Korišćenje humanih sekvenci klicine linije često se opravdava time što će CDR sekvence iz humanih klicinih linija biti manje imunogene kod ljudi nego sekvence izvedene iz drugih vrsta, što odražava uverenje u osnovi tog opravdanja, da će se CDR sekvence sistematski razlikovati u zavisnosti od toga od koje vrste potiču. Iako povećanje raznovrsnosti CDR sekvenci povećava verovatnoću pronalaženja antitela sa željenim osobinama, kao što je visok afinitet, to dalje uvećava poteškoće prilikom razvoja stabilne formulacije rastvora za dobijeno antitelo.

[0021] Čak i antitela koja se vezuju za isti antigen mogu dramatično da se razlikuju po sekvenci, i nisu nužno ništa bliže srodna po sekvenci od antitela na sasvim odvojene antigene. Na primer, varijabilni domeni antitela prema predmetnom pronalasku (hum13B8-b) dele samo približno 50 do 60% identičnosti sekvence sa drugim anti-IL-23p19-specifičnim antitelom CNTO 1959 (SEQ ID NOs: 116 i 106 iz SAD pat. br. 7,993,645). CNTO 1959 je potpuno humano antitelo. Na osnovu niske sličnosti sekvence, ne može se pretpostaviti da su hemijska svojstva antitela, pa tako ni njihova podložnost degradaciji, slična, uprkos tome što imaju zajednički ciljni molekul.

[0022] Kao što je u prethodnom tekstu pokazano, antitela su veliki, veoma složeni polipeptidni kompleksi podložni različitim oblicima degradacije i nestabilnosti u rastvoru. Diverzitet sekvenci, a time i strukture antitela, dovodi do širokog opsega hemijskih svojstava. Pored očiglednih razlika u specifičnosti vezivanja antitela, specifičnih za sekvencu, antitela pokazuju varijabilnu podložnost različitim putevima degradacije, agregacije i precipitacije. Bočni lanci aminokiselina razlikuju se po prisustvu ili odsustvu reaktivnih grupa, kao što su karboksi- (D,E), amino- (K), amido- (N,Q), hidroksil- (S,T,Y), sulfhidril- (C), tioetar- (M) grupe, kao i potencijalno hemijski reaktivnih mesta na histidinskim, fenilalaninskim i prolinskim ostacima. Bočni lanci aminokiselina direktno uključeni u interakcije prilikom vezivanja antigena su očigledni kandidati za inaktivaciju modifikacijama bočnog lanca, ali degradacija na drugim pozicijama takođe može da utiče na faktore kao što su sterička orjentacija CDR sekvenci (npr. promene ostataka u okvirnom regionu), efektorska funkcija (npr. promene u Fc regionu - videti, npr., Liu et al. (2008) Biochemistry 47:5088), ili samo-asocijacija/agregacija.

[0023] Antitela su podložna bilo kom broju potencijalnih puteva degradacije. Oksidacija metioninskih ostataka u antitelima, naročito u CDR sekvencama, može da bude problem ukoliko sprečava vezivanje antigena. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731; Lam et al. (1997) J. Pharm. Sci. 86:1250. Drugi potencijalni putevi degradacije uključuju deamidaciju asparagina (Harris et al. (2001) Chromatogr., B 752:233; Vlasak et al. (2009) Anal. Biochem. 392:145), oksidaciju triptofana (Wei et al. (2007) Anal. Chem.79:2797), cisteinilaciju (Banks et al. (2008) J. Pharm. Sci. 97:775), glikaciju (Brady et al. (2007) Anal. Chem. 79:9403), obrazovanje piroglutamata (Yu et al. (2006) J. Pharm. Biomed. Anal. 42:455), rearanžman disulfida (Liu et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:29266), i hidrolizu (Davagnino et al. (1995) J. Immunol. Methods 185:177). Razmatrano u Ionescu & Vlasak (2010) Anal. Chem. 82:3198. Videti takođe Liu et al. (2008) J. Pharm. Sci.97:2426. Neki potencijalni putevi degradacije zavise ne samo od prisustva specifičnih ostataka aminokiselina, već i od okolne sekvence. Deamidacija i obrazovanje izoaspartata može da se dogodi usled spontanog unutarmolekulskog rearanžmana peptidne veze nakon (C-terminalne u odnosu na) N ili D ostataka, pri čemu su N-G i D-G sekvence tome naročito podložne. Reissner & Aswad (2003) CMLS Cell. Mol. Life Sci.60:1281.

[0024] Antitela su takođe tokom čuvanja podložna ne-enzimskoj fragmentaciji koja je zavisna od sekvence. Vlasak & Ionescu (2011) mAbs 3:253. Prisustvo reaktivnih bočnih lanaca kao što su D, G. S. T, C ili N može da dovede do reakcija unutarmolekulskog cepanja koje razdvaja polipeptidnu kičmu. Ovakve reakcije hidrolize koje su specifične za sekvencu u principu kritično zavise od pH. Isto. Antitela takođe mogu da podležu agregaciji koja zavisi od sekvence, na primer kada CDR sekvence uključuju veliki broj hidrofobnih ostataka. Perchiacca et al. (2012) Prot. Eng. Des. Selection 25:591. Agregacija je naročito problematična kod antitela koja moraju da budu formulisana u visokim koncentracijama u cilju potkožne primene, što je dovelo do toga da se sekvenca antitela u nekim slučajevima modifikuje dodavanjem naelektrisanih ostataka da bi se povećala rastvorljivost. Isto.

[0025] Odražavajući raznolikost potencijalnih problema sa stabilnošću antitela, koji su specifični za sekvencu, potencijalne formulacije antitela su takođe raznovrsne. Potrebno je da se za svako novo antitelo izvestan broj različitih promenljivih optimizuje po meri. Formulacije mogu da variraju, na primer, po koncentraciji antitela, po puferu, pH, prisustvu ili odsustvu surfaktanta, prisustvu ili odsustvu sredstava za regulaciju toničnosti (jonskih ili nejonskih), prisustvu ili odsustvu sredstava sa efektom nagomilavanja molekula. Komercijalno dostupna terapeutska antitela prodaju se u širokom spektru formulacija rastvora, u fosfatnom puferu (npr. adalimumab), fosfat/glicinskom puferu (npr. basiliksumab), Tris puferu (npr. ipilimumab), histidinskom (npr. ustekinumab), natrijum citratnom (npr. rituksimab); i od pH 4,7 (npr. certolizumab) i pH 5,2 (npr. adalimumab) do pH 7,0-7,4 (npr. cetuksimab). Takođe su dostupna u formulacijama koje opciono sadrže dinatrijum edetat (npr. alemtuzumab), manitol (npr. ipilimumab), sorbitol (npr. golimumab), saharozu (npr. ustekinumab), natrijum hlorid (npr. rituksimab), kalijum hlorid (npr. alemtuzumab), i trehalozu (npr. ranibizumab); svi sa ili bez polisorbata-80, u opsegu od 0,001% (npr. abciksmab) do 0,1% (npr. adalimumab).

[0026] Primeri formulacija antitela nalaze se u SAD pat. br. 7,691,379 (anti-IL-9 mAb MEDI-528); 7,592,004 (anti-IL-2 receptor, daklizumab); 7,705,132 (anti-EGFR, panitumumab); i 7,635,473 (anti-Aβ; bapineuzumab). Dodatni primeri formulacija antitela nalaze se u obj. SAD pat. pr. br. 2010/00021461 (anti-α4-integrin, natalizumab); 2009/0181027 (anti-IL-12/IL-23, ustekinumab); 2009/0162352 (anti-CD20, ritumiksmab); 2009/0060906 (anti-IL-13); 2008/0286270 (anti-RSV, palivizumab); i 2006/0088523 (anti-Her2, pertuzumab). Još dodatnih formulacija je opisano u Daugherty & Mrsyn (2006) Adv. Drug Deliv. Rev.58:686; Wang et al. (2007) J. Pharm. Sci.96:1; and Lam et al. (1997) J. Pharm. Sci.86:1250.

[0027] Varijabilnost sekvence, koja je osnov za specifičnost antitela nalazi se u središtu imunog odgovora. Ova varijabilnost dovodi do hemijske heterogenosti dobijenih antitela, što za rezultat ima širok spektar potencijalnih puteva degradacije. Veoma veliki niz formulacija antitela razvijenih do sada svedoči o činjenici da formulacije moraju da se optimizuju individualno da bi se za svako specifično antitelo osigurala optimalna stabilnost. U stvari, baš svako komercijalno terapeutsko antitelo odobreno do sada za upotrebu kod ljudi, imalo je jedinstvenu, različitu formulaciju.

III. Biološka aktivnost humanizovanog anti-IL-23

[0028] Formulacije rastvora anti-IL-23p19 mAb hum13B8-b prema predmetnom pronalasku, naći će upotrebu u lečenju poremećaja za koje se očekuje da selektivni antagonizam IL-23 signalnog puta bude od koristi. Inflamatorne bolesti kože, zglobova, CNS-a, kao i proliferativni poremećaji pokreću slične imune odgovore, te bi blokiranje IL-23 trebalo da obezbedi inhibiciju ovih inflamatornih poremećaja posredovanih imunim sistemom, a da ne ugrozi sposobnost domaćina da se bori protiv sistemskih infekcija. Antagonizovanje IL-23 trebalo bi da ublaži upalu povezanu sa inflamatornom bolešću creva, Kronovom bolešću, ulceroznim kolitisom, reumatoidnim artritisom, psorijaznim artritisom, psorijazom, ankilozirajućim spondilitisom, bolešću kalema protiv domaćina, atopijskim dermatitisom i različitim drugim autoimunim i inflamatornim poremećajima. Upotreba IL-23 inhibitora takođe će obezbediti inhibiciju proliferativnih poremećaja , npr., kancera i autoimunih poremećaja, npr., multiple skleroze, dijabetesa tipa I i SLE. Opisi IL-23 u ovim raznolikim poremećajima mogu da se nađu u sledećim objavljenim PCT prijavama: WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; i WO 01/18051. Inhibitori IL-23 takođe mogu da nađu primenu u lečenju infekcija, uključujući hronične infekcije kao što su bakterijske, mikobakterijske, virusne i gljivične infekcije. Videti SAD pat. br.8,263,080 i objavu međunarodne prijave WO 2008/153610.

[0029] Formulacije rastvora visoke koncentracije prema predmetnom pronalasku uključuju antitela koja zadržavaju biološku aktivnost kada se čuvaju tokom dužih vremenskih perioda. Kako je ovde korišćen, izraz "biološki aktivan" odnosi se na antitelo ili fragment antitela koji je u stanju da se veže za željeni epitop antigena i direktno ili indirektno ispolji biološko dejstvo. Ova dejstva tipično nastaju usled toga što IL-23 ne uspeva da se veže za svoj receptor. Kako je ovde korišćeno, izraz "specifičan" odnosi se na selektivno vezivanje antitela za epitop ciljnog antigena. Specifičnost vezivanja antitela je moguće testirati poređenjem vezivanja antitela za IL-23 sa vezivanjem za irelevantni antigen ili smešu antigena pod datim skupom uslova. Ako se antitelo vezuje za IL-23 najmanje 10 i poželjno 50 puta više nego za irelevantni antigen ili smešu antigena, tada se smatra da je specifično. Antitelo koje se vezuje za IL-12 nije IL-23-specifično antitelo. Antitelo koje se "specifično vezuje" za IL-23p19 ne vezuje se za proteine koji ne sadrže IL-23p19-izvedene sekvence, tj. "specifičnost", kako je ovde korišćeno, odnosi se na IL-23p19 specifičnost, a ne na bilo koju drugu sekvencu koja može da bude prisutna u datom proteinu. Na primer, kako se ovde koristi, antitelo koje se "specifično vezuje" za IL-23p19 tipično će se vezivati za FLAG®-hIL-23p19, koji je fuzioni protein koji sadrži IL-23p19 i FLAG® peptidni obeleživač, ali se ne vezuje za FLAG® peptidni obeleživač kada je sam, ili kada je fuzionisan sa nekim drugim proteinom koji nije IL-23p19.

[0030] IL-23-specifična vezujuća jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da inhibiraju bilo koju od njegovih bioloških aktivnosti, uključujući, ali ne i ograničeno na, proizvodnju IL-1β i TNF od strane peritonealnih makrofaga i IL-17 od strane TH17 T ćelija. Videti Langrish et al. (2004) Immunol. Rev. 202:96-105. Anti-IL-23p19 antitela će takođe moći da inhibiraju ekspresiju gena za IL-17A, IL-17F, CCL7, CCL17, CCL20, CCL22, CCR1 i GM-CSF. Videti Langrish et al. (2005) J. Exp. Med. 201:233-240. IL- 23-specifična vezujuća jedinjenja prema predmetnom pronalasku, takođe će blokirati sposobnost IL-23 da pospešuje proliferaciju ili preživljavanje TH17 ćelija. Cua and Kastelein (2006) Nat. Immunol. 7:557-559. Inhibitorna aktivnost konstruisanih anti-IL-23p19 antitela, biće korisna u lečenju inflamatornih, autoimunih i proliferativnih poremećaja. Primeri takvih poremećaja opisani su u objavama PCT patentnih prijava WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; i WO 01/18051.

Formulacije rastvora visoke koncentracije prema predmetnom pronalasku su korisne, na primer, za čuvanje i isporučivanje anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja povezanog sa povišenom aktivnošću IL-23 ili IL-23p19, kao što su Th17-posredovane bolesti, autoimuni ili hronični inflamatorni poremećaji ili kanceri.

IV. Formulacije rastvora humanizovanog anti-IL-23p19 antitela 13B8-b

[0031] Predmetni pronalazak obezbeđuje formulacije rastvora visokih koncentracija anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b, koje sadrži dva identična laka lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 2 i dva identična teška lanca sa sekvencom SEQ ID NO: 1, i koje su objavljene u istovremeno prijavljenom, SAD pat. br. 8,293,883 istog nosioca. Humanizovana sekvenca lakog lanca, 13B8 (sa kapa konstantnim regionom) obezbeđena je u SEQ ID NO: 2, a varijabilni domen lakog lanca sadrži ostatke 1-108 iz te sekvence. Humanizovana sekvenca teškog lanca, 13B8 (sa γ1 konstantnim regionom) obezbeđena je u SEQ ID NO: 1, a varijabilni domen teškog lanca sadrži ostatke 1-116 iz te sekvence.

[0032] Sekvence teškog i lakog lanca (SEQ ID NOs: 1 i 2) obezbeđene su bez signalnih sekvenci. Primeri signalnih sekvenci teškog i lakog lanca obezbeđeni su u SEQ ID NOs: 12 i 13, redom. Signalne sekvence, ili sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju signalne sekvence, mogu se dodati na N-terminus respektivnih lanaca antitela kako bi se kreirao prekursorski protein za sekreciju iz ćelije iz koje potiče. Takođe mogu da se koriste i alternativne signalne sekvence, i nekoliko njih može da se nađe pod "SPdb: a Signal Peptide Database." Choo et al. (2005) BMC Bioinformatics 6:249.

[0033] Hibridom koji eksprimira parentalno antitelo 13B8 deponovan je u skladu sa Budimpeštanskim sporazumom u Američkoj kolekciji kultura sojeva (ATCC - Manassas, Virginia, SAD) 17. avgusta 2006. pod pristupnim brojem PTA-7803. Detalji o odnosu između parentalnog antitela 13B8 i hum13B8-b dati su u SAD pat. br.8,293,883 istog nosioca.

[0034] Formulacije rastvora prema predmetnom pronalasku razvijene su upotrebom najmanje osam različitih serija antitela 13B8-b pripremljenih iz ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) u kulturi, obima proizvodnje 500 - 2000 L.

[0035] Opseg uslova inicijalnog rastvora, razmatran je za formulaciju rastvora prema predmetnom pronalasku. Eksperimenti su izvedeni sa različitim puferima, kao što su acetatni, citratni, histidinski, TRIS i fosfatni, pri pH vrednostima u opsegu od 4,0 do 8,8. Testirani su ekscipijensi, kao što su saharoza, trehaloza i manitol, kao i različite koncentracije (a tako i jonske snage) NaCl, i uključivanje surfaktanta polisorbat 80. Formulacije su podvrgnute skriningu na osnovu opalescencije, određivanjem O.D. na 350 nm. Agregacija je merena gel hromatografijom visokih performansi (HP-SEC), dinamičkim rasipanjem svetlosti (DLS) i analitičkim ultracentrifugiranjem (AUC). Biohemijska stabilnost je merena jonoizmenjivačkom hromatografijom visokih performansi (HP-IEX), i termička stabilnost je merena diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC).

[0036] Početni eksperimenti na prvobitnim formulacijama pri 1 mg/mL hum13B8-b otkrili su da se procenat čistoće, meren reverzno-faznom tečnom hromatografijom visokih performansi (RP-HPLC), povećavao do oko pH 6,0 a zatim ostajao stabilan sve do pH 8,8. Videti SL. 1A. Međutim, temperatura odmotavanja antitela imala je pik na oko pH 5. Videti SL. 1A. Poređenje vrsta pufera sa acetatom, citratom, fosfatom i TRIS-om pokazalo je da je citratni pufer na oko pH 5,5 dao najveći procenat monomera i najniži procenat kasno eluirajućih pikova. Videti SL. 1B. Iako je optimalna biohemijska i biofizička stabilnost uočena u citratnom puferu na pH 5,5, koncentracija antitela u citratnom puferu do >65 mg/mL antitela, dovodila je do značajne opalescencije (podaci nisu prikazani). Opalescencija je nepoželjna zbog potencijala da smanji prihvatanje antitela od strane pacijenta, što je naročito važno za lek koji može da se formuliše za samoprimenu. Iako je ova opalescencija reverzibilna nakon razblaživanja i snižavanja pH do 4,8 u citratnom puferu (SL. 1C), a snižavanje pH je takođe snižavalo hidrodinamički dijametar (SL.

1D), snižavanje pH takođe je smanjilo termičku i biohemijsku stabilnost rastvora, što se ogledalo u povećanom udelu oblika sa niskom tačkom topljenja (SL. 1E), povećanom akumulacijom kasno eluirajućih pikova tokom vremena, što je mereno pomoću HP-SEC (SL.1F), i smanjenjem glavnog pika tokom vremena, što je mereno pomoću HP-IEX (SL.1G).

[0037] Zatim je, u pokušaju da se bez smanjenja termičke i biohemijske stabilnosti, smanji opalescencija i samoasocijacija, kao alternativni puferski sistem razmatran histidin. Uzorci su pripremljeni u 10 mM acetatu (pH 4,8 i 5,6), 10 mM citratu (pH 4,8, 5,5 i 6,0) i 10 mM histidinu (pH 5,5 i 6,0). Opalescencija i hidrodinamički dijametar određeni su pomoću OD350i DLS, redom. Videti SL. 1H i 1I. Zamena citrata ili acetatom ili histidinom maksimalno je smanjila opalescenciju i smanjila je samoasocijaciju, ne ugrožavajući biohemijsku stabilnost. Pri višim koncentracijama antitela (50 do 100 mg/mL), formulacije sa acetatom (pH 5,5) i histidinom (pH 6,0) bile su bistre i nisu pokazivale povećanu hidrodinamičku veličinu koja je uočena sa citratom (pH 5,5). Vidi SL.1J. Formulacije sa niskim pH (4,8), sa citratom ili acetatom, takođe su dovele do povećane akumulacije kasno eluirajućih pikova tokom čuvanja pod RH4 uslovima (40°C, 75% relativna vlažnost), sto je mereno gel hromatografijom (SEC). Videti SL.1K.

[0038] Takođe su testirani efekti različitih ekscipijenasa (100 mM NaCl, 7% saharoza, 7% trehaloza i 6% manitol) na temperaturu odmotavanja (SL. 2A) i opalescenciju (SL. 2B). Sedmoprocentna saharoza dodavana je kako bi se postigla izotoničnost formulacija, smanjila opalescencija i povećala termička stabilnost (povećanje Tm). Takođe su testirani efekti surfaktanata polisorbat-20 (PS20), polisorbat-80 (PS80) i PLURONIC® F-68 na agregaciju (SL.

3A i 3B) i opalescenciju (SL. 3C). Polisorbat 80 dodavan je kako bi se maksimalno smanjila agregacija usled stresa izazvanog agitacijom.

[0039] Ovi rezultati doveli su do izmene poželjnog puferskog sistema. Anti IL-23 je pokazao samoasocijaciju i opalescenciju pri visokim koncentracijama u citratu pH 5,5 i pH 6,0. Zamena citrata acetatom (pH 5,5) ili histidinom (pH 6,0) maksimalno je smanjila opalescenciju ne ugrožavajući termičku i biohemijsku stabilnost. Saharoza (7%) je dodavana da bi se postigla izotoničnost formulacija. Saharoza (7%) je takođe smanjila opalescenciju i povećala termičku stabilnost (povećanje Tm) i smanjila gubitak procenata monomera tokom studija ubrzane stabilnosti (podaci nisu prikazani). Polisorbat 80 (0,05%) dodavan je kako bi se maksimalno smanjila agregacija izazvana stresom usled mućkanja.

[0040] Formulacija na bazi histidina koja sadrži 10 mM histidin (pH 6,0), 7% saharozu i 0,05% PS-80 odabrana je kao poželjna formulacija hum13B8-b. Različita svojstva rastvora, uključujući viskoznost, gustinu, osmolarnost i čestice, određena su za formulaciju sa 10 mM histidina (pH 6,0). Videti tabelu 1. Zabeležena viskoznost na sobnoj temperaturi (5,65 cP) prihvatljiva je za upotrebu u prethodno napunjenim špricevima i auto-injektorima.

Tabela 1

V. Stabilnost formulacija rastvora visokih koncentracija humanizovanog anti-IL-23p19 antitela 13B8-b

[0041] Dugoročna stabilnost odabranih formulacija prema predmetnom pronalasku proučavana je nakon 3-24 meseca čuvanja pod različitim uslovima čuvanja. Uzorci su inkubirani u staklenim bočicama od 2 ml (SL. 4), u kesama od 30 ml (skladištenje u balku) (SL. 5 i 6), ili u prethodno napunjenim špricevima (komercijalno pakovanje za jednu dozu) (SL. 7) na različitim temperaturama i nivoima vlažnosti. Uzorci su analizirani metodama kao što su gel hromatografija visokih performansi (HP-SEC), jonoizmenjivačka hromatografija (HP-IEX), SDS kapilarna elektroforeza (CE-SDS, redukujuća i neredukujuća), mapiranjem peptida, kako bi se utvrdilo prisustvo degradacije i agregacije. Stabilnost antitela merena je diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC). Biološka aktivnost procenjivana je IL-23 vezujućim ELISA testom i ćelijskim funkcionalnim testom. Koncentracija antitela određivana je UV apsorpcijom na 280 nm. Opalescencija je određivana merenjem optičke gustine na 350 nm (OD350). Rezultati su obezbeđeni na SL.4 - 7.

[0042] U prvoj grupi eksperimenata, 1,5 ml uzoraka je stavljano u staklene bočice od 2,0 ml i analizirano nakon čuvanja u različitim uslovima. Rezultati su predstavljeni na SL.4. U uzorcima koji su čuvani na 5°C i pri vlažnosti sredine koja odgovara tipičnim uslovima čuvanja u frižideru, uočeno je vrlo malo degradacije ili agregacije. SL. 4A - 4F. Uslovi ubrzane degradacije, kao što su RH4 uslovi (40°C, 75% relativna vlažnost), koji su bili uključeni kao pozitivna kontrola za degradaciju uzoraka, pokazali su očekivani gubitak monomera i porast proizvoda degradacije i agregacije počevši već od prve vremenske tačke (jedan mesec). SL. 4A -4F. Opalescencija je bila stabilna na 5°C (SL. 4G), ali se povećavala na 25°C i 40°C (SL. 4H i 4I). Oksidacija je bila slično minimalna na 5°C, ali značajna pod RH4 uslovima ili na 40°C. SL.

4J i 4K. Ovi rezultati pokazuju da je, iako je u eksperimentima bilo moguće detektovati degradaciju određenim brojem testova, o čemu svedoče, npr., RH4 rezultati, čuvanje pod uslovima kao što su uslovi u frižideru dovodilo do malo, ili ni malo gubitka kvaliteta proizvoda, tokom najmanje oko devet meseci čuvanja.

[0043] U drugoj grupi eksperimenata, uzorci su stavljani u etilen-vinil-acetatne (EVA) Celsius® Pak (Sartorius, Goettingen, Nemačka) kese od 30 mL sa fluidnim kontaktnim slojem i analizirane nakon čuvanja u različitim uslovima. Rezultati su predstavljeni na SL. 5 i 6. Ovi eksperimenti su primarno dizajnirani tako da se proceni stabilnost supstance leka pod tipičnim uslovima skladištenja u balku.

[0044] Uzorci za skladištenje u balku su čuvani zamrznuti pod tri tipa uslova (-80°, -45°C i -20°C) i ohlađeni, na temperaturi frižidera (2°- 8°C). Reprezentativni podaci su obezbeđeni na SL. 5 za uzorke čuvane na 5°C (± 3°C) i -45°C najduže do 18 meseci. Blaga povećanja koncentracije bila su uočena tokom 12 meseci čuvanja (SL. 5A), verovatno zbog isparavanja iz kesa za čuvanje kod uzoraka na 5°C. Što se tiče biološke aktivnosti, nisu uočeni značajni trendovi (SL. 5B i 5C) i nečistoće u vezi sa proteinima, proizvodi degradacije i agregati su generalno bili u okvirima specifikacija tokom i do 18 meseci, naročito za uzorke zamrznute na -45°C (SL.5D - 5L).

[0045] Stabilnost pri skladištenju u balku takođe je procenjivana na višim temperaturama. Reprezentativni podaci su obezbeđeni na SL. 6 za uzorke čuvane na 5°C (± 3°C), 25°C, 25H, 40°C i RH4 najduže do 12 meseci. Ohlađeni uzorci su pokazivali stabilnu biološku aktivnost tokom 12 meseci, dok su uzorci čuvani na sobnoj temperaturi (25°) zapravo pokazali očigledna povećanja u biološkoj potenciji, što je efekat koji se verovatno javlja zbog neto koncentracije usled isparavanja. SL.6A i 6B. uzorci su bili stabilni tokom 12 meseci kada su čuvani na 5°C, ali su se nečistoće u vezi sa proteinima (proizvodi degradacije i agregati) povećavale tokom vremena za uzorke čuvane na 25°C i 25H, i povećavale dramatično za uzorke koji su čuvani na 40°C i RH4 (uslovi ubrzane degradacije). SL.6C - 6K.

[0046] U trećoj grupi eksperimenata, 1 ml uzoraka formulacije sa 100 mg/ml antitela stavljano je u špriceve (BD Hypak Physiolis prethodno napunjeni špricevi) i analizirano nakon čuvanja pod različitim uslovima. Rezultati su prikazani na SL. 7 za uzorke čuvane na 5°C (± 3°C) tokom najviše 24 meseca. Koncentracije antitela ostajale su suštinski nepromenjene (SL. 7A), kao i biološka aktivnost (SL. 7B i 7C). Nivoi vrsta visoke molekulske težine, procenta monomera, vrsta visoke molekulske težine, procenta glavnog pika antitela, kiselih varijanti, baznih varijanti, vrsta post glavnog pika, glavnog IgG, i teških i lakih lanaca (SL. 7D - 7L, redom) su svi ostali suštinski stabilni tokom najmanje 12 – 24 meseca.

[0047] Eksperimenti u vezi sa dugoročnom stabilnošću, predstavljeni na SL.4 - 7 pokazuju da je formulacija hum13B8-b sa histidinom, prema predmetnom pronalasku stabilna, što se tiče i biološke aktivnosti i fizičkog integriteta pri visokim koncentracijama antitela, pod tipičnim uslovima čuvanja, kako zamrznuta u rastvoru, u rastvoru u balku, tako i ohlađena u frižideru, recimo, u prethodno napunjenom špricu.

[0048] Svrha rezultata dobijenih pod uslovima ubrzane degradacije, kao što su RH4 i 25H, i drugi uslovi kada je temperatura povišena, je samo da ilustruju moguće proizvode i puteve razgradnje za antitelo hum13B8-b, a ne odražavaju stope degradacije antitela namenjenog za terapeutsku upotrebu. Glavni putevi degradacije za hum13B8-b koji su nađeni za vreme uslova ubrzane degradacije uključuju gubitak čistoće pokazan pomoću CE-SDS, povećanja HMW i LMW vrsta i smanjenje procenta monomera uočeno pomoću HP-SEC. Pored toga, pomoću HP-IEX otkrivena su povećanja kiselih varijanti i vrsta post-glavnog pika, sa smanjenjem baznih varijanti i glavnog pika. Produženo čuvanje na povišenoj temperaturi formulacija rastvora lekova sa antitelima, kao što je hum13B8-b veoma je malo verovatno. Verovatno je da se dugoročno čuvanje hum13B8-b, na primer, odvija u CELSIUS®-Pak kesama zamrznutim na -45°C, što su uslovi pod kojima se očekuje da obeležja kvaliteta ostanu stabilna tokom najmanje 18 meseci. Verovatno je da će se prethodno napunjeni špricevi ili auto-injektori koji sadrže pojedinačne doze hum13B8-b čuvati na oko 5°C (± 3°C), i takođe se očekuje da će ostajati stabilni tokom najmanje 18 meseci.

VI. Doziranje i primena

[0049] Iako su formulacije rastvora visoke koncentracije prema predmetnom pronalasku naročito pogodne za potkožnu primenu visoke doze, ove formulacije mogu takođe da budu primenjene i na druge načine. Pogodni putevi primene mogu, na primer, da uključe oralnu, rektalnu, transmukoznu ili intestinalnu primenu; parenteralno isporučivanje, uključujući intramuskularne, intradermalne, intramedularne injekcije, kao i intratekalne, direktne intraventrikularne, intravenske, intraperitonealne, intranazalne ili intraokularne injekcije.

[0050] Alternativno, antitelo može da se primeni pre lokalno nego sistemski, na primer, injeciranjem antitela direktno u artritični zglob ili u patogenom indukovanu leziju koju odlikuje imunopatologija, često kao formulaciju u vidu depoa ili sa produženim oslobađanjem. Uz to, antitelo može da se primeni u sistemu ciljane isporuke leka, na primer, u lipozomu koji je obložen tkivno specifičnim antitelom, i koji za cilj ima artritični zglob ili patogenom indukovanu leziju koju odlikuje imunopatologija. Lipozomi će biti ciljano usmereni ka i selektivno preuzeti od strane pogođenog tkiva.

[0051] Potkožna primena može da se izvodi injekcijom pomoću šprica, auto-injektora i injekcione olovke ili injekcionog uređaja bez igle.

[0052] Iako su formulacije rastvora sa visokim koncentracijama terapeutskih antitela prema predmetnom pronalasku od naročite koristi za upotrebe u kojima je neophodna visoka koncentracija antitela, nema razloga da se te formulacije ne koriste i pri nižim koncentracijama u okolnostima kada visoke koncentracije nisu neophodne ili poželjne. Niže koncentracije antitela mogu da budu korisne za potkožnu primenu niskih doza, ili pri drugim načinima primene (kao što je intravenska primena) gde je zapremina koja može da se isporuči značajno veća od 1 ml. Takve niže koncentracije mogu da uključuju 60, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1 mg/ml ili manje.

[0053] Odabiranje režima primene za terapeutsko sredstvo zavisi od nekoliko faktora, uključujući stepen prometa u serumu ili tkivu datog entiteta, nivo simptoma, imunogenost entiteta i pristupačnost ciljnih ćelija u biološkoj matrici. Poželjno, režim primene maksimalno povećava količinu terapeutskog sredstva isporučenog pacijentu, u skladu sa prihvatljivim nivoom sporednih dejstava. U skladu s tim, količina isporučenog biološkog materijala zavisi delom od konkretnog entiteta i ozbiljnosti stanja koje se leči. Dostupne su smernice pri odabiru odgovarajućih doza antitela, citokina i malih molekula. Videti, npr., Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios ScientificPub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med.348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med.341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med.344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602; Physicians’ Desk Reference 2003 (Physicians’ Desk Reference, 57th Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002).

[0054] Određivanje odgovarajuće doze obavljaju klinički lekari, npr., koristeći parametre ili faktore za koje se u tehnici zna ili sumnja da utiču na lečenje ili se predviđa da utiču na lečenje. Odgovarajuća doza ("terapeutski efikasna količina") proteina zavisiće, na primer, od stanja koje treba da se leči, ozbiljnosti i toka tog stanja, od toga da li se protein primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na protein, od vrste proteina koji se koristi i od procene nadležnog lekara. U nekim okolnostima, bira se niska početna doza i povećava se u malim koracima nakon toga, dok se ne postigne željena ili optimalna terapeutska korist u odnosu na bilo koja negativna sporedna dejstva. Važna dijagnostička merenja uključuju merenja simptoma, npr., inflamacije ili nivo proizvedenih inflamatornih citokina. Protein se pogodno primenjuje kod pacijenta jednokratno ili višekratno. Protein može da se primenjuje sam ili zajedno sa drugim lekovima ili terapijama.

[0055] Antitela mogu da budu primenjena kontinuiranom infuzijom ili dozama u određenim intervalima, npr., jednom dnevno, 1-7 puta nedeljno, jednom nedeljno, na dve nedelje, mesečno, dvomesečno, kvartalno, polugodišnje ili godišnje, itd. Poželjni dozni protokol je onaj koji uključuje maksimalnu dozu ili učestalost doze kojom se izbegavaju značajna, neželjena sporedna dejstva. Ukupna nedeljna doza je u principu najmanje 0,05 µg/kg, 0,2 µg/kg, 0,5 µg/kg, 1 µg/kg, 10 µg/kg, 100 µg/kg, 0,2 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 10 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg telesne mase ili više. Videti, npr., Yang et al. (2003) New Engl. J. Med. 349:427-434; Herold et al. (2002) New Engl. J. Med.346:1692-1698; Liu et al. (1999) J. Neurol. Neurosurg. Psych. 67:451-456; Portielji et al. (20003) Cancer Immunol. Immunother.52:133-144.

VII. Upotrebe

[0056] Predmetni pronalazak obezbeđuje formulacije rastvora visoke koncentracije antihumanog IL-23p19 mAb hum13B8-b za upotrebu u lečenju inflamatornih poremećaja i stanja, npr., centralnog nervnog sistema, perifernog nervnog sistema i gastrointestinalnog trakta, kao i autoimunih i proliferativnih poremećaja.

[0057] Formulacije prema predmetnom pronalasku mogu da se upotrebljavaju u lečenju npr., multiple skleroze (MS), uključujući relapsno-remitentnu MS i primarno-progresivnu MS, Alchajmerove bolesti, amiotrofične lateralne skleroze (takođe poznata i kao ALS; Lu Gerigova bolest), ishemijske povrede mozga, prionskih bolesti i demencije povezane sa HIV-om, kao i neuropatijskog bola, posttraumatskih neuropatija, Gilen-Bareovog sindroma (GBS), periferne polineuropatije i kod regeneracije nerava.

[0058] Formulacije prema predmetnom pronalasku takođe mogu da se upotrebljavaju u lečenju inflamatornih poremećaja creva, npr., Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, celijakije i sindroma iritabilnog creva. Takođe mogu da se upotrebljavaju u lečenju inflamatornih poremećaja kao što su bolest kalema protiv domaćina, psorijaza, atopijski dermatitis, artritis, uključujući reumatoidni artritis, osteoartritis i psorijazni artritis, autoimunih poremećaja kao što su sistemski lupus eritematozus i dijabetes tipa I i proliferativnih poremećaja kao što je kancer. Videti, npr., objave PCT patentnih prijava WO 04/081190; WO 04/071517; WO 00/53631; i WO 01/18051.

PRIMERI

Primer 1

Formulacija rastvora

[0059] U jednom primeru izvođenja, formulacija rastvora hum13B8-b prema predmetnom pronalasku, obezbeđena je kao rastvor antitela od 100 mg/mL u zapremini od 1,0 mL u prethodno napunjenom špricu ili auto-injektoru. Zapremina od 1,0 mL je ekstraktabilna zapremina, pre nego zapremina punjenja, koja može da uključi dovoljno viška da se osigura isporučivanje pune doze od 1,0 mL. Primer recepta za 1,0 ml formulacije prema predmetnom pronalasku obezbeđen je u tabeli 2. U jednom primeru izvođenja, serija proizvoda sa lekom priprema se u obimu od 15 - 30 L, ili oko 15000 - 30000 doza.

Tabela 2

[0060] U nekim primerima izvođenja, količine komponenti pufera (L-histidin i L-histidin HCl) malo odstupaju od težinskih količina navedenih u tabeli 2 zbog potrebe da se pH podesi na približno 6,0. Specifično, u nekim primerima izvođenja dodaje se više ili manje bilo kiselog, bilo baznog oblika histidina, u poređenju sa količinama iz tabele 2, kako bi se pH podesio na željenu vrednost od oko 6,0. U još nekim dodatnim primerima količine L-histidina i L-histidin HCl, približne vrednostima u tabeli 2, dodaju se da bi se dobio pH blizak, ali nešto viši od 6,0, a zatim se dodaje HCl kako bi se pH dobijene formulacije snizio do oko 6,0.

Primer 2

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC)

[0061] Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) Valeriana Plotnikova korišćena je za praćenje termičke stabilnosti antitela u formulacijama prema predmetnom pronalasku. DSC direktno meri promene toplote do kojih dolazi u proteinima tokom kontrolisanog porasta ili snižavanja temperature. Protein u rastvoru je u ravnoteži između nativne (uvijene) konformacije i svog denaturisanog (odmotanog) stanja. DSC se koristi da se odredi temperatura na kojoj je 50% proteina denaturisano (srednja tačka termalnog prelaza, Tm). Proteini sa višom Tmsu u principu stabilniji. Na primer, na SL.1E data je kriva SLDSC, koja prikazuje dva prelaza, prvi (Tm1) koji se javlja oko 64 - 70°C, u zavisnosti od pH, i drugi, glavni prelaz (Tm2) oko 80°C. Glavni prelaz može da se pripiše odmotavanju Fc fragmenta. Termički događaji koji prethode glavnom prelazu (tj. na nižoj temperaturi) verovatno su posledica odmotavanja nekoliko drugih domena u okviru antitela (npr. Fab), što je u skladu sa očekivanim strukturnim elementima IgG1 antitela, opisanim u literaturi. Vermeer (2000) Biophys. J.78:394.

Primer 3

Ekskluziona hromatografija visokih performansi (HP-SEC)

[0062] Procenat vrsta visoke molekulske težine (HMW), vrsta niske molekulske težine (LMW) i monomera u hum13B8-b formulacijama prema predmetnom pronalasku detektovani su pomoću HP-SEC. Testirani rastvor je razblažen i razdvojen pomoću HPLC-a koristeći ekskluzionu kolonu (YMC-pack Diol-200, 200Å veličina pore, 300 x 8.0 mm, 5 µm, ili ekvivalentnu; YMC Co. Ltd., Kyoto, Japan). Površine pika su korišćene da bi se odredio procenat monomera, HMW vrsta i LMW vrsta.

[0063] Elucioni pikovi iz SEC okarakterisani su upotrebom višeugaonog rasipanja laserske svetlosti (SEC-MALLS), koje može da se koristi da bi se procenila molekulska težina i da bi se pratili agregati. Nakon razdvajanja monomerskog pika od fragmenata i agregata na SEC koloni, uzorak prolazi kroz ultraljubičasti (UV) detektor, MALLS i detektor indeksa refrakcije (RI), što omogućava izračunavanje koncentracije analita i zatim, procenu njegove molekulske težine (MW). Intenzitet rasute svetlosti (detektovan pomoću MALLS) proporcionalan je proizvodu koncentracije proteina (određene pomoću RI) i molekulske težine. SEC-MALLS prikazuje preovlađujući glavni pik molekulske težine od približno 138 kDa. Ovo sasvim dobro odgovara izračunatoj teorijskoj molekulskoj težini monomera hum13B8-b, a takođe i masi monomera hum13B8-b koja je detektovana upotrebom masene spektrometrije, uzimajući u obzir hromatografsku rezoluciju SEC i tačnost detekcije rasipanja svetlosti. Vrsta visoke molekulske težine (HMW1), koja ima molekulsku težinu od približno 300 kDa, verovatno predstavlja vrstu dimera. Drugi HMW pik (HMW2), koji se ne uočava u svim serijama, sadrži vrstu sa procenjenom molekulskom težinom od približno 465 kDa, što odgovara vrsti trimera. Detektovana je vrsta niske molekulske težine (LMW) sa približnom molekulskom težinom od 108 - 117 kDa, koja može da predstavlja proizvod fragmentacije, na primer, proizvod fragmentacije u regionu zgloba.

Primer 4

Dinamičko rasipanje svetlosti (DLS)

[0064] Dinamičko rasipanje svetlosti (DLS) je tehnika koja može da obezbedi uvid u profil raspodele po veličini za monoklonska antitela u opsegu od 0,5 nm do 6 µm u rastvoru. Monoklonsko antitelo hum13B8-b prikazuje prosečni hidrodinamički dijametar od približno 9,5 nm po intenzitetu (i 6,5 nm po zapremini). Ovo je u skladu sa vrednostima za druga monoklonska antitela. Formulacije sa višom jonskom snagom teže da imaju niže hidrodinamičke dijametre nego formulacije niske jonske snage i na njih mogu da utiču drugi parametri rastvora, kao što su pufer i pH. Videti SL.1I i 1J. Antitela u formulacijama prema predmetnom pronalasku suštinski su monodisperzna. Hidrodinamički dijametar antitela prema predmetnom pronalasku je reverzibilan, o čemu svedoče eksperimenti u kojima se antitelo razblažuje puferom više ili niže jonske snage (podaci nisu prikazani). Ovi rezultati sugerišu da će se hidrodinamički dijametar uravnotežiti sa okolinom, lokalno na mestu injeciranja, kada se primeni na subjekta.

Primer 5

Katjon-izmenjivačka hromatografija visokih performansi (HP-IEX)

[0065] Naelektrisane varijante hum13B8-b detektovane su pomoću metode HP-IEX, koja se oslanja na elektrostatičke interakcije između proteina u uzorku i naelektrisanja imobilisanih na smoli. Pozitivno naelektrisane varijante hum13B8-b vezuju se za negativno naelektrisanu smolu izmenjivačke kolone slabih katjona (Dionex ProPac WCX-10, 4 x 250 mm, ili ekvivalentna; Thermo Scientific, Bannockburn, Ill., SAD) i razdvajaju pomoću HPLC. Antitelo se eluira povećavanjem pH i koncentracije soli, koje efikasno smanjuje naelektrisanje varijanti antitela i zamenjuje ih jonima ekvivalentnog naelektrisanja. Prisustvo hum13B8-b i varijanti u eluentu određuje se UV detekcijom. Površine pikova se koriste kako bi se odredili procenti kiselih varijanti, glavnog pika, post-glavnog pika i baznih varijanti.

[0066] Sve vrste detektovane pre glavnog pika koji se eluira približno na 23 minuta, označene su kao kisele varijante, dok se one koje se eluiraju nakon glavnog pika označavaju kao bazne varijante. Analiza kiselih varijanti i kiselih pikova otkriva da one nemaju N- ili C-terminalne modifikacije, dok glavni pik pokazuje kompletnu degradaciju lizina na C-terminusu, i kompletno obrazovanje piroglutamata na N-terminusu. Glavni pik zadržava punu biološku aktivnost. Postglavni pik pokazuje kompletnu degradaciju lizina i ograničenu α-amidaciju prolina na C-terminusu, kompletno obrazovanje piroglutamata na N-terminusu, oksidaciju Met251 i Met427, i pokazuje smanjenu potenciju, mereno vezujućim ELISA testom. Bazni pik 1 pokazuje kompletnu degradaciju lizina i izvesnu α-amidaciju prolina na C-terminusu, i kompletno obrazovanje piroglutamata na N-terminusu. Bazni pik 3, najzastupljeniji od baznih pikova, pokazuje kompletnu degradaciju lizina na C-terminusu i nekompletno obrazovanje piroglutamata na N-terminusu. Bazne varijante pokazuju kompletnu degradaciju lizina i varijabilne nivoe αamidacije prolina na C-terminusu i nekompletno do kompletno obrazovanje piroglutamata na N-terminusu. Većina naelektrisanih varijanti zadržava biološku aktivnost.

Primer 6

Mapiranje peptida

[0067] Mapiranje peptida obezbeđuje informacije o primarnoj strukturi hum13B8-b, i može da se koristi kako bi se procenilo da li je došlo do oksidacije. Da bi se povećala pokrivenost sekvence, za karakterizaciju hum13B8-b korišćene su dve različite enzimske peptidne mape. Mapiranje peptida nakon digestije endoproteinazom Lys-C je prvo obavljeno. Peptidna mapa je dobijena tretiranjem uzorka hum13B8-b guanidin hidrohloridom kako bi se protein denaturisao i 1,4-ditiotreitolom (DTT), kako bi se redukovale disulfidne veze. Uzorci su zatim tretirani jodoacetamidom (IAM) da bi se alkilovali slobodni tioli koji nastaju tokom DTT tretmana. Uzorci su zatim digestirani endoproteinazom Lys-C. Analiza rezultujućih peptida izvršena je pomoću reverzno-fazne tečne hromatografije (Xbridge C18, 5 µm, veličina pore 130 Å, 2,1x150 mm ili ekvivalentno; Waters Corporation, Milford, Mass., SAD) u sprezi sa masenom spektrometrijom elektrospreja. Peptidna sekvenca poreklom od lakih (L) i teških (H) lanaca, kao i njihove mase koje su detektovane upotrebom masene spektrometrije, dati su u Tabeli 3. Vremena zadržavanja određena su apsorpcijom u ultraljubičastom spektru na 214 nm tokom hromatografije u trajanju od 90 min. Mase su korigovane za alkilaciju cisteinskih ostataka tako što je dodavana neto masa od 57 Da po IAM-alkilovanom cisteinskom ostatku. Pet peptida poreklom iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR) hum13B8-b od naročitog su značaja. Uobičajeni posttranslaciono modifikovani peptidi, kao što su peptid teškog lanca sa piroglutamatom na N-terminusu, peptid teškog lanca sa uklonjenim lizinom na C-terminusu i nekoliko peptida oksidovanih na metioninu ili deamidovanih, takođe su uočeni. U CDR regionima molekula nije nađena ni jedna od ovih modifikacija. Rutinski eksperimenti peptidnog mapiranja mogu da se izvedu bez korišćenja masene spektrometrije, a vremena zadržavanja uočenih pikova mogu da se koriste za poređenje uzoraka, kao što su uzorak za određivanje stabilnosti (test) i kontrolni (referentni) uzorak.

[0068] Drugi postupak mapiranja peptida, koji koristi digestiju tripsinom, razvijen je kako bi se dodala pokrivenost ostataka 64 - 120 teškog lanca, koji nisu bili dobro prezentovani Lys-C peptidnom mapom. Izuzev mesta degradacije sa C-terminalne strane lizinskih ostataka, koji je zajednički za proteinazu C, tripsin takođe cepa C-terminalni kraj argininskih ostataka (osim ako je sledeći ostatak P), čime se dobija set manjih peptida. Peptidi koji nastaju od ostataka 64 do 120 teškog lanca detektovani su upotrebom reverzno-fazne tečne hromatografije u sprezi sa detekcijom UV apsorbancije i masenom spektrometrijom (za anotaciju pika). Relevantni peptidni fragmenti hum13B8-b nastali posle delovanja tripsina uključeni su u tabelu 3.

Tabela 3

Primer 7

Koncentracija proteina na osnovu UV spektroskopije

[0069] Koncentracija proteina antitela hum13B8-b u formulacijama rastvora prema predmetnom pronalasku određena je UV spektroskopijom. Određivanje se zasniva na apsorpciji UV svetlosti na 280 nm od strane aminokiselina kao što su triptofanski, tirozinski i cisteinski ostaci. Apsorbancija na 280 nm koriguje se za vrednost rasipanja svetlosti upotrebom apsorbancije na 320 nm. Postupak uključuje gravimetrijsko razblaživanje uzorka u vodi i beleženje UV spektra kako bi se utvrdila apsorbancija na 280 nm i apsorbancija na 320 nm. Ove vrednosti apsorbancije i eksperimentalno određeni koeficijent ekstinkcije od 1,44 mL mg<-1>cm<-1>korišćeni su da se izračuna koncentracija hum13B8-b.

Primer 8

Biološka aktivnost –funkcionalni ćelijski test

[0070] Funkcionalni ćelijski test je razvijen kako bi se procenila sposobnost hum13B8-b u formulacijama prema predmetnom pronalasku da blokira biološke aktivnosti humanog IL-23. Ovaj esej procenjuje sposobnost hum13B8-b da inhibira IL- 23-indukovanu STAT3 aktivaciju u IL-23 responsivnoj ćelijskoj liniji (Kit 225). Serijska razblaženja hum13B8-b referentnog materijala i testirani uzorak, inkubirani su sa fiksiranom koncentracijom humanog IL-23, što je praćeno inkubacijom sa Kit225 IL-23- responsivnim ćelijama. Inhibicija STAT3 fosforilacije pomoću hum13B8-b merena je u lizatima ćelija pomoću ELISA testa koji koristi par antitela STAT3 za hvatanje i anti-p-STAT3 za detekciju, nakon čega je sledila inkubacija sa anti-IgG konjugovanim sa peroksidazom i dodavanje hemiluminescentnog supstrata. Kriva inhibitornog odgovora ("standardna kriva") je formirana upotrebom nelinearne regresije četvoroparametarskog logističkog fitovanja, gde IC50 vrednost predstavlja koncentraciju anti-IL23 koja inhibira 50% maksimalnog odgovora. Relativna potencija testiranog uzorka procenjivana je poređenjem krive inhibitornog odgovora testiranog uzorka sa standardnom krivom reference i izračunavana kao procenat reference. Vrednosti relativne potencije za višestruke replikate istog uzorka kombinovani su u jedinstvenu vrednost za izveštavanje - geometrijsku sredinu relativne potencije.

Primer 9

Biološka aktivnost – Vezujući ELISA test

[0071] Afinitet hum13B8-b u formulacijama prema predmetnom pronalasku za humani IL-23 procenjen je ravnotežnim vezujućim ELISA testom, u kome se serijska razblaženja referentnog materijala i uzoraka koji se testiraju nanose na ploče za test koje su obložene humanim citokinom IL-23. Ovaj test može da se koristi, na primer, kao bi se procenilo zadržavanje biološke aktivnosti u različitim potencijalnim terapeutskim formulacijama. Relativna potencija testiranog uzorka je procenjena poređenjem krive odgovora na dozu za testirani uzorak sa krivom odgovora na dozu za referentni materijal i izračunata kao procenat reference.

[0072] ELISA testovi se izvode prema postupcima dobro poznatim u tehnici. Ukratko, serijska razblaženja hum13B8-b u formulaciji prema predmetnom pronalasku dodaju se u bunarčiće mikrotitar ploče koja je prethodno obložena humanim proteinom IL-23, a zatim blokirana. Nakon perioda inkubacije, bunarčići su ispirani i dodavan je reagens sa kozijim anti-humanim IgG (Fc) detekcionim antitelom konjugovanim sa peroksidazom. Bunarčići su ponovo ispirani i dodavan je hemiluminescentni supstrat za peroksidazu. Signal je očitavan hemiluminescencijom. Sigmoidna kriva odgovora na dozu je formirana upotrebom nelinearne regresije četvoroparametarskog logističkog fitovanja, gde EC50 vrednost predstavlja koncentraciju potrebnu da se postigne 50% maksimalnog signala vezivanja IL-23. Relativna biološka potencija je izračunavana poređenjem rezultata dobijenih sa testiranim uzorcima sa standardnom krivom dobijenom na osnovu nivoa signala dobijenih sa referentnim uzorkom. Rezultati su predstavljeni kao procenat biološke potencije u poređenju sa rastvorom referentnog antitela. Vrednosti relativne potencije za višestruke replikate istog uzorka kombinovani su u jedinstvenu vrednost za izveštavanje - geometrijsku sredinu relativne potencije.

Primer 10

SDS kapilarna elektroforeza (CE-SDS)

[0073] Kapilarna elektroforeza sa natrijum dodecil sulfatom (CE-SDS) razdvaja proteine na osnovu veličine. CE-SDS može da se izvodi pod neredukujućim uslovima ili pod redukujućim uslovima. Neredukujuća CE-SDS razdvaja intaktna antitela od drugih vrsta u uzorku, dok redukujuća CE-SDS razdvaja disocirane teške i lake lance jedne od drugih, a takođe i od drugih potencijalnih vrsta u uzorku. Videti, npr., Rustandi et al. (2008) Electrophoresis 29:3612.

[0074] Neredukujuća CE-SDS uključuje toplotnu denaturaciju uzoraka antitela hum13B8-b u prisustvu N-etilmaleimida, kako bi slobodni cisteinski ostaci bili alkilovani, i SDS. Nakon toga, uzorak se razdvaja u kapilari koja sadrži zamenjivi SDS polimernu matricu, koja obezbeđuje selektivnost prosejavanja pri razdvajanju. Svi pikovi u testiranom uzorku se integrišu i površine pikova se koriste kako bi se odredio procenat glavnog IgG (intaktnog antitela) u uzorku.

[0075] Redukujuća CE-SDS uključuje toplotnu denaturaciju uzoraka antitela hum13B8-b u prisustvu 2-merkaptoetanola, da bi se redukovale disulfidne veze, i SDS. Nakon toga, uzorak se razdvaja u kapilari koja sadrži zamenjivu SDS polimernu matricu, koja obezbeđuje selektivnost prosejavanja pri razdvajanju. Svi pikovi u testiranom uzorku su integrisani i površine pikova su upotrebljene da se odredi procenat intaktnih teških i lakih lanaca u hum13B8-b.

Primer 11

Analitičko ultracentrifugiranje sa određivanjem brzine taloženja (SV-AUC)

[0076] Metod SV-AUC je korišćen kako bi se istražila kvaternarna struktura hum13B8-b antitela u formulacijama prema predmetnom pronalasku. SV-AUC meri stopu kojom se molekuli talože kao odgovor na centrifugalnu silu. Ova stopa sedimentacije obezbeđuje informacije o molekulskoj težini molekula koji su prisutni u uzorku. Hum13B8-b se pretežno taloži kao jedna vrsta sa koeficijentom sedimentacije (s20,w) od 7,0S. Ova vrsta ima procenjenu molekulsku težinu od približno 150 kDa, što je u skladu sa očekivanom molekulskom težinom monomera. Koeficijent trenja, koji zavisi od hidratacije i oblika makromolekula je sličan za različite lotove.

Primer 12

Produžena stabilnost formulacija antitela

[0077] Dodatni podaci o dugoročnoj stabilnosti dobijeni su za formulacije antitela prema predmetnom pronalasku. Primeri podataka o stabilnosti do 24 meseca, predstavljeni su u tabelama 4 - 9 u daljem tekstu, za lotove E i D.

Tabela 4

Tabela 5

Tabela 6

ND –nije detektovano; NQ –nije kvantifikovano; RH4 :40°C/75% relativna vlažnost Tabela 7

Tabela 8

Tabela 9

[0078] Tabela 10 navodi sekvence iz liste sekvenci.

Tabela 10

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Formulacija rastvora anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b, koja sadrži:

a) najmanje 50 mg/ml anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b;

b) 10 mM histidinskog pufera, pH 6,0;

c) 0.05% polisorbata 80; i

d) 7% saharoze,

pri čemu pomenuto antitelo hum13B8-b sadrži:

i) polipeptid lakog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 2; i

ii) polipeptid teškog lanca koji sadrži sekvencu SEQ ID NO: 1.

2. Formulacija rastvora prema patentnom zahtevu 1 koja sadrži najmanje 80 mg/ml anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b.

3. Formulacija rastvora prema patentnom zahtevu 2 koja sadrži najmanje 100 mg/ml anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b.

4. Formulacija rastvora prema patentnom zahtevu 1 koja sadrži 80 - 120 mg/ml anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b.

5. Formulacija rastvora prema patentnom zahtevu 4 koja sadrži 100 mg/ml anti-IL-23p19 antitela hum13B8-b.

6. Formulacija rastvora prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 5 za upotrebu u lečenju autoimune bolesti, inflamatorne bolesti ili proliferativnog poremećaja.

7. Formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 naznačena time što se formulacija primenjuje potkožno.

8. Formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7 naznačena time što se potkožna primena obavlja putem injekcije upotrebom šprica, auto-injektora, injekcione olovke ili injekcionog uređaja bez igle.

9. Formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 naznačena time što se formulacija primenjuje u kvartalnim intervalima.

10. Formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 6 naznačena time što je inflamatorna bolest psorijaza.