TARIFNAME ISLENMIS ANTI-IL-23Pl9 ANTIKORLARIN SOLÜSYON FORMÜLASYONLARI BULUSUN SAHASI Mevcut bulus, genel olarak terapötik antikorlarin yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlari ve bunlarin çesitli rahatsizliklarin tedavi edilmesinde kullanimlari ile ilgilidir. BULUSUN ALT YAPISI paylasilan p40 olmak üzere iki alt üniteden olusan bir heterodimerik sitokindir. Pl9 alt ünitesi IL-6, granülosit-koloni stimüle edici faktör (G-CSF) ve IL-12'nin p35 alt ünitesi ile yapisal olarak ilgilidir. IL-23, IL-l2 reseptörüne mahsus olan lL-23R ve IL-21 reseptörü ile paylasilan IL- 12Rßl olmak üzere iki alt ünite içeren bir heterodimerik reseptöre baglanarak sinyallemeye aracilik eder. Bir takim önceden yapilmis çalismalar, p40'ta (p40 nakavt fare; p40KO faresi) bir genetik eksikligin sonuçlarinin, örnegin bir p35KO faresinde p35 eksikligi ile, gözlemlenenlerden daha siddetli oldugunu göstermistir. Bu sonuçlar sonuç olarak 23'ün ekspresyonunu da önlediginin fark edilmesiyle açiklanmistir. Bakiniz, ( Infection Immunity 70:1936- 1948). P40 KO farelerinin kullanimi hakkindaki son çalismalar, hem IL-23 hem de IL- 12'nin blokajinin çesitli enflamatuar ve otoimmün hastaliklarina yönelik olarak bir etkili tedavi oldugunu göstermistir. Bununla birlikte, IL-12 ila p40'in blokajinin, 02422-P-0002 firsatçi mikrobiyal enfeksiyonlara karsi arttirilmis duyarlilik veya arttirilmis tümör riski gibi istenmeyen sistemik sonuçlara sahip oldugu görülür. Bowman et al. Buna göre, örnegin enfeksiyonla savasmada ve bagisiklik gözetiminde IL-12`nin faydali aktiviteleri ile çakismadan, IL-23'ün patojenik enflamatuar aktivitesi ile çakistigindan, IL-23'ün pl9 alt ünitesinin spesifik blokaji insan hastaliginin tedavisinde tercih edilir. Sitokin aktivitesini bloke etmek üzere terapötik antikorlar kullanilabilir. Antikorlarin yasayan organizma içinde bir terapötik ajan olarak kullanilmasinda önemli bir sinirlama antikorlarin immünojenikligidir. Insan olmayan türlerden türetilen monoklonal antikorlara yönelik olarak, insanlarda tekrarlanan kullanim, terapötik antikora karsi bir immün yanitinin üretimi ile sonuçlanir. Bu tür bir bagisiklik yaniti bir minimumda bir terapötik etkinlik kaybi ve potansiyel olarak bir ölümcül anafilaktik yanit ile sonuçlanir. Buna göre, hümanize edilmis veya tamamen insan antikorlari gibi insanlarda indirgenmis immünojeniklik antikorlari insan deneklerin tedavisine yönelik olarak tercih edilir. IL-23p19'a örnekleyici açiklanir. Insanlarda kullanima yönelik antikor ilaçlari, bunlarin sabit alanlarinin amino asit sekansinda veya bunlarin degisken alanlar içerisindeki çerçeve sekanslarinda bir miktar farklilik gösterebilir, ancak tipik olarak en dramatik olarak CDR sekanslarinda farklilik gösterirler. Ayni proteine, ayni polipeptide veya potansiyel olarak ayni epitopa bile baglanan antikorlar bile tamamen farkli CDR sekanslari içerebiliri Insanlarda kullanima yönelik terapötik antikorlar ayni zamanda, yine 02422-P-0002 potansiyel CDR sekanslarinda daha fazla çesitlilige yol açarak, insan germ hatti antikor dizisinden veya hümanize edilmis antikorlarda oldugu gibi, insan olmayan (örnegin, kemirgen) germ hatti antikor dizilerinden de elde edilebilir. Bu sekans farkliliklari, solüsyon içinde farkli stabiliteler ve solüsyon parametrelerine farkli yanit verebilirlik ile sonuçlanir. Ek olarak, amino asitlerin düzenlenmesindeki küçük degisiklikler veya bir veya birkaç amino asit tortusundaki degisiklikler, önemli ölçüde farkli antikor stabilitesi ve sekansa özgü bozulma yolaklarina karsi hassaslik ile sonuçlanabilir. Sonuç olarak, antikor stabilitesini optimize etmek üzere gerekli olan solüsyon kosullarinin öngörülmesi simdiki durumda mümkün degildir. Optimum solüsyon formülasyonunu belirlemek üzere her bir antikor ayri Antikorlar, ayni zamanda, örnegin hormonlar ve sitokinler gibi diger terapötik proteinler ile karsilastirildiginda, nispeten yüksek moleküler agirlikli proteinlerdir (~ 150.000 Da). Sonuç olarak, ilacin istenen molar konsantrasyonlarini elde etmek üzere çogu zaman nispeten yüksek agirlikta antikor ilaçlari miktari ile dozlama yapilmasi gereklidir. Ek olarak, bu kendi kendine uygulamaya olanak sagladigindan, çogu kez antikor ilaçlarinin deri altindan uygulanmasi istenir. Kendi kendine uygulama, örnegin damar içinden uygulamaya yönelik olarak tibbi bir tesise ziyaretler ile iliskili zaman ve masrafi önler. Deri altindan verim, pratikte bir enjeksiyon bölgesinde genel olarak yaklasik 1 ila 1.5 ml olan bir tek enjeksiyon halinde verilebilen solüsyon hacmi tarafindan sinirlandirilir. Deri altindan kendi kendine uygulama, tipik olarak, hastanin enjeksiyondan önce ilaci yeniden askiya alma ihtiyacini önlemek üzere, bir liyofilize formdan ziyade, ilacin bir sivi solüsyon formülasyonu ile doldurulmus bir önceden doldurulmus siringa veya otoenjektör kullanilarak yerine getirilir. Daha yüksek ilaç dozlarin verilmesine yönelik olarak, bu hacim sinirlamasi yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlarinin gelistirilmesine çok önem verir. Bununla birlikte, bu tür yüksek antikor konsantrasyonlari, makromoleküler yükleme etkileri ve arttirilmis protein-protein etkilesimleri sergilerler, bu, renk oynasimi, kendiliginden birlesme, toplanma, yayilma ve faz ayrilmasi gibi fiziksel 02422-P-0002 stabilitesizlikler ile sonuçlanir. Bu tür yüksek konsantrasyonlu antikor solüsyonlari ayni zamanda önceden doldurulmus siringalarda ve otoenjektör cihazlarda siringalanabilirligi indirgeyen yüksek viskozite (örnegin, 10 santipoiz) sergileyebilir. Antikor ilaçlari etkinlik ve tutarli dozlamayi garanti altina almak üzere depolama sirasinda stabil olmalidir, bu nedenle, seçilen formülasyonun yüksek konsantrasyon, berraklik ve kabul edilebilir viskozite gibi istenen özellikleri desteklemesi ve ayni zamanda, bu özellikleri ve ilaç etkinligini tipik depolama kosullari altinda bir kabul edilebilir sekilde uzun raf ömrü boyunca muhafaza etmesi de son derece önemlidir. Sonuç olarak, insan IL-23pl9'a baglanan antikorlar gibi, terapötik antikorlarin stabil, yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlarina yönelik ihtiyaç mevcuttur. Bu tür stabil solüsyon formülasyonlari tercih edildigi üzere, karsilik gelen ilaç ürününe yönelik bir uzun raf ömrü ile sonuçlanan, kendi kendine uygulamaya yönelik ilaçlarin depolanmasina yönelik tipik sartlar altinda, diger bir ifadeyle bir siringa içinde buzdolabi sicakliginda, aylar ila yillar boyunca stabilite sergileyecektir. Bu tür stabil, yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlari, antikor ilacinin, kendi kendine uygulama ile yüksek konsantrasyonlu deri alti enjeksiyonuna yönelik olarak paketlenmesine olanak saglayacaktir. Histidin tamponu pH 6, polisorbat 80 ve sükroz içeren terapötik antikorlarin Claus-Michael et al., (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, formülasyonlari USZO] 1/0229490'da açiklanir. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, hümanize edilmis anti-IL-23pl9 antikoru l3B8-b'nin ("huml3B8- b") yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlarini saglar. Antikor huml3B8-b, SEQ ID NO: 2 dizisine sahip iki özdes hafif zincir ve SEQ ID NO: 1 02422-P-0002 dizisine sahip iki özdes agir zincir içerir. Bir düzenlemede, solüsyon formülasyonu, a) en az 50 mg/ml anti-IL-23pl9 antikoru huml3B8-b; b) 10 mM histidin tamponu, pH 6.0; e) %005 polisorbat 80; ve d) %7 sükroz içerir, burada söz konusu antikor huml3B8-b asagidakileri içerir: i) SEQ ID NO: 2 dizisini içeren bir hafif zincir polipeptidi; ve ii) SEQ ID NO: 1 dizisini içeren bir agir zincir polipeptidi. Çesitli düzenlemelerde, mevcut bulusun solüsyon formülasyonlari en az 50, 80, mevcut bulusun solüsyon formülasyonlari yaklasik 80 - 120 mg/ml antikor hum13B8-b ve 100 mg/ml antikor hum13B8-b içerir. Baska bakis açisinda, bulus, bunlarla sinirli olmamak üzere, enflamatuar hastalik, otoimmün hastalik, proliferatif rahatsizliklar, kanser, enfeksiyöz hastaliklar (örnegin, kronik enfeksiyonlar dahil olmak üzere bakteriyel, mikobakteriyel, viral veya mantar enfeksiyonu), artrit, sedef hastaligi, psoriatik artrit, entezit, ankilozan spondilit, Crohn hastaligi ve ülseratif kolit dahil olmak üzere enflamatuar bagirsak hastaligi, çoklu skleroz, üveit, graft versus host hastaligi, sistemik lupus eritematoz ve diyabeti dahil eden rahatsizliklari tedavi etmek üzere kullanima yönelik olarak mevcut bulusun anti-IL-23pl9 antikor hum13B8-b'nin yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlari ile ilgilidir. Yine baska bakis açisinda, bulus, bu ayni rahatsizliklarin tedavisinde kullanima yönelik olarak bir ilacin imalatinda anti-1L-23p19 antikoru hum13B8-b'nin yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlarinin kullanimi ile ilgilidir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI SEKIL 1, hum13B8-b'yi içeren formülasyonlara yönelik optimal tampon ve pH kosullarini belirlemek üzere kullanilan verileri gösterir. SEKIL 1A, çesitli l 02422-P-0002 mg/mL antikor formülasyonlarina yönelik olarak, diferansiyel taramali kalorimetri (DSC) tarafindan belirlendigi üzere, yayilma sicakligini ve RP-HPLC tarafindan ölçüldügü üzere saflik yüzdesini gösterir ve SEKIL lB, birkaç farkli tampona (asetat, sitrat, fosfat ve Tris) yönelik olarak bir pH fonksiyonu olarak, HP-SEC tarafindan ölçüldügü üzere, monomer yüzdesini ve geç ayrisan piklerin yüzdesini gösterir. DSC ve HP-SEC'in kisa tartismalari sirasiyla Örnekler 2 ve 3'te saglanir. SEKILLER lC - lE, sirasiyla, renk oynasimi (OD350), dinamik isik saçilimi (DLS) tarafindan ölçüldügü üzere hidrodinamik boyut (nm) dagilimi ve DSC tarafindan belirlendigi üzere erime sicakligi dahil olmak üzere, pH`1n bir fonksiyonu olarak 10 mM sitrat formülasyonlarinin çesitli özelliklerini gösterir. DLS ve DSC'nin kisa tartismalari sirasiyla Örnekler 4 ve 2'de saglanir. SEKILLER IP ve 1G, yüksek performansli iyon degistirme kromatografisi (HP- yüzdesini ve ana tepe yüzdesini gösterir. HP-IEX'in kisa bir tartismasi Örnek 5'te saglanir. SEKIL lJ, DLS tarafindan belirlendigi üzere, daha konsantre antikor formülasyonlarina (50 ve 100 lmg/ml) yönelik olarak hidrodinamik boyut (nm) dagilimini gösterirken, SEKILLER lH ve 11, farkli pH'larda çesitli tamponlarda düsük konsantrasyonlu antikor formülasyonlarina (l mg/ml) yönelik olarak, sirasiyla, dinamik isik saçilimi (DLS) ile ölçüldügü üzere, renk oynasimi (OD350) ve hidrodinamik boyutu (nm) gösterir. DLS'nin kisa bir tartismasi Örnek 4'te saglanir. SEKIL lK, HP-SEC tarafindan belirlendigi üzere, zaman içinde farkli pH'larda çesitli tamponlarda geç ayrisan piklerin yüzdesini gösterir. HP-SEC'in kisa bir tartismasi Örnek 3'te saglanir. SEKILLER 2A ve 2B, sirasiyla, çesitli eksipiyanlar (100 mM NaCl, %7 sükroz, olarak, DSC tarafindan belirlendigi üzere, yayilma sicakligini ve renk oynasimindaki degisiklikleri gösterir. DS ilaç maddesine refere eder. DSC'nin kisa bir tartismasi Örnek 2'de saglanir. 02422-P-0002 SEKILLER 3A ve 3B, sirasiyla, HP-SEC tarafindan belirlendigi üzere, antikor yüzdesini ve erken ayrisan pik yüzdesini gösterir ve Sekil 3C, yüzey aktif varliginin veya yoklugunun bir fonksiyonu olarak, bes günlük çalkalamadan önce ve sonra, renk oynasimini gösterir. Yüzey aktif madde içermeyen (NS) numuneye yönelik 5 Günlük Çalkalama degeri gerçekte 3'ün üzerinde ve böylece ölçegin oldukça disidir. HP-SEC'in kisa bir tartismasi Örnek 3'te saglanir. SEKIL 4, çesitli kosullar altinda saklandiginda, 10 mM tampon, %7 sükroz ve stabilitesini gösterir. Numuneler, 2.0 ml'lik cam siselerde 1.5 mlîlik numuneler olarak saklanmistir. SEKIL 4A, 5 °C`de (ortam bagil nemi) veya RH4 kosullari altinda (40 °C, %75 bagil nem) saklandiginda, HP-SEC tarafindan ölçülen monomer antikor yüzdesi tarafindan yansitildigi üzere, 50 ve 100 mg/ml antikor preparasyonlarinin stabilitesini gösterir. HP-SEC'in kisa bir tartismasi Örnek 3'te saglanir. SEKILLER 4B - 4D, HP-SEC tarafindan belirlendigi üzere, sirasiyla monomer yüzdesi, HMW türleri ve LMW türlerinin grafikleridir, çesitli saklama kosullari altinda "25H" 25 °C, %60 bagi] nemde saklamaya refere eder. SEKILLER 4B - 4D,nin 0rdinatlar1n (zaman eksenleri) dogrusal olmadigini not ediniz. HP-SEC'in kisa bir tartismasi Örnek 3'te saglanir. SEKILLER 4E ve 4F, sirasiyla ana pik ve asidik varyantlarin yüzdelerinin ölçülmesiyle antikor stabilitesini izleyen HP-IEX deneylerinin sonuçlarinin grafikleridir. HP-IEX'in kisa bir tartismasi Örnek 5'te saglanir. sonraki isik oynasimi grafikleridir. SEKILLER 4] ve 4K, sirasiyla, RH4 (40 °C, haritalamasiyla ölçüldügü üzere, oksidasyonu gösterir. Peptit haritalamanin kisa bir tartismasi Örnek 6'da saglanir. SEKILLER 4L ve 4M, sirasiyla, baslangiç numunelerine ve 5 °C veya RH4 kosullarinda 4.5 ay saklanan numunelere yönelik olarak, asetat ve histidin 02422-P-0002 formülasyonlari hakkindaki DSC deneylerinden gelen yayilma grafikleridir. DSC'nin kisa bir tartismasi Örnek 2'de saglanir. mM asetat ve 10 mM histidin formülasyonlarinin stabiliteleri, HP-SEC tarafindan ölçüldügü üzere, monomer yüzdesi olarak ve yüksek moleküler agirlikli türlerin yüzdesi olarak ölçülmüstür. Stabilite 5 °C (±3 °C), 25H (25 °C, yönelik olarak ölçülmüstür. Sonuçlar SEKILLER 4A ve 4B'de sunulur. HP- SEC'in kisa bir tartismasi Örnek 3`te saglanir. SEKIL 5, 30 mL etilen-vinil-asetat (EVA) sivi temas katmani Celsius® Pak torbalarinda ilaç maddesi olarak saklandiginda mevcut bulusun antikor formülasyonlarina yönelik stabilite verilerini sunar. Veriler, 10 mM Histidin formülasyonlara yönelik olarak sunulur. SEKILLER 5A - SC, sirasiyla, üç farkli huml3B8-b (Parçalar A, B ve C) preparasyonuna yönelik olarak protein konsantrasyonu, biyolojik potens (hücre bazli fonksiyonel analiz tarafindan ölçüldügü üzere) ve biyolojik potens (ELISA tarafindan Ölçüldügü üzere) grafikleridir. Protein konsantrasyonu belirleme, hücre bazli fonksiyonel analizler ve ELISA'larin kisa tartismalari sirasiyla Örnekler 7, 8 ve 9'da saglanir. SEKILLER 5D - 5G, sirasiyla, asidik varyantlar, ana pik, ana pik sonrasi türler ve bazik varyantlarin yüzdelerinin ölçülmesiyle antikor stabilitesini izleyen HP-IEX deneylerinin sonuçlarinin grafikleridir. HP-IEX'in kisa bir tartismasi Örnek 5'te saglanir. SEKIL SH, HP-SEC tarafindan ölçüldügü üzere, monomer yüzdesini gösterir. HP- SEC'in kisa bir tartismasi Örnek 3`te saglanir. SEKILLER 51 ve SJ, sirasiyla, indirgeyici olmayan CE-SDS ile ana pikin yüzdesinin veya indirgeyici CE-SDS ile agir ve hafif zincirlerin yüzdesinin ölçülmesiyle safligi gösterir. CE-SDS'nin kisa bir tartismasi Örnek 10'da saglanir. SEKILLER 5K ve 5L, HP-SEC tarafindan ölçüldügü üzere, sirasiyla yüzde HMW ve LMW türlerini gösterir. HP-SEC'in kisa bir tartismasi Örnek 3'te saglanir. SEKIL 6, 30 mL etilen-vinil-asetat (EVA) sivi temas katmani Celsius® Pak torbalarinda ilaç maddesi olarak saklandiginda mevcut bulusun antikor 02422-P-0002 formülasyonlarina (antikor Parçalari A ve B) yönelik ek stabilite verileri sunar. antikor huml3B8-b içeren formülasyonlara yönelik olarak sunulur. SEKILLER 6A ve 6B, sirasiyla ELISA tarafindan ölçüldügü üzere ve hücre bazli fonksiyonel analiz tarafindan ölçüldügü üzere biyolojik potens grafikleridir. ELISA ve hücre bazli fonksiyonel analizlerin kisa tartismalari sirasiyla Örnekler 9 ve 8'de saglanir. SEKILLER 6C - 6E, çesitli saklama kosullari altinda HP-SEC tarafindan belirlendigi üzere sirasiyla monomer yüzdesi, HMW türleri ve LMW türlerinin yüzdelerinin grafikleridir. HP-SEC'in kisa bir tartismasi Örnek 3'te saglanir. SEKILLER 6F ve 6G, sirasiyla, indirgeyici olmayan CE-SDS ile ana pikin yüzdesinin veya indirgeyici CE-SDS ile agir ve hafif zincirlerin yüzdesinin ölçülmesiyle safligi gösterir. CE-SDS'nin kisa bir tartismasi Örnek 10`da saglanir. SEKILLER 6H - 6K, sirasiyla, asidik varyantlar, ana pik, ana pik sonrasi türler ve bazik varyantlarin yüzdelerinin ölçülmesiyle antikor stabilitesini izleyen HP-IEX deneylerinin sonuçlarinin grafikleridir. HP-IEX'in kisa bir tartismasi Örnek 5'te saglanir. SEKIL 7, 100 mg/ml antikor konsantrasyonunda ve 1.0 ml doldurma hacminde önceden doldurulmus siringalardaki birim dozlarda ilaç ürünü olarak 5 °C'de (3 ciC) saklandiginda mevcut bulusun antikor formülasyonlarina yönelik stabilite verileri sunar. SEKIL 7A, uv emilimi tarafindan belirlendigi üzere dört farkli huml3B8-b (Parçalar D, E. F, G ve H) preparasyonlarina yönelik protein konsantrasyonunun bir grafigidir. Protein konsantrasyonu belirlemelerinin kisa bir tartismasi Örnek 7'de saglanir. SEKILLER 7B ve 7C, dört farkli hum13B8-b (Parçalar E, F, G ve H) preparasyonuna yönelik olarak, sirasiyla, hücre bazli fonksiyonel analiz tarafindan ölçüldügü üzere ve ELISA tarafindan ölçüldügü üzere biyolojik potens grafikleridir. Hücre bazli fonksiyonel analizleri ve ELISA'larin kisa tartismalari sirasiyla Örnekler 8 ve 9'da saglanir. SEKILLER 7D - 7F, HP-SEC tarafindan belirlendigi üzere, sirasiyla HMW türleri, monomer ve LMW türlerinin yüzdesinin grafikleridir. HP-SEC'in kisa bir tartismasi Örnek 3'te saglanir. 02422-P-0002 SEKILLER 7G - 7J, sirasiyla, ana pik, asidik varyantlar, bazik varyantlar ve ana pik sonrasi türlerin yüzdelerinin Ölçülmesiyle antikor stabilitesini izleyen HP-IEX deneylerinin sonuçlarinin grafikleridir. HP-IEX'in kisa bir tartismasi Örnek 5'te saglanir. SEKILLER 7K ve 7L, sirasiyla, indirgeyici olmayan CE-SDS ile ana pikin yüzdesinin veya indirgeyici CE-SDS ile agir ve hafif Zincirlerin yüzdesinin ölçülmesiyle satligi gösterir. CE-SDS'nin kisa bir tartismasi Örnek lO'da saglanir. DETAYLI AÇIKLAMA Ekli istemler dahil olmak üzere, burada kullanildigi üzere, "bir", "bir" ve "bir" gibi tekil kelime formlari, baglam açikça aksini belirtmedigi sürece bunlarin karsilik gelen çogul referanslarini içerir. Asagidaki Tablo 10, bu basvuruda kullanilan sekans tanimlayicilarinin bir listesini saglar. Aksi belirtilmedigi sürece, burada refere edilen proteinler ve denekler, baska türlerden ziyade insan proteinleri ve insan denekleridir. Burada kullanildigi üzere, "SEKIL X", ayri ayri SEKILLER XA - XZ,nin tümüne toplu olarak refere eder. ve anjiyogenezin yani sira, örnegin, normal hücre bölünümünü tesvik eden, buna yönelik olarak gerekli olan veya bunlar ile spesifik olarak iliskili olan bir aktiviteyi kapsar. Burada kullanildigi üzere, "çok degisken bölge" terimi, antijen baglanmasindan sorumlu olan bir antikorun amino asit kalintilarina refere eder. Çok degisken bölge, hafif Zincirli degisken alandaki bir "tamamlayicilik belirleme bölgesinden" veya "CDR"den gelen amino asit kalintilarini (örnegin, kalintilar , agir Zincirli degisken alandaki 02422-P-0002 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) ve/veya bir "çok degisken halkadan" gelen kalintilari (diger bir ifadeyle, hafif Zincirli degisken alandaki , 917) içerir. Burada kullanildigi üzere, "çerçeve" veya "FR" kalintilari terimi, burada CDR kalintilari olarak tanimlanan çok degisken bölge kalintilari disindaki degisken alan kalintilarina refere eder. Yukaridaki kalinti numaralandirma, Kabat numaralandirma sistemi ile ilgilidir ve eslik eden Sekans Listelemede sekans numaralandirmasina ayrintili olarak karsilik gelmesi zorunlu degildir. bir enflamatuar rahatsizlik ve bir otoimmün rahatsizlik veya hastaligi kapsar. enfeksiyonlar, tümörler ve bagisiklik sistemi tarafindan yok edilmeye direnç gösteren kanserler dahil olmak üzere kanser, tümörler ve anjiyogenez gibi proliferatif kosullara refere eder. "Kanseröz kosul" örnegin, kanser, kanser hücreleri, tümörler, anjiyogenez ve displazi gibi kanser öncesi kosullari içerir. sistemin hücrelerinin sayisindaki bir degisiklik, göç hizindaki degisiklik veya aktivasyonundaki degisiklikten sonuçlandigi bir hastalik veya patolojik kosul anlamina gelir. Bagisiklik sisteminin hücreleri, örnegin, T hücreleri, B hücreleri, monositler veya makrofajlar, antijen sunan hücreler (APC`ler), dendritik hücreler, mikroglia, NK hücreleri, NKT hücreleri, nötrofiller, eozinofiller, mast hücreleri veya spesifik olarak immünoloji ile iliskili herhangi bir baska hücreyi, örnegin, sitokin üreten endotel veya epitel hücreleri, içerir. Burada kullanildigi üzere, konsantrasyonlarin, neredeyse farmasötik formülasyonlarin imalatinda normal olarak bu tür konsantrasyonlar ile iliskili araliklar içerisinde oldugu seklinde yorumlanmalidir. Spesifik olarak, 02422-P-0002 konsantrasyonlarin kesin olmasi gerekmez, ancak GMP kosullari altinda imal edilen ilaçlara yönelik olarak tipik olarak beklenen toleranslar içerisindeki belirtilen konsantrasyonlardan farklilik gösterebilir. Benzer bir sekilde, pH degerleri, neredeyse, GMP kosullari altinda imal edilen ve tipik depolama kosullari altinda depolanan ilaçlara yönelik olarak tipik olarak beklenen toleranslar içerisindedir. Örnegin, mevcut bulusun histidin formülasyonlarinin 60'lik bir pH"a sahip oldugu seklinde refere edilir, ancak tipik tolerans pH 6.0'dir (± 0.3). Aksi belirtilmedigi sürece, yüzde konsantrasyonlari agirlik/agirlik konsantrasyonlaridir. Tipik terapötik monoklonal antikorlar dört polipeptitten olusur: iki hafif Zincirli (örnegin, 214 amino asit uzunlugunda) ve iki agir zincirli (örnegin, 446 amino asit uzunlugunda). Her bir zincir sirasiyla bir degisken alandan ve bir sabit alandan olusur. Anti-IL-23p19 huml3B8-b"ye yönelik degisken alanlar, hafif ve agir zincirlere yönelik olarak, sirasiyla, 108 ve 116 amino asittir ve sabit alanlar 106 ve 330 amino asittir. Bir antikorun hedefine yönelik spesifisitesi büyük ölçüde, sözde "çok degisken" veya "tamamlayicilik belirleyici" bölgeler (CDR'ler) içerisine düsen diziler tarafindan belirlenir, bunlarin üçü agir ve hafif zincirlerin her birinin degisken alanlarinda bulunur. CDR'ler uzunluk bakimindan farkli antikorlar arasinda degisiklik gösterebilir, ancak hum13B8-b'de CDR'ler agir zincirler üzerinde 44 amino asit ve hafif zincir üzerinde 27 amino asit içerir. CDR kalintilari farkli antikorlar arasinda oldukça degiskendir ve insan germ hatti sekanslarindan (tamamen insan antikorlari durumunda) veya insan olmayan (örnegin, kemirgen) germ hatti sekanslarindan kaynaklanabilir. Çerçeve bölgeleri ayni zamanda antikordan antikora da önemli ölçüde farklilik gösterebilir. Sabit bölgeler, seçilen antikorun bir lambda Ot) veya kappa (K) hafif zincirine sahip olup olmamasina bagli olarak ve antikorun (IgA, IgD, IgE, IgG veya IgM) sinifina (veya izotipine) ve alt sinifina (örnegin, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) bagli olarak degisiklik gösterecektiri Toplamlanm toplami, sinif, alt sinif ve hafif zincirli sabit 02422-P-0002 alanlar bakimindan degiskenlik gösteren sabit alanlar ile, "çok degisken" bölgelerdeki 71 amino asit dahil olmak üzere, 224'ü degisken alanlarda olmak üzere, yaklasik olarak 650 amino asitten olusan yaklasik olarak 150,000 Da'lik bir antikor molekülüdür. Mevcut bulusun antikoru (anti-IL-23pl9 mAb hum13B8-b), ayni zamanda, tamamen insandan ziyade insanlastirilmis olmasi bakimindan, birçok yakin zamanda gelistirilen terapötik antikordan farklilik gösterir. Sonuç olarak, CDR sekanslari, insan germ hatti sekanslarindan ziyade, insan olmayan (bu durumda fare) germ hatti sekanslarindan türetilir. Germ hatti sekanslari, somatik hipermutasyondan türetilmis degisikliklerden baska, bir antikorun CDR sekanslarinin türetildigi sekans repertuarini içerir ve sonuç olarak, bir fare germ hattindan baslayan elde edilen CDR'lerin, bir insan hattindan baslayanlardan sistematik olarak farklilik göstermesi beklenecektir. Aslinda, bu, farkli türlerin kullanimi, ortaya çikan CDR sekanslarindaki potansiyel çesitliligi arttirdigindan, antikorlari yükseltmek üzere farkli türlerdeki bagisiklik sistemlerinin kullanilmasina yönelik temeldir. Insan germ hatti sekanslarinin kullanimi, altta yatan CDR'lerin bunlarin köken türlerine bagli olarak sistematik olarak farklilik gösterecegi inancini yansitan, insan germ hatlarindan gelen CDR sekanslarinin insanlarda diger türlerden türetilenlere göre daha az immünojenik olmasi esasina bagli olarak çogu zaman hakli çikarilir. CDR çesitliligindeki artisin yüksek afinite gibi istenen özelliklere sahip antikorlari bulma olasiligini arttirmasina ragmen, ortaya çikan antikorun bir sabit solüsyon formülasyonunun gelistirilmesindeki zorluklari daha da siddetlendirir. Ayni antijene baglanan antikorlar bile sekans bakimindan çarpici bir sekilde farklilik gösterebilir ve antijenleri tamamen ayirmak üzere sekans bakimindan antikorlardan daha yakindan ilgili olmak zorunda degildir. Örnegin, mevcut bulusun antikorunun degisken alanlari (huml3B8-b) sadece, baska anti-IL- 02422-P-0002 1959 bir tamamen insan antikorudur. Düsük sekans benzerligine bagli olarak, antikorlarin kimyasal özelliklerinin ve böylece bunlarin bozulmaya karsi duyarliliginin, bunlarin ortak hedeflerine ragmen benzer olduklari varsayilamaz. Yukarida gösterildigi üzere, antikorlar solüsyon içinde çesitli bozulma ve stabilitesizlik formlarina maruz kalan büyük, oldukça karmasik polipeptit kompleksleridir. Antikorlarin sekansinin ve böylece yapisinin, çesitliligi çok çesitli kimyasal özelliklere yol açar. Antijen baglama spesifisitesindeki belirgin sekansa özgü farkliliklarindan baska, antikorlar, çesitli bozucu yolaklara, birikmeye ve çökelmeye karsi degisiklik gösteren duyarlilik sergiler. Amino asit yan zincirleri, histidin, fenilalanin ve prolin kalintilari üzerinde potansiyel olarak kimyasal olarak reaktif bölgelerin yani sira, karboksi- (D,E), amino- (K), amid- (N,Q), hidroksil- (S,T,Y), sülfhidril- (C), tiyoeter- (M) gruplari gibi reaktif gruplarin varliginda veya yoklugunda farklilik gösterir. Dogrudan antijen baglama etkilesimlerinde yer alan amino asit yan zincirleri, yan zincir modifikasyonu ile etkisizlestirmeye yönelik açik adaylardir, ancak diger pozisyonlardaki bozulma ayni zamanda, CDR'lerin sterik oryantasyonu (örnegin, çerçeve kalintilarindaki degisiklikler), efektör fonksiyonu (Örnegin, Fc bölgesinde - bakiniz, örnegin, Liu faktörleri de etkileyebilir. Antikorlar, herhangi bir sayida potansiyel bozulma yolagina maruz kalir. Metiyonyon kalintilarinin antikorlarda, özellikle CDR'lerde, oksidasyonu, antijen baglanmasini bölmesi durumunda, bir problem olabilir. Presta (2005) J. Allergy potansiyel bozulma yolaklari, asparagin deamidasyonunu (Harris et al. (2001) 02422-P-0002 spesifik amino asit kalintisinin varligina degil, ayni zamanda çevreleyen sekansa da baglidir. Deamidasyon ve izoaspartat olusumu, N-G ve D-G sekanslarinin özellikle duyarli olmasiyla, (C-terminalinden) N veya D kalintilarini takip eden peptit baginin bir kendiliginden intramoleküler yeniden düzenlemesinden ortaya Antikorlar ayni zamanda, depolama sirasinda sekansa özgü enzimatik olmayan fragmantasyona da maruz kalir. Vlasak & Ionescu (2011) mAbs 32253. D, G.S.T, C veya N gibi reaktif yan zincirlerin varligi, polipeptit omurgasini ayiran intramoleküler bölünme reaksiyonlari ile sonuçlanabilir. Bu tür sekansa özgü hidroliz reaksiyonlari tipik olarak kritik derecede pH. 1d." ye baglidir. Antikorlar ayni zamanda, örnegin CDR'ler yüksek sayida hidrofobik kalintilari içerdiginde, sekansa bagli toplanmaya ugrayabilir. Perchiacca et al. (2012) Prot. Eng. Des. Selection 25:591. Toplanma, deri altindan uygulamaya yönelik olarak yüksek konsantrasyonlarda formüle edilmesi gereken antikorlara yönelik olarak özellikle problemlidir ve çözünürlük Idfyi arttirmak üzere yüklü kalintilarin ilave edilmesiyle antikor sekansini modifiye etmeye bile yol açmistir. Potansiyel sekansa özgü stabilite sorunlarinin antikorlar ile çesitliligi yansitildiginda, potansiyel antikor formülasyonlari da çesitlidir. Her bir yeni antikora yönelik olarak bir takim farkli degisken siparis üzerine optimize edilmelidir. Formülasyonlar örnegin antikor konsantrasyonu, tampon, pH, yüzey aktif maddenin varligi veya yoklugu, toniklestirici ajanlarin varligi veya yoklugu (iyonik veya noniyonik), moleküler kalabaliklastirici ajanin varligi veya yoklugu bakimindan farklilik gösterebilir. Ticari olarak ulasilabilir terapötik antikorlar, genis bir solüsyon formülasyonlari araliginda, fosfat tamponu (örnegin, adalimumab), fosfat/glisin tamponu (örnegin, baziloksumab), Tris tamponu (örnegin, ipilimumab), histidin (örnegin, ustekinumab), sodyum sitrat (Örnegin, 02422-P-0002 rituksimab) içinde; ve pH 4.7 (örnegin, sertolizumab) ve pH 5.2'den (örnegin, adalimumab) pH 7.0-7.4'e (örnegin, setuksimab) kadar pazarlanir. Bunlar ayni zamanda istege bagli olarak, tümü, %000] (örnegin, abciksmab) ila %0.] (örnegin, adalimumab) araliginda degisen polisorbat-80 ile ve bu olmadan, disodyum edetat (örnegin, alemtuzumab), mannitol (örnegin, ipilimumab), sorbitol (örnegin, golimumab), sükroz (örnegin, ustekinumab), sodyum klorür (örnegin, rituksimab), potasyum klorür (örnegin, alemtuzumab) ve trehaloz (örnegin, ranibizumab) içeren formülasyonlar halinde de ulasilabilirdir. Örnekleyici antikor formülasyonlari U.S. Pat. NOslari. 7,691,379 (anti-IL-9 mAb panitumumab); ve 7,635,473`te (anti-AB; bapineuzumab) bulunur. Ilave örnekleyici antikor formülasyonlari U.S. Patent Basvurusu Yayin No'lari pertuzumab) bulunur. Yine ilave formülasyonlar Daugherty & Mrsyn (2006) Adv. Antikor spesifisitesine yönelik temel olan sekans degiskenligi, immün yanitinin kalbindedir. Bu degiskenlik, çok çesitli potansiyel bozulma yolaklari ile sonuçlanan ortaya çikan antikorlarin kimyasal heterojenligine yol açar. Simdiye kadar gelistirilen genis antikor formülasyonlari dizisi, formülasyonlarin optimal stabiliteyi garanti altina almak üzere her bir spesifik antikoruna yönelik olarak ayri ayri optimize edilmesi gerektigi gerçegini tasdikler. Aslinda, simdiye kadar insanlarda kullanima yönelik olarak onaylanmis her bir ve her ticari terapötik antikor bir benzersiz, farkli formülasyona sahip olmustur. 02422-P-0002 Mevcut bulusun anti-IL-23pl9 mAb hum13B8-b'sinin solüsyon formülasyonlari, rahatsizliklarin tedavisinde kullanim bulacaktir. Benzer bagisiklik yanitlarini, böylece IL-23 blokajini ortaya çikaran proliferatif rahatsizliklarin yani sira cildin, eklemlerin, CNS'nin enflamatuar hastaliklari sistemik enfeksiyonlarla savasmak üzere konak yetenegini içermeden, bu bagisiklik aracili enflamatuar rahatsizliklarin inhibisyonunu saglamalidir. Antagonize edici IL-23, enflamatuar bagirsak hastaligi, Crohn hastaligi, ülseratif kolit, romatoid artrit, psoriatik artrit, sedef hastaligi, ankilozan spondilit, graft-versus-host hastaligi, atopik dermatit ve çesitli diger otoimmün ve enflamatuar rahatsizliklari ile iliskili iltihabi hafifletmelidir. IL-23 inhibitörlerinin kullanimi ayni zamanda, proliferatif rahatsizliklarin, örnegin, kanser ve otoimmün rahatsizliklarin, örnegin, multipl skleroz, tip 1 diyabet ve SLE inhibisyonunu da saglayacaktir. Bu çesitli rahatsizliklarda IL-23'ün açiklamalari, asagidaki yayinlanmis PCT basvurularinda lL-23 inhibitörleri ayni zamanda bakteriyel, mikobakteriyel, viral ve mantar enfeksiyonlari gibi kronik enfeksiyonlar dahil olmak üzere enfeksiyonlarin tedavisinde de kullanim bulabilir. Bakiniz U.S. Patent No. 8,263,080 ve Int'l Mevcut bulusun yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlari, uzatilmis süreler boyunca depolandiginda biyolojik olarak aktiviteyi koruyan antikorlari içerir. Burada kullanildigi üzere, "biyolojik olarak aktif" terimi, istenen antijenik epitopunu baglayabilen ve bir biyolojik etkiyi dogrudan veya dolayli olarak sergileyebilen bir antikor veya antikor fragmanina refere eder. Tipik olarak, bu etkiler IL-23'ün kendi reseptörünü baglamadaki basarisizligindan kaynaklanir. Burada kullanildigi üzere, "spesifik" terimi, antikorun hedef antijen epitopuna seçici baglanmasina refere eder. Antikorlar, bir verilen kosullar seti altinda, antikorun IL-23`e baglanmasinin alakasiz antijene veya antijen karisimina 02422-P-0002 baglanmayla karsilastirilmasiyla baglanma spesifisitesine yönelik olarak test edilebilir. Antikorun IL-23`e ilgisiz antijen veya antijen karisimindan en az 10 ve tercih edildigi üzere 50 kat daha fazla baglanmasi halinde, bunun spesifik oldugu kabul edilir. IL-12'ye baglanan bir antikor, bir IL-23'e özgü antikor degildir. IL- 23p19'a "spesifik olarak baglanan" bir antikor, IL-23pl9'den türetilmis sekanslari içermeyen proteinlere baglanmaz, diger bir ifadeyle, burada kullanildigi üzere degil, IL-23pl9 spesifisitesi ile ilgilidir. Örnegin, burada kullanildigi üzere, IL- 23p19'a "spesifik olarak baglanan" bir antikor tipik olarak IL-23pl9 ve bir FLAG® peptid etiketini içeren bir füzyon proteini olan FLAG®-hIL-23pl9'a baglanacaktir, ancak tek basina veya IL-23p19 disindaki bir proteine birlestirildiginde FLAG® peptid etiketine baglanmaz. Mevcut bulusun IL-23'e özgü baglayici bilesikleri, bunlarla sinirli olmamak üzere peritoneal makrofajlar tarafindan IL-1ß ve TNF ve Tn17 T hücreleri tarafindan CCL22, CCRl ve GM-CSF'nin gen ekspresyonunu da inhibe edebilecektir. özgü baglayici bilesikleri, ayni zamanda, IL-23'ün T1117 hücrelerinin çogalmasini veya hayatta kalmasini arttirma kabiliyetini de bloke edecektir. Cua and Kastelein edici aktivitesi, enflamatuar, otoimmün ve proliferatif hastaliklarin tedavisinde faydali olacaktir. Bu tür rahatsizliklarin örnekleri, PCT patent basvurusu yayinlari Mevcut bulusun yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlari, örnegin, Thl7 aracili hastaliklar, otoimmün veya kronik enflamatuar bozukluklar veya kanserler gibi, IL-23 veya IL-23pl9'un yükseltilmis aktivitesi ile iliskili bir rahatsizligin tedavisinde veya önlenmesinde kullanima yönelik olarak anti-IL-23pl9 antikor hum13B8-b'nin depolanmasina ve verilmesine yönelik olarak kullanislidir. 02422-P-0002 Formülasyonlari Mevcut bulus, SEQ ID NO: 2 sekansina sahip iki ayni hafif zincir ve SEQ ID NO: 1 sekansina sahip iki ayni agir zincir içeren ve es askida olan, yaygin olarak b'nin yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlarini saglar. Hümanize edilmis hafif zincir 13B8 sekansi (kappa sabit bölgesine sahip) SEQ ID NO: 2'de saglanir ve hafif zincir degisken alani bu sekansin 1-108 kalintilarini içerir. Hümanize edilmis agir zincir 13B8 sekansi (yl sabit bölgesine sahip) SEQ ID NO: 1'de saglanir ve agir zincir degisken alani bu sekansin l-llö kalintilarini Agir ve hafif zincir sekanslari (SEQ ID NO°1arz 1 ve 2) sinyal sekanslari olmadan saglanir. Örnekleyici agir ve hafif zincir sinyal sekanslari, sirasiyla SEQ ID NO,1ar: 12 ve 13'te saglanir. Sinyal dizileri veya sinyal sekanslarini kodlayan nükleik asit sekanslari, bir konakçi hücreden salgilanmaya yönelik olarak bir öncül protein olusturmak üzere ilgili antikor zincirlerinin N-ucuna eklenebilir. Ayni zamanda alternatif sinyal sekanslari de kullanilabilir ve birçogu "Sde: a Signal Peptide Database." Choo et al. (2005) BMC Bioinformatics 62249,da bulunabilir. Ebeveyn antikoru 13B8 eksprese eden bir hibridoma, Erisim Numarasi FTA-7803 altinda, 17 Agustos 2006'da Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC - Manassas, Virginia, USA) ile Budapeste Antlasmasi uyarinca tevdi edilmistir. Ebeveyn antikoru 13B8 ve hum13B8-b arasindaki iliski, yaygin olarak atanmis U.S. Pat. No. 8,293,883"de detaylandirilir. Mevcut bulusun solüsyon formülasyonlari, 500 - 2000 L ölçeginde kültürdeki Çin hamsteri yumurtalik (CHO) hücrelerinden hazirlanan en az sekiz farkli antikor 13B8-b parçasi kullanilarak gelistirilmistir. 02422-P-0002 Mevcut bulusun solüsyon formülasyonuna yönelik olarak bir baslangiç solüsyonu kosullari araligi kabul edilmistir. Deneyler, asetat, sitrat, histidin, TRIS ve fosfat gibi çesitli tamponlar ile 4.0 ila 8.8 araliginda degisen pH'larda yapilmistir. Sükroz, trehaloz ve mannitol gibi eksipiyanlar, NaCl'nin çesitli konsantrasyonlari (ve böylece iyonik kuvvetler) ve yüzey aktif madde polisorbat 80'in dahil edilmesi gibi test edilmistir. Formülasyonlar, 350nm'de O.D.,nin belirlenmesiyle renk oynasimina bagli olarak taranmistir. Agregasyon, yüksek performansli boyut dislama kromatografisi (HP-SEC), dinamik isik saçilimi (DLS) ve analitik ultrasantrifüjleme (AUC) tarafindan ölçülmüstür. Biyokimyasal stabilite, yüksek performansli iyon degisim kromatografisi (HP-IEX) tarafindan ölçülmüstür ve termal stabilite diferansiyel tarama kalorimetresi (DSC) tarafindan ölçülmüstür. l mg/mL huml3B8-b'deki baslangiç ön-formülasyon deneyleri, ters fazli yüksek performansli sivi kromatografisi (RP-HPLC) tarafindan ölçüldügü üzere, saflik yüzdesinin yaklasik pH 6.0'a kadar yükseldigini ve daha sonra pH 8.8,e kadar sabit kaldigini ortaya koymustur. Bakiniz SEKIL 1A. Bununla birlikte, antikorun yayilma sicakligi yaklasik pH 5"ta pik yapmistir. Bakiniz SEKIL 1A. Asetat, sitrat, fosfat ve TRIS arasindaki tampon türlerinin karsilastirilmasi, pH 5.5'teki sitrat tamponunun en yüksek monomer yüzdesini ve en düsük geç ayrisan piklerin yüzdesini verdigini göstermistir. Bakiniz SEKIL lB. optimal biyokimyasal ve biyofiziksel stabilitenin pH 5.5`te sitrat tamponunda gözlemlenmis olmasina ragmen, sitrat tamponu içindeki antikorun 65 mg/mL antikora konsantrasyonu, büyük ölçüde isik oynasimina yol açmistir (veriler gösterilmemistir). Kendi kendine uygulamaya yönelik olarak formüle edilebilecek bir ilaca yönelik bir özel endise olan azaltilmis hasta kabulüne yönelik potansiyel nedeniyle isik oynasimi istenmez. Bu isik oynasiminin seyreltme ve pH'in sitrat tamponunda 4.8'e düsürülmesi üzerine geri dönüslü olmasina (SEKIL lC) ve ayni zamanda pH'in düsürülmesinin hidrodinamik çapi da düsürmüs olmasina ragmen (SEKIL 1D), pH'in düsürülmesi ayni zamanda, düsük erime formundaki bir amirilmis oran ile yansitildigi üzere, 02422-P-0002 solüsyonun termal ve biyokimyasal stabilitesini de düsürmüstür (SEKIL IE), HP- SEC ile ölçüldügü üzere, zaman içindeki geç ayrisan piklerin birikimini arttirmistir (SEKIL IF) ve HP-IEX ile ölçüldügü üzere, zaman içindeki ana piki azaltmistir (Sekil 1G). Histidin daha sonra, termal ve biyokimyasal stabiliteyi azaltmadan isik oynasimini ve kendi kendine birlesmeyi azaltma girisiminde alternatif bir tampon sistemi olarak kabul edilmistir. Numuneler, 10 mM asetat (pH 4.8 ve 5.6), 10 mM sitrat oynasimi ve hidrodinamik çap sirasiyla OD350 ve DLS tarafindan belirlenmistir. Bakiniz SEKILLER 1H ve II. Sitratin asetat veya histidin ile yer degistirilmesi, biyokimyasal stabiliteden ödün vermeden isik oynasimini en aza indirmistir ve kendi kendine birlesmeyi azaltmistir. Daha yüksek antikor konsantrasyonlarinda (50 ila 100 mg/mL), asetat (pH 5.5) ve histidin (pH 6.0) formülasyonlari açik olmustur ve sitrat (pH 5.5) ile gözlemlenmis olan arttirilmis hidrodinamik boyuta sahip olmamistir. Bakiniz SEKIL 1] . Düsük pH (4.8) sitrat ve asetat formülasyonlari ayni zamanda, boyut dislama kromatografisi (SEC) tarafindan ölçüldügü üzere, RH4 kosullari altinda (40 °C, %75 bagil nem) depolama sirasinda geç ayrisan piklerin arttirilmis birikmesine yol açmistir. Bakiniz SEKIL Çesitli eksipiyanlar ( de yayilma sicakligi (SEKIL 2A) ve isik oynasimi (SEKIL 2B) üzerindeki etkilerine yönelik olarak test edilmistir. Formülasyonlari izotonik hale getirmek üzere, isik oynasimini azaltmak üzere ve termal stabiliteyi arttirmak (Tm°i arttirmak) üzere yüzde yedi sükroz ilave edilmistir. Yüzey aktif madde polisorbat-20 (PSZO), polisorbat-80 (PSSO) ve PLURONIC® F-68 de yayilma (SEKIL 3A ve 3B) ve isik oynasimi (SEKIL 3C) üzerindeki etkilerine yönelik olarak test edilmistir. Agitasyon indüklü stres nedeniyle toplanmayi en aza indirmek üzere polisorbat 80 ilave edilmistir. 02422-P-0002 Bu sonuçlar, tercih edilen tampon sisteminde bir degisiklige yol açmistir. Anti IL- 23, sitrat pH 5.5 ve pH 6.0'da yüksek konsantrasyonlarda kendi kendine birlesme ve isik oynasimi sergilemistir. Sitratin asetat (pH 5.5) veya histidin (pH 6.0) ile yer degistirilmesi, termal ve biyokimyasal stabiliteden ödün vermeden isik oynasimini en aza indirmistir. Formülasyonlari izotonik hale getirmek üzere sükroz (%7) ilave edilmistir. Sükroz (%7) ayni zamanda isik oynasimmi azaltmistir ve termal stabiliteyi (arttirilmis Tm) arttirmistir ve stabilite çalismalari sirasinda monomerdeki yüzde kaybini azaltmistir (veriler gösterilmemistir). Çalkalama stresi nedeniyle toplanmayi en aza indirmek üzere polisorbat 80 (%005) ilave edilmistir. mM histidin (pH 6.0), %7 sükroz ve %005 PS-SO içeren bir histidin bazli formülasyon, huml3B8-b'nin tercih edilen yüksek konsantrasyonlu formülasyonu olarak seçilmistir. 10 mM histidin (pH 6.0) formülasyonuna yönelik viskozite, yogunluk, ozmolarite dahil olmak üzere çesitli solüsyon özellikleri ve partikülatlar belirlenmistir. Bakiniz Tablo 1. Gözlemleiien oda sicakligi viskozitesi (, önceden doldurulmus siringalarda ve otoenjektörlerde kullanima yönelik olarak kabul edilebilirdir. Histidin Formülasyonun Solüsyon Özellikleri Solüsyon Özelligi Histidin (pH 6.0) Viskozite (CP) 5.65 (25°C) Yogunluk (g/cm3) 1.06 Ozmolarite 266 Alt görünebilir partikülatlar 25 (10 um) 2 (25 pm) 02422-P-0002 V. Hümanize Edilmis Anti-IL-23pl9 Antikoru 13B8-b'nin Yüksek Konsantrasyon Solüsyon Formülasyonlarinin Stabilitesi Mevcut bulusun seçilen formülasyonlarin uzun dönemli stabilitesi, çesitli depolama kosullari altinda 3-24 aylik depolamadan sonra çalisilmistir. Numuneler, çesitli sicaklik ve nemlilik seviyelerinde 2 ml'lik cam siselerde (SEKIL 4), 30 ml'lik torbalarda (yigin depolama) (SEKILLER 5 ve 6) veya önceden doldurulmus siringalarda (tek dozlu ticari paketleme) (SEKIL 7) inkübe edilmistir. Numuneler, yüksek performansli boyut dislama kromatografisi (HP- SEC), iyon degisim kromatografisi (HP-IEX), SDS kilcal elektroforezi (CE-SDS, indirgeyici ve indirgeyici olmayan) ve peptit haritalamasi gibi yöntemlerle bozulma ve toplanma ürünlerinin varligina yönelik olarak analiz edilmistir. Antikor stabilitesi, diferansiyel tarama kalorimetresi (DSC) ile ölçülmüstür. Biyolojik aktivite, IL-23 baglayici ELISA ve bir hücre bazli fonksiyonel analiz ile degerlendirilmistir. Antikor konsantrasyonu 280 nm'de UV emilimi ile belirlenmistir. Renk oynasimi, 350 nm'de (OD350) optik yogunlugun ölçülmesiyle belirlenmistir. Sonuçlar SEKILLER 4-7'de saglanir. Bir birinci deney setinde, 1.5 ml numuneler 2.0 ml cam siseler içine yerlestirilmistir ve çesitli kosullar altinda saklandiktan sonra analiz edilmistir. Sonuçlar SEKIL 4'te sunulur. Tipik sogutma kosullarina karsilik gelen 5 OC'de ve ortam nemliliginde depolanan numunelerde çok az bozulma veya toplanma gözlemlenmistir. SEKILLER 4A - 4F. Numune bozulmasina yönelik olarak pozitif bir kontrol olarak dahil edilen RH4 (40 0C, %75 bagi] nemlilik) gibi hizlandirilmis bozulma kosullari, beklenen monomer kaybini ve hemen birinci zaman noktasinda (bir ay) baslayan bozulma ve toplanma ürünlerinin yükselisini göstermistir. SEKILLER 4A - 4F. Renk oynasimi 5 °C'de (SEKIL 4G) stabil olmustur, ancak . Oksidasyon benzer sekilde 5 °C'de minimum olmustur, ancak RH4 kosullari altinda veya 40 °C'de önemli olmustur. SEKILLER 41 ve 4K. Bu sonuçlar, deneylerin, örnegin RH4 sonuçlari tarafindan gösterildigi üzere, bir takim analizler tarafindan 02422-P-0002 bozulmayi tespit edebilmesine ragmen, tipik sogutma kosullari altinda depolamanin, en az dokuz aylik depolama boyunca ürün kalitesinde az kayba yol açtigini veya hiç kayba yol açmadigini belirtir. Bir ikinci deney setinde, numuneler 30 m1 etilen-vinil-asetat (EVA) sivi temas katmani CELSIUS®-Pak torbalarina (Sattorius, Goettingen, Almanya) yerlestirilmistir ve çesitli kosullar altinda saklandiktan sonra analiz edilmistir. Sonuçlar SEKILLER 5 ve 6'da sunulur. Bu deneyler, esas olarak, tipik olarak yigin depolama kosullari altinda ilaç maddesinin stabilitesini degerlendirmek üzere dizayn edilmistir. Yigin depolama numuneleri, üç donmus kosul (-80°, -45 °C ve -20 °C) altinda saklanmistir ve sogutulmustur (2° - 8 °C). Temsili veriler, 18 aya kadar 5°C (± 3°C) ve -45°C'de saklanan numunelere yönelik olarak SEKIL 5`te saglanir. Muhtemelen 5 °C numunelerindeki saklama torbalarindaki buharlasma nedeniyle 12 aylik depolama (SEKIL 5A) boyunca konsantrasyonda hafif artislar gözlemlenmistir. Biyolojik aktivite (SEKILLER 5B ve 5C) baglaminda hiçbir önemli egilim mevcut olmamistir ve protein ile ilgili safsizliklar, bozulma ürünleri ve agregatlari, özellikle -45 °C'de dondurulmus saklanmis numunelere yönelik olarak genel olarak 18 aya kadar spesifikasyonlar içerisinde olmustur (SEKILLER 5D - SL). Yüksek sicakliklarda yigin depolamadaki stabilite de degerlendirilmistir. Temsili numunelere yönelik olarak SEKIL 6,da saglanir. Oda sicakliginda (25°) saklanan numuneler fiili olarak buharlasma nedeniyle muhtemelen net konsantrasyon nedeniyle bir etki olan, biyolojik potenste belirgin artislar göstermisken, sogutulmus numuneler 12 ay boyunca stabil biyolojik aktivite göstermistir. SEKILLER 6A ve 6B. Numuneler 5 °C'de saklandiginda 12 ay boyunca stabil olmustur, ancak protein ile ilgili safsizliklar, (bozulma ürünleri ve agregatlar) 25 °C ve 25H'de depolanan numunelere yönelik olarak zamanla aitmistir ve 40 °C ve 02422-P-0002 RH4'te depolanan numunelere yönelik olarak çarpici sekilde artmistir (hizlandirilmis bozulma kosullari). SEKILLER 6C - 6K. Bir üçüncü deney setinde, 1 ml 100 mg/ml antikor formülasyonu numuneleri siringalara (BD Hypak Physiolis Önceden Doldurulan Siringalar) yerlestirilmistir ve çesitli kosullar altinda saklandiktan sonra analiz edilmistir. Sonuçlar, 24 aya kadar 5°C'de (± 3 °C) saklanan numunelere yönelik olarak SEKIL 7'de sunulur. Antikor konsantrasyonlari, biyolojik aktivitenin (SEKILLER 7B ve 7C) yaptigi gibi, esasen degismeden kalmistir (SEKIL 7A). Yüksek moleküler agirlikli türlerin, monomer yüzdesinin, düsük moleküler agirlikli türlerin, ana antikor pik yüzdesinin, asidik varyantlarin, bazik varyantlarin, ana pik sonrasi türlerin, ana 7L) en az 12 - 24 ay boyunca esasen stabil kalmistir. SEKILLER 4-7'de sunulan uzun dönemli stabilite deneyleri, ister yigin solüsyon içinde dondurulmus ister, önceden doldurulmus bir siringa içinde oldugu gibi sogutulmus olsun, tipik saklama kosullari altinda yüksek antikor konsantrasyonlarinda, hem biyolojik aktivite hem de fiziksel bütünlüge göre, mevcut bulusun hum13B8-b'sinin histidin formülasyonunun stabil oldugunu ortaya koyar. RH4 ve 25H gibi hizlandirilmis bozulma kosullari ve diger yüksek sicaklik kosullari altinda elde edilen sonuçlarin sadece antikor huml3B8-b`ye yönelik olarak olasi çöküntü ürünlerini ve yolaklarini göstermesi tasarlanir ve terapötik kullanima yönelik olarak tasarlanan antikora yönelik bozulma oranlarini yansitmaz. Hizlandirilmis bozulma kosullari sirasinda bulunan hum13B8-b,ye yönelik ana bozulma yollari, CE-SDS tarafindan gözlemlenen saflik kaybini, HMW ve LMW türlerindeki artislari ve HP-SEC tarafindan gözlemlenen monomer yüzdesindeki azalmayi içerir. Ek olarak, HP-IEX, bazik varyantlar ve ana pikteki azalmalar ile, asidik varyantlarda ve pik sonrasi türlerdeki artislari ortaya çikarmistir. Yükseltilmis sicaklikta hum13B8-b gibi antikor ilaçlarin 02422-P-0002 solüsyon formülasyonlarinin genisletilmis depolanmasi çok uzak ihtimaldir. Örnegin huml3B8-b'nin uzun süreli depolanmasinin, -45 °C'de dondurulmus CELSIUS®-Pak torbalarinda saklanmasi muhtemeldir, bu sartlar altinda kalite özelliklerinin en az 18 ay boyunca stabil kalmasi beklenir. Bireysel huml3B8-b dozlari içeren önceden doldurulmus siringalarin veya otoenjektörlerin yaklasik 5 ° C`de (± 3 °C) saklanmasi muhtemeldir ve ayni zamanda en az 18 ay boyunca stabil kalmasi da beklenir. VI. Dozlama ve Uygulama Mevcut bulusun yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlarinin, yüksek dozda deri altindan uygulamaya yönelik olarak özellikle uygun olmasina ragmen, bu tür formülasyonlar baska sekillerde de uygulanabilir. Uygun uygulama yollari, örnegin, intratekal, dogrudan intraventriküler, intravenöz, intraperitoneal, intranazal veya intraoküler enjeksiyonlarin yani sira oral, rektal, transmukozal veya bagirsak uygulamasi; intramüsküler, intradermal, intramedüller enjeksiyonlar dahil olmak üzere parenteral dogumu içerebilir. Alternatif olarak, biri, antikoru, sistemikten ziyade bir lokal yoldan, örnegin antikorun direkt olarak çogu kez bir depoda veya sürekli salim formülasyonunda immünopatoloji tarafindan karakterize edilen bir artritik eklem veya patojen indüklü lezyona enjeksiyonu vasitasiyla uygulayabilir. Bundan baska, biri, antikoru, bir hedeflenmis ilaç verim sisteminde, örnegin, örnegin immünopatoloji tarafindan karakterize edilen artritik eklem veya patojen indüklü lezyonu hedefleyen bir dokuya özgü antikor ile kapli bir lipozomda, uygulayabilir. Lipozomlar, tutulan doku tarafindan seçici olarak hedeflenecek ve alinacaktir. Deri altindan uygulama, bir siringa, bir otoenjektör, bir enjektör kalemi veya bir ignesiz enjeksiyon cihazi kullanilarak enjeksiyonla gerçeklestirilebilir. 02422-P-0002 Mevcut bulusun yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlarinin, bir yüksek konsantrasyonlu antikoru gerektiren kullanimlara yönelik olarak özellikle avantajli olmasina ragmen, yüksek konsantrasyonlarin gerekli olmadigi veya istenmedigi durumlardaki düsük konsantrasyonlarda formülasyonlarin kullanilamamasinin bir nedeni yoktur. Düsük antikor konsantrasyonlari, düsük dozda deri altindan uygulamaya yönelik olarak veya verilebilecek hacmin büyük ölçüde l ml`den daha fazla oldugu diger uygulama modlarinda (intravenöz , 15, 10, 5, 2, 1 mg/ml veya daha azini içerebilir. Bir terapötige yönelik olarak bir uygulama rejiminin seçilmesi, varligin serum veya doku devir hizi, semptomlarin seviyesi, varligin immünojenikligi ve biyolojik matriksteki hedef hücrelerin erisilebilirligi dahil olmak üzere çesitli faktörlere baglidir. Tercih edildigi üzere, bir uygulama rejimi, bir kabul edilebilir yan etki seviyesi ile tutarli hastaya verilen terapötigin miktari maksimize eder. Buna göre verilen biyolojik miktari kismen özel varliga ve tedavi edilen durumun siddetine baglidir. Uygun dozlarda antikor, sitokin ve küçük moleküllerin seçilmesinde kilavuz ulasilabilirdir. Bakiniz örnegin, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Desk Reference , Medical Economics Uygun dozun belirlenmesi, klinisyen tarafindan, örnegin, teknikte tedaviyi etkiledigi bilinen veya tedaviyi etkilediginden süphelenilen veya tedaviyi 02422-P-0002 etkiledigi öngörülen parametreler veya faktörler kullanilarak yapilir. Proteinin uygun dozaji ("terapötik olarak etkili miktar"), örnegin, tedavi edilecek kosula, kosulun siddetine ve seyrine, proteinin önleyici veya terapötik amaçlara yönelik olarak uygulanip uygulanmadigina, önceki terapiye, hastanin klinik öyküsüne ve proteine yanitina, kullanilan protein tipine ve uzman doktorun takdirine bagli olacaktirBazi durumlarda, bir düsük baslangiç dozu seçilir ve dozaj, herhangi bir olumsuz yan etkiye göre istenen veya optimum terapötik fayda elde edilinceye kadar bundan sonra küçük artislarla arttirilir. Önemli tanisal ölçümler, örnegin, üretilen enflamatuar sitokinlerin enflamasyon veya seviyesinin semptomlarininkileri içerir. Protein hastaya uygun bir sekilde bir kerede veya tekrar tekrar uygulanir. Protein tek basina veya baska ilaçlar veya terapiler ile baglantili olarak uygulanabilir. Antikorlar sürekli infüzyon tarafindan veya örnegin bir gün, haftada 1-7 kez, bir hafta, iki hafta, aylik, iki ayda bir, üç ayda bir, yilda iki kere veya yillik, Vb. seklinde aralikli dozlar tarafindan saglanabilir. Tercih edilen bir doz protokolü, önemli istenmeyen yan etkileri önleyen maksimum doz veya doz frekansini kapsayan bir tanesidir. Toplam haftalik bir doz genel olarak en az 0.05 ug/kg, 0.2 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg vücut agirligi veya daha fazlasidir. Bakiniz VII. Kullanimlar Mevcut bulus, örnegin, otoimmün ve proliferatif rahatsizliklarin yani sira merkezi sinir sistemi, periferik sinir sistemi ve gastrointestinal yolun enflamatuar rahatsizliklarin ve kosullarin tedavisinde kullanima yönelik olarak anti-insan IL- 23p19 mAb hum13B8-b'nin yüksek konsantrasyonlu solüsyon formülasyonlarini 02422-P-0002 Mevcut bulusun formülasyonlari, örnegin, nöropatik agri, travma sonrasi nöropatiler, Guillain-Barre sendromu (GBS), periferik polinöropati ve sinir rejenerasyonunun yani sira nükseden tekrarlayici MS ve birincil ilerleyici MS dahil olmak üzere multipl skleroz (MS), Alzheimer hastaligi, amiyotrofik lateral skleroz (ayni zamanda ALS; Lou Gehrig hastaligi olarak da bilinir), iskemik beyin hasari, prion hastaliklari ve HIV ile iliskili demans tedavisinde kullanilabilir. Mevcut bulusun formülasyonlari ayni zamanda, inflamatuvar bagirsak bozukluklari, örnegin, Crohn hastaligi, ülseratif kolit, çölyak hastaligi ve irritabl bagirsak sendromu gibi, tedavisinde de kullanilabilir. Ayni zamanda, greft versus- host hastaligi, sedef hastaligi, atopik dermatit, romatizmal artrit, 0steoartrit ve psoriatik artrit dahil olmak üzere aitrit, sistemik lupus eritematozus ve tip diyabet gibi otoimmün rahatsizliklar ve kanser gibi proliferatif rahatsizliklarin tedavisinde de kullanilabilirler. Bakiniz örnegin, PCT patent basvurusu yayinlari WO ÖRNEKLER Solüsyon Formülasyonu Bir düzenlemede, mevcut bulusun hum13B8-b'nin solüsyon formülasyonu, bir önceden doldurulmus siringada veya bir otoenjektörde 1.0 mL hacminde bir 100 mg/mL'lik antikor solüsyonu olarak saglanir. 1.0 mL hacim, tam 1.0 mL dozun verilmesini garanti altina almak üzere yeterli fazla doldurmayi içerebilen doldurma hacminden ziyade çikarilabilir hacimdir. Mevcut bulusun formülasyonunun 1.0 ml'sine yönelik bir örnekleyici tarif Tablo 2'de saglanir. Bir düzenlemede, bir ilaç ürünü partisi 15 - 30 L ölçeginde veya yaklasik 15,000 - ,000 dozda hazirlanir. 02422-P-0002 1.0 mL Solüsyon Formülasyonu Bilesen Derece Nicelik hum13B8-b Ürün spesifikasyonlari 100 mg L-Histidin Ph.Eur./USP 0.683 mg Polisorbat 80 Ph.Eur./NF/JP 0.500 mg Sükroz Ph.Eur./NF/JP 70.0 mg Enjeksiyona yönelik su USP q.s. Bazi düzenlemelerde, tampon bilesenlerinin (L-histidin ve L-histidin HCI) miktarlari, pH'i yaklasik olarak 6.0'a ayarlama ihtiyaci nedeniyle Tablo 2'de listelenen agirlik miktarlarindan biraz sapar. Spesifik olarak, bazi düzenlemelerde, pH'i yaklasik 6.0 olan istenen degere ayarlamak üzere, Tablo 2'deki miktarlar ile karsilastirildigi üzere, histidinin asidik veya bazik formlarindan daha fazla veya daha azi ilave edilir. Yine baska düzenlemelerde, Tablo 2'deki degerlere yaklasan L-histidin ve L-histidin HCl miktarlari, lei, biraz daha yüksek olacak sekilde 6.0'a yaklastirmak üzere ilave edilir ve daha sonra elde edilen formülasyonun pH'ini yaklasik 6.0"a düsürmek üzere HCI ilave edilir. Diferansiyel Taramali Kalorimetri (DSC) Mevcut bulusun formülasyonlarindaki antikorlarin termal stabilitesini izlemek üzere Valerian-Plotnikov diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC) kullanilmistir. DSC direkt olarak sicakliktaki kontrol edilen artis veya düsüs sirasinda proteinlerde meydana gelen isi degisikliklerini ölçer. Solüsyondaki bir protein, dogal (katlanmis) konformasyon ve bunun denatüre (katlanmamis) durumu 02422-P-0002 arasinda dengededir. DSC, proteinin %50'sinin denatüre oldugu sicakligi belirlemek üzere kullanilir (termal geçis orta noktasi, Tm). Daha yüksek bir Tm degerine sahip olan proteinler, genel olarak, daha stabildir. Örnegin, birincisi (Tml), pH`a bagli olarak, yaklasik 64 - 70°C`de meydana gelen ve ikinci, ana geçis (T1112) 80°C civarinda meydana gelen olmak üzere, iki geçisi gösteren Sekil Ana geçisten (diger bir ifadeyle, düsük sicaklikta) önceki termal olaylarin, literatürde açiklanan IgGl antikorlarinin beklenen yapisal elemanlari ile ayni eksende olan antikor içerisinde (örnegin, Fab) birkaç baska alanin yayilmasi nedeniyle muhtemeldir. Vermeer (2000) Biophys. J. 78: 394. Yüksek Performansli Boyut Dislama Kromatografisi (HP-SEC) Mevcut bulusun hum13B8-b formülasyonlarindaki yüksek moleküler agirlikli (HMW) türlerin, düsük moleküler agirlikli (LMW) türlerin ve monomerin yüzdesi HP-SEC tarafindan tespit edilmistir. Test solüsyonu, bir boyut dislama kolonu YMC Co. Ltd., Kyoto, Japonya) kullanilarak HPLC tarafindan seyreltilmistir ve ayrilmistir. pik alanlari, monomer, HMW türleri ve LMW türlerinin yüzdesini belirlemek üzere kullanilir. SEC'den elüsyon pikleri, moleküler agirligi tahmin etmek ve agregatlari izlemek üzere kullanilabilen çok açili lazer isik saçilimi (SEÇ-MALLS) kullanilarak karakterize edilmistir. Monomer pikin SEC kolonundaki fragmanlardan ve agregatlardan ayrilmasindan sonra, numune, analit konsantrasyonunun hesaplanmasina ve bunun molekül agirliginin (MW) daha sonraki tahmin edilmesine olanak saglayarak, ultra viyole (UV), MALLS ve kirilma indeksi (RI) detektörlerinden geçirilir. Saçilan isigin yogunlugu (MALLS tarafindan tespit edilmistir), protein konsantrasyonunun (R1 tarafindan belirlenmistir) ürünü ve 02422-P-0002 moleküler agirlik ile orantilidir. SEC-MALLS, yaklasik olarak 138 kDa'lik bir moleküler agirliga sahip, bir baskin ana pik gösterir. Bu, SEC'nin kromatografik çözünürlügünü ve isik saçilim saptamasi göz önüne alinirken, hum13B8-b monomerinin hesaplanmis teorik moleküler agirligina ve ayni zamanda kütle spektrometrisi kullanilarak tespit edildigi üzere huml3B8-b monomerinin kütlesine fena olmayacak sekilde karsilik gelir. Yaklasik olarak 300 kDa'lik bir moleküler agirliga sahip olan yüksek moleküler agirlikli bir türün (HMWl), bir dimer türünü temsil etmesi muhtemeldir. Tüm partilerde gözlenmeyen bir ikinci HMW piki (HMWZ), bir trimer türüne karsilik gelen yaklasik olarak 465 kDaSlik bir tahmini moleküler agirliga sahip türleri içerir. Bir düsük moleküler agirlikli tür (LMW), bir fragmantasyon ürününü, örnegin mentese fragmantasyonu ürününü temsil edebilen 108 - 117 kDa'lik bir moleküler agirlik ile tespit edilir. Dinamik Isik Saçilimi (DLS) Dinamik isik saçilimi (DLS), monoklonal antikorlarin solüsyon içinde bir 0.5 nm ila 6 mm araligindaki boyut dagilim profilinin içyüzünü anlayabilen bir tekniktir. Monoklonal antikor huml3B8-b, yogunlukta yaklasik 9.5 nm'lik (ve hacimde 6.5 nm) bir ortalama hidrodinamik çapi gösterir. Bu, diger monoklonal antikorlarin degerleri ile tutarlidir. Daha yüksek iyonik mukavemetli formülasyonlar, düsük iyonik mukavemetli formülasyonlardan daha düsük hidrodinamik çaplara sahip olma egilimindedir ve tampon ve pH gibi diger solüsyon parametreleri tarafindan etkilenebilir. Bakiniz SEKILLER 11 ve H. Mevcut bulusun formülasyonlarindaki antikorlar esasen monodispersidir. Mevcut bulusun antikorlarina yönelik hidrodinamik çap, bir antikorun daha yüksek veya daha düsük iyonik mukavemetli bir tamponda seyreltildigi deneyler tarafindan kanitlandigi üzere, geri dönüsümlüdür (veriler gösterilmemistir). Bu sonuçlar, hidrodinamik çapin, bir denege uygulandiginda, enjeksiyon bölgesinin yerel çevrelerine esitlenecegini 02422-P-0002 Yüksek Performansli Iyon Degistirme Kromatografisi (HP-IEX) Huml3B8-biye yönelik yük varyantlari, bir numunedeki proteinler ve bir reçine üzerindeki immObilize edilmis yükler arasindaki elektrostatik etkilesimlere dayanan HP-IEX tarafindan tespit edilmistir. Pozitif yüklü huml3B8-b varyantlari bir zayif katyon degisim kolonunda (Dionex ProPac WCX-lO, 4 x 250 mm veya esdegeri; Thermo Scientific, Bannockburn, Ill., USA) bir negatif yüklü reçineye baglanir ve HPLC tarafindan ayrilir. Antikor, pH ve tuz konsantrasyonunun arttirilmasi, antikor varyantlarinin yükünün etkin bir sekilde azaltilmasi ve bunlarin esdeger yük iyonlari ile degistirilmesiyle ayristirilir. Elüentte huml3B8-b ve varyantlarin varligi UV tarafindan ile belirlenir. pik alanlari Asidik Varyantlar, Ana pik Sonrasi ve Bazik Varyantlarin yüzdesini belirlemek üzere kullanilir. Ana Pikten sonra ayristirilanlar Bazik Varyantlar olarak refere edilirken, ana pikten önce tespit edilen, yaklasik 23 dakikada ayristirilmis tüm türler Asidik Varyantlar olarak refere edilir. Ana Pik, C terminalinde tam lizin bölünmesi ve N terminalinde tam piroglütamat olusumu sergilerken, Asidik Varyantlarin Pikin analizi hiç N- veya C-terminal modifikasyonlarina sahip olmadiklarini ortaya koyar. Ana pik tam biyolojik aktiviteyi korur. Ana pik Sonrasi, C-terminalinde tam lizin bölünmesi ve sinirli prolin oi-amidasyonu, N-terminalinde tam piroglütamat olusumu, Met251 ve Met427 oksidasyonu sergiler ve ELISA'nin baglanmasi tarafindan ölçüldügü üzere indirgenmis potens sergiler. Bazik pik 1, C terminalinde tam lizin bölünmesi ve bazi prolin a-amidasyonu ve N terminalinde tam piroglütamat olusumu sergiler. Bazik piklerin en bol bulunan olan Bazik pik 3. C terminalinde tam lizin bölünmesi ve N terminalinde tamamlanmamis piroglutamat olusumu sergiler. Bazik Varyantlar, C-terminalinde tam lizin bölünmesi ve degisken seviyelerde prolin a-amidasyonu ve N-terminalinde tamamlamak üzere tamamlanmamis piroglutamat olusumu sergiler. Yük varyantlarinin çogunlugu biyolojik aktiviteyi korur. 