RS61872B1

RS61872B1 - Kompozicije koje sadrže bakterijske sojeve

Info

Publication number: RS61872B1
Application number: RS20210627A
Authority: RS
Inventors: Helene Savignac; Imke Elisabeth MULDER; Alexander James Stevenson
Original assignee: 4D Pharma Res Ltd
Priority date: 2017-05-22
Filing date: 2018-05-22
Publication date: 2021-06-30
Also published as: US11382936B2; JP2020520911A; EP3630136A1; SMT202100420T1; CY1124286T1; MA48939B1; WO2018215760A1; WO2018215758A1; CA3064171A1; PL3630136T3; ES2955870T3; TW201907929A; US20220184145A1; EP3630136B1; DK3630136T3; MA48941A; HUE054164T2; SI3630136T1; MD3630136T2; MA48939A

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Pronalazak se odnosi na kompozicije koje sadrže bakterijske sojeve izolovane iz crevnog trakta sisara, kao i na primenu ovih kompozicija u lečenju bolesti.

POLJE PRONALASKA

[0002] Smatra se da su ljudska creva sterilna in utero, ali da su odmah nakon rođenja izložena mnoštvu majčinskih i sredinskih mikroorganizama. Od tog trenutka počinje dinamičan period mikrobne kolonizacije i sukcesije, koji se odvija zavisno od brojnih faktora, među kojima su način porođaja, okruženje, ishrana i genotip domaćina, a svi oni utiču na konačan sastav mikrobiote creva, naročito tokom ranog života jedinke. Nakon tog perioda se mikrobiota stabilizuje i zadobija sastav sličan kao kod odraslih [1]. Mikrobiota ljudskih creva sadrži više od 1500 različitih filotipova, među kojima po zastupljenosti dominiraju dva glavna bakterijska razdela (filum), Bacteriodetes i Firmicute [2-3]. Uspešni simbiotski odnosi koji se uspostavljaju bakterijskim naseljavanjem čovečjih creva rezultuju veoma značajnim metaboličkim, strukturnim, zaštitnim i korisnim funkcijama. Povećana metabolička aktivnost kolonizovanih creva omogućava razgradnju inače za čoveka nerazgradivih komponenti hrane, uz oslobađanje nus-proizvoda koji imaju dodatni povoljan uticaj na zdravlje čoveka. Takođe je dobro poznat imunološki značaj mikrobiote creva, koji je dokazan je u animalnom modelu, poremećajem funkcije imunskog sistema kod sterilnih životinja, i njegovim funkcijskim oporavkom uvođenjem komensalnih bakterija [4-6].

[0003] Gastrointestinalni poremećaji, kao što je inflamatorna bolest creva (IBD), praćeni su značajnim promenama mikrobiotskog sastava. Na primer, sadržaj bakterija Clostridium klaster XIVa i Clostridium klaster XI (F. prausnitzii) niži je kod pacijenata koji boluju od IBD, dok je broj E. coli povećan, što ukazuje na poremećaj ravnoteže između simbionta i patobionta u crevima ovih bolesnika [7-11].

[0004] Potencijalno pozitivan uticaj koji neki sojevi bakterija mogu imati na rad creva, priznat je njihovim uvođenjem u terapiju različitih bolesti (videti, na primer, [12-15]).

Bakterije u čovekovim crevima proizvode masne kiseline kratkog lanca (SCFAs), koje se koriste u terapiji autoimunskih i/ili inflamatornih poremećaja [16]. Veliki broj bakterijskih sojeva, uključujući pre svega sojeve Lactobacillus i Bifidobacterium, predloženo je za upotrebu u lečenju brojnih bolesti creva (za pregled, videti [17]). Neki bakterijski sojevi, konkretno, butirogene bakterije, predložene su za lečenje i/ili prevenciji infekcija Clostridium difficile [18].

[0005] Pokazano je da Clostridium butyricum smanjuje cerebralnu ishemiju/reperfuziju u mišjem modelu bolesti ([19] i [20]). Primena C. butyricum snažno moduliše sastav crevne mikrobiote, što je u direktnoj korelaciji sa promenama nivoa neurotrofina i monoaminskih neurotransmitera koji su uključeni u neurološke funkcije. Zbog kompleksnosti uključenih molekula, autori navedene studije zaključuju da je neuroprotektivni mehanizam kojim C. butyricum proizvodi ove efekte teško objasniti. Tretman C. butyricum doveo je do smanjenja apoptoze, usled aktivacije PI3K/Akt i sledstvenog smanjenja nivoa kaspaze-3. Iz literature je poznato da PI3K/Akt signalni put ostvaruje protektivni efekat u psihijatrijskim bolestima.

[0006] Sojevi roda Blautia takođe modulišu mikrobni sastav i balans u digestivnom ekosistemu [21], pa su predložene konkretne vrste za primenu u lečenju sistemskih bolesti nezavisnih od crevnog sistema [22]. Ipak, uticaj pojedinačnih bakterijskih sojeva na različite bolesti, kao i precizni efekti konkretnih bakterijskih sojeva na rad creva i na funckionisanje celog organizma, kao i na konkretne bolesti, nisu dovoljno rasvetljeni.

[0007] Postoji potreba da se okarakterišu potencijalni efekti crevnih bakterija, kako bi se razvile nove terapije koje se baziraju na crevnim bakterijama.

[0008] WO2016/203218 obelodanjuje kompozicije koje sadrže bakterijske sojeve za lečenje i prevenciju inflamatornih i imunskih bolesti. US2016/143961 obelodanjuje probiotske i prebiotske kompozicije, i njihovu primenu u terapiji i prevenciji odbacivanja grafta nakon transplantacije. WO2015/033305 obelodanjuje primenu kompozicije koja sadrži mikroorganizme za povećanje crevne produkcije butirične kiseline, folne kiseline ili niacina i/ili na smanjenje produkcije ćilibarne kiseline u crevima. WO2017/148596 obelodanjuje kompozicije koje sadrže bakterijske sojeve Blautia, u terapiji visceralne hipersenzitivnosti.

Ji et al. analiziraju zajednice crevnih mikroba na moždani infarkt i ishemiju, primenom tehnologije visokopropusnog sekvencioniranja i praćenjem metabolizma šećera i lipida. Paven et al. razmatraju uticaj mikrobioma creva na razvoj multiple skleroze, Liu et al razmatraju novu klasifikaciju Clostridium coccoides, Ruminococcus hansenii, Ruminococcus hydrogenotrophicus, Ruminococcus luti, Ruminococcus productus i Ruminococcus schinkii, kao Blautia coccoides gen. nov., comb. nov., Blautia hansenii comb. nov., Blautia hydrogenotrophica comb. nov., Blautia luti comb. nov., Blautia producta comb. nov., Blautia schinkii comb. nov. i opis Blautia wexlerae sp. nov., izolovanih iz fecesa ljudi.

SAŽETAK PRONALASKA

[0009] Pronalazači su razvili nove terapije u lečenju moždane povrede. Konkretno, pronalazači su otkrili da bakterijski sojevi roda Blautia mogu biti efikasni u lečenju moždane povrede. Kao što je opisano u primerima, oralna primena kompozicija koje sadrže Blautia hydrogenotrophica može se primeniti u lečenju moždane povrede, podsticanju oporavka i unapređenju neuroloških funkcija, motornih sposobnosti i socijalnog prepoznavanja u mišjem modelu okluzivne moždane povrede čoveka. Stoga, u prvom obliku izvođenja, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Blautia, za primenu u postupku lečenja moždane povrede.

[0010] U poželjnim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži bakterijski soj roda Blautia, za primenu u postupcima lečenja ili prevencije moždane povrede. U poželjnim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji moždanog udara. U naročito poželjnom obliku izvođenja, moždani udar je cerebralna ishemija. U nekim oblicima izvođenja, cerebralna ishemija je ishemijski udar. U nekim oblicima izvođenja, moždani udar je hemoragijski udar.

[0011] U poželjnim oblicima izvođenja, bakterijski soj je Blautia hydrogenotrophica. Mogu se koristiti i veoma srodni sojevi, kao što su bakterijski sojevi koji poseduju sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci 16s rRNK bakterijskog soja Blautia hydrogenotrophica. Poželjno, bakterijski soj ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci SEQ ID NO:5. Najpoželjnije je da je bakterijski soj u sastavu kompozicije Blautia hydrogenotrophica koji je deponovan pristupnim brojem DSM 14294.

[0012] U daljim oblicima izvođenja, bakterijski soj u sastavu kompozicije je Blautia stercoris. Mogu se koristiti visoko srodni sojevi, kao što su bakterijski sojevi koji imaju sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci 16s rRNK bakterijskog soja Blautia stercoris. Poželjno, bakterijski soj ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvencama SEQ ID NO:1 ili 3. Poželjno je da je identitet sekvence SEQ ID NO:3. Poželjno, bakterijski soj za primenu prema ovom pronalasku ima sekvencu 16s rRNK koja je predstavljena sekvencom SEQ ID NO:3.

[0013] U daljim oblicima izvođenja pronalaska, bakterijski soj u sastavu kompozicije je Blautia wexlerae. Mogu se primeniti i visoko-srodni sojevi, kao što su bakterijski sojevi koji imaju sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci 16s rRNK bakterijskog soja Blautia wexlerae. Poželjno, bakterijski soj ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvencama SEQ ID NO:2 ili 4. Poželjno, sekvenca je identična sekvenci SEQ ID NO:4. Poželjno, bakterijski soj za primenu prema ovom pronalasku ima sekvencu 16s rRNK koja je predstavljena SEQ ID NO:4.

[0014] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku je za oralnu primenu. Oralna primena sojeva prema pronalasku može biti efikasna u lečenju moždane povrede. Takođe, oralna administracija je komotna za primenu, kako za pacijenta, tako i lekaru, jer omogućava unošenje bakterijske kompozicije u creva i/ili delimičnu ili potpunu kolonizaciju creva.

[0015] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih eksipijenasa ili nosača.

[0016] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži bakterijski soj koji je prethodno liofilizovan. Liofilizacija je efikasan i uobičajen postupak pripreme stabilnih bakterijskih kompozicija.

[0017] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje prehrambeni proizvod koji sadrži kompoziciju, kao što je prethodno opisano.

[0018] U nekim instancama, opis pronalaska obezbeđuje vakcinu koja sadrži opisanu kompoziciju.

[0019] Dodatno, u nekim instancama pronalazak obezbeđuje postupak lečenja povrede mozga, koji obuhvata administraciju kompozicije koja sadrži bakterijski soj roda Blautia.

KRATAK OPIS SLIKA

[0020]

Slika 1: Analiza neuroloških funkcija i motornih sposobnosti u mišjem modelu cerebralne ishemije-reperfuzije I/R, primenom testa obrnute rešetke, kod miševa koji su primili tretman Blautia hydrogenotrophica i ne-tretiranih kontrola.

Slika 2: Analiza neuroloških funkcija i socijalnog prepoznavanja u animalnom modelu cerebralne ishemije-reperfuzije I/R, pomoću testa socijalnog prepoznavanja, na miševima koji su primili tretman Blautia hydrogenotrophica i netretiranih kontrolnih miševa.

Slika 3: Efekat administracije Blautia hydrogenotrophica (10<10>/dan tokom perioda od 14 dana) na proizvodnju masnih kiselina kratkog lanca (RMN<1>H) u cekalnom uzorku zdravih HIM pacova.

Slika 4: qPCR analiza populacije B. hydrogenotrophica u fekalnim uzorcima IBS-HMA pacova, tretiranih kompozicijom koja sadrži B. hydrogenotrophica (BlautiX) tokom 28 dana i ne-tretiranih kontrola.

Slika 5: Koncentracije masnih kiselina kratkog lanca (SCFA) u uzorcima cekuma IBS-HMA pacova tretiranih B. hydrogenotrophica (Blautix) tokom 28 dana i ili netretiranih kontrola. Slika 5A prikazuje koncentracije ukupnih SCFA. Slika 5B prikazuje koncentracije sirćetne kiseline, propionske kiseline i butirične kiseline.

Slika 6: Histološka evaluacija tkivnih uzoraka miševa tretiranih bakterijskom kompozicijom koja sadrži B. hydrogenotrophica (Blautix). Slika 6A prikazuje semikvantitativnu procenu nivoa piknoze na osnovu histološke analize tkivnih preseka obojenih primenom histoloških boja H&E. Miševi tretirani kompozicijom prema pronalasku (5M) ispoljavaju značajno manji stepen piknoze u poređenju sa netretiranim kontrolnim miševima (negativna kontrola) (2M) (p < 0.0001). Slika 6B prikazuje semikvantitativnu procenu stepena vakuolizacije na histološkim preparatima obojenim H&E. Miševi tretirani kompozicijom prema pronalasku (5M) ispoljavaju značajno manji stepen vakuolizacije u poređenju sa negativnim kontrolama (2M) (p = 0.098). Slika 6C prikazuje reprezentativne mikrografije H&E obojenih preseka - tamna piknotička jedra neurona i nabubrele svetle vakuole u citoplazmi oštećenih neurona.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Bakterijski sojevi

[0021] Kompozicije prema pronalasku sadrže bakterijski soj roda Blautia. Primeri pokazuju da bakterije ovog roda ostvaruju pozitivne efekte u lečenju povrede mozga. Poželjni bakterijski sojevi su sojevi vrsta Blautia hydrogenotrophica, Blautia stercoris i Blautia wexlerae. Ostali poželjni bakterijski sojevi prema pronalasku su sojevi vrsta Blautia producta, Blautia coccoides i Blautia hansenii.

[0022] Primeri sojeva Blautia za primenu prema pronalasku obuhvataju sojeve Blautia hydrogenotrophica, B. stercoris, B. faecis, B. coccoides, B. glucerasea, B. hansenii, B. luti, B. producta, B. schinkii i B. wexlerae. Vrste Blautia roda su Gram – pozitivne, nepokretne bakterije, koje mogu biti kokoidne ili ovalne i obligatno su anaerobne, a proizvode sirćetnu kiselinu, kao glavni krajnji proizvod fermentacije glukoze [23]. Vrste roda Blautia mogu se izolovati iz čovečjeg creva, mada je B. producta izolovana iz uzoraka sepse.

[0023] Blautia hydrogenotrophica (ranije poznata kao Ruminococcus hydrogenotrophicus) izolovana iz creva sisara, isključivo je anaerobna i metaboliše H2/CO2do sirćetne kiseline, koja može biti važna za ljudsku ishranu. Tip soja Blautia hydrogenotrophica je S5a33 = DSM 14294 = JCM 14656. Pristupni broj kod GenBank za gensku sekvencu 16S rRNK Blautia hydrogenotrophica soja S5a36 je X95624.1 (ovde obelodanjen kao SEQ ID NO:5). Ovaj uzorni soj Blautia hydrogenotrophica opisan je u [19] i [24]. Sojevi S5a33 i S5a36 odgovaraju subklonovima sojeva izolovanih iz fekalnog uzorka zdravog ispitanika. Oni imaju istu morfologiju, fiziologiju i metabolizam i imaju identične sekvence 16S rRNK. Stoga, u nekim oblicima izvođenja, Blautia hydrogenotrophica za primenu prema pronalasku ima sekvencu 16S rRNK prikazanu u SEQ ID NO:5.

[0024] Bakterije Blautia hydrogenotrophica deponovane pod pristupnim brojem DSM 14294, testirane su u primerima, a ovde se pominju kao soj BH i Blautix. Soj BH je poželjan soj prema pronalasku. Soj BH deponovan je kod Deutsche Sammlung von Mikroorganismen [German Microorganism Collection] (Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany), pod pristupnim brojem DSM 14294 kao "S5a33", na dan 10. maja 2001. godine. Deponovalac je kompanija INRA Laboratoire de Microbiologie CR de Clermont-Ferrand/Theix 63122 Saint Genes Champanelle, France. Vlasništvo nad depozitom preneto je ustupanjem na kompaniju 4D Pharma Plc. Putem ugovora, 4D Pharma Plc dozvolila je kompaniji 4D Pharma Research Limited da se u prijavi pozove na deponovani biološki materijal i dala je bezrezervnu i neopozivu saglasnost da se deponovani biološki materijal obelodani.

[0025] Pristupni broj kod GenBank za sekvencu gena za 16S rRNK soja Blautia stercoris GAM6-1<T>je HM626177 (ovde obelodanjen kao sekvenca SEQ ID NO:1). Uzoran soj Blautia stercoris opisan je u [25]. Tip soja Blautia wexlerae je WAL 14507 = ATCC BAA-1564 = DSM 19850 [19]. Pristupni broj kod GenBank za sekvencu gena za 16S rRNK soja Blautia wexlerae WAL 14507 T je EF036467 (predstavljen ovde kao SEQ ID NO:2). Uzorni soj Blautia wexlerae opisan je u [19].

[0026] Poželjan soj Blautia stercoris je soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42381, koji se ovde navodi i kao soj 830. Sekvenca 16S rRNK za soj 830 predstavljena je u SEQ ID NO:3. Soj 830 deponovan je kod međunarodne depozitorne institucije NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland), od strane kompanije GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB252ZS, Scotland), na dan 12. marta 2015, kao "Blautia stercoris 830" i dodeljen mu je pristupni broj NCIMB 42381. Ubrzo zatim kompanija GT Biologics Ltd. promenila je ime u 4D Pharma Research Limited.

[0027] Poželjan soj Blautia wexlerae je soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42486, koji se ovde pominje pod imenom soj MRX008. Sekvenca 16S rRNK za soj MRX008 prikazana je u SEQ ID NO:4. Soj MRX008 deponovan je kod međunarodne depozitarne institucije NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB219YA, Scotland) od strane 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland), na dan 16. novembra 2015. godine, kao "Blautia/Ruminococcus MRx0008" i dodeljen mu je pristupni broj NCIMB 42486.

[0028] Očekuje se da bi svi bakterijski sojevi visoko srodni soju koji je testiran u primerima mogli biti efikasni u lečenju povrede mozga. U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj za primenu prema pronalasku ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci 16s rRNK bakterijskog soja Blautia hydrogenotrophica. Poželjno, bakterijski soj za primenu prema pronalasku ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% indentična sekvenci SEQ ID NO:5.

[0029] U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj za primenu prema pronalasku, ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci 16s rRNK bakterijskog soja Blautia stercoris. Poželjno, bakterijski soj za primenu prema pronalasku ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3. Poželjno, sekvenca je identična sekvenci SEQ ID NO:3. Poželjno, bakterijski soj za primenu prema pronalasku ima sekvencu 16s rRNK, predstavljenu sekvencom SEQ ID NO:3. U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj za primenu prema pronalasku ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci 16s rRNK bakterijskog soja Blautia wexlerae. Poželjno, bakterijski soj za primenu prema pronalasku ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvencama SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4. Poželjno, sekvenca je identična sekvenci SEQ ID NO:4. Poželjno, bakterijski soj za primenu prema pronalasku ima sekvencu 16s rRNK koja je predstavljena sekvencom SEQ ID NO:4.

[0030] Očekuje se da bakterijski sojevi koji su biotipovi bakterija deponovanih pod pristupnim brojem DSM 14294 ili biotipovi bakterija deponovanih pod pristupnim brojevima NCIMB 42381 i NCIMB 42486 takođe mogu biti efikasni u lečenju povrede mozga. Biotip je visoko srodan soj koji ima ista ili veoma slična biohemijska svojstva.

[0031] Sojevi koji su biotipovi bakterija deponovanih pod pristupnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486 i koji su pogodni za primenu prema pronalasku, mogu se identifikovati sekvencioniranjem drugih nukleotidnih sekvenci bakterija deponovanih pod pristupnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486. Na primer, moguće je sekvecionirati celokupan genom, i soj biotipa za primenu prema pronalasku može imati najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identičnosti sekvence duž najmanje 80% ukupnog genoma (na primer, duž najmanje 85%, 90%, 95% ili 99%, ili duž celog genoma). Na primer, u nekim oblicima izvođenja, soj biotipa ima najmanje 98% identičnosti sekvence duž 98% svog genoma ili najmanje 99% identičnosti sekvence duž 99% genoma. Ostale pogodne sekvence koje mogu poslužiti u identifikaciji sojeva biotipa uključuju hsp60 ili repetitivne sekvence, kao što su BOX, ERIC, (GTG)5, ili REP ili [26]. Sojevi bitipa mogu imati sekvence sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identičnosti sa odgovarajućim sekvencama bakterija deponovanih pod pristupnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486. U nekim oblicima izvođenja, soj biotipa ima sekvencu koja je najmanje 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična odgovarajućoj sekvenci soja Blautia hydrogenotrophica, deponovanoj pod pristupnim brojem DSM 14294 i koja obuhvata sekvencu 16S rRNK koja je najmanje 99% identična (na primer, najmanje 99.5% ili najmanje 99.9% identična) sekvenci SEQ ID NO:5. U nekim oblicima izvođenja, soj biotipa ima sekvencu sa najmanje 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identičnosti sa odgovarajućom sekvencom soja Blautia hydrogenotrophica, deponovanoj pod pristupnim brojem DSM 14294 i ima sekvencu 16S rRNK kao u SEQ ID NO:5.

[0032] Alternativno, sojevi koji su biotipovi bakterija deponovanih pod pristipnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486 i koji su pogodni za primenu prema pronalasku, mogu se identifikovati pomoću sekvence deponovane pod pristupnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486, i restrikcionom analizom i/ili PCR analizom, na primer, pomoću fluoresecentnog polimorfizma dužine umnoženih fragmenata (FAFLP) i repetitivnog DNK (rep)-PCR fingerprintinga, ili proteinskog profiliranja, ili parcijalnog sekvencioniranja 16S ili 23s rDNK. U poželjnim oblicima izvođenja, ove tehnike mogu se primeniti za identifikovanje drugih sojeva Blautia hydrogenotrophica, Blautia stercoris ili Blautia wexlerae.

[0033] U nekim oblicima izvođenja, sojevi koji su biotipovi bakterija deponovanih pod pristupnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486, a koji su pogodni za primenu prema pronalasku, jesu sojevi koji daju isti obrazac reakcije kao bakterije deponovane pod pristupnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486, kada se analiziraju amplifikovanom ribozomalnom DNK restrikcionom analizom (ARDRA), uz korišćenje restrikcionog enzima Sau3AI (za primere postupaka i uputstva, videti [27]). Alternativno, sojevi biotipa se identifikuju kao sojevi koji imaju identične obrasce fermentacije ugljenih hidrata, kao bakterije koje su deponovane pod pristupnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486.

[0034] Ostali sojevi roda Blautia koji se mogu primeniti u pravljenju kompozicija i postupcima prema pronalasku, kao što su biotipovi bakterija deponovani pod pristupnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486, mogu se identifikovati primenom odgovarajućeg postupaka ili strategija, koje obuhvataju testove opisane u primerima. Na primer, sojevi za primenu prema pronalasku mogu se identifikovati kultivisanjem bakterija i testiranjem na miševima u modelu okluzije. Na primer, saglasno pronalasku mogu se koristiti bakterijski sojevi koji ispoljavaju isti obrazac rasta, metabolički tip i/ili površinske antigene kao i bakterije deponovane pod pristipnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486. Primenljivi soj ispoljiće sličnu sposobnost modulacije sastava mikrobiote kao sojevi DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486. Konkretno, biotipa soja izazvaće sličan uticaj na povredu mozga slično onome što je prikazano u primerima, a što se može identifikovati kultivisanjem i protokolima administracije kao što je opisano.

[0035] Naročito pogodan soj za primenu prema pronalasku je soj Blautia hydrogenotrophica, deponovan pod pristupnim brojem DSM 14294. To je reprezentativni BH soj testiran u primerima, za koji se pokazalo da je efikasan u lečenju bolesti. Stoga, pronalazak obezbeđuje ćeliju, kao što je neka izolovana ćelija soja Blautia hydrogenotrophica, koji je deponovan pod pristupnim brojem DSM 14294, ili njen derivat, za primenu u lečenju, posebno u lečenju bolesti koje su ovde opisane.

[0036] Derivati sojeva deponovanih pod pristipnim brojevima DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486 mogu biti kćeri ćelije (potomstvo) ili sojevi nastali kultivisanjem (subkloniranjem) originala. Derivat soja prema pronalasku moguće je modifikovati na genetičkom nivou, bez uklanjanja biološke aktivnosti. Konkretno, derivat soja prema pronalasku je terapeutski aktivan. Derivat soja ima sličnu sposobnost da moduliše sastav mikrobiote kao što to imaju originalni sojevi DSM 14294, NCIMB 42381 ili NCIMB 42486. Konkretno, derivat soja imaće sličan uticaj na povredu mozga kao što je

1

opisano u Primerima, a ti uticaji se mogu opisati kultivisanjem i primenom protoka opisanih u Primerima. Derivat soja DSM 14294 načelno je biotip soja DSM 14294. Derivat soja NCIMB 42381 je načelno biotip soja NCIMB 42381. Derivat soja NCIMB 42486 je načelno biotip soja NCIMB 42486.

[0037] Referisanje na ćelije soja Blautia hydrogenotrophica deponovane pod pristupnim brojem DSM 14294 obuhvata sve ćelije koje imaju isti bezbednosti profil i terapeutsku efikasnost kao sojevi deponovani pod pristupnim brojem DSM 14294, i te ćelije su obuhvaćene pronalaskom. Referisanje na ćelije soja Blautia stercoris, koji je deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42381, obuhvata sve ćelije koje imaju isti bezbednosni profil i terapeutsku efikasnost kao sojevi deponovani pod pristupnim brojem NCIMB 42381, i ove ćelije su obuhvaćene pronalaskom. Referisanje na ćelije soja Blautia wexlerae, koji je deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42486, obuhvata sve ćelije koje imaju isti bezbednosni profil i terapeutsku efikasnost, kao sojevi deponovani pod pristupnim brojem NCIMB 42486, i ove ćelije su obuhvaćene pronalaskom.

[0038] U poželjnim oblicima izvođenja, bakterijski sojevi u kompoziciji prema pronalasku su vijabilni i sposobni da delimično ili potpuno kolonizuju creva.

Terapeutske primene

[0039] Kompozicije prema pronalasku se primenjuju u lečenju povrede mozga. Primeri pokazuju da kompozicije prema pronalasku pomažu oporavak i poboljšavaju neurološke funkcije, motorne sposobnosti i socijalno prepoznavanje u mišjem modelu okluzione povrede mozga, usled čega mogu biti korisne u lečenju povreda mozga.

[0040] U nekim oblicima izvođenja, povreda mozga je traumatska povreda mozga. U nekim oblicima izvođenja, povreda mozga je stečena povreda mozga. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku se koriste u terapiji povrede mozga koja je nastala usled trauma. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku se koriste u terapiji povrede mozga koja je rezultat tumora. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku se koriste u terapiji povrede mozga koja je nastala usled moždanog udara. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku se koriste u terapiji povrede mozga koja je nastala usled krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku se primenjuju u terapiji povrede mozga koja je nastala usled encefalomijelitisa. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku se koriste u terapiji povrede mozga koja je nastala usled hipoksije mozga. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku se koriste u terapiji povrede mozga koja je nastala kao rezultat cerebralne anoksije.

[0041] U poželjnim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku se primenjuju u terapiji moždanog udara. Efekti prikazani u primerima posebno su značajni u terapiji moždanog udara. Moždani udar se dešava usled prekida dotoka krvi u najmanje jednom delu mozga. Nervne ćelije veoma brzo stradaju kada ostanu bez adekvatnog krvnog toka, koji moždano tkivo snabdeva kiseonikom i hranljivim molekulima, i iz njega uklanja proizvode metabolizma. Simptomi udara zavise od regiona mozga u kojem je došlo do poremećaja snabdevanja krvlju. Simptomi obuhvataju paralizu, utrnulost ili slabost mišića, gubitak ravnoteže, vrtoglavicu, iznenadne jake glavobolje, poremećaj govora, gubitak pamćenja, gubitak rezonovanja, iznenadnu konfuzuju, oštećenje vida, komu ili smrt. Moždani udar se naziva moždani napad ili cerebrovaskularni akcident (CVA). Simptomi udara mogu biti blagi, ukoliko se unutar kratkog vremena obnovi adekvatan tok krvi. Međutim, ako se neadekvatno snabdevanje krvlju produži tokom značajnog perioda vremena, oštećenja ostaju trajna.

[0042] U naročito poželjnim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku obuhvata soj vrsta Blautia hydrogenotrophica i koristi se u terapiji moždanog udara.

[0043] U nekim oblicima izvođenja, udar je moždana ishemija. Moždana ishemija nastaje u uslovima kada umanjen dotok krvi u mozak ne može da zadovolji metaboličke potrebe ovog organa. U nekim oblicima izvođenja, cerebralna ishemija je fokalna cerebralna ishemija, to jest, ograničena je na jedan specifičan deo mozga. U nekim oblicima izvođenja, cerebralna ishemija je globalna ishemija, to jest, obuhvata najveći deo mozga. Do fokalne cerebralne ishemije dolazi usled delimičnog ili potpunog blokiranja moždanog krvnog suda, što dovodi do prekida snabdevanja dela mozga. U nekim oblicima izvođenja, fokalna ishemija je ishemijski udar. U nekim oblicima izvođenja, ishemijski udar je trombotičan, odnosno, izazvan je nastankom tromba ili krvnog ugruška, koji se razvija u krvnom sudu i ograničava ili blokira tok krvi. U nekim oblicima izvođenja, ishemijski udar je trombotičan udar. U nekim oblicima izvođenja, ishemijski udar je embolijski, odnosno, izazvan je embolusom, slobodnom masom koja putuje kroz krvotok i ograničava ili blokira tok krvi na mestu koje je udaljeno od mesta nastanka. U nekim oblicima izvođenja, ishemijski udar je embolijski udar. Globalna cerebralna ishemija obično se dešava kada je krvni tok prema mozgu blokiran ili umanjen. U nekim oblicima izvođenja globalna cerebralna ishemija je uzrokovana hipoperfuzijom, odnosno, usled šoka. U nekim oblicima izvođenja, globalna cerebralna ishemija nastaje usled srčanog zastoja.

[0044] U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati je od cerebralne ishemije. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od fokalne cerebralne ishemije. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od ishemijskog udara. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od trombotičnog udara. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kome je dijagnostikovana povreda mozga pati od embolijskog udara. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od globalne cerebralne ishemije. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od hipoperfuzije. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od srčanog zastoja. Ovi primeri pokazuju da kompozicije prema pronalasku mogu naročito biti korisne u oporavku nakon navedenih povreda mozga. U posebno poželjnim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku obuhvata soj vrste Blautia hydrogenotrophica i primenjuje se u lečenju pacijenata koji pate od cerebralne ishemije.

[0045] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji cerebralne ishemije. U nekim oblicima izvođenja kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji fokalne cerebralne ishemije. U nekim oblicima izvođenja kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji ishemijskog udara. U nekim oblicima izvođenja kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji trombotičnog udara. U nekim oblicima izvođenja kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji embolijskog udara. U nekim oblicima izvođenja kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji globalne cerebralne ishemije. U nekim oblicima izvođenja kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji hipoperfuzije.

[0046] U nekim oblicima izvođenja, udar je hemoragijski udar. Hemoragijski udar je izazvan krvarenjem unutar ili oko mozga što dovodi do bubrenja, pritiska i oštećenja ćelija i tkiva mozga. Hemoragijski udar je najčešće rezultat oslabljenog krvnog suda, koji puca i oslobađa krv u okolno tkivo. U nekim oblicima izvođenja, hemoragijski udar je intracerebralno krvarenje, odnosno, uzrokovan je krvarenjem unutar samog moždanog tkiva. U nekim oblicima izvođenja, intracerebralno krvarenje je uzrokovano intraparenhimskim krvarenjem. U nekim oblicima izvođenja, intracerebralno krvarenje je uzrokovano intraventrikularnim krvarenjem. U nekim oblicima izvođenja, hemoragijski udar je subarahnoidno krvarenje, odnosno, krvarenje koje se dešava van moždanog tkiva, ali unutar lobanje. U nekim oblicima izvođenja, hemoragijski udar je rezultat cerebralne amiloidne angiopatije. U nekim oblicima izvođenja, hemoragijski udar je

1

rezultat moždane aneurizme. U nekim oblicima izvođenja, hemoragijski udar je rezultat cerebralnih arteriovenskih malformacija (AVM)

[0047] U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od hemoragijskog udara. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od intracerebralnog krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od intraparenhimskog krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od intraventrikularnog krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od subarahnoidnog krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od cerebralne amiloidne angiopatije. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od moždane aneurizme. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od cerebralne AVM.

[0048] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku koristi se u terapiji hemoragijskog udara. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku koristi se u terapiji intracerebralnog krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku koristi se u terapiji intraparenhimskog krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku koristi se u terapiji intraventrikularnog krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku koristi se u terapiji subarahnoidnog krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku koristi se u terapiji cerebralne amiloidne angiopatije. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku koristi se u terapiji moždane aneurizme. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku koristi se u terapiji cerebralne AVM.

[0049] Uspostavljanje adekvatnog dotoka krvi u mozak nakon perioda prekida, iako doprinosi ublažavanju simptoma povezanih sa udarom, može, paradoksalno, da izazove dodatnu štetu u nervnom tkivu. Tokom perioda prekida, oštećeno tkivo pati zbog nedostatka kiseonika i hranljivih materija, a iznenadno uspostavljanje protoka krvi može da dovede do inflamacije i oksidativnog oštećenja, putem indukcije oksidativnog stresa. Ovaj fenomen je poznat pod imenom reperfuziona povreda, i dobro je opisan, ne samo nakon udara, već i nakon srčanog zastoja ili oštećenja drugih tkiva, kada se tok krvi vrati u normalu nakon perioda ishemije ili nedostatka kiseonika. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga pati od reperfuzione povrede nastale nakon šloga. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku koristi se u terapiji reperfuzione povrede koja je nastala kao rezultat udara.

[0050] Tranzitorni ishemijski napad (TIA), koji se još naziva mini-udar, smatra se upozoravajućim znakom ozbiljnog moždanog udara. Subjekti koji su doživeli jedan ili više TIA, imaju povećan rizik prema moždanom udaru. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem je dijagnostikovana povreda mozga patio od TIA. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji TIA. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku koriste se u terapiji povrede mozga kod subjekta koji je preživeo TIA.

[0051] Faktori rizika za moždani udar su visok krvni pritisak, visok nivo holesterola u krvi, familijarna istorija moždanih udara, srčane bolesti, dijabetes, moždana aneurizma, arteriovenske malformacije, srpasta anemija, vaskulitis, poremećaji krvarenja, primena ne-steroidnih anti-inflamatornih lekova (NSAID), korišćenje duvana, konzumiranje velike količine alkohola, korišćenje narkotika, gojaznost, nedostatak fizičke aktivnosti i nezdrava ishrana. Konkretno, sniženje krvnog pritiska dokazano smanjuje rizik od kako ishemijskog, tako i hemoragijskog udara [28, 29]. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku se koriste u terapiji povrede mozga kod subjekta koji ima najmanje jedan faktor rizika za moždani udar. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima dva faktora rizika za moždani udar. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima tri faktora rizika za moždani udar. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima četiri faktora rizika za moždani udar. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima visok krvni pritisak. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima visok nivo holesterola u krvi. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima familijarnu istoriju moždanog udara. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima bolest srca. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima dijabetes. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima moždanu aneurizmu. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima arteriovenske malformacije. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima vaskulitis. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima srpastu anemiju. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima poremećaj krvarenja. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ima istoriju dugotrajnog korišćenja ne-steroidnih antiinflamatornih lekova (NSAID).U nekim oblicima izvođenja, subjekt konzumira duvan. U nekim oblicima izvođenja, subjekat konzumira velike količine alkohola. U nekim oblicima izvođenja, subjekt koristi narkotike. U nekim oblicima izvođenja, subjekt je preterano gojazan. U nekim oblicima izvođenja, subjekt je gojazan. U nekim oblicima izvođenja, subjekt ne praktikuje fizičke aktivnosti. U nekim oblicima izvođenja, subjekt se nezdravo hrani.

[0052] Primeri pokazuju da kompozicije prema pronalasku mogu biti korisne u terapiji povrede mozga i podsticanju oporavka, kada se primene pre nego što se povreda desi. Stoga su kompozicije prema pronalasku posebno korisne u tretiranju povrede mozga

1

kada se administriraju subjektu kod kojeg postoji povećan rizik od povrede mozga, kao što je moždani udar. U poželjnim oblicima izvođenja. Kompozicije prema pronalasku sadrže soj vrste Blautia hydrogenotrophica i primenjuju se u lečenju pacijenta kod kojeg je prepoznat rizik od moždanog udara.

[0053] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku koriste se u cilju smanjenja oštećenja koje je izazvano potencijalnom povredom mozga, poželjno moždanim udarom. Kompozicije mogu da smanje oštećenje kada se administriraju pre potencijalne povrede mozga, posebno ako se administriraju pacijentu sa utvrđenim rizikom od povrede.

[0054] Primeri pokazuju da tretman kompozicijama prema pronalasku smanjuje motorni deficit nakon moždanog udara. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku deluju na moždanu povredu tako što smanjuju deficit motorike. Primeri pokazuju da tretman kompozicijama prema pronalasku poboljšava motorne funkcije. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku, deluju na moždanu povredu tako što poboljšavaju motorne funkcije. Primeri pokazuju da tretman kompozicijama prema pronalasku poboljšava snagu mišića. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku deluju na povredu mozga tako što poboljšavaju snagu mišića nakon moždanog udara. Primeri pokazuju da tretman kompozicijama prema pronalasku poboljšava pamćenje nakon moždanog udara. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku deluju na povredu mozga tako što poboljšavaju pamćenje. Primeri pokazuju da tretman kompozicijama prema pronalasku poboljšava socijalno prepoznavanje nakon moždanog udara. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku deluju na povredu mozga tako što poboljšavaju socijalno prepoznavanje. Primeri pokazuju da tretman kompozicijama prema pronalasku poboljšava neurološke funkcije nakon moždanog udara. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku deluju na povredu mozga tako što poboljšavaju neurološke funkcije.

[0055] Kao što je pokazano u primerima, bakterijske kompozicije prema pronalasku mogu biti efikasne u terapiji povrede mozga. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije mogu biti u formi bakterijske kulture. U nekim oblicima izvođenja, poželjno je da su kompozicije u liofilizovanoj formi.

[0056] Terapija povrede mozga može se odnositi, na primer, na umanjenje težine simptoma. Terapija povrede mozga može takođe da se odnosi na smanjenje neuroloških poremećaja nakon moždanog udara. Kompozicije za primenu prema pronalasku u terapiji moždanog udara mogu se administrirati subjektu pre moždanog udara, na primer, kad je kod pacijenta uočen rizik od moždanog udara. Kompozicije

1

prema pronalasku za primenu u terapiji moždanog udara mogu se dati nakon moždanog udara, na primer, tokom perioda oporavka. Kompozicije prema pronalasku za primenu u terapiji moždanog udara mogu se dati tokom akutne faze oporavka (odnosno, u prvoj nedelji nakon moždanog udara). Kompozicije prema pronalasku za primenu u terapiji moždanog udara mogu se dati tokom sub-akutne faze oporavka (odnosno, od prve nedelje do trećeg meseca nakon moždanog udara). Kompozicije prema pronalasku za primenu u terapiji moždanog udara mogu se primeniti tokom hronične faze oporavka (nakon tri meseca posle moždanog udara).

[0057] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku mogu se primeniti u kombinaciji sa sekundarno aktivnim agensom. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku koriste se u kombinaciji sa aspirinom ili aktivatorom tkivnog plazminogena (tPA). Ostali sekundarni agensi mogu biti anti-agregacijski (kao što je klopidogrel), antikoagulansi (kao što su heparini, varfarin, apiksaban, dabigatran, edoksaban ili rivaroksaban), antihipertenzivi (kao što su diuretici, ACE inhibitori, blokatori kalcijumskih kanala, beta-blokatori ili alfa-blokatori) ili statini. Kompozicije prema pronalasku mogu poboljšati odgovor pacijenta na sekundarni aktivni agens.

[0058] Iako su do sada brojni mehanizmi povezani sa patogenezom moždanog udara, veliki broj studija ukazuju na oksidativni stres, inflamaciju i apoptozu, kao ključne faktore razvoja bolesti [30, 31]. Smatra se da se usled trenutnog povećanja nivoa reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) neposredno nakon moždanog udara prevazilazi antioksidativna zaštita, što uzrokuje oštećenje tkiva. Reaktivne vrste kiseonika takođe stimulišu oslobađanje inflamatornih citokina i matriksnih metaloproteinaza, koje povećavaju propustljivost krvno-moždane barijere i ulazak leukocita u centralni nervni sistem. Superoksid-dismutaza (SOD) je endogeni antioksidans sa važnom ulogom u prevenciji oksidativnog oštećenja. Stoga, pojačavanje antioksidativne aktivnosti u mozgu, kao što je pojačavanje aktivnosti SOD, može značajno da ublaži oštećenje izazvano povredom. Takođe, inflamatorne reakcije mogu da povećaju oštećenje mozga nakon moždanog udara. Oksidativni stres i inflamacija izazivaju apoptozu neurona, i posledično, smrt neurona nakon moždanog udara.

[0059] Butirat je masna kiselina kratkog lanca (SCFA), koja se sintetiše bakterijskom fermentacijom inače nerazgradivih vlakana u debelom crevu. Postoje snažne indicije da butirat deluje neuroprotektivno, da smanjuje prohodnost krvno-moždane barijere nakon moždanog udara, da smanjuje oksidativni stres, i da ima anti-inflamatorne efekte, inhibira apoptozu neurona i podstiče opšte preživljavanje ćelija, tkivne prepravke i oporavak nakon moždanog udara [32, 33, 34, 35, 36].

1

[0060] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku poboljšavaju stepen piknoze i/ili vakuolizacije tkiva. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku poboljšavaju stepen piknoze i/ili vakuolizacije tkiva koje je bilo izloženo ishemiji. Primeri pokazuju da kompozicije prema pronalasku smanjuju oštećenje tkiva, ako se ono meri prema stepenu piknoze i vakuolizacije. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku smanjuju efekat ishemije na tkiva. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku smanjuju obim oštećenja izazvan ishemijom. U nekim oblicima izvođenja, tkiva oštećena ishemijom su moždana tkiva. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku smanjuju nekrozu ili broj nekrotičnih ćelija. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku smanjuju apoptozu i broj apoptotičnih ćelija. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku sprečavaju ćelijsku smrt nekrozom i/ili apoptozom. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku sprečavaju ćelijsku smrt nekrozom i/ili apoptozom uzrokovane ishemijom. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku poboljšavaju oporavak tkiva izazvan ishemijom. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku poboljšavaju uklanjanje nekrotičnih i/ili apoptotičnih ćelija. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku povećavaju efikasnost uklanjanja nekrotičnih i/ili apoptotičnih ćelija. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku poboljšavaju zamenu i/ili regeneraciju ćelija u tkivima. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku poboljšavaju zamenu i/ili regeneraciju ćelija u tkivima koja su oštećena ishemijom. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku poboljšavaju ukupnu histologiju tkiva (na primer, nakon biopsije).

Načini administracije

[0061] Poželjno, kompozicije prema pronalasku se administriraju u gastrointestinalni trakt kako bi se obezbedilo unošenje u i/ili delimična ili potpuna kolonizacija creva bakterijskim sojem prema pronalasku. Načelno, kompozicije prema pronalasku administriraju se oralnim putem, ali se mogu administrirati rektalno, intranazalno, ili bukalnim ili sublingvalnim putem.

[0062] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku mogu se administrirati u vidu pene, spreja ili gela.

[0063] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku mogu se administrirati u vidu supozitorije, kao što je rektalna supozitorija, na primer, u formi

1

teobroma (kakao puter), sintetičke čvrste masti (supocir, vitepsol), glicero-želatina, polietilen-glikola ili glicerinskog sapuna.

[0064] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku administriraju se u gastrointestinalni trakt putem creva, kao što je nazo-gastrično crevo, orogastričko crevo, gastrično crevo, jejunostomsko crevo (J crevo). Perkutane endoskopske gastrostomije (PEG), ili otvora, kao što je otvor grudnog zida koji obezbeđuje pristup želucu, jejunumu ili kroz druge dostupne otvore.

[0065] Kompozicije prema pronalasku mogu se administrirati jednokratno ili se mogu administrirati više puta kao deo terapeutskog režima. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku administriraju se na dnevnoj osnovi. Primeri pokazuju da administracija obezbeđuje uspešnu kolonizaciju i kliničku korist u terapiji povrede mozga.

[0066] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku administriraju se na regularnoj osnovi, kao što je dnevna, dvodnevna ili nedeljna administracija, tokom dužeg vremena, na primer, najmanje jedna nedelja, dve nedelje, jedan mesec, dva meseca, šest meseci ili jedna godina. Primeri pokazuju da administracija BH ne mora da dovede do trajne kolonizacije creva, pa će administracija tokom dužeg perioda dati veće terapeutske efekte.

[0067] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku administriraju se 7 dana, 14 dana, 16 dana, 21 dan ili 28 dana ili ne duže od 7 dana, 14 dana, 16 dana, 21 dan ili 28 dana. Na primer, u nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku administriraju se 16 dana. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku administriraju se 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 meseci, više od 6 meseci preko 1 godine.

[0068] U nekim oblicima izvođenja, tretman prema pronalasku je praćen procenom mikrobiote creva pacijenta. Tretman se može ponoviti ukoliko isporuka i/ili delimična ili potpuna kolonizacija creva sojem prema pronalasku nije uspela sa dovoljnom efikasnošću, ili se tretman može prekinuti ukoliko je delimična ili potpuna kolonizacija uspela, a tretman ostvario cilj.

[0069] U nekim oblicima izvođenja, tretman prema pronalasku može se administrirati skotnoj životinji, nekom sisaru, ili čoveku, sa ciljem tretiranja razvojne povrede mozga fetusa in utero i/ili se može dati novorođenčetu.

[0070] Kompozicije prema pronalasku mogu se administrirati pacijentu kod kojeg je dijagnostikovana povreda mozga ili stanje koje je povezano sa povredom mozga, ili koje je povezano sa rizikom od povrede mozga.

1

[0071] Kompozicije prema pronalasku mogu se administrirati pacijentu kod kojeg je utvrđen neodgovarajući sastav crevne mikrobiote. Na primer, pacijent može imati redukovanu ili potpuno odsutnu kolonizaciju creva vrstama roda Blautia, konkretno, Blautia hydrogenotrophica, Blautia stercoris ili Blautia wexlerae.

[0072] Kompozicije prema pronalasku mogu se administrirati hranom, kao što su suplementi ishrani.

[0073] Načelno, kompozicije prema pronalasku koriste se za tretman ljudi, iako se mogu primeniti kod životinja, uključujući životinje sa jednokomornim želucem, kao što su živina, svinje, mačke, psi, konji ili zečevi. Kompozicije prema pronalasku mogu se koristiti za podsticanje rasta i učinka životinja. Administricija kod životinja odvija se oralnom gavažom.

[0074] U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem se kompozicija administrira je odrastao čovek. U nekim oblicima izvođenja, subjekt kojem se kompozicija administrira je novorođenče.

Kompozicije

[0075] Načelno, kompozicije prema pronalasku sadrže bakterije. U poželjnim oblicima izvođenja pronalaska, kompozicije se formulišu liofilizacijom. Na primer, kompozicije prema pronalasku mogu biti u formu granula ili želatinskih kapsula, kao što su tvrde želatinske kapsule, u kojima se nalazi bakterijski soj prema pronalasku.

[0076] Poželjno, kompozicija prema pronalasku sadrži liofilizirane bakterije. Bakterije se liofilizuju primenom dobro ustanovljenih postupaka, a relevantna literatura može se naći u referencama [37-39]. Posebno može da bude efektivan liofilizat kompozicija. U poželjnim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku može sadržati liofilizovane bakterije i koristi se u tretmanu povrede mozga.

[0077] Alternativno, kompozicija prema pronalasku može sadržati žive, aktivne bakterijske kulture. U nekim oblicima izvođenja, bakterijski sojevi u sastavu kompozicije prema pronalasku nisu inaktivirani, na primer, nisu inaktivirani temperaturom. U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj u kompoziciji nije umrtvljen, na primer, nije umrtvljen temperaturom. U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj u kompoziciji nije utišan, na primer, nije utišan temperaturom. U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj u kompoziciji nije ubijen, inaktiviran i/ili utišan. Na primer, u nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku je živ. Na primer, u nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku je vijabilan. U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku je delimično ili potpuno

2

sposoban da kolonizuje creva. U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj u kompoziciji prema pronalasku je vijabilan i delimično ili potpuno sposoban da kolonizuje creva.

[0078] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija sadrži smešu živih bakterijskih sojeva i bakterijskih sojeva koji su umrtvljeni.

[0079] U poželjnim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku je inkapsulirana kako bi se omogućila dostava bakterijskog soja u creva. Kapsula štiti kompoziciju od degradacije sve do pristizanja do ciljne lokacije, do koje bi došlo usled hemijske ili fizičke razgradnje izazvane stimulusima, kao što su pritisak, enzimska aktivnost ili fizička dezintegracija, koja može biti izazvana promenom pH. Moguće je primeniti različite postupke inkapsuliranja. Primeri obuhvataju pakovanje unutar poroznog matriksa, pričvršćavanje ili adsorpciju za čvrsti nosač, auto-agregaciju flokulacijom ili pomoću unakrsnog veznika, mehaničko zadržavanje na mikroporoznoj membrani ili mikrokapsule. Smernice za poželjne forme inkapsulacije mogu se naći u referencama [40-41].

[0080] Kompozicije se mogu administrirati oralno i mogu biti u formi tablete, kapsule ili praška. Poželjni je da kompozicije budu u formi kapsule, jer su vrste Blautia anaerobne. U sastav kompozicije mogu se uključiti i drugi sastojci (kao što je na primer, vitamin C), kao hvatači kiseonika i prebiotski supstrati koji poboljšavaju isporuku i/ili delimičnu ili potpunu kolonizaciju i preživljavanje bakterija in vivo. Alternativno, probiotska kompozicija prema pronalasku može se administrirati oralno, kao hrana ili prehrambeni proizvod, kao što je mleko ili fermentirani mlečni proizvod na bazi surutke ili kao farmaceutski proizvod.

[0081] Kompozicija se može formulisati kao probiotik.

[0082] Kompozicija prema pronalasku obuhvata terapeutski efektivne količine bakterijskog soja prema pronalasku. Terapeutski efektivna količina bakterijskog soja je ona koji izaziva povoljan efekat kod pacijenta. Terapeutski efektivna količina bakterijskog soja može biti dovoljna da dovede do isporuke kompozicije u creva i delimične i/ili potpune kolonizacije creva pacijenta.

[0083] Pogodna dnevna doza bakterija, na primer, kod odraslog čoveka, može biti od oko 1 × 10<3>do oko 1 × 10<11>CFU jedinica; na primer, od oko 1 × 10<7>do oko 1 × 10<10>CFU; u narednom primeru, od oko 1 × 10<6>do oko 1 × 10<10>CFU; u narednom primeru, od oko 1 × 10<7>do oko 1 × 10<11>CFU; u narednom primeru, od oko 1 × 10<8>do oko 1 × 10<10>CFU; u narednom primeru, od oko 1 × 10<8>do oko 1 × 10<11>CFU.

[0084] U nekim oblicima izvođenja, doza bakterija je najmanje 10<9>ćelija na dan, na primer, najmanje 10<10>, najmanje 10<11>, ili najmanje 10<12>ćelija na dan.

[0085] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija sadrži bakterijski soj u količini od oko 1 × 10<6>do oko 1 × 10<11>CFU/g, prema masi kompozicije; na primer, od oko 1 × 10<8>do oko 1 × 10<10>CFU/g. Doza može biti, na primer, 1 g, 3 g, 5 g, i 10 g.

[0086] Uobičajeno je da se se probiotik, kao što je kompozicija prema pronalasku, kombinuje sa najmanje jednim pogodnim prebiotskim jedinjenjem. Prebiotik je obično nerazgradivi ugljeni hidrat, kao što su oligo- ili polisaharidi, ili šećerni alkohol, koji se ne razgrađuju niti apsorbuju nakon pristizanja u digestivni trakt. Poznati prebiotici obuhvataju komercijalne proizvode, kao što su inulin, ili transgalakto-oligosaharide.

[0087] U nekim oblicima izvođenja probiotska kompozicija prema pronalasku obuhvata prebiotsko jedinjenje u količini koja iznosi od oko 1 do oko 30% mase, od ukupne mase kompozicije (na primer, 5 do 20% mase). Ugljeni hidrati se mogu izabrati iz grupe koja se sastoji od: frukto-oligosaharida (ili FOS), kratkolančanih frukto-oligosaharida, inulina, izomalt-oligosaharida, pektina, ksilo-oligosaharida (ili XOS), hitozan-oligosaharida (ili COS), beta-glukana, modifikovane arabike, rezistentnog skroba, polidekstroze, D-tagatoze, akacija vlakana, rogača, heljde i citrusnih vlakana. U jednom aspektu, prebiotici su kratkolančani frukto- oligosaharidi (zbog jednostavnosti, ovde prikazani kao FOSs-c.c); pomenuti FOSs-c. c. nisu razgradljivi ugljeni hidrati, nisu dobijeni konverzijom šećerne repe, i ne uključuju molekul saharoze za koji su vezana tri glukozna molekula.

[0088] Kompozicije prema pronalasku mogu sadržati farmaceutski prihvatljive ekcsipijense ili nosače. Primeri pogodnih eksipijenasa mogu se naći u referencama [42]. Poželjni nosači ili diluenti za terapeutsku primenu, dobro su poznati u farmaceutskoj tehnici, opisani su, na primer, u referencama [43]. Pogodni nosači obuhvataju laktozu, skrob, glukozu, metal-celulozu, magnezijum stearat, manitol, sorbitol i slične. Primeri pogodnih diluenata obuhvataju etanol, glicerol i vodu. Izbor farmaceutskog nosača, ekscipijensa ili diluenta zavisi od nameravane rute isporuke i uobičajene farmaceutske prakse. Farmaceutska kompozicija može sadržati uz nosač, eksipijens i razblaživač, pogodno sredstvo za zgušnjavanje, lubrikans, suspendujući agens, oblogu, solubilizator. Primeri pogodnih sredstava za zgušnjavanje obuhvataju skrob, želatin, prirodne šećere, kao što je glukoza, anhidridna laktoza, protočna laktoza, beta-laktoza, kukuruzni skrob, prirodne i sintetske gume, kao što je akacija, tragakant, ili natrijum alginat, karboksimetil- celuloza i polietilen glikol. Primeri pogodnih lubrikanasa obuhvataju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično. Konzervansi, stabilizatori, boje i arome mogu biti sastavni deo farmaceutske kompozicije. Primeri konzervanasa obuhvataju natrijum benzoat, limunsku kiselinu, cistein i estre hidroksi-benzojeve kiseline, na primer, u nekim oblicima izvođenja, konzervans je izabran iz grupe natrijum benzoat, limunska kiselina i estar p-hidroksibenzojeve kiseline. Antioksidanti i suspendujući agensi se takođe mogu primeniti. Još jedan primer pogodnog nosača je saharoza. Još jedan primer konzervansa je cistein.

[0089] Kompozicije prema pronalasku mogu se formulisati kao prehrambeni proizvod. Na primer, prehrambeni proizvod može uz terapeutski efekat prema pronalasku, pružiti nutritivne koristi, kao što u slučaju dodataka ishrani. Takođe, hranljivi proizvod može se formulisati tako da se pojača ukus kompozicije prema pronalasku ili da se kompozicija učini atraktivnijom za konzumaciju, tako što će biti sličnija hrani, nego leku. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku formuliše se kao mlečni proizvod. Termin “mlečni proizvod” označava tečni ili polu-čvrsti proizvod na bazi mleka ili surutke, sa različitim sadržajem masti. Mlečni proizvod može biti, na primer, kravlje mleko, kozje mleko, ovčije mleko, obrano mleko, punomasno mleko, mleko u prahu, i neobrađena surutka ili prerađeni proizvod, kao što je jogurt, usireno mleko, surutka, punomasno kiselo mleko, pavlaka, kiselo-mlečni proizvod. Druga važna grupa ovakvih proizvoda obuhvata mlečne napitke, kao što su surutka, fermentisano mleko, kondenzovano mleko, mleko za bebe; aromatizovano mleko, sladoled ili hranu koja sadrži mleko, kao što su slatkiši.

[0090] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku obuhvataju jedan ili više bakterijskih sojeva roda Blautia i ne sadrže bakterije drugih rodova ili sadrže samo de minimis ili biološki irelevantne količine bakterija drugog roda.

[0091] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži jedan bakterijski soj i ne sadrži druge bakterijske sojeve ili vrste. Ovakve kompozicije sadrže samo de minimis ili biološki irelevantnu količinu drugih bakterijskih sojeva ili vrsta. Ovakve kompozicije mogu biti kulture suštinski lišene prisustva druge vrste ili drugog organizma. U nekim oblicima izvođenja, ovakve kompozicije mogu biti liofilizati koji su suštinski lišeni prisustva druge vrste ili drugog organizma.

[0092] U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku sadrže jedan ili više bakterijskih sojeva roda Blautia, na primer, Blautia hydrogenotrophica, i ne sadrže druge bakterijske rodove, ili sadrže samo de minimis ili biološki irelevantne količine bakterija ostalih rodova. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku sadrže jednu vrstu Blautia, na primer, Blautia hydrogenotrophica, i ne sadrže ni jednu drugu vrstu, ili sadrže samo de minimis ili biološki irelevantne količine bakterija iz drugih vrsta. U nekim oblicima izvođenja, kompozicije prema pronalasku sadrže jedan soj

2

Blautia, na primer, Blautia hydrogenotrophica, i ne sadrže ni jedan drug soj niti bakterijsku vrstu, ili sadrže samo de minimis ili biološki irelevantnu količinu bakterija drugog soja ili vrste.

[0093] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku obuhvata jedan ili više bakterijskih sojeva ili vrsta. Na primer, u nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži jedan ili više sojeva iste vrste (na primer, više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili 45 sojeva), i opciono, ne sadrži bakterije drugih vrsta. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži manje od 50 sojeva jedne iste vrste (na primer, manje od 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ili 3 soja), i opciono, ne sadrži bakterije druge vrste. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku, sadrži 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25, ili 31-50 sojeva jedne vrste, i opciono, ne sadrži bakterije druge vrste. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži više od jedne vrste istog roda (na primer, više od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, 23, 25, 30, 35 ili 40 vrsta), i opciono, ne sadrži bakterije drugog roda. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži manje od 50 vrsta jednog roda (na primer, manje od 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4 ili 3 vrste), i opciono ne sadrži bakterije drugog roda. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku sadrži 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10,1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25, ili 31-50 vrsta istog roda, i opciono ne sadrži bakterije ni jednog drugog roda. Pronalazak obuhvata sve prethodne navedene varijacije.

[0094] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija sadrži zajednicu mikroorganizama. Na primer, u nekim oblicima izvođenja, kompozicija sadrži soj bakterija Blautia kao deo zajednice mikroorganizama. Na primer, u nekim oblicima izvođenja Blautia bakterijski soj prisutan je u kombinaciji sa jednim ili više (na primer, najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 15 ili 20) bakterijskih sojeva drugih rodova, sa kojima živi u simbiozu u crevima in vivo. Na primer, u nekim oblicima izvođenja, kompozicija sadrži bakterijski soj Blautia hydrogenotrophica, i bakterijski soj nekog drugog roda. U nekim oblicima izvođenja, zajednica mikroorganizama obuhvata dva ili više bakterijskih sojeva dobijenih iz fecesa jednog organizma, na primer, čoveka. U nekim oblicima izvođenja, zajednica mikroorganizama ne postoji u prirodi. Na primer, u nekim oblicima izvođenja, zajednica mikroorganizama sadrži bakterijske sojeve dobijene iz fecesa najmanje dva različita organizma. U nekim oblicima izvođenja, dva različita organizma pripadaju istoj vrsti, na primer, dve različite osobe. U nekim oblicima izvođenja, dva različita organizma su novorođenče i odrastao čovek. U nekim oblicima izvođenja, dva različita organizma su čovek i neki drugi sisar.

[0095] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku dodatno sadrži bakterijski soj koji ima isti bezbednosni profil i terapeutsku efikasnost kao soj Blautia hydrogenotrophica, koji je deponovan pod pristupnim brojem DSM 14294, ali koji nije soj Blautia hydrogenotrophica, deponovan pod pristupnim brojem DSM 14294, i koji nije Blautia hydrogenotrophica ili nije Blautia.

[0096] U nekim oblicima izvođenja u kojima kompozicija prema pronalasku sadrži više od jednog soja, vrste ili roda bakterija, pojedinačni sojevi, vrste i rodovi bakterija mogu biti odvojeno, simultano ili sekvencijalno administrirani. Na primer, kompozicija može da sadrži više od jednog bakterijskog soja, vrste ili roda, ili bakterijski sojevi, vrste i rodovi mogu biti čuvani nezavisno i administrirani zasebno, simultano ili sekvencijalno. U nekim oblicima izvođenja, više od jednog soja, vrste ili roda se čuvaju zasebno, ali se mešaju pre upotrebe.

[0097] U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj koji se koristi u kompoziciji prema pronalasku dobija se iz fecesa odraslog čoveka. U nekim oblicima izvođenja, u kojima kompozicija prema pronalasku sadrži više od jednog bakterijskog soja, svi bakterijski sojevi se dobijaju iz fecesa odraslog čoveka ili ako su prisutni drugi sojevi, oni su prisutni samo u de minimis količinama. Bakterije mogu biti kultivisane nakon što su dobijene iz fecesa odraslog čoveka, zatim korišćene za dobijanje kompozicije prema pronalasku.

[0098] U nekim oblicima izvođenja, jedan ili više bakterijskih sojeva Blautia jeste ili jesu terapeutski aktivni agensi u kompoziciji prema pronalasku. U nekim oblicima izvođenja, bakterijski soj(evi) u kompoziciji, jedini su terapeutski aktivni agensi u kompoziciji prema pronalasku.

[0099] Kompozicija za primenu prema pronalasku može i ne mora zahtevati tržišno odobrenje.

[0100] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje navedenu farmaceutsku kompoziciju, naznačenu time da je navedeni bakterijski soj liofilizovan. U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje navedenu farmaceutsku kompoziciji, naznačenu time da je bakterijski soj sušen u spreju. U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje navedenu farmaceutsku kompoziciju, naznačenu time da je bakterijski soj liofilizovan i da je živ. U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje navedenu farmaceutsku kompoziciju, naznačenu time da je bakterijski soj liofilizovan ili sušen u spreju i sposoban da delimično ili potpuno kolonizuje creva. U nekim oblicima

2

izvođenja, pronalazak obezbeđuje navedenu farmaceutsku smešu, naznačenu time da je bakterijski soj liofilizovan ili sušen u spreju i naznačeno time da je vijabilan i sposoban da delimično ili potpuno kolonizuje creva.

[0101] U nekim slučajevima, liofilizovan soj ili soj osušen u spreju rekonstituiše se pre primene. U nekim slučajevima, rekonstitucija se obavlja pomoću diluenta, koji je ovde opisan.

[0102] Kompozicija prema pronalasku sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, diluens ili nosač.

[0103] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: bakterijski soj prema pronalasku; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač ili diluent; naznačeno time da je bakterijski soj prisutan u količini dovoljnoj za terapiju bolesti, kada se administrira subjektu kojem je tretman potreban; i naznačeno time da se terapija daje zbog povrede mozga.

[0104] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju naznačenu time da je količina bakterijskog soja u kompoziciji od oko 1 ×10<3>do oko 1 × 10<11>CFU jedinica po gramu mase kompozicije.

[0105] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje navedenu farmaceutsku kompoziciju, naznačenu time da se kompozicija administrira u dozi od 1 g, 3 g, 5 g ili 10 g.

[0106] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje navedenu farmaceutsku kompoziciju, naznačenu time da se kompozicija administrira postupkom koji je izabran iz grupe koja se sastoji od oralne, rektalne, potkožne, nazalne, bukalne i sublingvalne primene.

[0107] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži, nosač izabran iz grupe koja se sastoji od laktoze, skroba, glukoze, metalceluloze, magnezijum stearata, manitola i sorbitola.

[0108] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži diluente izabrane iz grupe koja se sastoji od etanola, glicerola i vode.

[0109] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži ekscipijens izabran iz grupe koja se sastoji od skroba, želatina, glukoze, anhidridne laktoze, protočne laktoze, beta-laktoze, kukuruznog skroba, akacije, tragakanta, natrijum alginata, karboksimetil-celuloze, polietilen glikola, natrijum oleata, natrijum stearata, natrijum benzoata, natrijum acetata i natrijum hlorida.

[0110] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja dodatno sadrži najmanje jedan konzervansiv, antioksidans i stabilizator.

2

[0111] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konzervans izabran iz grupe koja se sastoji od natrijum benzoata, sorbinske kiseline i estra p-hidroksibenzojeve kiseline.

[0112] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje prethodno navedenu farmaceutsku kompoziciju, naznačenu time da je bakterijski soj liofilizovan.

[0113] U nekim oblicima izvođenja, pronalazak obezbeđuje navedenu farmaceutsku kompoziciju, naznačenu time da je kompozicija upakovana u zaptivenu posudu, na oko 4°C ili oko 25°C i da se posuda čuva u atmosferi 50% relativne vlažnosti, pri čemu najmanje 80% bakterijskog sastava, izraženo u CFU jedinicama, preostaje nakon perioda od najmanje: 1 meseca, 3 meseca, 6 meseci, 1 godine, 1.5 godine, 2 godine, 2.5 godine ili 3 godine.

[0114] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku je upakovana u zaptivenu posudu koja sadrži opisanu kompoziciju. U nekim oblicima izvođenja, zaptivena posuda može biti kesica ili bočica. U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku upakovana je u špric koji sadrži opisanu kompoziciju.

[0115] Kompozicija prema pronalasku, u nekim oblicima izvođenja, može biti u formi farmaceutske formulacije. Na primer, kompozicija može biti u vidu tablete ili kapsule. U nekim oblicima izvođenja, kapsula je želatinska kapsula ("gel-cap").

[0116] U nekim oblicima izvođenja, kompozicija prema pronalasku se administrira oralno. Oralna primana obuhvata gutanje, tako da jedinjenje ulazi u gastrointestinalni trakt, i/ili bukalnu, lingvalnu ili sublingvalnu administraciju, putem kojih kompozicija ulazi u krvi tok u ustima.

[0117] Farmaceutske formulacije koje su pogodne za administraciju putem oralne primene obuhvataju tvrde kapsule, tvrde mikročestice, polutvrde i tečne (uključujući višefazne ili disperzione sisteme), kao što su tablete; meke i čvrste kapsule koje sadrže nanočestice. Tečnosti (na primer, vodeni rastvori), emulzije ili praškovi; lozenge (uključujući one sa tečnošću), žvake; gelove; brzo dispergujuće dozne forme; filmove; ovule i bukalne, mukoadhezivne flastere.

[0118] U nekim oblicima izvođenja, farmaceutska formulacije je u formi za enteričnu primenu, odnosno, u formi gastro-rezistentne formulacije (na primer, otporne na pH želudačnog soka), koja je pogodna za primenu kompozicije prema pronalasku oralnom administracijom i da je oslobode u crevni fluid. Enterične formulacije mogu biti naročito korisne kada su bakterije i druge komponente kompozicije osetljive na kiseline, sklone razgradnji pod uslovima koji vladaju u želucu.

2

[0119] U nekim oblicima izvođenja, enterična formulacija sadrži enteričku prevlaku. U nekim oblicima izvođenja, formulacija je u formi enterički solubilne prevučene dozne forme. Na primer, formulacija može biti enterično obložena tableta ili kapsula ili slično. Enterička prevlaka može biti uobičajena enterička prevlaka za tablete, kapsule ili slične doze za oralnu primenu. Formulacija može sadržati film prevlaku, na primer, tanak film enteričkog polimera, kao što je polimer nerastvorljiv u kiselinama.

[0120] U nekim oblicima izvođenja, enterične formulacije su intrinsički enterične, na primer, gastrorezistentne bez potrebe da budu dodatno prevučene. Stoga, u nekim oblicima izvođenja, formulacija je enterička formulacija koja ne sadrži prevlaku. U nekim oblicima izvođenja formulacija je u formi kapsule napravljene od termo-želirajućeg materijala. U nekim oblicima izvođenja, termo-želirajući materijal je celulozni materijal, kao što je metal-celuloza, hidroksimetil-celuloza ili hidroksipropilmetil-celuloza (HPMC). U nekim oblicima izvođenja, kapsula ima prevlaku koji ne sadrži polimer koji pravi film. U nekim oblicima izvođenja, kapsula ima čauru koja sadrži hidroksipropilemetil-celulozu i ne sadrži polimer koji formira film (na primer, videti [44]). U nekim oblicima izvođenja, formulacija je suštinski enterička kapsula (na primer, Vcaps® od Capsugel-a).

[0121] U nekim oblicima izvođenja, formulacija je u formi meke kapsule. Meke kapsule su kapsule, koje zbog dodatka omekšivača, na primer glicerola, sorbitola, maltiola i polietilen glikola, prisutnih u prevlaci kapsule, imaju izvesnu elastičnost i mekoću. Meke kapsule se mogu proizvesti, na bazi želatina i skroba. Želatinske meke kapsule su komercijalno dostupne kod brojnih dobavljača. Zavisno od postupka administracije, kao što je na primer, oralna ili rektalna administracija, meke kapsule mogu imati različite oblike, i mogu biti, na primer, okrugle, ovalne ili oblika torpeda. Meke kapsule se mogu proizvesti konvencionalnim postupkom, na primer, Šererovim postupkom Akogel postupkom ili postupcima kapljice ili duvanjem.

Postupci kultivacije

[0122] Bakterijski soj za primenu prema pronalasku može se kultivisati primenom standardnih mikrobioloških postupaka, kao što je opisano u priključenim referencama [45-47].

[0123] Čvrsti i tečni medijumi koji se koriste za kultivisanje mogu biti, na primer, YCFA agar ili YCFA medijum. YCFA medijum može da sadrži (u 100 ml, približne vrednosti): Kaziton (1.0 g), ekstrakt kvasca (0.25 g), NaHCO3(0.4 g), cistein (0.1 g), K2HPO4(0.045 g), KH2PO4(0.045 g), NaCl (0.09 g), (NH4)2SO4(0.09 g), MgSO4· 7H2O (0.009

2

g), CaCl2(0.009 g), rezazurin (0.1 mg), hemin (1 mg), biotin (1 μg), kobalamin (1 μg), paminobenzojeva kiselina (3 μg), folna kiselina (5 μg) i piridoksamin (15 μg).

Opšti postupci

[0124] U primeni predmetnog pronalaska biće primenjeni, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalni postupci hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, unutar stanja tehnike. Ovi postupci detaljno su opisani u literaturi. Videti, na primer, reference [48-55], i td.

[0125] Termin "sadrži" ima značenje "obuhvata", kao i "sastoji se", na primer, kompozicija koja “sadrži” X može se sastojati od samo X ili može obuhvatiti neke druge sastojke, na primer, X Y.

[0126] Termin "oko" u kontekstu numeričkih vrednosti x, označava približnu vrednost x i označava, na primer, x ± 10%.

[0127] Reč "suštinski” ne obuhvata značenje "kompletno", na primer, kompozicija koja je “suštinski” oslobođena prisustva Y, ne mora biti potpuno lišena prisustva Y. Kada je neophodno, reč “suštinski” može se izostaviti iz definisanja predmetnog pronalaska.

[0128] Pozivanje na procente identičnosti između dve nukleotidne sekvence znači da, kada se poredi redosled nukleotida, da navedeni procenat nukleotida označava stepen identičnosti dve sekvence. Poređenje redosleda nukleotida i procenat homologije ili identičnosti sekvence mogu se odrediti primenom softverskih programa poznatih u stanju tehnike, na primer, onih koji su opisani u odeljku 7.7.18 refrence [56]. Poželjan stepen homologije određen je primenom Smith-Waterman pretraživača homologije pomoću afino preslikavanja, uz uslov nepoklapanja od 12 i produženja 2, BLOSUM matriks 62. Smith-Watermanov pretraživač homologije obelodanjen je u referenci [57].

[0129] Ukoliko nije drugačije naznačeno, proces ili postupak koji sadrži brojne korake može da sadrži i dodatne korake pre i posle postupka, ili može da sadrži dodatne umetnute korake. Takođe, koraci se mogu kombinovati, izostaviti ili izvesti na drugačiji način, kada je potrebno.

[0130] Ovde su opisani različiti oblici izvođenja pronalaska. Smatraće se da se osobenosti specifikovane u oblicima izvođenja mogu kombinovati sa drugim specifičnim osobenostima, kako bi se postigli dodatni načini izvođenja. Konkretno, posebno naglašeni oblici izvođenja kao pogodni, tipični ili poželjni, mogu se međusobno kombinovati (osim ako nisu međusobno isključivi).

NAČINI IZVOĐENJA PRONALASKA

Primer 1 – Testiranje stabilnosti

2

[0131] Opisana kompozicija sadrži najmanje jedan navedeni bakterijski soj, u zaptivenoj posudi na 25°C ili na 4°C, a posuda je čuva u atmosferi sa 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% ili 95% relativne vlažnosti. Nakon 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, 6 meseci, 1 godine, 1.5 godine, 2 godine, 2.5 godine ili 3 godine, preostaće najmanje 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% bakterijskog soja ostaće kao što je izmereno u CFU jedinicama i određeno standardnim protokolima.

Primer 2 – Protektivni efekat u modelu cerebralne ishemije na mišu

Sažetak

[0132] Testirano je pet grupa životinja (1M, 2M, 3M, 4M i 5M), svaka sa 15-20 miševa. U istraživanje su uključene samo jedinke koje su ispoljavale normalno ponašanje. Prva doza je primenjena na Dan - 14. Grupe 1M i 2M tretirane su PBS-om, kao kontrolnim rastvorom, svakog dana do završetka istraživanja. Grupa 4M primala je liofilizovani prašak jednom dnevno, od prvog dana tretiranja do završetka ispitivanja. Grupa 5M je tretirana liofilizovanim bakterijama, od prvog dana do kraja ispitivanja. Tretmani su aplicirani životinji u drugoj polovini svakog radnog dana. Redosled tretiranja grupa je bio nasumičan, i menjan je tokom svake studije. Na Dan 1 svi miševi su anestezirani. Napravljen je rez sa duž središnje linije ventralne strane vrata, kako bi se izložile desna i leva karotidna arterija. Modelu cerebralne ishemije-reperfuzije I/R podvrgute su grupe 2M, 3M, 4M i 5M, podvezivanjem obe karotidne arterije (bilateralna okluzija – BCCAO), pomoću vaskularnih štipaljki tokom 15 minuta. Po završetku okluzije, štipaljke su uklonjene. Grupa 1M je šam kontrola (lažno operisana), podvrgnuta istoj hirurškoj intervenciji , ali bez okluzije karotidnih arterija. Grupa 3M primila je injekciju jedinjenja MK-801 neposrednom nakon operacije, i služila je kao pozitivna kontrola. Da bi se tretman održao što ujednačeniji, grupe 1M, 2M, 4M i 5M su primile sterilni fiziološki rastvor neposredno nakon operacije. Polovina svake grupe je eutanazirana na Dan 15, a druga polovina na Dan 29.

Soj

[0133] Bakterije Blautia hydrogenotrophica, deponovane pod pristupnim brojem DSM 14294.

Raspored administracije

[0134]

Dizajn studije

[0135] Tokom perioda od dana -14 do 14: Životinjama je administrirana dnevna doza PBS-a (grupe 1M i 2M), liofilizovani prašak (grupa 4M) i liofilizovane Bakterije (grupa 5M).

[0136] Dan 1: Hirurška operacija cerebralne ishemije-perfuzije I/R u grupama 2M, 3M, 4M i 5M; Životinje u grupi 1M (šam kontrole) su operisane, uz otvaranje kože bez podvezivanja arterija. Grupa 3M je primila MK-801, a grupe 1M, 2M, 3M i 5M sterilni rastvor, neposredno nakon operacije.

[0137] Dan 15: Polovina miševa iz svake grupe je eutanazirana.

[0138] Dani 15 do 28: Dnevna doza PBS-a (grupe 1M i 2M), liofilizovanog praška (grupa 4M ) i liofilizovane Bakterije (grupa 5M) za preostale miševe u grupi.

[0139] Dan 29: Eutanazija preostalih miševa.

Ostale varijable istraživanja

[0140] Mortalitet i morbiditet svih grupa proveravan je dva puta dnevno.

[0141] Telesna masa je merena dva puta nedeljno.

1

[0142] Uzorci krvi (100 μL) prikupljeni su slučajnim redosledom, 2-3 sata pre tretmana na Dan -14 i stavljeni su u tube sa litijum-heparinom. Na Dan 15, od svih miševa je uzeto 150 μL krvi, od čega je polovina stavljena u Li-heparinske tube, a druga polovina u tube sa EDTA. Nakon uzimanja krvi polovina miševa je eutanazirana. Na Dan 29 ponovljena je ista procedura uzorkovanja krvi od preostalih miševa.

[0143] Prikupljeni su fekalni ostaci životinja u tri vremenske tačke: Dan -14, Dan 15 i Dan 29. Uzorkovanje je izvršeno u sterilnim uslovima (potpuno aseptičnim = čišćenje kaveza između životinja), tako što je svaki miš izvađen iz kaveza i postavljen u novu sterilnu kutiju za uzorkovanje fekalnog peleta. Prikupljeno je što je više moguće fekalnih peleta, da bi se dostigao minimum od 80 mg, a poželjno 100 mg materijala po mišu. Test prevrnute rešetke

[0144] Test prevrnute rešetke je izveden na Dan -2/-1 (osnovni nivo), Dan 14 i Dan 28. U klasičnom primeru testa prevrnute rešetke ([58], [59]), netrenirani miš se postavlja na gornju stranu žičane rešetke koja se postavlja horizontalno na metalnu šipku iznad radne površine. Šipka se rotira za 180°, tako da se miš nađe sa donje strane rešetke. Meri se vreme zadržavanja na rešetki, odnosno, vreme potrebno da miš padne na radnu površinu.

[0145] Rezultati testa obrnute rešetke mogu se izraziti u jedinicama vremena (na primer, sekundama) ili se mogu izraziti u vidu neurološke ocene: pad nakon 1-10 sek = 1; pad nakon 11-25 sek = 2; pad nakon 26-60 sek = 3; pad nakon 61-90 sek = 4; pad nakon 90 sec = 5.

Test socijalnog prepoznavanja

[0146] Test socijalnog prepoznavanja je obavljen na Dan -2/-1 (osnovni nivo), Dan 14 i na Dan 28. U klasičnom testu socijalnog prepoznavanja [60], svaki testirani miš je prebačen je u kavez slične veličine i ostavljen 30 minuta da se prilagodi na novu sredinu. Nakon tog vremena se uvodi novi (ciljni) miš. Socijalno ispitivanje, koje se sastoji od njuškanja i praćenja (međusobno rastojanje od osnove repa < 2 cm), registruje se 2 minuta. Vreme koje testirani miš provede u socijalnom ispitivanju ciljnog miša u prvoj rundi se oznakom T1. Test se zatim ponavlja sat vremena kasnije, sa istim parom miševa. Vreme provedeno u socijalnom ispitivanju tokom druge runde označava se T2. Ako je vreme T2 manje od T1, to ukazuje da testirani miš ima sposobnost da prepozna, odnosno, pamti ciljnog miša (odnosno, prepoznavanje poznatog ciljnog miša u ponovljenom testu dovodi do smanjenja ispitivanja, pa je T2 manje od T1).

Rezultati

2

[0147] Rezultati testa obrnute rešetke predstavljeni su na Slici 1. Y-osa na Slici 1 predstavlja osnovnu vrednost izraženu u sekundama, umanjenu za drugu vrednost u sekundama (Dan 14 i 28 zavisno od x-ose). Y-osa predstavlja razliku vremena provedenog na rešetki, relativno u odnosu na početnu vrednost. S obzirom na to da yosa umanjuje kasniju vrednost od osnovne vrednosti, pozitivne vrednosti na y-osi ukazuje na smanjenje vremena provedenog na rešetki (dakle, lošiji učinak na testu), dok negativna vrednost na y-osi ukazuje na produženje vremena provedenog na rešetki pre pada (odnosno, poboljšanje učinka na testu). Tretirana grupa (5M) pokazala je jasno poboljšanje u odnosu na 2M kontrolnu grupu, ukazujući da kompozicija prema pronalasku pomaže oporavak i poboljšava neurološke funkcije i motorne sposobnosti nakon indukovane povrede mozga.

[0148] Rezultati testa socijalnog prepoznavanja prikazani su na Slici 2. Y-osa na Slici 2 predstavlja vreme T1-T2. Dakle, što je manja vrednost T2 (koja ukazuje na veće socijalno prepoznavanje) to je veća vrednost na y-osi. Na Dan 14 i Dan 28, tretirana grupa (5M) pokazuje najveće socijalno prepoznavanje, ukazujući na to da kompozicija prema pronalasku potpomaže oporavak i poboljšava neurološke funkcije i socijalno prepoznavanje nakon indukovane povrede mozga.

Primer 3 – Efekti bakterijskog liofilizata na produkciju SCFA kod zdravih pacova [0149] Ispitani su efekti dugotrajne primene liofilizata Blautia hydrogenotrophica soja DSM 14294 na produkciju SCFA kod zdravih HIM pacova, a rezultati su prikazani na Slici 3. Ostali detalji eksperimenata dati su ranije u opisima slike. Slika 3 prikazuje da tretman BH izaziva značajno povećanje produkcije acetata i butirata.

Primer 4 - Efikasnost B. hydrogenotrophica ispitana na pacovskom modelu humane mikrobiote (HMA pacov)

Sažetak

[0150] Grupi od 16 sterilnih pacova (po 8 pacova u kontrolnoj i u eksperimentalnoj grupi) inokulirana je mikrobiota izolovana iz pacijenta sa IBS (IBS-HMA pacovi). Izvršena su tri eksperimenta sa fekalnim uzorcima 3 različita IBS pacijenta. Dve druge grupe pacova (n = 10) inokulirane su fekalnim uzorcima zdravih subjekata (n = 2 subjekta; 2 grupe zdravih-HMA pacova), koje su poslužile kao kontrole visceralne osetljivosti. Ukupno je bilo 24 pacova inokuliranih IBS mikrobiotom (kontrola), 24 pacova inokuliranih IBS mikrobiotom tretiranih Blautix-om i 20 pacova inokuliranih mikrobiotom zdravih ispitanika. Polovina IBS-HMA pacova je tokom 28 dana primala kompoziciju koja sadrži soj B. hydrogenotrophica, dok je druga polovina primila kontrolni rastvor.

Soj

Blautia hydrogenotrophica (BH) soj DSM 14294.

Kompozicija i administracija

[0151] Liofilizat BH suspendovan je u sterilnom rastvoru soli, do koncentracije od 10<10>bakterija/ml. Svaki IBS-HMA pacov primio je po 2 ml ove suspenzije dnevno, oralnom gavažom tokom perioda od 28 dana.

[0152] Kao kontrolni rastvor korišćen je sterilni fiziološki rastvor davan dnevno (2 ml po pacovu), oralnom gavažom kontrolnoj grupi IBS-HMA pacova.

Pacovi

[0153] Sterilni pacovi Fisher soja (starosti 10 nedelja) inokulirani su humanom fekalnom mikrobiotom izolovanom od IBS pacijenata (IBS-HMA pacovi). Šesnaest pacova je inokulirano istim humanim fekalnim inokulumom. Izvedena su tri sukcesivna eksperimenta sa fekalnim uzorcima tri različita IBS subjekta. Dve ostale grupe od deset pacova su inokulirane fekalnim uzorcima 2 zdrava ispitanika (normo-senzitivne kontrolne grupe).

Dizajn studije

[0154] Dan -14 – Inokulacija sterilnih pacova humanom fekalnom mikrobiotom.

[0155] Dani 0 do 28 – Dnevna doza BH liofilizata (test grupa), ili kontrolnog rastvora (kontrolna grupa) oralnom gavažom. Između dana 14 i 22 – izvršeno je implantiranje elektrode u abdomen (za test istezanja).

Dani 22-28 – Prilagođavanje pacova na test istezanja.

[0156] Dan 28 – test distenzije i eutanazija životinja, kako bi se prikupili uzorci cekuma, za testiranje sulfide i sadržaja masnih kiselina kratkog lanca (SCFA).

[0157] Dani 0, 14 i 28 – Prikupljanje fekalnih uzoraka za mikrobijalnu analizu; qPCR test procene BH populacije i drugih komensalnih grupa mikroorganizama i označavanje funkcionalnih grupa mikroorganizama pomoću selektivnog medijuma i striktno anaerobnog postupka.

Rezultati

[0158] Slika 4 prikazuje rezultate qPCR analize populacije B. hydrogenotrophica u fekalnim uzorcima IBS-HMA pacova koji su tretirani kontrolnim rastvorom ili BH liofilizatom. Značajno povećanje populacije BH uočeno je na kraju perioda administracije (D 28), kod pacova koji su primili BH liofilizat, što potvrđuje uspešnu isporuku BH u debelo crevo.

4

[0159] Slika 5 prikazuje uticaj administracije BH na glavni fermentivni metabolit, masne kiseline kratkog lanca, u uzorcima cekuma IBS-HMA pacova. Administracija BH dovela je do značajnog povećanja koncentracije acetata, kao i značajnog povećanja koncentracije butirata (Slika 5B).

Primer 5 – Histološka procena efekta B. hydrogenotrophica na moždano tkivo u modelu cerebralne ishemije-reperfuzije I/R kod miša

Sažetak

[0160] Jedan broj miševa je podvrgnut cerebralnoj ishemiji-reperfuziji I/R, kao što je ranije opisano u Primeru 2. Na kraju eksperimenta, u Dane 15 i 29, moždano tkivo miševa je pripremljeno za histološku procenu. Okluzija arterija izaziva smanjenje snabdevanja moždanog tkiva krvlju, odnosno, nestašicu kiseonika i glukoze koje su neophodne za ćelijski metabolizam i normalno funkcionisanje moždanog tkiva. Primenjeni model imitira patologiju moždanog udara.

[0161] Da bi se utvrdilo da li kompozicija prema pronalasku smanjuje uticaje ishemijereperfuzije na moždano tkivo, ispitana je histologija moždanog tkiva nakon završetka ishemije-reperfuzije. Histološka procena je izvršena na osnovu određivanja stepena piknoze (koji procenjuje nivo nekroze i ćelijske smrti) i stepena vakuolizacije (koji procenjuje nivo apoptotske degeneracije tkiva). Ovo su ključni markeri broja ćelija koje su ušle u apoptozu ili nekrozu, odnosno, u procese ćelijske smrti. Do ćelijske smrti dolazi nakon moždanog udara ili eksperimentalnog moždanog udara, usled nedostatka krvi/kiseonika. Što su navedeni test parametri veći, veće je oštećenje izazvano modažnim udarom. Što navedeni test parametri manji, to je kompozicija prema pronalasku efikasnija u sprečavanju oštećenja tokom moždanog udara i poboljšanju oporavka.

Soj

[0162] Blautia hydrogenotrophica bakterije deponovane pod pristupnim brojem DSM 14294.

Dizajn studije i protokol

[0163] Izveden je model ishemije-reperfuzije, kao u Primeru 2. Broj životinja koji je podvrgnut histološkoj analizi u svakoj grupi je prikazan u narednoj tabeli.

Priprema tkiva za histološku analizu

[0164] Životinje su eutanazirane asfiksijom u CO2. Polovina životinja je eutanazirana na Dan 15, a druga polovina na Dan 29. Nakon perfuzije fiziološkim rastvorom, izolovani su delovi creva, ileum, cekum i kolon, prebačeni su u sterilne epruvete i smrznuti na -80°C. Nakon perfuzije izolovani su mozgovi. Desna hemisfera svakog mozga je fiksirana u 2.5% paraformaldehidu i ostavljena na 2-8°C. Leva hemisfera svakog mozga je zamrznuta na -80°C.

[0165] Tanki tkivni preseci desne hemisfere u svakoj grupi postavljeni su na pločice za histološku procenu. Tkiva su isečena, potopljena u parafin, isečena na preseke debljine 5 mikrona i obojene Hematoksilinom i eozinom (H&E) (kao i reagensom za TUNEL analize), primenom standardnog protokola. Pločice su analizirane pod svetlosnim mikroskopom. Mikrografije su analizirane pod mikroskopom (Olympus BX60) pri uvećanjima od ×10, ×20 i ×40. Korišćena je kamera Olympus DP-73.

Protokol histološke procene

[0166] Izbrojana su piknotična jedra i apoptotične ćelije, i izračunate su srednje vrednosti. Prebrojani su neuroni u hipokampusu desne hemisfere. Procena stepena piknoze i vakuolizacije procenjeno određena je na osnovu analize 10 mikroskopskih polja pri uvećanju ×20, a ocene su određene prema sledećim kriterijumima

[0167] Semi-kvantitiativna ocena stepena piknoze i vakuolizacije:

1. Ocena 0 = nema oštećenih ćelija

2. Ocena 1 = do 10 oštećenih ćelija

3. Ocena 2 = > 10 i < 20 oštećenih ćelija

4. Ocena 3 = > 20 i < 30 oštećenih ćelija

5. Ocena 4 = > 30 i < 40 oštećenih ćelija

6. Ocena 5 = > 40 i < 50 oštećenih ćelija

7. Ocena 6 = > 50 oštećenih ćelija

[0168] Ocena je određena za svako polje ×20 uvećanja, kod svakog miša u određenoj grupi. Izračunate su srednje vrednosti za svaki uzorak. Izračunate su srednje vrednosti za svaku grupu i ta vrednost je prikazana na graficima (Slike 6A i 6B).

Rezultati

Piknoza

[0169] Slika 6A prikazuje semi-kvantitativnu procenu stepena piknoze nakon hisitološke analize H&E bojenja. Kao što se očekivalo, miševi iz grupe PBS negativna kontrola (2M) podvrgnuti ishemiji-reperfuziji pokazali su značajno povećanje broja nekrotičnih i/ili umirućih ćelija u poređenju sa lažno operisanom negativnom kontrolom (1M, miševi koji nisu podvrgnuti ishemiji-reperfuziji i koji su pokazali skor manji od 1). Miševi iz pozitivne kontrolne grupe, koji su tretirani MK-801 (3M) pokazali su smanjeni stepen piknoze, što ukazuje na manju broj nekrotičnih ćelija. Miševi koji su tretirani kompozicijom prema pronalasku (5M) imali su još manji stepen piknoze, koji je bio značajno smanjen u odnosu na PBS negativnu kontrolnu grupu (2M) i manji od skora kod miševa koji su tretirano liofilizovanim praškom (4M). Shodno tome, miševi kojima je administrirana kompozicija prema pronalasku ispoljili su trend značajnog smanjenja nekroze izazvane ishemijom.

Vakuolizacija

[0170] Slika 6B prikazuje rezultate semi-kvantitiativne procene vakuolizacije na histološkim preparatima obojenim H&E bojenjem. I ovde, očekivano, miševi iz grupe PBS negativna kontrola (2M) podvrgnuti ishemiji-reperfuziji ispoljili su povećan broj nekrotičnih i/ili umirućih ćelija u odnosu na grupu lažno operisanih životinja iz negativne kontrole (1M), čiji je skor bio nešto iznad 0. Suprotno ocenama piknotičkog skora, pozitivna kontrola (3M) nije uticala na stepen vakuolizacije, ukazujući da MK-801 ne smanjuje broj ćelija u apoptozi. Međutim, miševi kojima je administrirana kompozicija prema pronalasku (5M) ispoljili su značajno smanjenje vakuolizacije, koja je bila manja nego kod drugih grupa. Shodno, tome, kompozicije prema predmetnom pronalasku smanjuju nivo apoptotične ćelijske smrti izazvane ishemijom.

Reprezentativna histološka bojenja

[0171] Slika 6C prikazuje reprezentativne fotografije H&E dobijenih preseka testiranih životinja. Ove slike su korišćene za semi-kvantitiativnu procenu stepena piknoze i vakuolizacije. Grupa 5M (administrirana kompozicija prema pronalasku) ispoljava najveću gustinu i broj ćelija, i smanjenu vakuolizaciju u odnosu na grupu 4M (liofilizovani prašak) i sličnija je MK-801 pozitivnoj kontroli. U istinu, miševi kojima je administrirana bakterijska kompozicija prema pronalasku ispoljavaju značajno poboljšanu histologiju u poređenju sa ishemičnim miševima iz negativne kontrolne grupe (2M).

Zaključci

[0172] Soj B. hydrogenotrophica prema predmetnom pronalasku, značajno poboljšava histologiju moždanog tkiva miša podvrgnutog ishemiji-reperfuziji u poređenju sa obe negativne kontrole. U skladu sa ovim, bakterijske kompozicije smanjuju broj nekrotičnih i mrtvih ćelija, i smanjuju broj ćelija koje ulaze u apoptozu (vakuolizacija). Iako liofilizovani prašak takođe u maloj meri smanjuje piknozu i vakuolizaciju, ovo smanjenje nije istog obima kao u eksperimentalnoj grupi, kojoj je administrirana bakterijska kompozicija prema pronalasku. Jedno moguće objašnjenje poboljšanja histologije kod liofilizovane kontrole je da ovakav prašak sadrži šećere koji takođe mogu imati uticaj na oporavak ćelija podvrgnutih smanjenju nivoa kiseonika i metabolita (usled testa ishemije-reperfuzije). Pa ipak, bakterijski soj prema pronalasku izaziva vidljivo poboljšanje histologije, kako u pogledu piknoze, tako i u pogledu vakuolizacije, u odnosu na liofilizovane negativne kontrole. Dakle, bakterijski soj ima sposobnost da umanji ćelijsku smrt u moždanom tkivu (nekrozom ili apoptozom) i/ili da pomogne u oporavku moždanog tkiva nakon oštećenja izazvanog ishemijom-reperfuzijom.

Sekvence

[0173]

SEQ ID NO:1 (Blautia stercoris soj GAM6-1 gen za 16s-RNK, delimična sekvenca HM626177)

SEQ ID NO:2 (Blautia wexlerae soj WAL 14507 gen za 16S ribozomalnu RNS, delimična sekvenca EF036467)

SEQ ID NO:3 (konsenzusna sekvenca 16S rRNK kod Blautia stercoris soj 830)

SEQ ID NO:4 (konsenzusna sekvenca 16S rRNK kod Blautia wexlerae soj MRX 008)

SEQ ID NO:5 (Blautia hydrogenotrophica soj S5a36 gen za 16S ribozomalnu RNK, delimična sekvenca X95624.1)

4

REFERENCE

[0174]

[1] Spor et al. (2011) Nat Rev Microbiol.9(4):279-90.

[2] Eckburg et al. (2005) Science.10;308(5728):1635-8.

[3] Tap et al. (2009) Environ Microbiol, 11(10):2574-84

[4] Macpherson et al. (2001) Microbes Infect.3(12):1021-35 [5] Macpherson et al. (2002) Cell Mol Life Sci.59(12):2088-96.

[6] Mazmanian et al. (2005) Cell 15;122(1):107-18.

[7] Frank et al. (2007) PNAS 104(34): 13780-5.

[8] Scanlan et al. (2006) J Clin Microbiol.44(11):3980-8.

[9] Kang et al. (2010) Inflamm Bowel Dis.16(12):2034-42.

[10] Machiels et al. (2013) Gut.63(8):1275-83.

[11] Lopetuso et al. (2013), Gut Pathogens, 5: 23

[12] WO 2013/050792

[13] WO 03/046580

[14] WO 2013/008039

[15] WO 2014/167338

[16] US2016/143961

[17] Lee and Lee (2014) World J Gastroenterol.20(27): 8886-8897.

[18] WO2014/150094

[19] Sun et al.2015 Neuroscience letters 613, 30-35

[20] Sun et αl.2016 Brain research 1642, 180-188

[21] WO 01/85187

[22] WO 2016/203218

[23] Liu et al. (2008) Int J Syst Evol Microbiol 58, 1896-1902.

[24] Bernalier et al. (1996) Arch. Microbiol.166 (3), 176-183.

[25] Park et al. (2012) Int J Syst Evol Microbiol.62(Pt 4):776-9.

[26] Masco et al. (2003) Systematic and Applied Microbiology, 26:557-563.

[27] Srutková et al. (2011) J. Microbiol. Methods, 87(1): 10-6.

[28] Psaty et al. (2003) JAMA, 289(19):2534-44.

[29] Lancet. (1995) 346(8991-8992): 1647-53.

[30] Li et al. (2013) Neuroscience, 252:346-358.

[31] Zhao et al. (2008) Brain Research 1229:224-232.

[32] Park et al. (2016) J. Neuroinflammation 13:300.

[33] Sun et al. (2015) BioMed Res. Int. Article ID.

[34] Bourassa et al. (2016) Neurosci. Lett.625:56-63.

[35] Chuang et al. (2009) Trends Neurosci.32 (11):591-601

[36] Fischer et al. (2007) Nature 447(7141):178-182

[37] Miyamoto-Shinohara et al. (2008) J. Gen. Appl. Microbiol., 54, 9-24.

[38] Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, ed. by Day and McLellan, Humana Press.

[39] Leslie et al. (1995) Appl. Environ. Microbiol.61, 3592-3597.

[40] Mitropoulou et al. (2013) J Nutr Metab. (2013) 716861.

[41] Kailasapathy et al. (2002) Curr Issues Intest Microbiol.3(2):39-48.

[42] Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller

[43] Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit.

1985)

[44] US 2016/0067188

[45] Handbook of Microbiological Media, Fourth Edition (2010) Ronald Atlas, CRC Press.

[46] Maintaining Cultures for Biotechnology and Industry (1996) Jennie C. Hunter-Cevera, Academic Press

[47] Strobel (2009) Methods Mol Biol.581:247-61.

[48] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

[49] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press).

[50] Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.) [51] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific

Publications)

[52] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory

Press).

[53] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997) [54] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).

[55] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)

[56] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30

[57] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math.2: 482-489.

[58] Kondziela (1964) Int. Pharmacodyn.152:277-284

[59] Coughenour et al. (1977) Pharmacol Biochem Behav. 6(3):351-3

[60] Jacobs et al. (2016) Bio-Protocol 6(9)e1804

4

�

Claims

Patentni zahtevi

1. Kompozicija koja sadrži bakterijski soj roda Blautia, za upotrebu u postupku lečenja povrede mozga.

2. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time da povreda mozga predstavlja moždani udar.

3. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 2, naznačena time da je moždani udar:

(a) moždana ishemija;

(b) fokalna moždana ishemija;

(c) ishemijski udar; ili

(d) hemoragijski udar.

4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time da je kompozicija za upotrebu u lečenju povrede mozga kod subjekta kod kojeg je ustanovljen rizik od moždanog udara.

5. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 4, naznačena time da subjekt ima najmanje jedan faktor rizika za razvoj moždanog udara.

6. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 5, naznačena time da taj najmanje jedan faktor rizika jeste visok krvni pritisak ili dijabetes.

7. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 4-6, naznačena time da je subjekt iskusio najmanje jedan prolazni ishemijski napad.

8. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time da bakterijski soj je:

(a) Blautia hydrogenotrophica;

(b) Blautia stercoris; ili

(c) Blautia wexlerae.

9. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-7, naznačena time da bakterijski soj ima sekvencu 16s rRNK koja je:

4

(a) najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci 16s rRNK bakterijskog soja vrste Blautia hydrogenotrophica, opciono, pri čemu bakterijski soj ima sekvencu 16s rRNK koja je najmanje 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci SEQ ID NO:5 ili ima sekvencu 16s rRNK kao SEQ ID NO:5;

(b) najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci 16s rRNK bakterijskog soja Blautia stercoris; ili

(c) najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% ili 99.9% identična sekvenci 16s rRNK bakterijskog soja Blautia wexlerae.

10. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time da kompozicija sadrži: (a) bakterijski soj vrste Blautia hydrogenotrophica, za upotrebu u postupku lečenja povrede mozga;

(b) bakterijski soj vrste Blautia stercoris, za upotrebu u postupku lečenja povrede mozga; ili

(c) bakterijski soj Blautia wexlerae, za upotrebu u postupku lečenja povrede mozga.

11. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time da:

(a) kompozicija je za oralnu primenu;

(b) da kompozicija sadrži jedan ili više farmaceutskih prihvatljivih eksipijenasa ili nosača;

(c) bakterijski soj je liofilizovan; i/ili

(d) bakterijski soj je vijabilan.

12. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time da kompozicija sadrži jedan soj roda Blautia.

13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, koja sadrži bakterijski soj Blautia kao deo zajednice mikroorganizama.

14. Prehrambeni proizvod koji sadrži kompoziciju prema bilo kom od prethodnih zahteva, za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva.