RS65556B1 - Proteini domena skele na bazi fibronektina koji vezuju miostatin - Google Patents

Proteini domena skele na bazi fibronektina koji vezuju miostatin

Info

Publication number
RS65556B1
RS65556B1 RS20240550A RSP20240550A RS65556B1 RS 65556 B1 RS65556 B1 RS 65556B1 RS 20240550 A RS20240550 A RS 20240550A RS P20240550 A RSP20240550 A RS P20240550A RS 65556 B1 RS65556 B1 RS 65556B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
myostatin
seq
adnectin
amino acid
loop
Prior art date
Application number
RS20240550A
Other languages
English (en)
Inventor
Sharon Cload
Linda Engle
Dasa Lipovsek
Malavi Madireddi
Ginger Chao Rakestraw
Joanna F Swain
Wenjun Zhao
Aaron P Yamniuk
Alexander T Kozhich
Martin J Corbett
Stanley Richard Krystek Jr
Hui Wei
Vidhyashankar Ramamurthy
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49253416&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS65556(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of RS65556B1 publication Critical patent/RS65556B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)

Description

Napomene:
Kompletan dokument uključujući Referentnu tabelu (Referentne tabele) i listu (liste) sekvenci može se preuzeti sa veb stranice EPO-a
Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na proteine domena skele na bazi fibronektina koji vezuju miostatin. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na primenu inovativnih proteina u terapijskim primenama za lečenje bolesti gubitka mišića i metaboličkih poremećaja. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na ćelije koje sadrže takve proteine, polinukleotide koji kodiraju takve proteine i na vektore koji sadrže polinukleotide koji kodiraju inovativne proteine.
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] Miostatin, takođe poznat kao faktor rasta i diferencijacije-8 (GDF-8 - growth and differentiation factor), je član superfamilije transformišućeg faktora rasta-β (TGF-β) sekretornih faktora rasta. Miostatin ima sve strukturne odlike zajedničke proteinima familije TGF-β: hidrofobni amino-terminus koji deluje kao sekretorni signal, devet nepromenjljivih cisteinskih ostataka i "RXXR" mesto tipa furina za proteolitičku obradu. Proteolitičko cepanje proteina dovodi do C-terminalnog domena koji formira homodimer koji je biološki aktivan oblik miostatina (Thies i sarad., Growth Factors 2001;18(4):251-9). Poravnanja C-terminalnog fragmenta aminokiselinskih sekvenci miostatina iz više vrsta kičmenjaka otkrivaju da je protein visoko očuvan (100% identičnosti) između čoveka, majmuna, krave, psa, miša, pacova, ćurke i pileta (McPherron, i sarad. PNAS, 94:12457-61, 1997).
[0003] Ekspresija miostatina je ograničena prvenstveno na skeletne mišiće i masno tkivo, gde se pokazalo da je negativan regulator razvoja skeletnih mišića (Lee LS, Immunol Endocr Metab Agensi Med Chem.2010;10:183-194). Kod sisara se čini da su skeletni mišići glavno ciljno tkivo miostatina, gde se vezuje za receptore na površini ćelije, što dovodi do gubitka mišića. Miševi i goveda sa genetskim nedostatkom miostatina pokazuju dramatično povećanje skeletne mišićne mase, tj., fenotip "dvostrukih mišića", stoga podržavaju ulogu miostatina u suzbijanju rasta mišića (McPherron i Lee, Proc Natl Acad Sci SAD. 2003 Dec 23;100(26):15842-6). Hipertrofija mišića kod Belgijskih plavih i Pijemontskih rasa goveda je posledica misens mutacije unutar trećeg egzona goveđeg gena za miostatin (Bass i sarad., Domest Anim Endocrinol.1999;17(2-3):191-7). Transgenska prekomerna ekspresija inhibitora miostatina takođe dovodi do povećane mišićavosti. Pojačani rast mišića kod ovih životinja je posledica povećanja oba, i broja ćelija ili hiperplastičnog rasta, i veličine ćelije ili hipertrofičnog rasta, što rezultira većim i težim mišičnim vlaknima. Povećana masa skeletnih mišića zbog mutacije miostatina je takođe zabeležna kod ljudi. Inhibicija miostatina efikasno povećava masu i snagu skeletnih mišića, kako u postnatalnom periodu tako i kod odraslih.
[0004] Povećanje mase i snage skeletnog mišića je takođe povezano sa metaboličkim adaptacijama koje pozitivno utiču na sastav tela, potrošnju energije, homeostazu glukoze i potrebe za insulinom. I genetski i farmakološki nalazi ukazuju na to da miostatin reguliše energetski metabolizam i da njegova inhibicija može značajno umanjiti napredovanje metaboličkih bolesti, uključujući gojaznost i dijabetes. Na primer, miostatin “null” miševi pokazuju smanjenu akumulaciju telesne masti (McPherron & Lee, J. JCI 109:595, 2002) u poređenju sa divljim tipom miševa istog uzrasta. Ovo smanjenje telesne masti je manifestacija smanjenog broja i veličine adipocita, što implicira značajnu ulogu miostatina u adipogenezi kao i u miogenezi.
[0005] Shodno tome, miostatin je poželjna meta za terapijsku ili profilaktičku intervenciju za lečenje poremećaja ili stanja koja bi imala koristi od povećanja mišićne mase, mišićne snage i/ili metabolizma (npr., mišićna distrofija, slabost, atrofija usled neupotrebe i kaheksija), poremećaja u vezi sa gubitkom mišića (npr., bubrežna bolest, srčana insuficijencija ili bolest, i bolest jetre) i metaboličkih poremećaja (npr., Dijabetes tipa II, metabolički sindrom, gojaznost i osteoartritis).
[0006] Shodno tome, bilo bi korisno dobiti poboljšane proteine skele fibronektinskog domena koji vezuju miostatin za terapijsko lečenje npr., metaboličkih poremećaja, poremećaja gubitka mišića, i gubitka mišića usled neaktivnosti.
SAŽETAK PREDMETNOG PRONALASKA
[0007] Predmetni pronalazak se zasniva, makar delimično, na otkriću Adnektina koji se vezuju za miostatin i antagonizuju ga. Konkretno, anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska inhibiraju aktivnost miostatina, čime utiču na nishodnu SMAD signalizaciju. Jedan mehanizam koji objašnjava izmenjenu SMAD signalizaciju nekih od anti-miostatin Adnektina predmetnog pronalaska uključuje inhibiciju regrutovanja Alk4 u kompleksu miostatin-ActRIIb, čije su fiziološke konsekvence povećana zapremina mišića i telesna masa.
[0008] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži deseti tipa III domen (<10>Fn3) fibronektina, gde se<10>Fn3 domen sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 281(SEK ID BR:28). Polipeptid pronalaska ima BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs (SEK ID BROJEVIMA): 34, 39 i 75, redom, i sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 331 [jezgrenu adnektin sekvencu PRD-1474 i 3116_A06 bez N-terminalne vodeće sekvence ili C-terminalnog repa].
[0009] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ili 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NOs: 264, 269 i 273. U drugim tehničkim rešenjima, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 118 [3116_06], 264 [PRD-1288], 269 [PRD-1305] i 273 [PRD-1474].
[0010] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu ne-BC, DE i FG regionima petlje SEQ ID NO: 118, 273, 281 ili 331.
[0011] Polipeptidi pronalaska vezuju se za diskontinurano mesto vezivanja adnektina na miostatinu. Polipeptidi pronalaska vezuju se unutar dva regiona, aminokiselina 85-101 i 55-66, miostatina (SEQ ID NO: 3).
[0012] Polipeptidi pronalaska se ne takmiče za vezivanje za miostatin sa ActRIIB. Polipeptidi pronalaska se takmiče za vezivanje za miostatin sa ALK4 i/ili ALK5.
[0013] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptidi opisani iznad mogu da sadrže jedan ili više farmakokinetičkih (FK) segmenata kao što su polietilen glikol, sijalinska kiselina, Fc, Fc fragment, transferin, serumski albumin, protein koji se vezuje za albumin u serumu i protein koji vezuje imunoglobulin u serumu. U jednom tehničkom rešenju, FK segment je protein koji se vezuje za albumin u serumu koji sadrži<10>Fn3 domen koji se vezuje za, na primer, HSA. U drugom tehničkom rešenju, FK segment je Fc i može biti na N- ili C-kraju polipeptida, i po izboru formirati dimer. U još jednom tehničkom rešenju, FK segment je polietilen glikol. U nekim tehničkim rešenjima, FK segment i polipeptid su povezani preko najmanje jedne disulfidne veze, peptidne veze, polipeptida, polimernog šećera ili polietilen glikolnog dela.
[0014] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži polipeptid opisan iznad, koji je po izboru bez endotoksina.
[0015] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid opisan gore, ekspresioni vektor koji sadrži nukleotidnu sekvencu, i ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid.
[0016] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje polipeptid ili kompoziciju predmetnog pronalaska za primenu u postupku lečenja mišićnog, neurološkog ili metaboličkog poremećaja koji je u vezi sa gubitkom mišića i/ili atrofijom mišića, ili degenerativnim poremećajem kostiju.
[0017] Dalje, predmetna objava obezbeđuje postupak dobijanja anti-miostatin polipeptida ćelijskom kultivacijom.
[0018] Dalje, predmetna objava obezbeđuje postupak za ublažavanje ili inhibiciju bolesti ili poremećaja koji su u vezi sa miostatinom kod subjekta administriranjem efikasne količine polipeptida ili kompozicije koja sadrži polipeptid opisan iznad. Bolest koja se leči može biti mišićna distrofija, amiotrofična lateralna skleroza, miozitis inkluzionog tela (IBM- inclusion body myositis), kongestivna opstruktivna bolest pluća, hronična srčana insuficijencija, kancer, AIDS, bubrežna insuficijencija, hronična bolest bubrega, uremija, reumatoidni artritis, sarkopenija, gubitak mišića zbog dužeg spavanja, povrede kičmene moždine, šlog, fraktura kostiju, starenje, dijabetes, gojaznost, hiperglikemija, kaheksija, osteoartritis, osteoporoza, infarkt miokarda ili fibroza.
[0019] Dalje, predmetna objava obezbeđuje postupak za ublažavanje ili inhibiciju poremećaja koji su u vezi sa degeneracijom ili gubitkom mišića kod subjekta.
[0020] Dalje, predmetna objava obezbeđuje postupak administriranja polipeptida za povećanje mišićne mase, povećanje broja mišićnih ćelija, povećanje veličine mišićnih ćelija, povećanje mišićne snage, fizičke performanse i/ili izdržljivosti subjekta.
[0021] Dalje, predmetna objava obezbeđuje postupak za ublažavanje ili inhibiciju metaboličkog poremećaja kod subjekta. Metabolički poremećaj može biti dijabetes (npr., dijabetes tipa II), hiperglikemija, hiperinsulinemija, hiperlipidemija, insulinska rezistencija, poremećeni metabolizam glukoze, lipodistrofija, gojaznost ili metabolički sindrom. Po izboru, može se administrirati druga terapijska kompozicija. Administriranje polipeptida može dovesti do povećane osetljivosti na insulin, povećanog unosa glukoze u ćelije, smanjenja nivoa glukoze u krvi, i/ili smanjenja telesne masti.
[0022] Dalje, predmetna objava obezbeđuje postupak, za povećanje čiste mišićne mase kod subjekta, koji obuhvata administriranje efikasne količine polipeptida ili kompozicije opisane iznad.
[0023] Dalje, predmetna objava obezbeđuje postupak za povećanje odnosa čiste mišićne mase i masti kod, subjekta koji obuhvata administriranje efikasne količine polipeptida ili kompozicije opisane iznad.
[0024] Dalje, predmetna objava obezbeđuje komplete koji sadrže polipeptid ili kompoziciju opisane iznad, i uputstva za upotrebu.
[0025] Dalje, predmetna objava obezbeđuje postupke detekcije ili merenja miostatina u uzorku koji obuhvataju dovođenje u kontakt uzorka sa polipeptidom opisanim iznad i detekciju ili merenje vezivanja polipeptida za miostatin.
[0026] Dalje, predmetna objava se odnosi na anti-miostatin vezujuće Adnektine za primenu u ublažavanju ili inhibiciji bolesti ili poremećaja koji su u vezi sa miostatinom, ublažavanju ili inhibiciji poremećaja koji je u vezi sa degeneracijom ili gubitkom mišića, povećanju mišićne mase, povećanju broja mišićnih ćelija, povećanju veličine mišićnih ćelija, povećanju mišićne snage, fizičke performanse i/ili izdržljivosti, ublažavanju ili inhibiranju metaboličkog poremećaja, povećanju čiste mišićne mase, i/ili povećanju odnosa čiste mišićne mase i masti, kod subjekta. Anti-miostatin adnektini mogu biti oni koji su ovde opisani, npr., anti-miostatin adnektini navedeni u SEQ ID NOs: 80-123, 228-239 i 252-273.
[0027] Anti-miostatin vezujući Adnektini mogu se koristiti za pripremu leka za ublažavanje ili inhibiranje bolesti ili poremećaja koji su u vezi sa miostatinom, ublažavanje ili inhibiranje poremećaja koji je u vezi sa degeneracijom ili gubitkom mišića, povećanje mišićne mase, povećanje broja mišićnih ćelija, povećanje veličine mišićnih ćelija, povećanje mišićna snaga, fizičke performanse i/ili izdržljivost, ublažavanje ili inhibiranje metaboličkog poremećaja, povećanje čiste mišićne mase i/ili povećanje odnosa čiste mišićne mase i masti, kod subjekta. Antimiostatin adnektini mogu biti oni koji su ovde opisani, npr., anti-miostatin adnektini navedeni u SEQ ID NOs: 80-123, 228-239, i 252-273.
KRATAK OPIS SLIKA
Slika 1 prikazuje poravnjanje, uzetih kao primer, aminokiselinskih sekvenci anti-miostatin Adnektina. Petlje BC, DE i FG aminokiselinskih sekvenci su identifikovane podvlačenjem, kurzivom/podvlačenjem ili podebljanim slovima/podvlačenjem, redom.
Slika 2 prikazuje analizu zasnovanu na WebLogo-u različitih ostataka BC petlje 1979_B06 familije anti-miostatin Adnektina. Naznačena je učestalost aminokiselina u svakoj poziciji BC petlje koje su varirale tokom PROfuzije. Slika je kreirana korišćenjem WebLogo-a (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: Generator logotipa sekvence. Genome Research 2004;14:1188-1190).
Slika 3 prikazuje analizu zasnovanu na WebLogo-u različitih ostataka DE petlje 1979_B06 familije anti-miostatin Adnektina. Naznačena je učestalost aminokiselina u svakoj poziciji DE petlje koje su varirale tokom PROfuzije.
Slika 4 prikazuje analizu zasnovanu na WebLogo-u različitih ostataka FG petlje 1979_B06 familije anti-miostatin Adnektina. Naznačena je učestalost aminokiselina u svakoj poziciji FG petlje koje su varirale tokom PROfuzije.
Slika 5 prikazuje analizu zasnovanu na WebLogo-u različitih ostataka BC petlje 2062_G02 familije anti-miostatin Adnektina. Naznačena je učestalost aminokiselina u svakoj poziciji BC petlje koje su varirale tokom PROfuzije.
Slika 6 prikazuje analizu zasnovanu na WebLogo-u različitih ostataka DE petlje 2062_G02 familije anti-miostatin Adnektina. Naznačena je učestalost aminokiselina u svakoj poziciji DE petlje koje su varirale tokom PROfuzije.
Slika 7 prikazuje analizu zasnovanu na WebLogo-u različitih ostataka FG petlje 2062_G02 familije anti-miostatin Adnektina. Naznačena je učestalost aminokiselina u svakoj poziciji FG petlje koje su varirale tokom PROfuzije.
Slika 8 predstavlja grafik koji prikazuje korelaciju biohemijskih podataka i podataka baziranih na ćelijama za diskretne alanin mutantne proteine Adnektina 3116_A06, sa njihovim relativnim prilagođavnjem u dubokom mutacionom skeniranju prema položaju sekvence.
Slika 9 predstavlja grafik koji prikazuje korelaciju ER<norm>–a iz NGS dubokog mutacionog skeniranja alaninskih mutacija Adnektina 3116_A06 sa IC50 vrednošću izmerenom pomoću HTRF. Indikovani su binovi (intervali) za poželjne, poželjnije i najpoželjnije mutacije na jednom mestu vezivanja za miostatin.
Slika 10 predstavlja grafik testa kompetitivnog vezivanja (kompetitivna ELISA) koji prikazuje da Adnektini PRD-1285, PRD-1286 i PRD-1288 ne blokiraju vezivanje miostatina za ActRIIb-Fc. Naznačen je % kompeticije ActRIIb-Fc vezivanja za miostatin. Kao što se očekivalo, ActRIIb-Fc konstrukt pozitivne kontrole se takmičio sa vezivanjem ActRIIb-Fc za miostatin.
Slika 11 predstavlja grafik koji prikazuje efekte različitih koncentracija Adnektina PRD-1285, PRD-1286 i PRD-1288 na aktivnost miostatina u testu ARE-luciferaze. Eksperimentalni uslovi su kao što je opisano u Primeru 3. Svaki od PRD-1285, PRD-1286 i PRD-1288 inhibirao je 100% aktivnosti ARE-luciferaze izazvane miostatinom.
Slika 12 shematski prikaz mehanizma delovanja kojim Adnektini predmetnog pronalaska inhibiraju aktivnost miostatina. Nativni signalni kompleks je prikazan na Sl.
12A. Konkretno, vezivanje miostatina za ActRIIb je praćeno regrutovanjem kinaze 4 (ALK4) ili ALK5 slične aktivin receptoru, a ActRIIb i ALK4/5 se vezuju za različite regione miostatina. Adnektini predmetnog pronalaska sprečavaju vezivanje ALK4/5, ali ne i ActRIIb, za miostatin (Sl.12B).
Slika 13 predstavlja računarski model koji prikazuje kompleks 3116_A06 i miostatina. Sl.
13A prikazuje strukturu samog miostatina (siva), sa naznačenim mestima vezivanja ALK4 i ActRIIB. Regioni u kojima se 3116_A06 vezuje za miostatin (tj., Regioni 1 i 2) su označeni crnom bojom, kao što je utvrđeno iz eksperimenata koji su opisani u Primeru 11. Sl. 13B prikazuje poželjni kompleks 3116_A06 (crno) i miostatina (sivo) dobijen od doking protokola kao što je opisano u Primeru 12. Regioni miostatina 1 i 2 kako su identifikovani uz pomoću HDX-MS (Primer 11) su predstavljeni u kalotnom (“space-fill”) samo na jednoj strani molekula, a BC, DE i FG petlje 3116_A06 su predstavljene u štapičastom prikazu. Iako ova slika prikazuje jedan Adnektin vezan za jedno od dva mesta vezivanja za Adnektin, treba napomenuti da bi moglo biti zauzeto bilo pojedinačno mesto vezivanja za Adnektin, bilo oba mesta vezivanja za Adnektin.
Slika 14 prikazuje stubičasti grafik koji prikazuje procentualno povećanje telesne mase 15. dana kod miševa tretiranih naznačenim anti-miostatin Adnektinima u poređenju sa kontrolnim miševima. B6 SCID miševi su tretirani bilo dvonedeljno bilo nedeljno subkutanim injektiranjem anti-miostatin Adnektina tokom 14 dana, kao što je opisano u Primeru 13. Telesne mase su merene tokom perioda lečenja; prikazane su izračunate vrednosti promene procenta za 15 dana. (*= označava statističke razlike u odnosu na odgovarajuću kontrolnu grupu; p ≤ 0.01 t-test).
Slika 15 prikazuje stubičasti grafik koji prikazuje povećanje zapremine mišića nogu (u cm<3>) 15. dana kod miševa tretiranih naznačenim anti-miostatin Adnektinima u poređenju sa kontrolnim miševima. B6 SCID miševi su tretirani bilo dvonedeljno bilo nedeljno subkutanim injektiranjem anti-miostatin Adnektina tokom 14 dana kao što je opisano u Primeru 13. (*= označava statističke razlike u odnosu na odgovarajuću kontrolnu grupu; p ≤ 0.05 t-test).
Slika 16 prikazuje stubičasti grafik koji prikazuje povećanje zapremine mišića nogu (u cm<3>) 28. dana kod miševa tretiranih različitim naznačenim dozama PRD-1474. B6 SCID miševi su tretirani bilo dvonedeljno bilo nedeljno subkutanim injektiranjem PRD-1474 tokom 28 dana kao što je opisano u Primeru 14. (*p< 0.0001; # nije značajno između grupa).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
[0029] Osim ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni pojmovi imaju isto značenje koje obično razume stručnjak iz oblasti. Iako se u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska mogu koristiti bilo koji postupci i kompozicije slični ili ekvivalentni onima koje su ovde opisani, ovde su opisani poželjni postupci i kompozicije.
[0030] "Miostatin pune dužine" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptidnu sekvencu pune dužine opisanu u McPherron i sarad. (1997), supra, kao i srodne peptide pune dužine uključujući alelne varijante i interspecijske homologe. Pojam "miostatin" ili "zreli miostatin" odnosi se na fragmente biološki aktivnog zrelog miostatina, kao i na srodne polipeptide uključujući alelne varijante, splajsne varijante, i fuzione peptide i polipeptide. Prijavljeno je da zreli C-terminal proteina ima 100% identičnosti sekvence među mnogim vrstama uključujući čoveka, miša, pile, svinju, ćurku i pacova (Lee i sarad., PNAS 2001;98:9306). Sekvenca za humani prepromiostatin je:
[0031] Sekvenca za humani promiostatin je:
[0032] Sekvenca za zreli miostatin (konzerviran kod čoveka, murine miša, pacova, pileta, ćurke, psa, konja i svinje) je:
[0033] "Polipeptid" kako se ovde koristi odnosi se na bilo koju sekvencu od dve ili više aminokiselina, bez obzira na dužinu, post-translacionu modifikaciju ili funkciju. "Polipeptid," "peptid" i "protein" se ovde koriste naizmenično. Polipeptidi mogu uključivati prirodne aminokiseline i aminokiseline koje nisu prirodne kao što su one opisane u američkom patentu sa brojem 6,559,126. Polipeptidi se takođe mogu modifikovati na bilo koji od različitih standardnih hemijskih načina (npr., aminokislena se može modifikovati sa zaštitnom grupom; karboksiterminalna aminokiselina može da se pretvori u terminalnu amidnu grupu; terminalni amino ostatak može biti modifikovan sa grupama da, npr., poveća lipofilnost; ili polipeptid može biti hemijski glikozilovan ili na drugi način modifikovan da poveća stabilnost ili in vivo poluživot). Modifikacije polipeptida mogu uključivati vezivanje druge strukture kao što je ciklično jedinjenje ili drugi molekul za polipeptid i takođe mogu uključiti polipeptide koji sadrže jednu ili više aminokiselina u izmenjenoj konfiguraciji (tj., R ili S; ili L ili D). Peptidi predmetnog pronalaska su proteini izvedeni iz desetog tipa III domena fibronektina koji su modifikovani da se vezuju za miostatin i ovde se pominju kao, "anti-miostatin Adnektin" ili "miostatin Adnektin."
[0034] "Polipeptidni lanac", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid gde je svaki od njegovih domena spojen sa drugim domenom(ima) peptidnom vezom(ama), za razliku od nekovalentnih interakcija ili disulfidnih veza.
[0035] "Izolovani" polipeptid je onaj koji je identifikovan i odvojen i/ili preuzet iz komponente svog prirodnog okruženja. Zagađujuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostiku ili terapijsku upotrebu polipeptida, a mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. U poželjnim tehničkim rešenjima, polipeptid će biti prečišćen (1) na više od 95% po masi polipeptida kako je određeno Lorijevom metodom, a najpoželjnije više od 99% po masi, (2) do stepena dovoljnog da se dobiju najmanje ostaci N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence korišćenjem rotirajuće čašice sekvenatora, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukujućim ili neredukujućim uslovima korišćenjem Komasi plave ili, poželjno, srebrne boje. Izolovani polipeptid uključuje polipeptid in situ unutar rekombinantnih ćelija pošto najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja polipeptida neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovani polipeptid će biti dobijen najmanje jednim korakom prečišćavanja.
[0036] "Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence" je ovde definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u odabranoj sekvenci, nakon poravnjanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalan procenat identičnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Usklađivanje u svrhu određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su u okviru struke, na primer, korišćenjem javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ili Megalign (DNASTAR<™>) softver. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako da odrede odgovarajuće parameter za merenje poravnjanja, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnjanja preko sekvenci punih dužina koje se porede. Na primer, % identičnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A prema, sa ili naspram date aminokiselinske sekvence B (koja se alternativno može izraziti kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identičnosti aminokiselinske sekvence, sa ili naspram date aminokiselinske sekvence B) izračunava se na sledeći način: 100 puta udeo X/Y gde je X broj aminokiselinskih ostataka postignutih kao identična poklapanja od strane programa za poravnjanje sekvence ALIGN-2 u poravnjanju A i B tog programa, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Biće shvaćeno da kada dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identičnosti aminokiselinske sekvence od A do B neće biti jednak % identičnosti aminokiselinske sekvence od B do A.
[0037] Kako se ovde koristi, "konzervativna supstitucija" označava zamenu aminokislenskih ostataka drugim, bez promene ukupne konformacije i funkcije peptida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, zamenu aminokiseline sa onom koja ima slična svojstva (kao što je, na primer, polarnost, potencijal vodonične veze, kiselost, baznost, oblik, hidrofobnost, aromatičnost i slično). Aminokiseline sa sličnim svojstvima su dobro poznate u oblasti. Na primer, arginin, histidin i lizin su hidrofilne-bazne aminokiseline i mogu biti izmenljive. Slično, izoleucin, hidrofobna aminokiselina, može se zameniti leucinom, metioninom ili valinom. Neutralne hidrofilne aminokiseline, koje se mogu zameniti jedna drugom, uključuju asparagin, glutamin, serin i treonin. Pod "supstitiuisanim"' ili "modifikovanim" predmetni pronalazak uključuje one aminokiseline koje su izmenjene ili modifikovane od aminokiselina koje se nalaze u prirodi. Kao takva, treba razumeti da je u kontekstu predmetnog pronalaska konzervativna supstitucija prepoznata u oblasti kao supstitucija jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima slična svojstva.
[0038] Kako se ovde koristi, pojam "mesto vezivanja Adnektina" odnosi se na mesto ili deo proteina (npr., miostatin) koji intereaguje ili se vezuje za određeni Adnektin (npr., pošto antitelo prepoznaje epitope). Mesta vezivanja Adnektina mogu da se formiraju od susednih aminokiselina ili aminokiselina koje nisu susedne ali su postavljene jedna uz drugu tercijarnim uvijanjem proteina. Mesta vezivanja Adnektina formirana susednim aminokiselinama se obično zadržavaju pri izlaganju denaturišućim rastvaračima, dok se mesta vezivanja Adnektina formirana tercijarnim uvijanjem obično gube pri tretmanu sa denaturišućim rastvaračima.
[0039] Mesto vezivanja Adnektina za anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska može se odrediti primenom standardnih tehnika koje se najčešće koriste za mapiranje epitope antitela uključujući, ali ne ograničavajući se na mapiranje proteaze i analizu mutacija. Alternativno, mesto vezivanja Adnektina se može odrediti testom kompeticije korišćenjem referentnog Adnektina ili antitela koje se vezuje za isti polipeptid, npr., miostatin (kao što je dalje opisano infra u odeljku "Unakrsna kompeticija Adnektina i/ili Adnektina koji se vezuju za isto mesto vezivanja Adnektina." Ako se ispitivani Adnektin i referentni molekul (npr., drugi Adnektin ili antitelo) takmiče, onda se vezuju za isto mesto vezivanja Adnektina ili mesta vezivanja Adnektina koja su dovoljno proksimalna tako da vezivanje jednog molekula interferira sa drugim.
[0040] Pojmovi "specifično vezuje," "specifično vezivanje," "selektivno vezivanje," i "selektivno vezuje," kako se ovde koriste naizmenično odnose se na Adnektin koji pokazuje afinitet za miostatin, ali se ne vezuje značajno (npr., manje od oko 10% vezivanja) za drugi polipeptid izmeren tehnikom dostupnom u oblasti kao što je, ali bez ograničenja, Scatchard-ova analiza i/ili testovi kompetitivnog vezivanja (npr., kompetitivni ELISA, BIACORE test). Pojam je takođe primenljiv kada je npr., domen vezivanja Adnektina predmetnog pronalaska specifičan za miostatin.
[0041] Pojam "preferencijalno vezuje" kako se ovde koristi odnosi se na situaciju u kojoj se Adnektin predmetnog pronalaska vezuje za miostatin najmanje oko 20% više nego što se vezuje za drugi polipeptid izmereno tehnikom dostupnom u oblasti kao što je, bez ograničenja, Scatchardova analiza i/ili testovi kompetitivnog vezivanja (npr., kompetitivni ELISA, BIACORE test).
[0042] Kako se ovde koristi, pojam "unakrsna reaktivnost" odnosi se na Adnektin koji se vezuje za više od jednog različitog proteina koji ima identična ili vrlo slična mesta vezivanja za Adnektine.
[0043] Pojam "KD," kako se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije adnektin-protein (npr., miostatin) ili afinitet Adnektina za protein (npr., miostatin), mereno korišćenjem testa površinske plazmonske rezonance ili testa ćelijskog vezivanja. "Željena KD," kako se ovde koristi, odnosi se na KDAdnektina koja je dovoljna za razmatrane svrhe. Na primer, željena KDse može odnositi na KDAdnektina koji je potreban za izazivanje funkcionalnog efekta u in vitro testu, npr., testu luciferaze baziranom na ćelijama.
[0044] Pojam "kas", kako se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na konstantu brzine asocijacije Adnektina u kompleksu Adnektin/protein.
[0045] Pojam "kdis", kako se ovde koristi, namenjen je da se odnosi na konstatu brzine disocijacije za disocijaciju Adnektina iz kompleksa Adnektin/protein.
[0046] Pojam "IC50", kako se ovde koristi, odnosi se na koncentraciju Adnektina koja inhibira odgovor, bilo u in vitro ili in vivo testu, do nivoa koji je 50% od maksimalnog inhibitornog odgovora, tj., na pola puta između maksimalnog inhibitornog odgovora i netretiranog odgovora.
[0047] Pojam "aktivnost miostatina" kako se ovde koristi odnosi se na jednu ili više aktivnosti regulacije rasta ili morfogenetskih aktivnosti u vezi sa vezivanjem aktivnog proteina miostatina za ActRIIb i naknadnim angažovanjem Alk4 ili Alk5. Na primer, aktivni miostatin je negativni regulator mase skeletnih mišića. Aktivni miostatin takođe može da moduliše proizvodnju enzima specifičnih za mišiće (npr., kreatin kinaza), stimuliše proliferaciju mioblasta i modulira diferencijaciju preadipocita u adipocite. Aktivnost miostatina se može odrediti korišćenjem postupaka poznatih u oblasti, kao što su oni opisani ovde.
[0048] Izrazi "inhibiraju aktivnost miostatina" ili "antagonizuju aktivnost miostatina" ili "antagonizuju miostatin" se koriste naizmenično da upućuju na sposobnost anti-miostatin Adnektina iz predmetnog pronalaska da neutrališu ili antagonizuju aktivnost miostatina in vivo ili in vitro. Pojmovi "inhibirati"ili "neutralisati" kako se ovde koristi u odnosu na aktivnost Adnektina predmetnog pronalaska označavaju sposobnost da se suštinski antagonizuje, zabrani, spreči, obuzda, uspori, omete, eliminiše, zaustavi, smanji ili preokrene npr., napredovanje ili ozbiljnost onoga što se inhibira uključujući, ali ne ograničavajući se na, biološku aktivnost ili svojstvo, bolest ili stanje. Inhibicija ili neutralizacija je poželjno najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili više.
[0049] Na primer, anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska može da smanji cirkulišuće nivoe biološki aktivnog miostatina koji se normalno nalazi kod kičmenjaka, ili smanji cirkulišuće nivoe biološki aktivnog miostatina kod subjekata sa poremećajima koji rezultiraju povišenim nivoima miostatina u cirkulaciji. Smanjenje aktivnosti miostatina može se odrediti korišćenjem in vitro testova, npr., testova vezivanja, kao što je ovde opisano. Alternativno, smanjenje aktivnosti miostatina može dovesti do povećanja telesne mase, povećanja mišićne mase, povećanja mišićne snage, promene u odnosu mišića i masti, povećanja mišićne mase bez masti, povećanja veličine i/ili broja mićnih ćelija, i/ili smanjenja sadržaja telesne masti.
[0050] Pojam "FK" je akronim za "farmakokinetički" i obuhvata osobine jedinjenja uključujući, na primer, apsorpciju, distribuciju, metabolizam i eliminaciju od strane subjekta. "FK modulacioni protein" ili "FK segment" kako se ovde koristi odnosi se na bilo koji protein, peptid, ili segment koji utiče na farmakokinetička svojstva biološki aktivnog molekula kada je fuzionisan ili administriran zajedno sa biološki aktivnim molekulom. Primeri FK modulacionog proteina ili FK segmenta uključuju PEG, veziva humanog serumskog albumina (HSA) kao što je stavljeno na uvid javnosti u američkim publikacijama sa brojevima 2005/0287153 i 2007/0003549, PCT publikacijama brojevi WO 2009/083804 i WO 2009/133208), humani serumski albumin, Fc ili Fc fragmenti i njihove varijante i šećeri (npr., sijalinska kiselina).
[0051] "Poluživot" aminokiselinske sekvence ili jedinjenja se generalno može definisati kao vreme potrebno da se koncentracija polipeptida u serumu smanji za 50%, in vivo, na primer zbog degradacije sekvence ili jedinjenja i/ili klirensa ili sekvestracije sekvence ili jedinjenja prirodnim mehanizmima. Poluživot se može odrediti na bilo koji način poznat sam po sebi, kao što je farmakokinetička analiza. Pogodne tehnike će biti jasne stručnjaku u ovoj oblasti, i mogu na primer generalno uključiti korake odgovarajućeg administriranja subjektu pogodne doze aminokiselinske sekvence ili jedinjenja predmetnog pronalaska; prikupljanje uzoraka krvi ili drugih uzoraka od subjekata u redovnim intervalima; određivanje nivoa ili koncentracije aminokiselinske sekvence ili jedinjenja predmetnog pronalaska u pomenutom uzorku krvi; i izračunavanje iz (grafikon) tako dobijenih podataka, vremena dok se nivo ili koncentracija aminokiselinske sekvence ili jedinjenja predmetnog pronalaska ne smanji za 50% u poređenju sa početnim nivoom nakon doziranja. Upućivanje je, na primer, na standardne priručnike, kao što su Kenneth, A. i sarad., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters i sarad., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996). Takođe se upućuje na Gibaldi, M. i sarad., Pharmacokinetics, 2. Rev. izdanje, Marcel Dekker (1982).
[0052] Poluživot se može izraziti korišćenjem parametara kao što su t1/2-alfa, t1/2-beta, HL_Lambda_z, površina ispod krive (AUC). U ovoj specifikaciji, "povećanje poluživota" se odnosi na povećanje bilo kog od ovih parametara, bilo koja dva od ovih parametara, bilo koja tri od ovih parametara ili sva četri od ovih parametara. "Povećanje poluživota" se posebno odnosi na povećanje t1/2-beta, i/ili HL_Lambda_z, bilo sa ili bez povećanja t1/2-alfa i/ili AUC ili oboje.
[0053] Oznake "mpk", "mg/kg" ili "mg po kg" se odnose na miligrame po kilogramu. Sve oznake se koriste naizmenično u ovoj objavi.
[0054] Pojmovi "pojedinac", "subjekt" i "pacijent," koji se ovde koriste naizmenično, odnose se na životinju, poželjno sisara (uključujući neprimate i primate) ili ptičije vrste, uključujući, ali ne ograničavajući se na, murine miševe, simijane, ljude, životinje sisare sa farme (npr., goveda, svinje, ovce), sportske životinje sisara (npr., konji) i kućne ljubimce sisara (npr., psi i mačke); poželjno se pojam odnosi na ljude. Pojam se takođe odnosi na vrste ptica, uključujući, ali ne ograničavajući se na, piliće i ćurke. U određenom tehničkom rešenju, subjekt, poželjno sisar, poželjno čovek, je dalje okarakterisan bolešću ili poremećajem ili stanjem koje bi imalo koristi od smanjenog nivoa ili smanjene bioaktivnost miostatina. U drugom tehničkom rešenju subjekt, poželjno sisar, poželjno čovek, je dalje okarakterisan kao izložen riziku od razvoja poremećaja, bolesti ili stanja koje bi imalo koristi od sniženog nivoa miostatina ili smanjene bioaktivnosti miostatina.
[0055] Pojam "terapijski efikasna količina" odnosi se na barem minimalnu dozu, ali manju od toksične doze agensa koja je neophodna da bi se se subjektu pružila terapijska korist. Na primer, terapijski efikasna količina anti-miostatin Adnektina pronalaska je količina koja kod sisara, poželjno ljudi, dovodi do jednog ili više od sledećeg: povećanja mišićnog volumena i/ili mišićne snage, smanjenja telesne masti, povećanja oseljivosti na insulin, ili lečenja stanja u kojima prisustvo miostatina izaziva ili doprinosi neželjenom patološkom efektu ili smanjenje nivoa miostatina dovodi do blagovremenog terapijskog efekta.
[0056] Pojam "slab" ili "slabost" kako se ovde koristi odnosi se na stanje koje se može okarakterisati sa dva ili više simptoma kao što su slabost, gubitak težine, usporena pokretljivost, umor, niski nivoi aktivnosti, slaba izdržljivost i poremećeni odgovor ponašanja na senzorne znakove, Jedno obeležje slabosti je "sarkopenija," ili gubitak mišićne mase koji je u vezi sa godinama.
[0057] Pojam "kaheksija" kako se ovde koristi odnosi se na stanje ubrzanog trošenja mišića i gubitka čiste telesne mase koje može biti rezultat različitih bolesti.
Pregled
[0058] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove polipeptide koji se vezuju za miostatin i antagonizuju ga (ovde se pominje kao "anti-miostatin Adnektini"). Da bi se identifikovali antagonisti miostatina, miostatin je predstavljen velikim sintetičkim bibliotekama Adnektina. Adnektini koji su se vezali za miostatin testirani su na vezivanje za miostatin, na biofizička svojstva, i na inhibitornu aktivnost miostatina. Anti-miostatin adnektini su mutirani i podvrgnuti daljem selektivnom pritisku snižavanjem ciljne koncentracije i selekcijom anti-miostatin Adnektina sa sporim brzinama isključenja. Iz ovog procesa optimizacije, familija Adnektina je identifikovana kao inhibitori specifični za miostatin sa povoljnom biohemijskom i biofizičkom aktivnošću. Anti-miostatin adnektini stavljeni na uvid javnosti u ovoj prijavi su korisni za lečenje poremećaja, bolesti i stanja za koje je poznato da je korisna inhibicija aktivnosti miostatina, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lečenje bolesti gubitka mišića, metaboličke poremećajei i atrofiju mišića usled neaktivnosti.
[0059] Kao što je stavljeno na uvid javnosti u Rebbapragada i sarad. (MCB 2003;23:7230-42), signalni put miostatina uključuje vezivanje miostatina za ActRIIb, nakon čega sledi regrutovanje kinaze 4 (ALK4) ili ALK5 slične aktivin receptoru. Vezivanje za ALKs indukuje fosforilaciju Smad2/Smad3, nakon čega sledi aktivacija signalnog puta sličnog TGFβ (videti, npr., Rebbapragada i sarad., MCB 2003;23:7230-42).
I. Skele na bazi fibronektina
[0060] Jedan aspekt prijave obezbeđuje anti-miostatin Adnektine koji sadrže Fn3 domen u kome su jedna ili više petlji dostupnih rastvaraču randomizovane ili mutirane. Polipeptidi predmetnog pronalaska su kao što je definisano u patentnim zahtevima. Tehnička predmetna objava navedena u nastavku može u nekim aspektima prevazići obim patentnih zahteva. Elementi predmetne objave koji ne spadaju u obim patentnih zahteva dati su za informaciju.
[0061] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, Fn3 domen je Fn3 domen izveden iz divljeg tipa desetog modula tipa III domena (<10>Fn3) humanog fibronektina:
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTAT ISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 4) (BC, DE, i FG petlje su podvučene).
[0062] U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, ne-ligand vezujuće sekvence<10>Fn3, tj., "<10>Fn3 skela", mogu biti izmenjene pod uslovom da<10>Fn3 zadrži funkciju vezivanja liganda i/ili strukturnu stabilnost. Prijavljeni su različiti mutanti<10>Fn3 skela. U jednom aspektu, jedna ili više Asp 7, Glu 9 i Asp 23 je zamenjena drugom aminokiselinom, kao što je, na primer, aminokiselinski ostatak koji nije negativno naelektrisan (npr., Asn, Lys, itd.). Prijavljeno je da ove mutacije imaju efekat promovisanja veće stabilnosti mutanta<10>Fn3 pri neutralnom pH u poređenju sa oblikom divljeg tipa (videti, npr., PCT publikaciju br. WO 02/04523). Stavljene su na uvid javnosti razne dodatne izmene u skeli<10>Fn3 koje su ili korisne ili neutralne. Videti, na primer, Batori i sarad., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (Decembar 2002); Koide i sarad., Biohemija, 40(34):10326-10333 (Avg.28, 2001).
[0063] Obe varijante i divlji tip<10>Fn3 proteina karakteriše ista struktura, odnosno sedam betalančanih domenskih sekvenci označenih od A do G i šest regiona petlje (AB petlja, BC petlja, CD petlja, DE petlja, EF petlja i FG petlja) koji povezuju sedam beta-lančanih domenskih sekvenci. Beta lanci smešteni najbliže N- i C-terminusima mogu usvojiti konformaciju sličnu beta u rastvoru. U SEQ ID NO:4, AB petlja odgovara ostacima 15-16, BC petlja odgovara ostacima 21-30, CD petlja odgovara ostacima 39-45, DE petlja odgovara ostacima 51-56, EF petlja odgovara ostacima 60-66, a FG petlja odgovara ostacima 76-87 (Xu i sarad., Hemija & Biology, 9:933-942, 2002).
[0064] Shodno tome, u nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin je<10>Fn3 polipeptid koji je najmanje 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ili 90% identičan sa ljudskim<10>Fn3 domenom, prikazan u SEQ ID NO:4. Veliki deo varijabilnosti će se generalno pojaviti u jednoj ili više petlji. Svaki od beta ili beta sličnih lanaca polipeptida<10>Fn3 može se u suštini sastojati od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identična sekvenci odgovarajućeg beta ili beta sličnog lanca SEQ ID NO:4, pod uslovom da takva varijacija ne remeti stabilnost polipeptida u fiziološkim uslovima.
[0065] Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-miostatin adnektin koji sadrži deseti tipa III domen fibronektina (<10>Fn3), pri čemu<10>Fn3 domen sadrži petlju, AB; petlju, BC; petlju, CD; petlju, DE; petlju EF; i petlju FG; BC, DE i FG petlje imaju izmenjenu aminokiselinsku sekvencu u odnosu na sekvencu odgovarajuće petlje ljudskog<10>Fn3 domena. Anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska sadrže<10>Fn3 domen koji sadrži aminokiselinsku sekvenca identičnu regionima koji nemaju petlju SEQ ID NO:4, pri čemu su BC, DE, i FG petlje izmenjene, tj.,<10>Fn3 domeni sadrže petlje koje se ne pojavljuju u prirodi. Pod "izmenjenim" se podrazumeva jedna ili više promena aminokiselinske sekvence u odnosu na templatnu sekvencu (odgovarajući domen humanog fibronektina) i uključuje aminokiselinske dopune, brisanja, supstitucije ili njihovu kombinaciju. Izmenjena aminokiselinska sekvenca može se postići namernim, slepim ili spontanim varijacijama sekvence, generalno sekvence koja kodira nukleinsku kiselinu, i može se do nje doći bilo kojom tehnikom, na primer, PCR, PCR sklon greškama, ili hemijskom sintezom DNK. Konkretno, antimiostatin adnektin prema predmetnom pronalasku sadrži ljudski<10>Fn3 domen koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 281.
[0066] U anti-miostatin Adnektinu predmetnog pronalaska, BC, DE, i FG petlje su produžene ili skraćene po dužini u odnosu na odgovarajuću petlju ljudskog fibronektina. Da bi se optimizovalo vezivanje antigena, dužina petlje od<10>Fn3 može biti promenjena po dužini kao i u sekvenci da bi se dobila najveća moguća fleksibilnost i afinitet u vezivanju antigena.
[0067] Anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska su bazirani na<10>Fn3 skeli i mogu se generalno definisati sledećom sekvencom:
EVVAAT(Z)aSLLI(Z)xYYRITYGE(Z)bQEFTV(Z)yATI(Z)cDYTITVYAV(Z)zISINYRT (SEQ ID NO: 5),
gde je AB petlja predstavljena sa (Z)a, CD petlja je predstavljena sa (Z)b, EF petlja je predstavljena sa (Z)e, BC petlja je predstavljena sa (Z)x, DE petlja je predstavljena sa (Z)y, i FG petlja je predstavljena sa (Z)z. Z predstavlja bilo koju aminokiselinu a indeks iza Z predstavlja ceo broj broja aminokiselina. Konkretno, a može biti bilo gde od 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3 ili 1-2 aminokiselina; i b, c, x, y i z mogu svaki nezavisno biti bilo gde od 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, ili 6-7 aminokiselina.
[0068] Tačnije, anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska su na bazi<10>Fn3 skele definisane generalno sekvencom:
Pri čemu je BC petlja predstavljena sa (Z)x, DE petlja je predstavljena sa (Z)y, i FG petlja je predstavljena sa (Z)z. Z predstavlja bilo koju aminokiselinu, a indeks iza Z predstavlja ceo broj broja aminokiselina. Konkretno, aminokiselinska sekvenca ljudskog<10>Fn3 domena sadržana u anti-miostatin Adnektinu prema predmetnom pronalasku je navedena u SEQ ID NO: 281.
[0069] U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin može da sadrži sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 5 ili 6, pri čemu se menja najmanje jedna od BC, DE i FG petlji predstavljena (Z)x, (Z)y, i (Z)z, redom. Kao što je gore opisano, aminokiselinski ostaci koji odgovaraju ostacima 21-30, 51-56, i 76-87 SEQ ID NO: 4 definišu BC, DE i FG petlje, redom. Međutim, treba razumeti da ne treba svaki ostatak unutar regiona petlje da se modifikuje da bi se postiglo<10>Fn3 vezivo koje ima jak afinitet za željenu metu (npr., miostatin).
[0070] Na primer, ostatke 21 (S) i 22 (W) BC petlje kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 nije potrebno modifikovati za vezivanje za miostatin. To jest,<10>Fn3 domeni sa visokim afinitetom vezivanja za miostatin mogu se dobiti modifikacijom samo ostataka 23-30 petlje BC kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4. Ovo je demonstrirano u BC petljama prikazanim u Tabeli 1, što ukazuje da su samo podvučene pozicije modifikovane.
[0071] Slično, pozicije 51 (P) i 56 (T) petlje DE kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4 ne moraju biti modifikovane za vezivanje miostatina. To jest,<10>Fn3 domeni sa visokim afinitetom vezivanja za miostatin mogu se dobiti modifikacijom samo ostataka 52-55 petlje DE kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4. Ovo je demonstrirano u DE petljama prikazanim u Tabeli 1, što ukazuje da su izmenjene samo ostaci koji obuhvataju podvučene pozicije.
[0072] Slično, pozicije 76 (T) i 87 (P) FG petlje kao što je prikazano u SEQ ID NO: 1 ne moraju biti modifikovane za vezivanje za miostatin. To jest,<10>Fn3 domeni sa visokim afinitetom vezivanja za miostatin mogu se dobiti modifikacijom samo ostataka 77-86 petlje FG kao što je prikazano u SEQ ID NO: 4. Ovo je demonstrirano u FG petljama prikazanim u Tabeli 1, što ukazuje da su izmenjeni samo ostaci koji obuhvataju podvučene pozicije.
[0073] Shodno tome, u nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC, DE, i FG regioni petlje anti-miostatin Adnektina mogu se opisati prema konsenzus sekvencama. Primeri ovih konsenzus sekvenci su BC, DE, i FG petlje prikazane u Tabeli 1, a kako je utvrđeno WebLogo analizom (Slike 2-7) (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: Generator logotipa sekvence. Genome Research 2004;14:1188-1190).
[0074] WebLogo analiza generiše potpis aminokislene koji odražava učestalost aminokiselina u svakoj izmenjenoj poziciji BC, DE ili FG petlje.
[0075] Na primer, u nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja, (Z)x, je definisana konsenzusnom sekvencom X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, gde je X1S, T ili Y; X2je H, Y, N, R, F, G, S ili T; X3je A, P, Q, S, F, H, N ili R; X4je G ili A; X5H, L, R, V, N, D, F, I ili K; X6je A, L, G, M, F, I ili V; i X7je H ili N. U određenim ovde opisanim poželjnim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu između SEQ ID NOs: 7, 11-21, 23-31, 34, i 36-38. U once ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, BC petlja sadrži aminokiselinu navedenu u SEQ ID NO.34.
[0076] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, DE petlja, (Z)y, je definisana konsenzusnom sekvencom G-R-G-X8, gde je X8V ili L. U određenim ovde opisanim poželjnim tehničkim rešenjima, DE petlja sadrži aminokislenu odabranu od SEQ ID NOs: 39 i 42. U once ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, DE petlja sadrži aminokiselinu navedenu u SEQ ID NO.39.
[0077] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, FG petlja, (Z)z, je definisana konsenzusnom sekvencom X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, gde je X9L, V ili I; X10je T ili S; X11je K, R, A, G, S, D, H, N, Tili P; X12je S, T, A, E, H, K ili N; X13je K, G, Q, D, E, N, T ili S; X14je V, I, F, L, M, P, T ili Y; X15je I, L ili Y; X16je H, I, V, K, L, R, F, G, S ili T; X17je Y ili H; i Xis je K, M, L, R ili V. U određenim ovde opisanim poželjnim tehničkim rešenjima, FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 46, 50-62, 64-72, 75-77, i 79. U once ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, FG petlja sadrži aminokiselinu navedenu u SEQ ID NO.75.
[0078] U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja, (Z)x, je definisana konsenzusnom sekvencom X19-X20-P-X21-G-X22-A, gde je X19D, E, V ili W; X20je A, S ili V; X21je R, A, G, K ili L; i X22je L ili R. U određenim ovde opisanim poželjnim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 8-10, 22, 32, 33 i 35.
[0079] U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, DE petlja, (Z)y, je definisana konsenzusnom sekvencom X23-G-R-G-X24, gde je X23V, P, F, I ili L; i X24je S, N ili T. U određenim ovde opisanim poželjnim tehničkim rešenjima, DE petlja sadrži i aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 40, 41 i 43-45.
[0080] U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, FG petlja, (Z)z, je definisana konsenzusnom sekvencom X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32, gde je X25I ili V; X26je F, D ili Y; X27je D ili T; X28je P, M, V ili T; X29je V, L, N, R ili S; X30je H, T, L, N, Q ili S; X31je F, W, Y, H ili L; i X32je D, A ili G. U određenim ovde opisanim poželjnim tehničkim rešenjima, FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 47-49, 63, 73, 74 i 78.
[0081] Shodno tome, u određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC petlju, (Z)x, koja ima sekvencu X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7i DE petlju, (Z)y, koja ima sekvencu G-R-G-X8, kako je gore definisano. U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 7, 11-21, 23-31, 34, i 36-38, a DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 39 i 42. U jednom ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, BC i DE petlje sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NOs: 34 i 39, redom.
[0082] U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC petlju, (Z)x, koja ima sekvencu X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7i FG petlju, (Z)z, koja ima sekvencu X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, kako je gore definisano. U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 7, 11-21, 23-31, 34 i 36-38, i FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 46, 50-62, 64-72, 75-77 i 79. U jednom ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, BC i FG petlje sadrže aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NOs: 34 i 75, redom.
[0083] U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži DE petlju, (Z)y, koja ima sekvencu G-R-G-Xs i FG petlju, (Z)z, koja ima sekvencu X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, kako je gore definisano. U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 39 i 42, i FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 46, 50-62, 64-72, 75-77, i 79. U jednom ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, DE i FG petlje sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NOs: 39 i 75, redom.
[0084] U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC petlju, (Z)x, koja ima sekvencu X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, DE petlju, (Z)y, koja ima sekvencu G-R-G-X8i FG petlju, (Z)z, koja ima sekvencu X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Xis, kako je gore definisano. U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID Nos: 7, 11-21, 23-31, 34, i 36-38, DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID Nos: 39 i 42, i FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID Nos: 46, 50-62, 64-72, 75-77 i 79. U jednom ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, BC, DE i FG petlje sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75, redom.
[0085] U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antimiostatin adnektin koji sadrži BC petlju, (Z)x, koja ima sekvencu X19-X20-P-X21-G-X22-A i DE petlju, (Z)y, koja ima sekvencu X23-G-R-G-X24, kako je gore definisano. U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 8-10, 22, 32, 33 i 35 a DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 40, 41 i 43-45.
[0086] U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC petlju, (Z)x, koja ima sekvencu X19-X20-P-X21-G-X22-A i FG petlju, (Z)z, koja ima sekvencu X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, kako je gore definisano. U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 8-10, 22, 32, 33, i 35 i FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 47-49, 63, 73, 74, i 78.
[0087] U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži DE petlju, (Z)y, koja ima sekvencu X23-G-R-G-X24i FG petlju, (Z)z, koja ima sekvencu X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, kako je gore definisano. U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 40, 41 i 43-45 a FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 47-49, 63, 73, 74 i 78.
[0088] U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC petlju, (Z)x, koja ima sekvencu X19-X20-P-X21-G-X22-A, sadrži DE petlju, (Z)y, koja ima sekvencu X23-G-R-G-X24i FG petlju, (Z)z, koja ima sekvencu X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, kako je gore definisano. U određenim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 8-10, 22, 32, 33 i 35, DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 40, 41 i 43-45, i FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NOs: 47-49, 63, 73, 74 i 78.
[0089] U određenim ovde opisanim poželjnim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 5 ili 6, gde su BC, DE i FG petlje predstavljene sa (Z)x, (Z)y, i (Z)z, redom, zamenjene odgovarajućim skupom BC, DE i FG petlji koje imaju konsenszusne sekvence SEQ ID NOs: 7-38, 39-45 i 46-79, redom.
[0090] U drugim ovde opisanim poželjnim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 5 ili 6, gde su BC, DE i FG petlje predstavljene sa (Z)x, (Z)y, i (Z)z, redom, zamenjene odgovarajućim skupom BC, DE i FG petlji koje imaju sekvence najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% identične sekvencama BC, DE ili FG petlji klonova navedenih u Tabeli 1.
[0091] U ovde opisanim primerima tehničkih rešenja, anti-miostatin adnektin je definisan SEQ ID NO: 5 i ima odgovarajući skup sekvenci BC, DE i FG petlji iz bilo kog od klonova navedenih u Tabeli 1. Na primer, klon 1979_B06 u Tabeli 1 sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 7, 39 i 46, redom. Stoga, anti-miostatin adnektin na bazi ovih petlji može da sadrži SEQ ID NO: 5 ili 6, pri čemu (Z)xsadrži SEQ ID NO: 7, (Z)ysadrži SEQ ID NO: 39 i (Z)zsadrži SEQ ID NO: 46. Slični konstrukti se razmatraju korišćenjem skupa BC, DE i FG petlji iz drugih klonova u Tabeli 1, ili konsenzusnih sekvenci SEQ ID NOs: 7-38, 39-45 i 46-79, redom. Regioni skele takvih anti-miostatin Adnektina mogu bilo gde sadržati od 0 do 20, od 0 do 15, od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 do 4, od 0 do 3, od 0 do 2 ili od 0 do 1 supstitucija, konzervativnih supstitucija, delecija ili adicija u odnosu na skelu aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO: 4. Takve modifikacije skele mogu biti napravljene, sve dok je anti-miostatin adnektin sposoban da veže miostatin sa željenom KD.
[0092] U poželjnim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja anti-miostatin Adnektina sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SWSLPHAGHVN (SEQ ID NO: 7), SWVSPRGRAR (SEQ ID NO: 8), SWEVPRGLAR (SEQ ID NO: 9), SWWAPLGLAR (SEQ ID NO: 10), SWTLPHAGLAH (SEQ ID NO: 11), SWYLPYPAHMN (SEQ ID NO: 12), SWSLPFAGHLN (SEQ ID NO: 13), SWSLPYSGLAN (SEQ ID NO: 14), SWSLPHAGHAH (SEQ ID NO: 15), SWTLPNFGLIN (SEQ ID NO: 16), SWTLPHAGRAH (SEQ ID NO: 17), SWSLPYAGHLN (SEQ ID NO: 18), SWSLPYAAHMN (SEQ ID NO: 19), SWSLPYPGHLN (SEQ ID NO: 20), SWSLPYAGHAH (SEQ ID NO: 21), SWDAPGGLAR (SEQ ID NO: 22), SWSLPTPGLAH (SEQ ID NO: 23), SWSLPHRGVAN (SEQ ID NO: 24), SWSLPSSGVAH (SEQ ID NO: 25), SWSLPHHGFGH (SEQ ID NO: 26), SWSLPHAGDAH (SEQ ID NO: 27), SWSLPHNGVAH (SEQ ID NO: 28), SWSLPRQGLAN (SEQ ID NO: 29), SWSLPGPGHFH (SEQ ID NO: 30), SWSLPHPGLGH (SEQ ID NO: 31), SWDAPRGLAR (SEQ ID NO: 32), SWDAPAGLAR (SEQ ID NO: 33), SWSLPHQGKAN (SEQ ID NO: 34), SWDAPKGLAR (SEQ ID NO: 35), SWSLPNPGIAH (SEQ ID NO: 36), SWSLPRPGNAH (SEQ ID NO: 37), i SWSLPNPGNAH (SEQ ID NO: 38). U anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu SWSLPHQGKAN (SEQ ID NO: 34).
[0093] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja anti-miostatin adnektin sadrži podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NOs: 7-38, kao što je prikazano u Tabeli 1. U once ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, BC petlja sadrži podvučeni deo SEQ ID NO: 34.
[0094] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, DE petlja anti-miostatin Adnektina sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od PGRGVT (SEQ ID NO: 39), PGRGST (SEQ ID NO: 40), LGRGST (SEQ ID NO: 41), PGRGLT (SEQ ID NO: 42), IGRGST (SEQ ID NO: 43), FGRGTT (SEQ ID NO: 44), i VGRGNT (SEQ ID NO: 45). U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, DE petlja anti-miostatin Adnektina predmetnog pronalaska sadrži podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NOs: 39-45, kao što je prikazano u Tabeli 1. U jednom ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin adnektini prema predmetnom pronalasku, DE petlja sadrži podvučeni deo SEQ ID NO: 39.
[0095] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, FG petlja anti-miostatin Adnektina sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od TLTKSQMIHYMP (SEQ ID NO: 46), TIYRDGMSHHDP (SEQ ID NO: 47), TVYRDGPLLLAP (SEQ ID NO: 48), TIFRTGMVQYDP (SEQ ID NO: 49), TLTNSEIILYKP (SEQ ID NO: 50), TLTKSQILHHRP (SEQ ID NO: 51), TLTRSKIIHYMP (SEQ ID NO: 52), TLTHSNIIRYVP (SEQ ID NO: 53), TVSSTKVIVYLP (SEQ ID NO: 54), TITKSTIIIYKP (SEQ ID NO: 55), TVTTTSVILYKP (SEQ ID NO: 56), TLTKSQLIHYMP (SEQ ID NO: 57), TLTRSQVIHYMP (SEQ ID NO: 58), TLTKSKIIHYMP (SEQ ID NO: 59), TVSSTKVIHYKP (SEQ ID NO: 60), TLTKSKVIHYMP (SEQ ID NO: 61), TVTTTKVIHYKP (SEQ ID NO: 62), TIDRDGVNHFAP (SEQ ID NO: 63), TVTHHGVIGYKP (SEQ ID NO: 64), TLTGANVIIYKP (SEQ ID NO: 35), TVTNTGVIIYKP (SEQ ID NO: 66), TVTATGIIIYKP (SEQ ID NO: 67), TVTRAGFYRYKP (SEQ ID NO: 68), TVTREEVISYKP (SEQ ID NO: 69), TVTAAGVIIYKP (SEQ ID NO: 70), TVTANQPIIYKP (SEQ ID NO: 71), TITPETIIVYKP (SEQ ID NO: 72), TIDRDGTRSFDP (SEQ ID NO: 73), TIFRDGPVTWDP (SEQ ID NO: 74), TVTDTGYLKYKP (SEQ ID NO: 75), TLTGSDTIFYKP (SEQ ID NO: 76), TVTGKDVIKYKP (SEQ ID NO: 77), TIFRDGVVNYGP (SEQ ID NO: 78), i TVTDTGFITYKP (SEQ ID NO: 79). U anti-miostatin Adnektinima prema predmetnom pronalasku, FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu TVTDTGYLKYKP (SEQ ID NO: 75).
[0096] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, FG petlja anti-miostatina sadrži podvučeni deo bilo koje od SEQ ID Nos: 46-79, kao što je prikazano u Tabeli 1. U jednom ovde opisanom tehničkom rešenju i u anti-miostatin adnektini prema predmetnom pronalasku, FG petlja sadrži podvučeni deo SEQ ID NO: 75.
[0097] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži jednu sekvencu BC petlje odabranu od sekvenci BC petlje koje imaju SEQ ID NOs: 7-38, ili podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NOs: 7-38, kao što je prikazano u Tabeli 1; jedna sekvenca DE petlje odabrana od sekvenci DE petlje koje imaju SEQ ID NOs: 39-45, ili podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NOs: 39-45 kao što je prikazano u Tabeli 1; i jednu sekvencu FG petlje odabranu od sekvenci FG petlje koje imaju SEQ ID NOS: 46-79, ili podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NOS: 46-79 kao što je prikazano u Tabeli 1. U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlju aminokiselinske sekvence najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu bilo kojoj od SEQ ID NOs: 7-38, 39-45, i 46-79, redom. U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlju aminokiselinske sekvence najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu podvučenom delu bilo koje od SEQ ID NOS: 7-38, 39-45 i 46-79, redom, kao što je prikazano u Tabeli 1.
[0098] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 80-123, 228-239 i 252-273 (sekvence pune dužine iz Tabela 2, 5 i 6). U tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, anti-miostatin adnektin sadrži aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOs: 118, 264, 269 i 273 (sekvence pune dužine iz Tabela 2 i 6). U jednom tehničkom rešenju, anti-miostatin adnektin sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 273.
[0099] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu bilo kojoj od SEQ ID NOs: 80-123, 228-239 i 252-273. U drugim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu ne-BC, DE i FG regionima petlje SEQ ID NOs: 80-123, 228-239 i 252-273.
[0100] Anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska sadrži BC, DE, i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75, redom. Anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 281 [jezgrena adnektin sekvenca koju dele PRD-1474 i 3116_A06, kojoj prethodi N-terminalna produžena sekvenca (GVSDVPRDL) i koju sledi C-terminalni rep (EI)]. U jednom tehničkom rešenju, anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 273 [PRD-1474] ili SEQ ID NO: 118 [3116_A06]. Anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 331 [jezgrena adnektin sekvenca PRD-1474 i 3116_A06 bez N-terminalne vodeće sekvence ili C-terminalnog repa]. Jezgrena adnektin sekvenca PRD-1474 i 3116_A06 je navedena u nastavku:
EWAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPG VDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRT (SEQ ID NO: 331)
[0101] U jednom ovde opisanom tehničkom rešenju, anti-miostatin adnektin koji je ovde stavljen na uvid javnosti može se opisati u odnosu na anti-miostatin adnektin koji sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75.
[0102] Shodno tome, u nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75, redom, pri čemu BC petlja sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne supstitucije conservative aminokiselina. Shodno tome, u nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja je definisana konsenzusnom sekvencom X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, gde je X33T ili Y; X34je Y, N, R, F, G, S, ili T; X35je A, P, S, F, H, N, ili R; X36je A; X37is H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38je L, G, M, F, I, ili V; i X39je H.
[0103] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39, i 75, redom, pri čemu DE petlja sadrži 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna supstitucija aminokiselina. Shodno tome, u nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, DE petlja je definisana konsenzusnom sekvencom G-R-G-X40, gde je X40L.
[0104] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75, redom pri čemu FG petlja sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. Shodno tome, u nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, FG petlja je definisana konsenzusnom sekvencom X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, gde je X41L ili I; X42je S; X43je K, R, A, G, S, H, N, T, ili P; X44je S, A, E, H, K, ili N; X45je K, Q, D, E, N, T, ili S; X46is V, I, F, L, M, P, ili T; X47je I ili Y; X48je H, I, V, L, R, F, G, S ili T; X49je H; i X50je M, L, R, ili V.
[0105] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75, redom, pri čemu BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije, i DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija. U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, gde je X33T ili Y; X34je Y, N, R, F, G, S, ili T; X35je A, P, S, F, H, N, ili R; X36je A; X37je H, L, R, V, N, D, F ili I; X38je L, G, M, F, I, ili V; i X39je H, i DE petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X40, gde je X40L.
[0106] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75, redom, pri čemu BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije, i FG petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, gde je X33T ili Y; X34je Y, N, R, F, G, S, ili T; X35je A, P, S, F, H, N, ili R; X36je A; X37je H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38je L, G, M, F, I ili V; i X39je H, i FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, gde je X41L ili I; X42je S; X43je K, R, A, G, S, H, N, T, ili P; X44je S, A, E, H, K, ili N; X45je K, Q, D, E, N, T, ili S; X46je V, I, F, L, M, P, ili T; X47je I ili Y; X48je H, I, V, L, R, F, G, S, ili T; X49je H; i X50je M, L, R ili V.
[0107] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75, redom, pri čemu i DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija, a FG petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X40, gde je X40L, i FG petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, gde je X41L ili I; X42je S; X43je K, R, A, G, S, H, N, T ili P; X44je S, A, E, H, K ili N; X45je K, Q, D, E, N, T ili S; X46je V, I, F, L, M, P ili T; X47je I ili Y; X48je H, I, V, L, R, F, G, S ili T; X49je H; i X50je M, L, R ili V.
[0108] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75, redom, pri čemu BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije, i DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što su a konzervativna aminokiselinska supstitucija, a FG petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, gde je X33je T ili Y; X34je Y, N, R, F, G, S ili T; X35je A, P, S, F, H, N ili R; X36je A; X37je H, L, R, V, N, D, F ili I; X38je L, G, M, F, I ili V; i X39je H; DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli GR-G-X40, gde je X40L; i FG petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, gde je X41je L ili I; X42je S; X43je K, R, A, G, S, H, N, T ili P; X44je S, A, E, H, K ili N; X45je K, Q, D, E, N, T ili S; X46je V, I, F, L, M, P ili T; X47je I ili Y; X48je H, I, V, L, R, F, G, S ili T; X49je H; i X50je M, L, R ili V.
[0109] U jednom ovde opisanom tehničkom rešenju, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje kao što je navedeno u SEQ ID NOs: 34, 39 i 75, redom, i ima aminokiselinske supstitucije u BC, DE i FG petljama koje omogućavaju anti-miostatin adnektinu da održi vezivanje za miostatin. Takve aminokiselinske supstitucije mogu se odrediti, npr., dubokim mutacionim skeniranjem, kao što je opisano u Primeru 8.
[0110] Shodno tome, u nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC petlju koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, pri čemu: X51je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X52je odabran iz grupe koja se sastoji od L, M i V; X53je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V i Y; X54je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X55je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X56je odabranu iz grupe koja se sastoji od G i S; X57je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; Xss je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, G, L, M, S i T; i X59je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, F, H, N, P, Q, R, S i Y. U poželjnom tehničkom rešenju, X51je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, I, S, V, W i Y; X52je odabran iz grupe koja se sastoji od L; X53je odabran iz grupe koja se sastoji od P; X54je odabran iz grupe koja se sastoji od C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X55je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X56je odabran iz grupe koja se sastoji od G; X57je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W i Y; X58je odabran iz grupe koja se sastoji od A, G, L, M i S; i X59je odabran iz grupe koja se sastoji od C, H, N, Q, S i Y. U poželjnijem ovde opisanom tehničkom rešenju, X51je odabran iz grupe koja se sastoji od F, S i W; X52je odabran iz grupe koja se sastoji od L; X53je odabran iz grupe koja se sastoji od P; X54je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W i Y; X55je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V i Y; X56je odabran iz grupe koja se sastoji od G; X57je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, H, K, L, M, N, R, V, W i Y; X58je odabran iz grupe koja se sastoji od A, G i L; i X59je odabran iz grupe koja se sastoji od H, N i Q.
[0111] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, the anti-miostatin adnektin sadrži a DE petlja koji sadrži aminokiselinska sekvenca prema formuli G-R-G-X60, pri čemu X60je A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T, i V. U poželjnom ovde opisanom tehničkom rešenju, X60je C, E, I, L, M, Q, T, i V. U poželjnijem ovde opisanom tehničkom rešenju , X60je C, E, I, L, M, i V.
[0112] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži FG petlju koja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, pri čemu je X61odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W i Y; X62je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X63je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X64je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X65je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X66je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W i Y; X67je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X68je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X69je odabran iz grupe koja se sastoji od F, W, i Y; i X70je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y. U poželjnom ovde opisanom tehničkom rešenju, X61je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, I, L, M i V; X62je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W i Y; X63je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W i Y; X64je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X65je odabran iz grupe koja se sastoji od A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W i Y; X66je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, I, L, M, P, T, V, W i Y; X67je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W i Y; X68je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X69je odabran iz grupe koja se sastoji od W i Y; i X70je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T i V. U poželjnijem ovde opisanom tehničkom rešenju, X61je odabran iz grupe koja se sastoji od I i V; X62je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, I, L, M, T, V, W i Y; X63je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T i V; X64je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W i Y; X65je odabran iz grupe koja se sastoji od A, G, S, T i W; X66je odabran iz grupe koja se sastoji od F, I, V, W i Y; X67je odabran iz grupe koja se sastoji od F, H, I, L, M, V, W i Y; X68je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, F, G, I, K, L, M, T, V i W; X69je odabran iz grupe koja se sastoji od W i Y; i X70je odabran iz grupe koja se sastoji od A, G, K, L, M, P, Q i R.
[0113] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje, pri čemu BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, gde, X51je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X52je odabran iz grupe koja se sastoji od L, M, i V; X53je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V i Y; X54je A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X55je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X56je odabran iz grupe koja se sastoji od G i S; X57je A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X58je A, C, G, L, M, S i T; i X59je A, C, F, H, N, P, Q, R, S i Y; DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, gde je X60odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T i V; i FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, gde je X61odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W i Y; X62je A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X63je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X64je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X65je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X66je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W i Y; X67je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X68je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X69je odabran iz grupe koja se sastoji od F, W i Y; i X70je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y.
[0114] U poželjnom ovde opisanom tehničkom rešenju, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje, pri čemu BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, pri čemu, X51je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, I, S, V, W i Y; X52je L; X53je P; X54je odabran iz grupe koja se sastoji od C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X55je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X56je G; X57je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W i Y; X58je odabran iz grupe koja se sastoji od A, G, L, M i S; i X59je odabran iz grupe koja se sastoji od C, H, N, Q, S i Y; DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, gde je X60odabran iz grupe koja se sastoji od C, E, I, L, M, Q, T i V; i FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, gde je X61odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, I, L, M, i V; X62je C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W i Y; X63je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W i Y; X64je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W i Y; X65je odabran iz grupe koja se sastoji od A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W i Y; X66je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, I, L, M, P, T, V, W i Y; X67je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W i Y; X68je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y; X69je odabran iz grupe koja se sastoji od W i Y; i X70je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W i Y.
[0115] U poželjnijem ovde opisanom tehničkom rešenju, anti-miostatin adnektin sadrži BC, DE i FG petlje, pri čemu BC petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, gde je, X51odabran iz grupe koja se sastoji od F, S i W; X52je L; X53je P; X54je odabran iz grupe koja se sastoji od C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W i Y; X55je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, i Y; X56je G; X57je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, H, K, L, M, N, R, V, W i Y; X58je odabran iz grupe koja se sastoji od A, G i L; i X59je odabran iz grupe koja se sastoji od H, N i Q; DE petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, gde je X60odabran iz grupe koja se sastoji od C, E, I, L, M i V; i FG petlja sadrži aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, gde je X61odabran iz grupe koja se sastoji od I i V; X62je C, F, I, L, M, T, V, W i Y; X63je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T i V; X64je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W i Y; X65je odabran iz grupe koja se sastoji od A, G, S, T, i W; X66je odabran iz grupe koja se sastoji od F, I, V, W i Y; X67je odabran iz grupe koja se sastoji od F, H, I, L, M, V, W i Y; X68je odabran iz grupe koja se sastoji od A, C, F, G, I, K, L, M, T, V i W; X69je odabran iz grupe koja se sastoji od W i Y; i X70je odabran iz grupe koja se sastoji od A, G, K, L, M, P, Q i R.
[0116] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin je kodiran sekvencom nukleinske kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 124-167, 240-251 i 284-305 (sekvence pune dužine iz Tabela 2, 5 i 6). U nekim tehničkim rešenjima, antimiostatin adnektin je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identična bilo kojoj od SEQ ID NOs: 124-167, 240-251, i 284-305. U once tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, anti-miostatin adnektin je kodiran sekvencom nukleinske kiseline kao što je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 296, 301 i 305. Fibronektin prirodno vezuje određene tipove integrina preko svog integrin-vezujućeg motiva, "arginin-glicin-asparaginska kiselina" (RGD). Polipeptid predmetnog pronalaska sadrži<10>Fn3 domen kome nedostaje (RGD) integrin vezujući motiv. Domen koji se vezuje za integrin se može ukloniti promenom RGD sekvence aminokiselinskom supstitucijom, decijom ili insercijom.
[0117] U nekim ovde opisanim tehničkim rešenjima, BC, DE i/ili FG petlje aminokiselinskih sekvenci su identične podvučenom delu bilo koje od SEQ ID NOs: 7-38, 39-45 i 46-79, redom, kao što je prikazano u Tabeli 1, kalemljeni su u proteinske skele bez domena<10>Fn3. Na primer, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci petlje se razmenjuju ili se ubacuju u jednu ili više CDR petlji teškog ili lakog lanca antitela ili njegovog fragmenta. U drugim ovde opisanim tehničkim rešenjima, proteinski domen u kojem se jedna ili više aminokiselinskih sekvenci petlje razmenjuje ili ubacuje, uključuje, ali nije ograničeno na, konsenzus Fn3 domene (Centocor, SAD), ankirin ponavljajuće proteine (Molecular Partners AG, Cirih Švajcarska), domen antitela (Domantis, Ltd, Kembridž, MA), nanotela kamile sa jednim domenom (Ablynx, Belgija), Lipokaline (npr., antikalini; Pieris Proteolab AG, Frajsing, Nemačka), Avimere (Amgen, CA), afitela (Affibody AG, Švetska), ubikvitine (npr., afilini; Scil Proteins GmbH, Hale, Nemačka), mimetike proteinskih epitopa (Polyphor Ltd, Allschwil, Švajcarska), spiralne snopovske skele (npr. alfatela, Complix, Belgija), Fyn SH3 domene (Covagen AG, Švajcarska) ili atrimere (Anafor, Inc., CA).
[0118] SEQ ID NOs BC, DE i FG petlji ovde opisanih primera anti-miostatin adnektina i antimiostatin adnektina predmetnog pronalaska (videti 3116_A06) su predstavljene u Tabeli 1.
Tabela 1
Anti-miostatin adnektin BC, DE i FG petlje
Anti-miostatin adnektin BC, DE i FG petlje
[0119] SEQ ID NOs ovde opisanih primera anti-miostatin monoadnektina i primera anti-miostatin monoadnektina predmetnog pronalaska (videti 3116_A06) su predstavljeni u Tabeli 2.
Tabela 2
Međusobno konkurentni adnektini i/ili adnektini koji se vezuju za isto mesto vezivanja adnektina
[0120] Dalje, ovde su opisani adnektini koji se takmiče (npr., međusobno se nadmeću) za vezivanje za miostatin sa određenim ovde opisanim anti-miostatin adnektinima. Takvi konkurentni adnektini se mogu identifikovati na osnovu njihove sposobnosti da kompetitivno inhibiraju vezivanje za miostatin ovde opisanih adnektina u standardnim testovima vezivanja miostatina. Na primer, mogu se koristiti standardni ELISA testovi u kojima se rekonbinantni protein miostatina imobiliše na ploči, jedan od adnektina je fluorescentno obeležen i procenjuje se sposobnost neobeleženih adnektina da se takmiče sa obeleženim adnektinom za vezivanje.
[0121] Kompetitivni ELISA format se može izvesti da bi se utvrdilo da li se anti-miostatin adnektini vezuju na preklapajuća mesta vezivanja Adnektina na miostatinu. U jednom formatu, Adnektin #1 se nanosi na ploču, koja se zatim blokira i ispira. Ovoj ploči se dodaje ili sam miostatin, ili miostatin prethodno inkubiran sa zasićenom koncentracijom Adnektina #2. Posle odgovarajućeg perioda inkubacije, ploča se ispere i testira sa poliklonskim anti-miostatin antitelom, kao što je biotinilovano kozje anti-miostatin poliklonsko antitelo (R&D Systems), nakon čega sledi detekcija konjugatom streptavidin-HRP i standardnim postupcima razvoja tetrametilbenzidina. Ako je OD signal isti sa ili bez prethodne inkubacije sa Adnektinom #2, tada se dva Adnektina vezuju nezavisno jedan od drugog i njihova mesta vezivanja Adnektina se ne preklapaju. Međutim, ako je OD signal za bunariće koji su primili smeše miostatin/Adnektin#2 niži nego za one koji su primili sam miostatin, tada je potvrđeno da vezivanje Adnektina #2 blokira vezivanje Adnektina #1 za miostatin.
[0122] Alternativno, sličan eksperiment se sprovodi površinskom plazmonskom rezonancom (SPR- surface plasmon resonance, npr., BIAcore). Adnektin #1 se imobiliše na na površini SPR čipa, nakon čega slede injekcije ili samog miostatina ili miostatina prethodno inkubiranog sa zasićenom koncentracijom Adnektina #2. Ako je signal vezivanja za smeše miostatin/Adnektin#2 isti ili veći od signala samog miostatina, tada se Adnektini vezuju nezavisno jedan od drugog, i njihova mesta vezivanja za Adnektin se ne preklapaju. Međutim ako je, signal vezivanja za smeše miostatin/Adnektin#2 niži od signala vezivanja za sam miostatin, tada se potvrđuje da vezivanje Adnektina #2 blokira vezivanje Adnektina #1 za miostatin. Karakteristika ovih eksperimenata je upotreba zasićenih koncentracija Adnektina #2. Ako miostatin nije zasićen Adnektinom#2, gore navedeni zaključci ne važe. Slični eksperimenti se mogu koristiti da bi se utvrdilo da li se, bilo koja dva proteina koji se vezuju za miostatin, vezuju za preklapajuća mesta vezivanja za Adnektin.
[0123] Oba testa navedena iznad mogu se takođe izvesti obrnutim redosledom gde je Adnektin#2 imobilizovan a miostatin -adnektin#1 dodat na ploču. Alternativno, adnektin #1 i/ili #2 mogu biti zamenjeni monoklonskim antitelom i/ili rastvorljivim receptor-Fc fuzionim proteinom.
[0124] Kompeticija se takođe može odrediti korišćenjem HTRF sandvič testa, kao što je opisano u Primeru 4.
[0125] Konkurentni adnektin može biti adnektin koji se vezuje za isto mesto vezivanja adnektina na miostatinu kao određeni anti-miostatin adnektin opisan ovde. Standardne tehnike mapiranja, kao što su mapiranje proteaza, mutaciona analiza, rendgenska kristalografija i 2-dimenzionalna nuklearna magnetna rezonanca, mogu da se koriste da bi se utvrdilo da li se adnektin vezuje za isto mesto vezivanja adnektina kao referentni adnektin (videti, npr., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Tom 66, G. E. Morris, Izd. (1996)).
[0126] Konkurentni kandidat anti-miostatin adnektina može inhibirati vezivanje anti-miostatin adnektina predmetnog pronalaska za miostatin za najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99%. % kompeticije se može odrediti primenom gore opisanih postupaka.
[0127] Molekuli koji se takmiče sa anti-miostatin adnektinima predmetnog pronalaska ne moraju biti adnektin, ali mogu biti bilo koji tip molekula koji se vezuje za miostatin, kao što je, ali bez ograničenja, antitelo, mali molekul, peptid i slično.
[0128] Adnektini predmetnog pronalaska vezuju se za diskontinuirano mesto vezivanja adnektina na miostatinu. Polipeptidi predmetnog pronalaska vezuju se unutar dva regiona, aminokiseline 85-101 i 55-66, miostatina (SEQ ID NO: 3).
[0129] Polipeptidi predmetnog pronalaska se ne takmiče za vezivanje za miostatin sa ActRIIB. Polipeptidi predmetnog pronalaska se takmiče za vezivanje za miostatin sa ALK4 i/ili ALK5.
II. Produžene sekvence
[0130] U određenim tehničkim rešenjima, molekuli anti-miostatin adnektina mogu biti modifikovani tako da sadrže N-terminalnu produženu sekvencu i/ili C-terminalni produžetak. Na primer, MG sekvenca se može postaviti na N-terminus<10>Fn3 defininisanog SEQ ID NO: 4. M će se obično odcepiti, ostavljajući G na N-terminusu. Molekuli anti-miostatin adnektina prema predmetnom pronalasku sadrže G na N-terminusu (SEQ ID NO: 281). Alternativno, prvih 10 aminokiselina anti-miostatin adnektina prikazanih u Tabeli 2 mogu da se zamene alternativnom N-terminalnom sekvencom, koja se ovde naziva produžecima N-terminusa, kao što je prikazano u Tabeli 7. Pored toga, M, G ili MG takođe mogu biti postavljeni na N-terminus bilo kog od N-terminalnih produžetaka prikazanih u Tabeli 7. Ovde opisani anti-miostatin adnektini mogu takođe da sadrži alternativne C-terminalne repne sekvence, koje se ovde nazivaju C-terminalne produžene sekvence. Na primer, sekvence anti-miostatin adnektina prikazane u Tabeli 2 mogu biti skraćene na treoninu koji odgovara T94 SEQ ID NO: 4 (tj., skraćene nakon INYRT (SEQ ID NO: 168) dela sekvence). Takva skracena verzija se može koristiti kao terapijski molekuli u skraćenom obliku, ili se mogu dodati alternativni C-terminalni produžeci nakon treoninskog ostatka. Primeri sekvenci C-terminalnih produžetaka su prikazani u Tabeli 7. Primeri anti-miostatin Adnektina koji sadrže C-terminalne produžene sekvence su prikazani u Tabeli 2 kao SEQ ID NOs: 80-123. Na primer, SEQ ID NO: 80 (klon 1979_B06) sadrži prirodni C-terminalni produžetak EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211) praćen oznakom His6 (SEQ ID NO: 328). Međutim, treba razumeti da je oznaka His6 potpuno opciona.
[0131] U određenim tehničkim rešenjima, sekvence C-terminalnog produžetka (takođe nazvane "repovi"), sadrži E i D ostatke, i mogu biti između 8 i 50, 10 i 30, 10 i 20, 5 i 10, i 2 i 4 aminokiselina u dužini. U nekim tehničkim rešenjima, repne sekvence uključuju veznike na bazi ED u kojima sekvenca sadrži tandem ponavljanja ED. U uzetim za primer tehničkim rešenjima, repna sekvenca sadrži 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 ili 5 ED ponavljanja. U određenim tehničkim rešenjima, repne sekvence bazirane na ED mogu takođe uključiti dodatne ostatke aminokiselina, kao što su, na primer: EI, EID, ES, EC, EGS i EGC. Takve sekvence su delimično zasnovane na poznatim repnim sekvencama adnektina, kao što su EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211), u kojima su uklonjeni D i K ostaci. U uzetim za primer tehničkim rešenjima, rep baziran na ED sadrži E, I ili EI ostatke pre nego što se ED ponavlja. Molekuli anti-miostatin adnektina prema predmetnom pronalasku sadrže EI ostatake na C-terminusu (SEQ ID NO: 281).
[0132] U drugim tehničkim rešenjima, N- ili C-terminalne sekvence mogu se kombinovati sa poznatim sekvencama veznika (npr., SEQ ID NO: 181-227 u Tabeli 4) po potrebi kada se dizajnira fuzioni molekul anti-miostatin adnektina. U nekim tehničkim rešenjima, sekvence mogu biti postavljene na C-terminusu<10>Fn3 domena da bi se olakšalo vezivanje farmakokinetičkog dela. Na primer, veznik koji sadrži cistein kao što je GSGC (SEQ ID NO: 189) može se dodati C-terminus da bi se olakšala PEGilcija usmerena na cisteinski ostatak. Uzeti za primer anti-miostatin adnektini koji sadrže veznik koji sadrži cistein prikazani su u Tabeli 5 kao SEQ ID NOs: 228-239.
III. Farmakokinetički segmenti
[0133] U jednom aspektu, prijava obezbeđuje anti-miostatin adnektine koji dalje sadrže farmakokinetički (FK) segment. Poboljšana farmakokinetika se može proceniti u skladu sa uočenom terapijskom potrebom. Često je pozeljno povećati bioraspoloživost i/ili povećati vreme između doza, verovatno povećanjem vremena u kome protein ostaje dostupan u serumu nakon vezivanja. U nekim slučajevima, poželjno je poboljšati kontinuitet koncentracije proteina u serumu tokom vremena (npr., smanjiti razliku u koncentraciji proteina u serumu ubrzo nakon primene i neposredno pre sledeće primene). Anti-miostatin adnektin može biti vezan za segment koji smanjuje brzinu klirensa polipeptida kod sisara (npr., miša, pacova ili čoveka) za više od dva puta, više od tri puta, više od četiri puta ili više od pet puta u odnosu na nemodifikovani anti-miostatin adnektin. Druge mere poboboljšane farmakokinetike mogu uključiti poluživot u serumu, koje se često dele na alfa fazu i beta fazu. Jedna ili obe faze mogu se značajno poboljšati dodavanjem odgovarajućeg segmenta. Na primer, FK segment može da poveća poluživot polipeptida u serumu za više od 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000% ili više u odnosu na sam Fn3 domen.
[0134] Segmenti koji usporavaju uklanjanje proteina iz krvi, koji se ovde nazivaju "FK segmenti", uključuju polioksialkilen segmente (npr., polietilen glikol), šećere (npr., sijalinska kiselina) i proteinske segmente koji se dobro tolerišu (npr., Fc i fragmenti i njihove varijante, transferin, ili serumski albumin). Anti-miostatin adnektin takođe može biti fuzionisan ili za albumin ili fragment (deo) ili varijantu albumina kao što je opisano u američkoj pulikaciji sa brojem 2007/0048282, ili može biti fuzionisan sa jednim ili više Adnektina koji vezuju serumski albumin, kao što je ovde opisano.
[0135] Drugi FK segmenti koji se mogu koristiti u predmetnom pronalasku uključuju one opisane u Kontermann i sarad., (Current Opinion in Biotechnology 2011;22:868-76). Takvi FK segmenti uključuju, ali nisu ograničeni na, fuzije humanog serumskog albumina, konjugate humanog serumskog albumina, veziva humanog serumskog albumina (npr., Adnektin PKE, AlbudAb, ABD), XTEN fuzije, PAS fuzije (tj., rekombinantne PEG mimetike na bazi tri aminokiseline prolin, alanin i serin), konjugate ugljenih hidrata (npr., hidroksietil skrob (HES)), glikozilaciju, konjugate polisijalinske kiseline i konjugate masnih kiselina.
[0136] Shodno tome, u nekim tehničkim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje antimiostatin adnektin fuzionisan sa FK segmentom koji je polimerni šećer. U nekim tehničkim rešenjima, FK segment je polietilen glikol ili Fc region. U nekim tehničkim rešenjima, FK segment je protein koji se vezuje za albumin u serumu kao što su oni opisani u američkoj pulikaciji pod brojevima 2007/0178082 i 2007/0269422. U nekim tehničkim rešenjima FK segment je humani serumski albumin. U nekim tehničkim rešenjima, FK segment je transferin.
Polietilen glikol
[0137] U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin sadrži polietilen glikol (PEG). PEG je dobro poznat polimer rastvorljiv u vodi koji je komercijalno dostupan ili se može dobiti polimerizacijom etilen glikola sa otvaranjem prstena prema postupcima dobro poznatim u oblasti (Sandler i Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, Njujork, Tom 3, strane 138-161). Pojam "PEG" se široko koristi da obuhvati bilo koji molekul polietilen glikola, bez obzira na veličinu ili modifikaciju na kraju PEG-a, i može se predstaviti formulom: X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH, gde je n 20 do 2300 i X je H ili terminalna modifikacija, npr., C1-4alkil. PEG može sadržati dalje hemijske grupe koje su neophodne za reakcije vezivanja, koje su rezultat hemijske sinteze molekula; ili koji deluju kao spejser za optimalno rastojanje delova molekula. Pored toga, takav PEG se može sastojati od jednog ili više bočnih lanaca PEG koji su međusobno povezani. PEG-ovi sa više od jednog PEG lanca se nazivaju višekraki ili razgranati PEG-ovi. Razgranati PEG-ovi su opisani u, na primer, u objavi evropske prijave sa brojem 473084A i američkom patentu pod brojem 5,932,462.
[0138] Jedan ili više PEG molekula mogu biti vezani na različitim pozicijama na proteinu, a takvo vezivanje se može postići reakcijom sa aminima, tiolima ili drugim pogodnim reaktivnim grupama. Aminski segment može biti, na primer, primarni amin koji se nalazi na N-terminusu polipeptida ili aminska grupa prisutna u aminokisleni, kao što su lizin ili arginin. U nekim tehničkim rešenjima, PEG segment je vezan na poziciji na polipeptidu odabranoj iz grupe koja se sastoji od: a) N-terminusa; b) između N-terminsa i najviše N-terminalnog beta lanca ili betasličnog lanca; c) petlje postavljene na lice polipeptida nasuprot mestu vezivanja za metu; d) između C-terminsa i najviše C-terminalnog beta lanca ili beta sličnog lanca; i e) C-terminusa.
[0139] PEGilacije se može postići PEGilacijom usmerenom na mesto, pri čemu se odgovarajuća reaktivna grupa uvodi u protein da bi se stvorilo mesto gde se prvenstveno javlja PEGilacija. U nekim tehničkim rešenjima, protein je modifikovan da uvede cisteinski ostatak na željenu poziciju, omogućujući PEGilaciju usmerenu na mesto na cisteinu. Mutacije se mogu uvesti u sekvencu koja kodira protein da bi se generisali cisteinski ostaci. Ovo se može postići, na primer, mutacijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u cistein. Poželjne aminokiseline za mutiranje u cisteinski ostatak uključuju serin, treonin, alanine i druge hidrofilne ostatake. Poželjno, ostatak koji se mutira u cistein je površinski-izložen ostatak. Algoritmi su dobro poznati u oblasti za predviđanje površinske pristupačnosti ostataka na bazi primarne sekvence ili proteina. Alternativno, površinski ostaci se mogu predvideti upoređivanjem aminokiselinskih sekvenci vezujućih polipeptida, sobzirom na to da je kristalna struktura okvira, na osnovu koje su dizajnirani i evoluirani vezivni polipeptidi, rešena (videti Himanen i sarad., Nature 2001;414:933-8) i tako identifikovani ostaci izloženi površini. PEGilacija cisteinskih ostataka može se izvesti primenom, na primer, PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-jodoacetamida ili PEG-ortopiridil disulfida.
[0140] PEG se obično aktivira sa odgovarajćom aktivacionom grupom koja je odgovarajuća za kuplovanje na željeno mesto na polipeptidu. Postupci PEGilacije su dobro poznati u oblasti i dalje opisani u Zalipsky, S., i sarad., "Use of Functionalized Poly(Etilen Glycols) for Modification of Polypeptides" u Polyetilen Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, Njujork(1992), I u Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182.
[0141] PEG može da varira u velikoj meri u molekularnoj masi i može biti razgranat i linearan. Tipično, prosečna molekulska mase PEG-a je od oko 100 Daltona do oko 150,000 Daltona. Uzete kao primeri prosečne molekulske mase za PEG uključuju oko 20,000 Daltona, oko 40,000 Daltona, oko 60,000 Daltona i oko 80,000 Daltona. U određenim tehničkim rešenjima, molekulska masa PEG-a je 40,000 Daltona. Mogu se koristiti i razgranate varijante PEG-a koje imaju ukupnu molekulsku masu bilo koju od prethodno navedenih. U nekim tehničkim rešenjima, PEG ima dve grane. U drugim tehničkim rešenjima, PEG ima četiri grane. U drugom tehničkom rešenju, PEG je bis-PEG (NOF Corporation, DE-200MA), u kome su dva adnektina konjugovana (videti, npr., Primer 1 i ATI-1341 u Tabeli 5).
[0142] Konvencionalne tehnike odvajanja i prečišćavanja poznate u oblasti mogu se koristiti za prečišćavanje PEGilovanih anti-miostatin adnektina, kao što su hromatografija sa isključenjem po veličini (npr., gel filtracija) i jonizmenjivačka hromatografija. Prozvodi se takođe mogu razdvojiti pomoću SDS-PAGE. Prozvodi koji se mogu odvojiti uključuju mono-, di-, tri-, poli- i ne PEGilovane adnektine, kao i slobodni PEG. Procenat mono-PEG konjugata se može kontrolisati spajanjem širih frakcija oko pika eluiranja da bi se povećao procenat mono-PEG u kompoziciji. Oko 90% mono-PEG konjugata predstavlja dobar balans prinosa i aktivnosti.
[0143] U nekim tehničkim rešenjima, PEGilovani anti-miostatin adnektini će poželjno zadržati najmanje oko 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% biološke aktivnosti povezane sa nemodifikovanim anti-miostatin adnektinom. U nekim tehničkim rešenjima, biološka aktivnost odnosi se na njihovu sposobnost da se vezuju za miostatin, kao što je procenjeno pomoću KD, kon, ili koff. U nekim tehničkim rešenjima, PEGilovani anti-miostatin adnektin pokazuje povećano vezivanje za miostatin u odnosu na nePEGilovani anti-miostatin adnektin.
[0144] Primeri PEG-modifikovanih anti-miostatin adnektina su prikazani u Tabeli 5.
Fc domen imunoglobulina (i fragmenti)
[0145] U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin je fuzionisan se Fc domenom imunoglobulina, ili fragmentom ili njihovom varijantom. Kako se ovde koristi, "funkcionalni Fc region" je Fc domen ili njegov fragment koji zadržava sposobnost vezivanja za FcRn. U nekim tehničkim rešenjima, funkcionalni Fc region se vezuje za FcRn, ali ne poseduje efektorsku funkciju. Sposobnost Fc regiona ili njegovog fragmenta da se veže za FcRn može se odrediti standardnim testovima vezivanja poznatim u struci. U drugim tehničkim rešenjima, Fc region ili njegov fragment se vezuje za FcRn i poseduje najmanje jednu "efektorsku funkciju" prirodnog Fc regiona. Uzete kao primer "efektorske funkcije" uključuju C1q vezivanje; citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; citotoksičnost posredovanu ćelijama zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju receptora na ćelijskoj površini (npr., B ćelijski receptor; BCR), itd. Takve efektorske funkcije generalno zahtevaju da se Fc region kombinuje sa domenom vezivanja (npr., anti-miostatin adnektin) i može se proceniti korišćenjem različitih testova poznatih u oblasti za procenu takvih efektorskih funkcija antitela.
[0146] "Prirodna sekvenca Fc regiona" sadrži aminokiselinsku sekvencu identičnu aminokiselinskoj sekvenci Fc regiona koji se nalazi u prirodi. "Varijanta Fc regiona" sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od one prirodne sekvence Fc regiona na osnovu najmanje jedne modifikacije aminokiseline. Poželjno, varijanta Fc regiona ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa prirodnom sekvencom Fc regiona ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida, npr., od oko jedne do oko deset aminokiselinskih supstitucija, i poželjno od oko jedne do oko pet aminokiselinskih supstitucija u prirodnoj sekvenci Fc regiona ili u Fc regionu roditeljskog polipeptida. Varijanta Fc regiona ovde će poželjno imati najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa prirodnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida i najpopoželjnije najmanje oko 90% identičnosti sekvence sa njim, poželjnije najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa njim.
[0147] U primeru tehničkog rešenjima, Fc domen je izveden iz podklase IgG1, međutim, mogu se takođe koristiti i druge podklase (npr., IgG2, IgG3 i IgG4). Dole je prikazana sekvenca Fc domena humanog IgG1 imunoglobulina:
[0148] Jezgrena sekvenca zgloba je podvučena, i CH2 i CH3 regioni su u redovnom tekstu. Treba razumeti da je C-terminalni lizin opcion.
[0149] Fuzija se može formirati vezivanjem anti-miostatin adnektina na bilo koji kraj Fc molekula, tj., Fc-anti-miostatin adnektin ili anti-miostatin adnektin-Fc aranžmani. U određenim tehničkim rešenjima, Fc i anti-miostatin adnektin su fuzionisani preko veznika. Sekvence veznika uzete kao primer uključuju GAGGGGSG (SEQ ID NO: 181), EPKSSD (SEQ ID NO: 182), D, ESPKAQASSVPTAQPQAEGLA (SEQ ID NO: 183), ELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 184), GQPDEPGGS (SEQ ID NO: 185), GGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 186), ELQLEESAAEAQEGELE (SEQ ID NO: 187), GSGSG (SEQ ID NO: 188), GSGC (SEQ ID NO: 189), AGGGGSG (SEQ ID NO: 190), GSGS (SEQ ID NO: 191), QPDEPGGS (SEQ ID NO: 192), GSGSGS (SEQ ID NO: 193), TVAAPS (SEQ ID NO: 194), KAGGGGSG (SEQ ID NO: 195), KGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 196), KQPDEPGGS (SEQ ID NO: 197), KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 198), KTVAAPS (SEQ ID NO: 199), KAGGGGSGG (SEQ ID NO: 200), KGSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 201), KQPDEPGGSG (SEQ ID NO: 202), KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQ ID NO: 203), KTVAAPSG (SEQ ID NO: 204) AGGGGSGG (SEQ ID NO: 205), AGGGGSG (SEQ ID NO: 206), GSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 207), QPDEPGGSG (SEQ ID NO: 208) i TVAAPSG (SEQ ID NO: 209).
[0150] U nekim tehničkim rešenjima, Fc region koji se koristi u fuziji anti-miostatin adnektina sadrži zglobni region Fc molekula. Kako se ovde koristi, "zglobni" region sadrži ostatke jezgra zgloba koji obuhvataju pozicije 1-16 SEQ ID NO: 169 (DKTHTCPPCPAPELLG; SEQ ID NO: 170) IgG1 Fc regiona. U određenim tehničkim rešenjima, anti-miostatin Adnektin-Fc fuzija usvaja multimernu strukturu (npr., dimer), delimično, zahvaljujući cisteinskim ostacima na pozicijama 6 i 9 SEQ ID NO: 169 unutar zglobnog regiona. U drugim tehničkim rešenjima, zglobni region kako se ovde koristi, može dalje da uključuje ostatake izvedene iz CH1 i CH2 regiona koji flankiraju jezgrenu zglobnu sekvencu, kao što je prikazano u SEQ ID NO: 169. U još jednom tehničkom rešenju, sekvenca zgloba je GSTHTCPPCPAPELLG (tj., sekvenca zgloba za PRD-932; SEQ ID NO: 180).
[0151] U nekim tehničkim rešenjima, sekvenca zgloba, može uključivati supstitucije koje daju poželjna farmakokinetička, biofizička i/ili biološka svojstva. Neke uzete za primer sekvence zgloba uključuju EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 171; jezgreni zglobni region, podvučeno), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO 172; jezgreni zglobni region, podvučeno), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 173; jezgreni zglobni region, podvučeno), DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 174; jezgreni zglobni region, podvučeno) i DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 175; jezgreni zglobni region, podvučeno). U jednom tehničkom rešenju, ostatak P na poziciji 18 SEQ ID NO: 169 je zamenjen sa S da bi se odstranila Fc efektorska funkcija; ova zamena je ilustrovana u zglobovima koji imaju bilo koju od SEQ ID NOs: 172, 173 i 175. U drugom tehničkom rešenju, ostaci DK na pozicijama 1-2 SEQ ID NO: 169 su zamenjeni sa GS da bi se uklonilo potencijalno mesto klipa; ova zamena je ilustrovana u SEQ ID NO: 173. U drugom tehničkom rešenju, C na poziciji 103 SEQ ID NO: 176, koji odgovara konstantnom region teškog lanca humanog IgG1 (tj., domeni CH1-CH3), je zamenjen sa S za sprečavanje nepravilnog formiranja cisteinske veze u odsustvu lakog lanca; ova zamena je prikazana u SEQ ID NOs: 171-173.
[0152] U određenim tehničkim rešenjima, anti-miostatin Adnektin-Fc fuzija može imati sledeće konfiguracije: 1) anti-miostatin Adnektin-zglob-Fc ili 2) zglob-Fc-anti-miostatin Adnektin. Prema tome, bilo koji anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska može biti fuzionisan sa Fc regionom koji sadrži zglobnu sekvencu u skladu sa ovim konfiguracijama. U nekim tehničkim rešenjima, veznik se može koristiti za spajanje anti-miostatin Adnektina sa segmentom zgloba Fc, na primer, fuzioni protein uzet kao primer može imati konfiguraciju anti-miostatin Adnektinveznik-zglob-Fc ili zglob-Fc-veznik-anti-miostatin Adnektin. Dodatno, u zavisnosti od sistema u kome se proizvodi fuzioni polipeptid, vodeća sekvenca se može postaviti na N-terminusu fuzionog polipeptida. Na primer, ako se fuzija proizvodi u sistemu sisara, vodeća sekvenca kao što je METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 177) može se dodati na N-terminus fuzionog molekula. Ako se fuzija proizvodi u E. coli, metionin će prethoditi fuzionoj sekvenci.
[0153] Sledeća sekvenca ilustruje anti-miostatin Adnektin-zglob-Fc konstrukt (referentni primer):
[0154] Vodeća sekvenca je označena podebljanim slovima, sekvenca anti-miostatin Adnektina je u kurzivu, a zglobni regioni su podvučeni. Treba razumeti da je opcion C-terminalni lizin.
[0155] Ovde, Fc domen sadrži humane IgG1 CH2 i CH3 regione kao što sledi:
[0156] Sledeća sekvenca služi kao primer za konstrukt Fc-anti-miostatin Adnektina prema predmetnom pronalasku:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVL TVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALP APIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPEL QLEESAAEAQEGELEGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRTEI (PRD-1474; SEQ ID NO: 273). Zglobni region je podvučen, vodeća sekvenca je označena podebljanim slovima, a sekvenca anti-miostatin Adnektina je u kurzivu.
[0157] Ovde, Fc domen sadrži humane IgG1 CH2 i CH3 regione kao što sledi:
[0158] Uzete kao primer anti-miostatin Adnektin-Fc fuzije i Fc-anti-miostatin adnektin fuzije su prikazane u Tabeli 6 (SEQ ID NOs: 252-273). Uzete kao primer anti-miostatin Adnektin-Fc fuzije i Fc-anti-miostatin adnektin fuzije predmetnog pronalaska su navedene u SEQ ID NOs: 264, 269 i 273. Sve sekvence mogu početi metioninom ili vodećom sekvencom sisara (npr., SEQ ID NO: 177).
Adnektini
[0159] U nekim tehničkim rešenjima FK segment je još jedan Adnektin specifičan, na primer, za serumski protein (npr., human serumski albumin), kao što je opisano u US 2012/0094909. Ostali FK segmenti koji se mogu koristiti sa adnektinima predmetnog pronalaska su stavljeni na uvid javnosti u Kontermann i sarad. (Current Opinion in Biotechnology 2011; 22:868-76), kao što je diskutovano supra. Kao primer, takvi FK segmenti na bazi adnektina mogu biti direktno ili indirektno povezani sa anti-miostatin adnektinom preko polipeptidnog veznika. Pogodni veznici za pridruživanje Fn3 domenima su oni koji dozvoljavaju odvojenim domenima da se savijaju nezavisno jedan od drugog i formiraju trodimenzionalnu stukturu koja omogućava vezivanje za ciljni molekul. Uzeti kao primer polipeptidni veznici uključuju PSTSTST (SEQ ID NO: 210), EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211) i GS veznike, kao što su GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 213) i njihovi multimeri. U nekim tehničkim rešenjima, veznik je veznik na bazi glicin-serina. Ovi veznici sadrže ostatke glicina i serina i mogu biti između 8 i 50, 10 i 30, i 10 i 20 aminokiselina u dužini. Primeri uključuju veznike koji imaju aminokiselinsku sekvencu (GS)7(SEQ ID NO: 215), G(GS)6(SEQ ID NO: 216), i G(GS)7G (SEQ ID NO: 217). Drugi veznici sadrže glutaminsku aminokiselinu, i uključuju, na primer, (GSE)s (SEQ ID NO: 218) i GGSEGGSE (SEQ ID NO: 219). Drugi glicinserin veznici uzeti kao primer uključuju (GS)4(SEQ ID NO: 212), (GGGGS)7(SEQ ID NO: 220), (GGGGS)5(SEQ ID NO: 221), i (GGGGS)3G (SEQ ID NO: 222). U nekim tehničkim rešenjima, veznik je veznik na bazi glicin-prolina. Ovi veznici sadrže ostatke glicina i prolina i mogu biti između 3 i 30, 10 i 30, i 3 i 20 aminokiselina u dužini. Primeri uključuju veznike koji imaju aminokiselinsku sekvencu (GP)3G (SEQ ID NO: 223), (GP)sG (SEQ ID NO: 224) i GPG. U drugim tehničkim rešenjima, veznik može biti veznik na bazi prolin-alanina koji ima između 3 i 30, 10 i 30, i 3 i 20 aminokiselina u dužini. Primeri veznika na bazi prolin alanina uključuju, na primer, (PA)3(SEQ ID NO: 225), (PA)6(SEQ ID NO: 226) i (PA)9(SEQ ID NO: 227). Optimalna dužina veznika i aminokiselinski sastav mogu se odrediti rutinskim eksperimentisanjem u pogledu ovde obezbeđenog učenja. U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin je vezan, na primer, za anti-HSA adnektin preko polipeptidnog veznika koji ima mesto proteaze koje može da se cepa proteazom u krvi ili ciljanom tkivu. Takva tehnička rešenja se mogu koristiti za oslobađanje anti-miostatin adnektina za bolju isporuku ili terapijska svojstva ili efikasnije dobijanje.
[0160] Dodatni veznici ili spejseri, mogu biti uvedeni na N-terminusu ili C-terminusu Fn3 domena između Fn3 domena i polipeptidnog veznika.
[0161] U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin može biti direktno ili indirektno vezan, na primer, za anti-HSA adnektin preko polimernog veznika. Polimerni veznici se mogu koristiti za optimalno variranje rastojanja između svake komponente fuzije kako bi se stvorila fuzija proteina sa jednom ili više sledećih karakteristika: 1) smanjena ili povećana sterična smetnja vezivanja jednog ili više domena proteina kada se vezuju za protein od interesa, 2) povećana stabilnost ili rastvorljivost proteina, 3) smanjena agregacija proteina i 4) povećana ukupna avidnost ili afinitet proteina.
[0162] U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektin je vezan, na primer, za anti-HSA adnektin, preko biokompatibilnog polimera kao što je polimerni šećer. Polimerni šećer može da uključi enzimsko mesto cepanja koje može da se cepa enzimom u krvi ili ciljanom tkivu. Takva tehnička rešenja se mogu koristiti za oslobađanje anti-miostatin adnektina za bolju isporuku ili terapijska svojstva ili efikasnije dobijanje.
[0163] Rezime monoadnektina i njihovih odgovarajućih modifikovanih oblika FK segmenata (npr., PEGilovani i Fc fuzije) su predstavljeni u Tabeli 3.
Tabela 3
<a>Nemodifikovani monoAdnektini imaju jezgrenu adnektinsku sekvencu kojoj prethodi N-terminalna produžena sekvenca (MGVSDVPRDL; SEQ ID NO: 306) i nakon nje sledi C-terminalni rep (EIDKPSQHHHHHH; SEQ ID NO: 325), kao što je prikazano u Tabeli 2. Jezgrena adnektinska sekvenca odgovara monoAdnektinskoj sekvenci kojoj nedostaje N-terminalni produžetak i C-terminalne repne sekvence.
<b>Adnektini sa cisteinskim mutantima imaju jezgrenu adnektinsku sekvencu monoAdnektina u prvoj koloni, a prethodi im N-terminalna produžena sekvenca (MGVSDVPRDL; SEQ ID NO: 306) a zatim sledi C-terminalni rep (GSGC [Modifikacija] HHHHHH; SEQ ID NO: 326 ili EGSGC[Modifikacija]HHHHHH; SEQ ID NO: 327), kao što je prikazano u Tabeli 5.<c>Adnektini sa Fc segmentom na C-terminusu imaju jezgrenu adnektinsku sekvencu monoAdnektina u prvoj koloni, kojoj prethodi N-terminalna produžena sekvenca (GVSDVPRDL; SEQ ID NO: 307) i nakon nje sledi C-terminalni rep (EI), iza koje sledi veznik sekvenca (Tabela 4) i sekvenca Fc regiona, kao što je opisano u Tabeli 6.
<d>Adnektini sa Fc segmentom na N-terminusu imaju sekvencu Fc regiona kojoj prethodi N-terminalna sekvenca zgloba i koju sledi veznik (Tabela 4) i jezgrenu adnektinsku sekvencu monoAdnektina u prvoj koloni, kojoj samoj prethodi N-terminalna produžena sekvenca (GVSDVPRDL; SEQ ID NO: 307) i koju sledi C-terminalni rep (EI), kao što je prikazano u Tabeli 6.
[0164] SEQ ID NOs primera veznika predmetnog pronalaska su predstavljene u Tabeli 4.
Tabela 4
[0165] SEQ ID NOs primera PEGilovanih anti-miostatin Adnektina opisanih ovde su predstavljene u Tabeli 5.
Tabela 5
[0166] u Tabeli 6 su predstavljene sekvence sa ID brojevima (SEQ ID Nos) primera Fcfuzionisanih anti-miostatin adnektina opisanih ovde i primera Fc-fuzionisanih anti-miostatin adnektina predmetnog pronalaska (videti PRD-1288, PDR-1474, PRD-1305).
Tabela 6
Fc-fuzionisani anti-miostatin adnektini
Sekvenca
Klon Aminokiselinska N-terminalni Veznik C-terminalni Sekvenca sekvenca domen domen nukleinskih kiselina
PRD- GQPDEPGGS (SEQ
1178 ID NO: 185)
PRD-1180
Fc-fuzionisani anti-miostatin adnektini
Sekvenca
Klon Aminokiselinska N-terminalni Veznik C-terminalni Sekvenca sekvenca domen domen nukleinskih kiselina
PRD- EPKSSD (SEQ ID
1301 NO: 182)
Fc-fuzionisani anti-miostatin adnektini
Sekvenca
Klon Aminokiselinska N-terminalni Veznik C-terminalni Sekvenca sekvenca domen domen nukleinskih kiselina
PRD- EPKSSD (SEQ ID
1302 NO: 182)
Fc-fuzionisani anti-miostatin adnektini
Sekvenca
Klon Aminokiselinska N-terminalni Veznik C-terminalni Sekvenca sekvenca domen domen nukleinskih kiselina
PRD- EPKSSD (SEQ ID
1303 NO: 182)
Fc-fuzionisani anti-miostatin adnektini
Sekvenca
Klon Aminokiselinska N-terminalni Veznik C-terminalni Sekvenca sekvenca domen domen nukleinskih kiselina
PRD- EPKSSD (SEQ ID
1304 NO: 182)
Fc-fuzionisani anti-miostatin adnektini
Sekvenca
Klon Aminokiselinska N-terminalni Veznik C-terminalni Sekvenca sekvenca domen domen nukleinskih kiselina
PRD- EPKSSD (SEQ ID
1305 NO: 182)
[0167] SEQ ID NOs uzetih kao primer vodećih sekvenci (N-terminalni produžetak) i sekvenci C-terminalnog repa su predstavljene u Tabeli 7.
Tabela 7
IV. Tehnologija fuzije nukleinske kiseline i proteina
[0168] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje adnektin koji sadrži domene fibronektina tipa III koji vezuju miostatin kako je definisano u patentnim zahtevima. Jedan od načina da se brzo naprave i testiraju Fn3 domeni sa specifičnim svojstvima vezivanja je tehnologija fuzije nukleinske kiseline i proteina od Adnekssad, Bristol-Myers Squibb R&D Company. Ova objava koristi tehnologiju in vitro ekspresije i označavanja, nazvanu 'PROfuzija' koja koristi fuzije nukleinske kiseline i proteina (RNK- i DNK-protein fuzije) za identifikaciju novih polipeptida i motiva aminokiselina koji su važni za vezivanje za proteine. Tehnologija fuzije nukleinske kiseline i proteina je tehnologija koja kovalentno spaja protein sa genetskim informacijama koje ga kodiranju. Za detaljan opis tehnologije fuzije RNK-protein i biblioteke postupaka skrininga proteina skele na bazi fibronektina videti Szostak i sarad., američki patenti sa brojevima 6,258,558, 6,261,804, 6,214,553, 6,281,344, 6,207,446, 6,518,018 i 6,818,418; Roberts i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997;94:12297-12302; i Kurz i sarad., Molecules, 2000;5:1259-64.
V. Vektori i polinukleotidi
[0169] Nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od različitih proteina ili polipeptida ovde stavljenih na uvid javnosti mogu se hemijski sintetisati. Upotreba kodona može se odabrati tako da poboljša ekspresiju u ćeliji. Takva upotreba kodona zavisi će od odabranog tipa ćelije. Razvijeni su specijalizovani obrasci upotrebe kodona za E. coli i druge bakterije, kao i ćelije sisara, biljne ćelije, ćelije kvasca i ćelije insekata. Videti na primer: Mayfield i sarad., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 100(2):438-442 (Jan.21, 2003); Sinclair i sarad., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (Oktobar 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (Oktobar 2001); Makrides i sarad., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (Septembar 1996); i Sharp i sarad., Kvasac, 7(7):657-678 (Oktobar 1991).
[0170] Opšte tehnike manipulacije nukleinske kiseline su opisane u, na primer, Sambrook i sarad., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Izdanje, tomovi 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ili Ausubel, F. i sarad., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, Njujork (1987) i periodična ažuriranja. Generalno, DNK koja kodira polipeptid operativno je povezana sa pogodnim transkripcijskim ili translacijskim regulatornim elementima dobijenim od sisara, virusnih ili gena insekata. Takvi regulatorni elementi uključuju promotor transkripcije, po izoru sekvencu operatora za kontrolu transkripcije, sekvencu koja kodira pogodno ribozomsko mesto vezivanja iRNK, i sekvence koje kontrolišu terminaciju transkripcije i translacije. Sposobnost replikacije u domaćinu, obično se dodeljuje izvoru replikacije, a dodatno je uključen izbor gena koji olakšava prepoznavanje transformanata.
[0171] Ovde opisani proteini mogu se dobiti rekombinantno ne samo direktno, ali i kao fuzioni polipeptid sa heterolognim polipeptidom, koji je poželjno signalna sekvenca ili drugi polipeptid koji ima određeno mesto za cepanje na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Heterologna signalna sekvenca koja je poželjno odabrana je jedna koja je prepoznata i obrađena (tj., cepa je signalna peptidaza) od strane ćelije domaćina. Uzeta kao primer N-terminalna vodeća sekvenca za dobijanje polipeptida u sistemu sisara je: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 177), koja je uklonjena od strane ćelije domaćina nakon ekspresije.
[0172] Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrađuju nativnu signalnu sekvencu, signalna sekvenca je supstituisana prokariotskom signalnom sekvencom odabranom, na primer, iz grupe vodećih sekvenci alkalne fosfataze, penicilinaze, 1 pp, ili toplotno-stabilnog enterotoksina II.
[0173] Za sekreciju kvasca nativna signalna sekvenca može biti supstituisana, npr., liderom invertaze kvasca, liderom faktora (uključujući lidere alfa faktora Saccharomyces i Kluyveromyces), ili liderom kisele fosfataze, liderom glukoamilaze C. albicans, ili signalnom sekvencom opisanom u američkom patentu pod brojem 5,631,144. U ćelijskoj ekspresiji sisara, na raspolaganju su signalne sekvence sisara kao i virusni sekretorni lideri, na primer, herpes simpleks gD signal. DNK za takve prekursorske regione može biti vezana u okviru čitanja sa DNK koja kodira protein.
[0174] I ekspresioni i klonirajući vektori sadrže sekvencu nukleinskih kiselina koja omogućava da se vektor replikuje u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Generalno, u vektorima za kloniranje ova sekvenca je ona koja omogućava vektoru da se replikuje nezavisno od hromozomske DNK domaćina, i uključuje poreklo replikacije ili sekvence koje se autonomno replikuju. Takve sekvence su dobro poznate po raznim bakterijama, kvascima i virusima. Poreklo replikacije iz plazmida pBR322 je pogodno za većinu Gram-negativnih bakterija, poreklo plazmida od 2 mikrona je pogodno za kvasac, a različita virusna porekla (SV40, polioma, adenovirus, VSV ili BPV) su korisna za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Generalno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za vektore ekspresije sisara (poreklo SV40 se obično može koristi samo zato što sadrži rani promotor).
[0175] Vektori ekspresije i kloniranja mogu da sadrže selekcioni gen, koji se takođe naziva selektivni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat ili traciklin, (b) dopunjuju auksotrofne nedostatake, ili (c) daju kritične hranjive materije koje nisu dostupne iz složenih medijuma, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacilli.
[0176] Vektori za ekspresiju i kloniranje obično sadrže promotor koji prepoznaje organizam domaćina i koji je operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira protein predmetnog pronalaska, npr., protein skele na bazi fibronektina. Promotori pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promotor, beta-laktamaza i laktoza promotorske sisteme, alkalnu fosfatazu, triptofan (trp) promotorski sistem i hibridne promotore kao što je tan promotor. Međutim, i drugi poznati bakterijski promotori su pogodni. Promotori za primenu u bakterijskim sistemima sadržaće takođe Shine-Dalgarno (S.D.) sekvencu koja je operativno povezana sa DNK koja kodira protein predmetnog pronalaska. Promotorske sekvence su poznate za eukariote. Praktično svi eukariotski geni imaju AT bogat region koji se nalazi otprilike 25 do 30 baza ushodno od mesta gde je transkripcija pokrenuta. Druga sekvenca pronađena 70 do 80 baza ushodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskig gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su prikladno umetnute u eukariotske ekspresione vektore.
[0177] Primeri pogodnih promotorskih sekvenci za primenu sa domaćinima kvasca uključuju promotore za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukozo izomeraza i glukokinaza.
[0178] Transkripcija iz vektora u ćelijama domaćina sisara može se kontrolisati, na primer, promotorima dobijenim iz genoma virusa kao što su polioma virus, virus boginja živine, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, virus sarkoma ptica, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa-B i najpoželjnije Simian Virus 40 (SV40), od heterolognih promotora sisara, npr., promotor aktina ili promotor imunoglobulina, iz promotora toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promotori kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.
[0179] Transkripcija DNK koja kodira protein predmetnog pronalaska od strane viših eukariota se često pojačava umetanjem sekvence pojačivača u vektor. Mnoge sekvence pojačivača su sada poznate iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim obično se koristi pojačivač virusa eukariotske ćelije. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani porekla replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotora citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani porekla replikacije i pojačivače adenovirusa. Videti takođe Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) o elementima pojačivača za aktivaciju eukariotskih promotora. Pojačivač se može ugraditi u vektor na poziciji 5' ili 3' u sekvenci koja kodira peptid, ali je poželjno lociran na mestu 5' promotora.
[0180] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukarariotskim ćelijama domaćina (npr., kvasca, gljiva, insekta, biljaka, životinja, čoveka, ili ćelijama sa jedrom iz drugih višećelijskih organizama) će takođe sadržati sekvence neophodne za završetak transkripcije i za stabilizaciju iRNK. Takve sekvence su obično dostupne iz 5' i, povremeno 3', neprevedenih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovani fragmenti u neprevedenom delu iRNK koji kodira protein predmetnog pronalaska. Jedna korisna komponenta za terminaciju transkripcije je region poliadenilacije goveđeg hormona rasta. Videti WO 94/11026 i ekspresioni vektor koji je u njemu stavljen na uvid javnosti.
[0181] Rekombinantna DNK takođe može uključiti bilo koju vrstu sekvence proteinske oznake koja može biti korisna za prečišćavanje proteina. Primeri proteinskih oznaka uključuju, ali nisu ograničene na, histidinsku oznaku, FLAG oznaku, myc oznaku, HA oznaku ili GST oznaku. Odgovarajući vektori za kloniranje i ekspresiju za upotrebu sa ćelijskim domaćinima bakterija, gljivica, kvasca i sisara mogu se naći u vektorima za kloniranje: A Laboratory Manual, (Elsevier, Njujork (1985)).
[0182] Ekspresioni konstrukt se uvodi u ćeliju domaćina koristeći postupak koji odgovara ćeliji domaćinu, kao što će biti očigledno stručnjaku u ovoj oblasti. Različiti postupci za uvođenjenje nukleinskih kiselina u ćelije domaćina su poznati u oblasti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, elektroporaciju; transfekciju koja koristi kalcijum hlorid, rubidijum hlorid, kalcijum fosfat, DEAE-dekstran, ili druge supstance; bombardovanje mikroprojektilom; lipofekciju; i infekciju (gde je vektor infektivni agens).
[0183] Pogodne ćelije domaćina uključuju prokariote, kvasce, ćelije sisara ili bakterijske ćelije. Pogodne bakterije uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme, na primer, E. coli ili Bacillus spp. Kvasac se takođe može koristiti za dobijanje polipeptida, poželjno iz vrsta Saccharomyces, kao što je S. cerevisiae. Različiti sistemi kultura ćelija sisara ili insekata takođe se mogu koristiti za ekspresiju rekombinantnih proteina. Bakulovirusni sistemi za proizvodnju heterolognih proteina u ćelijama insekata su pregledani od strane Luckow i sarad. (Bio/ Technology, 6:47 (1988)). Primeri pogodnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju endotelne ćelije, COS-7 ćelije bubrega majmuna, CV-1, L ćelije, C127, 3T3, jajnik kineskog hrčka (CHO), embrionalne ćelije bubrega čoveka, HeLa, 293, 293T i BHK ćelijske linije. Prečišćeni polipeptidi su dobijeni kultivacijom pogodnih sistema domaćin/vektor za ekspresiju rekombinantnih proteina. Za mnoge primene, mala veličina mnogih polipeptida ovde stavljenih na uvid javnosti bi omogućila ekspresiju u E. coli kao poželjan postupak za ekspresiju. Protein se zatim prečišćava iz medijuma kulture ili ćelijskih ekstrakata.
VI. Proizvodnja proteina
[0184] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na ćelijske linije koje eksprimiraju anti-miostatin adnektin ili njegov fuzioni polipeptid. Stvaranje i izolovanje ćelijskih linija koje proizvode antimiostatin adnektin može se postići korišćenjem standardnih tehnika poznatih u oblasti, kao što su one opisane ovde.
[0185] Ćelije domaćina su transformisane ovde opisanim ekspresionim ili klonirajućim vektorima za proizvodnju proteina i kultivisane u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim na odgovarajući način za indukovanje promotora, selekciju transformanata, ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence. U ovde prikazanim primerima, ćelije domaćina korišćene za proizvodnju proteina visoke propusnosti (HTPP - high-throughput protein production) i proizvodnju srednjeg obima bile su one iz bakterijskog soja HMS174.
[0186] Adnektini predmetnog pronalaska se takođe mogu dobiti u aglikozilovanom obliku proizvodnjom adnektina u, npr., prokariotskim ćelijama (npr., E. coli). Posebno, aglikozilovani oblici adnektina predmetnog pronalaska pokazuju isti afinitet, potenciju i mehanizam delovanja kao glikozilovani adnektini kada su testirani in vitro.
[0187] Ćelije domaćina korišćene za proizvodnju proteina predmetnog pronalaska mogu se kultivisati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medijumi kao što su Hamov F10 (Sigma), Minimalni esencijalni medijum ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbekov modifikovani Eagle-ov medijum ((DMEM), Sigma)) su pogodni za kultivaciju ćelija domaćina. Pored toga, mnogi medijumi opisani u Ham i sarad., Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barites i sarad., Anal. Biochem., 102:255 (1980), američkom patentu sa brojevima 4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, 5,122,469, 6,048,728, 5,672,502, ili američkom patentu sa brojem RE 30,985 se mogu koristiti kao medijum za kulturu ćelija domaćina. Bilo koji od ovih medijuma može se po potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je lek Gentamicin), elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u ukupnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Bilo koji drugi neophodni dodaci takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćina odabranom za ekspresiju, i biće očigledni običnom stručnjaku.
[0188] Proteini koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu se takođe proizvesti korišćenjem sistema za ćelijsku translaciju. Za takve svrhe nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid moraju biti modifikovane kako bi se omogućila in vitro transkripcija da se proizvede iRNK i omogući bezćelijska translacija iRNK u određenom bezćelijskom sistemu koji se koristi (eukariotski kao što je sistem translacije bez ćelije sisara ili kvasca ili prokariotski kao što je sistem translacije bez bakterijskih ćelija).
[0189] Proteini predmetnog pronalaska se takođe mogu proizvesti hemijskom sintezom (npr., postupcima opisanim u Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Izdanje, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)). Modifikacije proteina se takođe mogu proizvesti hemijskom sintezom.
[0190] Proteini predmetnog pronalaska mogu se prečistiti postupcima izolovanja/prečišćavanja za proteine opšte poznate u oblasti hemije proteina. Neograničavajući primeri uključuju ekstrakciju, rekristalizaciju, isoljavanje (npr., sa amonijum sulfatom ili natrijum sulfatom), centrifugiranje, dijalizu, ultrafiltraciju, adsorpcionu hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju, hidrofobnu hromatografiju, hromatografiju normalne faze, hromatografiju reverzne faze, gel filtraciju, gel permeacijsku hromatografiju, afinitetnu hromatografiju, elektroforezu, protivstrujnu distribuciju ili bilo koje kombinacije istih. Nakon prečišćavanja, polipeptidi se mogu zameniti u različitim puferima i/ili koncentrovati bilo kojim od niza postupaka poznatih u oblisti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, filtraciju i dijalizu.
[0191] Prečišćeni polipeptid je poželjno najmanje 85% čist, ili poželjno najmanje 95% čist i najpoželjnije najmanje 98% čist. Bez obzira na tačnu numeričku vrednost čistoće, polipeptid je dovoljno čist za upotrebu kao farmaceutski proizvod.
VII. Biofizička i biohemijska karakterizacija
[0192] Vezivanje anti-miostatin adnektina pronalaska za ciljni molekul (npr., miostatin) može se proceniti u smislu konstanti ravnoteže (npr., disocijacije, KD) i u smislu kinetičkih konstanti (npr., “on-rate” konstanta (asocijacije), koni “off-rate” konstanta (disocijacije), koff). Adnektin će se generalno vezati za ciljni molekul sa KDmanjom od 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM ili 100 pM, iako se više vrednosti KDmogu tolerisati tamo gde je koffdovoljno niska ili kon, dovoljno visoka.
In vitro testovi za afinitet vezivanja
[0193] Anti-miostatin adnektini koji se vezuju i antagonizuju miostatin mogu se identifikovati korišćenjem različitih in vitro testova. Poželjno, testovi su testovi visoke propusnosti koji omogućavaju skrining više kandidata adnektina istovremeno. U nekim tehničkim rešenjima, BMP-11, koji deli 90% aminokiselinske identičnosti sa miostatinom, može se koristiti kao surogat za miostatin u in vitro testovima kada se test izvodi u uslovima zasićenja. Posebno, anti-miostatin adnektini spojeni sa Fc domenima mogu da vežu i miostatin i BMP-11, dok se monoAdnektini prvenstveno vezuju za miostatin. Bez ograničenja teorijom, ovo može odražavati povećanu avidnost bivalentnih Fc-spojenih adnektina u poređenju sa monovalentnim adnektinima. Slično pojačano vezivanje za BMP11 primećeno je kod bivalentnih PEGilovanih adnektina, kao što je ATI-1341, koji sadrže adnektine spojene na dva kraja 20kDa PEG segmenta.
[0194] Uzeti kao primer testovi za određivanje afiniteta vezivanja anti-miostatin adnektina su opisani u Primerima infra, i uključuju, ali nisu ograničeni na, postupke u fazi rastvora kao što je test kinetičkog isključivanja (KinExA) (Blake i sarad., JBC 1996;271:27677-85; Drake i sarad., Anal Biochem 2004;328:35-43), površinska plazmonska rezonanca (SPR) sa Biacor sistemom (Uppsala, Švetska) (Welford i sarad., Opt. Quant. Elect 1991;23:1; Morton i Myszka, Methods in Enzymology 1998;295:268) i testove homogene vremenski razdvojene fluorescencije (HTRF-homogeneous time resolved fluorescence) (Newton i sarad., J Biomol Screen 2008;13:674-82; Patel i sarad., Test Drug Dev Technol 2008;6:55-68).
[0195] U nekim tehničkim rešenjima, biomolekularne interakcije se mogu pratiti u realnom vremenu Biacor sistemom, koji koristi SPR da detektuje promene u rezonantnom uglu svetlosti na površini tankog zlatnog filma na staklenoj podlozi usled promena indeksa prelamanja površine udaljene do 300 nm. Biacore analiza generiše konstante brzine asocijacije, konstante brzine disocijacije, ravnotežne konstante disocijacije i konstante afiniteta. Afinitet vezivanja se dobija procenom konstanti brzine asocijacije i disocijacije korišćenjem Biacore površinskog plazmonskskog rezonancionog sistema (Biacore, Inc.). Biosenzorski čip se aktivira za kovalentno kuplovanje mete. Meta se zatim razblaži i injektuje preko čipa da bi se dobio signal u jedinicama za odgovor imobilisanog materijala. Pošto je signal u rezonantnim jedinicama (RU- resonance units) proporcionalan masi imobilisanog materijala, ovo predstavlja opseg gustina imobilisanih meta na matriksu. Podaci o asocijaciji i disocijaciji se uklapaju istovremeno u globalnu analizu da bi se rešio izraz neto brzine ekspresije za biomolekularnu interakciju 1:1, dajući najbolje prikladne vrednosti za kon, koffi Rmax(maksimalni odgovor pri zasićenju). Ravnotežne konstante disocijacije za vezivanje, KD,su izračunate iz PR merenja kao koff/kon.
[0196] U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini pronalaska pokazuju KDu SPR afinitetnom testu opisanom u Primeru 6 od 500 nM ili manje, 400 nM ili manje, 300 nM ili manje, 200 nM ili manje, 150 nM ili manje, 100 nM ili manje, 90 nM ili manje, 80 nM ili manje, 70 nM ili manje, 60 nM ili manje, 50 nM ili manje, 40 nM ili manje, 30 nM ili manje, 20 nM ili manje, 15 nM ili manje, 10 nM ili manje, 5 nM ili manje, ili 1 nM ili manje. Poželjno, KDje 15 nM ili manje. Poželjnije, KDje 2.0 nM ili manje.
[0197] U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini pronalaska pokazuju IC50 u HTRF testu opisanom u Primeru 4 od 5 nM ili manje, 4 nM ili manje, 3 nM ili manje, 2.5 nM ili manje, 2 nM ili manje, 1.5 nM ili manje, 1 nM ili manje, 0.5 nM ili manje, 0.2 nM ili manje, ili 0.1 nM ili manje. Poželjno, IC50 je 1.5 nM ili manje. Poželjnije, IC50 je 0.5 nM ili manje.
[0198] U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini pronalaska pokazuju KDu testu kinetičkog isključenja opisanom u Primeru 7 od 2 nM ili manje, 1.5 nM ili manje, 1 nM ili manje, 900 pM ili manje, 850 pM ili manje, 800 pM ili manje, 750 pM ili manje, 700 pM ili manje, 650 pM ili manje, 600 pM ili manje, 550 pM ili manje, 500 pM ili manje, 450 pM ili manje, 400 pM ili manje, 350 pM ili manje, 340 pM ili manje, 330 pM ili manje, 300 pM ili manje, 250 pM ili manje, 200 pM ili manje, 150 pM ili manje, ili 100 pM ili manje. Poželjno, KDje 850 pM ili manje.
[0199] Trebalo bi razumeti da su ovde opisani testovi uzeti kao primer, i da bilo koji postupak poznat u struci za određivanje afiniteta vezivanja između proteina (npr., fluorescentno baziran transfer (FRET), test imunosorbenta vezanog za enzim, i testovi kompetitivnog vezivanja (npr., radioimunoeseji)) se mogu koristiti za procenu afiniteta vezivanja anti-miostatin adnektina pronalaska.
In vitro testovi za aktivnost antagonista
[0200] Sposobnost anti-miostatin Adnektina da antagonizuju aktivnost miostatina može se lako odrediti korišćenjem različitih in vitro testova. Poželjno, testovi su testovi visoke propusnosti koji omogućavaju skrining više kandidata adnektina istovremeno. U nekim tehničkim rešenjima, antagonistički efekti anti-miostatin adnektina na aktivnost miostatina mogu se odrediti u luciferaza reporterskim testovima na bazi ćelija aktivin responsivnog elementa (ARE), kao što je opisano u Primeru 3. U određenim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska smanjuje aktivnost ARE-luciferaze izazvanu miostatinom za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili više, u odnosu na kontrolu nakon koinkubacije miostatina sa anti-miostatin adnektinom pre stimulisanja ćelija smešom. Uzete kao primer kontrolne reakcije uključuju tretiranje ćelija samo miostatinom ili miostatinom prethodno inkubiranim sa viškom referentnog inhibitora miostatina kao što je Human Activin RIIB Fc Chimera (R&D Sistemi) ili ActRIIb-Fc kao što je opisano u Morrison i sarad. (Experimental Neurology 2009; 217:258-68). U drugim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini pronalaska inhibiraju aktivnost reportera ARE-luciferaze sa IC50 od 500 nM ili manje, 400 nM ili manje, 300 nM ili manje, 200 nM ili manje, 100 nM ili manje, 50 nM ili manje, 10 nM ili manje, 5 nM ili manje, 1 nM, 0.5 nM ili manje, 0.4 nM ili manje, 0.3 nM ili manje, 0.2 nM ili manje, ili 0.10 nM ili manje, kao što je opisano u Primeru 3.
[0201] U drugim tehničkim rešenjima, antagonistički efekti anti-miostatin adnektina na aktivnost miostatina mogu se odrediti merenjem obima SMAD fosforilacije u ćelijama tretiranim miostatinom, kao što je opisano u Primeru 5. U određenim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska smanjuju fosforilaciju SMAD izazvanu miostatinom za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 97% ili više, u odnosu na kontrolu nakon koinkubacije miostatina sa anti-miostatin adnektinom pre stimulacije ćelija smešom. Primeri kontrolnih reakcija uključuju tretiranje ćelija samo miostatinom ili miostatinom prethodno inkubiranim sa viškom referentnog inhibitora miostatina kao što je Human Activin RIIB Fc Chimera (R&D Sistemi) ili ActRIIb-Fc kao što je opisano u Morrison i sarad. (Eksperimental Neurology 2009;217:258-68). U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini pronalaska inhibiraju SMAD fosforilaciju sa IC50 od 1 nM ili manje, 0.8 nM ili manje, 0.6 nM ili manje, 0.4 nM ili manje, 0.3 nM ili manje, 0.2 nM ili manje, ili 0.1 nM ili manje u odgovoru inhibicije od 12-tačaka ili 4-tačke, kao što je opisano u Primeru 5. U drugim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini pronalaska na 10 nM inhibiraju SMAD fosforilaciju miostatinom za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97% ili najmanje 98% ili više, kao što je opisano u Primeru 5.
[0202] Dodatno, poznato je nekoliko in vitro modela sistema koji koriste ćelije, kulturu tkiva i histološke metode za proučavanje bolesti motornih neurona. Na primer, organotipski presek kičmene moždine pacova podvrgnut ekscitotoksičnosti glutamata je koristan kao model sistem za testiranje efikasnosti anti-miostatin adnektina u sprečavanju degeneracije motornog neurona. Corse i sarad., Neurobiol. Dis. (1999) 6:335346. Za diskusiju o in vitro sistemima za primenu u proučavanju ALS, videti, npr., Bar, P. R., Eur. J. Pharmacol. (2000) 405:285295; Silani i sarad., J. Neurol. (2000) 247 Suppl 1:12836; Martin i sarad., Int. J. Mol. Med. (2000) 5:313.
[0203] Trebalo bi razumeti da su ovde opisani testovi uzeti kao primer, i da je bilo koji postupak poznat u oblasti koji može da posluži kao očitavanje aktivnosti miostatina pogodan za primenu za testiranje myostatin antagonističkih efekata anti-miostatin adnektina pronalaska (npr., RT-PCR u realnom vremenu iRNK ciljnih gena SMAD (npr., Smad 7; Ciarmela i sarad., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2011;96;755-65) ili iRNK gena koji sadrže ARE).
In vivo modeli
[0204] Postoje različiti životinjski modeli priznati u oblasti koji rekapituliraju simptome bolesti, poremećaja i stanja koji su u vezi sa gubitkom mišića koji je u vezi, na primer sa mišićnim, neuromišićnim, neurološkim i metaboličkim poremećajima. Ovi modeli se mogu koristiti za testiranje efikasnosti anti-miostatin adnektina pronalaska.
[0205] Na primer, neograničavajući primeri takvih životinjskih modela uključuju, npr., mišji model, sa X u vezi, mišićne distrofije (mdx) (US2011/0008375, Gehrig i sarad., Nature 2012;484:394-8), uključujući 4 dodatna soja od mdx miša-mdx2cv, mdx3cv, mdx4cv, ili mdx5cv miša (Phelps i sarad., Human Molecular Genetics.1996;5(8):1149-1153), mdx miša sa dodatnom ablacijom utrofina homologa distrofina (mdx/utr<-/->) (Deconinck i sarad., Cell. 1997;90(4):717-727), alfa-SG-nul C57BL/6 miša (Duclos i sarad.i(1998) J. Cell Biol. 142, 1461-1471), i one nedavno pregledane u Nakamura i sarad., (J Biomed Biotechnol. 2011; Article ID No: 184393), npr., mdx52 miša, kod kojeg je izbrisan egzon 52 murinskog DMD gena, model mišićne distrofije zlatnog retrievera (GRMD), model pseće sa X u vezi mišićne distrofije (CXMDJ) i model hipertrofične mišićne distrofije mačaka (HFMD) (npr., Shelton i sarad., Neuromuscular Disorders.
2005;15(2): 127-138).
[0206] Životinjski modeli za proučavanje motoneuronskih poremećaja kao što je ALS su transgeni miševi sa ALS-vezanim mutantnim Cu/Zn genom superoksid dismutaze (SOD1) (mSOD1G93A i/ili mSOD1G37R). Ovi miševi razvijaju dominantno nasleđeni paralitički poremećaj kod odraslih sa mnogim kliničkim i patološkim karakteristikama porodičnog ALS-a. (npr., Gurney i sarad., Science (1994) 264:17721775; Nagano i sarad., Life Sci (2002) 72:541548). Ostali životinjski modeli uključuju dva murinska modela koji se javljaju u prirodi za progresivnu (pmn) i kolebljivu motornu neuronopatiju (Haegggeli i Kato, Neurosci. Lett. (2002) 335:3943). Za pregled različitih životinjskih modela za primenu u proučavanju motoneuronskih bolesti kao što je ALS, videti, npr., Jankowsky i sarad., Curr Neurol Neurosci. Rep. (2002) 2:457 464; Elliott, J. L., Neurobiol. Dis. (1999) 6:31020; i Borchelt i sarad., Brain Pathol. (1998) 8:735757.
[0207] Životinjski modeli drugih neurodegenerativnih ili neuropatoloških bolesti pored ALS-a uključuju transgeni mišji model za procenu spinalne i bulbarne mišićne atrofije (SBMA) (Katsuno i sarad., Neuron (2002) 35:843 854), životinjske modele za paralitički poliomijelitis kod ljudi (Ford i sarad., Microb. Pathog. (2002) 33:97107), životinjske modele spinalne mišićne atrofije (Schmid i sarad., J. Child Neurol.22, 1004-1012, 2007), životinjske modele za distalnu miopatiju i naslednu miopatiju inkluzionog tela (Malicdan i sarad., Acta Myol.2007 Decembar; 26(3): 171-175), murinske modele genetske demijelinizirajuće bolesti (Suzuki i sarad., Microsc. Res. Tech.
1995;32:204-214), i one koje su opisali Meyer ZuHörste i sarad. (Curr. Opin. Neurol.
2006;19:464-473).
[0208] Životinjski modeli za testiranje efikasnosti anti-miostatin adnektina pronalaska protiv gubitka mišićnog volumena usled atrofije i/ili neaktivnosti uključuju, ali nisu ograničeni na, mišje modele jednostrane imobilizacije (Madaro i sarad., Basic Applied Myology 2008;18:149-153), razderotine Ahilove tetive (tenotomija) (Bialek i sarad., Physiol Genomics 2011;43:1075-86), i one stavljene na uvid javnosti u Powers i sarad. (Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005;288:R337-44), kao što su, podizanje (vešanje) zadnjih udova životinja, imobilizacija udova i kontrolisana mehanička ventilacija.
[0209] Relevantni životinjski modeli za testiranje efikasnosti anti-miostatin adnektina predmetnog pronalaska u lečenju metaboličkih poremećaja uključuju, ali nisu ograničeni na, one stavljene na uvid javnosti u Ramaro i sarad. (Indian J Med Res 2007;125:451-472) i Kennedy i sarad. (Bolest Models & Mechanisms 2010;3:156-166). Neograničavajući primeri takvih životinjskih modela uključuju Lep<ob/ob>miševe, Lepr<db>miševe, Kuo Kondo miševe, KK/<Ay>miševe, Novozelandske gojazne (NZO) miševe, NONcNZO10 miševe, Tsumara Suzuki gojazne djabetične (TSOD) i Tsumara Suzuki negojazne (TSNO) miševe, M16 miševe, Zucker pacove sa masnoćama, Zucker dijabetične pacove sa masnoćama, SHR/N- cp pacova, JCR/LA -cp pacove, Otsuka Long Evans Tokushima pacove sa masnoćama, gojazne rezus majmune, Cohen diajabetične pacove, Goto-Kakizaki pacove, i mutantne C57 BL/6 (Akita) negojazne miševe. Dijabetes tipa 2 takođe može biti izazvan ishranom, npr., hranjenjem negojaznih, nedijabetičnih miševa C57BL6 hranom sa visokom sadržajem masti (Surwit i sarad., Diabetes 1988;37:1163-7). Dijabetes tipa 2 se takođe može hemijski indukovati sa, npr., zlatotioglukozom (Le Marchand Brustel i sarad., Am J Physiol 1978;234:E348-58) ili streptozotocinom, ili indukovati hirurški (npr., delimično pankreatomizovane dijabetičke životinje) (McNeil JH., Experimental models of diabetes. Florida, US: CRC Press LLc; 1999; Sasaki i sarad., In Vivo 2000;14:535-41). Takođe je poznato da mnogi genetski životinjski modeli rekapituliraju simptome i fenotipove metaboličkih poremećaja, kao što su oni pregledani u Kennedy i sarad., 2010 (supra).
[0210] U nekim tehničkim rešenjima, efikasnost anti-miostatin adnektina pronalaska za povećanje mišićne mase ili zapremine može se testirati subkutanim injektiranjem miševa, kao što je opisano u Primeru 9. Imajući u vidu da inhibicija miostatina povećava mišićnu masu, očekuje se da će antimiostatin adnektini pronalaska povećati telesnu težinu i mišićnu masu, mera u kojoj se može koristiti za određivanje potencije adnektina.
[0211] U nekim tehničkim rešenjima, posebno kad anti-miostatin adnektini su imunogeni kod miševa (npr., zbog upotrebe domena humanog fibronektina tipa III) i kad su poželjni hronični tretmani, anti-miostatin adnektini pronalaska mogu da se administriraju SCID miševima, koji nisu u stanju da podignu ćelijske ili humoralne imune odgovore. U nekim tehničkim rešenjima, SCID miševi se mogu ukrstiti sa drugim genetskim modelima, kao što su oni koji su ovde opisanih (npr., diajabetički miševi), da bi se razvio imunokompromitovani mišji model koji je podložan hroničnom lečenju sa anti-miostatin adnektinima pronalaska.
VIII. Terapijske primene
[0212] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-miostatin adnektine korisne za lečenje bolesti ili poremećaja u vezi sa miostatinom, npr., poremećaja gubitka mišića, atrofije mišića, metaboličkog poremećaja i degenerativnog poremećaja kostiju. Shodno tome, ovde opisni postupci za ublažavanje ili inhibiciju bolesti ili poremećaja u vezi sa miostatinom kod subjekta koji obuhvataju administriranje subjektu efikasne količine polipeptida koji se vezuje za miostatin, tj., anti-miostatin adnektina. U nekim tehničkim rešenjima, subjekt je čovek. U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini su farmaceutski prihvatljivi za sisare, posebno za čoveka. "Farmaceutski prihvatljiv" polipeptid se odnosi na polipeptid koji se administrira životinji bez značajnih štetnih medicinskih posledica, kao što je u suštini bez endotoksina, ili veoma niskih nivoa endotoksina.
[0213] U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska će se administrirati subjektu u kombinaciji (istovremeno ili odvojeno) sa sredstvom koje je u oblasti poznato kao korisno za određeni poremećaj ili bolest koja se leči.
[0214] U nekim tehničkim rešenjima, ciljna populacija pacijenata za terapiju anti-miostatin adnektinom je ona koja nije podložna standardnoj terapiji bolesti, poremećaja ili stanja koje se leči zbog, npr., starosti, postojećih stanja, genetskog sastava, i/ili pratećih bolesti. Anti-miostatin adnektini pronalaska mogu poslužiti kao alternativa postojećim terapijama koje su u vezi sa značajnim sporednim efektima (npr., reproduktivne performanse) ili bezbedonosnim problemima.
[0215] Bolesti, poremećaji i stanja uzeti kao primer, za koje će anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska biti korisni, opisani su detaljnije u nastavku.
Mišićne, neurološke i metaboličke bolesti i poremećaji
[0216] Anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska mogu se koristiti za lečenje mišićnih, neuroloških i metaboličkih poremećaja koji su u vezi sa gubitkom mišića i/ili atrofijom mišića. Na primer, prekomerno eksprimiranje miostatina in vivo izaziva znake i simptome karakteristične za kaheksiju, a agensi koji vezuju miostatin mogu delimično da reše efekat gubitka mišića miostatina (Zimmers i sarad., Science 2002;296:1486-8). Pacijenti sa AIDS-om takođe pokazuju povećane nivoe imunoreaktivnog materijala miostatina u serumu u poređenju sa pacijentima bez AIDS-a ili sa pacijentima sa AIDS-om koji ne pokazuju gubitak težine (Gonzalez-Cadavid i sarad., PNAS 1998;95:14938-43). Takođe je primećeno da eliminacija miostatina specifična za srce smanjuje atrofiju skeletnih mišića kod miševa sa srčanom insuficijencijom, i obrnuto, specifična prekomerna ekspresija miostatina u srcu je dovoljna da izazove gubitak mišića (Breitbart i sarad., AJP-Heart; 2011;300:H1973-82). Nasuprot tome, miostatin nokaut miševi pokazuju povečanu mišićnu masu, i smanjenje akumulacije masti u zavisnosti od starosti u poređenju sa njihovim pandanima divljeg tipa (McPherron i sarad., J. Clin. Invest.2002;109:595-601).
[0217] Poremećaji uzeti kao primer, koji se mogu lečiti u skladu sa medicinskom primenom pronalaska uključuju miopatije i neuropatije, uključujući, na primer, bolest motornih neurona, neuromišićne i neurološke poremećaje.
[0218] Na primer, anti-miostatin adnektini se mogu koristiti za lečenje naslednih miopatija i neuromišićnih poremećaja (npr., mišićna distrofija (Gonzalez-Kadavid i sarad., PNAS, 1998;95:14938-43), poremećaja motornih neurona, kongenitalne miopatije, inflamatorne miopatije i metaboličke miopatije), kao i stečene miopatije (npr., miopatija izazvana lekovima, miopatija izazvana toksinom, miopatija izazvana infekcijom, paraneoplastična miopatija i druge miopatije povezane sa kritičnim bolestima).
[0219] Takvi poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na, Dišenovu mišićnu distrofiju, progresivnu mišićnu distrofiju, Bekerovu mišićnu distrofiju, Dejerine-Landouzy mišićnu distrofiju, Erbovu mišićnu distrofiju, Emery Dreifuss-ovu mišićnu distrofiju, mišićnu distrofiju udovi-pojas, okulofaringealnu mišićnu distrofiju (OPMD), facioskapulohumeralu mišićnu distrofiju, kongenitalnu mišićnu distrofiju, infantilnu neuroaksonalnu mišićnu distrofiju, miotoničnu distrofiju (Steinertova bolest), distalnu mišićnu distrofiju, nemalinsku miopatiju, porodičnu periodičnu paralizu, nedistrofičnu miotoniju, periodičn paralize, spinalnu mišićnu atrofiju, spinalnu mišićnu atropiju (SMA), amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS), primarnu lateralnu sklerozu (PLS), progresivnu mišićnu atrofiju (PMA), , distalnu miopatiju, miotubularnu/centronuklearnu miopatiju, nemalinsku miopatiju, bolest mini jezgra, bolest centralnog jezgra, desminopatiju, miozitis sa inkluzionim telom, dermatomiozitis, polimiozitis, mitohondrijalnu miopatiju, kongenitalni miastenični sindrom, mijasteniju gravis, disfunkciju mišića nakon poliomijelitisa, steroidnu miopatiju, alkoholnu miopatiju, perioperativnu mišićnu atrofiju i ICU neuromiopatiju.
[0220] Nasleđene i stečene neuropatije i radikulopatije koje se mogu lečiti sa anti-miostatin adnektinima uključuju, ali nisu ograničeni na, sindrom krute kičme, bolest mišića-oka-mozga, naslednu motornu i senzornu neuropatiju, Carcot-Marie-Tooth bolest, hroničnu inflamatornu neuropatiju, progresivnu hipertrofičnu neuropatiju, tomakuloznu neuropatiju, lupus, Guillain-Barre sindrom, hroničnu inflamatornu demijelinizirajuću polineuropatiju, multiplu sklerozu, sarkoidozu, dijabetičku neuropatiju, alkoholnu neuropatiju, neuropatije koje su u vezi sa bolešću (npr., HIV/AIDS, Lajmska bolest), neuropatije koje su u vezi sa toksinom (npr., teški metal, hemoterapija), kompresione neuropatije (npr., tumori, neuropatija uklještenja) i neuropatije koje su u vezi sa povredom ili traumom (npr., sindrom degenerativne lubmosakralne stenoze, paraplegija, kvadriplegija).
[0221] U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini pronalaska mogu se koristiti za lečenje mišićnih distrofija (npr., Dišenova mišićna distrofija, Becker-ova mišićna distrofija), ALS i sarkopenije.
[0222] Dodatni poremećaji koji su u vezi sa gubitkom mišića koji se mogu lečiti sa anti-miostatin adnektinima pronalaska uključuju kaheksiju, sindrom gubitka, sarkopeniju, kongestivnu opstruktivnu bolest pluća, cističnu fibrozu (plućna kaheksija), srčanu bolest ili zastoj (srčana kaheksija), kancer, gubitak zbog AIDS-a, gubitak zbog bubrežne insuficijencije, bubrežnu bolest, klaudikaciju, kaheksiju kaja je u vezi sa dijalizom, uremiju, reumatoidni artritis, povredu mišića, operaciju, oporavak oštećenog mišića, slabost, atrofiju zbog neupotrebe, osteoporozu, osteoartritis, rast i oporavak ligamenta.
[0223] Anti-miostatin adnektini pronalaska se takođe mogu koristiti za povećanje zapremine mišića kod subjekata koji pate od atrofije mišića zbog neupotrebe. Atrofija zbog neupotrebe može biti rezultat brojnih uzroka uključujući bilo koji poremećaj ili stanje koje dovodi do produžene nepokretnosti ili neupotrebe, uključujući, ali ne ograničavajući se na produženo ležanje, vezanost za invalidska kolica, imobilizaciju udova, pražnjenje dijafragme putem mehaničke ventilacije, transplantaciju čvrstog organa, zamenu zgloba, šlog, slabost uzrokovanu oštećenjem CNS-a, povredu kičmene moždine, oporavak od teške opekotine, sedentarnu hroničnu hemodijalizu, oporavak nakon traume, oporavak nakon sepse i izlaganje mikrogravitaciji (Powers i sarad., Am JPhysiol Regul Integr Comp Physiol 2005;288:R337-44).
[0224] Pored toga, povećanje odnosa masti i mišića koje je u vezi sa starošću, i mišićna atrofija koja je u vezi sa godinama izgleda da su u vezi sa miostatinom. Na primer, prosečan serumski miostatin-imunoreaktivni protein se povećao sa godinama u grupama mladih (19-35 godina starosti), srednjih godina (36-75 godina starosti) i starih (76-92 godina starosti) muškaraca i žena, dok prosečna mišićna masa i masa bez masti su opadale sa godinama u ovim grupama (Yarasheski i sarad. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). Shodno tome, subjekti sa atrofijom mišića usled starenja, i/ili subjekti koji su slabi zbog, na primer, sarkopenije, takođe bi imali koristi od lečenja sa antimiostatin adnektinima pronalaska.
[0225] Takođe se razmatraju postupci za povećanje mišićne mase, kod životinja koje se hrane hranom, administriranjem efikasne doze anti-miostatin adnektina ovim životinjama. Pošto je zreli C-terminalni polipeptid miostatina identičan u svim vrstama, očekuje se da anti-miostatin adnektini efikasno povećavaju mišićnu masu i smanjuju masnoće kod bilo koje poljoprivredno važne vrste, na primer, ali ne ograničavajući se na, goveda, piletina, ćurke i svinje.
[0226] Efikasnost anti-miostatin adnektina u lečenju poremećaja gubitka mišića ili atrofije mišića može se odrediti, na primer, jednom ili više metoda za merenje povećanja mišićne mase ili zapremine, povećanja broja mišićnih ćelija (hiperplazija), povećanje veličine mišićne ćelije (hipertrofija) i/ili povećanje mišićne snage. Na primer, efekti na povećanje mišićnog volumena anti-miostatin adnektina predmetnog pronalaska su demonstrirani u Primerima opisanim dole infra. Postupci za određivanje "povećane mišićne mase" su dobro poznati u oblasti. Na primer, sadržaj mišića se može meriti pre i posle administriranja anti-miostatin adnektina predmetnog pronalaska korišćenjem standardnih tehnika, kao što je merenje pod vodom (videti, npr., Bhasin i sarad. New Eng. J. Med. (1996) 335:1-7) i dual-energetska rendgenska apsorpciometrija (videti, npr., Bhasin i sarad. Mol. Endocrinol. (1998) 83:3155-3162). Povećanje veličine mišića može biti dokazano povećanjem težine od najmanje oko 5-10%, poželjno najmanje oko 10-20% ili više.
Metabolički poremećaji
[0227] Anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska, koji smanjuju aktivnost miostatina i/ili signalizaciju, korisni su za lečenje metaboličkih poremećaja, kao što su gojaznost, dijabetes melitus tipa II, poremećaji koji su u vezi sa dijabetesom, metabolički sindrom i hiperglikemija.
[0228] Miostatin je uključen u patogenezu dijabetes melitusa tipa II. Miostatin se eksprimira u masnom tkivu i miševi sa nedostatkom miostatina pokazuju smanjenu akumulaciju masti kako stare. Štaviše, opterećenje glukozom, akumulacija masti i ukupna telesna težina su smanjeni kod aguti smrtonosno žutih i gojaznih (Lep<ob/ob>) miševa (Yen i sarad., FASEB J. 8:479, 1994; McPherron i sarad., 2002) sa nedostatkom miostatina. Kao što je stavljeno na uvid javnosti u US2011/0008375, antagonisti miostatina mogu da smanje odnos masti i mišića u modelu starijeg miša, očuvaju skeletnu mišićnu masu i nemasnu telesnu masu, i ublaže hipertrofiju bubrega kod STZ-indukovanih dijabetičkih miševa.
[0229] Kako se ovde koristi, "gojaznost" je stanje u kome se višak telesne masti akumulirao do te mere da može negativno uticati na zdravlje. Obično se definiše kao indeks telesne mase (BMI-body mass index) od 30 kg/m2 ili više što ga razlikuje od prekomerne težine kako je definisano pomoću BMI od 25 kg/m2 ili više (videti, npr., Svetska zdravstvena organizacija (2000) (PDF).
Serije tehničkog izveštaja 894: Gojaznost: Prevenija i upravljanje globalnom epidemijom. Ženeva: Svetska zdravstvena organizacija). Prekomerna telesna težina je povezana sa različitim bolestima, posebno kardiovaskularnim bolestima, dijabetes melitusom tipa II, opstruktivnom apnejom u snu, određenim vrstama kancera i osteoartritisom.
[0230] Subjekt sa gojaznošću se može identifikovati, na primer, određivanjem BMI (BMI se izračunava deljenjem težine subjekta kvadratom njegove ili njene težine), obima struka i odnosa struka i kukova (apsolutni obim struka (>102 cm za muškarce i >88 cm za žene) i odnos struka i kukova (obim struka podeljen sa obimom bokova >0.9 za muškarce i >0.85 za žene) (videti, npr., Yusuf S, i sarad., (2004). Lancet 364: 937-52) i/ili procenat telesne masti (ukupne telesne masti izražene kao procenat ukupne telesne težine: muškarc sa više od 25% telesne masti i žene sa više od 33% telesne masti su gojazni; procenat telasne masti može se proceniti iz BMI osobe po sledećoj formuli: Telesna mast% = (1.2 * BMI) (0.23 *starost) - 5.4 - (10.8 * pol), gde je pol 0 ako je žena i 1 ako je muškarac). Tehnike merenja procenta telesne masti uključuju, na primer, kompjuterizovanu tomografiju (CT skeniranje), snimanje magnetnom rezonancom (MRI-magnetic resonance imaging) i dualnu energetsku apsorciometriju rendgenskih zraka (DEXA- dual energy X-ray absorptiometry).
[0231] Pojam "dijabetes tipa II" odnosi se na hroničnu, doživotnu bolest koja nastaje kada insulin u telu ne radi efikasno. Glavna komponenta dijabetesa tipa II je "insulinska rezistencija," pri čemu insulin koji proizvodi pankreas ne može da se poveže sa masnim i mišićnim ćelijama kako bi omogućio glukozi unutra da proizvodi energiju, što izaziva hiperglikemiju (visok nivo glukoze). Da bi se kompenzovao, pankreas proizvodi više insulina, a ćelije, osetivši ovu poplavu insulina, postaju još otpornije, što dovodi do začaranog kruga visokih nivoa glukoze i često visokih nivoa insulina.
[0232] Izraz "poremećaji u vezi sa dijabetesom" ili "sa dijabetesom povezani poremećaji" ili "poremećaji koji se odnose na dijabetes," kako se ovde koristi, odnosi se na stanja i druge bolesti koje su obično srodne ili u vezi sa dijabetesom. Primeri poremećaja povezanih sa dijabetesom uključuju, na primer, hiperglikemiju, hiperinsulinemiju, hiperlipidemiju, insulinsku rezistenciju, poremećeni metabolizam glukoze, gojaznost, diajbetičku retinopatiju, makularnu degeneraciju, kataraktu, dijabetičku nefropatiju, glomerulosklerozu, dijabetičku neuropatiju, erektilnu disfunkciju, predmenstrualni sindrom, vaskularnu restenozu, ulcerozni kolitis, koronarnu bolest srca, hipertenziju, anginu pektoris, infarkt miokarda, šlog, poremećaje kože i vezivnog tkiva, ulceraciju stopala, metaboličku acidozu, artritis i osteoporozu.
[0233] Efikasnost anti-miostatin adnektina u lečenju metaboličkih poremećaja može se utvrditi, na primer, jednom ili sa više metoda merenja povećanja insulinske osetljivosti, povećanja preuzimanja glukoze u ćelije subjekta, smanjenje nivoa glukoze u krvi i smanjenje telesne masti.
[0234] Na primer, kod subjekata koji imaju dijabetes tipa II ili koji su u riziku od razvoja dijabetesa, nivoi HbA1c se mogu pratiti. Pojam "hemoglobin 1AC" ili "HbA1c" kako se ovde koristi odnosi se na proizvod neenzimske glikacije B lanca hemoglobina. Željeni ciljni opseg nivoa HbA1c za osobe sa dijabetesom može se odrediti iz smernica Američkog udruženja za dijabetes (ADA- American Diabetes Association), tj., Standarda medicinske nege kod dijabetesa (Diabetes Care 2012;35(dodatak 1):5511-563). Trenutni ciljni nivoi HbA1c su generalno <7.0% za osobe sa dijabetesom, a ljudi koji nemaju dijabetes obično imaju vrednosti HbA1c manje od 6%. Shodno tome, efikasnost anti-miostatin adnektina predmetnog pronalaska može se odrediti primećenim smanjenjem nivoa HBA1c kod subjekta.
[0235] Anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska može se administrirati sam, ili u kombinaciji sa drugim agensima koji su poznati u oblasti za kontrolu glikemije (npr., insulin, GLP1) ili za lečenje komplikacija koje su u vezi sa dijabetesom koje su prepoznate u struci.
Ostali poremećaji
[0236] Miostatin nokaut miševi pokazuju povećanu mišićnu masu, kao i povećan sadržaj minerala i gustinu mišjeg humerusa, i povećan sadržaj minerala i trabekularne i kortikalne kosti u regionima gde se mišići vezuju (Hamrick i sarad. Calcif Tkivo Intl 2002;71:63-8). Ovo sugeriše da povećanje mišićne mase može pomoći u poboljšanju snage kostiju i smanjenju osteoporoze i drugih degenerativnih bolesti kostiju.
[0237] Dodatne bolesti ili poremećaji za koje su korisni anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska uključuju zarastanje rana, antifibrotičnu bolest, Lambert-Eaton-ov sindrom i Parkinsonovu bolest.
Kombinovane terapije
[0238] Anti-miostatin adnektini koji su ovde navedeni mogu se koristiti u kombinaciji sa antidijabetičkim agensima, antihiperglikemijskim agensima, antihiperinsulinemičnim agensima, antiretinopatskim agensima, antineuropatskim agensima, antineurodegenerativnim agensima, antinefropatskim agensima, antiaterosklerotskim agensima, antiishemijskim agensima, antihipertenzivnim agensima, agensima protiv gojaznosti, antidislipidemijskim agensima, antidislipidemijskim agensima, antihiperlipidemjskim agensima, antihipertrigliceridemijskim agensima, antihiperholesterolemijskim agensima, antirestenotičkim agensima, antipankreatijskim agensima, agensima za snižavanje lipida, anorektičkim agensima, agensima za poboljšanje pamćenja, agensima protiv demencije, ili agensima koji podstiču kogniciju, sredstvima za suzbijanje apetita, neuro- ili mišićno-restorativnim tretmanima, tretmanima srčane insuficijencije, tretmanima bolesti perifernih arterija i antiinflamatornim agensima.
[0239] Antidijabetički agensi koji se koriste u kombinaciji sa anti-miostatin adnektinima uključuju, ali nisu ograničeni na, insulinske sekretagoge ili insulinske senzibilizatore, modulatore GPR40 receptora ili druge antidijabetičke agense. Ovi agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore dipeptidil peptidaze IV (DP4) (na primer, sitagliptin, saksagliptin, alogliptin, vildagliptin i slično), bigvanide (na primer, metformin, fenformin i slično), sulfonil uree (na primer, gliburide, glimepiride, glipizide i slično), inhibitore glukozidaze (na primer, akarboza, miglitol, i slično), agoniste PPAPγ kao što su tiazolidindioni (na primer, rosiglitazone, pioglitazone, i slično), PPAR α/γ dual agoniste (na primer, muraglitazar, tesaglitazar, aleglitazar, i slično), aktivatore glukokinaze (kao što je opisano u Fyfe i sarad., Drugs of the Future, 34(8):641-653 (2009)), modulatore GPR119 receptora (MBX-2952, PSN821, APD597 i slično), inhibitore SGLT2 (dapagliflozin, kanagliflozin, remagliflozin i slično), analoge amilina kao što je pramlintid i/ili insulin. Pregledi trenutnih i novih terapija za lečenje dijabetesa mogu se naći u: Mohler i sarad., Medicinal Research Reviews, 29(1):125-195 (2009), i Mizuno i sarad., Current Medicinal Chemistry, 15:61-74 (2008).
[0240] Anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska mogu takođe biti po izboru korišćeni u kombinaciji sa jednim ili više hipofagičnih agenasa kao što su dietilpropion, fendimetrazin, fentermin, orlistat, sibutramin, lorkaserin, pramlintid, topiramat, antagonisti MCHR1 receptora, oksintomodulin, naltrekson, amilin peptid, modulatori NPY Y5 receptora, modulatori NPY Y2 receptora, modulatori NPY Y4 receptora, cetilistat, modulatori 5HT2c receptora, i slično. Antimiostatin adnektini predmetnog pronalaska se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa agonistom receptora peptida 1 sličnog glukagonu (GLP-1 R), kao što je eksenatid, liraglutid, GPR-1(1-36) amid, GLP-1(7-36) amid, GLP-1(7-37) kao što je stavljeno na uvid javnosti u Američkom patentu sa brojem 5,614,492 od Habener), koji se može administrirati putem injektiranja, intranazalno ili transdermalnim ili bukalnim uređajima. Pregledi trenutnih i novih terapija za lečenje gojaznosti mogu se naći u: Melnikova i sarad., Nature Reviews Drug Discovery, 5:369-370 (2006); Jones, Nature Reviews: Drug Discovery, 8:833-834 (2009); Obici, Endocrinology, 150(6):2512-2517 (2009); i Elangbam, Vet. Pathol., 46(1):10-24 (2009).
[0241] Anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska se takođe mogu administrirati sa jednim ili više dodatnih teapijskih agenasa, u zavisnosti od određene bolesti ili poremećaja koji se leči. Neograničavajući primeri dodatnih agenasa uključuju one koji su korisni za lečenje metaboličkih poremećaja kao što su dijabetes tipa II i sarkopenija i uključuju, ali nisu ograničeni na, GLP-1, GLP-1-sličan, amilin i FGF21; one koji su korisni za lečenje antifibrozne bolesti, neuromišićne bolesti, bolesti motornih neurona i sarkopenije i uključuju, ali nisu ograničeni na, grelin, SARM, riluzol, testosteron, androgene, hormone rasta, terapiju hormonske zamene, inhibitore COX-2, aktivatore troponina, β2 agoniste, CTLA4-Ig (npr., abetacept, belatacept) i anti-TGFβ antitela; one koji su korisni za lečenje kaheksije i drugih sindroma trošenja i uključuju, ali nisu ograničeni na, inhibitore kinaznog receptora TGFβ, anti-IL-6, i inhibitore ubikvitin-proteazoma; one koji su korisni za lečenje mišićnih grčeva povezanih sa miotonijom i PLS uključuju, ali nisu ograničeni na fitoin, kinin, baklofen i tizanidin; one koji su korisni za neuropatije uključuju antidepresive (npr., triciklične i selektivne inhibitore ponovnog preuzimanja serotonina-norepinefrina (SNRI's)), antikonvulzante, kanabinoide, botulinum toksin Tipa A, NMDA antagoniste (npr., ketamin), dijetetske suplemente (npr., alfa lipoična kiselina i benfotiamin); one koji su korisni za lečenje hroničnih inflamatornih neuropatija uključuju, ali nisu ograničeni na, kortikosteroide, intravenski imunoglobulin, i imunosupresivne lekove (npr., ciklofosfamid, ciklosporin, azatioprin, mikofenolat mofetil, anti-timocit globulin, rituksimab); i one koji su korisni za lečenje Gilen Bareovog sindroma, sarkopenije, preloma, i gubitka kostiju i uključuju, ali nisu ograničeni na, Boniva (ibandronat) i PTH.
[0242] Anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska mogu se administrirati sa jednim ili više dodatnih agenasa koji se koriste u simptomatskoj terapiji. Neograničavajući primeri takvih agenasa za lečenje simptoma ALS uključuju aktivatore tranzicije mitohondrijalne permeabilnosti pora (MPT - mitochondrial permeability transition), brze skeletne aktivatore troponina, regulatore makrofaga (npr., NP001), agense za lečenje lizozomalne bolesti skladištenja (npr., NP003), i antagoniste receptora nikotinskog acetilholina (nAchR). Neograničavajući primer dodatnog agensa za primenu u lečenje simptoma DMD/BMD je agens koji povećava nivoe ATP-a.
[0243] Anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska se takođe mogu administrirati sa jednim ili više dodatnih agenasa koji se koriste u terapiji modifikacije bolesti. Neograničavajući primeri takvih agenasa za lečenje ALS uključuju hvatače slobodnih radikala (npr., edaravon (norfenazon), CV-3611), VEGF agoniste (npr., sNN0029), Nogo-A protein I (npr., GSK122324), inhibitore SOD1 (npr., ISIS-SOD1Rx) i inhibitore PGE sintaze 1 (npr., AAD-2004). Neograničavajući primeri takvih agenasa za lečenje DMD/BMD uključuju one koji promovišu preskakanje egzona (npr., antisens molekuli kao što su drisapersen (PRO051/GSK2402968), PRO044, Eteplirsen, AVI-4658, AVI-5038, Ataluren (PTC124)), agensi za gensku terapiju, antiinflamatorne agense (npr., CRD007) i agense protiv fibroze (npr., HT-100).
[0244] Kao što je gore diskutovano, agensi koji promovišu zaobilaženje egzona mogu se koristiti u kombinaciji sa anti-miostatin adnektinima predmetnog pronalaska za lečenje Dišenove mišićne distrofije i mišićne distrofije tipa Becker. Primeri specifičnih egzona koji se mogu ciljati da povrate funkcionalni distrofin uključuju egzone 7, 8, 17, 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 53 i 55 (videti, npr., Lu i sarad., Molecular Therapy 2011;19:9-15). U nekim tehničkim rešenjima, više od jednog agensa, npr., antisens oligonukleotida, može da se koristi za indukciju zaobilaženje više egzona.
IX. Farmaceutske kompozicije
[0245] Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antimiostatin adnektin ili njegove fuzione proteine, pri čemu je kompozicija u suštini bez endotoksina, ili barem ne sadrži više od prihvatljivih nivoa endotoksina kako je odredila odgovarajuća regulatorna agencija (npr., FDA).
[0246] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti u obliku pilule, tablete, kapsule, tečnosti ili tablete sa produženim oslobađanjem za oralno administriranje; tečnosti za intravensko, subkutano ili parenteralno administriranje; ili gela, losiona, masti, kreme ili polimera ili drugog nosača sa produženim oslobađanjem za lokalno administriranje.
[0247] Postupci dobro poznati u oblasti za dobijanje kompozicija nalaze se, na primer, u "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20. Izd. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.). Kompozicije za parenteralno administriranje mogu, na primer, da sadrže ekscipijense, sterilnu vodu, fiziološki rastvor, polialkilen glikole kao što je polietilen glikol, ulja biljnog porekla, ili hidrogenizovane naftalene. Biokompatibilni, biorazgradivi laktidni polimer, laktid/glikolid kopolimer, ili polioksietilen-polioksipropilen kopolimeri mogu se koristiti za kontrolu oslobađanja jedinjenja. Kompozicije nanočestica (npr., biorazgradive nanočestice, čvrste lipidne nanočestice, lipozomi) mogu se koristiti za kontrolu biodistribucije jedinjenja. Drugi potencijalno korisni sistemi za parenteralnu isporuku uključuju čestice kopolimera etilen-vinil acetata, osmotske pumpe, implantabilne infuzione sisteme i lipozome. Koncentracija jedinjenja u kompoziciji varira u zavisnosti od brojnih faktora, uključujući dozu leka koja se administrira i način administriranja.
[0248] Prihvatljivi nosači, ekscipijensi ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfat, citrat, i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekularne mae (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrane; helatne agense kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra jon koji formira so kao što je natrijum; komplekse metala (npr., kompleksi Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante kao što su Tween, PLURONIC<™>ili polietilen glikol (PEG).
[0249] Polipeptidi predmetnog pronalaska mogu se po izboru administrirati kao farmaceutski prihvatljiva so, kao što su netoksične kiselinske adicione soli ili kompleksi metala koji se obično kpriste u farmaceutskoj industriji. Primeri kiselinskih adicionih soli uključuju organske kiseline kao što su sirćetna, mlečna, pamoinska, maleinska, limunska, jabučna, askorbinska, jantarna, benzojeva, palmitinska, suberinska, salicilna, vinska, metansulfonska, toluensulfonska, ili trifluorosirćetna kiseline ili slično; polimerne kiseline kao što su taninska kiselina, karboksimetil celuloza, ili slično; i neorganska kiselina kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, ili slično. Kompleksi metala uključuju cink, gvožđe, i slično. U once primeru, polipeptid je formulisan u prisustvu natrijum acetata da bi se povećala termalna stabilnost.
[0250] Aktivni sastojci takođe mogu biti zarobljeni u mikrokapsuli pripremljenoj, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsula i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, redom, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su stavljene na uvid javnosti u Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980).
[0251] Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže proteine predmetnog pronalaska, pri čemu su matrice u formi oblikovanih predmeta, npr., filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (Američki patenti br. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske aminokiseline i y etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečne kiseline-glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT<™>(mikrosfere za injekcije sastavljene od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetat), i poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu. Dok polimeri kao što su etilenvinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula preko 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine za kraće vremenske periode. Kada inkapsulirani proteini predmetnog pronalaska mogu ostati duže vreme u telu, oni se mogu denaturisati ili agregirati kao rezultat izlaganja vlazi na 37°C, što dovodi do gubitka biološke aktivnosti i mogućih promena u imunogenosti. Mogu se osmisliti racionalne strategije za stabilizaciju u zavisnosti od uključenog mehanizma. Na primer, ako se otkrije da je mehanizam agregacije formiranje intermolekularne S-S veze putem razmene tio-disulfida, stabilizacija se može postići modifikovanjem sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, korišćenjem odgovarajućih aditiva i razvojem specifičnih kompozicija polimerne matrice.
[0252] Kompozicije predmetnog pronalaska za oralnu primenu uključuju tablete koje sadrže activni sastojak(e) u smeši sa netoksičnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom. Ovi ekscipijensi mogu biti, na primer, inertni razblaživači ili punioci (npr., saharoza i sorbitol), agensi za podmazivanje, klizna sredstva i anti-adhezivi (npr., magnezijum stearat, cink stearat, stearinska kiselina, silicijum dioksid, hidrogenizovana biljna ulja, ili talc). Kompozicije za oralnu upotrebu takođe mogu biti obezbeđene kao tablete za žvakanje, ili kao tvrde želatinske kapsule gde je aktivni sastojak pomešan sa inertnim čvrstim razblaživačem, ili kao meke želatinske kapsule gde je aktivni sastojak pomešan sa vodom ili uljanim medijumom.
[0253] Farmaceutska kompozicija koja se koristi za in vivo administriranje tipično mora biti sterilna. Ovo se može postići filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane. Tamo gde je kompozicija liofilizovana, sterilizacija korišćenjem ovog postupka može da se sprovede ili pre ili posle liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicija za parenteralno administriranje može se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Pored toga, parenteral kompozicije se generalno stavljaju u kontejner koji ima sterilni pristupni otvor, na primer, vrećicu za intravenski rastvor ili bočicu sa čepom koja se može probiti iglom za hipodermičku injekciju.
[0254] Kada je farmaceutska kompozicija formulisana, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca ili dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovan) koji zahteva rekonstituciju pre administriranja.
[0255] Kompozicije ovde mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja po potrebi za određenu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Takvi molekuli su prikladno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu.
X. Administriranje
[0256] Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska može se administrirati subjektu koji ima rizik od ili pokazuje patologije kao što je ovde opisano korišćenjem standardnih tehnika administriranja uključujući oralno, parenteralno, plućno, transdermalno, intramuskularno, intranazalno, bukalno, sublingualno, ili administriranje supozitorija. Poželjno, administriranje anti-miostatin adnektina predmetnog pronalaska je parenteralno. Pojam parenteralno kako se ovde koristi uključuje intravensko, intramuskularno, subkutano, rektalno, vaginalno ili intraperitonealno administriranje. Poželjna je periferna sistemska isporuka intravenskom ili intraperitonealnom ili subkutanom injekcijom.
[0257] Terapijski efikasna doza se odnosi na dozu koja proizvodi terapijske efekte zbog kojih se administrira. Efikasna količina farmaceutske kompozicije koja će se koristiti u terapiji zavisiće, na primer, od terapijskog konteksta i ciljeva. Stručnjak u oblasti će shvatiti da će odgovarajući nivoi doze za lečenje tako varirati u zavisnosti, delimično, od isporučenog molekula, indikacije za koju se koristi molekul vezivnog agensa, načina administriranja, i veličine (telesna težina, telesna površina ili veličina organa) i stanja (starost i opšte zdravlje) pacijenta.
[0258] Na primer, terapijski efikasna doza se može inicijalno proceniti ili u testovima ćelijske kulture ili na životinjskim modelima kao što su miševi, pacovi, zečevi, psi, svinje ili majmuni. Životinjski model se takođe može koristiti za određivanje odgovarajućeg opsega koncentracije i načina administriranja. Takve informacije se zatim mogu koristiti za određivanje korisnih doza i načina administriranja kod ljudi.
[0259] Tačna doza će biti određena u svetlu faktora u vezi sa subjektom koji zahteva lečenje, i može se utvrditi korišćenjem standardnih tehnika. Doziranje i administriranje se prilagođavaju da obezbede dovoljne nivoe aktivnog jedinjenja ili da održe željeni efekat. Faktori koji se mogu uzeti u obzir uključuju ozbiljnost stanja bolesti, opšte zdravlje subjekta, starost, težinu i pol subjekta, vreme i učestalost administriranja, kombinaciju(e) leka, reakcionu osetljivost, i odgovor na terapiju. Generalno, anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska se administriraju u dozi od oko 0.01 mg/kg do oko 50 mg/kg dnevno, poželjno 0.01 mg/kg do oko 30 mg/kg dnevno, najpoželjnije 0.01 mg/kg do oko 20 mg/kg dnevno. U nekim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska se administriraju u nedeljnim dozama od oko 1 do 50 mg, more poželjnije oko 10-50 mg. U drugim tehničkim rešenjima, anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska se administriraju u mesečnim dozama od 30-200 mg, poželjno 50-150 mg, a poželjnije 60-120 mg.
[0260] Učestalost doziranja zavisiće od farmakokinetičkih parametara molekula vezivnog agensa u formulaciji koja se koristi. Tipično, kompozicija se administrira sve dok se ne postigne doza kojom se postiže željeni efekat. Kompozicija se stoga može administerirati kao pojedinačna doza ili kao višestruke doze (u istim ili različitim koncentracijama/dozama) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija. Rutinski se vrši dalje usklađivanje odgovarajuće doze. Odgovarajuće doze se mogu utvrditi korišćenjem odgovarajućih podataka o dozi i odgovoru. Na primer, anti-miostatin adnektin se može administrirati dnevno (npr., jednom, dva, tri ili četiri puta dnevno) ili ređe (npr., jednom svakog drugog dana, jednom ili dva puta nedeljno, ili mesečno). Pored toga, kao što je poznato u oblasti, možda će biti neophodna prilagođavanja starosne dobi kao i telesne težine, opšteg zdravlja, pola, ishrane, vremena administriranja, interakcije sa lekom i težine bolesti, a to će se utvrditi rutinskim eksperimentisanjem od strane stručnjaka u oblasti. Anti-miostatin adnektin se prikladno administrira pacijentu u jednom trenutku ili tokom serije tretmana.
[0261] Administriranje anti-miostatin adnektina ili njegove fuzije, i jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa, bilo da se administriraju zajedno ili daju uzastopno, može se desiti terapijska promena kao što je opisano iznad. Stručnjak će razumeti da pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači, razblaživači i ekscipijensi za zajedničko administriranje zavise od identiteta određenog terapijskog agensa koji se administrira.
XI. Postupci detekcije i dijagnostike
[0262] Anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska su takođe korisni u različitim diajagnostičkim primenama. Na primer, anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska može da se koristi za diajagnozu poremećaja ili bolesti koje su u vezi sa povećanim nivoima miostatina. Na sličan način, anti-miostatin adnektin se može koristiti u testu za praćenje nivoa miostatina kod subjekta koji se leči od stanja koje je u vezi sa miostatinom. Anti-miostatin adnektini mogu se koristiti sa ili bez modifikacije, i obeleženi su kovalentnim ili nekovalentnim vezivanjem detektabilnog segmenta. Detektabilni segment može biti bilo koji, koji je sposoban da proizvede, bilo direktno ili indirektno, detektabilni signal. Na primer, segment koji se može detektovati može biti radioizotop, kao što je H3, C14 ili 13, P32, S35 ili 1131; fluorescentno ili hemiluminiscentno jedinjenje, kao što je fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin; ili enzim, kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza ili peroksidaza rena.
[0263] Može se primeniti bilo koji postupak, poznat u struci, za konjugaciju proteina na segmentu koji se može detektovati, uključujući one postupke koje su opisali Hunter, i sarad., Nature 144:945 (1962); David, i sarad., Biohemija 13:1014 (1974); Pain, i sarad., J. Immunol. Meth. 40:219 (1981); i Nygren, J. Histochem. i Cytochem. 30:407 (1982). In vitro postupci uključuju hemiju konjugacije dobro poznatu u struci, uključujući hemiju kompatibilnu sa proteinima, kao što je hemija za specifične aminokiseline, kao što su Cys i Lys. Da bi se povezao segment (kao što je PEG) sa proteinom predmetnog pronalaska, koristi se grupa za vezivanje ili reaktivna grupa. Pogodne grupe za vezivanje su dobro poznate u oblasti i uključuju disulfidne grupe, tioetarske grupe, kiselinsko labilne grupe, fotolabilne grupe, grupe labilne na peptidazu i grupe labilne na esterazu. Poželjne vezujuće grupe su disulfidne grupe i tioetarske grupe u zavisnosti od primene.
Za polipeptide bez aminokiseline Cys, Cys se može konstruisati na lokaciji koja omogućava postojanje aktivnosti proteina dok se stvara lokacija za konjugaciju.
[0264] Anti-miostatin adnektini povezani sa detektabilnim segmentom takođe su korisni za in vivo snimanje. Polipeptid može biti vezan za radio-neprozirni agens ili radioizotop, koji se administrira subjektu, poželjno u krvotok, a prisustvo i lokacija obeleženog proteina u subjektu se ispituju. Ova tehnika snimanja je korisna u stadijumu i lečenju maligniteta. Protein može biti obeležen bilo kojim segmentom koji se može detektovati kod subjekta, bilo nuklearnom magnetnom rezonancom, radiologijom ili drugim sredstvima za detekciju koja su poznata u oblasti.
[0265] Anti-miostatin adnektini su takođe korisni kao afinitetni agensi za prečišćavanje. U ovom procesu, polipeptidi se imobilišu na pogodnoj podlozi, kao što je Sefadeks smola ili filter papir, korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u oblasti.
[0266] Anti-miostatin adnektini se mogu koristiti u bilo kom poznatom postupku ispitivanja, kao što su testovi kompetitivnog vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi i testovi imunoprecipitacije (Zola, Monoclonal Antitela: A Manual of Techniques, str. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987)).
[0267] U određenim aspektima, predmetna objava obezbeđuje postupke za detekciju ciljnog molekula u uzorku. Postupak može da obuhvata dovođenje u kontakt uzorka sa anti-miostatin adnektinima opisanim ovde, pri čemu se pomenuti kontakt izvodi pod uslovima koji omogućavaju formiranje anti-miostatin adnektin-ciljnih kompleksa; i detektovanje pomenutog kompleksa, čime se detektuje pomenuta meta u pomenutom uzorku. Detekcija se može izvesti korišćenjem bilo koje tehnike priznate u oblasti, kao što je, npr., radiografija, imunološki test, fluorescentna detekcija, masena spektroskopija, ili površinska plazmonska rezonanca. Uzorak može biti od čoveka ili drugog sisara. Anti-miostatin adnektini mogu biti obeleženi obeležavajućim segmentom, kao što je radioaktivni segment, fluorescentni segment, hromogeni segment, hemiluminiscentni segment, ili hapten segment. Anti-miostatin adnektini mogu biti imobilisani na čvrstoj podlozi.
XII. Kompleti i proizvodni predmeti
[0268] Anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska se može obezbediti u kompletu, upakovanoj kombinaciji reagenasa u unapred određenim količinama sa uputstvima za upotrebu u terapijskim ili dijagnostičkim postupcima predmetnog pronalaska.
[0269] Na primer, u jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, obezbeđen je proizvodni predmet koji sadrži materijale korisne za lečenje ili prevenciju poremećaja ili stanja opisanih iznad. Proizvodni predmet sadrži kontejner i oznaku. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve i test epruvete. Kontejneri mogu biti formirani od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner nosi kompoziciju predmetnog pronalaska koja je efikasna za prevenciju ili lečenje poremećaja ili stanja i mogu imati sterilni pristupni otvor (na primer kontejner može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji može da se probije iglom za hipodermičku injekciju). Aktivni agens u kompoziciji je anti-miostatin adnektin predmetnog pronalaska. Oznaka na, ili povezana sa, kontejnerom ukazuje na to da se kompozicija koristi za lečenje stanja po izboru. Proizvodni predmet može dalje da sadrži drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Dalje može uključivati druge materijale poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve, i umetke za pakovanja sa uputstvima za upotrebu.
PRIMERI
[0270] Predmetni pronalazak je sada opisan pozivanjem na sledeće primere.
Primer 1 – Dobijanje proteina
Proizvodnja proteina visoke propusnosti (HTPP- High Throughput Protein Production)
[0271] Odabrana veziva klonirana u PET9d vektor ushodno od oznake HIS6i transformisana u ćelije E.coli BL21 DE3 plisS su inokulisana u 5 ml LB medijuma koji sadrži 50 µg/mL kanamicina u formatu sa 24 bunarića i uzgajana na 37°C preko noći. Sveže kulture LB medijuma od 5 ml (50 µg/mL kanamicin) pripremljene su za inducibilnu ekspresiju aspiracijom 200 µl iz kulture preko noći i sipanjem u odgovarajući bunarić. Kulture su uzgajane na 37°C do A6000.60.9. Posle indukcije sa 1 mM izopropil-β-tiogalaktozidom (IPTG), kultura je eksprimirana 6 sati na 30°C i sakupljena centrifugiranjem 10 minuta pri 2750 g na 4°C.
[0272] Ćelijski pelet (u formatu sa 24-bunarića) je liziran resuspendovanjem u 450µl pufera za lizu (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x Complete<™>koktel inhibitora proteaze bez EDTA (Roche), 1 mM PMSF, 10 mM CHAPS, 40 mM imidazol, 1 mg/ml lizozim, 30 µg/ml DNK-aze, 2 µg/ml aprotonina, pH 8.0) i mućkan na sobnoj temperaturi 1-3 sata. Lizati su očišćeni i ponovo prebačeni u format sa 96-bunarića prenošenjem u Whatman GF/D Unifilter sa 96-bunarića opremljen pločom za hvatanje od 96-bunarića od 1.2 ml i filtrirani pozitivnim pritiskom. Očišćeni lizati su prebačeni u ploču sa niklom ili kobaltom za heliranje sa 96-bunarića koja je bila ekvilibrisana puferom za ravnotežu (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8.0) i inkubirani 5 min. Nevezani material je uklonjen pozitivnim pritiskom. Smola je isprana dva puta sa 0.3 ml/bunariću sa puferom za ispiranje #1 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 5 mM CHAPS, 40 mM imidazol, pH 8.0). Svako ispiranje je uklonjeno pozitivnim pritiskom. Pre eluiranja, svaki bunarić je ispran sa 50 µl pufera za eluiranje (PBS 20 mM EDTA), inkubiran 5 min, a ovo ispiranje je odstranjeno pozitivnim pritiskom. Protein je eluiran nanošenjem dodatnih 100 µl pufera za eluiranje u svaki bunarić. Posle 30 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, ploča(e) su centrifugirane 5 minuta na 200 g i eluirani protein je sakupljen u pločama za hvatanje sa 96-bunarića koje sadrže 5µl 0.5 M MgCl2dodatog na dno ploče za hvatanje eluata pre eluiranja. Eluirani protein je kvantifikovan korišćenjem testa ukupnog proteina sa domenom divljeg tipa<10>Fn3 kao standardom proteina.
Eksprimiranje i prečišćavanje nerastvorljivih veziva proteina skele na bazi fibronektina
[0273] Za ekspresiju, odabrani klon(ovi), praćeni oznakom HIS6, klonirani su u pET9d vektor i eksprimirani u E.coli BL21 DE3 plisS ćelijama. Dvadeset ml kulture inokuluma (generisane iz jedne kolonije na ploči) je korišćeno za inokulaciju 1 litra LB medijuma ili TB-medijuma za ekspresiju preko noći (auto indukciju) koji sadrži 50 µg/ml Kanamicina i 34 µg/ml hloramfenikola. Kulture u LB medijumu su inkubirane na 37°C do A6000.6-1.0 nakon čega su indukovane sa 1 mM izopropil-β-tiogalaktozidom (IPTG) i uzgajane tokom 4 sata na 30°C. Kulture uzgajane u TB-medijumu za ekspresiju preko noći su inkubirane na 37°C 5 sati, nakon čega je temperatura spuštena na 18°C i gajene su 19 sati. Kulture su sakupljene centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥10,000 g na 4°C. Ćelijski pelet je zamrznut na -80°C. Nakon odmrzavanja, ćelijski pelet je resuspendovan u 25 ml pufera za lizu (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x Complete<™>koktel inhibitora proteaze bez EDTA (Roche), pH 7.4) koristeći Ultra-turrax homogenizator (IKA radi) na ledu. Liza ćelija je postignuta homogenizacijom pod visokim pritiskom (≥18,000 psi) korišćenjem mikrofluidizatora modela M-1105 (Microfluidics). Nerastvorna frakcija je odvojena centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥23,300 g na 4°C. Nerastvorni pelet dobijen centrifugiranjem lizata je ispran s 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl, pH7.4. Pelet je ponovo rastvoren u 6 M guanidin hidrohlorida u 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl pH 7.4 uz pomoć ultrazvuka, nakon čega je usledila inkubacija na 37 stepeni tokom 1-2 sata. Resolubilizovani pelet je filtriran pomoću filtera od 0.45 µm i nanet na Histrap kolonu ekvilibrisanu sa 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl/6 M guanidin pH7.4 pufera. Nakon punjenja, kolona je isprana sa dodatnih 25 zapremina kolone sa istim puferom. Vezani protein je eluiran sa 50 mM imidazola u 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl/6 M guanidin-HCl, pH 7.4. Prečišćeni protein je ponovo uvijen dijalizom nasuprot 50 mM natrijum acetata/150 mM NaCl, pH 4.5 ili PBS, pH 7.2.
Ekspresija i prečišćavanje rastvorljivih veziva proteina skele na bazi fibronektina
[0274] Kao alternativa prečišćavanju nerastvorljivih veziva, takođe se može koristiti prečišćavanje rastvorljivih veziva. Za ekspresiju, odabran klon(ovi), praćeni oznakom HIS6, su klonirani u pET9d vektor i eksprimirani u E.coli BL21 DE3 plisS ćelijama. Dvadeset ml kulture inokuluma (generisane iz jedne kolonije na ploči) su korišćeni za inokulaciju 1 litra LB medijuma ili TB-medijuma za ekspresiju preko noći (auto indukcija) koji sadrži 50 µg/ml Kanamicina i 34 µg/ml hloramfenikola. Kulture u LB medijum su inkubirane na 37°C do A6000.6-1.0, nakon čega je usledila inkubacija sa 1 mM izopropil-β-tiogalaktozidom (IPTG) i uzgajane su 4 sata na 30°C. Kulture uzgajane u TB-medijumu za ekspresiju preko noći su inkubirane na 37°C tokom 5 sati, nakon čega je temperature spuštena na 18°C, i uzgajane su 19 sati. Kulture su sakupljene centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥10,000 g na 4°C. Ćelijski pelet je zamrznut na -80°C. Odmrznuti ćelijski pelet je resuspendovan u 25 ml pufera za lizu (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, Complete<™>koktel inhibitora proteaze bez EDTA (Roche), pH 7.4) korišćenjem Ultra-turrax homogenizatora (IKA radi) na ledu. Liza ćelija je postignuta homogenizacijom pod visokim pritiskom (≥18,000 psi) korišćenjem mikrofluidizatora modela M-110S (Microfluidics). Rastvorljiva frakcija je odvojena centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥ 23,300 g na 4°C.
Supernatant je izbistren korišćenjem filtera od 0.45 µm. Prečišćen lizat se nanosi na Histrap kolonu (GE) prethodno ekvilibrisanu sa 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl, pH 7.4. Kolona je zatim isprana sa 25 zapremina kolone istog pufera, zatim 20 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl/25 mM imidazola, pH 7.4 i zatim 35 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl/40 mM imidazola, pH 7.4. Protein je eluiran sa 15 zapremina kolone 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl/500 mM imidazola, pH 7.4, frakcije su sakupljene na osnovu apsorbance na A280, i dijalizovane naspram 1x PBS ili 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.5 ili 50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH4.5. Precipitati su uklonjeni filtriranjem pomoću filtera od 0.22 µm.
PEGilacija adnektina sa polietilen glikolom (PEG) specifična za mesto
[0275] Adnektini koji sadrže konstruisani cisteinski ostatak su konjugivani PEG-om ili reagensom za blokiranje cisteina putem adicione hemije po Majklu, između tiol grupe na cisteinu i maleimidne funkcionalne grupe PEG ili n-etilmaleimida (NEM). Za PEGilaciju sa 2-razgranatim PEG-om od 40kDa (NOF Corporation, PIN GL2-400MA), PEG je dodat u molarnom višku u rastvor proteina pod blago kiselim do neutralnim uslovima. Reakcija je ostavljena da se odvija na sobnoj temperaturi 2 sata do preko noći. Reakcija je zatim naneta na jonoizmenjivačku kolonu da se odvoji PEGilovani adnektin od neizreagovanog PEG-maleimida i ne-PEGilovanog adnektina. Za PEGilaciju sa 4-razgranatim PEG-om od 40kDa (NOF, PIN GL4-400MA) ili 20kDa bis-PEG (NOF corporation, PIN DE-200MA), adnektin je prečišćen iz SP FF u citratnom puferu, pH 6.5. Nakon redukcije sa DTT, uzorak je odsoljen na G25 koloni u istom puferu da bi se uklonio DTT i reagovao sa 20kDa bis-PEG ili 4-razgranatim 40K PEG u odnosu 2:1 (PEG:adnektin) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, a reakcija je zaustavljena dodatkom viška BME. Uzorak je prečišćen pomoću kolone Resource 15S (GE #17-0944-10) da bi se selektovano uklonile ne-PEGilovane vrste (i mono-PEGilovane vrste u slučaju reakcije bis-PEG od 20kDa). Konačna preparativna SEC kolona (GE #17-1071-01, Superdex200, 26/60) je korišćena (ako je potrebno) za uklanjanje visokomolekularnih vrsta i nereaktivnog adnektina. Da bi se pripremio CYS-blokirani adnektin, dodat je 10-truki molarni višak NEM-a (Pierce Chemical) odmah nakon gore pomenutog koraka odsoljavanja G25 u citratnom (pH 6.5) puferu. Ovo je inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi i reakcija je zaustavljena dodavanjem BME u višku. Uzorak je zatim ekstenzivno dijalizovan nasuprot PBS-a. Prečišćeni konjugovani adnektini su analizirani pomoću SDS-PAGE i hromatografije sa isključenjem po veličini.
Prečišćavanje i PEGilacija neoznačenih veziva proteina skele na bazi fibronektina
[0276] Odabrana veziva su klonirana u pET9d vektor bez oznake HIS6i eksprimirana u E.coli BL21 DE3 plisS ćelijama.25 ml kulture inokuluma prethodno izolovane iz jedne kolonije na ploči uzgajano je u balonu od 125 ml dok OD 600 nm nije dostigao 1-2, koristeći medijum pH 6.85 50ug/ml kanamicina (amonijum hlorid, limunska kiselina, gvožđe amonijum citrat, magnezijum sulfat, monobazni natrijum fosfat monohidrat, anhidrovana dekstroza, glicerol, fiton pepton, granulirani ekstrakt kvasca, kanamicin sulfat, amonijum sulfat za podešavanje pH vrednosti). Fermentor od 10 L (7.5 L početna zapremina šaržnog medijuma) je inokulisan na konačnih OD 600 nm od 0.003. Kultura je uzgajana preko noći na 25°C uz konstantno mešanje na 650 opm i nivoima rastvorenog O2od >30%, uz održavanje pH vrednosti. Sledećeg dana, temperatura je pomerena na 37°C i kultura je uzgajana dok OD 600 nm nije dostigao 20-25. Kada se postigne ciljni OD, temperatura je pomerena na 30°C i kultura je indukovana sa IPTG (konačna koncentracija: 1 mM). Medijum za napajanje (glicerol, fiton pepton, granulirani ekstrakt kvasca, kanamicin sulfat i fosforna kiselina za podešavanje pH vrednosti) je dodat brzinom od 40 ml medijuma/L zapremine formiranja/sat. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 10,000g tokom 30min na 4°C. Ćelijski pelet je zamrznut na -80°C.
[0277] Ćelijska pasta je odmrznuta u 1x PBS u odnosu od 10 ml pufera/g ćelijske paste. Nakon odmrzavanja, uzorak je razbijen UltraTurrax homogenizatorom (IKA radi) do homogenosti. Rastvor je zatim propušten dva puta kroz mikrofluidizator na 18,000 psi. Rastvorljiva frakcija je odvojena centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥ 10,000g na 4°C. Supernatant je razblažen 1:1 sa natrijum acetatom (pH 4.5), i pročišćen pomoću filtera od 0.2 µm. Prečišćeni lizat je nanet na SP FF kolonu (SP1; GE) prethodno ekvilibrisanu sa 50 mM natrijum acetata (pH 4.5). Kolona je zatim isprana sa 2 zapremine kolone istog pufera, a zatim sa 8 zapremina kolone 50 mM natrijum acetata/350 mM NaCl, pH 4.5. Protein je eluiran sa 50 mM natrijum acetata/700 mM NaCl, pH 4.5. Eluati su objedinjeni na osnovu apsorbance na A280.
[0278] SP1 eluat je razblažen 1:5 sa 20 mM natrijum fosfata (pH 6.7) i nanet na SP FF kolonu (SP2) prethodno ekvilibrisanu sa 20 mM natrijum fosfata/100 mM NaCl, pH 6.7. Kolona je zatim isprana sa 2 zapremine kolone istog pufera. Protein je eluiran sa kolone sa 20 mM natrijum fosfata/0.5 M NaCl, pH 6.7. Eluati su objedinjeni na osnovu apsorbance na A280.
[0279] SP2 eluat je razblažen do 100 mM NaCl sa 20 mM natrijum fosfata (pH 6.7) i nanet na Q FF kolonu (GE) prethodno ekvilibrisanu sa 20 mM natrijum fosfata/100 mM NaCl, pH 6.7. Sakupljen je FT pik (koji sadrži proizvod). Kolona je isprana puferom za ekvilibraciju dok se FT pik nije vratio na baznu liniju.
[0280] Adnektini koji sadrže konstruisani cisteinski ostatak su konjugivani sa PEG preko adicione hemije po Majklu između tiolne grupe na cisteinu i maleimidne funkcionalne grupe PEG reagensa. Q FT frakcija je PEGilovana sa 40kDa razgranatim PEG-om u molarnom odnosu 2:1 PEG prema proteinu. Uzorak je inkubiran preko noći na sobnoj temperaturi. Reakcija PEGilacije je razblažena sa 2 dela 50 mM natrijum acetata (pH 4.5) i naneta na SP FF kolonu (GE) prethodno ekvilibrisanu sa 50 mM natrijum acetatom (pH 4.5). Kolona je isprana sa 2 zapremine kolone istog pufera. PEGilovani protein je eluiran sa kolone sa 50 mM natrijum acetata/200 mM NaCl, pH 4.5). Eluati su objedinjeni na osnovu apsorbance na A280. PEGilovani protein je koncentrovan korišćenjem 30kDa Millipore Biomax membrane. Uzorak je filtriran preko filtera od 0.22 µm i čuvan na, npr, 4°C, -20°C ili -80°C.
Prolazna ekspresija i prečišćavanje Fc-formatiranih veziva proteina skele na bazi fibronektina
[0281] Za generisanje DNK, odabrani kandidati su klonirani u pDV-16 plazmid iz kojeg su transformisane ćelije E. coli Top10. pDV-16 je modifikovana verzija pTT5 (Yves Durocher, NRC Kanada), gde je uvedena sekvenca kodiranja humanog IgG1-Fc, kojoj prethodi signalna sekvenca, a restrikciona mesta su uključena kako bi se omogućilo umetanje sekvenci kodiranja adnektina na bilo koji kraj Fc. Transformisane ćelije su proširene inokulacijom 1 L bujona Luria koji sadrži 100 µg/ml ampicilina i inkubacijom u rotirajućem inkubatoru na 225 opm tokom 18 sati na 37°C. Bakterijski pelet je sakupljen centrifugiranjem na >10000g tokom 30 minuta na 4°C. Prečišćena plazmidna DNK je izolovana korišćenjem QIAGEN Plazmid Plus Mega Kompleta (QIAGEN) kao što je opisano u u protokolu proizvođača. Prečišćena DNK je kvantifikovana korišćenjem apsorbance na 260nm i zamrznuta na -80°C pre upotrebe.
[0282] HEK 293-EBNA1 (klon 6E) (Yves Durocher, NRC Kanada) ćelije su proširene na 2×10<6>ćelija/ml u 2 L medijuma F17 u vrećici od 10 L GE Healthcare Wave na 37°C, 5% CO2, i pomešane ljuljanjem pod uglom od 8 stepeni pri 18 opm.
[0283] DNK je pripremljena za transfekciju na sledeći način: F17 medijum je zagrejan na 37°C. DNK i PEI transfekcioni reagens su odmrznuti u sterilnoj biološkoj haubi. DNK (2.25 mg) je dodata u 100 ml zagrejanog F17 medijuma u sterilnoj posudi za kulturu od polipropilena i lagano vrtložno mešana. U posebnoj posudi, 6.75 mg PEI (1 mg/ml) je kombinovano sa 100 ml prethodno zagrejanog F17 medijuma i lagano vrtložno mešano. Posude su ostavljene da miruju tokom 5 minuta pre kombinovanja sadržaja dodavanjem PEI rastvora u posudu koja sadrži DNK i lagano vrtložno mešane.
[0284] Sadržj posude koja sadrži DNK: smeša PEI je dodata u vrećicu za talasanje koja sadrži ćelije HEK 293-6E nakon inkubiranja na sobnoj temperaturi tokom15 minuta u biološkoj haubi. Kesica koja sadrži transfektovane HEK 293-6E ćelije je inkubirana dvadeset četiri sata na 37°C, 5% CO2, i mešana ljuljanjem pod uglom od 8 stepeni na 18 OPM. Posle 24 sata, 100 ml sterilno filtriranog 20% Tripton N1 (Organotechnie, Kanada) rastvorenog u medijumu F17 je aseptički dodato kulturi. Ćelije i medijum su sakupljeni nakon dodatna 72 sata inkubiranja kao što je gore opisano. Alternativno, prolazna ekspresija HEK u posudama za mućkanje (0.5 L medijuma u posudi od 2 L) se može izvesti sa DNK:PEI u odnosu od 1:2. Ćelije su odvojene od kondicioniranog medijuma centrifugiranjem na 6000g tokom 30 minuta na 4°C. Kondicioniran medijum je zadržan, filtriran pomoću filtera od 0.2 µM i čuvan na 4°C.
[0285] Kondicionirani medijum je nanet na kolonu za hromatografiju od 10 ml koja sadrži GE MabSelect Sure smolu prethodno ekvilibrisanu u PBS brzinom od 5 ml/minuti. Posle nanošenja filtriranog kondicioniranog medijuma, kolona je isprana sa najmanje 100 ml PBS na sobnoj temperaturi. Prečišćeni proizvod je eluiran sa kolone primenom 100 mM Glicin/100 mM NaCl, pH 3.0. Frakcije su neutralisane u pH ili sakupljanjem u epruvetama koje sadrže 1/6 zapremine 1M Tris pH 8, ili spajanjem prema apsorbanci na A280 praćeno dodavanjem 1M Tris pH 8 do 100 mM. Ako je sadržaj vrsta visokih molekularnih masa veći od 5% nakon eluiranja Proteina A, onda se uzorak dalje prečišćava pomoću Superdeks 200 (26/60) kolone (GE Healthcare) u PBS. SEC frakcije koje sadrže monomere su spojene i koncentrovane. Dobijeni protein A ili SEC grupa je iscrpno dijalizovana nasuprot PBS na 4°C i sterilno filtrirana korišćenjem graničnog filtera (eng. cutoff filter) 0.22 µm pre zamrzavanja na -80°C.
Proizvodnja na veliko: eksprimiranje kod sisara i primarno dobijanje: UCOE CHO sistem
[0286] Banka istraživačkih ćelija sisara (RCB- Research Cell Bank) je stvorena transfekcijom antimiostatin adnektin-Fc fuzija kloniranih u pUCOE vektoru koji sadrži Sveprisutni element otvaranja hromatina (UCOE - Ubiquitous Chromatin Opening Element) [Modifikovani UCOE vektor od Milipora] u CHO-S ćelijama. RCB je uspostavljen širenjem ćelija u medijumu za selekciju (0.04% (v/v) L-Glutamina (Invitrogen) i 0.01% (v/v) HT dodatka (Invitrogen) u CD CHO medijumu (Invitrogen)) koji sadrži 12.5 µg/mL puromicina. Ćelije sa malim brojem pasaža su aseptički izolovane centrifugiranjem, resuspendovane u medijumu za pohranjivanje (0.04% (v/v) L-Glutamin (Invitrogen), 0.01% (v/v) HT dodatak (Invitrogen) i 7.5% (v/v) DMSO u CD CHO medijumu (Invitrogen)) do konačne koncentracije od 1 × 10<7>ćelije/mL. Ove ćelije su prvobitno zamrznute u kupatilu od 70% izopropil alkohola na -80°C preko noći a zatim prebačene u tečni azot za dugotrajno skladištenje sledećeg dana.
[0287] Ćelijska kultura je započeta odmrzavanjem jedne RCB bočice u 25 mL medijuma za selekciju koji sadrži 12.5 µg/mL puromicina i širenjem kulture u istom medijumu. Ćelije su ostavljene da postignu koncentraciju između 1-2 × 10<6>ćelija/mL pre nego što su ponovo podeljene na 0.2 × 10<6>ćelija/mL. Ćelije su generalno održavane između 2-4 nedelje pre zasejavanja u bioreaktor. Ekspanziona kultura je pasažirana poslednji put i ostavljena da raste do tačke gde bioreaktor od 15 L koji sadrži 8 L produkcionog medijuma (Invitrogen CD CHO medijum koji sadrži 0.01% (v/v) HT dodatak (Invitrogen), 0.04% (v/v) Glutamaks (Gibco), i 0.005% (v/v) Pluronic F-68 (Gibco)) može biti zasejan pri konačnoj gustini od 0.2 × 10<6>ćelija/mL. Kultura bioreaktora je svakodnevno praćena na VCD (Viable Cell Density-gustina vijabilnih ćelija), procenat vijabilnosti, pH i koncentraciju glukoze. Kultura bioreaktora je hranjena 3. i 6. dana sa dodatkom 10% bolusa od ukupnog volumena medijuma za ishranu. Kultura je sakupljena 7. i 9. dana sa procentom vijabilnosti >70%. Tokom kultivacije, bioreaktorska kultura je kontrolisana na pH od 7.1, temperaturi od 37°C, %DO2 od 40%, i konstantnom broju obrtaja OPM od 100.
[0288] Na dan sakupljanja, bioreaktorske kulture su direktno pasažirane kroz filter dubine 6.0/3.0 µm nakon čega je sledila sterilna filtracija od 0.8/0.2 µm u sterilnoj vreći. Prečišćena sterilna kultura je čuvana preko noći na 2-8°C. Prečišćena sterilna kultura je zatim koncentrovana preko ravnog lista TFF korišćenjem membrane od 30,000 kDa. Približna koncentracija je bila 6x, u zavisnosti od titra koji se sakuplja. Koncentrovan supernatant je zatim sterilno filtriran u PETG boce i direktno obrađen ili čuvan na -80°C.
Prečišćavanje anti-miostatin-adnektin-Fc fuzije
[0289] Sakupljeni supernatant kulture (čist ili koncentrovan) se nanosi na kolonu MabSelect Protein A koja je prethodno ekvilibrisana PBS-om. Kolona je isprana sa 5CV 50mM Tris pH8.0, 1M Uree, 10% PG-a. Adnektin-Fc fuzija se eluira sa 100 mM Glicina pH 3.3, sakupljajući pik u kontejner koji je prethodno napunjen sa 1CV 200 mM natrijum acetata pH 4.5. Maksimalno eluiranje se zasniva na apsorbanci na A280.
[0290] Eluat Proteina A je razblažen do pH 3.0 uz dodatak 2 M limunske kiseline i ostavljen na sobnoj temperaturi 1 sat, radi inaktivacije virusa. Uzorak se zatim razblaži sa 200 mM trobaznog natrijum fosfata dok se ne postigne pH 4.5. Ako je potrebno, rastvor se dalje razblaži vodom da bi se provodljivost smanjila ispod 10ms/cm.
[0291] Eluat razblaženog Proteina A se pasažira preko Tosoh Q 600C AR (Tosoh Bioscience), prethodno kondicioniranog sa 50mM natrijum acetata pH 4.5, u režimu negativnog hvatanja. Pik protoka se prikuplja na osnovu apsorbance na A280. Kolona je isprana sa 50mM natrijum acetata i očišćena sa 0.2N NaOH.
[0292] Protok Q 600C AR je formulisan korišćenjem filtracije tangencionog protoka upotrebom 30K NMWCO membrane od šupljih vlakana (GE), uz veoma nežno mešanje retentata. Adnektin-Fc fuzija je dijafiltrirana u 25mM natrijum fosfata 150mM trehaloze pH 7.0 za 6 dijavolumena, a zatim koncentrovana do ciljne koncentracije proteina.
Primer 2 – Biofizička procena anti-miostatin proteina
[0293] Hromatografija sa razdvajanjem po veličini: Izvršena je standardna hromatografija sa razdvajanjem po veličini (SEC-size exclusion chromatography) na kandidatima adnektinima koji su rezultat procesa srednje skale. SEC materijal srednje skale izveden je korišćenjem Superdex 200 10/30 ili na Superdex 7510/30 (GE Healthcare) koloni na Agilent 1100 ili 1200 HPLC sistemu sa UV detekcijom na A214 nm i A280 nm i sa detekcijom fluorescencije (pobuda 280 nm, emisija 350 nm). Pufer od 100 mM natrijum sulfata/100 mM natrijum fosfata/150 mM natrijum hlorida, pH 6.8 je korišćen pri odgovarajućoj brzini protoka za korišćenu SEC kolonu. Za kalibraciju molekulske mase korišćeni su standardi za gel filtraciju (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Rezultati SEC-a na prečišćenim adnektinima srednje skale pokazali su pretežno monomerni adnektin i eluciju u približnom opsegu od 10 kDa naspram standarda globularne gel filtracije (BioRad) kao što je prikazano u Tabelama 9 i 10.
[0294] Termostabilnost: Analiza HTPP adnektina pomoću termičke skenirajuće fluorescencije (TSF) je izvršena da bi se pregledali prema relativnoj termičkoj stabilnosti. Uzorci su normalizovani na 0.2 mg/ml u PBS-u.1 µl Sipro narandžaste boje razblažene 1:40 sa PBS-om je dodat u 25 µl svakog uzorka i ploča sa 96 bunarića je zapečaćena prozirnim lepkom za mikroploče. Uzorci su skenirani korišćenjem BioRad RT-PCR mašine povećanjem temperature od 25°C-95°C, brzinom od 2 stepena po minuti. Podaci su analizirani korišćenjem BioRad CFX menadžer 2.0 softvera. Pokazalo se da Th vrednosti dobijene pomoću TSF-a dobro koreliraju sa vrednostima Tm dobijenim pomoću DSC-a u opsegu topljenja od 40°C do 70°C. Ovo se smatra prihvatljivim radnim opsegom za ovu tehniku. Rezultat ND ("No data" – nema podataka) se dobija kada je nagib prelazne krive suviše mali da bi omogućio da se njen pik derivata (brzina promene fluorescencije tokom vremena) razlikuje od šuma. "ND" rezultat se ne može tumačiti kao indikacija termostabilnosti. Analize diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) dijalizovanih HTPP i adnektina srednje skale su izvedene da bi se odredile njihove odgovarajuće Tm. Rastvor od 0.5 mg/ml je skeniran u VP-kapilarnom diferencijalnom skenirajućem kalorimetru (GE Microcal) povećanjem temperature sa 15 °C na 110°C, brzinom od 1 stepen u minuti pod pritiskom od 70 p.s.i. Podaci su analizirani u poređenju sa kontrolnom serijom odgovarajućeg pufera korišćenjem najboljeg uklapanja upotrebom Origin Softvera (OriginLab Corp). Rezultati TSF i DSC analiza sumirani su u Tabelama 8-10. Kao što je prikazano u Tabelama 8-10, mnogi od klonova su ispoljili temperature odvijanja od preko 60°C, što ukazuje na visoko biofizički stabilnu strukturu pogodnu za medicinske formulacije. Adnektini su generalno bili tolerantni na PEGilaciju ili Fc-formatiranje bez vidljivog gubitka stabilnosti. U nekim slučajevima, ovi formati su pružili poboljšanu stabilnost. Na primer, 3116_A07 kao nemodifikovani Adnektin ima Tm prema TSF od 60°C, ali kada je PEGilovan (ATI-1377) Tm prema DSC je bio 68°C, a u Fc-X format (PRD-1286) Tm prema DSC je bio 66°C.
Primer 3 – Test Luciferaze zasnovan na ćelijama
[0295] Reporterski plazmid luciferaze, Activin-Responsive Element (ARE)-luc, generisan je spajanjem devet ponavljanja ARE u tandemu sa reporterom luciferase svica. Plazmid je prolazno transfektovan u HepG2 ćelije. Plazmid pGL4.74[hRluc/TK] je ko-transfektovan da bi se normalizovala efikasnost transfekcije. 10,000 ćelija je postavljeno po bunariću u ploči sa 96 bunarića. Kada se protein kao što je miostatin, aktivin, ili BMP-11, doda ćelijama i veže za njihov srodni receptor, pokreće se nishodna SMAD signalizacija, što dovodi do vezivanja fosforilisanog SMAD kompleksa za ARE. Količina, npr., miostatina, izložena ćelijama je direktno proporcionalna količini proizvedenog proteina luciferase i posledično, merenoj aktivnosti luciferase. Kada se antagonist miostatina (npr., anti-miostatin adnektin) doda ćelijama istovremeno sa miostatinom, aktivacija ARE se smanjuje, što dovodi do smanjene produkcije i aktivnosti luciferaze.
[0296] U ovom eksperimentu, (1) anti-miostatin adnektin i miostatin, (2) anti-miostatin adnektin i aktivin A, ili (3) anti-miostatin adnektin i BMP-11 su prethodno inkubirani pre dodadavanja ćelijama. Miostatin (R&D Systems) je korišćen na 10-500 pM, aktivin A (R&D Sistemi) na 10-500 pM, a BMP-11 (R&D Systems) na 10-500 pM. Posle inkubacije preko noći sa ovim različitim kombinacijama, ćelije su lizirane i aktivnost luciferaze (luminiscencija) je merena korišćenjem Dual-Glo Luciferaza Test Sistem<®>(EnVision). IC50 se definiše kao koncentracija Adnektina koja je potrebna da se postigne 50% inhibicije aktivnosti ARE-luciferaze izazvane miostatinom.
[0297] Kao što je prikazano u Tabelama 8-10, anti-miostatin adnektini su inhibirali povećanje aktivnosti reportera ARE-luc posredovano miostatinom.
Primer 4 –Test vezivanja HTRF
[0298] HTRF test je korišćen za merenje afiniteta vezivanja anti-miostatin adnektina za miostatin. Test je bio kompetitivni HTRF test koji koristi oznaku Eu-W1024 kao donor fluorofora i Alexa FluorO 647 kao akceptor fluorofora. Biotinilovani adnektin 1889E01 i Alexa Fluor<®>647 obeleženi rhActRIIb-Fc mogu istovremeno da vežu miostatin na dva različita mesta vezivanja. Eu-W1024 označen Streptavidin se koristi za vezivanje biotinilovanog 1889E01. Dva fluorofora, Eu-W1024 i Alexa FluorO 647, spajaju se formiranjem kompleksa 1889E01/miostatin/ActRIIb-Fc, a HTRF signal se može očitati na čitaču ploča EnVision (Perkin Elmer) koristeći HTRF protokol. U prisustvu kompetitivnog adnektina, HTRF signal se smanjuje. IC50 su predstavljene u Tabelama 8-10.
Tabela 8: Biofizička karakterizacija, rezultati ARE-luciferaza reporterskog testa, i testa vezivanja HTRF za anti-miostatin mono-adnektine.
Tabela 9: Biofizička karakterizacija, rezultati ARE-luciferaza reporterskog testa, i testa vezivanja HTRF za PEGilovane anti-miostatin adnektine.
Tabela 10: Biofizička karakterizacija, rezultati ARE-luciferaza reporterskog testa i testa vezivanja HTRF za Fc-fuzionisane anti-miostatin adnektine.
Primer 5- Anti-miostatin adnektinom posredovana inhibicija SMAD2 fosforilacije izazvane miostatinom
[0299] RH41 ćelije humanog rabdomiosarkoma (DSMZ, Braunschweig, Nemačka) korišćene su za analizu odgovora inhibicije u 12-, 2-, i 4-tačke kako je opisano u nastavku. Ćelije su uklonjene iz medijuma kulture i isprane da bi se uklonio serum i mirovale su u medijumu za ispitivanje koji sadrži BSA tokom 4 sata. Ćelije su odignute iz posude korišćenjem versena i prebačene u polipropilenske ploče sa 96 bunarića i V-dnom pri 5×10<5>ćelija/bunariću. Za odgovor inhibicije od 12-tačaka, ćelijama je dodato 100 pM rekombinantnog miostatina (R&D Systems), prethodno inkubiranog 1 sat sa 5-strukim opsegom koncentracija adnektina u razblaženju počevši od 1000 nM (tj., 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, 0.064 nM, 0.0128 nM, 0.00256 nM, 0.000512 nM, 0.000102 nM, .0000204 nM). Za odgovor inhibicije u 4-tačke, ćelijama je dodato 100 pM miostatina, prethodno inkubiranog 1 sat sa opsegom koncentracija adnektina (30 nM, 3 nM, 0.1 nM ili 0.001 nM). Za odgovor inhibicije u 2-tačke, ćelijama je dodato 100 pM miostatina, prethodno inkubiranog 1 sat sa opsegom koncentracija adnektina (10nM ili 0.5nM). Ćelije su tretirane smešom miostatin-adnektin tokom 1 sata na 37°C da bi se izazvala fosforilacija SMAD2 (pSmad2). Stimulacija je zaustavljena stavljanjem ćelija na led i dodavanjem ledeno hladnog PBS-a. Ćelije su peletirane i lizirane prema standardnim protokolima, a fosforilacija SMAD2 je detektovana korišćenjem ELISA testa (Cell Signaling Technologies). Inhibicija postignuta opsegom koncentracije adnektina je ucrtana korišćenjem GraphPad Prism Softvera i normalizovanih tačaka podataka za kontrole koje su dale 100% i 0% inhibicije. IC50 je definisana kao koncentracija adnektina potrebna da se postigne 50% inhibicije SMAD2 fosforilacije izazvane miostatinom. Podaci predstavljeni u Tabeli 11 pokazuju da su adnektini izvedeni iz optimizacije afiniteta roditeljskih klonova 1979_B06 i 2062_G02 i snažno i potpuno inhibirali fosforilaciju pSMAD indukovanu miostatinom i prikazali vrednosti IC50 u rasponu od 0.78 nM do 0.06 nM. Ovo predstavlja poboljšanje više od 16-75 puta vrednosti IC50 u odnosu na roditeljske klonove 1979_B06 (IC50 = 12.8 nM) i 2062_G02 (IC50 = 59.1 nM).
Tabela 11. Inhibicija fosforilacije SMAD2 (pSMAD2) anti-miostatin adnektinima
ID Mio IC50 (nM) 12- Mio IC50 (nM) 4- Mio % inhibicija pri 10 tačaka tačke nM
Test pSmad2
Primer 6 - SPR merenja afiniteta za anti-miostatin adnektine kinetika vezivanja adnektina koristeći SPR format A
[0300] Anti-humano Fc antitelo (Biacore/GE) je imobilisano na Biacore CM5 čipu preko NHS/EDC kuplovanja prema uputstvima proizvođača. ActRIIb-Fc (R&D Sistemi) je uhvaćen i na referentnim i na aktivnim protočnim ćelijama, nakon čega je usledilo hvatanje humanog miostatina (R&D Systems), humanog BMP-11 (GDF-11; R&D Sistemi) ili humanog Aktivina A (R&D Systems) na samo aktivne protočne ćelije (svaka rastvorena u skladu sa protokolom koji je predložio proizvođač i razblažena u HBSP radnom puferu). Opseg koncentracija anti-miostatin adnektina je primenjen na sve protočne ćelije u HBSP radnom puferu. Regeneracija površine čipa između ciklusa je postignuta sa dva impulsa od 30 sekundi 3M MgCl2. Kinetički tragovi referentno-oduzetih senzorgrama su prilagođeni modelu vezivanja 1:1 korišćenjem Biaevaluation softvera. Rezime Biacore kinetičkih podataka je prikazan u Tabeli 12.
[0301] Podaci prikazani u Tabela 12 ukazuju da optimizovani adnektini potomstva čvrsto vezuju miostatin, sa KDu opsegu od 0.06-1.47 nM, u poređenju sa roditeljskim adnektinima 1979_B06 i 2062_G02, koji su pokazali KDod 29 i 49 nM, redom.
[0302] Nakon PEGilacije, postoji određeni gubitak u afinitetu miostatina, sa KDu rasponu od 0.76 do 14.4 nM, iako nema efekta PEGilacije na potenciju u testu ARE-luciferaze (videti Tabele 8 i 9).
[0303] Selektivnost adnektina u odnosu na BMP-11 kreće se od potpuno neselektivne do čak 17-struke, dok je vezivanje za aktivin ili izuzetno slabo ili uopšte ne postoji, što sugeriše visoku selektivnost u odnosu na aktivin.
Kinetika vezivanja adnektina koristeći SPR format B (korisno za Fc-formatirane adnektine)
[0304] Humani miostatin (R&D Systems), humani BMP-11 (GDF-11; R&D Systems), ili humani aktivin A (R&D Systems) je rastvoren u skladu sa protokolom koji je predložio proizvođač i imobilizovan na Biacore CM5 čipu pri 1-10 µg/mL u acetatnom (pH 4.0 ili 4.5) puferu korišćenjem standardnog NHS/EDC kuplovanja. Opseg koncentracija anti-miostatin adnektina je primenjen u HBSP radnom puferu. Regeneracija površine čipa između ciklusa je postignuta sa 60 sekundi 10-50 mM NaOH. Kinetički tragovi referentno-oduzetih senzorgrama su prilagođeni modelu vezivanja 1:1 korišćenjem Biaevaluation softvera. Za Fc-formatirane adnektine, kinetike interakcije su vođene avidnošću bivalentnog Fc i dimernog miostatina čak i pri niskoj gustini imobilizacije. Rezime Biacore kinetičkih podataka je prikazan u Tabeli 12. Podaci prikazani u Tabeli 12 ukazuju na to da neki od adnektina koji rade u ovom SPR formatu vezuju miostatin i BMP-11, kao i aktivin sa sličnim afinitetima. Značajna selektivnost u odnosu na aktivin u testu ARE-luciferaze, međutim, sugeriše da afinitet za aktivin može biti veštački naglašen u ovom formatu SPR testa.
Primer 7- Afinitet faze rastvora za anti-miostatin adnektine
[0305] Afinitet rastvora PRD-1474, Fc-fuzionisanog anti-miostatin adnektina, za miostatin je meren korišćenjem testa kinetičkog isključenja (KinExA- Kinetic Exclusion Test). Četvorostruke titracije PRD-1474 su izvedene sa miostatinom u koncentraciji monomera od 2 nM (n=2), 1 nM (n=1) i 0.7 nM (n=1). Relativna koncentracija nevezanog miostatina je merena hvatanjem na ATI-1310 čvrstom matriksu (spojenom sa poliakrilamidnim kuglicama preko konstruisanog slobodnog Cisteina) praćeno detekcijom fluorescentno obeleženog konstrukta ko-receptora miostatina, ActRIIB-Ig koji može da veže miostatin istovremeno sa adnektinom. ATI-1310 je srodni adnektin koji se takmiči sa PRD-1474 u vezivanju za miostatin i omogućava hvatanje nevezanog miostatina. Globalna analiza Kd prikazana u Tabeli 13 daje Kd od 170 pM sa 95% pouzdanim intervalom od 330-60 pM. Afiniteti PRD-1177 i ATI-1338 su takođe mereni korišćenjem istog formata analize. Trostruke titracije PRD-1177 su izvedene sa miostatinom u koncentraciji monomera od 1 nM (n=2) i 0.8 nM (n=1). Trostruke titracije ATI-1338 su izvedene sa miostatinom u koncentraciji monomera od 5 nM (n=1), 1.6 nM (n=1) i 1.4 nM (n=1). Ove analize pokazuju da PRD-1177 vezuje miostatin sa globalnom vrednošću Kd od 250 pM i 95% pouzdanim intervalom od 340-130 pM (Tabela 13). ATI-1338 vezuje miostatin sa globalnom vrednošću Kd od 850 pM i 95% pouzdanim intervalom od 1400-330 pM.
Tabela 13. Merenje afiniteta faze rastvora KinExA za vezivanje miostatina.
Primer 8 - Mutaciona analiza 3116_A06
[0306] Da bi se razumela relativna tolerancija položaja petlje na mutaciju, sprovedene su dve slične, ali odvojene studije. Prvo je bilo tradicionalno alaninsko skeniranje, gde su vezivanje i efikasnost diskretnih mutacija alanina u petljama adnektina 3116_A06 (SEQ ID NO: 118) procenjene biohemijskim i ćelijskim testovima. Druga studija se sastojala od dubokog mutacionog skeniranja u kome smo kreirali biblioteku mutacija na jednom mestu na istim pozicijama 3116_A06 (SEQ ID 118), ali smo svaku poziciju zamenili sa 20 mogućih aminokiselina. Ove komponente biblioteke su zatim eksprimirane kao fuzije protein-iRNK i podvrgnute jednom krugu prikaza iRNK (kao što je opisano u Odeljku IV), razdvajajući komponente bublioteke sa biotinilovanim miostatinom od onih koje su ostale nevezane korišćenjem magnetnih perli streptavidina. U ovom pristupu, sekvenciranje sledeće generacije ulaznih i vezanih populacija omogućilo je određivanje relativnog obogaćivanja/trošenja svake sekvence, održavajući njen urođeni afinitet za miostatin.
[0307] Skeniranje alanina: PCR mutageneza usmerena na mesto je korišćena za stvaranje mutacija alanina na jednom mestu u 3116_A06 (SEQ ID NO: 118) u BC petlji (ostaci 25-33), DE petlja (ostaci 55-58) i FG petlji (ostaci 80-89). Klonovi su eksprimirani u E. coli i prečišćeni pomoću HTPP kao što je opisano u Primeru 1. Hromatografija sa isključenjem po veličini (SEC, kao što je opisano u Primeru 2) potvrdila je da su ovi protein supstituisani alaninom pretežno monomerni (Tabela 14). Sprovedeni su testovi ARE-luciferaze (Primer 3) i HTRF (Primer 4). U testu kompetitivnog vezivanja HTRF, potencije su se kretale od IC50 = 1.5 nM do >100 nM (Tabela 14). Većina pozicija je tolerisala supstituciju alanina u HTRF testu u određenom stepenu, sa izuzetkom Gly55, Arg56 i Gly57 DE petlje, za koje je vezivanje drastično smanjeno (IC50 >100 nM). Manji efekat se desio na poziciji Gly30 BC petlje, i Val80, Thr81 i Tyr88 FG petlje, koje su i dalje pokazale vezivanje ali sa >10-trukim povećanjem IC50 u odnosu na roditeljsku sekvencu ("WT"). U ćelijskom testu ARE-luciferaze, potencija mutanata se kretala od IC50 = 0.6 nM do >100 nM (Tabela 14). Uticaj mutacija alanina je generalno bio veći u testu zasnovanom na ćelijama u odnosu na HTRF test. Gly55, Arg56, i Gly57 DE petlje i Val80 i Tyr88 FG petlje su pokazale drastično smanjenu potenciju u testu, sa IC50 >100 nM. Umereniji efekat je primećen za BC pozicije Leu26, Pro27, His28, Gly30 i Asn33 i FG pozicije Thr81, Tyr85 i Leu86, koje su sve imale IC50 >10-puta veće od roditeljske sekvence.
Tabela 14: Biohemijska karakterizacija i ćelijske potencije za alaninske mutante 3116_A06
[0308] Duboko mutaciono skeniranje: Sekvenciranje visoke propusnosti je kombinovano sa prikazom proteina kako bi se omogućilo istovremeno merenje relativne sposobnosti svakog mogućeg mutanta na jednom mestu u petlji, na skali koja bi bila teška za tradicionalni pristup kao što je gore opisano (za pregled pristupa " Dubokog mutacionog skeniranja ", videti Araya i sarad., Trends in Biotechnology 29: 435-442, 2011; sličan pristup je dalje prikazan u Forsyth i sarad., mAbs 5: 523-532, 2013).
[0309] Konstrukcija i izbor biblioteke: Stvorene su tri odvojene biblioteke koje su sadržale svaku moguću mutaciju na jednom mestu u svakoj od tri petlje 3116_A06 (SEQ ID NO: 118): BC petlja (pozicije 25-33), DE petlja (pozicije 55-58) i FG petlja (pozicije 80-89). Za svaku petlju je dizajnirano više oligonukleotida koji su pojedinačno inkorporirali NNK kodon na svakoj poziciji, gde je N=A, C, G, T i K=G, T. Upotreba ovih degenerativnih kodona omogućava kodiranje svih 20 aminokiselina (plus stop kodon) na mestu gde je NNK ugrađen. Oligonukleotidi su sastavljeni putem PCR-a sa ekstenzijom preklapanja da bi se generisale biblioteke adnektina pune dužine, gde je Lib-BC sadržao svaku pojedinačnu aminokiselinsku mutaciju BC petlje 3116_A06, Lib-DE je sadržao svaku pojedinačnu aminokiselinsku mutaciju DE petlje 3116_A06 i Lib-FG je sadržao svaku pojedinačnu aminokiselinsu mutaciju FG petlje 3116_A06. Tri biblioteke su izražene kao fuzionisani molekul iRNK-proteina koristeći PROfuzije prema Xu i sarad., Chemistry & Biology 9: 933-942, 2002. Lib-BC, Lib-DE i Lib-FG PROfuzioni molekuli su odvojeno odabrani u odnosu na 3 nM biotinilovani miostatin, a vezujući molekuli su naknadno uhvaćeni na magnetnim perlama streptavidina. Veziva su eluirana iz kuglica korišćenjem 100 mM KOH. Molekuli eluirani iz kuglica predstavljaju varijante 3116_A06 koje se još uvek mogu vezati za miostatin, dok oni prisutni u početnoj biblioteci, ali koji nisu pronađeni u eluatu, predstavljaju varijante 3116_A06 koje se ne vezuju tako dobro za miostatin.
[0310] NGS barkodiranje i mešanje: Sakupljene su dve populacije, ulazna (pre vezivanja miostatina) i veziva (eluat iz perlica nakon selekcije), izvedene iz svake od tri biblioteke (Lib-BC, Lib-DE i Lib-FG) i pojedinačno pojačane. Svakoj populaciji je dodat 5'- TruSeq Universal Adaptor, 3'- Truseq Adaptor II, i jedinstveni 6-nukleotidni bar kod pomoću PCR-a. Ukupno šest barkodiranih populacija je zatim pojedinačno kvantifikovano i pomešano (Lib-BC: Lib-DE: Lib-FG = 9:4:10) na osnovu broja nasumičnih ostataka u svakoj petlji, kako bi se dobili slični brojevi sekvenci po statistički randomizovanoj poziciji. Objedinjeni uzorak je sekvenciran MiSeq 150bp uparenim krajevima (Illumina) sekvenciranjem sledeće generacije.
[0311] Analiza NGS podataka: Sekvence koje se čitaju unapred iz sekvenciranja sledeće generacije su grupisane prema populaciji, položaju mutacije i identitetu mutirane aminokiseline. Sve sekvence lošeg kvaliteta i one koje sadrže više mesta mutacije eliminisane su iz analize. Zatim, učestalost svake sekvence u populaciji nakon selekcije je podeljena sa njenom učestalošću u ulaznoj populaciji da bi se dobio koeficijent obogaćenja (ER- enrichment ratio). Poređenje ER-ova roditeljskih sekvenci (WT, koji funkcioniše kao pozitivna kontrola) i sekvence koje sadrže stop kodon (koje funkcionišu kao negativna kontrola, predstavljajući pozdinski šum slučajnog preživljavanja) pokazalo je da je odnos signala i pozadine (S/B - signal to background) varirao između tri petlje, verovatno zato što je svaka biblioteka petlje propuštena kroz individualnu selekciju. Iz tog razloga, svaka sekvenca je normalizovana na prosečne stop i prosečne wt ER vrednosti za sopstvenu specifičnu petlju, da bi se izveo ER<norm>.
[0312] Duboko mutaciono skeniranje je potvrđeno poređenjem relativne sposobnosti mutanata alanina na jednom mestu sa biohemijskim podacima iz tradicionalnog skeniranja alanina. Sve u svemu, korelacija je bila prilično jaka (Slika 8). NGS ER definišu profil obogaćivanja i iscrpljivanja mutanata alanina preko petlji koji dobro korelira sa uticajem primećenim u testovima HTRF i ARE-luciferaze.
[0313] Biohemijski HTRF IC50 je takođe ucrtan direktno u odnosu na NGS ER<norm>za svaki mutant alanina, kao što je prikazano na Slici 9.
[0314] Na osnovu alaninskih korelacija, ustanovljene su tri kategorije u koje se sve aminokiselinske mutacije na jednom mestu mogu vezati preko svojih NGS odnosa obogaćivanja: Najpoželjnije mutacije (ER<norm>> 0.8), poželjnije mutacije (ER<norm>> 0.5) i poželjne mutacije (ER<norm>> 3 standardne devijacije od prosečne petlje ERstop). Donje granice ER<norm>koje definišu poslednju kategoriju razlikovale su se za tri petlje: BC = 0.25; DE = 0.15; FG = 0.35. Svi mutanti na jednom mestu u petljama 3116_A06 su bili zaglavljenii prema njihovim normalizovanim odnosima obogaćivanja da bi se odredila relativna tolerancija svake pozicije na mutaciju (Tabela 15).
Tabela 15: Mutacije na jednom mestu u sekvencama petlje 3116_A06 koje održavaju vezivanje za miostatin
82 X63ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY ACDEFGHILMNPQSTVW Y ACDEFGHILMNQSTV Položaj Poželjne mutacije Poželjnije mutacije Najpoželjnije mutacije
83 X64ACDEFGHIKLMNPQRSTVWY ACDEFGHIKLMNQRSTV WY ACDFGILMNQSTVWY
[0315] Koristeći pune podatke dubokog mutacionog skeniranja, čini se da su pozicije BC petlje 25, 26, 27, 30, 32 i 33, pozicije DE petlje 55, 56 i 57 i pozicije FG petlje 80 i 88 najočuvanije, gde samo jedan ili nekoliko tipova aminokiselina na ovim pozicijama održavaju vezivanje za miostatin. S druge strane, drugi položaji su visoko tolerantni na mutaciju, uključujući položaje BC petlje 28, 29 i 31 i položaje FG petlje 82, 83 i 87.
Primer 9 – Procena farmakokinetika anti-miostatin adnektina
[0316] Da bi se istražio farmakokinetički profil Adnektina sa različitim PEGilovanim formatima, anti-miostatin adnektin 2987_H07 je formatiran sa 2-razgranatim 40 KD PEG (ATI-1338), 4-razgranatim 40 KD PEG (ATI-1339) i Bis 20 KD PEG (ATI-1341). Studije pojedinačne doze subkutanog administriranja sa ova tri PEGilovana Adnektina su sprovedene na C57BL6 miševima. Ukupne koncentracije leke su određene ELISA testom. Bioanalitički FK imunoesej za kvantifikaciju ATI-1338 koristio je standardni ELISA test u sendvič formatu, gde je 1338 uhvaćen sa monoklonskim antitelom na HIS-TAG protein, a zatim detektovan poliklonskim anti-PEG antitelom. Kao što je prikazano u Tabeli 16, dva 40 KD PEGilovana formata, ATI-1338 i ATI-1339, pružila su izraženije farmakokinetičko poboljšanje (tj., duži poluživot (t1/2) i veća doza – normalizovana izloženost) od Bis-20 KD PEGilovanog formata, ATI-1341.
Tabela 16. Farmakokinetičko poređenje tri PEGilovana formata za Adnektin 2987_H07
[0317] Studije pojedinačne doze nakon intravenskog i subkutanog administriranja Fc-fuzionisanih anti-miostatin adnektina (PRD-1177, PRD-1286 i PRD-1474) sprovedene su na miševima C57BL6 da bi se procenili efekti Fc-fuzije na farmakokinetičke parametre. Ukupne koncentracije leka su određene ELISA testovima. Bioanalitički FK imunoesej za kvantifikaciju Fc konjugata za PRD1177, 1474 i 1286 koristio je standardni ELISA test u sendvič formatu koristeći ECL tehnologiju, gde je 1177 uhvaćen poliklonskim antitelom na skelu adnektina, a zatim detektovan anti-humanim IgG antitelom. Kao što je prikazano u Tabeli 17, sva tri adnektina spojena sa Fc imala su duži poluživot (58 -172 h) od PEGilovanih adnektina ATI-1338 (25 h). Niža biodostupnost SC verovatno odražava proteolizu tokom intersticijalnog i limfnog tranzita biološkog molekula. SC biodostupnost adnektina spojenih sa Fc je u razumnom opsegu na osnovu objavljene literature (npr., Richter i sarad., AAPS J.2012;14:559-70).
Tabela 17. Farmakokinetičko poređenje tri Fc-fuzionisana anti-miostatin adnektina
Primer 10 - Mehanizam inhibicije anti-miostatin adnektina
[0318] Kompetitivna ELISA: Testovi kompetitivnog vezivanja za procenu sposobnosti antimiostatin adnektina da se takmiče sa vezivanjem ActRIIB receptora za miostatin su sprovedeni korišćenjem kompetitivne ELISA. Nunc Maxisorp ploče su obložene sa 2 µg/mL ActRIIb-Fc (R&D Systems) u 0.2M puferu natrijum karbonata pH 9.6 preko noći na 4°C. Posle ispiranja sa PBS-T (PBS koji sadrži 0.05% Tween-20), bunarići su blokirani sa OptEIA puferom (BD Biosciences) tokom 1 h na 25°C uz mućkanje. Miostatin (10 nM; R&D Systems) je prethodno inkubiran sa opsegom koncentracije adnektina ili ActRIIb-Fc konkurenta (0.2 pM to 1 µM) u OptEIA puferu tokom 1 h na 25°C uz mućkanje. Blokirana i obložena ploča za analizu je isprana sa PBS-T, a zatim su dodate smeše miostatin/konkurent i inkubirane tokom 30 min na 25°C uz mućkanje. Ploča za analizu je isprana sa PBS-T, nakon čega je vezani miostatin detektovan sa 1:1000 biotinilovanim kozjim anti-miostatinskim poliklonalnim (R&D Systems) razblaženim u OptEIA, tokom 1 h na 25°C uz mućkanje. Posle ispiranja sa PBS-T, dodat je 1:5000 Streptavidin-HRP (Thermo/Pierce) razblažen u OptEIA, nakon čega je usledila inkubacija tokom 30 min na 25°C uz mućkanje. Ploča za analizu je razvijena sa TMB (BD Biosciences), kvenčovana sa 2N sumpornom kiselinom, a apsorbanca je očitana na A450. Kao što je prikazano u Sl.10, ActRIIb-Fc u rastvoru u potpunosti blokira vezivanje miostatina za ActRIIb-Fc obložen na ploči, kao što se očekivalo. Nasuprot tome, međutim, PRD-1288 (razlikuje se od PRD-1474 samo po sekvenci veznika), PRD-1285 i PRD-1286 u koncentracijama do 1 µM ne blokiraju vezivanje miostatina za ActRIIb.
[0319] Kompeticija SPR: Testovi kompetitivnog vezivanja za procenu sposobnosti anti-miostatin adnektina da se takmiče sa receptorima Tipa I i Tipa II za vezivanje za miostatin ili BMP11, kao surogat za miostatin, takođe su sprovedeni korišćenjem SPR na Biacore T100 instrumentu, u dva različita eksperimentalna formata. U "SPR Formatu A", površine senzorskog čipa su pripremljene imobilizacijom 100 ug/ml proteina A (Pierce) u 10 mM acetatu pH 4.5 do 4500 RU na CM5 senzorskom čipu (Biacore/GE Healthcare) koristeći standardni etil(dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukcinimid (NHS) hemija, sa blokiranjem etanolamina. ALK4-Fc (R&D Systems), ALK5-Fc (R&D Systems), ActRIIB-Fc (proizveden u kući), antimiostatin/BMP11 monoklonsko antitelo (mAb-A) koje se takmiči za vezivanje za miostatin sa ActRIIB, ali se ne takmiči sa 3116A06 za vezivanje za mizotatin (proizveden u kući), ili AdnektinFc PRD-1474 u koncentracijama od 7-13 µg/ml su uhvaćeni preko Fc repa do površinske gustine od 1600 - 4300 RU upotrebom 60 s injekcija pri 10 µl/min. Eksperimenti kompeticije su izvedeni protokom 100 nM miostatina (R&D Sistemi) ili BMP11 (R&D Systems) preko ovih površina u prisustvu ili odsustvu 200 nM adnektin ATI-1523 pri brzini protoka od 30 µl/min sa 180 s vremena asocijacije i disocijacije. Radni pufer za imobilizaciju i eksperimente takmičenja bio je 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, i 0.05% v/v surfaktant P20, pH 7.4, a površine su regenerisane između ciklusa korišćenjem dve injekcije od 10 mM glicina pH 1.5 za 30 s pri 30 µl/min.
[0320] U SPR Formatu A, BMP11 se specifično vezuje za ALK4-Fc, ALK5-Fc, ActRIIB-Fc, mAb-A i PRD-1474 površine, dok se miostatin vezuje specifično za ActRIIB-Fc, mAb-A i PRD-1474, ali ne i za ALK4-Fc ili ALK5-Fc. Da bi se procenio efekat ATI-1523 na vezivanje miostatina ili BMP11, odgovori vezivanja za svaki protein na kraju faze asocijacije od 180 s su normalizovani na 100%, i upoređeni sa odgovorima vezivanja za miostatin ili BMP11 u prisustvu ATI-1523 (Tabela 18). ATI-1523 je potpuno blokirao vezivanje miostatina ili BMP11 za kontrolnu PRD-1474 površinu, kao što se očekivalo. U testovima procene sposobnosti ATI-1523 da blokira interakciju miostatina sa ALK4-Fc ili ALK5-Fc, BMP-11, koji se takođe vezuje za ALK4-Fc i ALK5-Fc, je korišćen kao surogat za miostatin, pošto se sam miostatin ne vezuje značajno za ALK4-Fc i ALK5-Fc u ovom eksperimentalnom formatu. ATI-1523 je značajno smanjio signal vezivanja za BMP11 prema ALK4-Fc (smanjenje od 98%) i ALK5-Fc (smanjenje od 69%), što sugeriše da se adnektin takmiči za vezivanje za miostatin sa receptorima Tipa I. Nasuprot tome, uočen je povećan odgovor vezivanja za komplekse miostatin/ATI-1523 ili BMP11/ATI-1523 na ActRIIB-Fc ili mAb-A površinama, što sugeriše da su kompleksi miostatin/ATI-1523 ili BMP11/ATI-1523 sposobni da se vežu na ove površine, tj., adnektin nije kompetitivan sa ActRIIB-Fc ili mAb-A. Veliki porast u odgovoru vezivanja (>1000% povećanje) za kompleks miostatin/ATI-1523 na površinama ActRIIB-Fc i mAb-A je u skladu sa dejstvom adnektina koji ima solubilizirajući efekat na miostatin.
Tabela 18: Odgovor vezivanja SPR za 100 nM miostatina ili 100 nM BMP11 u odsustvu ili prisustvu 200 nM ATI-1523 na ALK4-Fc, ALK5-Fc, ActRIIB-Fc, mAb-A ili PRD-1474 površinama.
[0321] Takmičenje adnektina korišćenjem "SPR formata B": Mehanizam delovanja za antimiostatin adnektine bio je dalje procenjen u "SPR Formatu B", gde su miostatin ili BMP11 (10 µg/ml u 10 mM acetatu pH 4.5) bili direktno imobilisani na CM5 površini senzorskog čipa koristeći EDC/NHS hemiju kuplovanja do gustine od 985 RU (miostatin) ili 530 RU (BMP11). Ovde je upoređen odgovor vezivanja za receptore ALK4-Fc (R&D Systems), ALK5-Fc (R&D Systems) ili ActRIIB-monomer (proizveden u kući) pojedinačno injektovane (2 µM tokom 180 s na 30 µl/min), sa odgovorima vezivanja za ove receptore nakon prethodnog vezivanja adnektin-Fc fuzije PRD-1474 za površinu (1 µM za 480 s na 30 µl/min). Radni pufer za imobilizaciju i eksperimente kompeticije bio je 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, id 0.05% v/v surfaktant P20, pH 7.4, a površine su regenerisane između ciklusa korišćenjem 4 injekcije 50 mM NaOH za15 s pri 30 µl/min.
[0322] U odsustvu PRD-1474, svaki receptor se specifično vezuje za imobilisani BMP11, dok su se samo ALK5-Fc i ActRIIB-monomer, ali ne i ALK4-Fc, vezali za imobilisani miostatin. Prethodno vezivanje PRD-1474 značajno je smanjilo signal vezivanja za ALK4-Fc prema BMP11 (smanjenje od 70%) i takođe smanjilo vezivanje ALK5-Fc prema miostatinu ili BMP11 (smanjenje od 35-41%), ali je imalo minimalan uticaj na vezivanje ActRIIB-monomera bilo za površine miostatina ili BMP11, Tabela 19. Ovi podaci, uzeti zajedno sa podacima o kompeticiji SPR iz "SPR Format A" (Tabela 18), kompetitivnim ELISA podacima (Sl. 10), i potpunom inhibicijom siganlizacije miostatina uočenom u testu ARE-luciferaze (Sl. 11), pokazuju da je mehanizam delovanja adnektina blokada regrutovanja signalnih receptora (ALK4/5) Tipa I, i da se adnektini ne takmiče sa vezivanjem receptora (ActRIIB) Tipa II.
Tabela 19: Odgovor vezivanja SPR za 1 µM ALK4-Fc, ALK5-Fc ili ActRIIB-monomer na imobilisanim površinama miostatina ili BMP11 sa ili bez prethodno vezanog PRD-1474.
Površina Prethodno vezivanje PRD- ALK4-Fc ALKS-Fc ActRIIB-monomer
[0323] Pošto ovi adnektini predstavljaju familije sekvenci koje su prikazane u predmetnom pronalasku, a pojedinačni klonovi unutar dobro definisane familije sekvenci održavaju isto mesto vezivanja, sekvence obuhvaćene predmetnim pronalaskom deluju tako što blokiraju regrutovanje ALK4/5 u kompleks miostatin-ActRIIb.
[0324] Farmakokinetički podaci dalje ukazuju da se nivoi kompleksa miostatin-adnektin akumuliraju sa vremenom i da se ovi kompleksi vezuju za ActRIIb, delujući tako kao dominantni negativni inhibitor signalizacije nezavisno od slobodnog leka. Ovaj jedinstveni mehanizam razlikuje anti-miostatin adnektine predmetnog pronalaska od anti-miostatin antitela opisanih u literaturi (npr., US 7632499), i ukazuju da anti-miostatin adnektini pronalaska imaju povećanu aktivnost.
Primer 11: Mapiranje mesta vezivanja adnektina na miostatinu pomoću HDX-MS:
[0325] Mesto vezivanja adnektina na miostatinu je dalje procenjeno korišćenjem masene spektrometrije izmene vodonik-deuterijum (HDX-MS - hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry).
[0326] Metod masene spektrometrije izmene vodonik-deuterijum (HDX-MS) ispituje konformaciju proteina i konformacionu dinamiku u rastvoru praćenjem brzine izmene deuterijuma i obima vodonika u amidnoj osnovnoj strukturi. Nivo HDX zavisi od dostupnosti rasvaraču vodonika amida osnovne strukture i konformacije proteina. Povećanje mase proteina pod HDX može se precizno izmeriti pomoću MS. Kada je ova tehnika uparena sa enzimskom digestijom, mogu se dobiti strukturne karakteristike na nivou peptida, omogućavajući diferencijaciju površinski izloženih peptida od onih koji su uvijeni unutra, ili od onih koji su sekvestrirani na interfejsu protein-protein kompleksa. Obično se izvode eksperimenti sa obeležavanjem deuterijuma i naknadnim kvenčovanjem, nakon čega sledi onlajn digestija pepsina, odvajanje peptida i MS analiza.
[0327] Pošto je otkriveno da sam miostatin ima neprikladno nisku rastvorljivost za HDX-MS u uslovima fiziološki relevantnog pH (< 10 µg/ml), koristili smo alternativnu strategiju povećanja rastvorljivosti miostatina tako što smo protein kompleksirali sa Fab fragmentom iz mAb-A (Fab-A), za koji je pokazano da nije konkurentan adnektinu korišćenjem SPR eksperimenata opisanih u Primeru 10. Oligomerno stanje HDX-MS uzoraka je okarakterisano hromatografijom isključenja po veličini spojenom sa detektorom višeugaonog rasejanja laserske svetlosti (SEC-MALS - multiangle laser light scattering detector), gde je MALS-određena masa miostatin/Fab-A kompleksa (~120 kDa) bila u skladu sa očekivanom stehiometrijom jednog homodimera miostatina vezanog za dva Fab-A molekula, i MALS-određena masa miostatin/Fab-A/3116_A06 kompleksa (142 kDa) bila je u skladu sa očekivanom stehiometrijom jednog homodimera miostatina vazanog za dva Fab-A molekula plus dva 3116_A06 molekula.
[0328] Pre mapiranja mesta vezivanja adnektina na miostatinu koje je prepoznao adnektin 3116_A06 pomoću HDX-MS, izvedeni su nedeuterisani eksperimenti da se generiše lista uobičajenih peptičkih peptida za miostatin iz miostatin/Fab-A (1:1 molarni odnos na 30 µM svaki) i miostatin/Fab-A/3116_A06 (1:1:1 molarni odnos na 30 µM svaki) uzoraka, čime se postiže pokrivenost sekvence od 83.5% za miostatin. U ovom eksperimentu, 10 mM fosfatnog pufera (pH 7.0) je korišćeno tokom koraka obeležavanja, nakon čega je dodat pufer za kvenčovanje (200 mM fosfatnog pufera sa 4M GdnCl i 0.5M TCEP, pH 2.5, 1:1, v/v). Za eksperimente mapiranja mesta vezivanja adnektina, 5 µL svakog uzorka (miostatin/Fab-A ili miostatin/Fab-A/3116_A06) je pomešano sa 65 µL HDX pufera za obeležavanje (10 mM fosfatnog pufera u D2O, pD 7.0) da započne reakcije obeležavanja na sobnoj temperaturi (~25°C). Reakcije su sprovedene u različitim vremenskim periodima: 20 sec, 1 min, 10 min, 60 min i 240 min. Do kraja svakog reakcionog perioda obeležavanja, reakcija je kvenčovana dodavanjem pufera za kvenčovanje (1:1, v/v) i kvenčovan uzorak je injektovan u Waters HDX-MS sistem za analizu. Uočeni uobičajeni peptički peptidi su praćeni prema nivoima njihovog unosa deuterijuma u odsustvu/prisustvu 3116_A06.
[0329] Eksperimentalni podaci dobijeni pomoću HDX-MS merenja pokazuju da adnektin 3116_A06 prepoznaje diskontinuirano mesto vezivanja za adnektin koje je sačinjeno od dva peptidna regiona u miostatinu:
Region 1: LYFNGKEQIIYGKIPAM (85-101); SEQ ID NO: 329
Region 2: PHTHLVHQANP (56-66); SEQ ID NO: 330
[0330] Na osnovu relativnih nivoa preuzimanja deuterijuma, dva peptidna regiona mogu se rangirati kao region 1 > 2, pri čemu region 1 ima najznačajnije promene u preuzimanju deuterijuma.
Primer 12 - In silico doking adnektina 3116_A06 na miostatin
[0331] Računski pristup je korišćen za generisanje strukturnog modela kompleksa 3116_A06-miostatin koji je bio u skladu sa HDX-MS podacima (Sl. 13). Proteinski doking 3116_A06 u strukturu humanog miostatina (PDB 3HH2 preuzeto iz Protein Data Bank, www.rcsb.org; Cash i sarad., EMBO J. 28:2662-2676, 2009) izvedeno je korišćenjem ZDOCK (Chen and Wang, Proteins 47:281-294, 2002) kako je implementirano u Accelrys software Discovery Studio v3.5 (Accelrys). Protokol ZDOCK koristi čvrst doking dve proteinske strukture (ligand = 3116_A06 i receptor = miostatin). Usidrene poze su filtrirane za komplekse koji sadrže konformacije 3116_A06 FG (ostaci Thr79 do Tyr88) i BC (ostaci Ser25 do N33) petlji. Poželjni kompleks je odabran na osnovu komplementarnosti povezanih ostataka spojenih sa korelacijom povoljnih supstitucija petlje identifikovanih mutagenezom adnektina. Sl. 13A pokazuje mesto vezivanja ALK4 i mesto vezivanja ActRIIB mapirano na strukturu miostatina (siva). Region 1 i Region 2, koji su identifikovani pomoću HDX-MS eksperimentima kao što je opisano u Primeru 11, označeni su crnom bojom. Sl. 13B prikazuje poželjni kompleks iz dokinga, sa BC, DE i FG petljom od 3116_A06 (crna) prikazana u štapnom obliku, i Regioni 1 i 2 miostatina (siva) predstavljeni u prostoru za popunjavanje. Nekoliko ostataka koji su identifikovani kao mutacije pogodne za petlju pokazuju ključne doprinose. Na primer, u BC petlji 3116_A06, ostaci Ser25, Leu26, i Pro27 su važni kao strukturna ograničenja za održavanje ukupne konformacije petlje. Nasuprot tome Ala32 se uklapa u mali hidrofobni rascep formiran na spoju kompleksa i osnovna struktura ostataka formira vodonične veze sa miostatinom. Najpoželjnije supstitucije na poziciji 32 su Gly ili Leu, i predviđa se da će se dobro uklopiti umesto alanina. Slično, Asn33 je uključen sa vodoničnim vezama sa obližnjim ostacima triptofana miostatina. Najpoželjnije supstitutucije na poziciji 33 su His i Gln, koje takođe sadrže bočne lance koji mogu doprineti kao donori vodonične veze. Ostaci u DE petlji su kritični: najpovoljnije supstitucije su ograničene na Gly55, Arg56 i Gly 57, a samo konzervativne supstitucije su poželjnije za Va158. U strukturi modela, Arg56 je kritični ostatak koji doprinosi pi katjonskim interakcijama sa Y86 miostatina u Regionu 1 kao i dodatnim vodoničnim vezama sa osnovnom strukturom (kičmom) i bočnim lancem drugih ostataka Regiona 1. Za mnoge ostatke FG petlje, najpoželjnije supstitucije su bile konzervativne zamene. Jedna kritična identifikovana pozicija je Tyr88, koja ima pi katjonske interakcije i pi-pi interakcije sa Y55 i drugim ostacima iz Regiona 2 miostatina. FG petlja je takođe uključena u nekoliko hidrofobnih interakcija sa oba Regiona 1 i 2 identifikovanih iz eksperimenata mutageneze. Ovi proračuni prikazuju dobro slaganje sa podacima HDX-MS i SPR eksperimenata.
Primer 13 - In vivo mišji model mišićno-skeletne efikasnosti
[0332] Mužjaci B6.SCID miševa (stari 9-13 nedelja, Jackson Laboratories, Bar Harbor, Mejn) su smešteni u prostoriju sa kontrolisanom temperaturom sa obrnutim ciklusom svetlo/mrak od 12 sati. Voda i standardna hrana za jelo su bili dostupni ad libitum. Miševi su randomizovani i raspoređeni između tretiranih grupa da bi primili ili kontrolna ili ispitivana jedinjenja predmetnog pronalaska na osnovu telesne težine (oko 20-22 g). Da bi se demonstrirala in vivo efikasnost jedinjenja predmetnog pronalaska, jedinjenja su administrirana ili nedeljno (Fc-fuzioni anti-miostatin adnektini) ili dva puta nedeljno (PEGilovani anti-miostatin adnektini) subkutanom injekcijom. Ispitivana jedinjenja su administrirana životinjama u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS - Phosphate-Buffered Saline). Kontrole su tretirane samo puferom za rekonstituciju. Ispitivane životinje (n=8-10 miševi/grupa) su dozirane subkutano u vremenskom opsegu od 14 dana, sa npr., 5, 6 ili 10 mg/kg/nedeljno jedinjenja predmetnog pronalaska. Merenja telesne težine su zabeležena pre randomizacije, na dan randomizacije i dva do tri puta nedeljno tokom perioda lečenja i na kraju studije. Mišićna masa potkolenice je zabeležena sa leševa tela na kraju studije analizom kvantitativno magnetnom rezonantnom tomografijom (MRI - magnetic resonance imaging, Echo Medical Sistemi, Tex). Ispitivane grupe su upoređene sa kontrolnom grupom. Rezultati pokazuju da su anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska povećali procenat telesne težine u odnosu na baznu liniju (Sl.14) i imali značajne anaboličke efekte na zapreminu skeletnih mišića (Sl. 15), u poređenju sa kontrolnim miševima (npr., približno 7-10% povećanje mišićnog volumena u poređenju sa kontrolom).
Magnetna rezonantna tomografija (MRI)
[0333] MRI za merenje volumena mišića nogu obavljena je na Bruker PharmaScan 4.7 Tesla sa otvorom od 16 cm (Bruker Biospin, Billerica, Ma. SAD. Za predajnik i prijemnik je korišćen kalem zapremine od 62 mm. Nakon prikupljanja slika lokalizatora potkolenice, T2 ponderisane slike su dobijene korišćenjem plana aksijalnog preseka. Brzi sin-eho (RARE) niz se sastojao od Hermite pulsa od 90° praćeno Hermitovim pulsom od 180° sa TR/TE = 2000/23ms. Jedanaest aksijalnih rezova je prikupljeno od vrha kolena do skočnog zgloba sa dimenzijom matrice od 256 × 128 tačaka podataka. Vidno polje je bilo 5 cm sa 2.5 cm, sa debljinom preseka 1.25 mm i RARE faktorom od 4 i 8 signala u proseku. Volumeni mišića nogu izračunati su zbirom svih površina aksijalnih preseka pomoženih sa debljinom preseka od 1.25 mm za ukupni volumen mišića u svakoj nozi. Slike su analizirane kao prosek oblasti za region od interesa (ROI - region-of-interests) pomoću analize slika sekvence (ISA - Image Sequence Analysis, Bruker Biospin, Billerica, Ma.). Ručni ROI su nacrtani oko mišića nogu, isključujući kožu i potkožno masno područje. Ukupan prosečni volumen mišića za obe noge je prikazan na Sl.15.
[0334] MRI za zapremine srca kao bezbedonosnu krajnju tačku takođe je izveden sa istim MRI skenerom. Nakon dobijanja inicijalnih lokalizatorskih snimaka torakalnog područja, sakupljeno je 9 aksijalnih slika od velikih sudova do vrha srca. Slično analizi mišiča nogu, aksijalne površine su dodate i pomnožene sa debljinom preseka od 1.25 mm da bi se dobila ukupna zapremina srca za svaku životinju. Nije primećena značajna promena u zapremini srca pomoću MRI.
Statistika
[0335] Razlike između grupa su procenjene korišćenjem Studentovog t-testa 2-strano uparene analize.
Primer 14 - Efikasnost PRD-1474 na rast mišića in vivo
[0336] Mužjaci B6.SCID miševa (n=10/grupa) su održavani i tretirani kao što je opisano u Primeru 10, sa izuzetkom što je PRD-1474 administriran u različitim dozama kao što je prikazanona Sl.
16, a trajanje tretmana je bilo 28 dana. PRD-1474 u dozi od 1 mg/kg prikazao je značajno povećanje volumena mišića podkolenice od 11.1% u poređenju sa kontrolnom grupom PBS

Claims (15)

  1. (p<0.0001). Značajno povećanje u volumenu mišića potkolenice od 27.7%, 29.7% i 32.8% takođe je primećeno sa PRD-1474 pri dozi od 10 mg/kg, 30 mg/kg i 100 mg/kg, redom. Nije primećena promena u zapremini srca u svim doznim grupama za lečenje u odnosu na kontrolu. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± standardna devijacija. Različite dozne grupe su upoređene korišćenjem ANOVA. (*p< 0.0001;<#>nije značajno između grupa).
    [0337] Podaci prikazuju da su anti-miostatin adnektini predmetnog pronalaska efikasni u značajno nižim dozama od prethodno opisanih inhibitora miostatina (npr., US 7632499, J. Clin. Onclo.
    30(Suppl):Apstr. 2516, 2012). Prema tome, anti-miostatin adnektini pronalaska opisani ovde obezbeđuju povećanu efikasnost pri nižim dozama u kombinaciji sa smanjenim neželjenim nuspojavama, kada se administriraju sami ili u kombinaciji sa drugim inhibitorima miostatina ili drugim lekovima, za lečenje gubitka mišića i metaboličkih bolesti.
    Patentni zahtevi
    1. Polipeptid koji sadrži deseti tipa III domen (<10>Fn3) humanog fibronektina, pri čemu se<10>Fn3 domen sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 281.
  2. 2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu polipeptid sadrži Fc domen imunoglobulina.
  3. 3. Polipeptid prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je Fc domen izveden iz IgG1.
  4. 4. Polipeptid prema patentnom zahtevu 2, pri čemu su Fc i<10>Fn3 domen fuzionisani preko veznika odabranog od SEQ ID NOs: 181-209.
  5. 5. Polipeptid prema patentnom zahtevu 4, pri čemu je veznik odabran od SEQ ID NOs: 181-187.
  6. 6. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, pri čemu se polipeptid sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 264, 269 ili 273.
  7. 7. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se polipeptid sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 273.
  8. 8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 i farmaceutski prihvatljivi nosač.
  9. 9. Nukleinska kiselina koja kodira polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7.
  10. 10. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 9.
  11. 11. Ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 9.
  12. 12. Nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 9, koja sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 296, 301 ili 305.
  13. 13. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 ili kompozicija prema patentnom zahtevu 8, za primenu u postupku lečenja mišićnog, neurološkog ili metaboličkog poremećaja koji je u vezi sa gubitkom mišića i/ili atrofijom mišića ili degenerativnim poremećajem kostiju.
  14. 14. Polipeptid ili kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 13, pri čemu subjekt ima mišićnu distrofiju.
  15. 15. Polipeptid ili kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu subjekt ima Dišenovu mišićnu distrofiju.
RS20240550A 2012-09-13 2013-09-12 Proteini domena skele na bazi fibronektina koji vezuju miostatin RS65556B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261700697P 2012-09-13 2012-09-13
US201361780005P 2013-03-13 2013-03-13
EP20206702.1A EP3835310B1 (en) 2012-09-13 2013-09-12 Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS65556B1 true RS65556B1 (sr) 2024-06-28

Family

ID=49253416

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240550A RS65556B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Proteini domena skele na bazi fibronektina koji vezuju miostatin
RS20190618A RS58801B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin
RS20210753A RS62009B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190618A RS58801B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin
RS20210753A RS62009B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin

Country Status (33)

Country Link
US (9) US8853154B2 (sr)
EP (4) EP2895503B1 (sr)
JP (2) JP6346895B2 (sr)
KR (3) KR102424590B1 (sr)
CN (2) CN104768969B (sr)
AU (2) AU2013315482B2 (sr)
BR (1) BR112015005466B1 (sr)
CA (1) CA2884730C (sr)
CL (1) CL2015000500A1 (sr)
DK (3) DK2895503T3 (sr)
EA (1) EA033536B1 (sr)
ES (3) ES2879387T3 (sr)
FI (1) FI3835310T3 (sr)
HR (3) HRP20240676T1 (sr)
HU (3) HUE054699T2 (sr)
IL (3) IL294314B1 (sr)
LT (3) LT3835310T (sr)
MX (2) MX390017B (sr)
MY (2) MY172863A (sr)
NZ (1) NZ628446A (sr)
PE (1) PE20150954A1 (sr)
PH (1) PH12015500397B1 (sr)
PL (3) PL3564258T3 (sr)
PT (3) PT3835310T (sr)
RS (3) RS65556B1 (sr)
SG (3) SG11201501741YA (sr)
SI (3) SI2895503T1 (sr)
SM (1) SMT202400214T1 (sr)
TN (1) TN2015000086A1 (sr)
TW (2) TWI633117B (sr)
UY (2) UY40128A (sr)
WO (1) WO2014043344A1 (sr)
ZA (1) ZA201501457B (sr)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2892925T3 (es) 2006-03-31 2022-02-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Métodos para controlar la farmacocinética en sangre de anticuerpos
CN101874042B9 (zh) 2007-09-26 2019-01-01 中外制药株式会社 利用cdr的氨基酸取代来改变抗体等电点的方法
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
ES2573108T3 (es) 2010-05-26 2016-06-06 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de armazón a base de fibronectina que tienen estabilidad mejorada
TWI812066B (zh) 2010-11-30 2023-08-11 日商中外製藥股份有限公司 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體
RS55609B1 (sr) 2011-04-13 2017-06-30 Bristol Myers Squibb Co Fc fuzioni proteini koji sadrže nove linkere ili aranžmane
TW202237660A (zh) 2012-08-24 2022-10-01 日商中外製藥股份有限公司 FcγRIIb特異性Fc區域變異體
EP3597747B1 (en) 2012-08-24 2023-03-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse fcgammarii-specific fc antibody
TWI633117B (zh) * 2012-09-13 2018-08-21 必治妥美雅史谷比公司 結合至肌肉生長抑制素（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）以纖維連接蛋白爲主之支架結構域蛋白質
EA201590719A1 (ru) 2013-01-25 2015-12-30 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Фоллистатин в лечении мышечной дистрофии дюшенна
EP2951206A2 (en) 2013-02-01 2015-12-09 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins
ES2689372T3 (es) 2013-02-06 2018-11-13 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de dominio de fibronectina tipo III con solubilidad mejorada
ES2870802T3 (es) 2013-02-12 2021-10-27 Bristol Myers Squibb Co Métodos de replegado de proteínas a elevado pH
AU2014250434B2 (en) 2013-04-02 2019-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
HRP20251426T1 (hr) 2013-05-06 2026-01-02 Scholar Rock, Inc. Sastavi i postupci za modulaciju faktora rasta
CN106795214B (zh) 2014-03-20 2022-09-02 百时美施贵宝公司 稳定化的基于纤连蛋白的支架分子
EP3129401B1 (en) 2014-03-20 2019-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Serum albumin-binding fibronectin type iii domains
US10016394B2 (en) 2014-04-16 2018-07-10 The Scripps Research Institute PPARG modulators for treatment of osteoporosis
WO2016018917A2 (en) 2014-07-28 2016-02-04 The Regents Of The University Of Califoria Compositions and methods of making polymerized nucleic acids
US10980744B2 (en) 2014-08-08 2021-04-20 The Regents Of The University Of California High density peptide polymers
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
JP6668345B2 (ja) 2014-11-21 2020-03-18 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 修飾された重鎖定常領域を含む抗体
MY189836A (en) 2014-11-21 2022-03-11 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against cd73 and uses thereof
ES2981335T3 (es) 2014-11-25 2024-10-08 Bristol Myers Squibb Co Novedosos polipéptidos de unión a PD-L1 para obtención de imágenes
MX385081B (es) 2014-11-25 2025-03-14 Bristol Myers Squibb Co Métodos y composiciones para radioetiquetado con 18f de productos biológicos.
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
CN107207594B (zh) 2014-12-23 2019-05-07 百时美施贵宝公司 针对tigit的抗体
CN114773470A (zh) 2015-02-05 2022-07-22 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US10993993B2 (en) * 2015-05-28 2021-05-04 Immunoforge Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treating muscle atrophy or sarcopenia including glucagon-like peptide (GLP-1) or GLP-1 receptor agonist
TN2019000101A1 (en) 2015-05-29 2020-07-15 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against ox40 and uses thereof.
AU2016285920A1 (en) 2015-06-29 2018-02-01 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to CD40 with enhanced agonist activity
US20180228925A1 (en) * 2015-08-28 2018-08-16 University Of Massachusetts Quantifying Net Axonal Transport in Motor Neuron Pathologies
ES2809125T3 (es) * 2015-09-23 2021-03-03 Bristol Myers Squibb Co Moléculas de armazón a base de fibronectina de unión a glipicano-3
CN108350416A (zh) 2015-11-09 2018-07-31 百时美施贵宝公司 操纵在cho细胞中产生的多肽的品质属性的方法
US11359009B2 (en) 2015-12-25 2022-06-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
KR20230038311A (ko) 2016-03-04 2023-03-17 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-cd73 항체와의 조합 요법
ES2985566T3 (es) 2016-03-04 2024-11-06 Univ Rockefeller Anticuerpos contra CD40 con actividad agonista mejorada
RU2613420C1 (ru) * 2016-04-13 2017-03-16 Сергей Михайлович Юдин Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US11708390B2 (en) 2016-05-11 2023-07-25 Cytiva Bioprocess R&D Ab Method of storing a separation matrix
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
JP6987424B2 (ja) 2016-05-11 2022-01-05 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを洗浄および／または消毒する方法
CN109071613A (zh) 2016-05-11 2018-12-21 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离基质
JP7031934B2 (ja) 2016-05-11 2022-03-08 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックス
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10994033B2 (en) 2016-06-01 2021-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18F-radiolabeled biologics
US11344639B2 (en) 2016-06-01 2022-05-31 Bristol-Myers Squibb Company PET imaging with PD-L1 binding polypeptides
KR20190044070A (ko) * 2016-08-03 2019-04-29 넥스트큐어 인코포레이티드 Lair 신호 변환을 조정하기 위한 조성물 및 방법
TWI693940B (zh) 2016-08-05 2020-05-21 日商中外製藥股份有限公司 Ｉｌ-８相關疾病之治療用或預防用組成物
US12448411B2 (en) 2016-09-30 2025-10-21 Cytiva Bioprocess R&D Ab Separation method
EP3549595A4 (en) 2016-12-05 2020-07-22 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. COMPOSITION INHIBITING AMYOTROPHY
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
TWI897843B (zh) 2017-05-03 2025-09-21 美商必治妥美雅史谷比公司 結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物
IL270596B2 (en) 2017-05-25 2026-01-01 Bristol Myers Squibb Co Antibodies containing heavy constant regions are adapted for use in cancer therapy
CN111788227B (zh) 2017-12-27 2025-02-25 百时美施贵宝公司 抗cd40抗体及其用途
WO2019144945A1 (en) * 2018-01-25 2019-08-01 I-Mab Anti-pd-l1 antibody and il-7 fusions
CN108593615A (zh) * 2018-05-02 2018-09-28 浠思（上海）生物技术有限公司 利用htrf一步法筛选pd1/pd-l1阻断剂的方法
JP7051656B2 (ja) 2018-09-28 2022-04-11 三菱重工コンプレッサ株式会社 タービンステータ、蒸気タービン、及び仕切板
US11274150B2 (en) 2018-11-16 2022-03-15 Bristol-Myers Squibb Company Anti-human natural killer cell inhibitory receptor group 2A protein (NKG2A) antibodies
EP3887397A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
US12516145B2 (en) 2019-09-30 2026-01-06 Northwestern University Bioactive peptide brush polymers via photoinduced reversible-deactivation radical polymerization
WO2021183428A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
WO2021231732A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
US11566346B2 (en) 2020-06-25 2023-01-31 Philip David Rodley Protein scaffold
US20230416410A1 (en) * 2020-11-20 2023-12-28 Zoetis Services Llc Bovine antibody variants
CN119562762A (zh) 2022-04-04 2025-03-04 加利福尼亚大学董事会 遗传互补组合物和方法
WO2025177263A1 (en) 2024-02-25 2025-08-28 Biohaven Therapeutics Ltd. Myostatin-binding proteins
WO2025219859A1 (en) 2024-04-14 2025-10-23 Biohaven Therapeutics Ltd. Combination therapy to treat overweight, obesity, and related health conditions

Family Cites Families (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5672502A (en) 1985-06-28 1997-09-30 Celltech Therapeutics Limited Animal cell culture
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5614492A (en) 1986-05-05 1997-03-25 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone GLP-1 (7-36) and uses thereof
US5770697A (en) 1986-11-04 1998-06-23 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
US5589173A (en) 1986-11-04 1996-12-31 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US5641648A (en) 1986-11-04 1997-06-24 Protein Polymer Technologies, Inc. Methods for preparing synthetic repetitive DNA
US5514581A (en) 1986-11-04 1996-05-07 Protein Polymer Technologies, Inc. Functional recombinantly prepared synthetic protein polymer
US6018030A (en) 1986-11-04 2000-01-25 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5506134A (en) 1990-10-22 1996-04-09 Corvas International, Inc. Hypridoma and monoclonal antibody which inhibits blood coagulation tissue factor/factor VIIa complex
US5792742A (en) 1991-06-14 1998-08-11 New York University Fibrin-binding peptide fragments of fibronectin
WO2002081494A1 (en) 2001-03-26 2002-10-17 Sirna Therapeutics, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
MD1367C2 (ro) 1992-11-13 2000-11-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Metode de tratament al limfomului celulelor B, anticorpi anti-CD20, hibridom.
WO1994017097A1 (en) 1993-01-19 1994-08-04 Regents Of The University Of Minnesota Synthetic fibronectin fragments as inhibitors of retroviral infections
US20030074680A1 (en) 1993-03-19 2003-04-17 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
DK0690873T3 (da) 1993-03-19 2003-09-29 Univ Johns Hopkins Med Vækstdifferentieringsfaktor-8
US6465239B1 (en) 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US5994618A (en) 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
US6673534B1 (en) 1995-10-26 2004-01-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods for detection of mutations in myostatin variants
US6607884B1 (en) 1993-03-19 2003-08-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-8
US7393682B1 (en) 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US7332575B2 (en) 1994-03-18 2008-02-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
DK1712623T3 (da) 1997-01-21 2012-02-06 Gen Hospital Corp Udvælgelse af proteiner ved anvendelse af RNA-proteinfusioner
WO1998033887A1 (en) 1997-02-05 1998-08-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US7749498B2 (en) 1997-03-10 2010-07-06 Genentech, Inc. Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
EP1958962A3 (en) 1997-06-12 2013-05-01 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
AU3463699A (en) 1998-04-03 1999-10-25 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
ES2330062T3 (es) 1998-05-06 2009-12-03 Metamorphix, Inc. Procedimientos para tratar la diabetes por inhibicion de gdf-8.
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
DE69941267D1 (de) 1998-12-10 2009-09-24 Bristol Myers Squibb Co Proteingerüste für antikörper-nachahmer und andere bindende proteine
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
JP2003528632A (ja) 2000-03-31 2003-09-30 インスティティ・パスツール 血管内皮成長因子（ｖｅｇｆ）−媒介性脈管形成を阻害するペプチド、該ペプチドをエンコードするポリヌクレオチド及びその使用方法
CA2416219C (en) 2000-07-11 2016-10-11 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
CA2418835A1 (en) 2000-10-16 2002-04-25 Phylos, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7598352B2 (en) 2000-11-17 2009-10-06 University Of Rochester Method of identifying polypeptide monobodies which bind to target proteins and use thereof
CA2443332A1 (en) 2001-04-04 2002-10-17 University Of Rochester .alpha..nu..beta.3 integrin-binding polypeptide monobodies and their use
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
WO2003104418A2 (en) 2002-06-06 2003-12-18 Research Corporation Technologies, Inc. Reconstituted polypeptides
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
ES2655912T3 (es) 2002-11-08 2018-02-22 Ablynx N.V. Anticuerpos de dominio simple dirigidos contra factor de necrosis tumoral-alfa y usos para los mismos
US20080220049A1 (en) 2003-12-05 2008-09-11 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins
CN1946417A (zh) 2003-12-05 2007-04-11 阿德内克休斯治疗公司 2型血管内皮生长因子受体的抑制剂
ES2567634T3 (es) 2004-02-09 2016-04-25 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina
ATE557042T1 (de) 2004-03-23 2012-05-15 Lilly Co Eli Anti-myostatin-antikörper
WO2005118646A2 (en) 2004-04-26 2005-12-15 Centocor, Inc. Epitope directed selection of antibodies to murine tissue factor
KR20120064120A (ko) 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
BRPI0516308A2 (pt) 2004-10-04 2010-06-15 Qlt Usa Inc composição fluida, métodos de tratamento de uma doença ou disfunção, métodos de liberação local ou sistêmica de um agente biológico, implantes, método de formação de um implante, kit de agente biológico e usos de uma composição fluida
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
NL1031674C2 (nl) 2005-04-25 2007-04-26 Pfizer Antilichamen tegen myostatine.
ES2534760T3 (es) 2005-08-19 2015-04-28 Wyeth Llc Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8
BRPI0616923A2 (pt) 2005-10-06 2011-07-05 Lilly Co Eli anticorpos monoclonais, seus usos e composição farmacêutica
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
JP2009518422A (ja) 2005-12-06 2009-05-07 アムジェン インコーポレイテッド ミオスタチン・アンタゴニストの使用
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
CA2661836A1 (en) 2006-09-05 2008-03-13 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
WO2008031098A1 (en) 2006-09-09 2008-03-13 The University Of Chicago Binary amino acid libraries for fibronectin type iii polypeptide monobodies
CA2670471A1 (en) 2006-11-22 2008-06-05 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company (A Delaware Corporation) Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including igf-ir
US20100144599A1 (en) 2007-02-02 2010-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Vegf pathway blockade
EP2162540A2 (en) 2007-05-22 2010-03-17 Amgen Inc. Compositions and methods for producing bioactive fusion proteins
US8470966B2 (en) 2007-08-10 2013-06-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
US8680019B2 (en) 2007-08-10 2014-03-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin Type III binding-domain libraries
US20090176654A1 (en) 2007-08-10 2009-07-09 Protelix, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
US20100285000A1 (en) 2007-08-20 2010-11-11 Bristol-Myers Squibb Company Use of vegfr-2 inhibitors for treating metastatic cancer
KR100857861B1 (ko) * 2007-10-15 2008-09-11 주식회사 바이오리더스 Ｍｙｏ－２ 펩타이드 중합체와 마이오스타틴의 융합단백질표면발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미생물
EP2215246B1 (en) 2007-10-31 2015-01-07 MedImmune, LLC Protein scaffolds
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
EP2217274A1 (en) 2007-11-28 2010-08-18 Bristol-Myers Squibb Company Combination vegfr2 therapy with mtor inhibitors
WO2009086116A2 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Inc. Alternative scaffold protein fusions phage display via fusion to plx of m13 phage
JP2011507543A (ja) 2007-12-27 2011-03-10 ノバルティス アーゲー 改善されたフィブロネクチンベースの結合分子およびそれらの使用
EP2080812A1 (en) 2008-01-18 2009-07-22 Transmedi SA Compositions and methods of detecting post-stop peptides
CN102007145A (zh) 2008-02-14 2011-04-06 百时美施贵宝公司 基于结合egfr的工程化蛋白质的靶向治疗剂
PL2274331T3 (pl) 2008-05-02 2014-04-30 Novartis Ag Ulepszone cząsteczki wiążące oparte na fibronektynie i ich zastosowanie
PE20091931A1 (es) 2008-05-22 2009-12-31 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de dominio de armazon basadas en fibronectina multivalentes
BRPI0919881B1 (pt) 2008-10-31 2021-09-08 Centocor Ortho Biotech Inc Proteína de arcabouço e seu método de geração, biblioteca e seu método de construção, molécula de ácido nucleico, vetor de ácido nucleico, célula hospedeira, composição, dispositivo médico e artigo de fabricação
US8415291B2 (en) 2008-10-31 2013-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-TNF alpha fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
US20110275535A1 (en) 2008-12-16 2011-11-10 Novartis Ag Yeast Display Systems
AR074777A1 (es) * 2008-12-19 2011-02-09 Glaxo Group Ltd Proteinas de union a antigeno
WO2010093771A1 (en) 2009-02-11 2010-08-19 Bristol-Myers Squibb Company Combination vegfr2 therapy with temozolomide
BRPI1008532B1 (pt) 2009-02-12 2021-12-14 Janssen Biotech, Inc Arcabouço de proteína isolada, método para construção de uma biblioteca de arcabouço de proteína isolada, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de ácido nucleico isolado, célula hospedeira de bactéria ou fungo, composição, dispositivo médico e artigo de manufatura para uso farmacêutico ou de diagnóstico em seres humanos
US8067201B2 (en) 2009-04-17 2011-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Methods for protein refolding
EP2464663A4 (en) 2009-08-13 2013-05-29 Massachusetts Inst Technology MANIPULATED PROTEINS WITH MUTANT FIBRONECTIN DOMAINS
EP2494046B1 (en) 2009-10-30 2018-09-12 Novartis AG Universal fibronectin type iii bottom-side binding domain libraries
WO2011051466A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof
US20110123545A1 (en) 2009-11-24 2011-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Combination of vegfr2 and igf1r inhibitors for the treatment of proliferative diseases
WO2011092233A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Novartis Ag Yeast mating to produce high-affinity combinations of fibronectin-based binders
WO2011100700A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 University Of Rochester Antigenic mimics of discontinuous epitopes of pathogen recognized by broadly neutralizing antibodies
KR20130010461A (ko) 2010-02-18 2013-01-28 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｉｌ―２３에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질
EA022983B1 (ru) 2010-04-13 2016-04-29 Бристол-Майерс Сквибб Компани Белки на основе структурного домена фибронектина, связывающие pcsk9
CA2795325A1 (en) 2010-04-13 2011-10-20 Medimmune, Llc Fibronectin type iii domain-based multimeric scaffolds
EP3569256B1 (en) 2010-04-30 2022-06-15 Janssen Biotech, Inc. Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
ES2573108T3 (es) 2010-05-26 2016-06-06 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de armazón a base de fibronectina que tienen estabilidad mejorada
CN107903321A (zh) 2010-07-30 2018-04-13 诺华有限公司 纤连蛋白摇篮分子和其库
US8999343B2 (en) 2010-08-16 2015-04-07 Amgen Inc. Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
JP2014504587A (ja) * 2010-12-22 2014-02-24 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｌ−２３に結合するフィブロネクチンをベースとするスカフォールドドメインタンパク質
RS55609B1 (sr) 2011-04-13 2017-06-30 Bristol Myers Squibb Co Fc fuzioni proteini koji sadrže nove linkere ili aranžmane
EP2709669A1 (en) 2011-05-17 2014-03-26 Bristol-Myers Squibb Company Methods for maintaining pegylation of polypeptides
EP3318880B1 (en) 2011-05-17 2020-12-16 Bristol-Myers Squibb Company Improved methods for the selection of binding proteins
EP2761066B1 (en) 2011-09-27 2018-12-05 Janssen Biotech, Inc. Fibronectin type iii repeat based protein scaffolds with alternative binding surfaces
JP2015525230A (ja) 2012-06-11 2015-09-03 アムジエン・インコーポレーテツド デュアル受容体アンタゴニスト性抗原結合タンパク質およびその使用
EP2861617A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 Pfizer Inc. Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
TWI633117B (zh) * 2012-09-13 2018-08-21 必治妥美雅史谷比公司 結合至肌肉生長抑制素（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）以纖維連接蛋白爲主之支架結構域蛋白質
TWI897843B (zh) 2017-05-03 2025-09-21 美商必治妥美雅史谷比公司 結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物

Also Published As

Publication number Publication date
JP2018183138A (ja) 2018-11-22
LT3564258T (lt) 2021-08-25
CA2884730A1 (en) 2014-03-20
CN104768969B (zh) 2021-04-16
HUE043482T2 (hu) 2019-08-28
IL237559B (en) 2019-10-31
ZA201501457B (en) 2021-09-29
BR112015005466A2 (pt) 2017-08-08
PT3564258T (pt) 2021-06-30
US20170088602A1 (en) 2017-03-30
US20140309163A1 (en) 2014-10-16
ES2727453T3 (es) 2019-10-16
DK3564258T3 (da) 2021-06-21
CN108409856B (zh) 2022-03-04
PL3835310T3 (pl) 2024-06-03
SMT202400214T1 (it) 2024-07-09
UY35027A (es) 2014-03-31
JP6793680B2 (ja) 2020-12-02
ES2879387T3 (es) 2021-11-22
TWI694085B (zh) 2020-05-21
EA201590543A1 (ru) 2015-06-30
KR102751864B1 (ko) 2025-01-07
US8993265B2 (en) 2015-03-31
US10406212B2 (en) 2019-09-10
AU2018201273B2 (en) 2020-04-09
EP3564258B1 (en) 2021-04-28
EP3835310A1 (en) 2021-06-16
HUE054699T2 (hu) 2021-09-28
HUE067383T2 (hu) 2024-10-28
US8853154B2 (en) 2014-10-07
IL270110B (en) 2022-08-01
US11813315B2 (en) 2023-11-14
US20140107020A1 (en) 2014-04-17
MX2015002894A (es) 2015-06-03
IL294314B1 (en) 2026-02-01
MY189682A (en) 2022-02-25
PT2895503T (pt) 2019-06-03
ES2984405T3 (es) 2024-10-29
MX2019008391A (es) 2019-09-09
EP3835310B1 (en) 2024-03-20
HRP20240676T1 (hr) 2024-10-11
AU2013315482A1 (en) 2015-03-12
CA2884730C (en) 2023-07-04
MX366666B (es) 2019-07-19
SI2895503T1 (sl) 2019-08-30
US8933199B2 (en) 2015-01-13
TN2015000086A1 (en) 2016-06-29
KR102187714B1 (ko) 2020-12-07
US10245302B2 (en) 2019-04-02
CL2015000500A1 (es) 2015-07-31
DK3835310T3 (da) 2024-06-03
PL2895503T3 (pl) 2019-09-30
WO2014043344A1 (en) 2014-03-20
NZ628446A (en) 2017-06-30
MX390017B (es) 2025-03-11
CN108409856A (zh) 2018-08-17
KR20220107082A (ko) 2022-08-01
PL3564258T3 (pl) 2021-10-25
CN104768969A (zh) 2015-07-08
HRP20210990T1 (hr) 2021-09-17
HK1212717A1 (en) 2016-06-17
EP2895503B1 (en) 2019-03-27
EP4397675A2 (en) 2024-07-10
IL294314A (en) 2022-08-01
IL237559A0 (en) 2015-04-30
PE20150954A1 (es) 2015-06-20
EP2895503A1 (en) 2015-07-22
US20240316161A1 (en) 2024-09-26
JP2015530390A (ja) 2015-10-15
BR112015005466B1 (pt) 2023-04-11
SI3835310T1 (sl) 2024-07-31
US20140105896A1 (en) 2014-04-17
US20150072919A1 (en) 2015-03-12
LT3835310T (lt) 2024-04-25
IL270110A (sr) 2019-12-31
EA033536B1 (ru) 2019-10-31
RS58801B1 (sr) 2019-07-31
US20150231211A1 (en) 2015-08-20
SI3564258T1 (sl) 2021-07-30
PH12015500397A1 (en) 2015-04-27
US9662373B2 (en) 2017-05-30
KR102424590B1 (ko) 2022-07-27
FI3835310T3 (fi) 2024-05-31
KR20150054938A (ko) 2015-05-20
US20170354718A1 (en) 2017-12-14
RS62009B1 (sr) 2021-07-30
DK2895503T3 (da) 2019-05-27
TW201823269A (zh) 2018-07-01
TW201416376A (zh) 2014-05-01
KR20200138435A (ko) 2020-12-09
MY172863A (en) 2019-12-13
NZ800822A (en) 2025-02-28
US9493546B2 (en) 2016-11-15
LT2895503T (lt) 2019-07-25
EP3564258A1 (en) 2019-11-06
SG10201701970TA (en) 2017-05-30
JP6346895B2 (ja) 2018-06-20
SG10201913685YA (en) 2020-03-30
US20190307855A1 (en) 2019-10-10
EP4397675A3 (en) 2024-10-16
AU2018201273A1 (en) 2018-03-15
HRP20190845T1 (hr) 2019-08-09
AU2013315482B2 (en) 2018-03-15
PT3835310T (pt) 2024-05-20
TWI633117B (zh) 2018-08-21
SG11201501741YA (en) 2015-04-29
UY40128A (es) 2023-04-28
PH12015500397B1 (en) 2021-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240316161A1 (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
HK40107892A (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
HK40055226B (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
HK40055226A (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
HK1212717B (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
EA042548B1 (ru) Основанные на фибронектине каркасные доменные белки, которые связываются с миостатином