02422-P-0002 Peptit Haritalamasi Peptit haritalamasi, huml3B8-b'nin birincil yapisi hakkinda bilgi saglar ve oksidasyonun gerçeklesip gerçeklesmedigini degerlendirmek üzere kullanilabilir. Sekans kapsamini arttirmak üzere, huml3B8-b'yi karakterize etmek üzere iki farkli enzimatik peptid haritasi kullanilmistir. Birincisi, endoproteinaz Lys-C sindiriminden sonra peptit haritalamasidir. Proteini denatüre etmek üzere guanidin hidroklorür ile ve disülfit baglarini indirgemek üzere ile bir huml3B8-b numunesinin tedavi edilmesiyle bir peptit haritasi elde edilmistir. Daha sonra, DTT isleminden ortaya çikan serbest tiyolleri alkillestirmek üzere numuneler iyodoasetamid (IAM) ile tedavi edilmistir. Numuneler daha sonra endoproteinaz Lys-C ile sindirilmistir. Ortaya çikan peptitlerin analizi, elektrosprey kütle spektrometrisine birlestirilmis tersine çevrilmis fazli sivi esdegeri; Waters Corporation, Milford, Mass., USA) kullanilarak gerçeklestirilmistir. bunlarin kütle spektrometrisi kullanilarak tespit edilen kütlelerinin yani sira hafif (L) ve agir (H) zincirlerinden kaynaklanan peptit sekanslari Tablo 3'te verilir. Tutma süreleri, kromatografi sirasinda 90 dakika boyunca 214 nm'de ultraviyole emilimi ile belirlenmistir. IAM ile alkillenmis sistein kalintisi basina net 57 Da'lik bir kütlenin ilave edilmesiyle sistein kalintilarinin alkilasyonuna yönelik olarak kütleler düzeltilmistir. Huml3B8-b'nin tamamlayicilik belirleyici bölgesinden (CDR) kaynaklanan bes peptid özellikle ilgi konusudur. Piroglütamate N-terminal agir zincir peptidi, lisin-kirpilmis C- terminal agir zincir peptidi ve birkaç metiyonin ile oksitlenmis ve deamidatlanmis peptidler gibi yaygin post translasyonel olarak modifiye edilmis peptitler de gözlenmistir. Bu modifikasyonlarin hiçbiri molekülün CDR'lerinde bulunmaz. Rutin peptit haritalama deneyleri kütle spektrometrisi kullanilmadan gerçeklestirilebilir ve bir stabilite (test) numunesi ve bir kontrol (referans) 02422-P-0002 numunesi gibi numuneleri karsilastirmak üzere gözlemlenen piklerin tutulma süreleri kullanilabilir. Tripsin sindirimini kullanan bir ikinci peptit haritalama yöntemi, Lys-C peptit haritasinda iyi temsil edilmeyen agir zincirin 64 - 120 kalintilari üzerine kapsama ilave etmek üzere gelistirilmistir. Endoproteinaz C ile paylasilan lizin kalintilarinin bölünme bölgesi C-terminaline ek olarak, tripsin ayni zamanda, bir daha küçük peptit seti ile sonuçlanarak, arginin kalintilarinin C-terminalini de böler (bir sonraki tortu P olmadigi sürece). Agir zincirin 64 ila 120 kalintilarindan ortaya çikan peptitler, UV absorbans tespiti ve kütle spektrometrisi (pik notuna yönelik olarak) ile birlestirilmis tersine çevrilmis faz sivi kromatografisi kullanilarak tespit edilmistir. Huml3B8-b'nin ilgili triptik peptid fragmanlari Tablo 3'te dahil edilir. Endoproteinaz Lys-C ve Tripsin ile Peptit Haritalama Zincir Peptit Tutulma süresi Gözlemlenen kütle Notlar 02422-P-0002 Endoproteinaz Lys-C ve Tripsin ile Peptit Haritalama 338-359 133-146 414-438 360-369 121- 132 274-287 414-438 370-391 370-391 370-391 248-273 392-408 248-273 288-316 288-316 288-316 222-247 274-325 222-245 147-209 13-63 Tutulma süresi 43.49 43.81 45.04 47.39 47.97 50.08 52.65 56.90 57.27 58.13 60.30 62.47 63.11 70.98 71.19 71.39 71.74 73.05 73.88 82.40 93.78 Gözlemlenen kütle 2509.32 1320.68 3059.36 1160.62 1 185.65 1676.80 3043.37 2544.09 2543. 10 2544. 10 2970.41 1872.92 2954.42 5066.36 4904.28 4758.17 2843.43 6096.43 2618.29 6712.66 5696.78 Notlar M427 oksitlenmis N383 isoD N383 D M251 oksitlenmis 02422-P-0002 Zincir Peptit Tutulma süresi Gözlemlenen kütle Notlar UV Spektroskopisi ile Protein Konsantrasyonu Mevcut bulusun solüsyon formülasyonlarindaki huml3B8-b antikorunun protein konsantrasyonu UV spektroskopisi ile belirlenir. Belirleme, triptofan, tirozin ve sistein kalintilari gibi amino asitler tarafindan 280 nm'de UV isiginin emilimine baglidir. 280 nm'de emilim, 320 nm'de emilim kullanilarak isik saçilmasina 02422-P-0002 yönelik olarak düzeltilir. Yöntem, numunenin su içinde bir gravimetrik seyreltilmesini ve 280 nm`de emiciligi ve 320 nm'de emiciligi olusturmak üzere bir UV spektrumunun kaydedilmesini içerir. Bu absorbans degerleri ve deneysel olarak belirlenen 1.44 mL mg" cm"'lik sönme katsayisi, huml3B8-b konsantrasyonunu hesaplamak üzere kullanilir. Biyolojik Aktivite - Hücre Bazli Fonksiyonel Analiz Mevcut bulusun formülasyonlarindaki huml3B8-b'nin insan IL-23'ün biyolojik aktivitelerini bloke etme kabiliyetini degerlendirmek üzere bir fonksiyonel hücre bazli analiz gelistirilmistir. Bu analiz, huml3B8-b'nin, bir IL-23,e yanit veren hücre hattinda (Kit 225) IL-23 ile indüklenen STAT3 aktivasyonunu inhibe etme kabiliyetini degerlendirir. Bir huml3BS-b referans materyali ve test numunesinin seri seyreltileri, Kit225 IL-23'e yanit veren hücreler ile inkübasyon tarafindan takip edilen, bir sabit insan IL-23 konsantrasyonu ile inkübe edilir. STAT3 fosforilasyonunun huml3B8-b tarafindan inhibisyonu, peroksidaz ile konjüge edilmis anti-IgG ile inkübasyon ve kemilüminesan maddenin ilavesi tarafindan takip edilen, STAT3 yakalama ve anti-p-STAT3 tespit etme antikor çifti kullanilarak ELISA ile hücre lisatlarinda ölçülür. Bir inhibisyon yanit egrisi ("standart egri"), bir dogrusal olmayan regresyon dört parametre lojistik uyumu kullanilarak üretilir, burada IC50 degeri, maksimum yanitin 50'sini inhibe eden anti-IL-23 konsantrasyonunu temsil eder. Test numunesinin nispi potensi, test numunesinin inhibisyon tepkisi egrisinin standart egri ile karsilastirilmasi ile degerlendirilir ve referans yüzdesi olarak hesaplanir. Ayni numunenin çoklu kopyalarina yönelik nispi potens degerleri bir tek raporlanabilir deger - bagil potensin bir geometrik ortalamasi halinde birlestirilir. 02422-P-0002 Biyolojik Aktivite - ELISA Baglanmasi Mevcut bulusun formülasyonlardaki hum13B8-b'nin insan IL-23'e yönelik afinitesi bir denge baglayici ELISA'da degerlendirilir, burada referans materyali ve test numunelerinin seri seyreltilmeleri insan lL-23 sitokin ile kaplanmis analiz plakalarina uygulanir. Bu analiz, örnegin, çesitli potansiyel terapötik formülasyonlarda biyolojik aktivitenin tutulmasini degerlendirmek üzere kullanilabilir. Test numunesinin nispi potensi, test numunesinin doz yanit egrisinin referans materyalinin doz yanit egrisi ile karsilastirilmasiyla degerlendirilir ve referans yüzdesi olarak hesaplanir. ELISA'lar teknikte iyi bilinen yöntemler ile gerçeklestirilir. Kisaca, mevcut bulusun bir formülasyonundaki huml3B8-b`nin seri seyreltileri, daha önceden insan IL-23 proteini ile kaplanmis ve daha sonra bloke edilmis olan bir mikrotitre plakasinin oyuklarina ilave edilir. Bir inkübasyon periyodundan sonra, oyuklar yikanir ve bir peroksidaz ile konjuge keçi anti-insan IgG (FC) tespit etme antikoru reaktifi ilave edilir. Kuyucuklar tekrar yikanir ve bir kemilüminesan peroksidaz maddesi ilave edilir. Sinyal kemilüminesans ile okunur. Bir dogrusal olmayan regresyon dört parametrik lojistik uyumu kullanarak bir sigmoidal doz yanit egrisi üretilir, burada EC50 degeri maksimum IL-23 baglanma sinyalinin %50'sini elde etmek üzere gerekli olan konsantrasyonu temsil eder. Nispi biyolojik potens, test numuneleri ile elde edilen sonuçlarin referans numune ile elde edilen sinyal seviyelerine bagli bir standart egri ile karsilastirilmasiyla hesaplanir. Sonuçlar, referans antikor solüsyonu ile karsilastirildigi üzere biyolojik potens yüzdesi olarak sunulur. Ayni numunenin çoklu kopyalarina yönelik bagil potens degerleri bir tek raporlanabilir deger - bagi] potensin bir geometrik ortalamasi halinde birlestirilir. 02422-P-0002 SDS Kapiler Elektroforezi (CE-SDS) Sodyum dodesil sülfat ile kapiler elektroforezi (CE-SDS), boyuta bagli olarak proteinleri ayirir. CE-SDS, indirgeyici olmayan kosullar altinda veya indirgeyici kosullar altinda gerçeklestirilebilir. Indirgeyici CE-SDS ayristirilmis agir ve hafif zincirleri birbirinden ve yani zamanda numunedeki diger potansiyel türlerinden çözerken, indirgeyici olmayan CE-SDS bozulmamis antikorlari numunedeki diger Indirgeyici olmayan CE-SDS, serbest sistein kalintilarini alkillestirmek üzere antikor hum13B8-b numunelerinin N-etilmaleimit ve SDS varliginda isi denatürasyonunu gerektirir. Daha sonrasinda, numune, ayirmaya yönelik olarak eleme seçiciligi saglayan bir yer degistirebilir SDS polimer matrisi içeren bir kapiler içinde ayrilir. Test numunesindeki tüm pikler entegre edilir ve pik bölgeleri, numunedeki Ana IgG (bozulmamis antikor) yüzdesini belirlemek üzere kullanilir. Indirgeyici CE-SDS, disülfit baglarini indirgemek üzere antikor huml3B8-b numunelerinin 2-merkaptoetanol ve SDS varliginda isi denatürasyonunu gerektirir. Daha sonrasinda, numune, ayirmaya yönelik olarak eleme seçiciligi saglayan bir yer degistirebilir SDS polimer matrisi içeren bir kapiler içinde ayrilir. Test numunesindeki tüm pikler entegre edilir ve pik bölgeleri hum13B8-b'deki agir ve hafif zincirlerin yüzdesini belirlemek üzere kullanilir. Çökeltme Hizi Analitik Ultrasantrifüj (SV-AUC) 02422-P-0002 Mevcut bulusun formülasyonlarindaki hum13B8-b antikorunun dört bilesenli yapisini sorusturmak üzere SV-AUC kullanilmistir. SV-AUC, moleküllerin bir santrifüj kuvvete yanit olarak çökeldigi hizi ölçer. Bu çökeltme hizi, numunede mevcut olan moleküllerin moleküler agirligi hakkinda bilgi saglar. Hum13B8-b, baskin olarak, 7.0S'1ik bir çökeltme katsayisina (S20, W) sahip bir tür olarak çöker. Bu tür, monomerin beklenen moleküler agirligi ile ayni hizada olan yaklasik olarak 150 kDa'lik bir tahmini moleküler agirliga sahiptir. Makromolekülün hidrasyonuna ve sekline bagli olan sürtünme orani, parçalar arasinda benzerdir. Antikor Formülasyonlarinin Genisletilmis Stabilitesi Mevcut bulusun antikor formülasyonlarina yönelik ilave uzun dönemli stabilite verileri elde edilmistir. 24 aya kadar olan örnekleyici stabilite verileri, Parçalar E ve Daye yönelik olarak asagidaki Tablolar 4 - 9'da sunulur. TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR