ES2955870T3 - Composiciones que comprenden cepas bacterianas - Google Patents

Abstract

La invención proporciona composiciones que comprenden cepas bacterianas para tratar y prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden cepas bacterianas

Campo técnico

Está invención está en el campo de las composiciones que comprenden cepas bacterianas del género Blautia y el uso de dichas composiciones en el tratamiento o prevención de una enfermedad, particularmente un trastorno o afección del sistema nervioso central seleccionado del grupo que consiste en: un trastorno del neurodesarrollo; una afección neuropsiquiátrica; trastornos del espectro autista (ASD); trastorno del desarrollo infantil; trastorno obsesivo compulsivo (OCD); trastorno depresivo mayor; depresión; trastorno afectivo estacional; trastornos de ansiedad; trastorno de estrés postraumático; trastorno bipolar; psicosis y trastorno del estado de ánimo.

Antecedentes de la invención

Se considera que el intestino humano es estéril en el útero, pero está expuesto a una gran variedad de microbios maternos y ambientales inmediatamente después del nacimiento. A partir de entonces, se produce un período dinámico de colonización y sucesión microbiana, que está influenciado por factores tales como el modo de suministro, entorno, dieta y genotipo del huésped, todos los cuales impactan en la composición de la microbiota intestinal, particularmente durante los primeros años de vida. Posteriormente, la microbiota se estabiliza y se vuelve adulta [i]. La microbiota intestinal humana contiene más de 500-1000 filotipos diferentes que pertenecen esencialmente a dos grandes divisiones bacterianas, Bacteroidetes y Firmicutes [ii]. Las exitosas relaciones simbióticas que surgen de la colonización bacteriana del intestino humano han producido una amplia variedad de funciones metabólicas, estructurales, protectoras y otras funciones beneficiosas. Las actividades metabólicas potenciadas del intestino colonizado aseguran que los componentes dietéticos que de otro modo no serían digeribles se degraden con la liberación de subproductos que proporcionan una importante fuente de nutrientes para el huésped. De manera similar, la importancia inmunológica de la microbiota intestinal está bien reconocida y se ejemplifica en animales libres de gérmenes que tienen un sistema inmunológico deteriorado que se reconstituye funcionalmente luego de la introducción de bacterias comensales [iii-v].

El descubrimiento del tamaño y la complejidad del microbioma humano ha dado como resultado una evaluación continua de muchos conceptos de salud y enfermedad. Ciertamente, se han documentado cambios drásticos en la composición de la microbiota en trastornos gastrointestinales tales como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)[viix]. Más recientemente, existe un mayor interés en la técnica con respecto a las alteraciones en el microbioma intestinal que pueden desempeñar una función fisiopatológica en las enfermedades del cerebro humano [x]. La evidencia preclínica y clínica sugiere fuertemente un vínculo entre el desarrollo del cerebro y la microbiota [xi].

Un creciente cuerpo de literatura preclínica ha demostrado la señalización bidireccional entre el cerebro y el microbioma intestinal, que involucra múltiples sistemas de señalización neurocrinos y endocrinos. De hecho, los niveles elevados de especies de Clostridium en el microbioma se han relacionado con trastornos cerebrales [xii], y un desequilibrio de los filos Bacteroidetes y Firmicutes también se ha relacionado con trastornos del desarrollo cerebral [xiii]. Las sugerencias de que los niveles alterados de comensales intestinales, que incluyen los de los géneros Bifidobacterium, Lactobacillus, Sutterella, Prevotella y Ruminococcus y de la familia Alcaligenaceae, están involucrados en los trastornos del sistema nervioso central (CNS) inmunomediados, son cuestionadas por estudios que sugieren una carencia de alteración en la microbiota entre pacientes y sujetos sanos [xiv]. Esto indica que, en la actualidad, el efecto práctico del vínculo entre el microbioma y las enfermedades del cerebro humano está mal caracterizado. De acuerdo con lo anterior, se requieren estudios analíticos más directos para identificar el impacto terapéutico de alterar el microbioma sobre los trastornos del CNS.

En reconocimiento del efecto positivo potencial que ciertas cepas bacterianas pueden tener sobre el intestino animal, se han propuesto varias cepas para uso en el tratamiento de diversas enfermedades (véase, por ejemplo, [xiv-xvii]). También, ciertas cepas, que incluyen principalmente las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium, se han propuesto para uso en el tratamiento de varias enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias que no están directamente relacionadas con los intestinos (véase [xviii] y [xix] para revisiones). Además, se ha investigado una variedad de probióticos en modelos animales para determinar la función del microbioma intestinal en la modulación del comportamiento emocional, y Bifidobacterium y Lactobacillus son los principales géneros que muestran efectos beneficiosos, reducen la ansiedad y los comportamientos repetitivos y aumentan la interacción social [xx-xxii]. Sin embargo, la relación entre diferentes enfermedades y diferentes cepas bacterianas, y los efectos precisos de cepas bacterianas particulares sobre el intestino y a nivel sistémico y en cualquier tipo particular de enfermedad, están pobremente caracterizados, particularmente para las enfermedades del sistema nervioso central.

Existe un creciente cuerpo de evidencia que sugiere que el eje microbiota-intestino-cerebro se ve afectado en los trastornos del espectro autista (ASD) y otros trastornos del neurodesarrollo y neuropsiquiátricos. Los modelos animales han proporcionado una visión considerable de cómo la microbiota puede estar involucrada en los ASD. Adicionalmente, los estudios preclínicos han demostrado que dirigirse a la microbiota intestinal a través de la administración de bioterapéuticos vivos beneficiosos muestra eficacia para mejorar el comportamiento relacionado con el autismo en modelos animales, que incluyen el modelo de ratón con activación inmunitaria materna (MIA) y el ratón braquiúrico negro y tostado (BTBR). El ratón BTBR es una cepa de ratón endogámica modificada genéticamente que muestra una serie de comportamientos asociados con el ASD, tales como sociabilidad deteriorada, comportamiento repetitivo y aumento de la ansiedad. Más aún, estos ratones también presentan disfunciones gastrointestinales junto con alteraciones en la composición de la microbiota intestinal. En consecuencia, representa un modelo animal apropiado para investigar la función del eje microbiota-intestino-cerebro en los ASD.

De acuerdo con lo anterior, subsiste una necesidad en la técnica de nuevos métodos para tratar trastornos del sistema nervioso central. También es necesario caracterizar los efectos potenciales de las bacterias intestinales para que se puedan desarrollar nuevas terapias que utilicen bacterias intestinales.

El documento WO2016/203218 describe composiciones que comprenden cepas bacterianas para tratar y prevenir enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias.

Li, Wei et al. “Structural changes of gut microbiota in Parkinson's disease and its correlation with clinical features.” Science China. Life sciences vol. 60,11 (2017): 1223-1233 informan sobre la comparación entre la estructura de la microbiota intestinal en pacientes con enfermedad de Parkinson (PD) y controles sanos y explora las correlaciones entre la microbiota intestinal y las características clínicas de la PD.

Resumen de la invención

Los inventores han desarrollado nuevas terapias para tratar y prevenir trastornos del sistema nervioso central. En particular, los inventores han desarrollado nuevas terapias para tratar y prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro. En particular, los inventores han identificado que las cepas bacterianas del género Blautia pueden ser eficaces para tratar y prevenir enfermedades y afecciones mediadas por el eje microbiota-intestino-cerebro. Como se describe en los ejemplos, la administración oral de las composiciones que comprenden una cepa de Blautia puede reducir los síntomas asociados con la disfunción del eje microbiotaintestino-cerebro en un modelo de ratón con trastornos del espectro autista. Además, como se describe en los ejemplos, la administración oral de las composiciones que comprenden una cepa de Blautia pueden modular los niveles de moléculas de señalización asociadas con la función del eje microbiota-intestino-cerebro, y los trastornos del neurodesarrollo y neuropsiquiátricos.

La invención es como se define en las reivindicaciones. Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central en el que el trastorno o afección del sistema nervioso central es un trastorno del neurodesarrollo o una afección neuropsiquiátrica seleccionado del grupo que consiste en: trastornos del espectro autista (ASD); trastorno obsesivo compulsivo (OCD); trastorno depresivo mayor; depresión; trastorno afectivo estacional; trastornos de ansiedad; trastorno de estrés postraumático; trastorno bipolar; psicosis y trastorno del estado de ánimo. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia stercoris para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central. Las composiciones que utilizan Blautia stercoris pueden ser particularmente efectivas para tratar un trastorno o afección del sistema nervioso central. La divulgación proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia wexlerae para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central.

En realizaciones particulares, el trastorno o afección del sistema nervioso central es mediado por el eje microbiotaintestino-cerebro. La divulgación proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno del neurodesarrollo o una afección neuropsiquiátrica. Se proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia stercoris para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno del neurodesarrollo o afección neuropsiquiátrica. Las composiciones que utilizan Blautia stercoris pueden ser particularmente efectivas para tratar un trastorno del neurodesarrollo o afección neuropsiquiátrica. Se proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia wexlerae para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno del neurodesarrollo o afección neuropsiquiátrica. Los inventores han identificado que el tratamiento con cepas bacterianas de este género puede proporcionar beneficios clínicos en modelos de ratón con trastornos del sistema nervioso central, en particular aquellos mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro. Los inventores han identificado que el tratamiento con cepas bacterianas de este género puede modular la señalización en los sistemas nerviosos central, autónomo y entérico; puede modular la actividad de la ruta del eje hipotálamo-hipófisis suprarrenal (HPA); puede modular rutas neuroendocrinas y/o neuroinmunitarias; y/o puede modular los niveles de metabolitos comensales, marcadores inflamatorios y/o permeabilidad gastrointestinal de un sujeto. Las composiciones que utilizan Blautia stercoris pueden ser particularmente efectivas en modular la señalización en los sistemas nerviosos central, autónomo y entérico; modular la actividad de la ruta del eje hipotálamo-hipófisis suprarrenal (HPA); modular rutas neuroendocrinas y/o neuroinmunitarias; y/o modular los niveles de metabolitos comensales, marcadores inflamatorios y/o permeabilidad gastrointestinal de un sujeto. En ciertas realizaciones, también pueden ser eficaces las composiciones que utilizan Blautia wexlerae.

La invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en: trastornos del espectro autista (ASD); trastorno obsesivo compulsivo (OCD); trastorno depresivo mayor; depresión; trastorno afectivo estacional; trastornos de ansiedad; trastorno de estrés postraumático; trastorno bipolar; psicosis y trastorno del estado de ánimo. El efecto mostrado por las cepas bacterianas del género Blautia sobre el eje microbiota-intestino-cerebro y sobre enfermedades mediadas por el eje microbiota-intestino-cerebro puede proporcionar beneficios terapéuticos para otras enfermedades y afecciones mediadas por el eje microbiota-intestino-cerebro, tales como aquellas listadas anteriormente. En otras realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar comorbilidades asociadas con enfermedades y afecciones mediadas por el eje microbiota-intestino-cerebro, tales como aquellas listadas anteriormente. En realizaciones particularmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar comorbilidades gastrointestinales asociadas con enfermedades y afecciones mediadas por el eje microbiota-intestino-cerebro, tales como aquellas listadas anteriormente. Los experimentos con modelos de ratón utilizados en esta solicitud para la evaluación de los síntomas de trastornos del espectro autista se conocen en la técnica por ser aplicables para la evaluación de los síntomas de otros trastornos del sistema nervioso central que incluyen aquellos listados anteriormente [xxiii-xxv].

En realizaciones particularmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir trastornos del espectro autista, tales como autismo. Los inventores han identificado que el tratamiento con cepas de Blautia puede reducir la severidad de los síntomas en un modelo de ratón con trastornos del espectro autista y puede prevenir o reducir el comportamiento estereotipado, repetitivo, compulsivo y ansioso. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en el tratamiento de trastornos del espectro autista. Las composiciones que utilizan Blautia pueden ser particularmente eficaces para tratar trastornos del espectro autista. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición para uso en reducir el comportamiento estereotipado, repetitivo, compulsivo o ansioso, en particular en el tratamiento de trastornos del espectro autista. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en el tratamiento de los síntomas de comportamiento de los trastornos del espectro autista. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia para uso en el tratamiento de los síntomas gastrointestinales de los trastornos del espectro autista. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en el tratamiento del comportamiento y los síntomas gastrointestinales de los trastornos del espectro autista. El tratamiento con cepas de Blautia puede modular la señalización en los sistemas nerviosos central, autónomo y entérico; puede modular la actividad de la ruta del eje HPA; puede modular rutas neuroendocrinas y/o neuroinmunitarias; y/o puede modular los niveles de metabolitos comensales, marcadores inflamatorios y/o permeabilidad gastrointestinal de un sujeto, todos los cuales están implicados en la neuropatología de los trastornos del espectro autista. En ciertas realizaciones, el tratamiento con cepas de Blautia puede modular los niveles de hormonas oxitocina y/o vasopresina. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia stercoris para uso en un método para tratar o prevenir trastornos del espectro autista. Las composiciones que utilizan Blautia stercoris pueden ser particularmente efectivas para tratartrastornos del espectro autista. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia wexlerae para uso en un método para tratar o prevenir trastornos del espectro autista.

En realizaciones preferidas adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno obsesivo compulsivo (OCD). En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición para uso en reducir el comportamiento estereotipado, repetitivo, compulsivo o ansioso en el tratamiento de OCD. El tratamiento con cepas de Blautia puede modular la señalización en los sistemas nerviosos central, autónomo y entérico; puede modular la actividad de la ruta del eje HPA; puede modular rutas neuroendocrinas y/o neuroinmunitarias; y/o puede modular los niveles de metabolitos comensales y/o permeabilidad gastrointestinal de un sujeto, todos los cuales están implicados en la neuropatología del OCD. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia stercoris para uso en un método para tratar o prevenir el OCD. Las composiciones que utilizan Blautia stercoris pueden ser particularmente efectivas para tratar el OCD. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia wexlerae para uso en un método para tratar o prevenir el OCD.

En realizaciones preferidas adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno depresivo mayor (MDD). El tratamiento con cepas de Blautia puede proporcionar beneficios clínicos en un modelo de ratón con depresión. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en el tratamiento de depresión. Las composiciones que utilizan cepas de Blautia pueden ser particularmente eficaces para tratar depresión. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición para uso en reducir el comportamiento estereotipado, repetitivo, compulsivo o ansioso en el tratamiento de depresión. El tratamiento con cepas de Blautia puede modular la señalización en los sistemas nerviosos central, autónomo y entérico; puede modular la actividad de la ruta del eje HPA; puede modular rutas neuroendocrinas y/o neuroinmunitarias; y puede modular los niveles de metabolitos comensales, marcadores inflamatorios y/o permeabilidad gastrointestinal de un sujeto, todos los cuales están implicados en la neuropatología del MDD. En ciertas realizaciones, el tratamiento con cepas de Blautia puede modular los niveles de hormonas oxitocina y/o vasopresina. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia stercoris para uso en un método para tratar o prevenir el MDD. Las composiciones que utilizan Blautia stercoris pueden ser particularmente efectivas para tratar el MDD. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia wexlerae para uso en un método para tratar o prevenir el MDD.

En realizaciones preferidas adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir trastornos de ansiedad. El tratamiento con cepas de Blautia reduce la incidencia de la enfermedad y severidad de la enfermedad en un modelo de ratón con ansiedad en los ejemplos de esta solicitud. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en el tratamiento del trastorno de ansiedad. Las composiciones que utilizan cepas de Blautia pueden ser particularmente eficaces para tratar el trastorno de ansiedad. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición para uso en reducir el comportamiento estereotipado, repetitivo, compulsivo o ansioso en el tratamiento de la ansiedad. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia stercoris para uso en un método para tratar o prevenir trastornos de ansiedad. Las composiciones que utilizan Blautia stercoris pueden ser particularmente efectivas para tratar trastornos de ansiedad. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia wexlerae para uso en un método para tratar o prevenir trastornos de ansiedad.

En realizaciones preferidas adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir trastornos de estrés, tales como trastorno de estrés postraumático. Las composiciones que comprenden una cepa bacteriana del género Blautia pueden reducir el estrés en modelos de ratón con trastornos de estrés. El tratamiento con cepas de Blautia puede modular la señalización en los sistemas nerviosos central, autónomo y entérico; puede modular la actividad de la ruta del eje HPA; puede modular rutas neuroendocrinas y/o neuroinmunitarias; y puede modular los niveles de metabolitos comensales, marcadores inflamatorios y/o permeabilidad gastrointestinal de un sujeto, todos los cuales están implicados en la neuropatología del trastorno de estrés. En ciertas realizaciones, el tratamiento con cepas de Blautia puede modular los niveles de hormonas oxitocina y/o vasopresina. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia stercoris para uso en un método para tratar o prevenir trastornos de estrés. Las composiciones que utilizan Blautia stercoris pueden ser particularmente efectivas para tratar trastornos de estrés. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia wexlerae para uso en un método para tratar o prevenir trastornos de estrés.

En realizaciones preferidas adicionales, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno bipolar. Las composiciones que comprenden una cepa bacteriana del género Blautia pueden reducir las ocasiones de manía y/o depresión en modelos de ratón con trastorno bipolar. El tratamiento con cepas de Blautia puede modular la señalización en los sistemas nerviosos central, autónomo y entérico; puede modular la actividad de la ruta del eje HPA; puede modular rutas neuroendocrinas y/o neuroinmunitarias; y puede modular los niveles de metabolitos comensales, marcadores inflamatorios y/o permeabilidad gastrointestinal de un sujeto, todos los cuales están implicados en la neuropatología de trastorno bipolar. En ciertas realizaciones, el tratamiento con cepas de Blautia puede modular los niveles de hormonas oxitocina y/o vasopresina. En las realizaciones preferidas, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia stercoris para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno bipolar. Las composiciones que utilizan Blautia stercoris pueden ser particularmente efectivas para tratar el trastorno bipolar. En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia wexlerae para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno bipolar.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia hydrogenotrophica para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central. Las composiciones que utilizan Blautia hydrogenotrophica pueden ser particularmente eficaces para tratar un trastorno o afección del sistema nervioso central.

La divulgación proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia hydrogenotrophica para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno del neurodesarrollo o afección neuropsiquiátrica. Las composiciones que utilizan Blautia hydrogenotrophica pueden ser particularmente eficaces para tratar un trastorno del neurodesarrollo o afección neuropsiquiátrica.

Las composiciones que utilizan Blautia hydrogenotrophica pueden ser particularmente eficaces en modular la señalización en los sistemas nerviosos central, autónomo y entérico; modular la actividad de la ruta del eje hipotálamohipófisis suprarrenal (HPA); modular rutas neuroendocrinas y/o neuroinmunitarias; y/o modular los niveles de metabolitos comensales, marcadores inflamatorios y/o permeabilidad gastrointestinal de un sujeto. en una realización particularmente preferida, la Blautia hydrogenotrophica modula los niveles de butirato. En ciertas realizaciones, la modulación de los niveles de butirato trata o evita un trastorno o afección del sistema nervioso central.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia hydrogenotrophica para uso en un método para tratar o prevenir trastornos del espectro autista. Las composiciones que utilizan Blautia hydrogenotrophica pueden ser particularmente eficaces para tratar trastornos del espectro autista.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia hydrogenotrophica para uso en un método para tratar o prevenir el OCD. Las composiciones que utilizan Blautia hydrogenotrophica pueden ser particularmente eficaces para tratar el OCD.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia hydrogenotrophica para uso en un método para tratar o prevenir el MDD. Las composiciones que utilizan Blautia hydrogenotrophica pueden ser particularmente eficaces para tratar el MDD.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia hydrogenotrophica para uso en un método para tratar o prevenir trastornos de ansiedad. Las composiciones que utilizan Blautia hydrogenotrophica pueden ser particularmente eficaces para tratar trastornos de ansiedad.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia hydrogenotrophica para uso en un método para tratar o prevenir trastornos de estrés. Las composiciones que utilizan Blautia hydrogenotrophica pueden ser particularmente eficaces para tratar trastornos de estrés.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana de la especie Blautia hydrogenotrophica para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno bipolar. Las composiciones que utilizan Blautia hydrogenotrophica pueden ser particularmente eficaces para tratar el trastorno bipolar.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para uso en un método para modular el eje microbiotaintestino-cerebro en el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por el eje microbiota-intestinocerebro. En particular, las composiciones de la invención se pueden utilizar en modular el eje microbiota-intestinocerebro en el tratamiento o prevención de trastornos del espectro autista; trastorno obsesivo compulsivo; trastorno depresivo mayor; trastornos de ansiedad; y trastorno bipolar.

En las realizaciones preferidas de la invención, la cepa bacteriana en la composición es de Blautia stercoris. También se pueden utilizar cepas estrechamente relacionadas, tales como cepas bacterianas que tienen una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia stercoris. Preferiblemente, la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 o 2. Preferiblemente, la identidad de secuencia es con la SEQ ID NO:2. Preferiblemente, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO:2.

En las realizaciones preferidas de la invención, la cepa bacteriana en la composición es de Blautia wexlerae. También se pueden utilizar cepas estrechamente relacionadas, tales como cepas bacterianas que tienen una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia wexlerae. Preferiblemente, la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:3 o 4. Preferiblemente, la identidad de secuencia es con la SEQ ID NO:4. Preferiblemente, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO:4.

En las realizaciones preferidas de la invención, la cepa bacteriana en la composición es de Blautia hydrogenotrophica. También se pueden utilizar cepas estrechamente relacionadas, tales como cepas bacterianas que tienen una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia hydrogenotrophica. Preferiblemente, la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:7. aún más preferiblemente, la cepa bacteriana en la composición es la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención es para administración oral. La administración oral de las cepas de la invención puede ser eficaz para tratar trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular aquellos mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro. También la administración oral es conveniente para pacientes y practicantes y permite el suministro a y/o colonización total o parcial del intestino.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención comprende una cepa bacteriana que ha sido liofilizada. La liofilización es una técnica efectiva y conveniente para preparar composiciones estables que permiten el suministro de bacterias.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona un producto alimenticio que comprende la composición como se describió anteriormente.

Se proporciona una composición de vacuna que comprende la composición como se describió anteriormente.

También se discute en el presente documento un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro, que comprende administrar una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia.

Al desarrollar la invención anterior, los inventores han identificado y caracterizado una cepa bacteriana que es particularmente útil para terapia. La cepa de Blautia stercoris de la invención se muestra por ser efectiva para tratar las enfermedades descritas anteriormente, tales como trastorno del espectro autista. La invención proporciona una célula de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCINM 42381. La divulgación también proporciona composiciones que comprenden dichas células, o cultivos biológicamente puros de dichas células. La invención también proporciona una célula de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCINM 42381, para uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas anteriormente.

La divulgación proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso NCnVIB 42381, para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central. Se proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381, para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno del neurodesarrollo o una afección neuropsiquiátrica. En realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso NCINM 42381, para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno del espectro autista, o preferiblemente autismo. En realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381, para uso en un método para reducir el comportamiento estereotipado, repetitivo, compulsivo o ansioso, especialmente en el tratamiento de autismo.

Al desarrollar la invención anterior, los inventores han identificado y caracterizado una cepa bacteriana adicional que es particularmente útil para terapia. La cepa de Blautia wexlerae de la invención se muestra por ser efectiva para tratar las enfermedades descritas anteriormente, tales como trastorno del espectro autista. Por lo tanto, otro aspecto proporciona una célula de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486. La divulgación también proporciona composiciones que comprenden dichas células, o cultivos biológicamente puros de dichas células. La invención también proporciona una célula de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486, o un derivado de la misma, para uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas anteriormente.

Se proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486, para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central. Se proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486, para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno del neurodesarrollo o una afección neuropsiquiátrica. En realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486, para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno del espectro autista, o preferiblemente autismo. En realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486, para uso en un método para reducir el comportamiento estereotipado, repetitivo, compulsivo o ansioso, especialmente en el tratamiento de autismo.

Al desarrollar la invención anterior, los inventores han identificado y caracterizado una cepa bacteriana que es particularmente útil para terapia. La cepa Blautia hydrogenotrophica de la invención se muestra por ser efectiva para tratar las enfermedades descritas anteriormente, tales como trastorno del espectro autista. Por lo tanto, la divulgación proporciona una célula de la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294. La divulgación proporciona composiciones que comprenden dichas células, o cultivos biológicamente puros de dichas células. La invención también proporciona una célula de la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294, para uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas anteriormente.

En realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso DSM 14294, para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central. En realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso ^d S^m 14294 para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno del neurodesarrollo o una afección neuropsiquiátrica como se define en la reivindicación 1. En realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso d Sm 14294, para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno del espectro autista, o preferiblemente autismo. En realizaciones especialmente preferidas, la invención proporciona una composición que comprende la cepa depositada bajo el número de acceso DSM 14294, para uso en un método para reducir el comportamiento estereotipado, repetitivo, compulsivo o ansioso, especialmente en el tratamiento de autismo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones C57BI/6 en la prueba de 3 cámaras. *p<0.05 nuevo frente a familiar (A) y **p<0.01 objeto frente a animal (B).

Figura 2: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones C57Bl/6 en la prueba de nado forzado. Mrx006 significativamente diferente al grupo de vehículo **p<0.01; Grupo de vehículo significativamente diferente al grupo no tratado ##p<0.01.

Figura 3: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre

ratones C57Bl/6 en la prueba de suspensión de la cola. Figura 4: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones C57Bl/6 en la prueba de condicionamiento del miedo. * Mrx006 significativamente diferente al grupo de Vehículo; # Vehículo significativamente diferente al grupo No tratado; * p<0.05, #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001.

Figura 5: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones C57Bl/6 en la nueva prueba de reconocimiento de objetos. # Objeto significativamente diferente frente a familiar dentro de los grupos; #p<0.05.

Figura 6: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre

ratones C57Bl/6 en la prueba de enterramiento de canicas. Figura 7: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre

ratones C57Bl/6 en la prueba del laberinto elevado en cruz. Figura 8: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre la hipertermia inducida por estrés en ratones C57Bl/6. # Grupo de vehículo significativamente diferente al grupo no tratado, #p<0.05.

Figura 9: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre los niveles de oxitocina circulante en ratones C57Bl/6. * Mrx006 significativamente diferente del grupo de vehículo; * p<0.05.

Figura 10: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre los niveles plasmáticos de corticosterona en ratones C57Bl/6.

* Significativamente diferente al grupo no tratado (A) o vehículo (B); * p<0.05.

Figura 11: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre la permeabilidad intestinal en ratones C57Bl/6.

Figura 12: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre el peso de los órganos y la longitud del colon en ratones C57Bl/6.

Figura 13: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones BTBR en la prueba de interacción social de tres cámaras. ##p<0.01 en relación con el grupo respectivo. ###p<0.001 en relación con el grupo respectivo. * p<0.05 en relación con el grupo de vehículo.

Figura 14: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones BTBR en la prueba de intrusión forzada.

Figura 15: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones BTBR en la prueba de enterramiento de canicas. * p<0.05 en relación con el grupo de vehículo determinado por comparaciones a priori.

Figura 16: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones BTBR en la prueba de acicalamiento. * p<0.05 en relación con el grupo de vehículo. ** p<0.01 en relación con el grupo de vehículo, como se revela por las comparaciones a priori.

Figura 17: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones BTBR en la prueba del laberinto elevado en cruz.

Figura 18: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones BTBR en campo abierto. * p<0.05 en relación con el grupo de vehículo.

Figura 19: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones BTBR en la prueba de nado forzado.

Figura 20: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones BTBR en la prueba de olfateo de orina femenina.

#p<0.05 en relación con el grupo de vehículo en agua. ** p<0.01 en relación con el grupo de vehículo.

Figura 21: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones BTBR en la nueva prueba de reconocimiento de objetos

Figura 22: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre la permeabilidad gastrointestinal ex vivo en ratones BTBR.

Figura 23: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre la permeabilidad gastrointestinal in vivo en ratones BTBR.

Figura 24: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre la motilidad gastrointestinal in vivo en ratones BTBR. * p<0.05 en relación con el grupo de vehículo, como se revela por las comparaciones a priori.

Figura 25: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre los niveles plasmáticos de corticosterona inducidos por estrés en ratones BTBR.

Figura 26: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre el peso de los órganos y la longitud del colon en ratones BTBR.

Figura 27 Efecto del tratamiento con MRX006 sobre el peso de los ratones BTBR a lo largo del tiempo.

Figura 28: El tratamiento crónico con Mrx006 disminuyó el número de canicas enterradas en un modelo de ratones MIA. #p<0.05 en relación con el grupo de control; ** p<0.01 en relación con el grupo MIA de vehículo.

Figura 29: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la sociabilidad en ratones MIA en la prueba de transmisión social de preferencia alimenticia.

Figura 30: El tratamiento crónico con MRX006 atenúa la actividad locomotora inducida por estrés provocada por la exposición al campo abierto en ratones MIA. ##p<0.01 en relación con el grupo de control, * p<0.05 en relación con el grupo MIA de vehículo.

Figura 31: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre el comportamiento de tipo depresivo en ratones MIA en la prueba de olfateo de orina femenina. &p<0.05 en relación con el grupo de agua respectivo.

Figura 32: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre la motilidad gastrointestinal in vivo en ratones MIA.

Figura 33: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre el peso de los órganos y la longitud del colon en ratones MIA. Figura 34: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre las concentraciones de citoquinas circulantes en ratones BTBR.

Figura 35: Efecto del tratamiento con MRX008 sobre ratones MIA en la prueba de enterramiento de canicas. ##p<0.01 en relación con el grupo de control.

Figura 36: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre ratones MIA en la prueba de transmisión social de preferencia alimenticia.

Figura 37: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre ratones MIA en la prueba de nado forzado.

Figura 38: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre la permeabilidad intestinal.

Figura 39: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre la motilidad intestinal. ##p<0.01 en relación con el grupo de control.

Figura 40: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre ratones BTBR en la prueba de transmisión social de preferencia alimenticia.

Figura 41: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre ratones BTBR en la prueba de intrusión forzada. Figura 42: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre ratones BTBR en la prueba de enterramiento de canicas.

Figura 43: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre ratones BTBR en el laberinto elevado en cruz. Figura 44: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre ratones BTBR en campo abierto. *p<0.05 en relación con el grupo de vehículo, como se revela por las comparaciones por pares a priori.

Figura 45: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre ratones BTBR en la prueba de nado forzado.

Figura 46: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre el comportamiento de tipo depresivo en ratones BTBR en la prueba de olfateo de orina femenina. ##p<0.01 en relación con el grupo de vehículo en agua.

Figura 47: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre la motilidad intestinal in vivo en ratones BTBR. Figura 48: Efecto del tratamiento crónico con MRX008 sobre marcadores anatómicos selectivos en ratones BTBR. Figura 49: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión de oxitoxina, vasopresina y sus respectivos receptores en el hipotálamo de ratones BTBR. * p<0.05 en relación con el grupo de vehículo.

Figura 50: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión de oxitoxina, vasopresina y sus respectivos receptores en la amígdala de ratones BTBR. * p<0.05 en relación con el grupo de vehículo.

Figura 51: Efecto del tratamiento crónico con Blautia hydrogenotrophica y butirato sobre ratones BTBR en campo abierto. Los datos de las Figuras 51B, 51D, 51F y 51H son idénticos a los de las Figuras 51A, 51C, 51E y 51G, respectivamente, excepto que se han agrupado los números de control de PBS y LYO. p < 0.05: * frente a C57BL/6 (mismo tratamiento, en su caso); # frente a PBS mismo genotipo; § BTBR: But frente a PBS o Bact frente a Lyo.

PBS es el control negativo para la administración de butirato; LYO es el control negativo para la administración bacteriana (Blautia hydrogenotrophica); BUT es la administración experimental de butirato; BACT es la administración experimental de Blautia hydrogenotrophica.

Figura 52: Efecto del tratamiento crónico con Blautia hydrogenotrophica y butirato sobre ratones BTBR en la prueba de enterramiento de canicas. Los datos de la Figura 52B son idénticos a los de la Figura 52A, excepto que se han agrupado los números de control de PBS y LYO. p<0.05: * frente a C57BL/6 (mismo tratamiento, en su caso); # frente a PBS mismo genotipo; § BTBR: But frente a PBS o Bact frente a Lyo. PBS es el control negativo para la administración de butirato; LYO es el control negativo para la administración bacteriana (Blautia hydrogenotrophica); BUT es la administración experimental de butirato; BACT es la administración experimental de Blautia hydrogenotrophica.

Figura 53 : Efecto del tratamiento crónico con Blautia hydrogenotrophica y butirato sobre ratones BTBR en la prueba de excavación. La Figura 53A muestra el tiempo transcurrido excavando, mientras que la Figura 53B muestra el número de episodios de excavación. p < 0.05: * frente a C57BL/6 (mismo tratamiento, en su caso); # frente a PBS mismo genotipo; § BTBR: But frente a PBS o Bact frente a Lyo. PBS es el control negativo para la administración de butirato; LYO es el control negativo para la administración bacteriana (Blautia hydrogenotrophica); BUT es la administración experimental de butirato; BACT es la administración experimental de Blautia hydrogenotrophica.

Figura 54 : Efecto del tratamiento crónico con Blautia hydrogenotrophica y butirato sobre ratones BTBR en la prueba de autoacicalamiento. La Figura 54A muestra el tiempo transcurrido en el acicalamiento; La Figura 54C muestra el número de episodios de acicalamiento y la Figura 54E muestra el tiempo transcurrido en el acicalamiento por episodio. Los datos de las Figuras 54B, 54D y 54F son idénticos a los de las Figuras 54A, 54C y 54E respectivamente, excepto que se han agrupado los números de control de PBS y LYO. p < 0.05: * frente a C57BL/6 (mismo tratamiento, en su caso); # frente a PBS mismo genotipo; § BTBR: But frente a PBS o Bact frente a Lyo. PBS es el control negativo para la administración de butirato; LYO es el control negativo para la administración bacteriana (Blautia hydrogenotrophica); BUT es la administración experimental de butirato; BACT es la administración experimental de Blautia hydrogenotrophica.

Figura 55: Efecto de Blautia hydrogenotrophica (1010/día durante 14 días) sobre la producción de ácidos grasos de cadena corta (RMN 1H) en el contenido cecal de ratas HIM sanas.

Figura 56: Evaluación qPCR de la población de B. hydrogenotrophica en muestras fecales de ratas IBS-HMA tratadas o no con una composición que comprende B. hydrogenotrophica (BlautiX) durante 28 días.

Figura 57: Concentraciones de ácidos grasos de cadena corta (SCFA) en muestras cecales de ratas IBS-HMA tratadas o no con B. hydrogenotrophica (Blautix) durante 28 días. La Figura 57A muestra la concentración de SCFA total. La Figura 57B muestra la concentración de ácido acético, ácido propiónico y ácido butírico.

Figura 58: Efecto del tratamiento crónico con Blautia hydrogenotrophica y butirato sobre ratones BTBR en la prueba de tres cámaras. La Figura 58A muestra el efecto de la administración sobre la sociabilidad (la preferencia por olfatear un objeto u otro ratón), mientras que la Figura 58B muestra la preferencia por la novedad social (es decir, olfatear un ratón nuevo frente a un ratón familiar). p < 0.05: frente a 50 %; * frente a C57BL/6 (mismo tratamiento, en su caso); # frente a PBS mismo genotipo; § BTBR: But frente a PBS o Bact frente a Lyo. PBS es el control negativo para la administración de butirato; LYO es el control negativo para la administración bacteriana (Blautia hydrogenotrophica); BUT es la administración experimental de butirato; BACT es la administración experimental de Blautia hydrogenotrophica.

Figura 59: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión de oxitoxina y receptor de oxitoxina en las estirpes celulares hipotalámicas.

Figura 60: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la permeabilidad gastrointestinal ex vivo y la expresión de uniones estrechas en el colon en un modelo de ratón BALBc.

Figura 61: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la permeabilidad gastrointestinal ex vivo y la expresión de uniones estrechas en el íleon en un modelo de ratón BALBc.

Figura 62: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la producción de ácidos grasos de cadena corta cecal en un modelo de ratón BALBc.

Figura 63: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión de citoquinas de esplenocitos en un modelo de ratón BALBc.

Figura 64: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre los niveles plasmáticos de aminoácidos en un modelo de ratón BALBc.

Figura 65: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre los niveles de neurotransmisores en el tronco encefálico en un modelo de ratón BALBc.

Figura 66: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión génica de receptores de neurotransmisores del hipocampo en un modelo de ratón BALBc.

Figura 67: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión génica de receptores de neurotransmisores amigdalares en un modelo de ratón BALBc.

Figura 68: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión génica de los receptores de neurotransmisores de la corteza prefrontal en el modelo de ratón BALBc.

Figura 69: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión génica de marcadores inflamatorios en el hipocampo en un modelo de ratón BALBc.

Figura 70: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión génica de marcadores inflamatorios en la amígdala en un modelo de ratón BALBc.

Figura 71: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión génica de marcadores inflamatorios en la corteza prefrontal en un modelo de ratón BALBc.

Figura 72: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión génica de marcadores endocrinos del hipocampo en un modelo de ratón BALBc.

Figura 73: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión génica de marcadores endocrinos amigdalares en un modelo de ratón BALBc.

Figura 74: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la expresión génica de marcadores endocrinos de la corteza prefrontal en un modelo de ratón BALBc.

Figura 75: Efecto del tratamiento crónico con MRX006 sobre la permeabilidad gastrointestinal in vivo en el colon y el íleon en un modelo de ratón MIA.

Figura 76: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre la novedad social en la prueba de interacción social de tres cámaras en ratones MIA.

Figura 77: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre la preferencia social en la prueba de interacción social de tres cámaras en ratones MIA.

Figura 78: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones MIA en la prueba de acicalamiento.

Figura 79: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones MIA en la prueba del laberinto elevado en cruz. Figura 80: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre ratones MIA en la prueba de nado forzado.

Figura 81: Efecto del tratamiento con MRX006 sobre los niveles plasmáticos de corticosterona inducidos por estrés en ratones MIA.

Divulgación de la invención

Cepas bacterianas

Las composiciones de la invención comprenden una cepa bacteriana del género Blautia. Los ejemplos demuestran que las bacterias de esta especie son útiles para tratar o prevenir trastornos del espectro autista y trastornos del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro. Los experimentos con modelos de ratón utilizados en esta solicitud para la evaluación de los síntomas de trastornos del espectro autista se conocen en la técnica por ser aplicables para la evaluación de los síntomas de otros trastornos del sistema nervioso central que incluyen aquellos listados anteriormente

La invención proporciona una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia para uso en terapia, por ejemplo, para uso en tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central, en particular un trastorno o afección del sistema nervioso central mediado por el eje microbiota-intestino-cerebro. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden cepas del género Blautia y no contienen ningún otro género bacteriano. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una única cepa del género Blautia y no contienen ninguna de otras cepas, géneros o especies bacterianas.

Ejemplos de cepas de Blautia para uso en la invención incluyen Blautia stercoris, B. faecis, B. coccoides, B. glucerasea, B. hansenii, B. hydrogenotrophica, B. luti, B. producta, B. schinkii y B. wexlerae. Las especies preferidas son Blautia stercoris, B. wexlerae y B. hydrogenotrophica. Las especies de Blautia son bacterias Gram-positivas, no móviles que pueden ser cocoides u ovaladas y todas son anaerobias obligadas que producen ácido acético como el principal producto final de la fermentación de la glucosa [xxvi]. La Blautia se puede aislar del intestino humano, aunque la B. producta se aisló de una muestra de septicemia. El número de acceso de GenBank para la secuencia del gen de ARNr 16s de la cepa GAM6-1T de Blautia stercoris es HM626177 (divulgada en el presente documento como la SEQ ID NO: 1). Una cepa de Blautia stercoris de ejemplo se describe en [xxvii]. La cepa tipo de Blautia wexlerae es WAL 14507 = ATCC BAA-1564 = DSM 19850 [xxviii]. El número de acceso de GenBank para la secuencia del gen de ARNr 16s de la cepa WAL 14507 T de Blautia wexlerae es EF036467 (divulgada en el presente documento como la SEQ ID NO: 3). Esta cepa Blautia wexlerae de ejemplo se describe en [xxviii].

La bacteria Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCnVIB 42381 se probó en los Ejemplos y también se denomina en el presente documento como MRX006 (cepa 830). Los términos “MRX006”, “MRx0006”, “Mrx006”, “Mrx0006” y cepa 830 se utilizan en el presente documento de manera intercambiable. Una secuencia de ARNr 16S para MRX006 (cepa 830) que se probó se proporciona en la SEQ ID NO: 2. MRX006 (Cepa 830) se depositó ante la autoridad de depósito internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB252ZS, Escocia) el 12 de marzo de 2015 como “Blautia stercoris 830” y se le asignó el número de acceso NCINM 42381. Posteriormente, GT Biologics Ltd. cambió su nombre a 4D Pharma Research Limited.

El genoma de MRX006 (cepa 830) comprende un cromosoma y un plásmido. Se proporciona una secuencia de cromosomas para MRX006 (cepa 830) en la SEQ ID NO: 5. Se proporciona una secuencia de plásmido para MRX006 (cepa 830) en la SEQ ID NO: 6. Estas secuencias se generaron utilizando la plataforma PacBio RS II.

La bacteria Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486 se probó en los Ejemplos y también se denomina en el presente documento cepa MRX008. Los términos “MRX008”, “MRx0008”, “Mrx008” y “Mrx0008” se utilizan indistintamente en el presente documento. Se proporciona una secuencia de ARNr 16S para la cepa MRX008 que se probó en la SEQ ID NO: 4. La cepa MRX008 se depositó ante la autoridad de depósito internacional NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) por 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB252ZS, Escocia) el 16 de noviembre de 2015 como “BlautialRuminococcus" y se le asignó el número de acceso NCINM 42486.

Una cepa preferida adicional de la invención es la bacteria Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294. Esta cepa se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen [Colección Alemana de Microorganismos] (Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemania) bajo el número de acceso DSM 14294 como “S5a33” el 10 de mayo de 2001. El depositante fue INRA Laboratoire de Microbiologie CR de Clermont-Ferrand/Theix 63122 Saint Genés Champanelle, Francia. La propiedad de los depósitos ha pasado a 4D Pharma Plc mediante cesión. 4D Pharma Plc ha autorizado, mediante un acuerdo, a 4D Pharma Research Limited a hacer referencia al material biológico depositado en la solicitud y ha dado su consentimiento irrevocable y sin reservas para que el material depositado se ponga a disposición del público. El depósito bajo el número de acceso DSM 14294 se publicó el 11 de mayo de 2000.

La bacteria Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294 se probó en los Ejemplos y es una cepa preferida de la invención.

También se espera que las cepas bacterianas estrechamente relacionadas con la cepa probada en los ejemplos sean efectivas para tratar o prevenir trastornos del espectro autista y trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia stercoris. Preferiblemente, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:1 o 2. Preferiblemente, la identidad de secuencia es con la SEQ ID NO:2. Preferiblemente, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO:2. En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia wexlerae. Preferiblemente, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:3 o 4. Preferiblemente, la identidad de secuencia es con la SEQ ID NO:4. Preferiblemente, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO:4.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un cromosoma con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5. En las realizaciones preferidas, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un cromosoma con al menos 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO:5 a en al menos 60 % (por ejemplo, al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) de la SEQ ID NO:5. Por ejemplo, la cepa bacteriana para uso en la invención puede tener un cromosoma con al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 en un 70 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un 80 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un 90 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un 100 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 en un 70 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un 80 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un 90 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un 100 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un 70 % de la SEQ ID NO: 5, o al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 en un 80 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un 90 % de la SEQ ID NO:5, o al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 en un 100 % de la SEQ ID NO:5.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un plásmido con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6. En las realizaciones preferidas, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un plásmido con al menos 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO:6 en un al menos 60 % (por ejemplo, al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %) de la SEQ ID NO:6. Por ejemplo, la cepa bacteriana para uso en la invención puede tener un plásmido con al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 70 % de la SEQ ⁱD NO:6, o al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 80 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 90 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 100 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 70 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 80 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 90 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 100 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 70 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 80 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 90 % de la SEQ ID NO:6, o al menos 98 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un 100 % de la SEQ ID NO:6.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un cromosoma con la identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5 y un plásmido con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6.

También se espera que las cepas bacterianas que son biotipos de la bacteria depositada bajo el número de acceso 42381 sean eficaces para tratar o prevenir el trastorno del espectro autista y trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiotaintestino-cerebro. También se espera que las cepas bacterianas que son biotipos de la bacteria depositada bajo el número de acceso 42486 sean eficaces para tratar o prevenir el trastorno del espectro autista y trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro. Un biotipo es una cepa estrechamente relacionada que tiene características fisiológicas y bioquímicas iguales o muy similares.

Las cepas que son biotipos de la bacteria depositada bajo el número de acceso NCINM 42381 o 42486 y que son adecuadas para uso en la invención se pueden identificar al secuenciar otras secuencias de nucleótidos para la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381 o 42486. Por ejemplo, sustancialmente se puede secuenciar todo el genoma y una cepa de biotipo para uso en la invención puede tener al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia en un al menos 80 % de su genoma completo (por ejemplo, en un al menos 85 %, 90 %, 95 % o 99 %, o a través de su genoma completo). Por ejemplo, en algunas realizaciones, una cepa de biotipo tiene al menos 98 % de identidad de secuencia en un al menos 98 % de su genoma o al menos 99 % de identidad de secuencia en un 99 % de su genoma. Otras secuencias adecuadas para uso en identificar las cepas de biotipos pueden incluir hsp60 o secuencias repetitivas tales como BOX, ERIC, (GTG)5, o REP o [xxix]. Las cepas de biotipo pueden tener secuencias con al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de la bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381 o 42486.

En algunas realizaciones, una cepa de biotipo tiene una secuencia con al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de la cepa MRX006 depositada como NCINM 42381 y comprende una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 % idéntica (por ejemplo, al menos 99.5 % o al menos 99.9 % idéntica) a la SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, una cepa de biotipo tiene una secuencia con al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de la cepa MRX006 depositada como NCIMB 42381 y tiene la secuencia de ARNr 16s de la SEQ ID NO:2.

En algunas realizaciones, una cepa de biotipo tiene una secuencia con al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de la cepa MRX008 depositada como NCINM 42486 y comprende una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 % idéntica (por ejemplo, al menos 99.5 % o al menos 99.9 % idéntica) a la SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, una cepa de biotipo tiene una secuencia con al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de la cepa MRX008 depositada como NCIMB 42486 y tiene la secuencia de ARNr 16s de la SEQ ID NO:4.

Alternativamente, las cepas que son biotipos de una bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381 o 42486 y que son adecuadas para uso en la invención se pueden identificar al utilizar el depósito bajo el número de acceso NCnVIB 42381 o el depósito bajo el número de acceso NCIMB 42486, y el análisis de fragmentos de restricción y/o análisis de PCR, por ejemplo, al utilizar polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados fluorescentes (FAFLP) y elementos de ADN repetitivos (rep)-PCR de señales distintivas, o perfiles de proteínas o secuenciación parcial de ADNr 16S o 23s. En realizaciones preferidas, dichas técnicas se pueden utilizar para identificar otras cepas de Blautia stercoris o Blautia wexlerae.

En ciertas realizaciones, las cepas que son biotipos de una bacteria depositada bajo el número de acceso NCnVIB 42381 o 42486 y que son adecuadas para uso en la invención son cepas que proporcionan el mismo patrón que una bacteria depositada bajo el número de acceso NCINM 42381 o 42486 cuando se analiza mediante análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), por ejemplo, cuando se utiliza la enzima de restricción Sau3AI (para métodos y orientación de ejemplo, véase, por ejemplo, [xxx]). Alternativamente, las cepas de biotipo se identifican como cepas que tienen los mismos patrones de fermentación de carbohidratos que una bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381 o 42486.

Otras cepas de Blautia stercoris que son útiles en las composiciones y métodos de la invención, tales como los biotipos de la bacteria depositados bajo el número de acceso NCINM 42381 o 42486, se pueden identificar utilizando cualquier método o estrategia apropiados, que incluyen los ensayos descritos en los ejemplos Por ejemplo, las cepas para utilizar en la invención se pueden identificar al cultivar en YCFA anaeróbico y/o administrar la bacteria a un modelo de ratón con trastorno del espectro autista y luego evaluar los niveles de citoquinas. En particular, las cepas bacterianas que tienen patrones de crecimiento, tipo metabólico y/o antígenos de superficie similares a la bacteria depositada bajo el número de acceso NCINM 42381 o 42486 pueden ser útiles en la invención. Una cepa útil tendrá una actividad inmunomoduladora comparable a la cepa NCIMB 42381 o 42486. En particular, una cepa de biotipo provocará efectos comparables sobre los modelos de trastorno del espectro autista a los efectos mostrados en los Ejemplos, que se pueden identificar al utilizar los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos.

Una cepa particularmente preferida de la invención es la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381. Esta es la cepa MRX006 de ejemplo probada en los ejemplos y mostrada por ser efectiva para tratar la enfermedad. Por lo tanto, la invención proporciona una célula, tal como una célula aislada, de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381, o un derivado de la misma. La invención también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCINM 42381, o un derivado de la misma. La invención también proporciona un cultivo biológicamente puro de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCINM 42381. La invención también proporciona una célula de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381, o un derivado de la misma, para uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas anteriormente.

Una cepa particularmente preferida de la invención es la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486. Esta es la cepa MRX008 de ejemplo probada en los ejemplos y mostrada por ser efectiva para tratar la enfermedad. Por lo tanto, la invención proporciona una célula, tal como una célula aislada, de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486, o un derivado de la misma. La invención también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCINM 42486, o un derivado de la misma. La invención también proporciona un cultivo biológicamente puro de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCINM 42486. La invención también proporciona una célula de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486, o un derivado de la misma, para uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas anteriormente.

Un derivado de la cepa depositada bajo el número de acceso NCnVIB 42381 o 42486 puede ser una cepa hija (progenie) o una cepa cultivada (subclonada) a partir de la original. Un derivado de la cepa depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381 o 42486 puede ser una cepa hija (progenie) o una cepa cultivada (subclonada) a partir de la original. Se puede modificar un derivado de una cepa de la invención, por ejemplo, al nivel genético, sin ablación de la actividad biológica. En particular, una cepa derivada de la invención es terapéuticamente activa. Una cepa derivada tendrá actividad inmunomoduladora comparable con la cepa NCnVIB 42381 o 42486 original. En particular, una cepa derivada provocará efectos comparables sobre los modelos de trastorno o afección del sistema nervioso central y efectos comparables en los niveles de citoquinas a los efectos mostrados en los Ejemplos, que se pueden identificar al utilizar los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Un derivado de la cepa NCIMB 42381 generalmente será un biotipo de la cepa NCnVIB 42381. Un derivado de la cepa NCnVIB 42486 generalmente será un biotipo de la cepa NCnVIB 42486.

Las referencias a las células de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCINM 42381 abarcan cualesquier células que tienen las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que las cepas depositadas bajo el número de acceso NCINM 42381, y dichas células son abarcadas por la invención. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la referencia a las células de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381 solo se refiere a la cepa MRX006 depositada bajo NCnVIB 42381 y no se refiere a una cepa bacteriana que no se depositó bajo NCIMB 42381. En algunas realizaciones, la referencia a las células de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCINM 42381 se refiere a células que tienen las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que las cepas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 42381, pero que no son la cepa depositada bajo NCnVIB 42381.

Las referencias a las células de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCINM 42486 abarcan cualesquier células que tienen las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que las cepas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 42486, y dichas células son abarcadas por la invención. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la referencia a las células de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486 solo se refiere a la cepa depositada bajo NCnVIB 42486 y no se refiere a una cepa bacteriana que no se depositó bajo NCIMB 42486. En algunas realizaciones, la referencia a las células de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCnVIB 42486 se refiere a células que tienen las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que las cepas depositadas bajo el número de acceso NCIMB 42486, pero que no son la cepa depositada bajo NCnVIB 42486.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un cromosoma con la identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, por ejemplo, como se describió anteriormente, y una secuencia de ARNr 16s con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, 2, 3 o 4, por ejemplo, como se describió anteriormente, preferiblemente con una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o 4, más preferiblemente que comprende la secuencia de ARNr 16s de la SEQ ID NO:2 o 4.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un cromosoma con la identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, por ejemplo, como se describió anteriormente, y es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un cromosoma con la identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, por ejemplo, como se describió anteriormente, y una secuencia de ARNr 16s con identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4, por ejemplo, como se describió anteriormente, y es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 2 o 4 (por ejemplo, que comprende la secuencia de ARNr 16s de la SEQ ID NO:2 o 4) y un cromosoma con al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un al menos 90 % de la SEQ ID NO:5, y que es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención es una Blautia stercoris y tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 2 o 4 (por ejemplo, que comprende la secuencia de ARNr 16s de la SEQ ID NO:2 o 4) y un cromosoma con al menos 98 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 99 % o al menos 99.5 % de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO:5 en un al menos 98 % (por ejemplo, en un al menos 99 % o al menos 99.5 %) de la SEQ ID NO: 5, y que es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un plásmido con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, por ejemplo, como se describió anteriormente, y una secuencia de ARNr 16s con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:1, 2, 3 o 4, por ejemplo, como se describió anteriormente, preferiblemente con una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o 4, más preferiblemente que comprende la secuencia de ARNr 16s de la SEQ ID NO:2 o 4.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un plásmido con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, por ejemplo, como se describió anteriormente, y es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un plásmido con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, por ejemplo, como se describió anteriormente, y una secuencia de ARNr 16s con identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1,2, 3 o 4, por ejemplo, como se describió anteriormente, y es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 2 o 4 (por ejemplo, que comprende la secuencia de ARNr 16s de la SEQ ID NO:2 o 4) y un plásmido con al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un al menos 90 % de la SEQ ID NO:6, y que es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención es una Blautia stercoris y tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 2 o 4 (por ejemplo, que comprende la secuencia de ARNr 16s de la SEQ ID NO:2 o 4) y un plásmido con al menos 98 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 99 % o al menos 99.5 % de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO:6 en un al menos 98 % (por ejemplo, en un al menos 99 % o al menos 99.5 %) de la SEQ ID NO:6, y que es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un cromosoma con la identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, por ejemplo, como se describió anteriormente, un plásmido con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, por ejemplo, como se describió anteriormente, y una secuencia deARNr 16s con identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, por ejemplo, como se describió anteriormente, preferiblemente con una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 o 4, más preferiblemente que comprende la secuencia deARNr 16s de la SEQ ID NO:2 o 4.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un cromosoma con la identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, por ejemplo, como se describió anteriormente, y un plásmido con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, por ejemplo, como se describió anteriormente, y es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene un cromosoma con la identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5, por ejemplo, como se describió anteriormente, un plásmido con identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6, por ejemplo, como se describió anteriormente, y una secuencia deARNr 16s con identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4, por ejemplo, como se describió anteriormente, y es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una secuencia deARNr 16s que es al menos 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia deARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 2 o 4 (por ejemplo, que comprende la secuencia deARNr 16s de la SEQ ID NO:2 o 4), un cromosoma con al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:5 en un al menos 90 % de la SEQ ID NO:5, y un plásmido al menos 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:6 en un al menos 90 % de la SEQ ID NO:6, y que es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención es una Blautia stercoris y tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia deARNr 16s representada por la SEQ ID NO: 2 o 4 (por ejemplo, que comprende la secuencia deARNr 16s de la SEQ ID NO:2 o 4), un cromosoma con al menos 98 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 99 % o al menos 99.5 % de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO:5 en un al menos 98 % (por ejemplo, en un al menos 99 % o al menos 99.5 %) de la SEQ ID NO:5, y un plásmido con al menos 98 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 99 % o al menos 99.5 % de identidad de secuencia) con la SEQ ID NO:6 en un al menos 98 % (por ejemplo, en un al menos 99 % o al menos 99.5 %) de la SEQ ID NO:6, y que es efectiva para tratar o prevenir trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro.

En las realizaciones preferidas, las cepas bacterianas en las composiciones de la invención son viables y capaces de colonizar parcial o totalmente el intestino.

Se ha aislado Blautia hydrogenotrophica (anteriormente conocida como Ruminococcus hydrogenotrophicus) de los intestinos de los mamíferos, es estrictamente anaeróbica y metaboliza H₂/CO₂ a acetato, que puede ser importante para la nutrición y salud humanas. La cepa tipo de Blautia hydrogenotrophica es S5a33 = JCM 14656. El número de acceso de GenBank para la secuencia del gen de ARNr 16s de la cepa S5a36 de Blautia hydrogenotrophica es X95624.1 (divulgada en el presente documento como la SEQ ID NO: 7). Esta cepa de Blautia hydrogenotrophica de ejemplo se describe en [28] y [xxxi]. La cepa S5a33 y la cepa S5a36 corresponden a dos subclones de una cepa aislada de una muestra fecal de un sujeto sano. Muestran morfología, fisiología y metabolismo idénticos y tienen secuencias deARNr 16S idénticas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la Blautia hydrogenotrophica para uso en la invención tiene la secuencia deARNr 16S de SEQ ID NO: 7.

En ciertas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una secuencia deARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia deARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia hydrogenotrophica. Preferiblemente, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:7. Preferiblemente, la cepa bacteriana para uso en la invención tiene la secuencia deARNr 16s representada por la SEQ ID NO:7.

También se espera que las cepas bacterianas que son biotipos de la bacteria depositada bajo el número de acceso DSM 14294 sean eficaces para tratar o prevenir el trastorno del espectro autista y trastornos y afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos y afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiotaintestino-cerebro.

Las cepas que son biotipos de la bacteria depositada bajo el número de acceso DSM 14294 y que son adecuadas para uso en la invención se pueden identificar al secuenciar otras secuencias de nucleótidos para la bacteria depositada bajo el número de acceso DSM 14294. Por ejemplo, sustancialmente se puede secuenciartodo el genoma y una cepa de biotipo para uso en la invención puede tener al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia en un al menos 80 % de su genoma completo (por ejemplo, en un al menos 85 %, 90 %, 95 % o 99 %, o a través de su genoma completo). Por ejemplo, en algunas realizaciones, una cepa de biotipo tiene al menos 98 % de identidad de secuencia en un al menos 98 % de su genoma o al menos 99 % de identidad de secuencia en un 99 % de su genoma. Otras secuencias adecuadas para uso en identificar la cepas de biotipo pueden incluir hsp60 o secuencias repetitivas tales como BOX, ERIC, (GTG)5, o REP o [29]. Las cepas de biotipo pueden tener secuencias con al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de la bacteria depositada bajo el número de acceso DSM 14294.

En algunas realizaciones, una cepa de biotipo tiene una secuencia con al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de la cepa depositada como número de acceso DSM 14294 y comprende una secuencia de ARNr 16s que es al menos 99 % idéntica (por ejemplo, al menos 99.5 % o al menos 99.9 % idéntica) a la SEQ ID NO:7. En algunas realizaciones, una cepa de biotipo tiene una secuencia con al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente de la cepa depositada como número de acceso DSM 14294 y tiene la secuencia de ARNr 16s de la SEQ ID NO:7.

Alternativamente, las cepas que son biotipos de una bacteria depositada bajo el número de acceso DSM 14294 y que son adecuadas para uso en la invención se pueden identificar al utilizar el depósito bajo el número de acceso DSM 14294 y el análisis de fragmentos de restricción y/o análisis PCR, para por ejemplo, al utilizar el polimorfismo de longitud de fragmento amplificado fluorescente (FAFLP) y (rep)-PCR de señales distintivas de elementos de ADN repetitivos, o perfiles de proteínas o secuenciación parcial de ADNr 16S o 23s. En realizaciones preferidas, dichas técnicas se pueden utilizar para identificar otras cepas de Blautia hydrogenotrophica.

En determinadas realizaciones, las cepas que son biotipos de una bacteria depositada bajo el número de acceso NCnVIB 42381 o 42486 y que son adecuadas para uso en la invención son cepas que proporcionan el mismo patrón que una bacteria depositada bajo el número de acceso DSM 14294 cuando se analizan mediante análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), por ejemplo, cuando se utiliza la enzima de restricción Sau3AI (para orientación y métodos de ejemplo, véase, por ejemplo, [30]). Alternativamente, las cepas de biotipo se identifican como cepas que tienen los mismos patrones de fermentación de carbohidratos que una bacteria depositada bajo el número de acceso DSM 14294.

Otras cepas de Blautia hydrogenotrophica que son útiles en las composiciones y métodos de la invención, tales como los biotipos de la bacteria depositados bajo el número de acceso DSM 14294, se pueden identificar utilizando cualquier método o estrategia apropiados, que incluyen los ensayos descritos en los ejemplos. Por ejemplo, las cepas para uso en la invención se pueden identificar al cultivar en YCF^a anaeróbico y/o administrar la bacteria a un modelo de ratón con trastorno del espectro autista y luego evaluar los niveles de citoquinas. En particular, las cepas bacterianas que tienen patrones de crecimiento, tipo metabólico y/o antígenos de superficie similares a la bacteria depositada bajo el número de acceso DSM 14294 pueden ser útiles en la invención. Una cepa útil tendrá una actividad inmunomoduladora comparable a la cepa del número de acceso DSM 14294. En particular, una cepa de biotipo provocará efectos comparables en los modelos de trastorno del espectro autista para los efectos mostrados en los Ejemplos, que se pueden identificar al utilizar los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos.

Una cepa particularmente preferida de la invención es la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294. Esta es la cepa de ejemplo probada en los ejemplos y mostrada por ser efectiva para tratar la enfermedad. Por lo tanto, la invención proporciona una célula, tal como una célula aislada, de la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294, o un derivado de la misma. La invención también proporciona una composición que comprende una célula de la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294, o un derivado de la misma. La invención también proporciona un cultivo biológicamente puro de la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294. La invención también proporciona una célula de la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294, o un derivado de la misma, para uso en terapia, en particular para las enfermedades descritas anteriormente.

Un derivado de la cepa depositada bajo el número de acceso DSM 14294 puede ser una cepa hija (progenie) o una cepa cultivada (subclonada) a partir de la original. Un derivado de la cepa depositada bajo el número de acceso DSM 14294 puede ser una cepa hija (progenie) o una cepa cultivada (subclonada) a partir de la original. Se puede modificar un derivado de una cepa de la invención, por ejemplo, al nivel genético, sin ablación de la actividad biológica. En particular, una cepa derivada de la invención es terapéuticamente activa. Una cepa derivada tendrá actividad inmunomoduladora comparable a la cepa original depositada bajo el número de acceso DSM 14294. En particular, una cepa derivada provocará efectos comparables sobre los modelos de trastorno o afección del sistema nervioso central y efectos comparables en los niveles de citoquinas a los efectos mostrados en los Ejemplos, que se pueden identificar al utilizar los protocolos de cultivo y administración descritos en los Ejemplos. Un derivado de la cepa DSM 14294 generalmente será un biotipo de la cepa DSM 14294.

Las referencias a las células de la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294 abarcan cualesquier células que tienen las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que las cepas depositadas bajo el número de acceso DSM 14294, y dichas células son abarcadas por la invención. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la referencia a las células de la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294 solo se refiere a la cepa depositada bajo DSM 14294 y no se refiere a una cepa bacteriana que no se depositó bajo DSM 14294. En algunas realizaciones, la referencia a las células de la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada bajo el número de acceso DSM 14294 se refiere a células que tienen las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que las cepas depositadas bajo el número de acceso DSM 14294, pero que no son la cepa depositada bajo DSM 14294.

En las realizaciones preferidas, las cepas bacterianas in las composiciones de la invención son viables y capaces de colonizar parcial o totalmente el intestino.

Usos terapéuticos

Modulación del eje microbiota-intestino-cerebro

La comunicación entre el intestino y el cerebro (el eje microbiota-intestino-cerebro) se produce a través de un sistema de comunicación neurohumoral bidireccional. La evidencia reciente muestra que la microbiota que reside en el intestino puede modular el desarrollo del cerebro y producir fenotipos de comportamiento a través del eje microbiota-intestinocerebro. De hecho, una serie de revisiones sugieren una función del eje microbiota-intestino-cerebro en el mantenimiento de la funcionalidad del sistema nervioso central e implican la disfunción del eje microbiota-intestinocerebro en el desarrollo de trastornos y afecciones del sistema nervioso central [x],[xiii ],[xiv],[xxxii].

La comunicación bidireccional entre el cerebro y el intestino (es decir, el eje intestino-cerebro) incluye el sistema nervioso central, los sistemas neuroendocrino y neuroinmunitario, que incluyen el eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal (HPA), los brazos simpático y parasimpático del sistema nervioso autónomo (ANS), que incluyen el sistema nervioso entérico (ENS) y el nervio vago, y la microbiota intestinal.

Como se demuestra en los ejemplos, las composiciones de la presente invención pueden modular el eje microbiotaintestino-cerebro y reducir los síntomas de comportamiento asociados con un trastorno del CNS. De acuerdo con lo anterior, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir trastornos del sistema nervioso central (CNS), en particular aquellos trastornos y afecciones asociados con la disfunción del eje microbiota-intestinocerebro.

Las composiciones también pueden ser útiles para tratar o prevenir los trastornos del neurodesarrollo y/o afecciones neuropsiquiátricas. Las enfermedades del neurodesarrollo y afecciones neuropsiquiátricas a menudo se asocian con el eje microbiota-intestino-cerebro. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir enfermedades del neurodesarrollo y/o afecciones neuropsiquiátricas mediadas por la disfunción del eje microbiotaintestino-cerebro. En realizaciones preferidas adicionales, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir un trastorno del neurodesarrollo o una afección neuropsiquiátrica.

En realizaciones particulares, las composiciones de la invención pueden ser útiles para tratar o prevenir una enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en: trastornos del espectro autista (ASD); trastorno obsesivo compulsivo (OCD); trastorno depresivo mayor; depresión; trastorno afectivo estacional; trastornos de ansiedad; trastorno bipolar; psicosis; trastorno del estado de ánimo; y/o trastorno de estrés postraumático

Las composiciones de la invención pueden ser particularmente útiles para tratar o prevenir enfermedades crónicas, tratar o prevenir enfermedades en pacientes que no han respondido a otras terapias (tales como el tratamiento con antipsicóticos y/o antidepresivos), y/ o tratar o prevenir el daño tisular y los síntomas asociados con la disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el CNS. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el sistema nervioso autónomo (ANS). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el sistema nervioso entérico (ENS). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el eje hipotalámico, pituitario, suprarrenal (HPA). En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la ruta neuroendocrina. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la ruta neuroinmunitaria. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el CNS, el ANS, el ENS, el eje HPA y/o las rutas neuroendocrina y neuroinmunitarias. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de metabolitos comensales y/o la permeabilidad gastrointestinal de un sujeto.

La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro se modula por los sistemas neurales. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en los sistemas neurales. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización del sistema nervioso central. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en las neuronas sensoriales. En otras realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en las neuronas motoras. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en el ANS. En algunas realizaciones, el ANS es el sistema nervioso parasimpático. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan la señalización del nervio vago. En otras realizaciones, el ANS es el sistema nervioso. En otras realizaciones, las composiciones de la invención modulan la señalización en el sistema nervioso entérico. En ciertas realizaciones, la señalización de las neuronas del ANS y ENS responde directamente al contenido luminal del tracto gastrointestinal. En otras realizaciones, la señalización de las neuronas del ANS y ENS responde indirectamente a los neuroquímicos producidos por las bacterias luminales. En otras realizaciones, la señalización de las neuronas de ANS y ENS responde a neuroquímicos producidos por bacterias luminales o células enteroendocrinas. En ciertas realizaciones preferidas, las neuronas del ENS activan aferentes vagales que influyen en las funciones del CNS. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención regulan la actividad de las células de enterocromafines.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el condicionamiento del miedo en un modelo animal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se pueden utilizar para modular el desarrollo del miedo y/o la ansiedad, y/o modular la medida en que el miedo y/o la ansiedad se extinguen en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se pueden utilizar para modular el grado de hipertermia inducida por estrés en un modelo animal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el nivel de estrés y/o ansiedad en un sujeto.

Trastorno del espectro autista (ASP)

El trastorno del espectro autista es un conjunto de afecciones del neurodesarrollo heterogéneas, caracterizadas por dificultades de inicio temprano en la interacción social, comunicación y comportamiento e intereses inusualmente restringidos y repetitivos. Los síntomas se pueden reconocer desde una edad muy temprana, pero el ASD a menudo se diagnostica en niños más capaces que comienzan la educación general. El autismo representa el tipo primario de ASD.

Históricamente, el autismo se ha diagnosticado sobre la base de tres dominios centrales: interacción social deteriorada, comunicación anormal y comportamientos e intereses restringidos y repetitivos. En la Clasificación Internacional de Enfermedades (ICD-10R, OMS 1993) y el Manual Diagnóstico y Estadístico (DSM-IV, Asociación Americana de Psiquiatría, 2000), el autismo se encuentra bajo el término general de Trastorno Generalizado del Desarrollo (PDD), con cuatro subtipos diagnósticos posibles: Síndrome de Asperger, Autismo Infantil/Trastorno Autista, Autismo Atípico y PDD no especificado de otra manera. En DMS-5, estos subtipos de diagnóstico se combinan en una sola categoría de trastorno del espectro autista (ASD) y el uso anterior de tres dominios centrales de deterioro se ha reducido a dos áreas principales, a saber, la comunicación e interacción social, y el comportamiento repetitivo, que incluyen disfunciones de integración sensorial.

El ASD es un “trastorno de espectro” ya que afecta a cada persona en una variedad de formas diferentes y puede variar de muy leve a grave. El funcionamiento del individuo afectado varía sustancialmente dependiendo de las habilidades lingüísticas, nivel de inteligencia, comorbilidad, composición de los síntomas y el acceso a los servicios. El funcionamiento cognitivo, aprendizaje, atención y procesamiento sensorial suelen verse deteriorados.

El DSM-IV establece que el diagnóstico de autismo requiere la presencia de al menos seis síntomas, que incluyen un mínimo de dos medidas de deterioro cualitativo en la interacción social, un síntoma de deterioro cualitativo en la comunicación y un síntoma de comportamiento restringido y repetitivo. El DMS-5 redefine el diagnóstico de ASD en dos dominios de síntomas: (i) déficits de interacción social y comunicación social; y (ii) patrones de comportamiento, intereses o actividades restringidos y repetitivos.

Las afecciones médicas comórbidas son muy prevalentes en los ASD. Las comorbilidades incluyen ansiedad y depresión, convulsiones, déficit de atención, comportamientos agresivos, problemas para dormir, trastornos gastrointestinales, epilepsia, retardo mental, discapacidad intelectual y dificultades de alimentación.

Los ejemplos demuestran que las composiciones de la invención logran una reducción en la incidencia de la enfermedad y la gravedad de la enfermedad en un modelo animal de trastorno del espectro autista y, por lo tanto, pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de trastornos del espectro autista.

El ASD es un trastorno del sistema nervioso central que se desencadena parcialmente por factores ambientales. Por lo tanto, la disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro puede ser responsable del desarrollo y la persistencia de los ASD. De acuerdo con lo anterior, en las realizaciones preferidas, la composición de la invención es para uso en tratar o prevenir trastornos del espectro autista. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir el autismo. En algunas realizaciones, el autismo es un Trastorno Generalizado del Desarrollo (PDD). En otra realización, el PDD es Síndrome de Asperger, Autismo Infantil/Trastorno Autista, Autismo Atípico y/o PDD, no especificado de otra manera. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir trastornos del espectro autista, autismo, trastorno generalizado del desarrollo; Síndrome de Asperger; Autismo Infantil/Trastorno Autista, Autismo Atípico y/o PDD, no especificado de otra manera.

Las composiciones de la invención pueden ser útiles para modular el eje microbiota-intestino-cerebro de un sujeto. De acuerdo con lo anterior, en las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para uso en prevenir un ASD en un paciente que ha sido identificado como en riesgo de un ASD, o que ha sido diagnosticado con un ASD en un estadio prenatal o de desarrollo temprano; en la infancia y/o en la edad adulta. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para prevenir el desarrollo de ASD.

Las composiciones de la invención pueden ser útiles para manejar o aliviar los ASD. El tratamiento o la prevención de los ASD se puede referir, por ejemplo, a un alivio de la gravedad de los síntomas o a una reducción de la frecuencia de las exacerbaciones o del rango de desencadenantes que son un problema para el paciente.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian al menos un síntoma central de los ASD.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian al menos uno de los dos dominios de síntomas de ASD clasificados en el DMS-5. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los déficits de interacción social y/o comunicación social. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian patrones de comportamiento, intereses o actividades restrictivos y repetitivos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los déficits de interacción social, comunicación social y/o patrones de comportamiento, intereses o actividades restrictivos y repetitivos.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el comportamiento repetitivo, comportamiento estereotipado, comportamiento compulsivo, comportamiento rutinario, comportamiento de monotonía y comportamiento restringido. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la conciencia social, el procesamiento de información social, la capacidad de comunicación social, la ansiedad/evitación social y las preocupaciones y rasgos autistas en un sujeto con ASD.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian síntomas adicionales asociados con los síntomas centrales de los ASD. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la irritabilidad (que incluye agresión, autolesiones deliberadas y rabietas), agitación, llanto, letargo, retraimiento social, comportamiento estereotipado, hiperactividad, incumplimiento, habla inapropiada, ansiedad, depresión y/o comportamiento sobrecontrolado o subcontrolado en un sujeto con ASD. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran el funcionamiento cognitivo, aprendizaje, atención y/o procesamiento sensorial en un sujeto con ASD.

En otras realizaciones, las composiciones de la invención mejoran las medidas de resultado secundarias en un sujeto con ASD. En algunas realizaciones, las medidas de resultado secundarias incluyen síntomas adicionales y/o escalas de calificación funcional, escalas de comportamiento y medidas de interés diversas.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención provocan un cambio positivo en la escala diagnóstica y/o sintomática para la evaluación de los síntomas centrales de un sujeto con ASD. En algunas realizaciones, la escala diagnóstica y/o sintomática es la Entrevista Diagnóstica de Autismo - Revisada (ASI-R). En algunas realizaciones, la escala de diagnóstico o sintomática es el Programa de Observación de Diagnóstico de Autismo - Genérico (ADOS-G) ahora ADOS-2. En otras realizaciones, la escala diagnóstica o sintomática es la Entrevista de Diagnóstico de Autismo Revisada (ADI-R). En otras realizaciones, la escala diagnóstica o sintomática es la Entrevista Diagnóstica para Trastornos Sociales y de la Comunicación (DISCO). En aún otras realizaciones, la escala diagnóstica o sintomática es la Escala de Valoración del Autismo Infantil (CARS y CARS2).

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención provocan un cambio positivo en las medidas genéricas de los criterios de valoración de la eficacia de los ASD. En ciertas realizaciones, las medidas genéricas incluyen, pero no se limitan a, la Lista de Verificación de Comportamiento Aberrante (ABC), la Lista de Verificación de Comportamiento Infantil (CBCL), las Escalas de Comportamiento Adaptativo Vineland-II (VABS), la Escala de Respuesta Social (SRS), y/o la Escala de Comportamiento Repetitivo - Revisada (RBS-R).

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la escala de Impresión Clínica Global - Mejora Global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención muestran un efecto positivo sobre el funcionamiento global del sujeto con ASD.

El experto en la técnica conocerá escalas adicionales. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejorarían el resultado de escalas diagnósticas y/o sintomáticas conocidas por el experto en la técnica.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la incidencia de comorbilidades de ASD. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la incidencia de ansiedad y depresión, convulsiones, déficit de atención, comportamientos agresivos, problemas para dormir, trastornos gastrointestinales (que incluyen el síndrome del intestino irritable (IBS)), epilepsia, retardo mental, discapacidades intelectuales y/o dificultades de alimentación. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian comorbilidades gastrointestinales, tales como dolor abdominal, diarrea y flatulencia.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los síntomas de ciertos trastornos psiquiátricos y del comportamiento que pueden presentarse clínicamente con similitudes con el autismo. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el trastorno por déficit de atención (ADHD); trastornos afectivos/de ansiedad; trastornos del apego; trastorno negativista desafiante (ODD); trastorno obsesivo compulsivo (OCD) y/o psicosis, que incluyen la esquizofrenia (deterioro cognitivo).

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son particularmente eficaces para prevenir, reducir o aliviar los ASD cuando se utilizan en combinación con otra terapia para tratar los ASD. Dichas terapias incluyen fármacos antipsicóticos, ansiolíticos y antidepresivos. Dichos fármacos incluyen risperidona (Risperdal®); olanzapina (Zyprexa®); fluoxetina (Prozac®); sertralina (Zoloft®); fluvoxamina (Luvox®); clomipramina (Anafranil®); haloperidol (Haldol®); tioridazina; flufenazina; clorpromazina; ziprasidona (Geogon®); carbamazepina (Tegretol®); lamotrigina (Lamictal®); topiramato (Topomax®); ácido valproico (Depakote®); metilfenidato (Ritalin®); diazepam (Valium®) y lorazepam (Ativan®).

Las Directrices de la EMA sobre el desarrollo clínico de medicamentos para el tratamiento del trastorno del espectro autista establecen que, debido a la heterogeneidad de las enfermedades, puede que no sea posible lograr un efecto significativo en todos los síntomas centrales con un solo compuesto y, por lo tanto, la eficacia a corto plazo se ha demostrado en al menos un síntoma central. Las cepas bioterapéuticas vivas utilizadas en los Ejemplos han mostrado un tratamiento eficaz de al menos un síntoma central del trastorno del espectro autista, por lo que se espera que estas cepas y las cepas Blautia relacionadas sean eficaces contra la enfermedad humana.

Trastorno obsesivo compulsivo (OCD)

El OCD es un trastorno heterogéneo, crónico e incapacitante que pertenece a los trastornos de ansiedad. De acuerdo con la definición del DSM-IV, las características esenciales del OCD son las obsesiones y/o compulsiones recurrentes (criterio A) que son severas y consumen mucho tiempo (más de una hora al día) o provocan una angustia marcada o interfieren significativamente con la rutina normal del sujeto, funcionamiento ocupacional, actividades o relaciones sociales habituales (criterio C). En algún momento del curso del trastorno, la persona ha reconocido que las obsesiones o compulsiones son excesivas o irrazonables (criterio B).

Las obsesiones se definen como pensamientos, impulsos o imágenes recurrentes y persistentes que se experimentan como intrusivos e inapropiados y que provocan una marcada ansiedad o angustia. Los pensamientos, impulsos o imágenes no son simplemente preocupaciones excesivas sobre problemas acerca de la vida real, sino que son reconocidos por el paciente como un producto de su propia mente (por ejemplo, miedo a la contaminación, obsesión por la simetría). La persona intenta ignorar, suprimir o neutralizar las obsesiones con otros pensamientos o acciones.

Las compulsiones se definen como comportamientos repetitivos (por ejemplo, lavarse las manos, ordenar, acumular, revisar) o actos mentales (por ejemplo, rezar, contar, repetir palabras en silencio) que la persona se siente impulsada a realizar en respuesta a una obsesión o de acuerdo con reglas que debe aplicarse rígidamente.

El OCD a menudo se asocia con tasas de comorbilidad de otras enfermedades psiquiátricas que incluyen trastorno depresivo mayor, otros trastornos de ansiedad (trastorno de ansiedad generalizada, trastorno de ansiedad social, trastorno de pánico), abuso de sustancias y trastornos alimenticios (anorexia y bulimia).

El OCD es un trastorno psiquiátrico que puede desarrollarse o persistir debido a una disfunción del eje microbiotaintestino-cerebro. De acuerdo con lo anterior, en las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir el OCD en un sujeto.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian las características sintomáticas esenciales del OCD. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian las obsesiones y/o compulsiones recurrentes en un sujeto. En ciertas realizaciones, las obsesiones son pensamientos, impulsos o imágenes recurrentes o persistentes que son experiencias intrusivas e inapropiadas y que provocan ansiedad o angustia marcadas. En ciertas realizaciones, las compulsiones son comportamientos repetitivos que el sujeto se siente impulsado a realizar en respuesta a una obsesión o de acuerdo con reglas que debe aplicar de forma rígida.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas del OCD en un sujeto de acuerdo con las escalas diagnósticas y/o sintomáticas Y-BOCS y/o NIMH-OC. En algunas realizaciones, la escala Y-BOCS se utiliza para monitorizar la mejora de los criterios de valoración primarios. En algunas realizaciones, la escala NIMH-OC se utiliza para monitorizar la mejora de los parámetros secundarios.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la escala de Impresión Clínica Global - Mejora Global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención muestran un efecto positivo sobre el funcionamiento social global (relaciones, trabajo, etc.) del sujeto con ASD. En algunas realizaciones, la escala global es la escala de discapacidad de Sheehan.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian al menos una comorbilidad del OCD. Las comorbilidades del OCD incluyen trastorno depresivo mayor, otros trastornos de ansiedad (trastorno de ansiedad generalizada, trastorno de ansiedad social, trastorno de pánico), abuso de sustancias y trastornos alimenticios (anorexia y bulimia), síndrome de Gilles de la Tourette, ADHD (trastorno por déficit de atención/hiperactividad) y trastornos del desarrollo.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son particularmente eficaces para prevenir, reducir o aliviar el OCD cuando se utilizan en combinación con otra terapia para tratar el OCD. Dichas terapias incluyen inhibidores de la recaptación de serotonina y dopamina; clomipramina y antipsicóticos.

Trastorno depresivo mayor (MDD)

El MDD está asociado con una disfunción psicosocial sustancial y una alta tensión mental individual, así como con un exceso de morbilidad y mortalidad (el riesgo de suicidio es considerable). El término trastorno depresivo mayor abarca depresión clínica, depresión mayor, depresión unipolar, trastorno unipolar, depresión recurrente y simplemente depresión. El término trastorno depresivo mayor abarca los trastornos del estado de ánimo; distimia; depresión crónica; Trastorno afectivo estacional y trastorno límite de la personalidad.

De acuerdo con los criterios DMS-5, los síntomas del MDD incluyen un estado de ánimo deprimido o pérdida de interés o placer en las actividades diarias durante más de dos semanas; y deterioro de la función social, ocupacional y educativa. Síntomas específicos, al menos cinco de los nueve siguientes, presentes casi todos los días: estado de ánimo deprimido o irritable la mayor parte del día; disminución del interés o placer en la mayoría de las actividades, la mayor parte de cada día; cambio significativo de peso o cambio en el apetito; cambio en el sueño (insomnio o hipersomnia); cambio en la actividad (agitación o retardo psicomotor); fatiga o pérdida de energía; culpa o inutilidad (sentimientos de inutilidad o culpa excesiva o inapropiada); concentración reducida (disminución de la capacidad para pensar o concentrarse, o más indecisión; y tendencias suicidas (pensamientos de muerte o suicidio, o el sujeto tiene un plan de suicidio). Además, el MDD se asocia con síntomas de ansiedad que incluyen inquietud irracional; preocupación con inquietudes desagradables; problemas para relajarse y/o sentirse tenso. Los eventos de MDD pueden ser leves, moderados o severos.

Los eventos de MDD a menudo se asocian con comorbilidad con otros trastornos psiquiátricos o con trastornos somáticos como la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, trastornos cerebrovasculares, cáncer y síndromes de dolor crónico. El MDD se asocia con frecuencia con un amplio espectro de otros trastornos mentales como comorbilidades, que incluyen el trastorno de ansiedad generalizada; trastorno de ansiedad; trastornos por uso de sustancias; trastorno de estrés postraumático (PTSD); trastornos de personalidad; dolor; estrés; síndrome del intestino irritable; insomnio; dolores de cabeza y problemas interpersonales.

El trastorno depresivo mayor es un trastorno psiquiátrico que se puede desarrollar o persistir debido a la disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro. De acuerdo con lo anterior, en las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir MDD en un sujeto.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir eventos depresivos mayores agudos y/o la prevención de nuevos eventos (prevención de recurrencia). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de eventos del MDD leves, moderados o severos.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los síntomas del MDD como se clasifica según los criterios del DSM-5 enumerados en el presente documento. En una realización preferida, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian un estado de ánimo deprimido en un sujeto. En una realización preferida, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian una disminución del interés o placer en la mayoría de las actividades en un sujeto. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la aparición de síntomas del MDD dentro de un periodo de 2 semanas.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas del MDD de acuerdo con una escala sintomática o de diagnóstico. Dichas escalas para evaluar la mejoría sintomática incluyen la Escala de Calificación de Depresión de Hamilton (HAMD) y la Escala de Calificación de Depresión de Montgomery Asberg. Además, la Escala de Autoevaluación de Depresión de Zung (SDS) y la Escala de Ansiedad de Autoevaluación (SAS) de Zung también son escalas de mejora sintomática adecuadas.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la escala de Impresión Clínica Global - Mejora Global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención muestran un efecto positivo sobre el funcionamiento social y ocupacional global del sujeto con MDD.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir el MDD resistente al tratamiento.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian al menos una comorbilidad del MDD. Las comorbilidades del MDD incluyen el trastorno de ansiedad generalizada; trastorno de ansiedad; trastornos por uso de sustancias; trastorno de estrés postraumático (PTSD); Desorden de personalidad; dolor; estrés; IBS; insomnio; dolores de cabeza y problemas interpersonales.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son particularmente eficaces para prevenir, reducir o aliviar el MDD cuando se utilizan en combinación con otra terapia para tratar el MDD. Dichas terapias incluyen antidepresivos, estrategias de potenciación (por ejemplo, terapia de combinación, litio y otros estabilizadores del estado de ánimo, hormonas tiroideas y antipsicóticos atípicos) o incluso antipsicóticos de segunda generación.

Trastornos de ansiedad

Los trastornos de ansiedad son un grupo de trastornos mentales caracterizados por sentimientos de ansiedad y miedo. Se presenta una serie de trastornos de ansiedad que incluyen trastorno de ansiedad generalizada (GAD); fobia específica; trastorno de ansiedad social; trastorno de ansiedad por separación; agorafobia; trastorno de pánico y mutismo selectivo.

El GAD se diagnostica de acuerdo con el DMS-5 en seis criterios. El primer criterio es demasiada ansiedad o preocupación durante más de seis meses en los que la ansiedad o preocupación está presente la mayor parte del tiempo con respecto a muchas actividades. El segundo criterio es que el sujeto es incapaz de manejar los síntomas del primer criterio. El tercer criterio es que se presenten al menos tres (uno en niños) de los siguientes: inquietud; se cansa fácilmente; problemas para concentrarse; irritabilidad; tensión muscular y problemas con el sueño. Los últimos tres criterios son que los síntomas resulten en un deterioro social, ocupacional y funcional significativo; los síntomas no se deben a medicamentos, fármacos u otros problemas de salud física; y los síntomas no encajan mejor con otro problema psiquiátrico tal como el trastorno de pánico. Todos los demás trastornos de ansiedad se pueden considerar como diagnósticos diferenciales del GAD.

El GAD se asocia frecuentemente con un amplio espectro de otros trastornos mentales como comorbilidades que incluyen depresión; trastornos por uso de sustancias; estrés; IBS; insomnio; dolores de cabeza; dolor; eventos cardíacos; Problemas interpersonales y ADHD.

Los trastornos de ansiedad son trastornos psiquiátricos que se pueden desarrollar o persistir debido a una disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro. De acuerdo con lo anterior, en las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir trastornos de ansiedad en un sujeto. En ciertas realizaciones, el trastorno de ansiedad es trastorno de ansiedad generalizada (GAD); fobia específica; trastorno de ansiedad social; trastorno de ansiedad por separación; agorafobia; trastorno de pánico y mutismo selectivo.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los síntomas de GAD en un sujeto como se clasifica según los criterios del DSM-5 enumerados en el presente documento. De acuerdo con DMS-5, los mismos síntomas se asocian con otros trastornos de ansiedad. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los síntomas de trastornos de ansiedad en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la ansiedad o preocupación del sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la aparición de los síntomas dentro de un periodo de seis meses. En ciertas realizaciones, la composición de la invención evita, reduce o alivia la inquietud; fatiga; pérdida de concentración; irritabilidad; tensión muscular; y/o problemas con el sueño. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el deterioro social, laboral y funcional asociado con los trastornos de ansiedad.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas de los trastornos de ansiedad de acuerdo con una escala sintomática o diagnóstica. En ciertas realizaciones, la escala para evaluar la mejora sintomática incluye la Escala de Calificación de Ansiedad de Hamilton (HAM-A). En algunas realizaciones, la escala total HAM-A se utiliza para evaluar el criterio de valoración primario. En otras realizaciones, el factor de ansiedad psíquica HAM-A puede ser útil como criterio de valoración secundario.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la escala de Impresión Clínica Global - Mejora Global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención muestran un efecto positivo sobre el deterioro social, ocupacional y funcional global del sujeto con trastorno de ansiedad. En algunas realizaciones, la escala global es la escala de discapacidad de Sheehan.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian al menos una comorbilidad del GAD y trastornos de ansiedad. Las comorbilidades del GAD incluyen depresión; trastornos por uso de sustancias; estrés; IBS; insomnio; dolores de cabeza; dolor; eventos cardíacos; Problemas interpersonales y ADHD.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son particularmente eficaces en prevenir, reducir o aliviar los trastornos de ansiedad cuando se utilizan en combinación con otra terapia para tratar los trastornos de ansiedad. Dichas terapias incluyen inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (venlafaxina, duloxetina, escitalopram y paroxetina); benzodiacepinas (alprazolam, lorazepam y clonazepam); pregabalina (Lyrica®) y gabapentina (Neurontin®); agonistas parciales del receptor de serotonina (buspirona y tandospirona); antidepresivos serotoninérgicos atípicos (tales como imipramina y clomipramina); inhibidores de la monoaminooxidasa (MAOI) (tales como moclobemida y fenelzina); hidroxizina; propranolol; clonidina; guanfacina y prazosina.

Trastorno de estrés postraumático (PTSD)

El PTSD es un trastorno grave e incapacitante, una característica esencial del cual es la inclusión de un evento traumático como factor precipitante de este trastorno.

Los síntomas del PTSD se agrupan en cuatro grupos principales de acuerdo con los criterios DMS-V: (i) intrusión: los ejemplos incluyen pesadillas, pensamientos no deseados de los eventos traumáticos, flashbacks y reacciones a recordatorios traumáticos con angustia emocional o reactividad fisiológica; (ii) evitación: los ejemplos incluyen evitar desencadenantes de recuerdos traumáticos, que incluyen lugares, conversaciones u otros recordatorios; (iii) alteraciones negativas en las cogniciones y el estado de ánimo: los ejemplos incluyen culpa distorsionada de uno mismo o de otros por el evento traumático, creencias negativas sobre uno mismo o el mundo, emociones negativas persistentes (por ejemplo, miedo, culpa, vergüenza), sentirse alienado y afecto restringido (por ejemplo, incapacidad para experimentar emociones positivas); (iv) alteraciones en la excitación y la reactividad: los ejemplos incluyen comportamiento enojado, imprudente o autodestructivo, problemas de sueño, problemas de concentración, aumento de la respuesta de sobresalto e hipervigilancia.

Los síntomas que se resuelven dentro de las 4 semanas del evento traumático cumplen los criterios para un Trastorno de Estrés Agudo. El DSM distingue entre PTSD agudo (duración de los síntomas de menos de tres meses) y crónico (duración de los síntomas de más de 3 meses). Si los síntomas comienzan más de 6 meses después del factor estresante, el trastorno se define como PTSD de aparición tardía.

El PTSD conlleva altas comorbilidades con el trastorno depresivo mayor y trastornos por uso de sustancias.

El PTSD es un trastorno psiquiátrico que se puede desarrollar o persistir debido a una disfunción del eje microbiotaintestino-cerebro. De acuerdo con lo anterior, en las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir el PTSD en un sujeto. De acuerdo con una patogénesis similar, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir trastornos de estrés. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención tratan el trastorno de estrés agudo. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan el PTSD agudo y/o crónico. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención tratan el PTSD de inicio tardío.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los síntomas del PTSD (o trastorno de estrés) en un sujeto como se clasifica según los criterios del DSM-5 enumerados en el presente documento. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian pensamientos intrusivos en un sujeto con PTSD. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el comportamiento de evitación en un sujeto con PTSD. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian alteraciones negativas en cogniciones y estado de ánimo en un sujeto con PTSD. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen alteraciones en la excitación y reactividad en un sujeto con PTSD.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas del PTSD y trastornos de estrés de acuerdo con una escala sintomática o de diagnóstico. En ciertas realizaciones, la escala para evaluar la mejora sintomática es la escala PTSD Administrada Clínicamente (CAPS).

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la escala de Impresión Clínica Global - Mejora Global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención muestran un efecto positivo sobre el deterioro social, ocupacional y funcional global del sujeto con PTSD y trastornos de estrés. En algunas realizaciones, la escala global es la escala de discapacidad de Sheehan.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian al menos una comorbilidad de PTSD y trastornos de estrés. Las comorbilidades de PTSD y trastornos de estrés incluyen MDD, trastornos por uso de sustancias; estrés y ansiedad.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son particularmente eficaces para prevenir, reducir o aliviar el PTSD y los trastornos de estrés cuando se utilizan en combinación con otra terapia para tratar el PTSD y los trastornos de estrés. Dichas terapias incluyen agentes serotoninérgicos, antidepresivos tricíclicos, estabilizadores del estado de ánimo, agentes inhibidores adrenérgicos, antipsicóticos, benzodiazepinas, sertralina (Zoloft®), fluoxetina (Prozac®) y/o paroxetina (Paxil®).

Trastorno bipolar

El trastorno bipolar en general es una enfermedad crónica. La manía es el síntoma cardinal del trastorno bipolar. Existen varios tipos de trastorno bipolar según la duración específica y el patrón de los eventos maníacos y depresivos. En el DMS-5, se hace una distinción entre trastorno bipolar I, trastorno bipolar II, trastorno ciclotímico, trastorno bipolar de ciclo rápido y trastorno bipolar NOS.

De acuerdo con el DSM, la manía es un período distinto de estado de ánimo anormal y persistentemente elevado, expansivo o irritable. El evento debe durar una semana y el estado de ánimo debe tener al menos tres de los siguientes síntomas: alta autoestima; reducción de la necesidad de dormir; aumento de la velocidad del habla; salto rápido de ideas; distraído fácilmente; un mayor interés en las metas o actividades; agitación psicomotora; aumento de la realización de actividades con alto riesgo de peligro.

El trastorno bipolar I implica uno o más eventos maníacos o mixtos (manía y depresión) y al menos un evento depresivo mayor (véase anteriormente los síntomas de los eventos de MDD). El trastorno bipolar II tiene uno o más eventos depresivos mayores acompañados de al menos un evento hipomaníaco. No hay eventos maníacos o mixtos. La hipomanía es una forma menor de manía. Los síntomas son responsables de alteraciones sociales, ocupacionales y funcionales significativas. La ciclotimia se caracteriza por cambios depresivos de bajo nivel junto con períodos de hipomanía. Los síntomas deben estar presentes durante al menos dos años en adultos o un año en niños antes de que se pueda hacer un diagnóstico. Los períodos libres de síntomas en adultos y niños no duran más de dos meses o un mes, respectivamente. El trastorno bipolar de ciclo rápido es una forma grave de trastorno bipolar. Ocurre cuando una persona tiene al menos cuatro eventos de depresión mayor, manía, hipomanía o estados mixtos en un año. El trastorno bipolar no especificado (NOS) clasifica los síntomas bipolares que no encajan claramente en otros tipos. El NOS se diagnostica cuando hay múltiples síntomas bipolares, pero no los suficientes para cumplir con la etiqueta de cualquiera de los otros subtipos.

El trastorno bipolar está asociado con las siguientes comorbilidades: ADHD; trastornos de ansiedad; trastornos de sustancias; obesidad y síndrome metabólico.

El trastorno bipolar es un trastorno psiquiátrico que se puede desarrollar o persistir debido a una disfunción del eje microbiota-intestino-cerebro. Por lo tanto, en las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir trastorno bipolar en un sujeto. En ciertas realizaciones, el trastorno bipolar es trastorno bipolar I. En ciertas realizaciones, el trastorno bipolar es trastorno bipolar II. En ciertas realizaciones, el trastorno bipolar es trastorno ciclotímico. En ciertas realizaciones, el trastorno bipolar es un trastorno bipolar de ciclo rápido. En ciertas realizaciones, el trastorno bipolar es trastorno bipolar NOS.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los síntomas de trastorno bipolar en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de eventos maniacos en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de un estado de ánimo anormal y persistentemente elevado, expansivo o irritable. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los siguientes síntomas: alta autoestima; reducción de la necesidad de dormir; aumento de la velocidad del habla; salto rápido de ideas; distraído fácilmente; un mayor interés en las metas o actividades; agitación psicomotora; aumento de la realización de actividades con alto riesgo de peligro. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de uno o más eventos maníacos o mixtos en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen la aparición de al menos un evento depresivo mayor en un sujeto. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de al menos un evento depresivo mayor acompañado de al menos un evento hipomaníaco.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención tratan la fase aguda del trastorno bipolar y/o previenen la aparición de nuevos eventos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención tratan la fase aguda de los eventos maníacos/depresivos en un sujeto con trastorno bipolar y previenen la aparición de más eventos maníacos/depresivos.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran los síntomas del trastorno bipolar de acuerdo con una escala sintomática o de diagnóstico. En ciertas realizaciones, la escala para evaluar la mejora sintomática de los eventos maníacos es la Escala de Valoración del Estado Maníaco y la Escala de Valoración de la Manía Joven. En ciertas realizaciones, la escala es la Escala de Manía de Bech-Rafaelsen (BRMAS). En ciertas realizaciones, las escalas para evaluar la mejora sintomática del cambio de eventos maníacos a depresivos incluyen la Escala de Calificación de Depresión de Hamilton, la Escala de Calificación de Montgomery-Asberg y la Escala de Depresión de Bech-Rafaelsen.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención mejoran la escala de Impresión Clínica Global - Mejora Global (CGI-I) para evaluar trastornos psiquiátricos y neurológicos. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención muestran un efecto positivo sobre las deficiencias sociales, ocupacionales y funcionales globales del sujeto con trastorno bipolar.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian al menos una comorbilidad de trastorno bipolar. En ciertas realizaciones, la comorbilidad se selecciona de ADHD, trastornos de ansiedad, trastorno por sustancias, obesidad y síndrome metabólico.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención son para uso en tratar o prevenir enfermedad maníacodepresiva y el trastorno bipolar que no responde al litio y al divalproato.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención son particularmente eficaces para prevenir, reducir o aliviar el trastorno bipolar cuando se utilizan en combinación con otra terapia para tratar el trastorno bipolar. En ciertas realizaciones, dichas terapias incluyen carbonato de litio, fármacos anticonvulsivos (que incluyen valproato, divalproex, carbamazepina y lamotrigina) y fármacos antipsicóticos (que incluyen aripiprazol, olanzapina, quetiapina y risperidona).

Factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores y el eje microbiota-intestino-cerebro

Como se ha esbozado anteriormente, el eje microbiota-intestino-cerebro está modulado por varios sistemas fisiológicos diferentes. El eje microbiota-intestino-cerebro está modulado por una serie de moléculas de señalización. Las alteraciones en los niveles de estas moléculas de señalización dan como resultado defectos en el desarrollo y/o la funcionalidad del sistema nervioso central. De hecho, muchas de las moléculas divulgadas en esta sección se han implicado en la funcionalidad del eje microbiota-intestino-cerebro y en la patogenia de trastornos o afecciones del sistema nervioso central ([xiv], [xxxii], [x], [xxxiii]). Los experimentos realizados por los inventores indican que la administración de cepas de Blautia puede desencadenar cambios de comportamiento. Este efecto puede estar mediado por un efecto sobre los niveles de las moléculas de señalización, en particular las enumeradas en esta sección. Estas alteraciones pueden ser las responsables de los beneficios terapéuticos asociados a las cepas de Blautia. De acuerdo con lo anterior, debido al hecho de que los trastornos y afecciones del sistema nervioso central divulgados en el presente documento muestran una patogenia bioquímica y fisiológica fundamental similar (es decir, a través del eje microbiota-intestino-cerebro), también se puede lograr un beneficio terapéutico similar de las cepas de Blautia para estos trastornos y afecciones. La administración de Blautia stercoris puede ser particularmente eficaz para desencadenar cambios de comportamiento asociados con trastornos o afecciones del sistema nervioso central. En ciertas realizaciones, la administración de Blautia wexlerae puede ser particularmente eficaz para desencadenar cambios de comportamiento asociados con trastornos o afecciones del sistema nervioso central.

La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro se modula por los niveles de factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores. De acuerdo con lo anterior, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores. De acuerdo con lo anterior, en ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención alteran directamente la bioquímica del CNS. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan los niveles del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de monoaminas. En ciertas realizaciones, las monoaminas son serotonina (5-hidroxitriptamina (5-HT)), dopamina, norepinefrina y/o epinefrina. En ciertas realizaciones, las monoaminas son catecolaminas. En ciertas realizaciones, las catecolaminas son dopamina, norepinefrina y epinefrina. En ciertas realizaciones, las monoaminas son triptaminas. En ciertas realizaciones, las triptaminas son serotonina y melatonina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de acetilcolina.

En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan los niveles de oxitoxina. La oxitocina está asociada con fisiologías emocionales, sociales, cognitivas y neuroendocrinas, así como con la autorregulación. En particular, la liberación de oxitocina está involucrada en la ansiolisis; humor positivo; conducta materna, vínculo de pareja; comportamiento sexual; memoria social; memoria olfativa; efectos de anorexia; atenuación de la respuesta del eje HPA al estrés; autoexcitación durante el parto y la lactancia, así como otros procesos fisiológicos y psicológicos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan los niveles de oxitocina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen los niveles de oxitocina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan o disminuyen la señalización de oxitocina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de receptores de oxitocina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el flujo de iones de calcio dentro o fuera de las células neuronales, musculares y gastrointestinales. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención tratan y previenen enfermedades y trastornos del neurodesarrollo y neuropsiquiátricos asociados con el eje microbiota-intestino-cerebro mediante la modulación de los niveles de oxitocina.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de monoaminas y metabolitos de las mismas en el cerebro. En las realizaciones preferidas, la monoamina es serotonina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan las rutas serotoninérgica y/o quinurenina del metabolismo del triptófano. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de metabolitos de serotonina, tales como el ácido 5-Hidroxiindoleacético (5- HIAA). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de metabolitos de dopamina, tales como el ácido Homovanílico (HVA). La modulación de estos neurotransmisores y factores neuroquímicos es útil para tratar estrés, depresión y trastornos relacionados con la ansiedad.

La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por los niveles de ácido Y-aminobutírico (GABA). De acuerdo con lo anterior, en las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan los niveles de GABA. GABA es un neurotransmisor inhibidor que reduce la excitabilidad neuronal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan los niveles de GABA. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen los niveles de GABA. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención alteran la neurotransmisión GABAérgica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el nivel de transcripción de GABA en diferentes regiones del sistema nervioso central. En ciertas realizaciones, el GABA derivado de comensales cruza la barrera hematoencefálica y afecta directamente la neurotransmisión. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención conducen a una reducción de GABA en el hipocampo, la amígdala y/o el locus coeruleus. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención conducen a un aumento de GABA en las regiones corticales.

Los niveles de moléculas neuroactivas, tales como serotonina, melatonina, GABA, histaminas y acetilcolina, están ligadas a la fisiopatología de enfermedades del sistema nervioso central, tales como la demencia, enfermedad de Alzheimery enfermedad de Huntington.

La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por los niveles de histaminas. De acuerdo con lo anterior, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de histaminas. En ciertas realizaciones, las histaminas tienen un efecto inmunorregulador. En ciertas realizaciones, los niveles de histamina permiten la translocación de bacterias desde el lumen en la circulación sistémica. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención alteran la permeabilidad del tracto gastrointestinal y/o la función de barrera. En ciertas otras realizaciones, la histamina actúa como un neurotransmisor ligado a procesos centrales.

La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por el eje HPA. De acuerdo con lo anterior, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la actividad de HPA. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención atenúan la respuesta al estrés de HPA. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan las respuestas inflamatorias asociadas con la actividad h Pa . En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de glucocorticoides. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan los niveles de corticosterona y adrenalina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de factor liberador de corticotrofina y/o vasopresina. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de vasopresina y/u otras hormonas neurohipofisarias o antidiuréticas. Las alteraciones en la actividad del eje HPA se asocian con trastornos de ansiedad y estrés.

La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por alteraciones en la respuesta inmunitaria y factores y marcadores inflamatorios. De acuerdo con lo anterior, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden modular la respuesta inmunitaria. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles sistémicos de moléculas de señalización neuroinmunitaria circulantes. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan la inflamación y la producción de citoquinas proinflamatorias. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el estado inflamatorio. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la respuesta proliferativa de los esplenocitos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles sistémicos y/o plasmáticos de proteína C reactiva; citocinas de la familia IL-1; IL-1P; IL-2; IL-4; IL-6; IL-8; IL-10; IL-12p40; IL-17; IL-17A; IL-21; IL-23; TNF-a e IFN-^y. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de citocinas antiinflamatorias, por ejemplo, IL-10. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención aumentan los niveles de IL-10. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de TNF-a. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan los niveles de IFN-y. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la relación IFN-^y:IL-10. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención disminuyen la relación IFN-y:IL-10. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención disminuyen los niveles de las citocinas proinflamatorias TNF-a e IFN-y. El aumento de los niveles circulantes de citocinas está estrechamente relacionado con diversos trastornos neuropsiquiátricos, como depresión, ansiedad, esquizofrenia y ASD. La evidencia de alteración del estado inflamatorio se destaca en trastornos tales como la esquizofrenia, trastorno depresivo mayor y trastorno bipolar.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de células dendríticas mediadoras de tolerancia y regulan recíprocamente las respuestas de citocinas pro y antiinflamatorias. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención disminuyen el nivel sistémico de mieloperoxidasa (un marcador de inflamación y oxidación). Los moduladores terapéuticos del sistema inmunitario y de las respuestas inflamatorias son útiles para tratar trastornos del espectro autista y trastornos del estado de ánimo.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la respuesta inmunitaria a una infección o vacunación. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el nivel de inflamación en respuesta a la infección o vacunación. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan la activación inmunitaria materna en respuesta a una infección o vacunación durante el embarazo. De acuerdo con lo anterior, las composiciones de la invención se pueden administrar durante el embarazo para tratar o prevenir un trastorno del sistema nervioso central en la descendencia.

La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por niveles de metabolitos comensales. De acuerdo con lo anterior, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles sistémicos de metabolitos de la microbiota. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención modulan el nivel de ácidos grasos de cadena corta (SCFA). En ciertas realizaciones, el nivel de SCFA aumenta o disminuye. En algunas realizaciones, el SCFA es ácido butírico (BA) (o butirato). En algunas realizaciones, el SCFA es ácido propiónico (PPA). En algunas realizaciones, el SCFA es ácido acético. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la capacidad de los SCFA para cruzar la barrera hematoencefálica. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el nivel de Polisacárido A(PSA). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles del potente lipopolisacárido (LPS) de endotoxina proinflamatoria. El LPS conduce a la producción de citoquinas inflamatorias que alteran la actividad cerebral fisiológica y modulan la síntesis de neuropéptidos. El LPS tiene una importante influencia sobre la modulación del CNS, aumentando la actividad de las áreas dedicadas al control de las emociones (por ejemplo, la amígdala). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan el nivel de triptófano y/o sus metabolitos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de 4-etilfenilsulfato (4EPS; un tóxico urémico asociado con anormalidades del comportamiento relacionadas con ASD). En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención disminuyen los niveles de sulfato de 4-etilfenilo en un sujeto. Las señales generadas por la estimulación de las rutas de señalización neuronal provocadas por los estímulos intestinales intraluminales modulan fuertemente la actividad cerebral, que incluyen la percepción del dolor, modulación de la respuesta inmunitaria, control emocional y otras funciones homeostáticas. De acuerdo con lo anterior, una composición capaz de modular los niveles de estos factores tendría amplias aplicaciones terapéuticas para tratar o prevenir trastornos del CNS.

La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por los niveles de permeabilidad gastrointestinal. De acuerdo con lo anterior, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención alteran la integridad del epitelio del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la permeabilidad del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la función de barrera y la integridad del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la motilidad del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la translocación de metabolitos comensales y moléculas de señalización inflamatoria en el torrente sanguíneo desde el lumen del tracto gastrointestinal.

La señalización del eje microbiota-intestino-cerebro está modulada por la composición del microbioma en el tracto gastrointestinal. De acuerdo con lo anterior, en ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la composición del microbioma del tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen la disbiosis del microbioma y los aumentos asociados de metabolitos tóxicos (por ejemplo, LPS). En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de Clostridium en el tracto gastrointestinal. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención reducen el nivel de Clostridium en el tracto gastrointestinal. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención reducen los niveles de Campylobacter jejuni. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan la proliferación de bacterias anaeróbicas dañinas y la producción de neurotoxinas producidas por estas bacterias. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de microbioma de Lactobacillus y/o Bifidobacterium. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención modulan los niveles de microbioma de los géneros Sutterella, Prevotella, Ruminoccucs y/o la familia Alcaligenaceae. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención aumentan el nivel de Lactobacillus plantarum y/o Saccharomyces boulardii.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen la desregulación de la composición del microbioma por el uso extensivo de antibióticos. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mantienen una composición funcional del microbioma materno tras la administración de antibióticos durante el embarazo. De acuerdo con lo anterior, las composiciones de la invención se pueden administrar durante el embarazo para tratar o prevenir un trastorno del sistema nervioso central en la descendencia.

Se ha mostrado que la modulación del microbioma es eficaz para mejorar los comportamientos relacionados con trastornos psiquiátricos, que incluyen ansiedad, depresión, trastorno del espectro autista, trastorno obsesivocompulsivo y capacidades de memoria (que incluye la memoria espacial y no espacial), así como otros trastornos relacionados con el CNS, que incluyen la enfermedad de Parkinson. Ciertos estudios han sugerido que los probióticos pueden reducir el estrés psicológico, somatización, la depresión e ira-hostilidad. Los niveles de Lactobacillus están asociados con la depresión y se han implicado en la señalización del dolor asociado con molestias gastrointestinales.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian al menos uno de los síntomas de comportamiento asociados con un trastorno del sistema nervioso central descrito en el presente documento. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran la respuesta clínica general en un sujeto.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el comportamiento estereotipado y repetitivo en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de comportamientos y/o intereses inusualmente restrictivos. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian las obsesiones y/o compulsiones recurrentes en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los déficits en el comportamiento social en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el comportamiento de evitación en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los déficits en el comportamiento de comunicación en un sujeto.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian las alteraciones negativas en las cogniciones y el estado de ánimo en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el comportamiento relacionado con la ansiedad en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el comportamiento relacionado con el estrés en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el comportamiento relacionado con la depresión en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el comportamiento agresivo en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la aparición de un estado de ánimo anormal y persistentemente elevado, expansivo o irritable.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los pensamientos intrusivos en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención evitan alteraciones en la excitación y reactividad en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian los delirios, alucinaciones, habla desorganizada y comportamientos desorganizados o catatónicos en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el aplanamiento afectivo, restricción en la fluidez y productividad del pensamiento y el habla y en el inicio del comportamiento dirigido a un objetivo en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian uno o más de los siguientes síntomas: alta autoestima; reducción de la necesidad de dormir; aumento de la velocidad del habla; salto rápido de ideas; distraído fácilmente; un mayor interés en las metas o actividades; agitación psicomotora; aumento de la realización de actividades con alto riesgo de peligro.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran los déficits de memoria espacial y/o no espacial en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran tanto la cognición como el funcionamiento en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran la actividad locomotora en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian la bradicinesia en un sujeto. En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian el temblor de reposo; rigidez muscular y/o deterioro del reflejo postural en un sujeto.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención previenen, reducen o alivian al menos una comorbilidad asociada con un trastorno del CNS divulgado en el presente documento.

En las realizaciones preferidas, las composiciones de la invención mejoran las puntuaciones de un sujeto en al menos una de las escalas sintomáticas y/o diagnósticas para los trastornos del CNS descritos en el presente documento. En ciertas otras realizaciones, la escala sintomática y/o diagnóstica se selecciona del Cuestionario de Salud General (GHQ); la Escala de Depresión, Ansiedad y Estrés (DASS); el Índice de Leiden de Sensibilidad a la Depresión-Revisado (LEIDS-r); la Escala de Síntomas Positivos y Negativos (PANSS); el Inventario de Ansiedad Estado-Rasgo (STAI); la Lista de Verificación de Comportamiento de Desarrollo (DBC); el Inventario de Depresión de Beck (BDI); el Inventario de Ansiedad de Beck (BAI); la Lista de Verificación de Síntomas de Hopkins (HSCL-90); la Escala de Ansiedad y Depresión Hospitalaria (HADS); la Escala de Estrés Percibido (PSS); el Lista de Estrategias de Afrontamiento (CCL) (también utilizada para contrarrestar el estrés de la vida diaria); y el Perfil del Estado de Ánimo basado en cuestionarios (POMS).

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención pueden mejorar la escala sintomática y/o diagnóstica al evaluar la eficacia terapéutica en otros modelos animales de trastornos del CNS conocidos por el experto en la técnica. Además de los ensayos de comportamiento divulgados en los ejemplos, las composiciones de la invención pueden mejorar las interacciones sociales recíprocas; comunicación olfativa; vocalización ultrasónica; estereotipos motores (tal como dar vueltas y saltar verticalmente), comportamientos repetitivos como autoacicalarse y diferenciarse; y perseverancia en las tareas espaciales.

Además, las composiciones de la invención serán útiles para tratar y/o prevenir trastornos del CNS en otros modelos animales de trastornos del CNS. Otros modelos de ratones incluyen cepas de ratones consanguíneos (que incluyen BALB/cJ y C58/J) y también cepas de ratones modificados genéticamente (que incluyen cepas de ratones NEUREXIN1, NEUROLIGIN3, NEUROLIGIN4, SHANK₂, SHANK3, CNTNAP2, Tsc1/2 y mutantes del gen Fmr1).

El butirato es un ácido graso de cadena corta que actúa como un inhibidor de histona desacetilasa, es capaz de señalizar a través de receptores acoplados a proteína G y está implicado en la regulación de rutas metabólicas.

Los Ejemplos demuestran que Blautia hydrogenotrophica aumenta los niveles intestinales de butirato cuando se administra en composiciones orales. Los Ejemplos también demuestran que la Blautia hydrogenotrophica es útil para tratar trastornos y afecciones del sistema nervioso central. Este efecto de la Blautia hydrogenotrophica puede estar mediado por butirato.

El butirato se ha ligado con la desacetilación de histonas en el hipocampo y la corteza frontal del cerebro [xxxiv] y se ha implicado en la enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimery autismo [xxxv].

En ciertas realizaciones, la cepa de Blautia hydrogenotrophica para uso en la invención es un productor de butirato. En ciertas realizaciones, la cepa de Blautia hydrogenotrophica para uso en la invención sintetiza butirato mediante las rutas de acetil-CoA, glutarato, 4-aminobutirato y/o lisina. En ciertas realizaciones, la cepa de Blautia hydrogenotrophica para uso en la invención metaboliza polisacáridos complejos (por ejemplo, almidón y xilano) para producir acetil-CoA, que posteriormente se puede utilizar para sintetizar butirato. En ciertas realizaciones, la cepa de Blautia hydrogenotrophica para uso en la invención produce butirato por fermentación bacteriana en el colon.

En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones de la invención que comprenden Blautia hydrogenotrophica modulan los niveles de butirato. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención que comprenden Blautia hydrogenotrophica aumentan los niveles de butirato.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica es un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC). En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica inhibe la desacetilación de histonas en el hipocampo y la corteza frontal del cerebro. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica aumenta la acetilación de histonas y promueve la expresión de genes pro-supervivencia, pro-regenerativos y pro-plasticidad. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica rescata la acetilación de histonas, previene la muerte de células neuronales y prolonga la vida útil. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica protege a las neuronas de la muerte celular (por ejemplo, en la enfermedad de Parkinson). En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica restaura la acetilación de histonas y aumenta la expresión de genes asociados al aprendizaje. En ciertas realizaciones, estas modificaciones epigenéticas pueden ser tratamientos psiquiátricos potenciales.

En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de HDAC de la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica influye en la transcripción de numerosos genes implicados en la supervivencia, plasticidad y regeneración neuronal. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica aumenta la acetilación alrededor de los promotores de los factores neurotróficos. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica aumenta la acetilación alrededor del promotor de BDNF, GDNF y NGF. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica aumenta la expresión de BDNF, GDNF y NGF. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica aumenta la expresión de genes tempranos inmediatos implicados en la plasticidad, que incluye c-Fos y Homerla. En ciertas realizaciones, la expresión de estos factores se altera en el cerebro.

En ciertas realizaciones, la actividad inhibidora de desacetilasa de la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica mantiene la acetilación de proteínas no histonas. En ciertas realizaciones, la acetilación afecta la actividad enzimática y metabólica de muchas proteínas. Por ejemplo, se ha mostrado que los inhibidores de HDAC mantienen la acetilación y la activación del factor de transcripción Sp1 durante el estrés oxidativo, potenciando la respuesta adaptativa protectora para promover la supervivencia celular. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica previene el estrés oxidativo in vivo.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica restaura la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) y/o la expresión de proteína de unión estrecha (por ejemplo, claudina 5 y/u oclusión) en la corteza frontal, el hipocampo y el estriado. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica restaura y/o mantiene la integridad de la BBB. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica promueve y/o mantiene la expresión de uniones estrechas. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica puede establecer y/o mantener una barrera frente a mediadores inflamatorios, factores neuroquímicos, neuropéptidos y neurotransmisores asociados con trastornos del sistema nervioso central, en particular trastornos del neurodesarrollo y/o afecciones neuropsiquiátricas.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica inhibe la neuroinflamación. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica aumenta los niveles de II,-1RA(un inhibidor de la IL-1p proinflamatoria). En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica disminuye los niveles proinflamatorios de IL-1p y/o TNFa. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica aumenta la expresión de IL-4, lo que aumenta los niveles de IL-1RA.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica es un agente antiinflamatorio. En ciertas realizaciones, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica inhibe la activación del factor nuclear kB (NF-kB). De acuerdo con lo anterior, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica puede modular la expresión de genes de respuesta inflamatoria inmunitaria temprana, que incluyen IL-1B, TNFa, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, ácido nítrico sintasa inducible, ciclooxigenasa-2, molécula de adhesión intercelular-1, receptor-a de células T y moléculas MHC de clase II.

En ciertos casos, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica afecta la actividad mitocondrial.

En ciertos casos, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica afecta la señalización a través de GPCR.

En ciertos casos, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica afecta la acetilación de histonas.

En ciertos casos, la composición de la invención que comprende Blautia hydrogenotrophica afecta a la homeostasis del microbioma.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención que comprenden Blautia hydrogenotrophica pueden desencadenar una mejora en los cambios de comportamiento asociados con trastornos o afecciones del sistema nervioso central.

En ciertas realizaciones, los efectos de Blautia hydrogenotrophica pueden ser independientes del butirato. Por ejemplo, los Ejemplos demuestran que la administración de Blautia hydrogenotrophica, pero no de butirato solo, aumenta significativamente la actividad horizontal y vertical de los ratones y el tiempo transcurrido en el centro del modelo de campo abierto, lo que sugiere una función en la reducción de la ansiedad. Específicamente, la Blautia hydrogenotrophica muestra eficacia para reducir el comportamiento estereotipado y de tipo ansioso, mientras que la eficacia del butirato se limita a reducir el comportamiento estereotipado.

Modos de administración

Preferiblemente, las composiciones de la invención deben administrarse en el tracto gastrointestinal para permitir el suministro y/o la colonización parcial o total del intestino con la cepa bacteriana de la invención. Generalmente, las composiciones de la invención se administran por vía oral, pero se pueden administrar por vía rectal, intranasal o a través de las rutas bucal o sublingual.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se pueden administrar como una espuma, como un pulverizador o un gel.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se pueden administrar como un supositorio, tal como un supositorio rectal, por ejemplo, en forma de aceite de teobroma (manteca de cacao), grasa dura sintética (por ejemplo, suppocire, witepsol), composición de glicero-gelatina, polietilenglicol o glicerina jabonosa.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención se administra al tracto gastrointestinal a través de un tubo, tal como un tubo nasogástrico, tubo orogástrico, tubo gástrico, tubo de yeyunostomía (tubo en J), gastrostomía endoscópica percutánea (PEG) o un puerto, tal como un puerto de pared torácica que proporciona acceso al estómago, yeyuno y otros puertos de acceso adecuados.

Las composiciones de la invención se pueden administrar una vez o se pueden administrar secuencialmente como parte de un régimen de tratamiento. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención deben administrarse diariamente.

En ciertas realizaciones de la invención, el tratamiento de acuerdo con la invención va acompañado de una evaluación de la microbiota intestinal del paciente. El tratamiento se puede repetir si no se logra el suministro y/o la colonización parcial o total con la cepa de la invención de tal manera que no se observa eficacia, o se puede suspender el tratamiento si el suministro y/o la colonización parcial o total es exitoso y se observa eficacia.

En ciertas realizaciones, la composición de la invención se puede administrar a un animal preñado, por ejemplo, un mamífero tal como un humano para prevenir el desarrollo de una enfermedad inflamatoria o autoinmunitaria en su hijo en el útero y/o después del nacimiento.

Las composiciones de la invención se pueden administrar a un paciente que ha sido diagnosticado con un trastorno o afección del sistema nervioso central, en particular un trastorno o afección del sistema nervioso central mediado por el eje microbiota-intestino-cerebro, o que ha sido identificado como en riesgo de un trastorno o afección del sistema nervioso central, en particular, un trastorno o afección del sistema nervioso central mediado por el eje microbiotaintestino-cerebro. Las composiciones también se pueden administrar como medida profiláctica para prevenir el desarrollo de trastornos o afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos o afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro en un paciente sano.

Las composiciones de la invención se pueden administrar aun paciente que se ha identificado que tiene una microbiota intestinal anormal. Por ejemplo, el paciente puede tener una colonización reducida o ausente por Blautia, en particular Blautia stercoris o Blautia wexlerae. Por ejemplo, el paciente puede tener una colonización reducida o nula por Blautia, en particular Blautia stercoris, Blautia wexlerae o Blautia hydrogenotrophica.

Las composiciones de la invención se pueden administrar como un producto alimenticio, tal como un suplemento nutricional.

En general, las composiciones de la invención son para el tratamiento de humanos, aunque se pueden utilizar para tratar animales, que incluyen mamíferos monogástricos, tales como aves de corral, cerdos, gatos, perros, caballos o conejos. Las composiciones de la invención pueden ser útiles para mejorar el crecimiento y el rendimiento de los animales. Si se administra a animales, se puede utilizar alimentación forzada.

Composiciones

En general, la composición de la invención comprende bacterias. En realizaciones preferidas de la invención, la composición se formula en forma liofilizada. Por ejemplo, la composición de la invención puede comprender gránulos o cápsulas de gelatina, por ejemplo, cápsulas de gelatina dura, que comprenden una cepa bacteriana de la invención.

Preferiblemente, la composición de la invención comprende bacterias liofilizadas. La liofilización de bacterias es un procedimiento bien establecido y la orientación pertinente está disponible, por ejemplo, en las referencias [xxxvi], [] y [xxxviii].

Alternativamente, la composición de la invención puede comprender un cultivo bacteriano vivo y activo.

En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no se ha inactivado, por ejemplo, no se ha inactivado por calor. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no se ha destruido, por ejemplo, no se ha destruido por calor. En algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no se ha atenuado, por ejemplo, no se ha atenuado por calor. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención no se ha destruido, inactivado y/o atenuado. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención está viva. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención es viable. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención es capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana en la composición de la invención es viable y capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino.

En algunas realizaciones, la composición comprende una mezcla de cepas bacterianas vivas y cepas bacterianas que se han destruido.

En las realizaciones preferidas, la composición de la invención se encapsula para permitir el suministro de la cepa bacteriana al intestino. La encapsulación protege la composición de la degradación hasta el suministro en la ubicación diana a través, por ejemplo, de la ruptura con estímulos químicos o físicos tales como la presión, la actividad enzimática 0 la desintegración física, que pueden desencadenarse por cambios en el pH. Se puede utilizar cualquier método de encapsulación apropiado. Las técnicas de encapsulación de ejemplo incluyen atrapamiento dentro de una matriz porosa, adhesión o adsorción sobre superficies portadoras sólidas, autoagregación por floculación o con agentes de entrecruzamiento y contención mecánica detrás de una membrana microporosa o una microcápsula. La orientación sobre la encapsulación que puede ser útil para preparar las composiciones de la invención está disponible, por ejemplo, en las referencias [xxxix] y [xi].

La composición se puede administrar por vía oral y puede estar en forma de comprimido, cápsula o polvo. Se prefieren los productos encapsulados porque los Blautia son anaerobios. Otros ingredientes (tales como la vitamina C, por ejemplo), se pueden incluir como captadores de oxígeno y sustratos prebióticos para mejorar el suministro y/o la colonización parcial o total y la supervivencia in vivo. Alternativamente, la composición probiótica de la invención se puede administrar por vía oral como un producto alimenticio o nutricional, tal como un producto lácteo fermentado a base de leche o suero, o como un producto farmacéutico.

La composición se puede formular como un probiótico.

Una composición de la invención incluye una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana de la invención. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana es suficiente para ejercer un efecto beneficioso sobre un paciente. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una cepa bacteriana puede ser suficiente para dar como resultado el suministro y/o la colonización parcial o total del intestino del paciente.

Una dosis diaria adecuada de la bacteria, por ejemplo, para un ser humano adulto, puede ser de alrededor de 1 x 103 a alrededor de 1 x 1011 unidades formadoras de colonias (CFU); por ejemplo, de alrededor de 1 x 107 a alrededor de 1 x io 10 CFU; en otro ejemplo, de alrededor de 1 x 106 a alrededor de 1 x 1010 CFU.

En ciertas realizaciones, la composición contiene la cepa bacteriana en una cantidad de alrededor de 1 x 106 a alrededor de 1 x 1011 CFU/g, con respecto al peso de la composición; por ejemplo, de alrededor de 1 x 108 a alrededor de 1 x 1010 CFU/g. La dosis puede ser, por ejemplo, 1 g, 3 g, 5 g y 10 g.

Normalmente, un probiótico, tal como la composición de la invención, se combina opcionalmente con al menos un compuesto prebiótico adecuado. Un compuesto prebiótico usualmente es un carbohidrato no digerible, tal como un oligosacárido o un polisacárido, o un alcohol de azúcar, que no se degrada ni se absorbe en el tracto digestivo superior. Los prebióticos conocidos incluyen productos comerciales tales como inulina y transgalacto-oligosacáridos.

En ciertas realizaciones, la composición probiótica de la presente invención incluye un compuesto prebiótico en una cantidad desde alrededor de 1 hasta alrededor de 30 % en peso, con respecto al peso total de la composición (por ejemplo, desde 5 hasta a 20 % en peso). Los carbohidratos se pueden seleccionar del grupo que consiste en: fructooligosacáridos (o FOS), fructo-oligosacáridos de cadena corta, inulina, isomalta-oligosacáridos, pectinas, xilooligosacáridos (o XOS), quitosano-oligosacáridos (o COS), beta -glucanos, almidones modificados y resistentes de goma cultivable, polidextrosa, D-tagatosa, fibras de acacia, algarroba, avena y fibras de cítricos. En un aspecto, los prebióticos son los fructo-oligosacáridos de cadena corta (para simplificar, se muestran a continuación como FOSsc.c); dijo FOSs-c.c. son carbohidratos no digeribles, generalmente obtenidos por la conversión del azúcar de remolacha y que incluyen una molécula de sacarosa a la que se unen tres moléculas de glucosa.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se utilizan en combinación con otro compuesto terapéutico para tratar o prevenir el trastorno del sistema nervioso central. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran con suplementos nutricionales que modulan neurotransmisores centrales y neuropéptidos. En las realizaciones preferidas, los suplementos nutricionales comprenden o consisten en vitaminas nutricionales. En ciertas realizaciones, las vitaminas son vitamina B6, magnesio, dimetilglicina (vitamina B16) y vitamina C. En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención se administran en combinación con otro probiótico. En ciertas realizaciones preferidas, el probiótico comprende o consiste en óvulos de Trichuris suis.

Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de dichos excipientes adecuados se pueden encontrar en la referencia [xli]. Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en la referencia [xlii]. Los ejemplos de portadores adecuados incluyen lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol, sorbitol y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua. La elección del portador farmacéutico, excipiente o diluyente se puede seleccionar con respecto a la ruta de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como portador, excipiente o diluyente, o además del mismo, cualesquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agente(s) de solubilización adecuado(s). Los ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como acacia, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso agentes aromatizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También se pueden utilizar antioxidantes y agentes de suspensión.

Las composiciones de la invención se pueden formular como un producto alimenticio. Por ejemplo, un producto alimenticio puede proporcionar un beneficio nutricional además del efecto terapéutico de la invención, tal como en un suplemento nutricional. De manera similar, se puede formular un producto alimenticio para potenciar el sabor de la composición de la invención o para hacer que la composición sea más atractiva para consumir al ser más similar a un alimento común que a una composición farmacéutica. En ciertas realizaciones, la composición de la invención se formula como un producto a base de leche. El término “producto a base de leche” significa cualquier producto líquido o semisólido a base de leche o suero que tenga un contenido de grasa variable. El producto a base de leche puede ser, por ejemplo, leche de vaca, leche de cabra, leche de oveja, leche desnatada, leche entera, leche recombinada a partir de leche en polvo y suero sin ningún procesamiento, o un producto procesado, tal como yogur, leche cuajada, cuajada, leche agria, leche entera agria, leche de mantequilla y otros productos de leche agria. Otro grupo importante incluye bebidas lácteas, tales como bebidas de suero, leches fermentadas, leches condensadas, leches para lactantes o bebés; leches saborizadas, helados; alimentos que contienen leche, tales como dulces.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas del género Blautia y no contienen bacterias de ningún otro género, o que comprenden solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otro género. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas del género Blautia, que no contiene bacterias de ningún otro género o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otro género, para uso en terapia.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas de la especie Blautia stercoris o Blautia wexlerae y no contienen bacterias de ninguna otra especie, o que comprenden solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otras especies. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas de la especie Blautia stercoris o Blautia wexlerae, que no contiene bacterias de ninguna otra especie o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie, para uso en terapia.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas de la especie Blautia hydrogenotrophica y no contienen bacterias de ninguna otra especie, o que comprenden solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas de la especie Blautia hydrogenotrophica, que no contiene bacterias de ninguna otra especie o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie, para uso en terapia

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas de la especie Blautia stercoris o Blautia wexlerae y no contienen bacterias de ninguna otra especie de Blautia, o que comprenden solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie de Blautia. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas de la especie Blautia stercoris o Blautia wexlerae, que no contiene bacterias de ninguna otra especie de Blautia o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otras especies de Blautia, para uso en terapia.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden una o más cepas bacterianas de la especie Blautia hydrogenotrophica y no contienen bacterias de ninguna otra especie de Blautia, o que comprenden solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie de Blautia. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una o más cepas bacterianas de la especie Blautia hydrogenotrophica, que no contiene bacterias de ninguna otra especie de Blautia o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra especie de Blautia para uso en terapia.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención contienen una única cepa o especie bacteriana y no contienen ninguna otra cepa o especie bacteriana. Dichas composiciones pueden comprender solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de otras cepas o especies bacterianas. Dichas composiciones pueden ser un cultivo que esté sustancialmente libre de otras especies de organismos.

En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una sola cepa bacteriana del género Blautia, que no contiene bacterias de ninguna otra cepa o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra cepa para uso en terapia.

En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una sola cepa bacteriana de la especie Blautia stercoris o Blautia wexlerae, que no contiene bacterias de ninguna otra cepa o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra cepa para uso en terapia.

En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición que comprende una sola cepa bacteriana de la especie Blautia hydrogenotrophica, que no contiene bacterias de ninguna otra cepa o que comprende solo cantidades mínimas o biológicamente irrelevantes de bacterias de otra cepa para uso en terapia.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden más de una cepa bacteriana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden más de una cepa dentro de la misma especie (por ejemplo, más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 o 45 cepas) y, opcionalmente, no contienen bacterias de ninguna otra especie. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden menos de 50 cepas de la misma especie (por ejemplo, menos de 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 cepas), y, opcionalmente, no contienen bacterias de ninguna otra especie. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención comprenden 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25 o 31-50 cepas de la misma especie y, opcionalmente, no contienen bacterias de ninguna otra especie. La invención comprende cualquier combinación de los anteriores.

En algunas realizaciones, la composición comprende un consorcio microbiano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende la cepa bacteriana Blautia como parte de un consorcio microbiano. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la cepa bacteriana Blautia está presente en combinación con una o más (por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20) otras cepas bacterianas de otros géneros con las que puede vivir simbióticamente in vivo en el intestino. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición comprende una cepa bacteriana de Blautia en combinación con una cepa bacteriana de un género diferente. En algunas realizaciones, el consorcio microbiano comprende dos o más cepas bacterianas obtenidas de una muestra de heces de un solo organismo, por ejemplo, un humano. En algunas realizaciones, el consorcio microbiano no se encuentra unido en la naturaleza. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el consorcio microbiano comprende cepas bacterianas obtenidas de muestras de heces de al menos dos organismos diferentes. En algunas realizaciones, los dos organismos diferentes son de la misma especie, por ejemplo, dos humanos diferentes. En algunas realizaciones, los dos organismos diferentes son un ser humano infantil y un ser humano adulto. En algunas realizaciones, los dos organismos diferentes son un humano y un mamífero no humano.

En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende adicionalmente una cepa bacteriana que tiene las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que la cepa MRX006, pero que no es MRX006 depositada como NCINM 42381, o que no es una Blautia stercoris. En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende adicionalmente una cepa bacteriana que tiene las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que la cepa MRX008, pero que no es MRX008 depositada como NCIMB 42486, o que no es una Blautia wexlerae.

En algunas realizaciones, la composición de la invención comprende adicionalmente una cepa bacteriana que tiene las mismas características de seguridad y eficacia terapéutica que la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada como DSM 14294, pero que no es la cepa Blautia hydrogenotrophica depositada como DSM 14294, o que no es una Blautia hydrogenotrophica.

En algunas realizaciones, la composición de la invención no comprende una cepa bacteriana del género Bacillus. En algunas realizaciones, la composición de la invención no comprende Bacillus subtilis y/o no comprende Bacillus coagulans. En algunas realizaciones, el trastorno del CNS que se va a tratar con la composición de la invención no es un trastorno bipolar. En algunas realizaciones, el paciente que se va a tratar con la composición de la invención no tiene una infección fúngica. En algunas realizaciones, el paciente que se va a tratar con la composición de la invención no padece candidiasis. En algunas realizaciones, al paciente que se va a tratar con la composición de la invención no se le ha diagnosticado una infección fúngica y/o no se le ha diagnosticado que padece de candidiasis. En dichas realizaciones preferidas, al paciente que se va que se va a tratar con la composición de la invención nunca se le ha diagnosticado que tiene una infección fúngica y/o nunca se le ha diagnosticado que padece candidiasis.

En algunas realizaciones en las que la composición de la invención comprende más de una cepa, especie o género bacteriano, las cepas, especies o géneros bacterianos individuales pueden ser para administración separada, simultánea o secuencial. Por ejemplo, la composición puede comprender más de una cepa, especie o género bacteriano, o las cepas, especies o géneros bacterianos se pueden almacenar por separado y administrar por separado, simultánea o secuencialmente. En algunas realizaciones, las más de una cepa, especie o género bacteriano se almacenan por separado, pero se mezclan antes de su uso.

En algunas realizaciones, la cepa bacteriana para uso en la invención se obtiene de heces de adultos humanos. En algunas realizaciones en las que la composición de la invención comprende más de una cepa bacteriana, todas las cepas bacterianas se obtienen de heces de adultos humanos o, si están presentes otras cepas bacterianas, lo están solo en cantidades mínimas. Las bacterias se pueden haber cultivado después de obtenerse de las heces de adultos humanos y utilizarse en una composición de la invención.

Como se mencionó anteriormente, en algunas realizaciones, una o más cepas bacterianas de Blautia es/son el(los) único(s) agente(s) terapéuticamente activo(s) en una composición de la invención. En algunas realizaciones, la(s) cepa(s) bacteriana(s) en la composición es/son el(los) único(s) agente(s) terapéuticamente activo(s) en una composición de la invención.

Las composiciones para uso de acuerdo con la invención pueden o no requerir aprobación de comercialización.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que se liofiliza dicha cepa bacteriana. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que dicha cepa bacteriana se seca por pulverización. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en la que está viva. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en la que es viable. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en la que es capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino. En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que la cepa bacteriana se liofiliza o se seca por pulverización y en la que es viable y capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino.

En algunos casos, la cepa bacteriana liofilizada o secada por pulverización se reconstituye antes de la administración. En algunos casos, la reconstitución se realiza mediante el uso de un diluyente descrito en el presente documento.

Las composiciones de la invención pueden comprender excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana como se utiliza en la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en el que la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar un trastorno cuando se administra a un sujeto que lo necesita; y en el que el trastorno se selecciona del grupo que consiste en: trastornos del espectro autista (ASD); trastorno obsesivo compulsivo (OCD); trastorno depresivo mayor; depresión; trastorno afectivo estacional; trastornos de ansiedad; trastorno de estrés postraumático.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende: una cepa bacteriana como se utiliza en la invención; y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; en el que la cepa bacteriana está en una cantidad suficiente para tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central, en particular un trastorno o afección del sistema nervioso central mediado por el eje microbiota-intestino-cerebro, en el que dicha enfermedad o afección se selecciona del grupo que consiste en: trastornos del espectro autista (ASD); trastorno obsesivo compulsivo (OCD); trastorno depresivo mayor; depresión; trastorno afectivo estacional; trastornos de ansiedad; Trastorno de estrés postraumático.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que la cantidad de la cepa bacteriana es de alrededor de 1 * 103 a alrededor de 1 * 1011 unidades formadoras de colonias por gramo con respecto al peso de la composición.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que la composición se administra a una dosis de 1 g, 3 g, 5 g o 10 g.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que la composición se administra mediante un método seleccionado del grupo que consiste en oral, rectal, subcutáneo, nasal, bucal y sublingual.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un portador seleccionado del grupo que consiste en lactosa, almidón, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol y sorbitol.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un diluyente seleccionado del grupo que consiste en etanol, glicerol y agua.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un excipiente seleccionado del grupo que consiste en almidón, gelatina, glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorante de maíz, acacia, tragacanto, alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol, oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio y cloruro de sodio.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que además comprende al menos uno de un conservante, un antioxidante y un estabilizante.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, que comprende un conservante seleccionado del grupo que consiste en benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico.

En ciertas realizaciones, la invención proporciona la composición farmacéutica anterior, en la que cuando la composición se almacena en un recipiente sellado a aproximadamente 4 °C o aproximadamente 25 °C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tiene una humedad relativa del 50 %, a al menos el 80 % de la cepa bacteriana medida en unidades formadoras de colonias permanece después de un período de al menos aproximadamente: 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1.5 años, 2 años, 2.5 años o 3 años.

En algunas realizaciones, la composición de la invención se proporciona en un recipiente sellado que comprende una composición como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el recipiente sellado es una bolsita o una botella. En algunas realizaciones, la composición de la invención se proporciona en una jeringa que comprende una composición como se describe en el presente documento.

La composición de la presente invención puede, en algunas realizaciones, proporcionarse como una formulación farmacéutica. Por ejemplo, la composición se puede proporcionar en forma de comprimido o cápsula. En algunas realizaciones, la cápsula es una cápsula de gelatina (“cápsula de gel”).

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se administran por vía oral. La administración oral puede implicar la deglución, de tal manera que el compuesto entre en el tracto gastrointestinal, y/o la administración bucal, lingual o sublingual mediante la cual el compuesto entra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.

Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración oral incluyen tapones sólidos, micropartículas sólidas, semisólidas y líquidas (que incluyen fases múltiples o sistemas dispersos) tales como comprimidos; cápsulas blandas o duras que contienen multipartículas o nanopartículas, líquidos (por ejemplo, soluciones acuosas), emulsiones o polvos; pastillas para chupar (que incluyen las rellenas de líquido); chicles; geles; formas de dosificación de dispersión rápida; películas; óvulos; aerosoles; y parches bucales/mucoadhesivos.

En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica es una formulación entérica, es decir, una formulación gastrorresistente (por ejemplo, resistente al pH gástrico) que es adecuada para el suministro de la composición de la invención al intestino mediante administración oral. Las formulaciones entéricas pueden ser particularmente útiles cuando la bacteria u otro componente de la composición es sensible a los ácidos, por ejemplo, propenso a la degradación bajo condiciones gástricas.

En algunas realizaciones, la formulación entérica comprende un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones, la formulación es una forma de dosificación con recubrimiento entérico. Por ejemplo, la formulación puede ser un comprimido con recubrimiento entérico o una cápsula con recubrimiento entérico o similares. El recubrimiento entérico puede ser un recubrimiento entérico convencional, por ejemplo, un recubrimiento convencional para un comprimido, cápsula o similar para suministro oral. La formulación puede comprender un recubrimiento de película, por ejemplo, una capa de película delgada de un polímero entérico, por ejemplo, un polímero insoluble en ácido.

En algunas realizaciones, la formulación entérica es intrínsecamente entérica, por ejemplo, gastrorresistente sin necesidad de un recubrimiento entérico. Por tanto, en algunas realizaciones, la formulación es una formulación entérica que no comprende un recubrimiento entérico. En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula elaborada de un material termogelificante. En algunas realizaciones, el material termogelificante es un material celulósico, tal como metilcelulosa, hidroximetilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC). En algunas realizaciones, la cápsula comprende una cubierta que no contiene ningún polímero formador de película. En algunas realizaciones, la cápsula comprende una cubierta y la cubierta comprende hidroxipropilmetilcelulosa y no comprende ningún polímero formador de película (por ejemplo, véase [xliii]). En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula intrínsecamente entérica (por ejemplo, Vcaps® de Capsugel).

En algunas realizaciones, la formulación es una cápsula blanda. Las cápsulas blandas son cápsulas que, debido a la adición de suavizantes, tales como, por ejemplo, glicerol, sorbitol, maltitol y polietilenglicoles, presentes en la cubierta de la cápsula, pueden tener una cierta elasticidad y suavidad. Las cápsulas blandas se pueden producir, por ejemplo, a base de gelatina o almidón. Las cápsulas blandas a base de gelatina están disponibles comercialmente de varios proveedores. Dependiendo del método de administración, tal como, por ejemplo, por vía oral o rectal, las cápsulas blandas pueden tener varias conformaciones, pueden ser, por ejemplo, redondas, ovaladas, oblongas o con conformación de torpedo. Las cápsulas blandas se pueden producir mediante procesos convencionales, tales como, por ejemplo, mediante el proceso Scherer, el proceso Accogel o el proceso de gotitas o soplado.

Métodos de cultivo

Las cepas bacterianas para uso en la presente invención se pueden cultivar utilizando técnicas estándar de microbiología como se detalla, por ejemplo, en las referencias [xliv], [] y [xlvi].

El medio sólido o líquido utilizado para el cultivo puede ser agar YCFA o medio YCFA. El medio YCFA puede incluir (por 100 ml, valores aproximados): Casitona (1.0 g), extracto de levadura (0.25 g), NaHCO₃ (0.4 g), cisteína (0.1 g), K₂HPO₄ (0.045 g), KH₂PO₄ (0.045 g), NaCl (0.09 g), (NH4)₂SO₄ (0.09 g), MgSO₄ ■ 7H₂O (0.009 g), CaCh (0.009 g), resazurina (0.1 mg), hemina (1 mg), biotina ( i |jg), cobalamina (1 |jg), ácido p-aminobenzoico (3 |jg), ácido fólico (5 jg ) y piridoxamina (15 jg).

Cepas bacterianas para uso en composiciones de vacunas.

Los inventores han identificado que las cepas bacterianas de la invención son útiles para tratar o prevenir trastornos o afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos o afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro. Es probable que esto sea el resultado del efecto que las cepas bacterianas de la invención tienen sobre el sistema nervioso central, autónomo y/o entérico del huésped; la actividad de la ruta HPA; las rutas neuroinmunitarias y neuroendocrina; y el nivel de metabolitos comensales en el tracto gastrointestinal del huésped y/o la permeabilidad gastrointestinal del huésped. Por lo tanto, las composiciones de la invención también pueden ser útiles para prevenir trastornos o afecciones del sistema nervioso central, en particular trastornos o afecciones del sistema nervioso central mediados por el eje microbiota-intestino-cerebro, cuando se administran como composiciones de vacuna. En ciertas dichas realizaciones, las cepas bacterianas de la invención son viables. En ciertas dichas realizaciones, las cepas bacterianas de la invención son capaces de colonizar parcial o totalmente el intestino. En ciertas de dichas realizaciones, las cepas bacterianas de la invención son viables y capaces de colonizar parcial o totalmente el intestino. En otras ciertas dichas realizaciones, las cepas bacterianas de la invención se pueden destruir, inactivar o atenuar. En ciertas dichas realizaciones, las composiciones pueden comprender un adyuvante de vacuna. En ciertas realizaciones, las composiciones son para administración a través de inyección, tal como a través de inyección subcutánea.

General

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experticia en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, las referencias [xlvii] y [xlviii]-[liv], etc.

El término “que comprende” abarca “que incluye” así como “que consiste en”, por ejemplo, una composición que “comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y

El término “alrededor de” en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x 10 %.

En ciertas realizaciones, el término “modular” significa aumentar o activar. En realizaciones alternativas, el término “modular” significa disminuir o suprimir.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composición que está “sustancialmente libre” de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” se puede omitir de la definición de la invención.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de nucleótidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar utilizando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la ref. [lv]. Una alineación preferida se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman utilizando una búsqueda de espacio afín con una penalización de apertura de espacio de 12 y una penalización de extensión de espacio de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se divulga en la ref. [lvi].

A menos que se indique específicamente, un proceso o método que comprende numerosas etapas puede comprender etapas adicionales al principio o al final del método, o puede comprender etapas intermedias adicionales. Además, las etapas se pueden combinar, omitir o realizar en un orden alternativo, si corresponde.

En el presente documento se describen varias realizaciones de la invención. Se apreciará que las características especificadas en cada realización se pueden combinar con otras características especificadas para proporcionar realizaciones adicionales. En particular, las realizaciones destacadas en el presente documento como adecuadas, típicas o preferidas se pueden combinar entre sí (excepto cuando se excluyen mutuamente).

Modos para llevar a cabo la invención

El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto de productos bioterapéuticos vivos en el tratamiento de trastornos psiquiátricos y neurológicos en dos modelos de ratón diferentes que muestran características de comportamiento asociadas con trastornos psiquiátricos y del neurodesarrollo. En particular, el estudio se centra en el comportamiento relacionado con el autismo en (i) un modelo de ratón C57BL/6 wt, (ii) un modelo de ratón genéticamente modificado consanguíneo BTBR y (iii) un modelo de ratón de activación inmunitaria materna (MIA). Se investigaron los efectos del MRX006 crónico frente al tratamiento con vehículo en la ansiedad, depresión y dominios cognitivos y sociales del comportamiento en los tres modelos de ratones. Además, se realizaron análisis fisiológicos y anatómicos, así como detección de niveles de citoquinas y oxitocina circulantes.

Las Directrices de la EMA sobre el desarrollo clínico de productos medicinales para el tratamiento del trastorno del espectro autista establecen que, debido a la heterogeneidad de las enfermedades, puede que no sea posible lograr un efecto significativo en todos los síntomas principales con un solo compuesto y, por lo tanto, la eficacia a corto plazo se debe demostrar en al menos un síntoma central. Los productos bioterapéuticos vivos probados en los Ejemplos han mostrado un tratamiento eficaz de al menos un síntoma central del trastorno del espectro autista, por lo que se espera que estas cepas y las cepas de Blautia relacionadas sean eficaces contra la enfermedad humana. De manera similar, otros trastornos o afecciones del sistema nervioso central muestran una patología compleja con múltiples síntomas diferentes y tienen pocos tratamientos aprobados. Por lo tanto, se entiende que un tratamiento eficaz no necesita tratar todos los síntomas de un trastorno o afección del sistema nervioso central. Un tratamiento se consideraría terapéuticamente útil si tratara uno de los síntomas asociados con un trastorno o afección del sistema nervioso central.

Ejemplo 1: Evaluación de la ansiedad, depresión, dominios cognitivos y sociales del comportamiento en ratones C57Bl/6

Ejemplo 1a - Materiales y métodos para los experimentos con ratones C57BL/6

Ratones

Se adquirieron ratones C57BL/6 macho de Harlan UK. Los animales se alojaron en una habitación con temperatura y humedad controladas en un ciclo de oscuridad de 12 h (luces encendidas de 7:00 a 19:00 h). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/EEC, los requisitos de S.I. No 543 de 2012 y aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de University College Cork.

Cepa

MRX006: bacteria Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCINM 42381.

Se proporcionó el producto bioterapéutico en solución madre de glicerol. Los productos bioterapéuticos vivos se cultivaron en la instalación en condiciones anaeróbicas.

Administración del producto bioterapéutico vivo

La dosificación con MRX006 o vehículo (control) comenzó cuando los ratones tenían 7 semanas de edad. Estos ratones se trataron una vez al día con MRX006 o solución tampón de fosfato (PBS) durante 4 semanas antes del comienzo de la batería de comportamiento. Los ratones se trataron adicionalmente una vez al día durante la batería de comportamiento. MRX006 (administración oral de 1 x 109 CFU) se disolvió en PBS antes de la administración. Cronograma de administración

Los grupos de tratamiento para el estudio se muestran a continuación. El vehículo para la administración oral es PBS. La administración oral diaria se produce mediante alimentación forzada oral.

El grupo no tratado no se manejó hasta el comienzo de la batería de comportamiento.

Recolección fecal

Se recolectaron muestras fecales frescas de ratones individuales cada semana hasta el final del estudio. Se colocaron al menos 20 mg de heces frescas en un tubo de microcentrífuga, se colocaron inmediatamente en hielo y luego se almacenaron a -80 °C.

Diseño experimental y métodos.

Como se ha señalado anteriormente, la dosificación con MRX006 comenzó cuando los ratones tenían 7 semanas de edad. La dosificación inicial tuvo lugar durante 4 semanas antes de los experimentos de comportamiento. La batería de comportamiento ocurrió en el siguiente orden: enterramiento de canicas y pruebas de 3 cámaras en la semana 5; las pruebas de laberinto elevado en cruz y suspensión de la cola en la semana 6; las pruebas de campo abierto y reconocimiento de objetos nuevos en la semana 8; la prueba de hipertermia inducida por estrés en la semana 9; la prueba de condicionamiento del miedo en la semana 10; y la prueba de nado forzado en la semana 11. El ensayo de permeabilidad intestinal con fluoresceína se realizó en la semana 9. Finalmente, en la semana 12, los ratones fueron sacrificados y diseccionados para las regiones del cerebro, colon proximal y distal, suprarrenal y bazo, junto con las muestras de plasma.

Diseño gráfico y análisis estadístico

Todos los gráficos se generaron en el software Graphpad Prism (versión 5). Los datos se analizaron utilizando IBM SPSS Statistic 22.0 (EEUU). La distribución de datos se analizó utilizando la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov. Los datos que comparan el grupo de vehículo con los grupos MRX006 se analizaron utilizando ANOVA de dos vías y la prueba post hoc de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Los datos que comparan el grupo de vehículo frente a los ratones no tratados se analizaron mediante la prueba t de Student no pareada. Los datos que no se distribuyeron normalmente se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba U no paramétrica de Mann-Whitney P < 0.05 fue el criterio de significación estadística.

Ejemplo 1b: Evaluación del comportamiento de interacción social - las pruebas de tres cámaras

Justificación

La Prueba de Interacción Social de 3 Cámaras (3-CSIT) es un modelo etológicamente relevante bien validado que evalúa la interacción social entre congéneres del mismo sexo y permite lecturas de novedad social y preferencia social en ratones. La prueba se utiliza para caracterizar y demostrar cambios en esta lectura de comportamiento. La prueba permite a los ratones explorar libremente entre un objeto inanimado o ratones conespecíficos del mismo sexo.

Además, la prueba de 3 cámaras (3-CHT) es una prueba utilizada para evaluar la cognición en la forma de sociabilidad general e interés en la novedad social en modelos de roedores. Los roedores normalmente prefieren pasar más tiempo con otro roedor (sociabilidad) que con un objeto. Más aún, los roedores prefieren investigar un ratón nuevo frente a un ratón familiar (novedad social). En base a estas inclinaciones, la 3-CHT puede ayudar a identificar roedores con déficits en sociabilidad y/o novedad social.

Métodos

Los animales se colocan en un aparato rectangular dividido en tres cámaras (izquierda y derecha y una cámara central más pequeña) mediante particiones con pequeñas aberturas circulares que permiten un fácil acceso a todos los compartimentos. La prueba se compone de tres ensayos secuenciales de 10 minutos: (1) habituación (se permite que el animal de prueba explore las tres cámaras vacías); (2) sociabilidad (un animal desconocido se coloca en una jaula de alambre de malla interna en las cámaras izquierda o derecha); (3) preferencia por la novedad social (se coloca un animal nuevo en la jaula interior previamente vacía de la cámara, frente al animal ahora familiar). Los animales no tratados no deberían tener preferencia por ninguna de las cámaras en la fase de habituación, preferencia por el ratón en la fase de sociabilidad y preferencia por el ratón nuevo en la fase de novedad social. Un aumento en la relación de discriminación sugeriría un aumento en el comportamiento social. Todos los animales tienen la misma edad y sexo, y cada cámara se limpia y se reviste con lecho nuevo después de cada ensayo de 30 minutos. Para cada una de los tres estadios, el comportamiento es registrado por una cámara de video montada sobre el aparato.

Resultados

La prueba t de Student dentro de los grupos reveló que todos los grupos pasaron más tiempo investigando un ratón frente a un objeto (** p<0.01) lo que sugiere que no hay déficits en la sociabilidad (Figura 1). La alimentación forzada diaria no afectó la sociabilidad. Curiosamente, MRX006 potenció el tiempo transcurrido investigando un ratón nuevo frente a uno familiar, lo que sugiere una mayor novedad social (p<0.05; Figura 1).

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 potenció la preferencia por la novedad social en ratones C57Bl/6 en la prueba de tres cámaras.

Ejemplo 1c: evaluación del comportamiento sim ilar a depresión: la prueba de nado forzado (FST)

Justificación

La prueba de nado forzado (FST) es el paradigma experimental más utilizado para evaluar la actividad antidepresiva. Los animales no tratados mostrarán un comportamiento de escape en forma de natación, escalada y buceo antes de adoptar una postura flotante inmóvil. La duración de la inmovilidad es indicativa de desesperación conductual. Los fármacos antidepresivos disminuyen el tiempo que pasan inmóviles en esta prueba.

M étod os

Se obliga a los ratones a nadar durante 6 min en un cilindro de vidrio (24 * 21 cm) lleno de agua del grifo a 23-25 °C hasta una profundidad de 17 cm. La FST se grabó en video desde una cámara de techo. El parámetro de comportamiento puntuado es la inmovilidad durante los últimos 4 min de la prueba de 6 min.

Resultados

La alimentación forzada diaria aumentó el tiempo de inmovilidad que sugiere un comportamiento de tipo depresivo en comparación con ratones no tratados (prueba t de Student, t (190 = 4.565; p <0.01; Figura 2). El tratamiento crónico con MRX006 redujo significativamente la inmovilidad lo que sugiere efectos de tipo antidepresivo en comparación con el grupo de vehículo (F (2.29) = 14.992; ** p<0.01).

Conclusiones

El tratamiento crónico con MXR006 indujo un comportamiento de tipo antidepresivo en la prueba de nado forzado.

Ejemplo 1d: evaluación del comportamiento sim ilar a depresión: la prueba de suspensión de la cola

Justificación

La prueba de suspensión de la cola es una prueba bien caracterizada utilizada para evaluar el comportamiento similar a los antidepresivos. El tiempo que pasan inmóviles es un índice de comportamiento similar a depresión. El tratamiento con fármacos antidepresivos disminuye el tiempo de inmovilidad.

Métodos

Los ratones se suspenden a una barra elevada (60 cm) mediante un trozo de cinta adhesiva unida 1 cm antes de la punta de la cola durante un período de 6 min. Los ratones están suspendidos de tal manera que no pueden escapar ni aferrarse a las superficies cercanas. Durante esta prueba, de seis minutos de duración, se cuantifican los comportamientos orientados al escape resultantes. El parámetro de comportamiento puntuado es el tiempo que se pasa inmóvil. La prueba fue grabada en video por una cámara trípode y el tiempo de inmovilidad se puntuó manualmente por un investigador ciego a las condiciones experimentales.

Resultados

El manejo diario para alimentación forzada (prueba t de Student, t (20) = 0.9405; P = 0.3582) y el tratamiento crónico con MRX006 (ANOVA unidireccional, F (2.30) = 2,014; P = 0.152) no indujo ninguna efecto en la prueba de suspensión de la cola (Figura 3).

Conclusión

El tratamiento crónico con MRX006 no indujo ningún comportamiento de tipo antidepresivo observable en ratones C57Bl/6 en la prueba de suspensión de la cola.

Ejemplo 1e: evaluación de la cognición: la prueba de condicionamiento del miedo

Justificación

El condicionamiento del miedo contextual se utiliza como una medida de la memoria dependiente del hipocampo. El condicionamiento del miedo es una forma de aprendizaje asociativo que mide la respuesta de congelación mostrada por el animal a un estímulo incondicionado (US), tal como un choque con un estímulo condicionado (CS), un tono particular, una luz o un olor. La medición de los niveles de congelación se utilizó para evaluar la respuesta de los animales a los estímulos de US y CS. Esta prueba mide la eficiencia con la que los ratones olvidan lo que han adquirido el día de la adquisición. La prueba evalúa la ansiedad de los ratones hacia los estímulos condicionados asociados con los estímulos no condicionados y la velocidad a la que los ratones muestran ansiedad y/o estrés reducidos (niveles de congelación) en presencia de estímulos condicionados en ausencia repetida de estímulos no condicionados pareados.

Métodos

El aparato para esta prueba constaba de cámaras con una luz arriba. Cada cámara está ubicada dentro de una cámara más grande, que protege de la luz y el ruido del exterior. En el primer día (estadio de entrenamiento o adquisición), los ratones se colocaron en la cámara y se registró su comportamiento de congelación durante 3 minutos (valor de referencia), seguido de hasta 6 luces/tono [estímulo condicionado (CS - 30 s)] y emparejamientos de descarga eléctrica en las patas [estímulo incondicionado (US - 2 s)] con un intervalo de hasta 2 min. Los emparejamientos consistieron en la guía [por ejemplo, una exposición combinada de luz (~260 lx) y tono (80 dB)] durante 20 s y una descarga eléctrica en las patas durante los últimos 2 s de la guía. La descarga eléctrica en las patas aumenta el comportamiento de congelación. La intensidad de la corriente fue de 0.6 mA. Se utilizó la corriente mínima que induce una respuesta de congelación. Dos minutos después del último apareamiento, los ratones volvieron a sus condiciones normales de alojamiento. A las 24 y 48 h después del condicionamiento (días 2 (estadio de recuperación) y 3 (estadio de extinción), respectivamente), se repitió el mismo procedimiento experimental en ausencia de descargas en las patas para probar la retención de la memoria y la extinción de la memoria del miedo condicionado (fase de extinción). La retención de la memoria contextual se caracteriza por un comportamiento de congelación cuando el animal se coloca en el contexto (es decir, la cámara de descarga eléctrica en las patas) en ausencia de una descarga eléctrica en las patas.

Resultados

Los niveles de congelación se midieron en la fase de adquisición (exposición a CS y US acoplados juntos), fase de recuperación y extinción (CS no acoplado con US) (véase Figura 4). En este estudio, la alimentación forzada diaria indujo un aumento significativo en los niveles de congelación (fase 1 #p<0.05; fase 2 ###p<0.001; fase 3-4 ##p<0.01) en la fase de adquisición en comparación con los animales no tratados. El tratamiento crónico con MRX006 no alteró los niveles de congelación en comparación con el grupo de vehículo durante la fase de adquisición. La fase de adquisición fue seguida por la fase de recuperación que tuvo lugar 24 horas después de la sesión de entrenamiento (CS no seguido de US). Los datos mostraron un aumento significativo en los niveles de congelación en la fase 1 (exposición al primer tono) en el grupo de vehículo en comparación con el grupo no tratado(p<0.05). Curiosamente, se observó una reducción significativa en los niveles de congelación en la fase 1 en ratones tratados con MRX006 (* p<0.05) en comparación con el grupo de vehículo. En general, en la fase de recuperación, los tratados con MRX006 mostraron una tendencia a disminuir los niveles de congelación en comparación con el grupo de vehículo, lo que sugiere que el tratamiento crónico con MRX006 puede potenciar el aprendizaje. La fase de recuperación fue seguida por la fase de extinción (24 horas después, CS y sin US). Esta prueba mide la eficiencia con la que los ratones olvidan lo que han adquirido el día de la adquisición. En la fase 3 de la fase de extinción, el grupo de vehículo mostró mayores niveles de congelación en comparación con el grupo no tratado (p <0.05). El tratamiento crónico con MRX006 no indujo ningún cambio significativo en la fase de extinción.

Conclusión

El tratamiento crónico con MRX006 redujo los niveles de congelación en la fase de recuperación, lo que sugiere que MRX006 puede potenciar el aprendizaje. En general, el tratamiento crónico con MRX006 no alteró significativamente el comportamiento condicionado por el miedo.

Ejemplo 1f: Evaluación de la cognición: la prueba de reconocimiento de objetos nuevos (NOR)

Justificación

El protocolo utilizado se adaptó de Bevins y Besheer (2006), y se utilizó para probar la cognición, particularmente la memoria de reconocimiento. Esta prueba se basa en la tendencia espontánea de los roedores a pasar más tiempo explorando un objeto nuevo que uno familiar. La elección de explorar el objeto nuevo refleja el uso de la memoria de aprendizaje y reconocimiento. Además, la mejora de la memoria es un reflejo de la reducción del comportamiento similar a depresión.

Métodos

El protocolo utilizado se adaptó de Bevins y Besheer (2006). Se realizó durante 3 días. El día 1, se permitió que los animales se aclimataran al entorno de prueba durante 10 minutos, que era un contenedor grande equipado con una cámara superior. No se utilizó ropa de cama y el contenedor se limpió con etanol al 70 % entre cada animal. El Día 2, se permitió que los animales se aclimataran al aparato de prueba durante 10 minutos. Después de este período, el animal se retiró del contenedor y dos objetos idénticos fueron introducidos al entorno. El animal se devolvió al contenedor y se le permitió explorar durante 10 minutos más. Los objetos se limpiaron antes de cada prueba con una solución de etanol al 70 %. Después del período de entrenamiento, el roedor se retiró del entorno por un período de demora de 24 horas. El día 3, se devolvió al roedor al contenedor, que esta vez contenía solo 1 objeto familiar del día anterior y 1 objeto nuevo. Se registró la actividad del animal con los 2 objetos durante 5 minutos. La cantidad de tiempo que el roedor pasó explorando cada objeto se registró mediante observación manual y se generó un valor de índice de discriminación (DI) correspondiente al tiempo transcurrido interactuando con el objeto nuevo sobre el tiempo total de interacción. Una disminución en DI en comparación con las ratas de control indica un déficit en este tipo de memoria.

Resultados

La manipulación diaria para la alimentación forzada no afectó a la memoria de reconocimiento en ratones C57BI/6 (Figura 5). De hecho, ambos grupos muestran un patrón de preferencia por explorar más una novela frente a un objeto familiar (aunque no alcanzó la significación estadística). Los ratones tratados de forma crónica con MRX006 muestran una preferencia significativamente mayor por explorar un objeto nuevo frente a uno familiar (p<0.05) (Figura 5).

Conclusión

El tratamiento crónico con MRX006 dio como resultado que los ratones C57Bl/6 pasaran significativamente más tiempo investigando un objeto nuevo frente a un objeto familiar, lo que sugiere potenciar la memoria de reconocimiento.

Ejemplo 1g: Evaluación del comportamiento sim ilar a la ansiedad: la prueba de enterramiento de canicas Justificación

La prueba de enterramiento de canicas es un modelo útil de neofobia, ansiedad y comportamiento obsesivo compulsivo. También se utiliza para probar nuevos antidepresivos, ansiolíticos y antipsicóticos. Los ratones pretratados con agentes farmacológicos tales como los ansiolíticos muestran una disminución del comportamiento de enterramiento de canicas, en comparación con los ratones de control.

Métodos

Los ratones se colocaron individualmente en una jaula de polipropileno novedosa (35 * 28 * 18.5 cm, L * A * A), que contenía lecho estándar para roedores (madera dura) (5 cm) y 20 canicas encima (cinco filas de canicas separados regularmente 2 cm de las paredes y separadas 2 cm). Los experimentos se realizaron bajo una intensidad de luz de 1000 lux. 30 minutos después, se retiraron los ratones de estas jaulas y se puntuó el número de canicas enterradas en más de 2/3 de su superficie.

Resultados

La prueba t de Student (vehículo versus no tratado; t (20) = 0.1308; P = 0.8973) y el análisis ANOVA de una vía (F (2.38) = 0.992; P = 0.384) revelaron que ni el tratamiento crónico con MRX006 ni la alimentación forzada diaria alteraron el número de canicas enterradas lo que sugiere que no hay alteraciones en los valores de referencia similares a la ansiedad (Figura 6).

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no alteró de forma observable el comportamiento similar a la ansiedad en ratones C57BI/6 en la prueba de enterramiento de canicas.

Ejemplo 1h: Evaluación del comportamiento sim ilar a la ansiedad: la prueba del laberinto elevado en cruz

Justificación

El laberinto elevado en cruz (EPM) es una prueba ampliamente utilizada para evaluar comportamientos similares a la ansiedad en roedores. El EPM evalúa el comportamiento de ansiedad general, y los ratones menos ansiosos pasan más tiempo en los brazos abiertos del laberinto. Un aumento en la actividad del brazo abierto (duración) refleja un comportamiento anti-ansiedad.

Métodos

El montaje consistía en un laberinto de plástico gris en forma de cruz a 1 metro de altura del suelo, que comprendía dos brazos abiertos (aversivo) y dos cerrados (seguros) (paredes de 50 * 5 * 15 cm). Los experimentos ocurrieron bajo luz roja (7 lux). Los ratones se colocaron en el centro del laberinto frente a un brazo abierto (para evitar la entrada directa a un brazo cerrado) y se les permitió explorar la arena durante seis minutos. Los experimentos se grabaron en video utilizando una cámara de techo para permitir la medición de varios parámetros de comportamiento. El aparato se limpió con etanol al 70 % (vol/vol) después de cada sujeto para evitar guías olfativas del ratón anterior. El tiempo transcurrido en los brazos abiertos/cerrados, el tiempo transcurrido en el centro y el número de transiciones se analizaron manualmente. Se midió el porcentaje de tiempo empleado y el número de entradas en cada brazo para el comportamiento ansioso y la actividad locomotora, respectivamente. La entrada en un brazo se definió como todas las cuatro patas dentro del brazo. Un aumento en la actividad del brazo abierto (duración) refleja un comportamiento anti-ansiedad.

Resultados

El análisis de la prueba t de Student reveló que la alimentación forzada diaria no afectó el tiempo transcurrido en los brazos abiertos (Figura 7). El análisis ANOVA unidireccional reveló que el tratamiento crónico con MRX006 no alteró el comportamiento en el laberinto elevado en cruz en comparación con el grupo de control (Figura 7). Específicamente, el tratamiento crónico con Mrx006 no alteró el tiempo transcurrido en brazos abiertos y en brazos cerrados.

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no alteró de forma observable el comportamiento de los ratones C57Bl/6 en el laberinto elevado en cruz.

Ejemplo 1i: Evaluación de los niveles de ansiedad en la prueba de hipertermia inducida por estrés (SIH)

Justificación

El paradigma SIH es un índice de ansiedad bien caracterizado. En esta prueba, el estrés se desencadena simplemente por la medición de la temperatura rectal.

M étod os

Brevemente, los animales se alojaron individualmente 1 día antes de la prueba. La temperatura rectal se midió dos veces con un intervalo de 15 min utilizando una sonda sensible a la temperatura lubricada. Debido al estrés experimentado durante la primera medición de temperatura, la temperatura de la segunda medición (T2) es más alta que la de la primera (T1). Esta diferencia de temperatura (AT = T2 - T i) se define como la respuesta SIH. La respuesta SlH se reduce por diferentes clases de ansiolíticos.

Resultados

La manipulación diaria para la alimentación forzada aumentó AT, lo que sugiere un comportamiento similar a la ansiedad (prueba t de Student, t (19) = 2.121, P = 0.047). El tratamiento crónico con MRX006 no indujo cambios en AT en comparación con el grupo de vehículo (ANOVA unidireccional, F (2.29) = 1.215; P = 0.312) (Figura 8).

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no alteró de manera observable el cambio de temperatura inducido por estrés en la prueba de hipertermia inducida por estrés en ratones C57BI/6.

Ejemplo 1j: Análisis fis io lóg ico - niveles de oxitocina en plasma

Métodos y resultados

Los niveles de oxitocina se midieron en ratones no tratados, con vehículo y tratados con MRX006 (Figura 9). El péptido de oxitocina, que actúa en el sistema nervioso central de hombres y mujeres, es fundamental para una variedad de conductas sociales complejas, incluida la afiliación, comportamiento sexual, reconocimiento social, agresión y confianza. El radioinmunoensayo (RIA) es un método sensible para medir cantidades muy pequeñas de péptidos y metabolitos en la sangre. Las muestras se prepararon para RIA y se enviaron para la medición de oxitocina a través de la técnica RIA (RIAgnosis, Sinzing, Alemania). El tratamiento crónico con MRX006 en ratones C57Bl/6 mostró una reducción de los niveles de oxitocina (p<0.05).

Ejemplo 1k: Análisis fis io lóg ico - niveles plasmáticos de corticosterona inducidos por estrés

Métodos y resultados

La corticosterona es una de las principales hormonas de roedores liberada en respuesta al estrés. En este estudio, los cambios en el nivel de corticosterona se midieron al inicio y después de la prueba de nado forzado (exposición a estrés agudo) en ratones no tratados, con vehículo y tratados con MRX006 (Figura 10). Las mediciones de corticosterona se llevaron a cabo en diferentes puntos de tiempo, a saber, en T0 (antes de la prueba de nado forzado) y 30 min (T30), 90 min (T90) y 120 min (T120) después de la exposición a la prueba de nado forzado. Los datos mostraron un aumento significativo en los niveles de corticosterona inducidos por el estrés en el grupo de vehículo en comparación con el grupo no tratado en T30 (p <0.05). Curiosamente, se observó un aumento significativo en los niveles de corticosterona inducidos por el estrés en T30 en ratones tratados con MRX006 en comparación con el grupo de control. No se observaron cambios significativos en los otros puntos de tiempo. Estos resultados pueden sugerir una mayor sensibilidad al estrés tanto en el vehículo como en el grupo tratado con MRX006.

Ejemplo 1l: Análisis fis io lóg ico - ensayo de permeabilidad gastrointestinal in vivo

Justificación

Este procedimiento se utiliza para evaluar la motilidad intestinal in vivo. La permeabilidad intestinal se cuantificó entre los diferentes tratamientos crónicos a través de la cuantificación del isotiocianato de Fluoresceína (FITC) en sangre después de la administración oral del derivado de fluoresceína. Es un método establecido para cuantificar la permeabilidad intestinal, basado en el principio de fuga del derivado de fluoresceína administrado por vía oral a través del intestino hacia el sistema periférico.

Métodos

Los ratones de prueba se alojaron individualmente y se mantuvieron en ayunas durante la noche. A la mañana siguiente (~9 am), a los ratones se les administró FITC dextrano ((600 mg/kg) mediante alimentación forzada oral. Dos horas más tarde, se recolectaron 100 μl de muestra de sangre en tubos capilares recubiertos con heparina y se transfirieron a un eppendorf oscuro y se colocaron en hielo. Las muestras se centrifugaron a 3500 x g durante 15 minutos, se aspiró el plasma y las muestras se almacenaron a -80°D para un almacenamiento prolongado.

Se utilizó plasma sin diluir para cuantificar la concentración de FITC. Se pipetearon 25 μl de FITC por duplicado en una placa de 384 pocillos (Greiner bio one). FITC se midió con un espectrómetro Victor entre los rangos de 490 nm-520 nm. Para una curva estándar, se preparó una dilución en serie de FITC en PBS (pH 7.4). Un aumento en la absorbancia es indicativo de una disminución en la integridad de la barrera.

R e su lta d o s

Los datos mostraron una tendencia hacia un aumento en la permeabilidad intestinal con alimentaciones forzadas diarias (P = 0.051) pero no alcanzó significación (Figura 11). La permeabilidad general del intestino entre los grupos MRX006 permaneció inalterada.

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no mostró ningún efecto observable sobre la permeabilidad intestinal.

Ejemplo 1m: Análisis fis io lóg ico - peso de órganos y longitud del colon

La manipulación diaria para el tratamiento crónico y para la alimentación forzada con MRX006 no indujo cambios en el peso del ciego, el peso del bazo y el peso suprarrenal (Figura 12).

Conclusiones del modelo de ratón C57Bl/6

El tratamiento crónico con MRX006 indujo efectos similares a los antidepresivos en la prueba de nado forzado, una prueba ampliamente utilizada para cribar la actividad similar a los antidepresivos. Además, el tratamiento crónico con MRX006 potenció el comportamiento social en ratones C57Bl/6, que pasan más tiempo interactuando con ratones nuevos que con ratones familiares en la prueba de 3 cámaras, lo que indica que MRX006 revirtió las deficiencias sociales, un síntoma central de los trastornos del espectro autista. Adicionalmente, el tratamiento crónico con MRX006 tendió a reducir los niveles de congelación en la prueba de condicionamiento del miedo, lo que indica que la administración de esta cepa mejora las funciones cognitivas de la memoria y reduce la ansiedad en ratones C57Bl/6. Se requieren estudios adicionales para caracterizar los efectos de MRX006 cuando se administra de forma aguda o subcrónica sobre los niveles de oxitocina y los niveles de corticosterona. La evidencia indica que MRX006 modula la señalización del eje hipotalámico pituitario (HPA).

Por lo tanto, la administración de MRX006 provoca efectos antidepresivos, potencia la novedad social y los efectos procognitivos.

Ejemplo 2: El modelo de ratón BTBR

El modelo de ratón BTBR utiliza ratones genéticamente modificados endogámicos que muestran un fenotipo robusto de tipo autista. En esta cepa se han informado deficiencias en los comportamientos sociales, aumento de los comportamientos repetitivos y aumento de los comportamientos relacionados con la ansiedad (Meyza and Blanchard, 2017). Debido a este sólido fenotipo de comportamiento, el ratón BTBR es un modelo animal ideal para evaluar la eficacia de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de comportamientos relacionados con el autismo. El alivio de dichos síntomas por un producto bioterapéutico vivo también puede ser indicativo de la eficacia del producto bioterapéutico en el tratamiento de otras enfermedades psiquiátricas o neurológicas.

Ejemplo 2a: Materiales y métodos para el modelo de ratón BTBR Ratones

Se criaron ratones BTBR macho en casa. Los animales se alojaron en una habitación con temperatura y humedad controladas en un ciclo de oscuridad de 12 h (luces encendidas de 7:00 a 19:00 h). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/EEC, los requisitos de S.I. No 543 de 2012 y aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de University College Cork.

Cepa

MRX006: bacteria Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381.

Se proporcionó el producto bioterapéutico en solución madre de glicerol. Los productos bioterapéuticos vivos se cultivaron en la instalación en condiciones anaeróbicas.

Administración de producto bioterapéutico vivo

La dosificación con MRX006 o vehículo comenzó cuando los ratones tenían 8 semanas de edad. Estos ratones se trataron una vez al día con MRX006 o solución tampón de fosfato (PBS) durante 3 semanas antes del comienzo de la batería de comportamiento. Los ratones se trataron adicionalmente una vez al día durante la batería de comportamiento. La MRX006 (administración oral de 1X107 a 1X109 CFU) se disolvió en PBS antes de la administración.

Cronograma de administración

Los grupos de tratamiento para el estudio se muestran a continuación. El vehículo para la administración oral es PBS. La administración oral diaria se produce a través de alimentación forzada oral.

Recolección fecal

Se recolectaron muestras fecales frescas de ratones individuales cada semana hasta el final del estudio. Se colocaron al menos 20 mg de heces frescas en un tubo de microcentrífuga, se colocaron inmediatamente en hielo y luego se almacenaron a -80 °C.

Diseño experimental y métodos.

Como se ha señalado anteriormente, la dosificación con MRX006 comenzó cuando los ratones tenían 8 semanas de edad. La dosificación inicial tuvo lugar durante 3 semanas antes de los experimentos de comportamiento. La batería de comportamiento ocurrió en el siguiente orden: prueba de enterramiento de canicas en la semana 4; el laberinto elevado en cruz en la semana 5; las pruebas de campo abierto y reconocimiento de objetos nuevos, y las pruebas de transmisión social de preferencias alimenticias en la semana 6; las pruebas de olfateo de orina femenina e interacción social en la semana 7, y la prueba de nado forzado en la semana 9. Se presentó sangrado en el ensayo de motilidad gastrointestinal rojo carmín y el ensayo de permeabilidad gastrointestinal en la cola durante las semanas 8 y 9 respectivamente. Finalmente, en las semanas 10 a 11, los ratones se sacrificaron para la estimulación de esplenocitos y la medición ex vivo de FITC en el íleon y el colon.

Los efectos del tratamiento bioterapéutico vivo en el modelo BTBR sobre los comportamientos estereotipados, sociales y similares a la depresión, junto con parámetros gastrointestinales (permeabilidad y motilidad) se señalan en los siguientes ejemplos.

El Grupo 1, enumerado en la tabla anterior, representa los ratones BTBR de control, que se esperaría que mostraran fenotipos asociados con trastornos del espectro autista. Cualquier efecto del tratamiento sobre los síntomas de comportamiento de los trastornos del espectro autista se identificaría por las diferencias entre el Grupo 1 y el Grupo 2.

Diseño gráfico y análisis estadístico

Todos los gráficos se generaron en el software Graphpad Prism (versión 5). Los datos se analizaron utilizando IBM SPSS Statistic 22.0 (EEUU). La distribución de datos se analizó mediante la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov. Los datos que comparan el grupo de vehículo con el grupo MRX006 se analizaron utilizando ANOVA unidireccional y la prueba post hoc de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Si ANOVA no revelaba un efecto significativo del tratamiento, se realizaba una prueba de comparaciones por pares a priori contra el grupo de control. Los datos que no se distribuyeron normalmente se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de U no paramétrica de Mann-Whitney. P < 0.05 fue el criterio de significación estadística.

Ejemplo 2b: Evaluación de comportamientos sociales - la prueba de interacción social de tres cámaras

Justificación

La Prueba de Interacción Social de 3 Cámaras (3-CSIT) es un modelo etológicamente relevante bien validado que evalúa la interacción social entre congéneres del mismo sexo y permite lecturas de novedad social y preferencia social en ratones. La prueba permite a los ratones explorar libremente entre un objeto inanimado o ratones conespecíficos del mismo sexo.

Métodos

Los animales se colocan en un aparato rectangular dividido en tres cámaras (izquierda y derecha y una cámara central más pequeña) mediante particiones con pequeñas aberturas circulares que permiten un fácil acceso a todos los compartimentos. La prueba se compone de tres ensayos secuenciales de 10 minutos: (1) habituación (se permite que el animal de prueba explore las tres cámaras vacías); (2) sociabilidad (un animal desconocido se coloca en una jaula de alambre de malla interna en las cámaras izquierda o derecha); (3) preferencia por la novedad social (se coloca un animal nuevo en la jaula interior previamente vacía de la cámara, frente al animal ahora familiar). Los animales no tratados no deberían tener preferencia por ninguna de las cámaras en la fase de habituación, preferencia por el ratón en la fase de sociabilidad y preferencia por el ratón nuevo en la fase de novedad social. Un aumento en la relación de discriminación sugeriría un aumento en el comportamiento social. Todos los animales tienen la misma edad y sexo, y cada cámara se limpia y se reviste con lecho nuevo después de cada ensayo de 30 minutos. Para cada uno de los tres estadios, el comportamiento es registrado por una cámara de video montada sobre el aparato.

R e su lta d o s

Para evaluar la sociabilidad, la prueba t de Student dentro de los grupos reveló una mayor preferencia por un nuevo ratón conespecífico (CS) en relación con un objeto para el grupo MRX006 [t(22) = 5.281; P<0.0001] (Figura 13A). Para evaluar la novedad social, la prueba t de Student dentro de los grupos reveló una mayor preferencia por un conespecífico novedoso solo en el grupo de vehículo [t(22) = 3.452; p<0.001]. El ANOVA del tiempo de interacción con el nuevo coespecífico no reveló un efecto del tratamiento [F(3,47) = 2.492; P = 0.43; Figura 13B]. Sin embargo, una prueba de comparaciones por pares a priori reveló que el tratamiento con MRX006 (t(22) = 0.7497; P = 0.4614) disminuyó el tiempo de interacción con un nuevo conespecífico en comparación con el grupo de vehículo. El ANOVA del porcentaje de tiempo transcurrido investigando el nuevo coespecífico reveló un efecto del tratamiento [F(3,47) = 2.942; P = 0.0433; Figura 13C]. Las comparaciones post-hoc revelaron que el tratamiento con MRX006 disminuyó el porcentaje de tiempo investigando un nuevo conespecífico (p<0.05).

Análisis ANOVA de dos vías [Objeto/Conespecífico (CS): [F(1,47) = 21.164; p<0.0001; Tratamiento: F(1,47) = 0.56; P = 0.815; Objeto/CS x Tratamiento: F(1,47) = 5.414; P = 0.025] seguido de un análisis post hoc reveló que los ratones tratados con MRX006 pasaron más tiempo investigando el conespecífico frente al objeto (p<0.01; Figura 13D). Análisis ANOVA de dos vías [Familiar vs novedoso: F(1,47) = 3.454; P = 0.070; Tratamiento: F(1,47) = 0.360; P = 0.552; HN x Tratamiento: F(1.47) = 8.627; P = 0.005] seguido de comparaciones post hoc revelaron que los ratones tratados con MRX006 pasaron significativamente menos tiempo a investigar un ratón nuevo frente a uno familiar (p<0.05; Figura 13E). Por el contrario, los ratones del vehículo pasaron más tiempo investigando el conespecífico nuevo frente al conespecífico familiar (p<0.05; Figura 13E). El análisis porcentual reveló que los ratones tratados con MRX006 pasaron menos tiempo interactuando con el nuevo conespecífico en comparación con el grupo de vehículo (t = 2.480 df = 22; P = 0.0213; Figura 13F).

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 reduce la novedad social y disminuye la cognición social de ratones BTBR en la prueba de tres cámaras.

Ejemplo 2c: Evaluación de comportamientos sociales - prueba de intrusión forzada

Justificación

Este procedimiento evalúa el comportamiento de interacción social entre roedores. Al colocar un ratón intruso en la jaula del ratón residente, se puede evaluar la interacción social y el comportamiento agresivo.

Métodos

Cada sesión consistió en colocar un ratón intruso en la jaula de un ratón residente durante un período de 10 minutos. Los experimentos se grabaron en video utilizando una cámara de techo para permitir la medición de varios parámetros de comportamiento. Se registró la cantidad de tiempo que los animales pasaron interactuando.

Resultados

El ANOVA del tiempo de interacción no reveló un efecto del tratamiento [F(3,45) = 2.327; P = 0.088; Figura 14]. De manera similar, la prueba de comparaciones por pares a priori reveló que el tratamiento con MRX006 (t = 1.425 df = 22; P = 0.1682) no afectó el comportamiento de interacción social en comparación con el grupo de vehículo.

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no influye en el comportamiento social de ratones BTBR en la prueba de interacción social.

Ejemplo 2d: Evaluación de comportamientos estereotipados - la prueba de enterramiento de canicas

Justificación

Esta prueba evalúa el comportamiento repetitivo, compulsivo y ansioso. Un mayor número de canicas enterradas es indicativo de mayores conductas ansiosas o estereotipadas. De hecho, los ratones tratados con agentes farmacológicos como los ansiolíticos muestran una disminución del comportamiento de enterramiento de canicas, en comparación con los ratones de control.

Métodos

Los ratones se colocaron individualmente en una nueva jaula de polipropileno (35 x 28 * 18.5 cm, L * A * A), que contenía lecho estándar para roedores (madera dura) (5 cm) y 20 canicas encima (cinco filas de canicas separados regularmente 2 cm de las paredes y separados 2 cm). Los experimentos se realizaron bajo una intensidad de luz de 1000 lux. 30 minutos después, se retiraron los ratones de estas jaulas y se puntuó el número de canicas enterradas en más de 2/3 de su superficie.

Resultados

No hubo efecto del tratamiento según lo determinado por ANOVA sobre el número de canicas enterradas [F(3,45) = 1.64; P = 0.193]. Sin embargo, la prueba de comparaciones por pares a priori reveló que MRX006 (t = 2.276 df--21, p<0.05) disminuyó el número de canicas enterradas (Figura 15).

Conclusiones

El tratamiento con MRX006 reduce el comportamiento repetitivo en ratones BTBR en la prueba de enterramiento de canicas.

Ejemplo 2e: Evaluación de comportamientos estereotipados - la prueba de acicalamiento

Justificación

Esta prueba se utiliza como un índice para el comportamiento estereotipado y repetitivo. Un aumento en el tiempo transcurrido en el acicalamiento es indicativo de un aumento en el comportamiento estereotipado o repetitivo.

Métodos

Los ratones se colocaron individualmente en un vaso de precipitados de vidrio novedoso (500 ml), que se cubrió con una tapa de plexiglás. Los experimentos se realizaron bajo una intensidad de luz de 60 lux. Los experimentos se grabaron en video utilizando una cámara de mano unida a un soporte de trípode. El comportamiento de acicalamiento se registró durante 20 minutos.

Resultados

Hubo un efecto significativo de productos bioterapéuticos vivos según lo determinado por ANOVA [F(3,47) = 4.174; P = 0.011] sobre la actividad de acicalamiento. Las comparaciones post-hoc revelaron que el tratamiento con MRX006 redujo significativamente la cantidad de tiempo transcurrido en el acicalamiento en relación con el grupo de vehículo (p<0.05) (Figura 16). De manera similar, la prueba de comparaciones por pares a priori reveló que MRX006 (t = 2.895 df = 22, p <0.01) disminuyó el tiempo transcurrido en el acicalamiento en comparación con el grupo de vehículo. Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 reduce los comportamientos repetitivos en ratones BTBR en la prueba de acicalamiento.

Ejemplo 2f: evaluación de comportamientos similares a la ansiedad: el laberinto elevado en cruz Justificación

El laberinto elevado en cruz (EPM) es una prueba ampliamente utilizada para evaluar comportamientos similares a la ansiedad en roedores. La EPM evalúa el comportamiento de ansiedad general, y los ratones menos ansiosos pasan más tiempo en los brazos abiertos del laberinto. Un aumento en la actividad del brazo abierto (duración) refleja un comportamiento anti-ansiedad.

Métodos

El montaje consistía en un laberinto de plástico gris en forma de cruz a 1 metro de altura del suelo, que comprendía dos brazos abiertos (aversivo) y dos cerrados (seguros) (paredes de 50 * 5 * 15 cm). Los experimentos ocurrieron bajo luz roja (7 lux). Los ratones se colocaron en el centro del laberinto frente a un brazo abierto (para evitar la entrada directa a un brazo cerrado) y se les permitió explorar la arena durante cinco minutos. Los experimentos se grabaron en video utilizando una cámara de techo para permitir la medición de varios parámetros de comportamiento. Se midió el porcentaje de tiempo empleado y el número de entradas en cada brazo para el comportamiento ansioso y la actividad locomotora, respectivamente. La entrada en un brazo se definió como las cuatro patas dentro del brazo. Resultados

El análisis ANOVA no reveló efectos del tratamiento bioterapéutico en vivo sobre el porcentaje de tiempo transcurrido en brazos cerrados [F(3.47) = 0.885; P = 0.457; Figura 17A). El análisis no paramétrico de Kruskal Wallis del porcentaje de tiempo transcurrido en los brazos abiertos no reveló ningún efecto del tratamiento [chi-cuadrado = 1.220; df = 3; P = 0.748; Figura 17B]. El ANOVA del número de entradas en los brazos cerrados no reveló ningún efecto del tratamiento [F(3,44) = 1.82; P = 0.159; Figura 17C]. El análisis no paramétrico de Kruskal Wallis del número de entradas en los brazos abiertos no reveló ningún efecto del tratamiento [chi-cuadrado = 2.045; df = 3; P = 0.563; Figura 17D].

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no tiene efecto sobre el comportamiento similar a la ansiedad en ratones BTBR en el laberinto elevado en cruz.

Ejemplo 2g: Evaluación de comportamientos similares a la ansiedad - el campo abierto

Justificación

El campo abierto se utiliza para evaluar la respuesta de la exposición a un nuevo entorno estresante y actividad locomotora. Los ratones no tratados naturalmente pasan la mayor parte de su tiempo junto a las paredes de la arena, ya que están menos expuestos que el centro de la arena. Un aumento en la duración del tiempo transcurrido en el centro representa una disminución en el comportamiento similar a la ansiedad.

Métodos

Los ratones se colocaron individualmente en un campo abierto (43 * 35 * 25, L * A * A) y se les permitió explorar durante 10 minutos. Los experimentos ocurrieron bajo una intensidad de luz de 60 lux. Los experimentos se grabaron en video utilizando una cámara de techo para permitir la medición de varios parámetros de comportamiento utilizando el software Ethovision. La distancia recorrida se puntuó para la actividad locomotora.

Resultados

El ANOVA de la distancia recorrida no reveló un efecto del tratamiento sobre la actividad locomotora en el campo abierto [F(3,47) = 0.317; P = 0.813; Figura 18A y Figura 18D]. El ANOVA del tiempo transcurrido en la zona exterior no reveló un efecto del tratamiento [F(3,46) = 2.217; P = 0.100; Figura 18B]. Sin embargo, la prueba de comparaciones por pares a priori reveló que el tratamiento con MRX006 (t = 2.791 df = 21; p<0.05; Figura 18E) disminuyó el tiempo transcurrido en la zona exterior del campo abierto. El ANOVA del tiempo transcurrido en la zona interior no reveló un efecto del tratamiento [F(3,46) = 2.217; P = 0.100; Figura 18C]. Sin embargo, la prueba de comparaciones por pares a priori reveló que el tratamiento con MRX006 (t = 2.791 df = 21; p<0.05; Figura 18F) aumentó el tiempo transcurrido en la zona interior del campo abierto.

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 reduce el comportamiento similar a la ansiedad en ratones BTBR en la prueba de campo abierto.

Ejemplo 2h: Evaluación del comportamiento sim ilar a depresión - la prueba de nado forzado

Justificación

La prueba de nado forzado (FST) es el paradigma experimental más utilizado para evaluar la actividad antidepresiva. Los animales no tratados mostrarán un comportamiento de escape en forma de natación, escalada y buceo antes de adoptar una postura flotante inmóvil. La duración de la inmovilidad es indicativa de desesperación conductual. Los fármacos antidepresivos disminuyen el tiempo que pasan inmóviles en esta prueba.

Métodos

Se obliga a los ratones a nadar durante 6 min en un cilindro de vidrio (24 * 21 cm) lleno de agua del grifo a 23-25 °C hasta una profundidad de 17 cm. La FST se grabó en video desde una cámara de techo. El parámetro de comportamiento puntuado es la inmovilidad durante los últimos 4 min de la prueba de 6 min.

Resultados

El ANOVA del tiempo de inmovilidad no reveló un efecto del tratamiento [F(3,46) = 1.309; P = 0.284; Figura 19]. Conclusiones

El tratamiento crónico con MXR006 no influye en el tiempo de inmovilidad de los ratones BTBR en la prueba de nado forzado.

Ejemplo 2i: Evaluación del comportamiento sim ilar a depresión: la prueba de olfateo de orina femenina Justificación

La prueba de olfateo de orina femenina (FUST) se utiliza para evaluar el comportamiento de tipo anhedónico en roedores. Una reducción en el tiempo de olfateo sugiere evitación social/anhedonia, mientras que un aumento representa un aumento en el comportamiento social/comportamiento hedónico.

Métodos

Los ratones experimentales se alojan individualmente una semana antes de la prueba. Durante la prueba, se coloca un aplicador con punta de algodón, sumergido en agua esterilizada, en la jaula de origen y se permite que los ratones olfateen/investiguen durante tres minutos. Después de esta prueba de tres minutos, se retira el aplicador con punta de algodón. 45 minutos más tarde, se sumerge un nuevo aplicador con punta de algodón en orina femenina (recolectada de ratones hembra de la misma cepa que se encuentran en el estadio de celo de su ciclo) y se coloca en la jaula. Se permite a los ratones olfatear/investigar esto durante otros tres minutos. Se registra la cantidad de tiempo transcurrido olfateando el agua y la orina.

Resultados

Para el grupo de vehículo, la prueba t de Student reveló un aumento significativo en el tiempo transcurrido olfateando orina en relación con el tiempo transcurrido olfateando agua [t(16) = 2.611; P = 0.0189; Figura 20A]. Para la exposición al agua, el ANOVA del tiempo transcurrido olfateando no reveló un efecto del tratamiento en el grupo de agua [F(3,35) = 0.875; P = 0.464]. Para la exposición a la orina, el ANOVA del tiempo transcurrido olfateando no reveló un efecto del tratamiento [F(3,34) = 2.153; P = 0.114]. Sin embargo, una comparación a priori reveló que el tratamiento crónico con MRX006 (t = 3.602 df = 16; P = 0.0024) aumentó el tiempo transcurrido olfateando orina en comparación con el grupo de vehículo.

Análisis ANOVA de dos vías [Orina: [F(1,36) = 44.118; p<0.0001]; Tratamiento: [F(1,36) = 12.335; P = 0.001]; Orina x tratamiento: [F(1,36) = 9.236; P = 0.005] seguido de pruebas post hoc revelaron que los ratones tratados con MRX006 pasaban más tiempo olfateando orina en comparación con el grupo de vehículo (* p<0.01; Figura 20B). Es importante destacar que los ratones del vehículo pasaron más tiempo olfateando orina que agua como se esperaba (#p<0.05). Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 aumenta significativamente el tiempo transcurrido olfateando orina femenina en ratones BTBR en la prueba de olfateo de orina femenina.

Ejemplo 2j: Evaluación del comportamiento sim ilar a depresión - la prueba de reconocim iento de objetos nuevos

Justificación

El protocolo utilizado se adaptó de Bevins and Besheer (2006), y se utilizó para probar la memoria de reconocimiento. La mejora de la memoria es un reflejo de la reducción del comportamiento similar a depresión.

Métodos

El protocolo utilizado se adaptó de Bevins y Besheer (2006). Se realizó durante 3 días. El día 1, se permitió que los animales se aclimataran al entorno de prueba durante 10 minutos, que era un contenedor grande equipado con una cámara superior. No se utilizó lecho y el contenedor se limpió con etanol al 70 % entre cada animal. El día 2, se permitió que los animales se aclimataran al aparato de prueba durante 10 minutos. Después de este período, el animal se retiró del contenedor y dos objetos idénticos fueron introducidos al entorno. El animal se devolvió al contenedor y se le permitió explorar durante 10 minutos más. Los objetos se limpiaron antes de cada prueba con una solución de etanol al 70 %. Después del período de entrenamiento, el roedor se retiró del entorno por un período de demora de 24 horas. El día 3, se devolvió al roedor al contenedor, que esta vez contenía solo 1 objeto familiar del día anterior y 1 objeto nuevo. Se registró la actividad del animal con los 2 objetos durante 5 minutos. La cantidad de tiempo que el roedor pasó explorando cada objeto se registró mediante observación manual y se generó un valor de índice de discriminación (DI) correspondiente al tiempo transcurrido interactuando con el objeto nuevo sobre el tiempo total de interacción. Una disminución en DI en comparación con las ratas de control indica un déficit en este tipo de memoria. Resultados

La prueba t de Student dentro de los grupos no reveló una preferencia secundaria por el objeto A o B en el primer día de la prueba de reconocimiento de objetos nuevos (Figura 21A). La prueba t de Student dentro de los grupos no reveló una preferencia por el objeto novedoso en relación con el objeto familiar. Para el objeto novedoso, el ANOVA del tiempo de interacción no reveló un efecto del tratamiento [F(3,46) = 0.122; P = 0.946; Figura 21B]. Además, el análisis ANo Va no reveló ningún efecto del tratamiento sobre el índice de discriminación [F(3,47) = 0.535; P = 0.661; Figura 21C]. Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no tiene efecto sobre el comportamiento cognitivo en ratones BTBR en la nueva prueba de reconocimiento de objetos.

Ejemplo 2k: Ensayo de permeabilidad gastrointestinal in vivo

Justificación

Este procedimiento se utiliza para evaluar la motilidad intestinal in vivo.

Métodos

Los ratones de prueba se alojaron individualmente y se mantuvieron en ayunas durante la noche. A la mañana siguiente (~9 am), a los ratones se les administró FITC dextrano (600 mg/kg) mediante alimentación forzada oral. Dos horas más tarde, se recolectaron 100 |jl de muestra de sangre en tubos capilares recubiertos con heparina y se transfirieron a un eppendorf oscuro y se colocaron en hielo. Las muestras se centrifugaron a 3500 x g durante 15 minutos, se aspiró el plasma y las muestras se almacenaron a -80°D para un almacenamiento prolongado.

Se utilizó plasma sin diluir para cuantificar la concentración de FITC. Se pipetearon 25 j l de FITC por duplicado en una placa de 384 pocillos (Greiner bio one). FITC se midió con un espectrómetro Victor entre los rangos de 490 nm-520 nm. Para una curva estándar, se preparó una dilución en serie de FITC en PBS (pH 7.4). Un aumento en la absorbancia es indicativo de una disminución en la integridad de la barrera.

Resultados

La función de barrera intestinal se evaluó mediante la administración oral del compuesto fluorescente, isotiocianato de fluoresceína (FITC), seguido de posteriores sangrados de la cola para evaluar los niveles de FITC en plasma. El ANOVA de las concentraciones de FITC no reveló un efecto significativo del tratamiento [F(3,47) = 1.366; P = 0.266; Figura 23].

Conclusión

El tratamiento crónico con MRX006 no influyó en la permeabilidad intestinal en ratones BTBR.

Ejemplo 2l - Ensayo de permeabilidad gastrointestinal ex vivo

Justificación y métodos

La permeabilidad del íleon y el colon se evaluó ex vivo utilizando cámaras de Ussing. Se extirparon el colon y el íleon de los ratones y se recolectaron en tubos de 5 ml que contenían tampón de Kreb. Tanto el colon como el íleon se cortaron a lo largo de la línea mesentérica y se montaron sobre el aparato de cámara de Ussing. Para el colon, se agregaron 4 ml de solución de Krebs que contenía D-glucosa en ambos lados del aparato de cámara de Ussing. Para el íleon, se agregaron 4 ml de solución de Krebs que contenía D-manitol en el lado de la mucosa, mientras que se agregó un volumen igual de Krebs con D-glucosa en el lado de la serosa. Las cámaras se oxigenaron con gas carbógeno (O₂ al 95 % y CO₂ al 5 %) y se mantuvieron a 37 °C para mantener la integridad del tejido. Se agregaron 2.5 mg/ml de FITC-dextrano a la cámara mucosa. Se tomaron muestras de la cámara serosa en los puntos de tiempo 0 min (valor de referencia), 60 min, 90 min y 120 min. Se pipetearon 25 j l de FITC por duplicado en una placa de 384 pocillos (Greiner bio one). FITC se midió con un espectrómetro Victor entre los rangos de 490 nm-520 nm. Para una curva estándar, se preparó una dilución en serie de FITC en PBS (pH 7.4).

Resultados

En el ensayo de permeabilidad intestinal ex vivo, el ANOVA de medidas repetidas reveló un efecto del tiempo tanto para el colon [F(3,87) = 64.197; P<0.0001] y el íleon [F(3,87) = 34.572; p<0.0001]. El ANOVA de medidas repetidas no reveló un efecto del tratamiento con respecto al tiempo para el colon [F(9,87) = 1.184; P = 0.316; Figura 23a ] o íleon [F(9,87) = 0.810; P = 0.609; Figura 22B].

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no influye en la permeabilidad del colon o el íleon.

Ejemplo 2m: Ensayo de motilidad gastrointestinal in vivo

Justificación

Este procedimiento se utiliza para evaluar la motilidad intestinal in vivo.

Métodos

Los ratones se alojan individualmente antes del comienzo de la prueba. Los ratones se alimentaron de forma forzada por vía oral con un tinte coloreado no absorbible (rojo carmín). Se registró el tiempo hasta la excreción del primer bolo fecal coloreado y se utilizó como índice de la motilidad peristáltica de todo el intestino.

Resultados

Se administró a los ratones un tinte coloreado no absorbible (rojo carmín) mediante alimentación forzada oral. Se registró el tiempo hasta la excreción del primer bolo fecal coloreado y se utilizó como índice de la motilidad peristáltica de todo el intestino. El ANOVA del tiempo de motilidad no reveló ningún efecto del tratamiento [F(3,47) = 2.097; P = 0.114]. Sin embargo, una prueba de comparaciones por pares a priori reveló que los ratones tratados con MRX006 (t = 2,270 df = 22, p<0.05; Figura 24) muestran una motilidad intestinal alterada en comparación con el grupo de vehículo. Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 mostró motilidad intestinal reducida en ratones BTBR.

Ejemplo 2n - Determinación de corticosterona circulante inducida por estrés

Justificación

La exposición a la FST da como resultado una fuerte activación del eje HPA, con un aumento en los niveles de la hormona del estrés, la corticosterona. Las concentraciones de corticosterona en plasma tomadas antes y después de la exposición a la FST se utilizaron como un índice de la activación inducida por estrés del eje hipotalámico pituitario suprarrenal (HPA).

Métodos

El día de la FST, los ratones se retiraron de su jaula y se trasladaron a una sala quirúrgica donde se tomó una muestra de sangre basal. Se utilizó una hoja de bisturí para quitar la punta (1 mm) de la cola. La sangre se recolectó utilizando un tubo capilar heparinizado y luego se transfirió a un tubo de microcentrífuga. También se tomaron muestras de sangre 30, 60, 90 y 120 minutos después de la exposición a la FST para evaluar los niveles máximos y de recuperación de corticosterona. La sangre se mantuvo en hielo y luego se centrifugó a 2,500 x g durante 15 minutos a 4 °C. La corticosterona plasmática se evaluó mediante ELISA, siguiendo las instrucciones del proveedor (ENZO Corticosterona ELISA, ADI-900-097, Enzo Life Sciences).

Resultados

El ANOVA de medidas repetidas reveló un efecto significativo del tiempo [F(4,164) = 127.127; p<0.0001; Figura 25]. Las comparaciones post-hoc revelaron un aumento significativo en la corticosterona circulante en el punto de tiempo de 30 minutos para todos los grupos. El ANOVA de medidas repetidas no reveló un efecto significativo del tratamiento con respecto al tiempo [F(12,164) = 0.561; P = 0.871].

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no influye en los niveles de corticosterona inducidos por estrés en ratones BTBR expuestos a la prueba de nado forzado.

Ejemplo 2o - Peso de los órganos y longitud del colon

El ANOVA del peso de los órganos como porcentaje del peso corporal no reveló un efecto del tratamiento para las glándulas suprarrenales [F(3,44) = 1.480; P = 0.234; Figura 26A}, bazo [F(3,43) = 0.779; P = 0.513; Figura 26B] o ciego [F(3,44) = 0.441; P = 0.725; Figura 26C]. El ANOVA de la longitud del colon no reveló un efecto del tratamiento [F(3,46) = 0.826; P = 0.487; Figura 26D].

Conclusiones

El tratamiento con MRX006 no influye en los marcadores anatómicos selectivos.

Ejemplo 2p - Monitorización del peso

Se evaluaron los pesos corporales de los animales una vez por semana durante la duración del experimento para determinar si alguna de las cepas bacterianas estaba influyendo en este parámetro particular. El ANOVA de medidas repetidas reveló un efecto significativo del tiempo [F(11,484)= 111.217; P<0.0001; Figura 27]. El ANOVA de medidas repetidas no reveló un efecto del tratamiento con respecto al tiempo [F(33,484) = 0.581; P = 0.971].

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no influye en el peso corporal en ratones BTBR.

Conclusiones del modelo de ratón BTBR

Los principales hallazgos de este estudio fueron que el tratamiento con MRX006 atenuó los comportamientos estereotipados y relacionados con la ansiedad. Específicamente, MRX006 redujo la cantidad de canicas enterradas en la prueba de enterramiento de canicas y también redujo la cantidad de tiempo que los animales pasaron en acicalarse. Más aún, el tratamiento con este producto bioterapéutico vivo aumentó la cantidad de tiempo transcurrido en el centro del campo abierto, lo que se corresponde con una disminución en la cantidad de tiempo transcurrido en la periferia, lo que es indicativo de un efecto de tipo ansiolítico. Sin embargo, no se observaron efectos sobre el comportamiento similar a la ansiedad en la prueba del laberinto elevado en cruz. La capacidad de MRX006 para mejorar los comportamientos estereotipados y relacionados con la ansiedad en ratones BTBR es prometedora e indica que puede ser una terapia eficaz.

MRX006 también aumentó el tiempo transcurrido olfateando orina de ratones hembra. La prueba de olfateo de orina femenina se diseñó originalmente como una prueba para evaluar el comportamiento de tipo hedónico en roedores, con aumentos en el tiempo transcurrido olfateando orina interpretados como un aumento en el comportamiento de búsqueda de recompensas (Malkesman et al., 2010). Dado que no se informa que los ratones BTBR muestren un fenotipo similar al depresivo, es poco probable que el aumento observado en el tiempo transcurrido olfateando orina en los experimentos actuales después del tratamiento con MRX006 refleje una mejora en el comportamiento hedónico. Más bien, puede ser que MRX006 esté aumentando la capacidad de estos ratones para reconocer y procesar información social (es decir, feromonas femeninas). Sin embargo, no se observaron diferencias en el comportamiento social entre los grupos en la prueba de 3 cámaras y la prueba de interacción social. El tratamiento con MRX006 redujo la cantidad de tiempo que los ratones pasaron investigando un nuevo ratón conespecífico en relación con un conespecífico familiar.

Con la excepción de la motilidad intestinal, el producto bioterapéutico vivo evaluado en el presente estudio no afectó a los diversos parámetros fisiológicos medidos. Por ejemplo, no se observó ningún efecto del producto bioterapéutico vivo en la secreción de corticosterona inducida por estrés, el peso anatómico, la permeabilidad intestinal o el peso corporal total. En el ensayo de motilidad intestinal, el tratamiento con MRX006 prolongó el tiempo necesario para que apareciera el primer gránulo rojo después de la alimentación forzada oral con colorante rojo carmín. Dichos resultados sugieren que MRX006 prolonga la motilidad intestinal.

Ejemplo 3 - El modelo de ratón de activación inmunitaria materna (MIA)

El modelo de ratón MIA utiliza una exposición inmunitaria ambiental en ratones preñados para desencadenar los síntomas centrales del trastorno del espectro autista en la descendencia. Los ratones MIA normalmente muestran un comportamiento estereotipado (como se muestra en las pruebas de acicalamiento y enterramiento de canicas) y deficiencias en la comunicación social (como se muestra en el juego social, la interacción social de 3 cámaras y la transmisión social de las pruebas de preferencia alimenticia). La descendencia muestra los tres síntomas principales del autismo (comunicación reducida, sociabilidad reducida y comportamiento repetitivo o estereotipado aumentado) y, por lo tanto, proporciona un modelo adecuado para determinar si la administración de un producto terapéutico puede aliviar los fenotipos de comportamiento asociados con los trastornos del espectro autista y, de hecho, en una serie de otros trastornos neurológicos. Está bien establecido que la alteración de los fenotipos de comportamiento en modelos animales es indicativa de una intervención potencialmente relevante desde el punto de vista clínico, independientemente de la comprensión del mecanismo biológico o fisiológico subyacente (Crawley 2012).

Ejemplo 3a - Materiales y métodos para el modelo de ratón MIA

Ratones

El protocolo de activación inmunitaria materna (modelo de ratón ASD ambiental) se llevó a cabo como se describió previamente (Hsiao, McBride et al. 2013). Brevemente, se inyectaron ratones C57BL/6N preñados (ENVIGO, Reino Unido) i.p. sobre E12.5 con solución salina o 20 mg/kg de poli(I:C) de acuerdo con los métodos descritos en (Hsiao, McBride et al. 2013). Estos ratones se enumeran en los experimentos a continuación como ratones MIA. Los ratones macho comenzaron a comportarse a las 8 semanas de edad. Los animales se alojaron en una habitación con temperatura y humedad controladas en un ciclo de oscuridad de 12 h (luces encendidas de 7:00 a 19:00 h). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/EEC, los requisitos de S.I. No 543 de 2012 y aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de University College Cork.

Cepa

MRX006: bacteria Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCINM 42381.

Se cultivaron productos bioterapéuticos vivos en la instalación en condiciones anaeróbicas.

Administración de producto bioterapéutico vivo

La dosificación con MRX006 o vehículo comenzó cuando los ratones tenían 8 semanas de edad. Estos ratones se trataron una vez al día con MRX006 o solución de tampón de fosfato (PBS) durante 3 semanas antes del comienzo de la batería de comportamiento. Los ratones se trataron adicionalmente una vez al día durante 5 semanas durante la batería de comportamiento. El MRX006 (administración oral de 1X107 a 1X109 CFU) se disolvió en PBS antes de la administración.

Cronograma de administración

Los grupos de tratamiento para el estudio se muestran a continuación. El vehículo para la administración oral es PBS. La administración oral diaria se produce mediante alimentación forzada oral.

Recolección fecal

Se recolectaron muestras fecales frescas de ratones individuales cada semana hasta el final del estudio. Se colocaron al menos 20 mg de heces frescas en un tubo de microcentrífuga, se colocaron inmediatamente en hielo y luego se almacenaron a -80 °C.

Diseño experimental y métodos.

Como se ha señalado anteriormente, la dosificación con MRX006 o vehículo comenzó cuando los ratones tenían 8 semanas de edad. La batería de comportamiento se realizó en el siguiente orden: el campo abierto en la semana 4, la prueba de enterramiento de canicas en la semana 5; transmisión social de la prueba de preferencia alimenticia en la semana 6, y la prueba de olfateo de orina femenina en la semana 7. Se produjo sangrado en el ensayo de motilidad gastrointestinal rojo carmín y el ensayo de permeabilidad gastrointestinal en la cola durante las semanas 7 y 8 respectivamente. Finalmente, en la semana 9, los ratones se sacrificaron para la estimulación de esplenocitos y la medición ex vivo de FITC en el íleon y el colon.

Los efectos del tratamiento bioterapéutico vivo en el modelo MIA sobre los comportamientos estereotipados, sociales y similares a la depresión, junto con parámetros gastrointestinales (permeabilidad y motilidad) se señalan en los siguientes ejemplos.

El grupo 2, enumerado en la tabla anterior, representa los ratones de activación inmunitaria materna, cuyas madres fueron tratadas con poli (I:C) durante el embarazo. Se esperaría que estos ratones mostraran fenotipos asociados con trastornos del espectro autista en comparación con los ratones de control (Grupo 1); este control garantiza que la administración de poli (I:C) provocando los síntomas de comportamiento esperados en la descendencia del ratón materno. Cualquier efecto del tratamiento sobre los síntomas de comportamiento de los trastornos del espectro autista se identificaría por las diferencias entre el Grupo 2 y el Grupo 3.

Diseño gráfico y análisis estadístico

Todos los gráficos se generan en el software Graphpad Prism (versión 5). Los datos se analizaron utilizando IBM SPSS Statistic 22.0 (EEUU). La distribución de datos se analizó utilizando la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov. Los datos que comparan el grupo de vehículo frente al grupo MRX006 se analizan utilizando ANOVA unidireccional y la prueba posthoc de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Si el ANOVA no reveló un efecto significativo del tratamiento, se realizó una prueba de comparaciones por pares a priori contra el grupo de control. Los datos que no se distribuyeron normalmente se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de U no paramétrica de Mann-Whitney. P < 0.05 fue el criterio de significación estadística.

Ejemplo 3b: Evaluación de comportamientos estereotipados - la prueba de enterramiento de canicas

Justificación

Esta prueba evalúa el comportamiento repetitivo, compulsivo y ansioso. Un mayor número de canicas enterradas es indicativo de mayores conductas ansiosas o estereotipadas. De hecho, los ratones tratados con agentes farmacológicos tales como los ansiolíticos muestran una disminución del comportamiento de enterramiento de canicas, en comparación con los ratones de control.

Métodos

Los ratones se colocaron individualmente en una jaula de polipropileno nueva (35 ^ 28 ^ 18.5 cm, L * A * A), que contenía lecho estándar para roedores (madera dura) (5 cm) y 20 canicas encima (cinco filas de canicas separadas regularmente a 2 cm de las paredes y separadas 2 cm). Los experimentos se realizaron bajo una intensidad de luz de 1000 lux. 30 minutos después, se retiraron los ratones de estas jaulas y se puntuó el número de canicas enterradas en más de 2/3 de su superficie.

Resultados

El análisis de la prueba t de Student entre el grupo de control y el grupo MIA de vehículo reveló que los ratones con MIA de vehículo enterraron más canicas en comparación con el grupo de control (t(21) = 2.751, P = 0.011; Figura 28). El ANOVA del número de canicas enterradas reveló un efecto significativo del tratamiento [F(3,48) = 18.39; p<0.001]. Las comparaciones post-hoc revelaron que el tratamiento crónico con MRX006 resultó ser el número de canicas enterradas (p<0.01; Figura 28).

Conclusiones

El grupo MIA de vehículo mostró significativamente más canicas enterradas que el grupo de control, lo que indica que el modelo MIA se desencadenó con síntomas similares al trastorno del espectro autista en los ratones. El tratamiento crónico con MRX006 reduce el comportamiento repetitivo, compulsivo y ansioso en ratones MIA.

Ejemplo 3c: Evaluación de comportamientos sociales - transm isión social de preferencia alimenticia

Justificación

La transmisión social de preferencia alimenticia es una prueba relevante de la memoria olfativa que se utiliza en ratones para evaluar el comportamiento social. En esta prueba, los ratones observadores interactúan con un ratón demostrador que ha comido alimentos nuevos recientemente. Cuando a los ratones observadores se les presenta la posibilidad de elegir entre la comida consumida por el demostrador y algún otro alimento novedoso, los ratones observadores deberían preferir la comida consumida por el demostrador. La preferencia alimenticia reducida indicaría una sociabilidad reducida.

Métodos

Esta prueba se realizó como se describió previamente (Desbonnet, Clarke et al. 2015). Brevemente, 18 horas antes de la prueba, los ratones fueron privados de comida, mientras que el agua estaba disponible ad libitum. Las opciones de alimentos consistieron en 1 % de canela molida o 2 % de cacao en polvo hecho con comida para ratones molida. Se seleccionó aleatoriamente un ratón demostrador de cada jaula y se marcó la cola con un marcador azul para permitir la identificación durante las interacciones sociales posteriores. Se pesaron los recipientes de alimentos del demostrador antes y después de las sesiones de muestreo de 1 hora. Se requería un mínimo de 0.2 g de alimentos consumidos para su inclusión en la prueba. Los ratones demostradores se volvieron a colocar en sus respectivas jaulas de origen durante un período de interacción de 30 minutos con sus compañeros de jaula. Posteriormente, los compañeros de jaula se evaluaron individualmente para determinar la preferencia de alimentos guiados o nuevos alimentos. Los recipientes se pesaron inmediatamente antes y después de cada sesión de elección. A continuación, los ratones observados se volvieron a colocar en sus respectivas jaulas de origen y la sesión de elección se repitió 24 horas más tarde. Los ratones de prueba deben oler la canela o el cacao del ratón demostrador como guía social, y elegir preferentemente el mismo alimento cuando se les da a elegir entre los dos.

Resultados

La prueba t de Student del porcentaje de preferencia alimenticia no reveló diferencias entre la evaluación de los grupos de MIA de control y de vehículo a las 0 horas (t(22) = 0.3325, P = 0.7427) o a las 24 horas (t(21) = 0.2878, P = 0.7763). El ANOVA de la preferencia de alimentos guiados del demostrador no reveló diferencias significativas cuando los observadores se expusieron a la elección de alimentos en la hora 0 [F(3,48) = 1.49, P = 0.228; Figura 29A] o evaluación de 24 horas [F(3,47) = 2.66, P = 0.059; Figura 29B]. El tratamiento con MRX006 no alteró la preferencia por alimentos guiados en la transmisión social de la prueba de preferencia alimenticia.

Conclusiones

El grupo de vehículo MIA no mostró transmisión social de preferencia alimenticia reducida (el vehículo MIA no mostró alteración en la preferencia alimenticia en comparación con el control), lo que sugiere que el modelo MIA no ha desencadenado el fenotipo de sociabilidad reducida. El tratamiento crónico con MRX006 no tuvo efecto sobre la preferencia alimenticia. Sin embargo, como el modelo MIA parece no haber provocado un fenotipo de sociabilidad reducido en esta prueba, no es posible determinar los efectos del tratamiento crónico con MRX006 sobre la sociabilidad en la transmisión social de la prueba de preferencia alimenticia.

Ejemplo 3d: Evaluación del comportamiento sim ilar a la ansiedad: campo abierto

Justificación

El campo abierto se utiliza para evaluar la respuesta de la exposición a un nuevo entorno estresante y actividad locomotora. Los ratones no tratados, naturalmente, pasan la mayor parte de su tiempo junto a las paredes de la arena, ya que están menos expuestos que el centro de la arena. Un aumento en la duración del tiempo transcurrido en el centro representa una disminución en el comportamiento similar a la ansiedad.

Métodos

Los ratones se colocaron individualmente en un campo abierto (43 x 35 * 25, L * a * a) y se les permitió explorar durante 10 minutos. Los experimentos ocurrieron bajo una intensidad de luz de 60 lux. Los experimentos se grabaron en video utilizando una cámara de techo para permitir la medición de varios parámetros de comportamiento utilizando el software Ethovision. La distancia recorrida se puntuó para la actividad locomotora.

Resultados

La prueba t de Student no reveló diferencias significativas en la distancia total recorrida entre los grupos MIAde control y vehículo (t(22) = 0.9357, P = 0.3596). El ANOVA de la distancia total recorrida reveló un efecto significativo del tratamiento [F(3,47) = 4.36, P = 0.003, Figura 30A]. Las comparaciones post hoc revelaron que el tratamiento con MRX006 redujo la distancia total recorrida en relación con los animales tratados con vehículo (p<0.05). La prueba t de Student reveló un aumento significativo en el tiempo transcurrido en la zona exterior del campo abierto por el grupo MIA de vehículo en relación con el grupo de control (t (21) = 3.337, P = 0.003). El ANOVA del tiempo transcurrido en la zona exterior del campo abierto no reveló ningún efecto del tratamiento [F(3,47) = 0.093, Figura 30B]. La prueba t de Student reveló una disminución significativa en el tiempo transcurrido en la zona interior por los grupos MIA de vehículo en relación con los ratones de control (t(21) = 3.337, P = 0.003). El ANOVA del tiempo transcurrido en la zona interior no reveló ningún efecto del tratamiento [F(3,47) = 0.93, P = 0.96, Figura 30C].

Conclusiones

El tratamiento con MRX006 disminuye la distancia recorrida por los ratones MIA en el campo abierto. Por lo tanto, MRX006 puede atenuar la actividad locomotora inducida por estrés provocada por la exposición al campo abierto. Ejemplo 3e: Evaluación del comportamiento sim ilar a depresión: la prueba de olfateo de orina femenina Justificación

La prueba de olfateo de orina femenina (FUST) se utiliza para evaluar el comportamiento de tipo anhedónico en roedores. Una reducción en el tiempo de olfateo sugiere evitación social/anhedonia, mientras que un aumento representa un aumento en el comportamiento social/comportamiento hedónico.

Métodos

Los ratones experimentales se alojan individualmente una semana antes de la prueba. Durante la prueba, se coloca un aplicador con punta de algodón, sumergido en agua esterilizada, en la jaula de origen y se permite que los ratones olfateen/investiguen durante tres minutos. Después de esta prueba de tres minutos, se retira el aplicador con punta de algodón. 45 minutos más tarde, se sumerge un nuevo aplicador con punta de algodón en orina femenina (recolectada de ratones hembra de la misma cepa que se encuentran en el estadio de celo de su ciclo) y se coloca en la jaula. Se permite a los ratones olfatear/investigar esto durante tres minutos adicionales. Se registra la cantidad de tiempo transcurrido olfateando el agua y la orina.

Resultados

La prueba U de Mann-Whitney reveló que los grupos tanto de control [valor U de Mann-Whitney = 7, P = 0.0123] como de MIA de vehículo [valor U de Mann-Whitney = 57; P = 0.0201] pasaron más tiempo olfateando orina que agua (Figura 31). Para el tiempo transcurrido olfateando la orina, el análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis no reveló un efecto del tratamiento [df = 4, P = 0.3293].

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX006 no influye en el comportamiento de tipo depresivo en ratones MIA en la prueba de olfateo de orina femenina.

Ejemplo 3f: Ensayo de motilidad intestinal in vivo

Justificación

Se ha informado que el modelo MIA conduce a cambios en la función de barrera intestinal. Por lo tanto, era importante determinar si el tratamiento crónico con el producto bioterapéutico altera la motilidad intestinal.

Métodos

Los ratones se alojan individualmente antes del comienzo de la prueba. Los ratones se alimentaron de forma forzada por vía oral con un tinte coloreado no absorbible (rojo carmín). Se registró el tiempo hasta la excreción del primer bolo fecal coloreado y se utilizó como índice de la motilidad peristáltica de todo el intestino.

Resultados

El análisis de la prueba t de Student reveló que el grupo MIA de vehículo no muestra una motilidad intestinal alterada (se detectan gránulos rojos en menos tiempo) en comparación con el grupo de control (t(22) = 0.006, P = 0.9950). El An OVA del tiempo de motilidad no reveló ningún efecto del tratamiento [F(3,50) = 0.99; P = 0.404, Figura 32].

Conclusiones

En este experimento, el grupo MIA de vehículo no mostró motilidad intestinal alterada en comparación con el control. El tratamiento crónico con MRX006 no afectó la motilidad intestinal en comparación con los grupos MIA de control o de vehículo.

Ejemplo 3g - Peso de los órganos y longitud del colon

Para la longitud del colon, la prueba t de Student no reveló ninguna diferencia significativa entre los grupos MIA de control o de vehículo (t(21) = 1.26, P = 0.26). El ANOVA de longitud de colon no reveló efecto del tratamiento [F(3,49) = 0.69, P = 0.57; Figura 33A]. Para el peso del ciego como porcentaje del peso corporal, la prueba t de Student no reveló una diferencia significativa entre los grupos MIA de control o de vehículo (t(22) = 0.56, P = 0.58). El ANOVA no reveló ningún efecto significativo del tratamiento sobre el peso del ciego [F(3,48) = 0.84, P = 0.48, Figura 33B]. Para el peso del bazo como porcentaje del peso corporal, la prueba t de Student no reveló una diferencia significativa entre los grupos MIA de control o de vehículo (t(22) = 0.64, P = 0.53). El ANOVA no reveló ningún efecto significativo del tratamiento sobre el peso del bazo [F(3,48) = 2.25, P = 0.09, Figura 33C).

Conclusiones

El tratamiento con MRX006 no influye en la longitud del colon ni en el peso de los órganos en el modelo de autismo en ratones MIA.

Discusión de los resultados del modelo de ratón MIA

El tratamiento crónico con MRX006 fue capaz de revertir el fenotipo observado en la prueba de enterramiento de canicas en ratones MIA. El tratamiento crónico con MRX006 pudo reducir el número de canicas enterradas, lo que sugiere una reducción en el comportamiento estereotipado. Adicionalmente, el tratamiento crónico con MRX006 disminuyó la distancia recorrida sin tener ningún efecto sobre el tiempo transcurrido en las zonas interior y exterior en el campo abierto. En consecuencia, el tratamiento con MRX006 puede atenuar la actividad locomotora inducida por estrés provocada por la exposición al campo abierto. No se observó ningún efecto significativo del tratamiento en las pruebas de transmisión social de alimentos y olfateo de orina femenina, lo que sugiere que no hay efectos directamente observables en el comportamiento social y depresivo en el modelo de ratón MIA. El producto bioterapéutico vivo probado no afectó la motilidad o la permeabilidad intestinal. Por lo tanto, el modelo MIA ha demostrado ser útil para evaluar el comportamiento estereotipado, repetitivo y ansioso, pero no recreó una serie de otros síntomas asociados con los trastornos del espectro autista. No obstante, los resultados muestran que el tratamiento crónico con MRX006 puede tener un impacto positivo en los síntomas de los trastornos del espectro autista.

Conclusiones generales sobre MRX006 en el tratamiento de los trastornos del espectro autista

Se mostró que MRX006 es eficaz en el tratamiento de comportamientos estereotipados y similares a la ansiedad en el modelo de ratón BTBR y MIA. Se espera que las terapias que revierten los fenotipos conductuales y biológicos en modelos de autismo en ratones sean eficaces contra la enfermedad humana.

Las Directrices de la EMA sobre el desarrollo clínico de productos medicinales para el tratamiento del trastorno del espectro autista establecen que, debido a la heterogeneidad de las enfermedades, es posible que no sea posible lograr un efecto significativo en todos los síntomas centrales con un solo compuesto. y, por lo tanto, la eficacia a corto plazo se debe demostrar en al menos un síntoma central. El producto bioterapéutico vivo MRX006 ha demostrado un tratamiento eficaz de al menos un síntoma central del trastorno del espectro autista, por lo que se espera que él y las cepas relacionadas de Blautia y B. stercoris sean eficaces contra la enfermedad humana. De manera similar, otros trastornos o afecciones del sistema nervioso central muestran una patología compleja con múltiples síntomas diferentes y tienen pocos tratamientos aprobados. Por lo tanto, se entiende que un tratamiento eficaz no necesita tratar todos los síntomas de un trastorno o afección del sistema nervioso central. Un tratamiento se consideraría terapéuticamente útil si tratara uno de los síntomas asociados con un trastorno o afección del sistema nervioso central.

Ejemplo 4 - Medición de citocinas circulantes en ratones BTBR

Métodos y resultados

El plasma sanguíneo se recolectó de la sangre del tronco el día de los sacrificios de cada animal al final de los experimentos. Las citocinas circulantes se evaluaron en muestras de plasma de los grupos vehículo y MRX006 utilizando un sistema multiplex de electroquimioluminescencia disponible comercialmente (MSD, GaIthersberg, MSD, EE. UU.). Se ensayaron las siguientes citoquinas para: IL-1p, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, IL-23, TNF-a e IFN-y. El análisis múltiplex reveló que los niveles de IL-1p, IL-4, IL-17A, IL-21 e IL-23 estaban por debajo de los límites de detección tanto en los animales tratados con vehículo como MRX006. Para el TNF-a circulante, la prueba t de Student no reveló un efecto significativo del tratamiento con MRX006 (t(21) = 0.4264, P = 0.6742, Figura 34A). Para el IFN-circulante, la prueba de Student no reveló un efecto significativo del tratamiento con Mrx006 (t(17) = 0.4103, P = 0.6867, Figura 34B). Para la IL-6 circulante, la prueba t de Student no reveló un efecto significativo del tratamiento con MRX006 (t(11) = 0.020, P = 0.98, Figura 34C). Para la IL-10 circulante, el tratamiento crónico con MRX006 provoca un aumento no significativo de los niveles de IL-10 (t(13) = 1.396, P = 0.1861, Figura 34D).

Conclusiones

Si bien no hubo un efecto significativo de MRX006 en términos de regulación de las concentraciones de citoquinas circulantes, hubo una clara tendencia no significativa de un aumento en la IL-10 circulante después del tratamiento con el producto bioterapéutico vivo. Dichos resultados sugieren que MRX006 posee propiedades inmunorreguladoras y puede aumentar la producción de citocinas antiinflamatorias. Si bien el ensayo multiplex se realizó en muestras de plasma que contenían concentraciones basales de citoquinas no estimuladas, será interesante evaluar si MRX006 es capaz de modular la IL-10 y otras citoquinas en condiciones estimuladas.

Ejemplo 5: Evaluación de los efectos del tratam iento subcrónico con MRX006 sobre los niveles de oxitocina central y periférica en ratones C57Bl/6

Las cepas bacterianas se prepararon y administraron como se señaló en los Ejemplos anteriores. Los ratones C57BL/6 se trataron con el producto bioterapéutico vivo durante seis días en 7 grupos de tratamiento experimental cada uno con 10-12 ratones. Posteriormente, se diseccionó el hipotálamo de los ratones y se detectaron los niveles de oxitocina en el hipotálamo mediante radioinmunoensayo (RIA). Además, se detectaron mediante RIA los niveles de oxitocina en el plasma. Adicionalmente, los niveles de receptores de oxitocina, interleucinas y otros marcadores inflamatorios y hormonas vasopresina se detectaron por RIA y otros métodos analíticos.

Ejemplo 6 - Prueba de estabilidad

Una composición descrita en el presente documento que contiene al menos una cepa bacteriana descrita en el presente documento se almacena en un recipiente sellado a 25 °C o 4 °C y el recipiente se coloca en una atmósfera que tiene 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 % o 95 % de humedad relativa. Después de 1 mes, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 1 año, 1.5 años, 2 años, 2.5 años o 3 años, deberá quedar al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la cepa bacteriana medida en unidades formadoras de colonias determinadas por protocolos estándar. Ejemplo 7 - Adm inistración de otro producto bioterapéutico vivo en el modelo de ratón MIA

Ejemplo 7a - Materiales y métodos para el modelo de ratón MIA

Los ratones, la administración del producto bioterapéutico vivo y la recolección de heces utilizadas en este Ejemplo son idénticas a las utilizadas en el Ejemplo 3 anterior.

Cepa

MRX008: Blautia wexlerae, bacteria depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486.

Cronograma de administración

Los grupos de tratamiento para el estudio se muestran a continuación. El vehículo para la administración oral es PBS. La administración oral diaria se produce mediante alimentación forzada oral.

Diseño experimental y métodos.

La dosificación con MRX008 o vehículo comenzó cuando los ratones tenían 8 semanas de edad. La batería de comportamiento ocurrió en el siguiente orden: prueba de enterramiento de canicas en la semana 5; transmisión social de la preferencia alimenticia en la semana 6 y la prueba de nado forzado en la semana 8. Se produjo sangrado en el ensayo de motilidad gastrointestinal rojo carmín y el ensayo de permeabilidad gastrointestinal en la cola durante las semanas 7 y 8 respectivamente. Finalmente, en la semana 9, los ratones se sacrificaron para la estimulación de esplenocitos y la medición ex vivo de FITC en el íleon y el colon.

Los efectos del tratamiento bioterapéutico vivo en el modelo MIA sobre los comportamientos estereotipados, sociales y similares a la depresión, junto con parámetros gastrointestinales (permeabilidad y motilidad) se señalan en los siguientes ejemplos.

El grupo 2, enumerado en la tabla anterior, representa los ratones de activación inmunitaria materna, cuyas madres fueron tratadas con poli (I:C) durante el embarazo. Se esperaría que estos ratones mostraran fenotipos asociados con trastornos del espectro autista en comparación con los ratones de control (Grupo 1); este control garantiza que la administración de poli (I: C) provocó los síntomas de comportamiento esperados en la descendencia del ratón materno. Cualquier efecto del tratamiento sobre los síntomas de comportamiento de los trastornos del espectro autista se identificaría por las diferencias entre el Grupo 2 y el Grupo 3.

Diseño gráfico y análisis estadístico

Todos los gráficos se generaron en el software Graphpad Prism (versión 5). Los datos se analizaron utilizando IBM SPSS Statistic 22.0 (EEUU). La distribución de datos se analizó utilizando la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smimov. Los datos que compararon el grupo de vehículo frente al grupo MRX008 se analizaron utilizando ANOVA unidireccional y la prueba post hoc de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Si el ANOVA no revelaba un efecto significativo del tratamiento, se realizaba una prueba de comparaciones por pares a priori contra el grupo de control. Los datos que no se distribuyeron normalmente se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de U no paramétrica de Mann-Whitney. P < 0.05 fue el criterio de significación estadística.

Ejemplo 7b: Evaluación de comportamientos estereotipados - la prueba de enterramiento de canicas Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 3b anterior.

Resultados

El análisis de la prueba t de Student entre el grupo de control y el grupo MIA de vehículo reveló que los ratones con MIA de vehículo enterraron más canicas en comparación con el grupo de control (t(19) = 3.00, P = 0.007; Figura 35). El ANOVA del número de canicas enterradas reveló un efecto del tratamiento [F(3,42) = 6.37, P = 0.001]. El tratamiento crónico con MRX008 mostró una reducción en el número de canicas enterradas en relación con el grupo MIA de vehículo.

Conclusiones

El grupo MIA de vehículo mostró significativamente más canicas enterradas que el grupo de control, lo que indica que el modelo MIA desencadenó con éxito síntomas similares al trastorno del espectro autista en los ratones. Existe una tendencia hacia una reducción del comportamiento repetitivo, compulsivo y ansioso en ratones MIA con tratamiento crónico con MRX008.

Ejemplo 7c: Evaluación de comportamientos sociales - transm isión social de preferencias alimenticias Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 3c anterior.

Resultados

El ANOVA de la preferencia alimenticia guiada del demostrador no reveló diferencias significativas cuando los observadores se expusieron a la elección de alimentos inmediatamente después de la interacción con el demostrador (T0) (F(3,34) = 0.38, P = 0.77; Figura 36A) o 24 horas más tarde (F (3,34) = 0.85, P = 0.48; Figura 36B), independientemente de la administración de vehículo o MRX008.

Conclusiones

El grupo MIA de vehículo no mostró transmisión social de preferencia alimenticia reducida (el vehículo MIA no mostró alteración en la preferencia alimenticia en comparación con el control), lo que sugiere que el modelo MIA no ha desencadenado el fenotipo de sociabilidad reducida. De acuerdo con lo anterior, no es posible determinar los efectos del tratamiento crónico con MRX008 sobre la sociabilidad utilizando el modelo de ratón MIA.

Ejemplo 7d: Evaluación de comportamientos similares a depresión - la prueba de nado forzado Justificación

La prueba de nado forzado (FST) es el paradigma experimental más utilizado para evaluar la actividad antidepresiva ([lvii]). En esta prueba, los ratones se ven obligados a nadar durante 6 min y el parámetro de comportamiento puntuado es la inmovilidad durante los últimos 4 min de la prueba de 6 min. Los animales no tratados mostrarán un comportamiento de escape en forma de natación, escalada y buceo antes de adoptar una postura flotante inmóvil. La duración de la inmovilidad es indicativa de desesperación conductual. Los fármacos antidepresivos disminuyen el tiempo que pasan inmóviles en esta prueba.

Métodos

Se obliga a los ratones a nadar durante 6 min en un cilindro de vidrio (24 * 21 cm) lleno de agua del grifo a 23-25 °C hasta una profundidad de 17 cm. La FST se grabó en video desde una cámara de techo. El parámetro de comportamiento puntuado es la inmovilidad durante los últimos 4 min de la prueba de 6 min.

Resultados

El análisis de la prueba t de Student no reveló diferencias significativas sobre el tiempo de inmovilidad entre el grupo de control y el grupo MIA de vehículo (t = 0.8968 df = 20; 0.3805). El ANOVA del tiempo de inmovilidad no reveló un efecto del tratamiento con MRX008, aunque parece haber una ligera tendencia hacia una reducción en el tiempo que pasan tras la administración de MRX008 [F(3,42) = 1.803; P = 0.1625; Figura 37].

Conclusiones

El grupo MIA de vehículo no mostró un aumento del tiempo de inmovilidad en la prueba de nado forzado (el vehículo MIA no mostró alteración en el tiempo de inmovilidad en comparación con el control), lo que sugiere que el modelo MIA no ha aumentado los síntomas de tipo depresivo. De acuerdo con lo anterior, no es posible determinar los efectos del tratamiento crónico con MRX008 sobre el comportamiento de tipo depresivo utilizando el modelo de ratón MIA. Ejemplo 7e: Ensayo de permeabilidad intestinal in vivo

Justificación

Se ha informado que el modelo MIA conduce a cambios en la función de barrera intestinal. Por lo tanto, era importante determinar si el tratamiento crónico con el producto bioterapéutico afecta la permeabilidad intestinal.

Métodos

Los ratones de prueba se enjaularon individualmente y se les quitó la comida durante la noche. Al día siguiente (alrededor de las 9 a. m.) se administró a los ratones mediante alimentación forzada oral FITC dextrano (isotiocianato de flurosceína; PM: 4 kDa, Sigma; concentración: 600 mg/kg por animal de 80 mg/ml de FITC en PBS (pH 7.4)). Dos horas después de la administración de FITC, se recolectaron 100 μl de muestra de sangre, de sangrados de cola, en tubos capilares revestidos con heparina y se transfirieron a ámbar eppendorf y se colocaron en hielo. Las muestras se centrifugaron 3500 x g durante 15 minutos, se aspiró el plasma y las muestras se almacenaron a -80°D para un almacenamiento prolongado.

Se utilizó plasma sin diluir para cuantificar la concentración de FITC. Se pipetearon 25 μl de FITC por duplicado en una placa de 384 pocillos (Greiner bio one). FITC se midió con un espectrómetro Victor entre los rangos de 490 nm-520 nm. Para una curva estándar, se preparó una dilución en serie de FITC en PBS (pH 7.4).

Además, después del sacrificio de los ratones en la semana 9, se realizan mediciones ex vivo de FITC en el íleon y el colon.

Resultados

El análisis de la prueba t de Student no reveló diferencias entre el grupo de control y el grupo de vehículo MIA(t(20) = 0.56, P = 0.58; Figura 38). El ANOVA de las concentraciones de FITC no reveló un efecto significativo del tratamiento [F(3,39) = 2.23, P = 0.08].

Conclusiones

En este experimento, el grupo MIA de vehículo no mostró una permeabilidad intestinal alterada (el vehículo MIA no mostró alteración en la permeabilidad en comparación con el control). Adicionalmente, el tratamiento crónico con MRX008 no afectó la permeabilidad intestinal en ratones MIA.

Ejemplo 7f: Ensayo de motilidad intestinal in vivo

Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 3f anterior.

Resultados

El análisis de la prueba t de Student reveló que el grupo MIA de vehículo exhibió una mayor motilidad intestinal (se detectó un gránulo rojo en menos tiempo) en comparación con el grupo de control (t(19) = 3.00, P = 0.007). El ANOVA del tiempo de motilidad no reveló ningún efecto del tratamiento [F(3,38) = 0.74, P = 0.54; Figura 39].

Conclusiones

En este experimento, el grupo MIA de vehículo mostró una mayor motilidad intestinal en comparación con el control. El tratamiento crónico con MRX008 no afectó la motilidad intestinal en comparación con el control.

Ejemplo 8 - Adm inistración de otro producto bioterapéutico vivo en el modelo de ratón BTBR

Ejemplo 8a - Materiales y métodos para el modelo de ratón BTBR

Los ratones, la administración del producto bioterapéutico vivo y la recolección de heces utilizadas en este Ejemplo son idénticas a las utilizadas en el Ejemplo 2 anterior.

Cepa

MRX008: Blautia wexlerae, bacteria depositada bajo el número de acceso NCINM 42486.

Cronograma de administración

Los grupos de tratamiento para el estudio se muestran a continuación. El vehículo para la administración oral es PBS. La administración oral diaria se produce mediante alimentación forzada oral.

Diseño experimental y métodos

Como se ha señalado anteriormente, la dosificación con MRX008 comenzó cuando los ratones tenían 8 semanas de edad. La dosificación inicial tuvo lugar durante 3 semanas antes de los experimentos de comportamiento que incluían pruebas de sociabilidad, ansiedad, estereopatía y cognición. La batería de comportamiento ocurrió en el siguiente orden: prueba de enterramiento de canicas en la semana 4; el laberinto elevado en cruz en la semana 5; las pruebas de campo abierto y reconocimiento de objetos nuevos, y las pruebas de transmisión social de preferencias alimenticias en la semana 6; las pruebas de olfateo de orina femenina e interacción social en la semana 7, y la prueba de nado forzado en la semana 9. Se produjo sangrado en el ensayo de motilidad gastrointestinal rojo carmín y el ensayo de permeabilidad gastrointestinal en la cola durante las semanas 8 y 9 respectivamente. Finalmente, en las semanas 10 a 11, los ratones se sacrificaron para la estimulación de esplenocitos y la medición ex vivo de FITC en el íleon y el colon.

Los efectos del tratamiento bioterapéutico vivo en el modelo BTBR sobre los comportamientos estereotipados, sociales y similares a la depresión, junto con parámetros gastrointestinales (permeabilidad y motilidad) se señalan en los siguientes ejemplos.

El Grupo 1, enumerado en la tabla anterior, representa los ratones BTBR de control, que se esperaría que mostraran fenotipos asociados con trastornos del espectro autista. Cualquier efecto del tratamiento sobre los síntomas de comportamiento de los trastornos del espectro autista se identificaría por las diferencias entre el Grupo 1 y el Grupo 2.

Diseño gráfico y análisis estadístico

Todos los gráficos se generaron en el software Graphpad Prism (versión 5). Los datos se analizaron utilizando IBM SPSS Statistic 22.0 (EEUU). La distribución de datos se analizó utilizando la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov. Los datos que compararon el grupo de vehículo frente al grupo MRX008 se analizaron utilizando ANOVA unidireccional y la prueba post hoc de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher. Si ANOVA no revelaba un efecto significativo del tratamiento, se realizaba una prueba de comparaciones por pares a priori contra el grupo de control. Los datos que no se distribuyeron normalmente se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de U no paramétrica de Mann-Whitney. P < 0.05 fue el criterio de significación estadística.

Ejemplo 8b: Evaluación de comportamientos sociales - transm isión social de preferencia alimenticia

Justificación

La transmisión social de preferencia alimenticia es una prueba relevante de la memoria olfativa que se utiliza en ratones para evaluar el comportamiento social. En esta prueba, los ratones observadores interactúan con un ratón demostrador que ha comido alimentos nuevo recientemente. Cuando a los ratones observadores se les presenta la posibilidad de elegir entre la comida consumida por el demostrador y algún otro alimento novedoso, los ratones observadores deberían preferir la comida consumida por el demostrador. La preferencia alimenticia reducida indicaría una sociabilidad reducida.

Métodos

Esta prueba se realizó como se describió previamente (Desbonnet, Clarke et al. 2015). Brevemente, 18 horas antes de la prueba, los ratones fueron privados de comida, mientras que el agua estaba disponible ad libitum. Las opciones de alimentos consistieron en 1 % de canela molida o 2 % de cacao en polvo hecho con comida para ratones molida. Se seleccionó aleatoriamente un ratón demostrador de cada jaula y se marcó la cola con un marcador azul para permitir la identificación durante las interacciones sociales posteriores. Se pesaron los recipientes de alimentos del demostrador antes y después de las sesiones de muestreo de 1 hora. Se requería un mínimo de 0.2 g de alimentos consumidos para su inclusión en la prueba. Los ratones demostradores se volvieron a colocar en sus respectivas jaulas de origen durante un período de interacción de 30 minutos con sus compañeros de jaula. Posteriormente, los compañeros de jaula se probaron individualmente para determinar la preferencia de alimentos guiados o nuevos alimentos. Los recipientes se pesaron inmediatamente antes y después de cada sesión de elección. A continuación, los ratones observados se volvieron a colocar en sus respectivas jaulas de origen y la sesión de elección se repitió 24 horas más tarde. Los ratones de prueba deben oler la canela o el cacao del ratón demostrador como pista guía, y elegir preferentemente el mismo alimento cuando se les da a elegir entre los dos.

Resultados

El ANOVA de la preferencia alimenticia guiada del demostrador no reveló diferencias significativas cuando los observadores se expusieron a la elección de alimentos inmediatamente después de la interacción con el demostrador (T0) (F(3,36) = 1.123; P = 0.354; Figura 40A) o 24 horas más tarde (F (3,38) = 0.138; P = 0.936; Figura 40B).

Conclusiones

El tratamiento con MRX008 no afectó la sociabilidad de los ratones BTBR en la prueba de transmisión social de preferencia alimenticia.

Ejemplo 8c: Evaluación de comportamientos sociales - prueba de intrusión forzada

Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2c anterior.

Resultados

El ANOVA del tiempo de interacción no reveló un efecto del tratamiento [F(3,36) = 1.905; P = 0.1462; Figura 41]. Conclusiones

El tratamiento con MRX008 no influyó en el comportamiento social de los ratones BTBR en la prueba de interacción social.

Ejemplo 8d: Evaluación de comportamientos estereotipados - la prueba de enterramiento de canicas Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2d anterior.

Resultados

El ANOVA del número de canicas enterradas no reveló un efecto significativo del tratamiento [F(3,39) = 0.835; P = 0.483; Figura 42], aunque el tratamiento crónico con MRX008 muestra una tendencia hacia una reducción en el número de canicas enterradas por ratones BTBR.

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX008 no afectó significativamente el comportamiento repetitivo, compulsivo y ansioso en ratones BTBR, aunque muestra una tendencia hacia niveles reducidos de este comportamiento.

Ejemplo 8e: Evaluación del comportamiento sim ilar a la ansiedad: el laberinto elevado en cruz Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2f anterior.

Resultados

El ANOVA del porcentaje de tiempo transcurrido en brazos cerrados no reveló ningún efecto del tratamiento [F(3,39) = 0.556; P = 0.647; Figura 43A]. Los ratones tratados con MRX008 parecen pasar más tiempo con los brazos abiertos en comparación con el grupo de vehículo (Figura 43B). De acuerdo con esto, el tratamiento crónico con MRX008 parece aumentar el número de entradas en los brazos abiertos en comparación con el grupo de vehículo (Figura 43D). El ANOVA del número de entradas en los brazos cerrados no reveló ningún efecto del tratamiento [F(3,39) = 0.556; P = 0.647; Figura 43C].

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX008 muestra tendencias no significativas hacia el comportamiento contra la ansiedad en ratones BTBR en el laberinto elevado en cruz.

Ejemplo 8f: Evaluación del comportamiento sim ilar a la ansiedad - campo abierto

Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2g anterior.

Resultados

El ANOVA de la distancia recorrida no reveló un efecto significativo del tratamiento sobre la actividad locomotora en el campo abierto [F(3,37) = 1.325; P = 0.282, Figura 44A], aunque MRX008 pareció reducir la distancia recorrida, lo que sugiere una reducción de la actividad locomotora inducida por estrés. El ANOVA del tiempo transcurrido en la zona exterior no reveló un efecto del tratamiento [F(3,37) = 1.598; P = 0.208; Figura 44B]. Una comparación por pares a priori reveló que el tratamiento con Mrx008 disminuyó el tiempo transcurrido en la zona interior [t = 2.388 df = 17; P = 0.0288; Figura 44C].

Conclusiones

El tratamiento crónico con MRX008 muestra una tendencia hacia una reducción en la actividad locomotora inducida por estrés, pero mostró una reducción del tiempo en la zona interna que implica un comportamiento similar a la ansiedad.

Ejemplo 8g: Evaluación del comportamiento sim ilar a depresión - la prueba de nado forzado

Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2h anterior.

Resultados

El ANOVA del tiempo de inmovilidad no reveló un efecto del tratamiento sobre el tiempo de inmovilidad de los ratones BTBR en la FST [F(3,38) = 1.879; P = 0.151; Figura 45 ], aunque el tratamiento crónico con MRX008 sí provoca una tendencia a la reducción del tiempo que pasan inmóviles sugiriendo una conducta antidepresiva.

Conclusiones

El tratamiento con MRX008 reduce de manera no significativa el tiempo de inmovilidad de los ratones BTBR en la prueba de nado forzado, lo que implica un efecto antidepresivo del tratamiento.

Ejemplo 8h: Evaluación del comportamiento sim ilar a depresión - la prueba de olfateo de orina femenina Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2i anterior.

Resultados

Para el grupo de vehículo, la prueba U de Mann-Whitney reveló un aumento significativo en el tiempo transcurrido olfateando orina en relación con el tiempo transcurrido olfateando agua [t = 2.976 df = 18; P = 0.0081]. Para la exposición al agua, el análisis no paramétrico de Kruskal Wallis del tiempo transcurrido olfateando no reveló un efecto del tratamiento en el grupo de agua [Chi cuadrado: 6.352; df = 3; P = 0.096]. Para la exposición a la orina, el análisis no paramétrico de Kruskal Wallis del tiempo transcurrido olfateando no reveló un efecto del tratamiento [Chi cuadrado: 3.639; df = 3; P = 0.303, Figura 46].

Conclusiones

El tratamiento con MRX008 no tuvo efecto sobre el tiempo transcurrido olfateando orina en ratones BTBR.

Ejemplo 8i: Ensayo de motilidad gastrointestinal in vivo

Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2m anterior.

Resultados

El ANOVA del tiempo de motilidad no reveló ningún efecto del tratamiento [F(3,39) = 2.072; P = 0.121; Figura 47]. Conclusiones

El tratamiento con MRX008 no influyó en la motilidad intestinal.

Ejemplo 8j - Peso de los órganos y longitud del colon

El ANOVA del peso de los órganos como porcentaje del peso corporal no reveló un efecto del tratamiento para las glándulas suprarrenales [F(3,37) = 0.208; P = 0.890; Figura 48A], bazo F(3.35) = 0.629; P = 0.601; Figura 48B] o ciego [F(3,37) = 0.883; P = 0.460; Figura 48C]. El ANOVAde la longitud del colon no reveló un efecto del tratamiento [F(3,37) = 5.635; P = 0.003; Figura 48D].

Conclusiones generales con respecto a MRX008 en el tratamiento de los trastornos del espectro autista

Los experimentos divulgados en el presente documento muestran evidencia de que la administración de otra especie de Blautia (a saber, MRX008 de Blautia wexlerae) puede ser aplicable para el tratamiento de trastornos del neurodesarrollo y neuropsiquiátricos en modelos de ratones. En particular, el tratamiento con MRX008 mostró tendencias hacia posibles efectos antiansiolíticos, así como efectos antidepresivos en las pruebas de laberinto elevado en cruz y nado forzado, respectivamente, en el modelo de ratón BTBR, aunque el ensayo de campo abierto sugirió que MRX008 no afectó comportamiento similar a la ansiedad. Además, el MRX008 puede reducir el comportamiento estereotipado, repetitivo y ansioso, como lo muestra la prueba de enterramiento de canicas en los modelos de ratón MIA y BTBR. El tratamiento con el producto bioterapéutico MRX008 no alteró los diversos parámetros fisiológicos medidos en estos estudios.

Las Directrices de la EMA sobre el desarrollo clínico de medicamentos para el tratamiento del trastorno del espectro autista establecen que, debido a la heterogeneidad de las enfermedades, es posible que no sea posible lograr un efecto significativo sobretodos los síntomas principales con un solo compuesto. y, por lo tanto, la eficacia a corto plazo se debe demostrar en al menos un síntoma central. El producto bioterapéutico vivo MRX008 ha demostrado un tratamiento eficaz de al menos un síntoma central del trastorno del espectro autista, por lo que se espera que él y las cepas relacionadas de Blautia y B. wexlerae sean eficaces contra la enfermedad humana. De manera similar, otros trastornos o afecciones del sistema nervioso central muestran una patología compleja con múltiples síntomas diferentes y tienen pocos tratamientos aprobados. Por lo tanto, se entiende que un tratamiento eficaz no necesita tratar todos los síntomas de un trastorno o afección del sistema nervioso central. Un tratamiento se consideraría terapéuticamente útil si tratara uno de los síntomas asociados con un trastorno o afección del sistema nervioso central.

Ejemplo 9: Evaluación de los efectos del tratam iento subcrónico con MRX008 sobre los niveles de oxitocina central y periférica en ratones C57Bl/6

Las cepas bacterianas se prepararon y administraron como se señaló en los Ejemplos anteriores. Los ratones C57BL/6 se trataron con el producto bioterapéutico vivo durante seis días en 7 grupos de tratamiento experimental cada uno con 10-12 ratones. Posteriormente, se diseccionó el hipotálamo de los ratones y se detectaron los niveles de oxitocina en el hipotálamo mediante radioinmunoensayo (RIA). Además, se detectaron mediante RIA los niveles de oxitocina en el plasma. Adicionalmente, los niveles de receptores de oxitocina, interleucinas y otros marcadores inflamatorios y hormonas vasopresina se detectaron por RIA y otros métodos analíticos.

Ejemplo 10: Evaluación de los efectos del tratam iento crónico con MRX006 sobre los niveles de expresión génica de oxitocina, vasopresina y sus respectivos receptores en el hipotálamo y la amígdala de ratones BTBR

El tratamiento crónico con MRX006 aumenta el nivel de expresión génica de oxitocina y vasopresina en el hipotálamo de ratones BTBR (véanse las Figuras 49C y D). El efecto sobre los niveles de receptores de oxitocina y vasopresina en este tejido se muestra en las Figuras 49Ay B.

Se muestran los efectos del tratamiento crónico con MRX006 sobre el nivel de expresión génica de oxitocina, vasopresina o sus respectivos receptores en la amígdala de ratones BTBR en la Figura 50.

Por lo tanto, el tratamiento crónico con MRX006 aumenta la expresión de vasopresina y oxitocina en el hipotálamo de ratones BTBR. Este sorprendente resultado proporciona una correlación entre los cambios químicos en el cerebro y los cambios de comportamiento tras la administración de un producto bioterapéutico vivo. Esta es la primera vez que un estudio informa que un producto bioterapéutico vivo es capaz de alterar el sistema central de oxitocina/vasopresina, con un cambio simultáneo en el comportamiento social, similar a la ansiedad y estereotipado con una mejora en la función gastrointestinal.

Ejemplo 11 - Adm inistración de Blautia hydrogenotrophica en los modelos de ratón C57BL/6 y BTBR

En experimentos de comportamiento que utilizan ratones BTBR como modelo para el trastorno del espectro autista y otros trastornos neurológicos, los ratones C57BL/6 a los que se les administró PBS y LYO se utilizaron como controles para confirmar que el modelo de ratones BTBR demostró efectivamente un aumento de la ansiedad, reducción de la aversión social, y aumento de las conductas estereotipadas. Esto permitió una evaluación del efecto del tratamiento bacteriano sobre estos defectos de comportamiento relacionados con los ASD.

Ejemplo 11a: Evaluación del comportamiento sim ilar a la ansiedad - campo abierto

Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2g anterior. La actividad horizontal es la distancia recorrida por el ratón en el campo abierto. La actividad vertical es el número de ocasiones en que el ratón se alzó sobre las patas traseras. Una mayor frecuencia de estos comportamientos indica una mayor locomoción y exploración y/o un menor nivel de ansiedad. Un aumento en la frecuencia de estos comportamientos en el área central de la arena indica un alto comportamiento exploratorio y bajos niveles de ansiedad.

PBS es el control negativo para la administración de butirato ya que el butirato se administró en PBS. LYO es el control negativo para la administración de la Blautia hydrogenotrophica. Después de los primeros análisis (Figuras 51 A, C y E), los valores para los controles negativos de PBS y LYO en los modelos C57BL/6 y BTBR se combinan y promedian para proporcionar una comparación simplificada en el segundo análisis (Figuras 51 B, D y F).

Resultados

Actividad horizontal

Como cabría esperar de un modelo relacionado con la ansiedad y/o el autismo, los ratones BTBR muestran una actividad horizontal significativamente reducida en comparación con los ratones C57BL/6. El control negativo LYO no mostró ningún efecto sobre la actividad horizontal en ratones C57Bl/6 en comparación con el control PBS. En comparación con el control PBS en los primeros 30 minutos, los ratones BTBR tratados con el control LYO o butirato solo no mostraron diferencias significativas en la distancia recorrida, aunque en los segundos 30 minutos, el control LYO redujo la distancia recorrida por los ratones BTBR. Sin embargo, los ratones tratados con la cepa bacteriana mostraron un aumento significativo en la distancia recorrida en comparación con los ratones de control BTBR (Figura 51A).

Para proporcionar una comparación adicional entre los controles y los valores experimentales, como se ha señalado anteriormente, los valores para los controles PBS y LYO se combinaron en el segundo análisis. De manera similar al primer análisis, la administración de butirato no afectó la actividad horizontal. Sin embargo, la administración de la cepa bacteriana aumentó significativamente la actividad horizontal en comparación con el control del modelo BTBR (Figura 51B).

Actividad vertical

Los ratones BTBR muestran una actividad vertical (crianza) significativamente reducida en comparación con los ratones C57BL/6. El control negativo LYO no mostró ningún efecto sobre la actividad vertical en ratones C57Bl/6 en comparación con el control PBS. En comparación con los ratones de control PBS de BTBR, los ratones BTBR tratados con solo butirato no mostraron diferencias en la crianza, mientras que el control LYO redujo la actividad vertical de los ratones BTBR. Sin embargo, los ratones tratados con la cepa bacteriana mostraron un aumento significativo en la actividad vertical en comparación con los ratones de control LYO de BTBR (Figuras 51C).

Para proporcionar una comparación adicional entre los controles y los valores experimentales, como se ha señalado anteriormente, los valores para los controles PBS y LYO se combinaron en el segundo análisis. De manera similar al primer análisis, la administración de butirato no afectó la actividad vertical de los ratones BTBR. Sin embargo, la administración de la cepa bacteriana aumentó significativamente la actividad vertical en comparación con el control BTBR (Figura 51D).

% de la distancia recorrida en el centro del campo abierto en los primeros 5 minutos

Como era de esperar, en los primeros cinco minutos del análisis, los ratones BTBR mostraron un mayor porcentaje de su distancia recorrida en el centro del campo abierto en comparación con los ratones C57BL/6. Esto refleja la reducción de la distancia total recorrida por los ratones BTBR, que muestran un mayor comportamiento ansioso, y el hecho de que dentro de los primeros 5 minutos del ensayo, es más probable que los ratones BTBR más ansiosos se familiaricen con su entorno inicial en lugar de entrar en una fase exploratoria (Figura 51E).

Para proporcionar una comparación adicional entre los controles y los valores experimentales, como se ha señalado anteriormente, los valores para los controles PBS y LYO se combinaron en el segundo análisis (Figura 51F).

% del tiempo transcurrido en el centro del campo abierto

Al considerar todo el tiempo del análisis, los ratones BTBR muestran un porcentaje reducido de tiempo transcurrido en el centro de la arena en comparación con los ratones C57BL/6. Esto refleja el aumento de la ansiedad y la reducción de la actividad horizontal de los ratones BTBR. Ni el control de LYO ni el butirato por sí solos afectaron el tiempo transcurrido en el centro de la arena. Sin embargo, la administración de la cepa bacteriana aumentó significativamente la cantidad de tiempo transcurrido en el centro de la arena en comparación con el control LYO en ratones BTBR (Figura 51G).

Para proporcionar una comparación adicional entre los controles y los valores experimentales, como se ha señalado anteriormente, los valores para los controles PBS y LYO se combinaron en el segundo análisis. De manera similar al primero, la administración de butirato no afectó el tiempo transcurrido en el centro del campo en comparación con el control BTBR. La administración de la cepa bacteriana aumentó la cantidad de tiempo transcurrido en el centro del campo abierto.

Conclusiones

El tratamiento crónico con una composición de Blautia hydrogenotrophica aumenta la actividad exploratoria y reduce el comportamiento similar a la ansiedad en el modelo de ratón BTBR en la prueba de campo abierto. Fundamentalmente, la administración de la cepa bacteriana al modelo de ratón BTBR aumentó la actividad horizontal y vertical y aumentó la cantidad total de tiempo transcurrido en el centro de la arena en comparación con el control BTBR. De acuerdo con lo anterior, esta cepa bacteriana tiene efectos ansiolíticos y mejora el comportamiento exploratorio en un modelo de ratón representativo de los trastornos del sistema nervioso central (por ejemplo, trastornos del espectro autista).

Ejemplo 11b: Evaluación de comportamientos estereotipados - la prueba de enterramiento de canicas Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2d anterior. PBS es el control negativo para la administración de butirato. LYO es el control negativo para la administración de la cepa Blautia hydrogenotrophica. Después de los primeros análisis (Figura 52 A), los valores de los controles negativos de PBS y LYO en los modelos C57BL/6 y BTBR se combinan y promedian para proporcionar una comparación simplificada en el segundo análisis (Figura 52B).

Resultados

Como era de esperar, los ratones del modelo BTBR mostraron un aumento en el comportamiento repetitivo mostrando significativamente más canicas enterradas en comparación con el control del modelo C57BL/6 (Figura 52B). La administración de butirato y de la cepa bacteriana redujo el número de canicas enterradas (Figura 52Ay B).

Conclusión

La administración de butirato y/o la cepa bacteriana reduce el número de canicas enterradas, lo que indica una reducción de los comportamientos ansiosos o estereotipados.

Ejemplo 11c: Evaluación de comportamientos estereotipados: la prueba de excavación

Justificación y métodos

De manera similar a la justificación de la prueba de enterramiento de canicas, el aumento del comportamiento de excavación corresponde a un aumento en el comportamiento repetitivo y estereotipado.

Resultados

Como era de esperar, hubo un aumento significativo en el tiempo transcurrido excavando en el modelo BTBR en comparación con la cepa de control C57BL/6 (Figura 53A). Sin embargo, el número de episodios de excavación no fue significativamente diferente entre las cepas C57BL/6 y BTBR (Figura 53B). Por lo tanto, no es posible evaluar la función de la cepa bacteriana o el butirato en la prevención del comportamiento repetitivo en este análisis.

Ejemplo 11d: Evaluación de comportamientos estereotipados - la prueba de autoacicalamiento Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 2e anterior. PBS es el control negativo para la administración de butirato. LYO es el control negativo para la administración de la Blautia hydrogenotrophica. Después de los primeros análisis (Figuras 54A, C y E), los valores de los controles negativos de PBS y LYO en los modelos C57BL/6 y BTBR se combinaron y promediaron para proporcionar una comparación simplificada en el segundo análisis (Figura 54B, D y F).

Resultados

En línea con el modelo BTBR para comportamientos estereotipados, los ratones BTBR mostraron un mayor tiempo transcurrido en el acicalamiento, así como un mayor número de episodios de acicalamiento en comparación con el modelo de ratón C57BL/6, en los controles PBS y LYO. La administración de butirato solo mostró una reducción en el tiempo transcurrido en el acicalamiento, el número de episodios de acicalamiento y el tiempo transcurrido en el acicalamiento por episodio, en comparación con el control PBS. La administración de la cepa bacteriana redujo el tiempo empleado en acicalarse por episodio de acicalamiento (Figura 54A, C y E).

Para proporcionar una comparación adicional entre los controles y los valores experimentales, como se ha señalado anteriormente, los valores para los controles de PBS y LYO se combinaron en el segundo análisis. Este segundo análisis proporcionó resultados similares a aquellos del primer análisis (Figura 54B, D y F).

Conclusión

La administración de butirato o Blautia hydrogenotrophica reduce la cantidad de tiempo transcurrido en el acicalamiento por episodio de acicalamiento.

Ejemplo 11e - Conclusión general de los experimentos de Blautia hydrogenotrophica

En la prueba de campo abierto, la Blautia hydrogenotrophica mejoró significativamente el comportamiento exploratorio de los ratones BTBR. Adicionalmente, esta cepa bacteriana redujo el comportamiento similar a la ansiedad de estos ratones. De acuerdo con lo anterior, está claro que la administración de esta bacteria modula el comportamiento de los ratones BTBR que muestran características similares al autismo. Por lo tanto, se esperaría que estas bacterias fueran útiles en el tratamiento y/o prevención de trastornos o afecciones del sistema nervioso central, que incluyen trastornos o afecciones del neurodesarrollo y/o neuropsiquiátricos.

La administración de esta cepa bacteriana también parece reducir la cantidad de tiempo que lleva a cabo el comportamiento estereotipado por episodio de acicalamiento en la prueba de autoacicalamiento.

Ejemplo 11f - Conclusión general de los experimentos con butirato

Los datos de los ensayos de comportamiento estereotipado apuntan hacia una función terapéutica para el butirato en los trastornos del sistema nervioso central.

La administración de butirato redujo el número de canicas enterradas en comparación con el control BTBR y devolvió el número promedio a un nivel similar al observado en los ratones de control de tipo silvestre C57BL/6. Además, la administración de butirato solo redujo el tiempo total transcurrido en el acicalamiento y el número de episodios de acicalamiento en comparación con el control BTBR.

Estos resultados proporcionan indicaciones reveladoras con respecto a la función del butirato en la reducción de comportamientos repetitivos y estereotipados en modelos animales.

Ejemplo 12 - Efectos del liofilizado bacteriano sobre la producción de SCFAen ratas sanas

Se estudiaron los efectos de la administración crónica de un liofilizado de la cepa DSM 14294 de Blautia hydrogenotrophica sobre la producción de SCFA en ratas HIM sanas y los resultados se muestran en la Figura 55. Más detalles con respecto a los experimentos se proporcionaron anteriormente en las descripciones de la Figura. La Figura 55 muestra que la administración de BH induce un aumento significativo en la producción de acetato, así como de butirato.

Ejemplo 13 - Eficacia de la B. hydrogenotrophica estudiada en modelo de rata asociada a la m icrobiota humana (rata HMA)

Resumen

Se inocularon grupos de 16 ratas libres de gérmenes (que comprendían 8 ratas en el grupo de control y 8 ratas en el grupo de tratamiento) con la microbiota fecal de un sujeto con IBS humano (ratas con IBS-HMA). Se llevaron a cabo tres experimentos sucesivos utilizando muestras fecales de 3 pacientes con IBS diferentes. Se inocularon otros dos grupos de ratas (n = 10) con muestras fecales de sujetos sanos (n = 2 sujetos; 2 grupos de ratas HMA sanas) como control de sensibilidad visceral. Por lo tanto, hubo 24 ratas asociadas con microbiota IBS (control), 24 ratas asociadas con microbiota IBS tratadas con Blautix y 20 ratas asociadas con microbiota sana. A continuación, a la mitad de las ratas IBS-HMA se les administró durante 28 días una composición que comprendía la cepa bacteriana de B. hydrogenotrophica de acuerdo con la invención, mientras que la otra mitad de los animales recibió una solución de control.

Cepa

cepa DSM 14294 de Blautia hydrogenotrophica (BH).

Composición y administración

Se suspendió el liofilizado de BH en solución mineral estéril a una concentración de 1010 bacterias por ml. Se administraron dos ml de esta suspensión diariamente por rata IBS-HMA, mediante alimentación forzada oral, durante un período de 28 días.

La solución de control fue la solución mineral estéril que se administró diariamente (2 ml por rata) mediante alimentación forzada oral al grupo de control de ratas IBS-HMA.

Ratas

Se inocularon ratas Fisher macho libres de gérmenes (de 10 semanas de edad) con microbiota fecal humana de un sujeto con IBS (ratas con IBS-HMA). Dieciséis ratas se inocularon con el mismo inóculo fecal humano. Se realizaron tres experimentos sucesivos con muestras fecales de tres sujetos con IBS diferentes. Otros dos grupos de diez ratas se inocularon con muestra fecal de 2 sujetos sanos (grupos de control de normosensibilidad).

Diseño del estudio

Día -14: inoculación de ratas libres de gérmenes con microbiota fecal humana.

Días 0 a 28: dosis diaria de liofilizado de BH (grupo de ensayo) o solución de control (grupo de control) mediante alimentación forzada oral

Entre los días 14 y 22: operación para implantar electrodo en el abdomen (para ensayo de distensión)

Días 22-28: adaptación de las ratas para evitar el estrés asociado con la prueba de distensión.

Día 28: ensayo de distensión y eutanasia de animales para recolectar las muestras cecales para análisis de sulfuros y ácidos grasos de cadena corta (SCFA).

Días 0, 14 y 28: recolección de muestras fecales para análisis microbiano: qPCR para evaluar la población de BH y otros grupos comensales de microorganismos y enumeración de grupos funcionales de microorganismos utilizando medios selectivos y método estrictamente anaeróbico.

Resultados

La Figura 56 presenta los resultados del análisis qPCR de la población de B. hydrogenotrophica en muestras fecales de ratas IBS-HMA que reciben solución de control o liofilizado de BH. Se observó un aumento significativo en la población de BH al final del período de administración (D 28) en ratas que recibieron el liofilizado de BH, lo que confirma el suministro exitoso de BH en el colon.

La Figura 57 informa sobre el impacto de la administración de BH sobre los principales metabolitos fermentativos, ácidos grasos de cadena corta, en muestras cecales de ratas IBS-HMA. La administración de BH dio como resultado un aumento significativo en la concentración de acetato, así como un aumento significativo en la concentración de butirato (Figura 57B).

Ejemplo 14: Evaluación del comportamiento de interacción social en la prueba de tres cámaras Justificación y métodos

Véase el Ejemplo 1b anterior. En este experimento, los datos registrados son el tiempo de exploración, que se define por el tiempo de olfato de los cilindros (que contienen un objeto, un congénere) durante el primer período de 5 min y durante la sesión de 10 min.

Lecturas:

• Prueba 1, sociabilidad (congénere frente a objeto):

° Índice de sociabilidad: % de tiempo de olfateo del congénere (si >50 %: sociabilidad, es decir preferencia por el congénere frente al objeto)

° Otras lecturas, índices de conducta exploratoria: tiempo de exploración del congénere, del objeto, total • Prueba 2, preferencia por la novedad social (nuevo congénere frente a congénere familiar):

° Índice de preferencia (o aversión) a la novedad social: % de tiempo de olfateo del nuevo congénere ° Otras lecturas, índices de comportamiento exploratorio: tiempo de exploración de los congéneres nuevos y familiares, total

Resultados

Prueba 1: Sociabilidad (Figura 58A):

En los ratones C57BL/6, la sociabilidad no es diferente en los ratones tratados con PBS y con LYO. Como era de esperar, los ratones BTBR mostraron una sociabilidad reducida en el control PBS. Inesperadamente, los ratones BTBR mostraron una sociabilidad mejorada cuando se trataron con LYO. Sin embargo, las diferencias entre BTBR-PBS frente a C57-PBS, BTBR-LYO frente a C57-LYO y BTBR-PBS frente a BTBR-LYO no son significativas. Curiosamente, la administración de butirato mejoró la sociabilidad en ratones BTBR (significativamente diferente entre BTBR-PBS y BTBR-BUT). La administración de Blautia hydrogenotrophica aumentó la sociabilidad en comparación con el control bacteriano PBS.

Prueba 2: Novedad social (Figura 58B):

Se presenta una preferencia de novedad social en ratones C57BI/6 tratados con PBS, pero esta preferencia se reduce en ratones C57Bl/6 a los que se les administró LYO (estas diferencias no son significativas). En la sesión de 10 minutos, los ratones BTBR mostraron una preferencia por la novedad social reducida en comparación con los ratones C57BL/6 cuando se trataron con PBS o LYO. Las diferencias entre las diferencias BTBR-PBS frente a C57-PBS, BTBR-LYO frente a C57 LYO y BTBR-PBS frente a BTBR-LYO no son significativas. Por lo tanto, los resultados mostraron en la Figura 58B son difíciles de interpretar.

Conclusiones generales con respecto a Blautia hydrogenotrophica en el tratamiento de los trastornos del espectro autista

Los experimentos divulgados en el presente documento muestran evidencia de que la administración de otra especie de Blautia (es decir, Blautia hydrogenotrophica) puede ser aplicable para el tratamiento de trastornos neuropsiquiátricos y del desarrollo neurológico en modelos de ratones. En particular, el tratamiento con Blautia hydrogenotrophica redujo el comportamiento estereotipado y repetitivo similar a la ansiedad, y aumentó la sociabilidad en ratones.

Las Directrices de la EMA sobre el desarrollo clínico de productos medicinales para el tratamiento del trastorno del espectro autista establecen que, debido a la heterogeneidad de las enfermedades, es posible que no sea posible lograr un efecto significativo en todos los síntomas centrales con un solo compuesto y, por lo tanto, la eficacia a corto plazo se debe demostrar en al menos un síntoma central. El producto bioterapéutico vivo de Blautia hydrogenotrophica ha demostrado ser un tratamiento efectivo de al menos un síntoma central del trastorno del espectro autista, por lo que se espera que tanto él como las cepas relacionadas de Blautia y B. hydrogenotrophica sean eficaces contra la enfermedad humana. De manera similar, otros trastornos o afecciones del sistema nervioso central muestran una patología compleja con múltiples síntomas diferentes y tienen pocos tratamientos aprobados. Por lo tanto, se entiende que un tratamiento eficaz no necesita tratar todos los síntomas de un trastorno o afección del sistema nervioso central. Un tratamiento se consideraría terapéuticamente útil si tratara uno de los síntomas asociados con un trastorno o afección del sistema nervioso central.

Ejemplo 15: Evaluación de los efectos del tratam iento crónico con MRX006 sobre los niveles de expresión génica de oxitocina y sus respectivos receptores en las estirpes celulares hipotalámicas

El tratamiento crónico con MRX006 aumenta significativamente el nivel de expresión de ARNm de oxitocina y su receptor en estirpes celulares hipotalámicas (Figuras 59A y B).

Este sorprendente resultado proporciona una correlación entre los cambios químicos en el cerebro y los cambios de comportamiento tras la administración de MRX006. Esta es la primera vez que un estudio informa que un producto bioterapéutico vivo es capaz de alterar el sistema central de oxitocina, con un cambio simultáneo en el comportamiento social, similar a la ansiedad y estereotipado con una mejora en la función gastrointestinal.

Ejemplo 16 - El modelo de ratón BALBc

Ejemplo 16a - Materiales y métodos para el modelo de ratón BALBc

Ratones

Se alojaron en grupo ratones macho adultos BALBc (Envigo, Reino Unido) bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (luces encendidas de 7:00-19:00 h); El alimento y el agua estándar para roedores estaban disponibles ad libitum. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/EEC, los requisitos de S.I. No 543 de 2012 y aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal de University College Cork. Los animales tenían 8 semanas de edad al comienzo del experimento.

Cepa

MRX006: bacteria Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381.

Las bacterias se proporcionaron en la solución madre de glicerol y se cultivaron en la instalación en condiciones anaeróbicas.

Administración MRX006

Se permitió que los animales se habituaran a su sala de espera durante una semana después de su llegada a la unidad de animales. La dosificación con MRX006 o vehículo comenzó cuando los ratones tenían 8 semanas de edad. MRX006 (1 x 107 a 1 x 109 CFU) se disolvió en PBS antes de la administración. Los ratones recibieron alimentación mediante alimentación forzada oral (dosis de 200 j l) de MRX006 a una dosis de 1 x 109 CFU durante 6 días consecutivos entre las 15:00 y las 17:00. El día 7, los animales fueron decapitados y se recolectaron tejidos para experimentación.

Recolección de Tejidos

Los animales se sacrificaron de forma aleatoria con respecto al tratamiento y las condiciones de prueba; el muestreo se realizó entre las 9.00 a.m. y las 2:30 p.m. horas. La sangre del tronco se recolectó en tubos con EDTAde potasio (Ácido Etilendiaminotetraacético) y se centrifugó durante 15 min a 4000 g. El plasma se aisló y almacenó a -80 °C para análisis adicional. El cerebro se extirpó rápidamente, se diseccionó y cada región del cerebro se congeló instantáneamente en hielo seco y se almacenó a -80 C para análisis adicional. Se extrajo el bazo, se recolectó en 5 ml de medio RPMI (con L-glutamina y bicarbonato de sodio, R₈758 Sigma FBS al 10 % (F7524, Sigma) Pen/Strep al 1 % (P4333, Sigma)) y se procesó inmediatamente después de los sacrificios para la estimulación inmunitaria ex­ vivo. Se montó el tejido intestinal (se extirparon segmentos de 2 cm de íleon y colon más cercanos al ciego, y se utilizaron los 1 cm más alejados de tejido del ciego) en las cámaras de Ussing para el ensayo de permeabilidad intestinal. Se tomó 1 cm adicional de tejido de íleon y colon para el análisis de expresión génica de unión estrecha. Se extrajo el ciego, se pesó y se almacenó a -80 °C para el análisis de SCFA.

Análisis estadístico

Los datos normalmente distribuidos se presentan como media ± EEM; Los conjuntos de datos no paramétricos se presentan como mediana con rango intercuartílico. Se aplicó la prueba t de dos colas no pareadas para analizar los datos paramétricos y la prueba de Mann-Whitney para los no paramétricos. Se empleó el coeficiente de correlación de rangos de Spearman para el análisis de correlación en los conjuntos de datos agrupados. Un valor de p < 0.05 se consideró significativo en todos los casos.

Ejemplo 16b: Evaluación de los efectos del tratamiento crónico con MRX006 sobre la permeabilidad gastrointestinal ex vivo y la expresión de uniones estrechas

Métodos

Se sacrificó a los ratones mediante dislocación cervical y se extrajeron el íleon distal y el colon, se colocaron en solución de Krebs enfriada, se abrieron a lo largo de la línea mesentérica y se lavaron cuidadosamente. Luego, las preparaciones se colocaron en cámaras de Ussing (Harvard Apparatus, Kent, Reino Unido, área expuesta de 0.12 cm2) como se describió anteriormente (Hyland and Cox, 2005 [lviii]) con tampón de Krebs oxigenado (O₂ al 95 %, CO₂ al 5 %) mantenido a 37 °C. Se agregó FITC-dextrano de 4 kDa a la cámara mucosa a una concentración final de 2.5 mg/ml; se recolectaron muestras de 200 μl de la cámara serosa cada 30 min durante las siguientes 3 h.

Resultados

Usando el paso de FITC desde el lado luminal hasta el lado serosal de la cámara de Ussing como un índice de permeabilidad intestinal (como se describió en el Ejemplo 2l), se determinó que MRX006 no tenía efecto sobre la permeabilidad del tejido del íleon o colon. Las Figuras 60Ay 61A demuestran que el tratamiento crónico con MRX006 no influye en la permeabilidad del colon o el íleon.

MRX006 no tuvo ningún efecto sobre la expresión de ARNm de la proteína de unión estrecha (implicada en el mantenimiento de la integridad de la barrera intestinal) ocludina, la enzima IDO-1 (indolamina-pirrol 2,3-dioxigenasa-1, la primera y la enzima limitante de la tasa en la ruta triptófano/quinurenina), ni en el TPH1 (triptófano hidroxilasa 1, una isoforma de la enzima triptófano hidroxilasa, responsable de la síntesis de serotonina) en el tejido del íleon o colon (Figuras 60 y 61 B, C y E). Sin embargo, MRX006 aumentó la expresión de ARNm de TJP-1 (proteína de unión estrecha 1, una proteína de unión estrecha) en el íleon, pero no en el colon (Figuras 60D y 61D).

Discusión

MRX006 no tuvo efecto sobre la permeabilidad del íleon o del colon, pero aumentó la expresión de TJP1. TJP1 es una de una serie de proteínas de unión estrecha asociadas con el mantenimiento de la integridad intestinal, y aunque observamos este aumento en la expresión de ARNm, esto puede no reflejar necesariamente la expresión de la proteína de esta unión estrecha ni su incorporación en el endotelio. El hallazgo de que el tratamiento de 6 días con MRX006 no altera la permeabilidad sugiere que no tiene un impacto negativo sobre la permeabilidad e integridad intestinal. MRX006 tampoco alteró IDO-1 ni TPH1, lo que sugiere que no altera la producción de serotonina ni la ruta de triptófano/quinurenina en el intestino.

Estos datos demuestran que el tratamiento crónico con MRX006 no altera la permeabilidad intestinal y no afecta la integridad de la barrera intestinal. Esto demuestra que la capacidad de MRX006 para atenuar los comportamientos estereotipados y relacionados con la ansiedad no conduce a una deficiencia en la integridad de la barrera intestinal.

Ejemplo 16c: Evaluación de los efectos del tratam iento crónico con MRX006 sobre la producción de ácidos grasos de cadena corta cecal

Métodos

El contenido de ciego se mezcló y se agitó con agua MilliQ y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Los sobrenadantes se obtuvieron por centrifugación (10000 g, 5 min, 4 °C) para sedimentar bacterias y otros sólidos y filtración por 0.2 μm. Se transfirió a un vial de GC transparente y se utilizó ácido 2-etilbutírico (Sigma) como estándar interno. La concentración de SCFA se analizó utilizando un sistema de ionización de llama Varían 3500 GC, equipado con una columna ZB-FFAP (30 m * 0.32 mm * 0.25 mm; Phenomenex). Se construyó una curva estándar con diferentes concentraciones de una mezcla estándar que contenía acetato, propionato, isobutirato, n-butirato, isovalerato y valerato (Sigma). Los picos se integraron al utilizar el software Varian Star Chromatography Workstation versión 6.0. Todos los datos de SCFa se expresan como pmol/g.

Resultados

Los ácidos grasos de cadena corta (AGCC) se producen cuando las fibras no digeribles de la dieta son fermentadas por bacterias en el intestino. 6 días de administración de MRX006 no tuvo efecto sobre acetato (t12 = 0.959, P = 0.357), propionato (t12 = 1.033, P = 0.322), isobutirato (t12 = 1.859, P = 0.090), butirato (t12 = 0.857, P = 0.408), isovalearato (t12 = 1.757, P = 0.107) o valearato (t12 = 0.434, P = 0.672), en comparación con la administración de vehículo PBS (Figura 62).

Discusión

La administración de MRX006 no tuvo efecto sobre la producción de SCFA cecal. Esto sugiere que el régimen de 6 días de MRX006 no alteró la fermentación ni las bacterias responsables de la fermentación de las fibras no digeribles de la dieta.

Ejemplo 16d: Evaluación de los efectos del tratam iento crónico con MRX006 sobre la expresión de citoquinas de los esplenocitos

Justificación/Métodos

El ensayo de esplenocitos ex vivo implica exponer los esplenocitos (células aisladas del bazo, un órgano principal implicado en la defensa inmunitaria), con una exposición bacterio- o viral-mimética.

Los bazos se recolectaron inmediatamente en 5 ml de medio RPMI después del sacrificio y se cultivaron inmediatamente. Primero se homogeneizaron las células de bazo en medio RPMl. La etapa de homogeneización fue seguida por la etapa de lisis de RBC en la que las células se incubaron durante 5 min en 1 ml de tampón de lisis de RBC (11814389001 ROCHE, Sigma). Se agregaron 10 ml del medio para detener la lisis y se centrifugaron 200 g durante 5 min. Esto fue seguido por la etapa final en la que las células se pasaron a través de un filtro de 40 um. A continuación, el homogeneizado se filtró sobre un filtro de 40 um, se centrifugó a 200 g durante 5 min y se resuspendió en el medio. Las células se contaron y sembraron (4,000,000/ml de medio). Después de 2.5 h de adaptación, las células se estimularon con lipopolisacárido (LPS-2 μg/ml) o concanavalina A(ConA-2.5 μg/ml) durante 24 h. Después de la estimulación, se recolectaron los sobrenadantes para evaluar la liberación de citoquinas utilizando el kit V-PLEX del Panel 1 (ratón) Proinflamatorio (Meso Scale Discovery, Maryland, EE. UU.) para TNFa, IL-10, IL-1p, Interferón ^y, CXCL2 e IL6. Los análisis se realizaron utilizando MESO QuickPlex SQ 120, s ECt OR Imager2400, s Ec TOR Imager 6000, SECTOR S 600.

Resultados

MRX006 no tuvo efecto sobre la liberación de esplenocitos de proinflamatorios (IFNy, TNFa, IL-1p) ni antiinflamatorios (IL-10, IL-6) o CXCL1 (marcador de activación de la respuesta inmunitaria) en respuesta a la estimulación con LPS (que imita una infección bacteriana).o con concavalina A (que imita una infección viral) (Figura 63).

Discusión

MRX006 tampoco tuvo efecto sobre la expresión de citoquinas de los esplenocitos después de una exposición con LPS o concavalina A. Esto demuestra que la administración de MRX006 de 6 días no influyó negativamente en la respuesta inmunitaria periférica innata. Esto demuestra que el tratamiento con MRX006 no activa la activación inmunitaria sistémica.

Ejemplo 16e: Evaluación de los efectos del tratam iento crónico con MRX006 sobre los niveles plasmáticos de aminoácidos

Justificación y Métodos

Al final del experimento, se recolectó sangre del tronco para el análisis de aminoácidos en el plasma. Esto daría un índice de la biosíntesis y catabolismo de aminoácidos esenciales por cambios en la microbiota.

Los animales se sacrificaron de forma aleatoria con respecto al tratamiento y las condiciones de prueba; el muestreo se realizó entre las 9.00 a.m. y las 2:30 p.m. horas. La sangre del tronco se recolectó en tubos con EDTAde potasio (ácido etilendiaminotetraacético) y se centrifugó durante 15 min a 4000 g. El plasma se aisló y almacenó a -80 °C para análisis adicional. El plasma se diluyó con tampón de citrato de sodio 0.2 mol/L, pH 2.2 para producir 250 nmol de cada residuo de aminoácido. Las muestras se diluyeron con el estándar interno de norleucina, para dar una concentración final de 125 nm/ml. Los aminoácidos se cuantificaron utilizando un analizador de aminoácidos Jeol JLC500/V (Jeol Ltd, Garden City, Herts, Reino Unido) equipado con una columna de intercambio catiónico Jeol Na+ de alto rendimiento.

Resultados

MRX006 disminuyó los niveles de prolina y fenilalanina en el plasma.

Discusión

Los niveles plasmáticos de aminoácidos permanecieron prácticamente inalterados tras la administración de 6 días de MRX006. Se presentan nueve aminoácidos esenciales que no se pueden sintetizar de novo y se deben suministrar directamente en la dieta o mediante la descomposición de la dieta. Estos incluyen valina, fenilalanina, treonina, triptófano, metionina, leucina, isoleucina, lisina e histidina. Otros seis aminoácidos se consideran condicionalmente esenciales en la dieta humana, lo que significa que su síntesis puede verse limitada bajo condiciones fisiopatológicas especiales, tales como la prematuridad en el lactante o las personas con trastornos catabólicos graves. Estos seis aminoácidos incluyen arginina, cisteína, glicina, glutamina, prolina y tirosina. Cinco aminoácidos son prescindibles en humanos, lo que significa que pueden sintetizarse en cantidades suficientes en el cuerpo. Estos cinco son alanina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutámico y serina.

En este estudio, el aminoácido esencial fenilalanina y prolina, otro aminoácido importante, se redujeron después de la administración de MRX006, lo que sugiere que este probiótico puede desempeñar una función en el metabolismo de los aminoácidos clave de la dieta.

Ejemplo 16f: Evaluación de los efectos del tratam iento crónico con MRX006 en los niveles de neurotransmisores en el tronco encefálico

Métodos

La concentración de neurotransmisores se analizó mediante HPLC sobre muestras del tronco encefálico. Brevemente, el tejido del tronco encefálico se sometió a ultrasonidos en 500 μl de fase móvil enfriada enriquecida con 4 ng/40 μl de N-metil 5-HT (Sigma Chemical Co., Reino Unido) como estándar interno. La fase móvil contenía ácido cítrico 0.1 M, ácido octano-1-sulfónico 5.6 mM (Sigma), dihidrogenofosfato de sodio 0.1 M, EDTA0.01 mM (Alkem/Reagecon, Cork) y metanol al 9 % (v/v) (Alkem/Reagecon), y se ajustó a pH 2.8 utilizando hidróxido de sodio 4 N (Alkem/Reagecon). A continuación, los homogeneizados se centrifugaron durante 15 min a 22,000 x g a 4 °C y se inyectaron 40 μl del sobrenadante en el sistema de HPLC, que consistía en un controlador del sistema SCL 10-Avp, un detector electroquímico LECD 6A(Shimadzu), una bomba LC-10AS, un horno CTO-10A, un autoinyectorSIL-10A(con enfriador de muestras mantenido a 40 C) y un Gastorr Degasser en línea (ISS, Reino Unido). En la separación se empleó una columna de fase inversa (Kinetex 2.6 u C18 100 x 4.6 mm, Phenomenex) mantenida a 30 °C (caudal 0.9 ml/min). El electrodo de trabajo de carbón vítreo combinado con un electrodo de referencia Ag/AgCl (Shimdazu) operaba a 0.8 V y los cromatogramas generados se analizaron utilizando el software Class-VP 5 (Shimadzu). Los neurotransmisores se identificaron por sus tiempos de retención característicos determinados por inyecciones estándar, que se ejecutan a intervalos regulares durante el análisis de la muestra. Se midieron las relaciones de las alturas de los picos del analito frente al estándar interno y se compararon con la inyección estándar. Los resultados se expresaron como ng de neurotransmisor por g de peso fresco de tejido.

Resultados

La administración de 6 días de MRX006 no tuvo efecto sobre los niveles de noradrenalina, dopamina, serotonina, 5-HIAA(ácido 5-hidroxi-indol-acético; un metabolito de 5-HT (5-hidroxi-triptamina (serotonina)), o recambio de serotonina (la relación de 5-HIAA:5-HT) según lo determinado por la prueba t de 2 colas no pareada (Figura 65). Niveles de noradrenalina (t12 = 0.307, P = 0.764), dopamina (t12 = 0.957, P = 0.357), serotonina (t12 = 0.745, P = 0.074), 5-HIAA (t12 = 0.379, P = 0.711) o recambio de serotonina en el tronco encefálico (t12 = 0.683, P = 0.507).

Discusión

Los niveles de neurotransmisores en el tronco encefálico no se alteraron después de la administración de MRX006 de 6 días. Estos datos sugieren que MRX006 no tiene un impacto negativo sobre los comportamientos que se rigen por los niveles de monoamina a nivel del tronco encefálico.

Ejemplo 16g: Evaluación de los efectos del tratam iento crónico con MRX006 sobre la expresión génica central y gastrointestinal

Justificación

Se analizaron la expresión de genes para receptores de neurotransmisores [receptor de serotonina 1a(5-HT1a), receptor de dopamina D1, subunidad B1 del receptor GABAB, receptor GABAA, receptor NMDA2A y NMDA2B], marcadores inflamatorios [IL-1p, IL6, CD11b, TNFα y TLR4] y marcadores endocrinos [factor de liberación de corticosterona (CRF), receptores del factor de liberación de corticosterona 1 y 2 (CRFR1, CRFR2), factor de neurotrofina derivado del cerebro (BDNF), receptor de vasopresina, receptor de oxitocina, receptor de glucocorticoides y receptor de mineralocorticoides] en el tejido de cerebro desde la amígdala, corteza prefrontal e hipocampo.

Métodos

El ARN total se extrajo utilizando el kit de Aislamiento de ARNmi mirVana™ (Ambion/Llife technologies, Paisley, Reino Unido) y se trató con DNasa (Turbo DNA-free, Ambion/life technologies) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. El ARN se cuantificó utilizando el espectrofotómetro NanoDrop™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, Delaware, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó utilizando el Agilent Bioanalyzer (Agilent, Stockport, Reino Unido) de acuerdo con el procedimiento del fabricante y se calculó un número de integridad del ARN (RIN). Se utilizó ARN con valor RIN> 7 para experimentos posteriores. El ARN se transcribió inversamente aADNc utilizando el kit deADNc de alta capacidad de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se agregó transcriptasa inversa Multiscribe (50 U /jl) (1)(2)(1)(10) como parte de la mezcla maestra de RT, se incubó a 25 °C durante 10 min, 37 °C durante 2 h, 85 °C. C por 5 min y almacenó a 4 °C. La PCR cuantitativa se llevó a cabo utilizando sondas (6 carboxifluoresceína - FAM) diseñadas por Applied Biosystems para genes diana específicos de ratón, mientras se utilizaba p-actina como control endógeno. Las reacciones de amplificación contenían 1 j l deADNc, 5 j l de 2X PCR de mezcla Maestra (Roche), 900 nM de cada cebador y se llevaron a un total de 10 j l mediante la adición de agua libre de ARNasa. Todas las reacciones se realizaron por triplicado utilizando placas de 96 pocillos en el sistema LightCycler® 480. Las condiciones de los ciclos térmicos fueron las recomendadas por el fabricante (Roche) para 55 ciclos. Para verificar la contaminación por amplicón, cada serie no contenía controles de plantilla por triplicado para cada sonda utilizada. Se registraron los valores de umbral de ciclo (Ct). Los datos se normalizaron utilizando p-actina y se transformaron utilizando el método 2-AACT y se presentaron como un cambio de pliegue frente al grupo de control.

Resultados

La Figura 66 muestra que MRX006 no tuvo ningún efecto sobre la expresión génica del hipocampo de los receptores del neurotransmisor serotonina 1a (5-HTla) (tu = 0.742, P = 0.474), receptor de dopamina D1 (t™ = 1.426, P = 0.184), subunidad del receptor B1 GABAb (t12 = 1.871, P = 0.086), receptor GABAa (t-i2 = 0.017, P = 0.987), subunidad 2A del receptor NMDA(tn = 1.275, P = 0.229), subunidad 2B del receptor NMDA (tu = 1.39, P = 0.192).

La Figura 67 muestra que MRX006 no tuvo ningún efecto sobre la expresión génica de la amígdala de los receptores de neurotransmisores receptor de dopamina D1 (tu = 0.429, P = 0.677), subunidad B1 del receptor GABAb (tu = 0.998, P = 0.344), receptor GABAA (tu = 1.145, P = 0.277), subunidad 2A del receptor NMDA (t-,2 = 0.852, P = 0.411), subunidad 2B del receptor NMDA(t12 = 0.395, P = 0.707).

La Figura 68 muestra que MRX006 no tuvo ningún efecto sobre la expresión génica de la corteza prefrontal de los receptores de neurotransmisores receptor de dopamina D1 (tu = 0.583, P = 0.571), subunidad B1 del receptor GABAb (t12 = 1.304, P = 0.217), receptor GABA^a (t-i0 = 2.043, P = 0.068), subunidad 2A del receptor NMDA (tu = 0.177, P = 0.104), subunidad 2B del receptor NMDA (tu = 1.235, P = 0.243).

No hubo efecto de MRX006 sobre la expresión de ARNm de receptores de neurotransmisores en ninguna de las regiones cerebrales investigadas (Figuras 66-68).

En el hipocampo y la amígdala (Figuras 69 y 70) no hubo efecto sobre la expresión de ARNm de los diversos marcadores inflamatorios. MRX006 no tuvo efecto sobre la expresión génica del hipocampo de los marcadores inflamatorios IL-1 p (t10 = 1.346, P = 0.208), IL-6 (t-,2 = 1.041, P = 0.308), CD11b (t-,2 = 1.195, P = 0.255), TNFα (tu = 0.816, P = 0.342), TLR4 (t-i2 = 0.521, P = 0.612). MRX006 no tuvo efecto sobre la expresión génica de la amígdala de los marcadores inflamatorios IL-1 p (tu = 1.53, P = 0.988), IL-6 (tu = 1.145, P = 0.217), CD11b (tu = 1.143, P = 0.275), TLR4 (tu = 0.971, P = 0.532).

En la corteza prefrontal, MRX006 disminuyó la expresión de ARNm paraTLR4 sin ningún cambio en otros marcadores inflamatorios (Figura 71). MRX006 disminuyó significativamente la expresión de ARNm de TLR4 (t-i2 = 2.639, P = 0.0216) en la corteza prefrontal, pero no tuvo más efecto sobre la expresión génica de la corteza prefrontal para IL-6 (tu = 1.145, P = 0.217) o CD11b (tu =2.175, P = 0.523).

MRX006 disminuyó significativamente la expresión del ARNm del receptor de vasopresina en el hipocampo (t-i2 = 2.389, P = 0.0342), pero no tuvo ningún efecto adicional sobre la expresión del ARNm para los marcadores endocrinos CRF (t12 = 0.767, P = 0.458), CRFR1 (t-,2 = 0.174, P = 0.865), CRFR2 (tu = 0.238, P = 0.816), BDNF (t-,2 = 1.548, P = 0.148), receptor de oxitocina (t12 = 0.762, P = 0.461), receptor de glucocorticoides (t-i2 = 0.607, P = 0.556), receptor de mineralocorticoides (t-i2 = 0.67, P = 0.516) (Figura 72).

MRX006 no tuvo efecto sobre la expresión de ARNm de marcadores endocrinos amigdalares CRFR1 (t-i2 = 0.226, P = 0.825), CRFR2 (tu = 0.78, P = 0.451), BDNF (t-,2 = 0.201, P = 0.844), receptor de vasopresina (t-,2 = 0.756, P = 0.465), receptor de oxitocina (tu = 0.167, P = 0.87), receptor de glucocorticoides (tu = 1.027, P = 0.327), receptor de mineralocorticoides (tu = 1.448, P = 0.175) (Figura 73).

MRX006 no tuvo ningún efecto sobre la expresión de ARNm de los marcadores endocrinos de la corteza prefrontal CRFR1 (t12 = 1.666, P = 0.122), CRFR2 (tu = 1.179, P = 0.261), BDNF (tu = 1.065, P = 0.310), receptor de oxitocina (t-n = 1.037, P = 0.322), receptor de glucocorticoides (t-i2 = 1.185, P = 0.259), receptor de mineralocorticoides (tu = 1.910, P = 0.083) (Figura 74).

En la amígdala y la corteza prefrontal (Figuras 73 y 74), no hubo cambios en la expresión de ARNm de ningún marcador endocrino, mientras que en el hipocampo (Figura 72) hubo una disminución en la expresión de ARNm del receptor de vasopresina sin ningún efecto. sobre el resto de marcadores endocrinos analizados.

Discusión

La expresión del gen central para los receptores inflamatorios, endocrinos y de neurotransmisores permaneció mayoritariamente inalterada después de la administración de MRX006 de 6 días.

Conclusiones generales sobre la administración de MRX006 en parámetros fisiológicos

En general, estos datos confirman que la administración de MRX006 no tiene un impacto negativo sobre los eventos fisiológicos sistémicos y centrales. Estos datos sugieren que MRX006 puede tener un perfil de alta tolerabilidad con efectos secundarios no deseados mínimos.

Ejemplo 17 - El modelo de ratón de activación inmunitaria materna (MIA)

Los ratones MIA utilizados son los mismos que se describen en el Ejemplo 3a.

Ejemplo 17a: Evaluación de los efectos del tratam iento crónico con MRX006 sobre la permeabilidad gastrointestinal in vivo en el modelo MIA

La permeabilidad del íleon y el colon se evaluó in vivo utilizando cámaras de Ussing como se describe en el Ejemplo 2k. La Figura 75 demuestra que el tratamiento crónico con MRX006 no influye en la permeabilidad del colon o el íleon en el modelo MIA.

Esto confirma que el tratamiento crónico con MRX006 no altera la permeabilidad intestinal, lo que muestra que el comportamiento social beneficioso, reduce el comportamiento similar a la ansiedad y los efectos del comportamiento estereotipado de MRX006 no conducen a un déficit en la integridad del intestino.

Ejemplo 17b: Evaluación de comportamientos sociales - la prueba de interacción social de tres cámaras La Prueba de Interacción Social de 3 Cámaras (3-CSIT) se realizó como se describe en el ejemplo 1a, sin embargo, estos datos se puntuaron manualmente por un investigador que desconocía el tratamiento. Los datos en el ejemplo 1a se generaron automáticamente por un software de seguimiento informático que no puede distinguir entre la interacción con el ratón y simplemente estar en la misma cámara que el ratón.

En la prueba de novedad social (Figura 76), no hubo déficit inducido por MIA en la discriminación social y MRX006 no tuvo ningún efecto adicional sobre la novedad social.

La Figura 77 muestra que, en la prueba de sociabilidad, MRX006 fue capaz de revertir los déficits inducidos por MIA en el comportamiento social. Esto es similar a los datos vistos en el modelo BTBR donde MRX006 podría revertir los déficits en la sociabilidad.

Ejemplo 17c: Evaluación de comportamientos sociales - la prueba de acicalamiento

La prueba de acicalamiento se realizó como se describe en el ejemplo 2e. El tratamiento crónico con MRX006 no condujo a un cambio en los comportamientos repetitivos en ratones MIA en la prueba de acicalamiento (Figura 78). Ejemplo 17d: Evaluación de comportamientos sociales - el laberinto elevado en cruz

La prueba del laberinto elevado en cruz se realizó como se describe en el ejemplo 2f. El tratamiento con MRX006 no tiene efecto sobre el comportamiento similar a la ansiedad en ratones MIA en el laberinto elevado en cruz (Figura 79). Ejemplo 17e: Evaluación de comportamientos sociales - la prueba de nado forzado

La prueba de nado forzado se realizó como se describe en el ejemplo 2h. El tratamiento crónico con MRX006 redujo el tiempo de inmovilidad de los ratones MIA en la prueba de nado forzado (Figura 80).

Ejemplo 17f - Determinación de corticosterona circulante inducida por estrés

Los niveles de corticosterona se midieron como se describe en el ejemplo 2n. El tratamiento crónico con MRX006 no influye en los niveles de corticosterona inducidos por estrés en ratones MIA expuestos a la prueba de nado forzado (Figura 81).

Conclusiones

El tratamiento con MRX006 revirtió los déficits inducidos por MIA en el comportamiento social y redujo el tiempo de inmovilidad en la prueba de nado forzado. Esto demuestra la capacidad de MRX006 para mejorar la sociabilidad y la actividad antidepresiva.

Además de los resultados descritos anteriormente en el ejemplo 3, se ha demostrado que MRX006 tiene un impacto positivo en los síntomas de los trastornos del espectro autista.

Secuencias

SEQ ID NO: 1 (gen de ARN ribosomal de la cepa GAM6-1 16S de Blautia stercoris, secuencia parcial - HM626177)

SEQ ID NO: 2 (secuencia consenso ARNr 16S para MRX006 de Blautia stercoris (cepa 830))

SEQ ID NO: 3 (gen de ARN ribosomal 16S de la cepa WAL 14507 de Blautia wexlerae, secuencia parcial - EF036467)

SEQ ID NO: 4 (secuencia consenso de ARNr 16S para la cepa MRX008 de Blautia wexlerae)

SEQ ID NO: 5 (secuencia de cromosomas de MRX006 (cepa 830)) - véase el listado de secuencias electrónicas del documento WO2018/215758.

SEQ ID NO: 6 (secuencia de plásmido de MRX006 (cepa 830)) - véase el listado de secuencias electrónicas del documento WO2018/215758. X95624.1)

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una cepa bacteriana del género Blautia, para uso en un método para tratar o prevenir un trastorno o afección del sistema nervioso central en el que el trastorno o afección del sistema nervioso central es un trastorno del neurodesarrollo o una afección neuropsiquiátrica seleccionado del grupo que consiste en: trastornos del espectro autista (ASD); trastorno obsesivo compulsivo (OCD); trastorno depresivo mayor; depresión; trastorno afectivo estacional; trastornos de ansiedad; trastorno de estrés postraumático; trastorno bipolar; psicosis y trastorno del estado de ánimo.

2. La composición para uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1, en la que:

(a) el trastorno o afección del sistema nervioso central está mediado por el eje microbiota-intestino-cerebro; o (b) la composición es para uso en un método para tratar o prevenir el trastorno del espectro autista; opcionalmente en la que la composición es para uso en un método para reducir o prevenir el autismo.

3. La composición para uso en un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la composición evita, reduce o alivia el comportamiento estereotipado, repetitivo, compulsivo y/o ansioso.

4. La composición para uso en un método de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición es para uso en un método para tratar o prevenir:

(a) trastorno obsesivo compulsivo, opcionalmente en el que la composición evita, reduce o alivia el comportamiento repetitivo, compulsivo y/o ansioso;

(b) trastorno depresivo mayor, opcionalmente la composición trata o evita episodios depresivos mayores agudos y/o la prevención de nuevos episodios (prevención de recurrencia), además opcionalmente la composición evita, reduce o alivia la aparición de episodios de MDD leves, moderados o severos; o

(c) trastornos de ansiedad, opcionalmente en los que el trastorno de ansiedad es trastorno de ansiedad generalizada (GAD); fobia específica; trastorno de ansiedad social; trastorno de ansiedad por separación; agorafobia; trastorno de pánico y/o mutismo selectivo.

5. La composición para uso en un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la composición es para uso en un método para modular el eje microbiota-intestino-cerebro.

6. La composición para uso en un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que:

(a) la cepa bacteriana es de Blautia stercoris;

(b) la cepa bacteriana es de Blautia wexlerae; o

(c) la cepa bacteriana es de Blautia hydrogenotrophica.

7. La composición para uso en un método de acuerdo con cualesquiera de las reivindicaciones 1-16, en la que la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que:

(a) es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia stercoris;

(b) es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:1 o 2, opcionalmente en la que la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:2, o en la que la cepa bacteriana tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO:2;

(c) es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia wexlerae;

(d) es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:3 o 4, opcionalmente en la que la cepa bacteriana tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:4, o en la que la cepa bacteriana tiene la secuencia de ARNr 16s representada por la SEQ ID NO:4;

(e) es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia hydrogenotrophica; o

(f) es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:7.

8. La composición para uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la cepa bacteriana es

(a) es de Blautia hydrogenotrophica;

(b) una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la secuencia de ARNr 16s de una cepa bacteriana de Blautia hydrogenotrophica; o

(c) tiene una secuencia de ARNr 16s que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o 99.9 % idéntica a la SEQ ID NO:7 y la cepa bacteriana aumenta el nivel de butirato.

9. La composición para uso en un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que:

(a) la composición es para administración oral;

(b) La composición para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la composición comprende uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables;

(c) La composición para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que se liofiliza la cepa bacteriana; y/o

(d) La composición para uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la cepa bacteriana es viable y capaz de colonizar parcial o totalmente el intestino.

10. La composición para uso en un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la composición comprende una única cepa de Blautia o la composición comprende la cepa bacteriana de Blautia como parte de un consorcio microbiano.

11. Un producto alimenticio que comprende la composición de cualquier reivindicación precedente, para el uso en un método de cualquier reivindicación precedente.

12. Una célula de la cepa de Blautia stercoris depositada bajo el número de acceso NCIMB 42381 para el uso en un método de cualesquiera de las reivindicaciones 1-5 y 9-11.

13. Una célula de la cepa de Blautia wexlerae depositada bajo el número de acceso NCIMB 42486 para el uso en un método de cualesquiera de las reivindicaciones 1-5 y 9-11.

14. Una composición que comprende la célula de la reivindicación 12 o reivindicación 13 para el uso en un método de cualesquiera de las reivindicaciones 1-5 y 9-11.

15. La composición de la reivindicación 14, para uso en un método de cualesquiera de las reivindicaciones 1-5 y 9-11 que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.