RS62009B1 - Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin - Google Patents

Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin

Info

Publication number
RS62009B1
RS62009B1 RS20210753A RSP20210753A RS62009B1 RS 62009 B1 RS62009 B1 RS 62009B1 RS 20210753 A RS20210753 A RS 20210753A RS P20210753 A RSP20210753 A RS P20210753A RS 62009 B1 RS62009 B1 RS 62009B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
amino acid
loop
group
myostatin
Prior art date
Application number
RS20210753A
Other languages
English (en)
Inventor
Sharon Cload
Linda Engle
Dasa Lipovsek
Malavi Madireddi
Ginger Chao Rakestraw
Joanna F Swain
Wenjun Zhao
Hui Wei
Aaron P Yamniuk
Alexander T Kozhich
Vidhyashankar Ramamurthy
Martin J Corbett
Stanley Richard Krystek Jr
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49253416&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62009(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of RS62009B1 publication Critical patent/RS62009B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)

Description

Opis
POZIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava se poziva na prioritet privremene prijave Sjedinjenin Američkih Država Br.
61/700,697 pod nazivom "Fibronectin based scaffold domen proteins that bind to miostatin" podneta 13 septembra, 2012, i privremene prijave Sjedinjenin Američkih Država Br.61/780,005 pod nazivom "Fibronectin based scaffold domen proteins that bind to miostatin" podneta 13 marta, 2013.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Ovaj pronalazak odnosi se na fibronektin-bazirane skafold domenske proteine koji vezuje miostatin. Ovaj pronalazak takođe se odnosi na upotrebu novih proteina un terapeutskim primenama za lečenje bolesti gubljenja mišine mase i metaboličkih poremećaja. Ovaj pronalazak dalje se odnosi na ćelije koje obuhvataju takve proteine, polinukleotide koji kodiraju takve proteine ili njihove fragmente, i na vektore koji obuhvataju polinukleotide koji kodiraju nove proteine.
POZADINA PRONALASKA
[0003] Miostatin, takođe poznat faktili Rasta i diferencijacije-8 (GDF-8), je član superfamilije faktora tranformisanja rasta-β (TGF-β) izlučenih faktori rasta. Miostatin poseduje sve stukturalne osobine običajene za TGF-β familiju proteina: hidrofobni amino-terminus koji deluje kao signal lučenja, devet invarijantnih cisteinskih ostataka, i "RXXR" furin-tipa proteolitičko mesto obrade. Proteolitičko cepanje proteina daje C-terminalni domen koji formira homodimer koji je biološki aktivan oblik miostatina (Thies et al., Faktori rasta 2001;18(4):251-9). Poravnanja C-terminalnog fragmenta aminokiselinskih sekvenci miostatina iz više vrsta kičmenjaka otkrivaju da je protein veoma sačuvan (100% identitet) između čoveka, majmuna, krave, psa, miša, pacova, ćurke i kokoške (McPherron, et al. PNAS, 94:12457-61, 1997).
[0004] Ekspresija miostatina ograničena je primarno na skeletne mišiće i adipozno tkivo, gde je pokazano da je negativan regulatili Razvoja skeletnih mišića (Lee LS, Immunol Endocr Metab Agensi Med Chem.2010;10:183-194). Kod sisara, skeletni mišići su se pokazali kao glavno tkivo meta miostatina, gde se vezuje se za receptore ćelijske površine, što dovodi do gubitka mišića. Miševi i goveda sa genetskim deficijencijama miostatina pokazuju značajna povećanja mase skeletnih mišića, tj., "dvostruko mišićavog" fenotipa, čime se potvrđuje uloga miostatina u supresiji rasta mišića (McPherron i Lee, Proc Natl Acad Sci U S A.2003 Dec 23;100(26):15842-6). Hipetrofija mišića kod Belgijsko plave i Piedmontese rase goveda je zbog pogrešne mutacije unutar trećeg eksona miostatin gena kod govečeta (Bass et. al., Domest Anim Endocrinol.1999;17(2-3): 191-7). Transgena prekomerna ekspresija inhibitora miostatina takođe rezultuje kao hiper-mišićavost. Pojačan rast mišića kod ovih životinja je zbog povećanja i broja ćelija, ili hiperplastičnosti rasta, i veličine ćelija, ili hipertrofičnosti rasta, što rezultuje kao veća i teža miovlakna. Povećana masa skeletnih mišića zbog mutacije miostatina takođe je prijavljena i kod ljudi. Inhibicija miostatina efektivno povećava masu skeletnih mišića i jačinu, i u postnatalnom periodu, i kod odraslih.
[0005] Povećanja u masi i jačini skeletnih mišića takođe su povezana sa metaboličkim adaptacijama koje pozitivno utiču na sastav tela, potrošnju energije, glukoznu homeostazu i insulinske potrebe. I genetska i farmakološka saznanja ukazuju da miostatin reguliše metabolizam energije i da njegova inhibicija može značajno da umanji progresiju metaboličkih bolesti, koje uključuju gojaznost i dijabetes. Na primer, miostatin nulti miševi pokazuju smanjenu akumulaciju telesne masnoće (McPherron & Lee, J. JCI 109:595, 2002) u poređenju sa miševima divljeg tipa iste starosti. Ova redukcija masnoće u telu predstavlja manifestovanje redukovanog broja i veličine adipocita, što ukazuje na značajnu ulogu miostatina u adipogenezi kao i u miogenezi.
[0006] Saglasno tome, miostatin predstavlja željeni cilj za terapeutsku ili profilaktičku intervenciju za lečenje poremećaja ili stanja što pogodno dovodi do povećanja mišićne mase, mišićne jačine i/ili metabolizma (npr., distrofija mišića, krtost, disfunkcionalna atrofija i kaheksija), poremećaja povezanih sa gubljenjem mišićne mase (npr., bolest bubrega, otkazivanje srca ili bolest srca, i bolest jetre), i metaboličkih poremećaja (npr., Tip II dijabetes, metabolički sindrom, gojaznost i osteoartritis).
[0007] Saglasno tome, bilo bi poželjno da se obezbede poboljšani fibronektinski domenski skafold proteini koji vezuju miostatin, za upotrebu u terapeutskom lečenju, npr., metaboličkih poremećaja, poremećaja gubljenja mišićne mase, i gubitka mišića zbog neaktivnosti.
KRATAK PREGLED OVOG PRONALASKA
[0008] Ovaj pronalazak bazira se, najmanje delom, na otkriću adnektina koji se vezuju za i antagonišu miostatin. Određenije, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska inhibiraju aktivnost miostatina, čime utiču nishodno na SMAD signalizaciju. Jedan mehanizam zadužen za izmenjenu SMAD signalizaciju nekih od anti-miostatin adnektina ovog pronalaska uključuje inhibiciju Alk4 regrutovanja u miostatin-ActRIIb kompleksu, fiziološko posledice od kojih se povećava zapremina mišića i telesna masa.
[0009] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid koji obuhvata deseti domen fibronektinskog tipa III (<10>Fn3) u kojem<10>Fn3 ima najmanje jednu petlju izabranu od petlje Bc, DE i FG sa izmenjenom aminokiselinskom sekvencom u odnosu na sekvencu odgovarajuće petlje humanog<10>Fn3 domena i u kojem polipeptd vezuje miostatin. U određenim načinima ostvarivanja, polipeptid vezuje miostatin sa KDod manje od 500 nM.
[0010] U nekim primerima izvođenja, BC petlja polipeptida ovog pronalaska obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, u kojoj je (a) X1izabrano iz grupe koju čine S, T I Y; (b) X2je izabrano iz grupe koju čine H, Y, N, R, F, G, S i T; (c) X3je izabrano iz grupe koju čine A, P, Q, S, F, H, N i R; (d) X4je izabrano iz grupe koju čine G i A; (e) X5je izabrano iz grupe koju čine H, L, R, V, N, D, F, I i K; (f) X6je izabrano iz grupe koju čine A, L, G, M, F, I i V; I (g) X7je izabrano iz grupe koju čine H i N. U određenim primerima izvođenja, X1predstavlja S, i/ili X2predstavlja H ili Y, i/ili X3predstavlja A ili P, i/ili X4predstavlja G, i/ili X5predstavlja H, L ili R, i/ili X6predstavlja A ili L., i/ili X7predstavlja H.
[0011] U drugim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X19-X20-P-X21-G-X22-A, u kojoj je (a) X19izabrano iz grupe koju čine D, E, V i W; (b) X20izabrano iz grupe koju čine A, S i V; (c) X21izabrano iz grupe koju čine R, A, G, K i L; i (d) X22izabrano iz grupe koju čine L i R. U određenim primerima izvođenja, X19predstavlja D, i/ili X20predstavlja A, S ili V, i/ili X22predstavlja L.
[0012] U nekim primerima izvođenja, DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X8, u kojoj X8predstavlja V ili L.
[0013] U nekim primerima izvođenja, DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X23-G-R-G-X24, u kojoj je (a) X23izabrano iz grupe koju čine V, P, F, I i L; i (b) X24izabrano iz grupe koju čine S, N i T.
[0014] U nekim primerima izvođenja, FG petlja polipeptida ovog pronalaska obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18,u kojoj je (a) X9izabrano iz grupe koju čine L, V i I; (b) X10izabrano iz grupe koju čine T i S; (c) X11izabrano iz grupe koju čine K, R, A, G, S, D, H, N, T i P; (d) X12izabrano iz grupe koju čine S, T, A, E, H, K i N; (e) X13izabrano iz grupe koju čine K, G, Q, D, E, N, T i S; (f) X14izabrano iz grupe koju čine V, I, F, L, M, P, T i Y; (g) X15izabrano iz grupe koju čine I, L i Y; (h) X16izabrano iz grupe koju čine H, I, V, K, L, R, F, G, S i T; (i) X17izabrano iz grupe koju čine Y i H; i (j) X18izabrano iz grupe koju čine K, M, L, R i V.
[0015] U određenim primerima izvođenja, X9predstavlja L ili V, i/ili X10predstavlja T, X11predstavlja K il R, i/ili X12predstavlja S ili T, i/ili X13predstavlja K, G ili Q, i/ili X14predstavlja V ili I, i/ili X15predstavlja I, i/ili X16predstavlja H, I ili V, i/ili X17predstavlja Y i/ili X18predstavlja K ili M.
[0016] U drugim primerima izvođenja, FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32, u kojoj je (a) X25izabrano iz grupe koju čine I i V; (b) X26izabrano iz grupe koju čine F, D i Y; (c) X27izabrano iz grupe koju čine D i T; (d) X28izabrano iz grupe koju čine P, M, V i T; (e) X29izabrano iz grupe koju čine V, L, N, R i S; (f) X30izabrano iz grupe koju čine H, T, L, N, Q i S; (g) X31izabrano iz grupe koju čine F, W, Y, H i L; i (h) X32izabrano iz grupe koju čine D, A i G.
[0017] U određenim primerima izvođenja, X25predstavlja I, i/ili X26predstavlja F, i/ili X27predstavlja D, i/ili X28predstavlja P, i/ili X29predstavlja V, i/ili X30predstavlja H ili T, i/ili X31predstavlja F ili W, i/ili X32predstavlja D.
[0018] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata BC petlju i DE petlju, ili BC petlju i FG petlju, ili DE petlju i FG petlju, ili BC petlju, DE petlju I FG petlju.
[0019] U nekim primerima izvođenja, BC petlja polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 7-38. U drugim primerima izvođenja, DE petlja obuhvata aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39-45. Opet u drugim primerima izvođenja, FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 46-79. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca BC, DE, ili FG petlje je najmanje 80% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 7-38, 39-45, i 46-79, respektivno. U drugim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 80-123, 228-239, i 252-273. Opet u drugim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 80-123, 228-239, i 252-273.
[0020] U nekim primerima izvođenja, polipeptidi obuhvataju kombinacije BC, DE, i FG petlje kako je prikazano u tabeli 1. U jednom primeru izvođenja, polipeptid ima BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno.
[0021] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata BC, DE, i FG petlje kakve su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima izvođenja, BC petlja ima mainokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, u kojoj X33predstavlja T ili Y; X34predstavlja Y, N, R, F, G, S, ili T; X35predstavlja A, P, S, F, H, N, ili R; X36predstavlja A; X37predstavlja H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38predstavlja L, G, M, F, I, ili V; i X39predstavlja H.
[0022] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata BC, DE, i FG petlje kakve su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija. U nekim primerima izvođenja, DE petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X40, u kojoj X40predstavlja L.
[0023] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata BC, DE, i FG petlje kakve su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu FG petlja ima 12, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima izvođenja, FG petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, u kojoj X41predstavlja L ili I; X42predstavlja S; X43predstavlja K, R, A, G, S, H, N, T, ili P; X44predstavlja S, A, E, H, K, ili N; X45predstavlja K, Q, D, E, N, T, ili S; X46predstavlja V, I, F, L, M, P, ili T; X47predstavlja I ili Y;
X48predstavlja H, I, V, L, R, F, G, S, ili T; X49predstavlja H; i X50predstavlja M, L, R, ili V.
[0024] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, u kojoj BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativna aminokiselinska supstitucije, a DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija. U nekim primerima izvođenja, BC petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, u kojoj X33predstavlja T ili Y; X34predstavlja Y, N, R, F, G, S, ili T; X35predstavlja A, P, S, F, H, N, ili R; X36predstavlja A; X37predstavlja H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38predstavlja L, G, M, F, I, ili V; i X39predstavlja H, a DE petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X40, u kojoj X40predstavlja L.
[0025] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije, a FG petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima izvođenja, BC petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, u kojoj X33predstavlja T ili Y; X34predstavlja Y, N, R, F, G, S, ili T; X35predstavlja A, P, S, F, H, N, ili R; X36predstavlja A;
X37predstavlja H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38predstavlja L, G, M, F, I, ili V; i X39predstavlja H, a FG petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, u kojoj X41predstavlja L ili I; X42predstavlja S; X43predstavlja K, R, A, G, S, H, N, T, ili P; X44predstavlja S, A, E, H, K, ili N;
X45predstavlja K, Q, D, E, N, T, ili S; X46predstavlja V, I, F, L, M, P, ili T; X47predstavlja I ili Y;
X48predstavlja H, I, V, L, R, F, G, S, ili T; X49predstavlja H; i X50predstavlja M, L, R, ili V.
[0026] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu i DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija, a FG petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima izvođenja, DE petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X40, u kojoj X40predstavlja L, a FG petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, u kojoj X41predstavlja L ili I; X42predstavlja S; X43predstavlja K, R, A, G, S, H, N, T, ili P; X44predstavlja S, A, E, H, K, ili N;
X45predstavlja K, Q, D, E, N, T, ili S; X46predstavlja V, I, F, L, M, P, ili T; X47predstavlja I ili Y;
X48predstavlja H, I, V, L, R, F, G, S, ili T; X49predstavlja H; i X50predstavlja M, L, R, ili V.
[0027] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije, a DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija, a FG petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima izvođenja, BC petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, u kojoj X33predstavlja T ili Y; X34predstavlja Y, N, R, F, G, S, ili T; X35predstavlja A, P, S, F, H, N, ili R; X36predstavlja A;
X37predstavlja H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38predstavlja L, G, M, F, I, ili V; i X39predstavlja H; DE petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X40, u kojoj X40predstavlja L; a FG petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, u kojoj X41predstavlja L ili I; X42predstavlja S; X43predstavlja K, R, A, G, S, H, N, T, ili P; X44predstavlja S, A, E, H, K, ili N;
X45predstavlja K, Q, D, E, N, T, ili S; X46predstavlja V, I, F, L, M, P, ili T; X47predstavlja I ili Y;
X48predstavlja H, I, V, L, R, F, G, S, ili T; X49predstavlja H; a X50predstavlja M, L, R, ili V.
[0028] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, i ima aminokiselinske supstitucije u BC, DE, i FG petljama koje omogućavaju polipeptidu da održava vezivanje za miostatin. Takve aminokiselinske supstitucije mogu biti određene, npr., dubokim mutacionom skeniranjem kako je opisano u primeru 8. Saglasno tome, u nekim primerima izvođenja, polipeptid ima BC petlju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, u kojoj je: X51izabrano iz grupe koju čine A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X52izabrano iz grupe koju čine L, M, i V; X53izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, i Y; X54izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X55izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X56izabrano iz grupe koju čine G i S; X57izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X58izabrano iz grupe koju čine A, C, G, L, M, S, i T; i X59izabrano iz grupe koju čine A, C, F, H, N, P, Q, R, S, i Y. U poželjnom primeru izvođenja, X51je izabrano iz grupe koju čine C, F, I, S, V, W, i Y; X52izabrano iz grupe koju čine L; X53izabrano iz grupe koju čine P; X54izabrano iz grupe koju čine C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X55izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X56izabrano iz grupe koju čine G; X57izabrano iz grupe koju čine A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W, i Y; X58izabrano iz grupe koju čine A, G, L, M, i S; i X59izabrano iz grupe koju čine C, H, N, Q, S, i Y. U poželjnijem primeru izvođenja, X51izabrano iz grupe koju čine F, S, i W; X52izabrano iz grupe koju čine L; X53izabrano iz grupe koju čine P; X54izabrano iz grupe koju čine C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W, i Y; X55izabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, i Y; X56izabrano iz grupe koju čine G; X57izabrano iz grupe koju čine A, C, H, K, L, M, N, R, V, W, i Y; X58izabrano iz grupe koju čine A, G, i L; i X59izabrano iz grupe koju čine H, N, i Q. U konkretnom primeru izvođenja, X51S; X52predstavlja L;
X53predstavlja P; X54predstavlja H; X55predstavlja Q; X56predstavlja G; X57predstavlja K; X58predstavlja A; X59predstavlja N.
[0029] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata DE petlju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, u kojoj X60predstavlja A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T, i V. U poželjnom primeru izvođenja, X60predstavlja C, E, I, L, M, Q, T, i V. U poželjnijem primeru izvođenja, X60predstavlja C, E, I, L, M, i V. U konkretnom primeru izvođenja, X60predstavlja V.
[0030] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata FG petlju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, u kojoj je X61izabrano iz grupe koju čine A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W, i Y; X62izabrano iz grupe koju čine A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X63je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X64izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X65je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X66je izabrano iz grupe koju čine A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W, i Y; X67je izabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X68je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X69je izabrano iz grupe koju čine F, W, i Y; i X70je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y. U poželjnom primeru izvođenja, X61je izabrano iz grupe koju čine A, C, I, L, M, i V; X62izabrano iz grupe koju čine C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W, i Y; X63je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, i Y; X64je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X65je izabrano iz grupe koju čine A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y; X66je izabrano iz grupe koju čine C, F, I, L, M, P, T, V, W, i Y; X67je izabrano iz grupe koju čine C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, i Y; X68je izabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X69je izabrano iz grupe koju čine W i Y; i X70je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, i V. U poželjnijem primeru izvođenja, X61je izabrano iz grupe koju čine I i V; X62je izabrano iz grupe koju čine C, F, I, L, M, T, V, W, i Y; X63je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, i V; X64je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y; X65je izabrano iz grupe koju čine A, G, S, T, i W; X66je izabrano iz grupe koju čine F, I, V, W, i Y; X67je izabrano iz grupe koju čine F, H, I, L, M, V, W, i Y; X68je izabrano iz grupe koju čine A, C, F, G, I, K, L, M, T, V, i W; X69je izabrano iz grupe koju čine W i Y; i X70je izabrano iz grupe koju čine A, G, K, L, M, P, Q, i R. U konkretnom primeru izvođenja, X61predstavlja V; X62predstavlja T; X63predstavlja D; X64predstavlja T; X65predstavlja G; X66predstavlja Y; X67predstavlja L; X68predstavlja K; X69predstavlja Y; a X70predstavlja K.
[0031] U nekim primerima izvođenja, polipeptid ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje, pri čemu BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, pri čemu, X51je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X52je izabrano iz grupe koju čine L, M, i V; X53je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, i Y; X54predstavlja A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X55je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X56je izabrano iz grupe koju čine G i S; X57predstavlja A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X58predstavlja A, C, G, L, M, S, i T; i X59predstavlja A, C, F, H, N, P, Q, R, S, i Y; DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, u kojoj je X60izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T, i V; a FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, u kojoj je X61izabrano iz grupe koju čine A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W, i Y; X62predstavlja A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X63je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X64je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X65je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X66je izabrano iz grupe koju čine A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W, i Y; X67je izabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X68izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X69je izabrano iz grupe koju čine F, W, i Y; a X70je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y.
[0032] U poželjnom primeru izvođenja, polipeptid ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje, pri čemu BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, pri čemu je, X51izabrano iz grupe koju čine C, F, I, S, V, W, i Y; X52predstavlja L; X53predstavlja P;
X54izabrano iz grupe koju čine C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X55izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X56predstavlja G; X57izabrano iz grupe koju čine A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W, i Y; X58izabrano iz grupe koju čine A, G, L, M, i S; i X59izabrano iz grupe koju čine C, H, N, Q, S, i Y; DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, u kojoj X60izabrano iz grupe koju čine C, E, I, L, M, Q, T, i V; a FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, u kojoj je X61izabrano iz grupe koju čine A, C, I, L, M, i V; X62predstavlja C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W, i Y; X63je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, i Y; X64je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X65izabrano iz grupe koju čine A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y;
X66izabrano iz grupe koju čine C, F, I, L, M, P, T, V, W, i Y; X67izabrano iz grupe koju čine C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, i Y; X68je izabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X69je izabrano iz grupe koju čine W i Y; a X70je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y.
[0033] U poželjnijem primeru izvođenja, polipeptid ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje, pri čemu BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, pri čemu, X51je izabrano iz grupe koju čine F, S, i W; X52predstavlja L; X53predstavlja P; X54izabrano iz grupe koju čine C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W, i Y; X55je izabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, i Y; X56predstavlja G; X57je izabrano iz grupe koju čine A, C, H, K, L, M, N, R, V, W, i Y; X58je izabrano iz grupe koju čine A, G, i L; i X59je izabrano iz grupe koju čine H, N, i Q; DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, u kojoj je X60izabrano iz grupe koju čine C, E, I, L, M, i V; a FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, u kojoj je X61izabrano iz grupe koju čine I i V; X62predstavlja C, F, I, L, M, T, V, W, i Y; X63je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, i V; X64je izabrano iz grupe koju čine A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y; X65je izabrano iz grupe koju čine A, G, S, T, i W; X66je izabrano iz grupe koju čine F, I, V, W, i Y; X67je izabrano iz grupe koju čine F, H, I, L, M, V, W, i Y; X68je izabrano iz grupe koju čine A, C, F, G, I, K, L, M, T, V, i W; X69je izabrano iz grupe koju čine W i Y; i X70je izabrano iz grupe koju čine A, G, K, L, M, P, Q, i R.
[0034] U konkretnom primeru izvođenja, polipeptid ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje, pri čemu BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, u kojoj, X51predstavlja S; X52predstavlja L; X53predstavlja P; X54predstavlja H; X55predstavlja Q;
X56predstavlja G; X57predstavlja K; X58predstavlja A; X59predstavlja N; DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, u kojoj X60predstavlja V; a FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, u kojoj X61predstavlja V; X62predstavlja T; X63predstavlja D; X64predstavlja T; X65predstavlja G; X66predstavlja Y; X67predstavlja L; X68predstavlja K; X69predstavlja Y; a X70predstavlja K.
[0035] U drugom primeru izvođenja, polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 273 [PRD-1474], SEQ ID NO: 118 [3116 A06], SEQ ID NO: 281281 [sekvenca jezgra adnektina od PRD-1474 i 3116_A06 kojoj prethodi N-terminalna ekstenziona sekvenca (GVSDVPRDL) i praćena C-terminalnim repom (EI)], ili SEQ ID NO: 331 [sekvenca jezgra adnektina od PRD-1474 i 3116_A06 bez N-terminalne vodeće sekvence ili C-terminalnog repa]. Opet u drugom primeru izvođenja, polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu ne-BC, DE i FP regionima petlji SEQ ID NO: 118, 273, 281, ili 331.
[0036] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje za polipeptide koji se vezuju za isprekidano vezujuće mesto adnektina na miostatinu. U nekim primerima izvođenja, polipeptidi se vezuju za region unutar aminokiselina 55-66 miostatina (SEQ ID NO: 3). U nekim primerima izvođenja, polipeptidi vezuju se za region unutar aminokiselina 85-101 miostatina (SEQ ID NO: 3). U nekim drugim primerima izvođenja, polipeptidi se vezuju unutar dva regiona, aminokiseline 85-101 i 55-66, miostatina (SEQ ID NO: 3).
[0037] U nekim primerima izvođenja, polipeptidi ovog pronalaska ne ulaze u kompeticiju za vezivanje sa miostatinom sactRIIB. U nekim primerima izvođenja, polipeptidi ovog pronalaska ulaze u kompeticiju za vezivanje sa miostatinom sa ALK4 i/ili ALK5.
[0038] U nekim primerima izvođenja, prethodno opisane polipeptidi mogu da obuhvataju jednu ili više farmakokinetičkih (PK) grupa kao što je polietilen glikol, sijalinska kiselina, Fc, Fc fragment, transferin, serumski albumin, protein koji vezuje serumski albumin, i protein koji vezuje serumski imunoglobulin. U jednom primeru izvođenja, PK je protein koji vezuje serumski albumin koji obuhvata<10>Fn3 domen koji se vezuje za, na primer, HSA. U još jednom primeru izvođenja, PK grupa je Fc i može biti na bilo kom od N-ili C-terminusa polipeptida, i opciono formira dimer. U nekim drugim primerima izvođenja, PK grupa je polietilen glikol. U nekim primerima izvođenja, PK grupa i polipeptid su vezani putem najmanje jedne disulfidne veze, peptidne veze, polipeptida, polimernog šećera ili polietilen glikol grupe.
[0039] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata prethodno opisan polipeptid, koji je opciono bez endotoksina.
[0040] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira prethodno opisan polipeptid, ekspresioni vektor koji obuhvata nukleotidnu sekvencu, i ćeliju koja obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid. U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak proizvodnje anti-miostatin polipeptida uzgajanjem te ćelije.
1
[0041] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak ublažavanja ili inhibiranja sa miostatinom povezane bolesti ili poremećaja kod subjekta davanjem efektivne količine polipeptida ili kompozicije koja obuhvata prethodno opisan polipeptid. U nekim primerima izvođenja, bolest koja treba da se leči je distrofija mišića, amiotrofična lateralna skleroza, miozitis sa inkluzionim telašcima (IBM), kongestivna opstuktivna bolest pluća, hronično otkazivanje srca, kancer, SIDA, otkazivanje bubrega, hronična bolest bubrega, uremija, reumatoidni artritis, sarkopenija, gubljenje mišićne mase zbog produženog ležanja zbog bolesti, oštećenje kičmene moždine, šlog, prelom kosti, starenje, dijabetes, gojaznost, hiperglikemija, kaheksija, osteoartritis, osteoporoza, infarkt miokarda, ili fibroza.
[0042] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak ublažavanja ili inhibiranja poremećaja povezanog sa degeneracijom ili gubitkom mišića kod subjekta.
[0043] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak davanja polipeptida radi povećanja mišićne mase, povećanje broja mišićnih ćelija, povećanje veličine mišićnih ćelija, povećanje jačine mišića, fizičke performanse i/ili izdržljivosti kod subjekta.
[0044] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak ublažavanja ili inhibiranja metaboličkog poremećaja kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, metabolički poremećaj je dijabetes (npr., tip II dijabetes), hiperglikemija, hiperinsulinanemija, hiperlipidanemija, insulinska rezistencija, oslabljen metabolizam glikoze, lipodsitrofija, gojaznost, ili metabolički sindrom. U nekim primerima izvođenja, može se davati druga terapeutska kompozicija. U drugim primerima izvođenja, davanje polipeptida može dovesti do povećane osetljivosti na insulin, povećane apsorpcije glukoze od strane ćelija, smanjenih nivoa glukoze u krvi, i/ili smanjenih telesnih masnoća.
[0045] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za osnaživanje nemasne mišićne mase kod subjekta, koji obuhvata davanje efektivne količine polipeptida ili prethodno opisane kompozicije.
[0046] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za povećanje odnosa nemasne mišićna masa u odnosu na masnoće kod subjekta, koji obuhvata davanje efektivne količine polipeptida ili prethodno opisane kompozicije.
[0047] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje komplete koji obuhvataju polipeptid ili prethodno opisanu kompoziciju, i instrukcije za upotrebu.
[0048] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke detektovanja ili merenja miostatina u uzorku koji obuhvata dovođenje u kontakt tog uzorka sa prethodno opisanim polipeptidom, i detektovanje ili merenje vezivanja polipeptida sa miostatinom.
[0049] U drugom aspektu, ovaj pronalazak odnosi se na anti-vezivanje miostatin adnektina za upotrebu u ublažavanju ili inhibiranju sa miostatinom povezane bolesti ili poremećaja, ublažavanju ili inhibiranju poremećaja povezanog sa degeneracijom ili gubitkom mišića, povećavanju mišićne mase, povećavanju broja mišićnih ćelija, povećavanju veličine mišićnih ćelija, povećavanju jačine mišića, fizičke performanse i/ili izdržljivosti, ublažavanju ili inhibiranju metaboličkog poremećaja, ojačavanju nemasne mišićne mase, i/ili povećavanju odnosa nemasne mišićne mase u odnosu na masnoće, kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin-i mogu biti oni koji su ovde opisani, npr., anti-miostatin adnektini navedeni u SEQ ID NO: 80-123, 228-239, i 252-273.
[0050] U drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu anti-vezivanja miostatin adnektina za pripremu leka za ublažavanje ili inhibiranje sa miostatinom povezane bolesti ili poremećaja, ublažavanje ili inhibiranje poremećaja povezanog sa degeneracijom ili gubitkom mišića, povećavanje mišićne mase, povećavanje broja mišićnih ćelija, povećavanje veličine mišićnih ćelija, povećavanju jačine mišića, fizičke performanse i/ili izdržljivosti, ublažavanje ili inhibiranje metaboličkog poremećaja, ojačavanje nemasne mišićna masa, i/ili povećavanju odnosa nemasne mišićne mase u odnosu na masnoće, kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini su oni koji su ovde opisani, npr., anti-miostatin adnektini navedeni u SEQ ID NO: 80-123, 228-239, i 252-273.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0051]
Fig.1 prikazuje poravnavanje primernih anti-miostatin adnektin aminokiselinskih sekvenci.
Aminokiselinske sekvence BC, DE, i FG petlji identifikovane su podvlačenjem, zakošavanjem/podvlačenjem ili podebljavanjem/podvlačenjem, respektivno.
Fig.2 prikazuje WebLogo-baziranu analizu različitih ostataka BC petlje iz 1979_B06 familije antimiostatin adnektina. Označena je frekvencija aminokiselina u svakom položaju BC petlji koje variraju tokom PROfuzije. Slika je kreirana upotrebom WebLogo (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: A sequence logo generator. Genome Research 2004;14:1188-1190).
Fig.3 prikazuje WebLogo-baziranu analizu različitih ostataka DE petlje iz 1979_B06 familije antimiostatin adnektina. Označena je frekvencija aminokiselina u svakom položaju DE petlji koje variraju tokom PROfuzije.
Fig.4 prikazuje WebLogo-baziranu analizu različitih ostataka FG petlje iz 1979_B06 familije antimiostatin adnektina. Označena je frekvencija aminokiselina u svakom položaju FG petlji koje variraju tokom PROfuzije.
Fig.5 prikazuje WebLogo-baziranu analizu različitih ostataka BC petlje iz 2062_G02 familije antimiostatin adnektina. Označena je frekvencija aminokiselina u svakom položaju BC petlji koje variraju tokom PROfuzije.
Fig.6 prikazuje WebLogo-baziranu analizu različitih ostataka DE petlje iz 2062_G02 familije antimiostatin adnektina. Označena je frekvencija aminokiselina u svakom položaju DE petlji koje variraju tokom PROfuzije.
Fig.7 prikazuje WebLogo-baziranu analizu različitih ostataka FG petlje iz 2062_G02 familije antimiostatin adnektina. Označena je frekvencija aminokiselina u svakom položaju FG petlji koje variraju tokom PROfuzije.
Fig.8 prikazuje grafikon koji pokazuje vezu biohemijskih i podataka baziranih na ćelijama za diskretne alanin mutant proteine adnektina 3116_A06, sa njihovom relativnom sposobnošću u dubokom mutacionom skeniranju u skladu sa položajem sekvence.
Fig.9 prikazuje grafikon koji pokazuje vezu ER<norm>iz NGS duboko mutaciono skeniranja alanin mutacija adnektina 3116_A06 sa IC50 izmerenim pomoću HTRF. Označena su polja za poželjne, poželjnije, i najpoželjnije mutacije na jednom mestu za vezivanje sa miostatinom.
Fig.10 prikazuje grafikon ogleda kompetitivnog vezivanja (kompetitivna ELISA) koji prikazuje da adnektini PRD-1285, PRD-1286, i PRD-1288 ne blokiraju vezivanje miostatin za ActRIIb-Fc. Označen je % kompeticije ActRIIb-Fc vezivanja sa miostatinom. Kako je očekivano, pozitivbna kontrola ActRIIb-Fc konstrukt ulazi u kompeticiju sa ActRIIb-Fc vezivanjem sa miostatinom.
Fig.11 prikazuje grafikon koji pokazuje efekte raznih koncentracija adnektina PRD-1285, PRD-1286, i PRD-1288 na aktivnost miostatina u ARE-luciferaza ogledu. Eksperimentalni uslovi su kakvi su opisani u primeru 3. Svaki od PRD-1285, PRD-1286, i PRD-1288 inhibira 100% miostatin-indukovane ARE-luciferaza aktivnosti.
Fig.12 je šematski prikaz mehanizma dejstvovanja pomoću kojeg adnektini ovog pronalaska inhibiraju aktivnost miostatina. Nativni signalizacioni kompleks prikazan je na Fig.12A. Određenije, vezivanje miostatina sa ActRIIb praćeno je regrutovanjem aktivin receptor-slične kinaze 4 (ALK4) ili ALK5, i ActRIIb i ALK4/5 vezuju se za distinktivne regione miostatina. Adnektini ovog pronalaska sprečavaju vezivanje ALK4/5, ali ne ActRIIb, sa miostatinom (Fig.12B).
Fig.13 prikazuje komputacioni model koji prikazuje kompleks 3116_A06 i miostatina. Fig.13A prikazuje strukturu samog miostatina (sivo), označenimim ALK4 mestima vezivanja i ActRIIB mestima vezivanja. Regioni u kojima se 3116_A06 vezuje za miostatin (tj., Regioni 1 i 2) označeni su crnom bojom, kako je određeno iz eksperimenata opisanih u primeru 11. Fig.13B prikazuje poželjan kompleks 3116_A06 (crno) i miostatina (sivo) izveden iz protokola spajanja kako je opisano u primeru 12. Miostatin regioni 1 i 2 kakvi su identifikovani pomoću HDX-MS (Primer 11) prikazani su u ispunjenom prostoru samo sa jedne strane molekula, i BC, DE, i FG petlje 3116_A06 prikazane su u štapnom prikazu. Iako ova Fig. prikazuje jedan adnektin vezan za jedan od dva mesta vezivanja adnektina, treba napomenuti da bilo koje pojedinačno mesto vezivanja adnektina, ili oba mesta vezivanja adnektina, mogu biti zauzeta. Fig.14 prikazuje grafikon sa stubićima koji pokazuje procenat povećanja telesne mase na dan 15 kod miševa tretiranih označenim anti-miostatin adnektinima u poređenju sa kontrolnim miševima. B6 SCID miševi tretirani su ili svake druge nedelje ili svake nedelje subkutanim injekcijama anti-miostatin adnektina tokom 14 dana, kako je opisano u primeru 13. Telesne mase merene su tokom perioda
1
tretiranja; prikazane su izračunate vrednosti procentualne promene za dan 15. (*= označava statističke razlike od respektivne kontrolne grupe; p ≤ 0.01 t-test).
Fig.15 prikazuje grafikon sa stubićima koji pokazuje povećanja zapremine nožnog mišića (u cm<3>) na dan 15 kod miševa tretiranih označenim anti-miostatin adnektinima u poređenju sa kontrolnim miševima. B6 SCID miševi tretirani su ili svake druge nedelje ili svake nedelje subkutanim injekcijama anti-miostatin adnektina tokom 14 dana kako je opisano u primeru 13. (*= označava statističke razlike od respektivne kontrolne grupe; p ≤ 0.05 t-test).
Fig.16 prikazuje grafikon sa stubićima koji pokazuje povećanja zapremine nožnog mišića (u cm<3>) na dan 28 kod miševa tretiranih sa raznim označenim dozama PRD-1474. B6 SCID miševi tretirani su ili svake druge nedelje ili svake nedelje subkutanim injekcijama PRD-1474 tokom 28 dana kako je opisano u primeru 14. (*p< 0.0001; # beznačajno između grupa).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Definicije
[0052] Ukoliko nije drugačije naznačeno, svi tehnički i naučni pojmovi koji su ovde korišćeni, imaju isto značenje kakvo je uobičajeno poznato stručnjacima iz ove oblasti. Iako se u praksi ili ispitivanju ovog pronalaska mogu primeniti bilo koji postupci i kompozicije slične ili ekvivalentne onima koje su ovde opisane, ovde su opiasni poželjni postupci i kompozicije.
[0053] "Miostatin pune dužine" kako se ovde koristi odnosi se na polipeptidnu sekvencu pune dužine opisano u McPherron et al. (1997), iznad, kao i povezane polipeptide pune dužine koji uključuju alelne varijante i međuvrsne homologe. Pojam "miostatin" ili "zreli miostatin" odnosi se na fragmente biološki aktivnog zrelog miostatina, kao i povezanih polipeptida koji uključuju alelne varijante, varijante splajsovanja, i fuzione peptide i polipeptide. Prijavljeno je da zreli C-terminalni protein poseduje 100% sekvencioni identitet među mnogim vrstama koje uključuju čoveka, miša, kokošku, svinju, ćurk, i pacova (Lee et al., PNAS 2001;98:9306). Sekvenca za humani prepromiostatin je:
[0054] Sekvenca za humani pro-miostatin:
[0055] Sekvenca za zreli miostatin (sačuvan kod čoveka, glodara, pacova, kokoške, ćurke, psa, konja, i svinje) je:
[0056] "Polipeptid" kako se ovde koristi odnosi se na bilo koju sekvencu od dve ili više aminokiselina, bez obzira na dužinu, post-translacionu modifikaciju, ili funkciju. "Polipeptid," "peptid," i "protein" ovde se koriste naizmenično. Polipeptidi mogu da uključe prirodne aminokiseline i ne-prirodne aminokiseline kao što su one opisane u U.S. Pat. Br.6,559,126. Polipeptidi takođe mogu biti modifikovani na bilo koji od raznih standarnih hemijskih načina (npr., aminokiselina može biti modifikovana zaštitnom grupom; karboksi-terminalna aminokiselina može biti izvedena u terminalnoj amidnoj grupi; amino-terminalni ostatak može biti modifikovan sa grupama radi, npr., osnaživanja lipofiličnosti; ili polipeptid može biti hemijski glikolizovan ili drugačije modifikovan radi povećanja stabilnosti ili in vivo polu-života).
Modifikacije polipeptida mogu da uključe vezivanje druge strukture kao što je ciklično jedinjenje ili drugi molekul za polipeptid i takođe mogu da uključe polipeptide koji sadrže jednu ili više aminokiselina u izmenjenoj konfiguraciji (tj., R ili S; ili, L ili D). Peptidi ovog pronalaska su proteini izvedeni iz desetog domena tipa III fibronektina koji je modifikovan da se vezuje za miostatin i ovde su označeni kao, "antimiostatin adnektin" ili "miostatin adnektin."
[0057] "Polipeptidni lanac", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid u kojem je svaki od njegovih domena spojen sa drugim domenom(ima) peptidnom vezom(ama), nasuprot ne-kovalentnim interakcijama ili disulfidnim vezama.
[0058] "Izolovan" polipeptid je onaj koji je identifikovan i izdvojen i/ili izolovan iz komponente njegovog prirodnog okruženja. Kontaminirane komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi mogli da utiču na dijagnostičke ili ili terapeutske upotrebe polipeptida, i mogu da uključuju enzime, hormone, i drug proteinske ili neproteinske rastvorive materije. U poželjnim primerima izvođenja, polipeptid se prečišćava (1) do više od 95 mas.% polipeptida kako je određeno postupkom po Lowry-ju, i najpoželjnije više od 99 mas.%, (2) do stepen dovoljnog da se obezbede najmanje ostaci N-terminalne ili
1
internalne aminokiselinske sekvence upotrebom uređaja za sekvenciranje sa rotirajućom posudom, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukujućim ili neredukujućim uslovima upotrebom boje Coomassie blue ili, poželjno, srebrne. Izolovani polipeptid uključuje polipeptid in situ unutar rekombinantanne ćelije budući da najmanje jedna komponenta iz prirodnog okruženja polipeptida neće biti prisutna. Međutim, uobičajeno izolovani polipeptid će biti pripremljen najmanje jednom fazom prečišćavanja.
[0059] "Procenat (%) aminokiselinskog sekvencionog identiteta" ovde je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični aminokiselinskim ostacima u odabranoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalan procenat sekvencionog identiteta, pri čemu se ni jedna od konzervativnih supstitucija ne uzima u obzir kao deo sekvencionog identiteta. Poravnavanje u cilju određivanja procenta aminokiselinskog sekvencionog identiteta, može se postići na razne načine koji su unutar znanja stručnjaka iz ove oblasti, na primer, upotrebom javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ili Megalign (DNASTAR™) softver. Stručnjaci mogu lako da odrede pogodne parametre za merenje poravnavanja, koji uključuju bilo koje algoritme potrebne da se postigne maksimalno poravnavanje punom dužinom sekvence koja se poredi. Na primer, % aminokiselinskog sekvencionog identiteta date aminokiselinske sekvence A u, sa, ili naspram date aminokiselinske sekvence B (koja alternativno može biti frazirana kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili obuhvata određeni % aminokiselinskog sekvencionog identiteta u, sa, ili naspram date aminokiselinske sekvence B) izračunava se kako sledi: 100 puta frakcija X/Y u kojoj X je broj aminokiselinskih ostataka ocenjenih kao identična poklapanja pomoću programa za poravnavanje sekvenci ALIGN-2 u proavnavanju tog programa za A i B, i pri čemu je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B.
Podrazumeva se da tamo gde dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % aminokiselinskog sekvencionog identiteta za A do B neće biti jednak % aminokiselinskom sekvencionom identitetu za B do A.
[0060] Kako se ovde koristi, "konzervativna supstitucija" označava zamenu aminokiselinskog ostatka nekom drugom, bez menjanja ukupne konformacije i funkcije peptida, koje uključuju, ali se ne ograničavaju na, zamena aminokiselina sa onima sa sličnim osobinama (kao što je, na primer, polaritet, potencijal vezivanja vodonika, kiselost, baznost, oblik, hidrofobnost, aromatičnost, i slično).
Aminokiseline sa sličnim osobinama dobro su poznate u ovoj oblasti. Na primer, arginin, histidin i lizin su hidrofilno-bazne aminokiseline i mogu biti međusobno zamenljive. Slično, izoleucin, hidrofobna aminokiselina, može biti zamenjena leucinom, metioninom ili valinom. Neutralne hidrofilne aminokiseline, koje mogu biti supstituisane jedna drugom, uključuju asparagin, glutamin, serin i treonin. Pod "supstituisane"' ili "modifikovane" ovaj pronalazak uključuje one aminokiseline koje su izmenjene ili modifikovane od prirodnih aminokiselina. Na taj način, podrazumeva se da u kontekstu ovog
1
pronalaska, konzervativna supstitucija u struci se prepoznaje kao supstitucija jedne aminokiseline nekom drugom aminokiselinom koja ima slične osobine.
[0061] Kako se ovde koristi, pojam "mesto vezivanja adnektina" odnosi se na mesto ili deo proteina (npr., miostatin) koje reaguje ili se vezuje za određeni adnektin (npr., kao što je epitop prepoznat od strane antitela). Mesta vezivanja adnektina mogu biti formirana od skorišćeninih aminokiselina ili neskorišćeninih aminokiselina postavljenim jedna uz drugu tercijernim savijanjem proteina. Mesta vezivanja adnektina koja su formirana skorišćeninim aminokiselinama, tipično se zadržavaju na izlaganje denaturirajućim rastvaračima, pri lemu se mesta vezivanja adnektina formirana tercijernim savijanjem obično gube tokom tretiranja denaturirajućim rastvaračima.
[0062] Mesto vezivanja adnektina za anti-miostatin adnektin ovog pronalaska može se odrediti primenom standardnih tehnika koje se uobičajeno primenjuju za epitopno mapiranje antitela koje uključuju, ali se ne ograničavaju na, proteaza mapiranje i mutacionalna analiza. Alternativno, mesto vezivanja adnektina može se odrediti ogledom kompeticije upotrebom referentnog adnektina ili antitela koji se vezuje za isti polipeptid, npr., miostatin (kako je dalje opisano u nastavku u delu "adnektini koji unakrsno ulaze u kompeticiju i/ili adnektini koji se vezuju na istom mestu vezivanja adnektina." Ako test adnektin i referentni molekul (npr., još jedan adnektin ili antitelo) ulaze u kompeticiju, oni se tada vezuju na istom mestu vezivanja adnektina ili na mestima vezivanja adnektina dovoljno blizu tako da vezivanje jednog molekula utiče na drugo.
[0063] Pojmovi "specifično vezuje," "specifično vezivanje," "selektivno vezivanje," i "selektivno vezuje," kako se ovde naizmenično koriste, odnose se na adnektin koji pokazuje afinitet prema miostatinu, ali se ne vezuje u značajnoj meri (npr., manje od oko 10% vezivanja) za različiti polipeptid kako je izmereno tehnikom dostupnom u struci kao što je, ali se ne ograničava na, Scatchard analiza i/ili ogledi kompetitivnog vezivanja (npr., kompeticiona ELISA, BIACORE ogled). Pojam se takođe primenjuje kada je npr., domen vezivanja adnektina ovog pronalaska specifičan za miostatin.
[0064] Pojam "pre svega se vezuje" kako se ovde koristi odnosi se na situaciju u kojoj se adnektin ovog pronalaska vezuje za miostatin najmanje oko 20% više nego što se vezuje drugi polipeptid kako je izmereno pomoću tehnike dostupne u struci kao što je, ali se ne ograničava na, Scatchard analizu i/ili oglede kompetitivnog vezivanja (npr., kompeticiona ELISA, BIACORE ogled).
[0065] Kako se ovde koristi, pojam "unakrsna-reaktivnost" odnosi se na adnektin koji vezuje se za više od jednog distinktivnog proteina sa identičnim ili veoma sličnim mestima vezivanja adnektina.
[0066] Pojam "KD," kako se ovde koristi, namenjen je da označi konstantu ravnoteže disocijacije određene adnektin-protein (npr., miostatin) interakcije ili afiniteta adnektina za protein (npr., miostatin), kako je izmereno upotrebom ogled rezonance površinskog plazmona ili ogleda ćelijskog vezivanja. "Poželjna KD," kako se ovde koristi, odnosi se na KDadnektina koja je dovoljna za razmatrane svrhe. Na primer, poželjna KDmože da se odnosi na KDadnektina koja je potreba da ispolji funkcionalan
1
efekat u in vitro ogledu, npr., luciferaza ogled baziran na ćelijama.
[0067] Pojam "kass", kako se ovde koristi, namenjen je da označi konstantnu brzine asocijacije za asocijaciju adnektina u adnektin/protein kompleks.
[0068] Pojam "kdiss", kako se ovde koristi, namenjen je da označi konstantnu brzine disocijacije za disocijaciju adnektina iz adnektin/protein kompleksa.
[0069] Pojam "IC50", kako se ovde koristi, odnosi se na koncentraciju adnektina koja inhibira odgovor, ili u in vitro ili u in vivo ogledu, do nivoa koji je 50% maksimalnog inhibitornog odgovora, tj., polovina između maksimalnog inhibitornog odgovora i netretiranog odgovora.
[0070] Pojam "aktivnost miostatina" kako se ovde koristi odnosi se na jednu ili više rast-regulatornih ili morfogenetskih aktivnosti povezanih sa vezivanjem aktivnog miostatin proteina za ActRIIb i naknadno regrutovanje Alk4 ili Alk5. Na primer, aktivan miostatin je negativan regulator mase skeletnih mišića. Aktivan miostatin takođe može da moduliše proizvodnju mišić-specifičnih enzima (npr., kreatin kinaza), stimuliše mioblast proliferaciju, i moduliše predadipocitnu diferencijaciju u adipocite. Aktivnost miostatina može se odrediti upotrebom postupaka poznatih u struci, kao što su oni opisani ovde.
[0071] Izrazi "inhibiraju aktivnost miostatina" ili "antagonišu aktivnost miostatina" ili "antagonišu miostatin" koriste se naizmenično da označe sposobnost anti-miostatin adnektina ovog pronalaska da neutrališe ili antagoniše aktivnost miostatina in vivo ili in vitro. Pojmovi "inhibitira" ili "neutrališe" kako se ovde koriste u odnosu na aktivnost adnektina ovog pronalaska označavaju sposobnost da suštinski antagoniše, zabrani, spreči, ouzda, uspori, prekine, eliminiše, zaustavi, smanji ili preokrene npr., progresiju ili težinu onoga što se inhibira što uključuje, ali se ne ograničava na, biološku aktivnost ili osobinu, bolest ili stanje. Inhibicija ili neutralizacija poželjno je najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili veća.
[0072] Na primer, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska može da reguliše nivoe cirkulacije biološki aktivnog miostatina koji se uobičajeno nalazi kod kičmenjaka, ili redukuje nivoe cirkulacije biološki aktivnog miostatina kod subjekata sa poremećajima koji rezultuju u povišenim nivoima cirkulacije miostatina. Redukcija aktivnosti miostatina može se odrediti upotrebom in vitro ogleda, npr., ogledima vezivanja, kakvi su ovde opisani. Alternativno, redukcija u aktivnosti miostatina može da rezultuje kao povećanje telesne mase, osnažena mišićna masa, povećana jačina mišića, promena u odnosu mišić prema masnoća, povećanje bezmasne mišićne mase, povećanje veličine i/ili broja mišićnih ćelija, i/ili redukcija masnoće u sadržaju tela.
[0073] Pojam "PK" je akronim za "farmakokinetički" i obuhvata osobine jedinjenja koje uključuju, na primer, apsorpciju, distribuciju, metabolizam, i eliminaciju od strane subjekta. "PK modulacioni protein" ili "PK grupa" kako se ovde koristi odnosi se na bilo koji protein, peptid, ili grupu koja utiče na farmakokinetičke osobine biološki aktivnog molekula koji se fuzioniše ili daje zajedno sa biološki aktivnim molekulom. Primeri PK modulacionog proteina ili PK grupe uključuju PEG, veziva humanog
1
serumskog albumina (HSA) (kako je opisano u U.S. objavama Br. 2005/0287153 i 2007/0003549, PCT objavama br. WO 2009/083804 i WO 2009/133208), human serumski albumin, Fc ili Fc fragmente i njegove varijante, i šećere (npr., sijalinska kiselina).
[0074] "Polu-život" aminokiselinske sekvence ili jedinjenje generalno može biti definisan kao vreme koje tokom kojeg je koncentracija polipeptida u serumu redukovana za 50%, in vivo, na primer zbog degradacije sekvence ili jedinjenje i/ili klirensa ili sekvestracije sekvence ili jedinjenja prirodnim mehanizmima. Polu-život se može odrediti na bilo koji način poznat per se, kao što je farmakokinetičkom analizom. Pogodne tehnike su jasne stručnjaku iz ove oblasti, i mogu na primer generalno da uključe faze pogodnog davanja subjektu pogodne doze aminokiselinske sekvence ili jedinjenja ovog pronalaska; sakupljanje krvnih uzoraka ili drugih uzoraka od subjekta u regularnim intervalima; određivanje nivoa ili koncentracije aminokiselinske sekvence ili jedinjenja ovog pronalaska u pomenutom krvnom uzorku; i izračunavanje, iz (grafikona) ovako dobijenih podataka, vremena do kojeg su nivo ili koncentracija aminokiselinske sekvence ili jedinjenje ovog pronalaska redukovani za 50% u poređenju sa inicijalnim nivoom nakon doziranja. Referentno je, na primer, izraditi standardne priručnike, kao što je Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists i Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996). Takođe se može pozvati na Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2-go Rev. Izdanje, Marcel Dekker (1982).
[0075] Polu-život može biti izražen upotrebom parametara kao što su t1/2-alfa, t1/2-beta, HL_Lambda_z, i oblast ispod krive (AUC). U ovoj specifikaciji, "povećanje polu-života" odnosi se na povećanja bilo kog od ovih parametara, bilo koja dva od ovih parametara, bilo koja tri od ovih parametara ili sva četiri od ovih parametara. "Povećanje polu-života" određenije se odnosi na povećanje t1/2-beta, i/ili HL_Lambda_z, ili sa ili bez povećanja t1/2-alfa i/ili AUC ili oba.
[0076] Oznake "mpk", "mg/kg", ili "mg po kg" odnose se na miligrame po kilogramu. Sve oznake se koriste naizmenično kroz ceo opis pronalaska.
[0077] Pojmovi "pojedinac," "subjekat," i "pacijent," koji se ovde koriste naizmenično, označavaju životinju, poželjno sisara (koji uključuju neprimate i primate) ili ptičije vrste, koje uključuju, ali se ne ograničavaju na, glodare, majmune, ljude, sisarske domaće životinje (npr., goveda, svinje, ovce), sisarske sportske životinje (npr., konji), i sisarske ljubimce (npr., pse i mačke); poželjno pojam se odnosi na ljude. Pojam se takođe odnosi na ptičije vrste, koje uključuju, ali se ne ograničavaju na, kokoške i ćurke. U određenom primeru izvođenja, subjekat, poželjno sisar, poželjno čovek, dalje je okarakterisan bolešću ili poremećajem ili stanjem koje se poboljšava smanjenjem nivoa ili smanjenjem bioaktivnosti miostatina. U još jednom primeru izvođenja subjekat, poželjno sisar, poželjno čovek, dalje je okarakterisan kao neko ko je u riziku od razvijanja poremećaja, bolesti ili stanja koje se poboljšava smanjenjem nivoa miostatina ili smanjenjem bioaktivnosti miostatina.
1
[0078] Pojam "terapeutski efektivna količina" odnosi se na najmanje minimalnu dozu, ali manju od toksične doze, agensa koja je potrebna da se obezbedi terapeutsko poboljšanje kod subjekta. Na primer, terapeutski efektivna količina anti-miostatin adnektina ovog pronalaska je neka količina koja kod sisara, poželjno ljudi, rezultuje u jednom ili više od sledećeg: povećanje mišićne zapremine i/ili jačine mišića, smanjenje masnoće u telu, povećanje osetljivosti na insulin, ili lečenje stanja kod kojih prisustvo miostatina izaziva ili doprinosi nepoželjni patološki efekat ili smanjenje nivoa miostatina rezultuje u dobrobitnom terapeutskom efektu.
[0079] Pojam "slab" ili "slabost" kako se ovde koristi odnosi se na stanje koje može biti okarakterisano putem dva ili više simptoma između malaksalosti, gubitka mase, usporene pokretljivosti, zamora, niskih nivoa aktivnosti, slabe izdržljivosti, i oslabljenog bihavioralnog odgovora snezorne znake. Jedan od prepoznatljivih znakova slabosti je "sarkopenija," ili gubitak mišićne mase povezan sa starenjem.
[0080] Pojam "kaheksija" kako se ovde koristi odnosi se na stanje ubrzanog gubljenja mišićne mase i gubitak nemasne telesne mase koja rezultuje iz raznih bolesti.
Pregled
[0081] Ovaj pronalazak obezbeđuje nove polipeptide koji se vezuju za i antagonišu miostatin (ovde označeni kao "anti-miostatin adnektini"). Kako bi se identifikovali miostatin antagonisti, miostatin je stavljen pred velike sintetičke biblioteke adnektina. Adnektini koji su vezani sa miostatinom skrinovani su na vezivanje miostatina, na biofizičke osobine, i na miostatin inhibitornu aktivnost. Anti-miostatin adnektini su mutirani i podvrgnuti daljem selektivnom pritisku snižavanjem ciljane koncentracije i biranjem anti-miostatin adnektina sa niskim brzinama oslobađanja. Iz ovih optimizacionih postupaka, familija adnektina identifikovana je kao miostatin specifični inhibitori sa poželjnom biohemijskom i biofizičkom aktivnošću. Anti-miostatin adnektini opisani u ovom pronalasku, korisni su za lečenje poremećaja, bolesti, i stanja kod kojih je poznato da inhibicija miostatina aktivnost donosi dobrobit, što uključuje, ali se ne ograničava na, lečenje bolesti gubljenja mišićne mase, metaboličkih poremećaja, i atrofije mišića zbog neaktivnosti.
[0082] Kako je opisano u Rebbapragada et al. (MCB 2003;23:7230-42), putanja signaliziranja miostatin uključuje vezivanje miostatina sa ActRIIb, praćeno regrutovanjem aktivin receptor-slične kinaze 4 (ALK4) ili ALK5. Vezivanje sa ALK indukuje Smad2/Smad3 fosforilaciju, praćenu aktivacijom TGFβ-slične putanje signaliziranja (videti, npr., Rebbapragada et al., MCB 2003;23:7230-42).
I. Skafoldi na bazi fibronektina
[0083] Jedan aspekat ovog pronalaska obezbeđuje anti-miostatin adnektin-e koji obuhvataju Fn3 domen u kojem je jedna ili više petlji dostupnih rastvaraču randomizovana ili mutirana. U nekim primerima
2
izvođenja, Fn3 domen je Fn3 domen izveden iz divljeg tipa desetog modula humanog domena fibronektinskog tipa III (<10>Fn3):
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTAT ISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 4) (BC, DE, i FG petlje su podvučene).
[0084] U drugim primerima izvođenja, ne-ligand vezujuće sekvence od<10>Fn3, tj., "<10>Fn3 skafolda", mogu biti izmenjene pod uslovom da<10>Fn3 zadrži ligand vezujuću funkciju i/ili stukturalne stabilnosti.
Prijavljeni su različiti mutirani<10>Fn3 skafoldi. U jednom aspektu, jedna ili više od Asp 7, Glu 9, i Asp 23 zamenjena je nekom drugom aminokiselinom, kao što je, na primer, ne-negativno nalektrisani aminokiselinski ostatak (npr., Asn, Lys, itd.). Prijavljeno je da ove mutacije imaju efekat promovisanja veće stabilnosti od mutanta<10>Fn3 pri neutralnoj pH u poređenju sa oblikom divljeg tipa (videti, npr., PCT objava br. WO 02/04523). Opisane su različite dodatne alteracije u<10>Fn3 skafoldu koje su ili dobrobitne ili neutralne. Videti, na primer, Batori et al., Protein Eng., 15(12):1015-1020 (Decembar 2002); Koide et al., Biochemistry, 40(34):10326-10333 (Aug.28, 2001).
[0085] I varijanta i divlji tip<10>Fn3 proteina okarakterisani su istom strukturom, određenije sa sedam beta-lančanih domenskh sekvenci označenim sa A do G i šest petlji regiona (AB petlja, BC petlja, CD petlja, DE petlja, EF petlja, i FG petlja) koje spajaju sedam beta-lančane domen sekvence. Beta lanci postavljeni najbliže N- i C-terminusima, mogu da usvoje beta-sličnu konformaciju u rastvoru. U SEQ ID NO:4, AB petlja odgovara ostacima 15-16, BC petlja odgovara ostacima 21-30, CD petlja odgovara ostacima 39-45, DE petlja odgovara ostacima 51-56, EF petlja odgovara ostacima 60-66, i FG petlja odgovara ostacima 76-87 (Xu et al., Chemistry & Biology, 9:933-942, 2002).
[0086] Saglasno tome, u nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin je<10>Fn3 polipeptid koji je najmanje 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, ili 90% identičan humanom<10>Fn3 domenu, prikazano u SEQ ID NO:4. Mnoge varijabilnosti generalno se javljaju u jednoj ili više petlji. Svaki od beta ili beta-sličnih lanaca<10>Fn3 polipeptida mogu suštinski da se sastoje od aminokiselinskih sekvenci koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identične sekvenci odgovarajućeg beta ili beta-sličnog lanca od SEQ ID NO:4, pod uslovom da takve varijacije ne utiču na stabilnost polipeptida u fiziološkim uslovima.
[0087] U nekim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-miostatin adnektin koji obuhvata deseti domen fibronektinskog tipa III (<10>Fn3), pri čemu<10>Fn3 domen obuhvata petlju, AB; petlju, BC; petlju, CD; petlju, DE; petlju EF; i petlju FG; a ima najmanje jednu petlju izabranu od petlje BC, DE i FG sa izmenjenom aminokiselinskom sekvencom u odnosu na sekvencu odgovarajuće petlje iz humanog<10>Fn3 domena. U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska obuhvataju<10>Fn3 domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu ne-petlja regionima od SEQ ID NO:4, u kojem je najmanje jedna petlja izabrana od BC, DE, i FG petlje je izmenjena. U nekim primerima izvođenja, BC i FG petlje su izmenjene, a u nekim primerima izvođenja, BC, DE i FG petlje su izmenjene tj.,<10>Fn3 domeni obuhvataju ne-prirodne petlje. U nekim primerima izvođenja, AB, CD i/ili EF petlje su izmenjene. Pod "izmenjenim" podrazumeva se jedna ili više alteracija aminokiselinskih sekvenci u odnosu na šablon sekvencu (odgovarajući humani fibronektinski domen) i uključuje aminokiselinska dodavanja, brisanja, supstitucije ili njihove kombinacije. Menjanje aminokiselinske sekvence može se postići namernim, slepim ili spontanim variranjem sekvence, generalno nukleinske kiseline koja kodira sekvence, i mogu se javiti bilo kojom tehnikom, na primer, PCR, PCR sklona greškama, ili hemijska DNK sinteza.
[0088] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više petlji odabranih od BC, DE, i FG mogu biti produžene ili skraćene u dužini u odnosu na odgovarajuću humanu fibronektinsku petlju. U nekim primerima izvođenja, dužina petlje može biti proširena za 2-25 aminokiselina. U nekim primerima izvođenja, dužina petlje može biti skraćena za 1-11 aminokiselina. Na taj način, da bi se optimizovalo antigen vezivanje, dužina petlje<10>Fn3 može biti izmenjena u dužini kao i u sekvenci kako bi se obezbedila najveća moguća fleksibilnost i afinitet u antigen vezivanju.
[0089] U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata Fn3 domen koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 80, 85, 90, 95, 98, 99, ili 100% identičnu ne-petlja regionima od SEQ ID NO: 4, pri čemu je izmenjena najmanje jedna petlja izabrana od BC, DE, i FG. U nekim primerima izvođenja, izmenjena BC petlja ima do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija, do 1, 2, 3, ili 4 aminokiselinske delecije, do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih umetanja, ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, izmenjena DE petlja ima do 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih supstitucija, do 1, 2, 3, ili 4 aminokiselinske delecije, do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ili 13 aminokiselinskih umetanja, ili njihovu kombinaciju. U nekim primerima izvođenja, FG petlja ima do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 aminokiselinskih supstitucija, do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili 11 aminokiselinskih delecija, do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ,17 ,18 ,19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 aminokiselinskih umetanja, ili njihovu kombinaciju.
[0090] Anti-miostatin adnektini ovog pronalaska su na bazi<10>Fn3 skafolda i definisani su generalno sledećom sekvencom:
EVVAAT(Z)aSLLI(Z)xYYRITYGE(Z)bQEFTV(Z)yATI(Z)cDYTITVYAV(Z)zISINYRT (SEQ ID NO: 5),
pri čemu AB petlja predstavljena je sa (Z)a, CD petlja predstavljena je sa (Z)b, EF petlja predstavljena je sa(Z)e, BC petlja predstavljena je sa (Z)x, DE petlja predstavljena je sa (Z)y, i FG petlja predstavljena je sa (Z)z. Z predstavlja bilo koju aminokiselinu, a indeks koji sledi iza Z predstavlja okrugli broj aminokiselina. Određenije, a može biti bilo gde od 1-15, 2-15, 1-10, 2-10, 1-8, 2-8, 1-5, 2-5, 1-4, 2-4, 1-3, 2-3, ili 1-2 aminokiselina; i b, c, x, y, i z mogu svaki nezavisno biti bilo gde od 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-15, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, ili 6-7 aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, a je 2 aminokiseline, b je 7 aminokiselina, c je 7 aminokiselina, x je 11 aminokiselina, y je 6 aminokiselina, a z je 12 aminokiselina. Sekvence beta lanaca mogu imati bilo gde od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 do 4, od 0 do 3, od 0 do 2, ili od 0 do 1 supstitucije, brisanja ili dodavanja među svih 7 skafold regiona u odnosu na odgovarajuće aminokiseline prikazane u SEQ ID NO: 4. U određenim primerima izvođenja, sekvence beta lanaca mogu imati bilo gde od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 do 4, od 0 do 3, od 0 do 2, ili od 0 do 1 konzervativne supstitucije među svih 7 skafold regiona u odnosu na odgovarajuće aminokiseline prikazane u SEQ ID NO: 4. U određenim primerima izvođenja, aminokiselinski ostaci jezgra su fiksirani i bilo koje supstitucije, konzervativne supstitucije, brisanja ili dodavanja javljaju se na ostacima koji se razlikuju od aminokiselinskih ostataka jezgra.
[0091] Alternativno, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska su na bazi<10>Fn3 skafolda i generalno su definisani sekvencom:
u kojoj je BC petlja predstavljena sa (Z)x, DE petlja predstavljena je sa (Z)y, i FG petlja predstavljena je sa (Z)z. Z predstavlja bilo koju aminokiselinu, a indeks koji sledi iza Z predstavlja okrugli broj aminokiselina. Određenije, x, y i z svako nezavisno mogu biti bilo gde od 2-20, 2-15, 2-10, 2-8, 5-20, 5-15, 5-10, 5-8, 6-20, 6-10, 6-8, 2-7, 5-7, ili 6-7 aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, x je 11 aminokiselina, y je 6 aminokiselina, i z je 12 aminokiselina. Sekvence beta lanaca mogu imati bilo gde od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 do 4, od 0 do 3, od 0 do 2, ili od 0 do 1 supstitucije, brisanja ili dodavanja među svih 7 skafold regiona u odnosu na odgovarajuće aminokiseline prikazane u SEQ ID NO: 1. U određenim primerima izvođenja, sekvence beta lanaca mogu imati bilo gde od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 do 4, od 0 do 3, od 0 do 2, ili od 0 do 1 konzervativne supstitucije među svih 7 skafold regiona u odnosu na odgovarajuće aminokiseline prikazane u SEQ ID NO: 4. U određenim primerima izvođenja, aminokiselinski ostaci jezgra su fiksirani i bilo koje supstitucije, konzervativna supstitucije, brisanja ili dodavanja javljaju se na ostacima koji se razlikuju od aminokiselinskih ostataka jezgra.
[0092] U određenim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin opisan ovde može da obuhvata sekvencu kakva je prethodno navedena u SEQ ID NO: 5 ili 6, u kojoj je najmanje jedna od BC, DE, i FG petlje predstavljene sa (Z)x, (Z)y, i (Z)z, respektivno, su izmenjene. Kako je prethodno opisano, aminokiselinski ostaci koji odgovaraju ostacima 21-30, 51-56, i 76-87 od SEQ ID NO: 4 definišu BC, DE, i FG petlje, respektivno. Međutim, treba shvatiti da ne mora svaki ostatak unutar regiona petlje da bude modifikovan kako bi se postiglo<10>Fn3 vezivo sa snažnim afinitetom ka poželjnnoj meti (npr., miostatin).
[0093] Na primer, ostaci 21 (S) i 22 (W) BC petlje kakvi su prikazani u SEQ ID NO: 1 ne moraju biti modifikovani za vezivanje sa miostatinom. To jest,<10>Fn3 domeni sa visokim afinitetom vezivanja za miostatin mogu se dobiti modifikovanjem samo ostataka 23-30 petlje BC kako je prikazano u SEQ ID NO: 4. Ovo je prikazano u BC petljama datim kao primer u tabeli 1, što označava da su samo podvučeni položaji modifikovani.
2
[0094] Slično, položaji 51 (P) i 56 (T) petlje DE kako je prikazano u SEQ ID NO: 4 ne moraju biti modifikovani za vezivanje miostatina. To jest,<10>Fn3 domeni sa visokim afinitetom vezivanja za miostatin mogu se dobiti modifikovanjem samo ostataka 52-55 petlje DE kako je prikazano u SEQ ID NO: 4. Ovo je prikazano u DE petljama datim kao primer u tabeli 1, što označava da su samo ostaci ispod podvučenog položaja izmenjeni.
[0095] Slično tome, položaji 76 (T) i 87 (P) FG petlje kako je prikazano u SEQ ID NO: 1 ne moraju biti modifikovani za vezivanje miostatina. To jest,<10>Fn3 domeni sa visokim afinitetom vezivanja za miostatin mogu se dobiti modifikovanjem samo ostataka 77-86 petlje FG kako je prikazano u SEQ ID NO: 4. Ovo je prikazano u FG petljama datim kao primer u tabeli 1, da su samo ostaci ispod podvučenog položaja izmenjeni.
[0096] Saglasno tome, u nekim načinima ostvarivanja, regioni BC, DE, i FG petlja anti-miostatin adnektina prema ovom pronalasku mogu biti opisani u skladu sa konsenzus sekvencama. Ove konsenzus sekvence predstavljene kao BC, DE, i FG petlje prikazane su u tabeli 1, i kako je određeno WebLogo analizom (Fig.2-7) (Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE. WebLogo: A sequence logo generator. Genome Research 2004;14:1188-1190). WebLogo analiza generiše aminokiselinski potppredstavlja Koji utiče na frekvenciju aminokiseline u svakom izmenjenom položaju BC, DE, ili FG petlje.
[0097] Na primer, u nekim ovde opisanim primerima izvođenja, BC petlja, (Z)x, je definisana konsenzus sekvencom X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, u kojoj, X1je S, T ili Y; X2je H, Y, N, R, F, G, S ili T; X3je A, P, Q, S, F, H, N ili R; X4je G ili A; X5H, L, R, V, N, D, F, I ili K; X6je A, L, G, M, F, I ili V; i X7je H ili N. U određenom poželjnom primeru izvođenja ovde opisanim anti-miostatin adnektinima, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34, i 36-38. U jednom primeru izvođenja polipeptida ovog pronalaska, BC petlja obuhvata aminokiselinu navedenu u SEQ ID NO: 34.
[0098] U nekim primerima izvođenja, DE petlja, (Z)y, je definisana konsenzus sekvencom G-R-G-X8, u kojoj X8je V ili L. U određenim ovde opisanim anti-miostatin adnektinima, DE petlja obuhvata aminokiselinu odabranu od SEQ ID NO: 39 i 42. U jednom primeru izvođenja polipeptida ovog pronalaska, DE petlja obuhvata aminokiselinu navedenu u SEQ ID NO: 39.
[0099] U nekim primerima izvođenja, FG petlja, (Z)z, je definisan konsenzus sekvencom X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, u kojoj X9je L, V ili I; X10je T ili S; X11je K, R, A, G, S, D, H, N, T ili P; X12je S, T, A, E, H, K ili N; X13je K, G, Q, D, E, N, T ili S; X14je V, I, F, L, M, P, T ili Y; X15je I, L ili Y; X16je H, I, V, K, L, R, F, G, S ili T; X17je Y ili H; i X18je K, M, L, R ili V. U određenim poželjnim primerima izvođenja, FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 46, 50-62, 64-72, 75-77, i 79. U jednom primeru izvođenja, FG petlja obuhvata aminokiselinu navedenu u SEQ ID NO: 75.
[0100] U drugim primerima izvođenja, BC petlja, (Z)x, je definisana konsenzus sekvencom X19-X20-P-X21-G-X22-A, u kojoj X19je D, E, V ili W; X20je A, S ili V; X21je R, A, G, K ili L; i X22je L ili R. U određenim poželjnim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 8-10, 22, 32, 33, i 35.
[0101] U drugim primerima izvođenja, DE petlja, (Z)y, je definisana konsenzus sekvencom X23-G-R-G-X24, u kojoj X23je V, P, F, I ili L; i X24je S, N ili T. U određenim poželjnim primerima izvođenja, DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 40, 41, i 43-45.
[0102] U drugim primerima izvođenja, FG petlja, (Z)z, je definisana konsenzus sekvencom X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X31-X32, u kojoj X25je I ili V; X26je F, D ili Y; X27je D ili T; X28je P, M, V ili T; X29je V, L, N, R ili S; X30je H, T, L, N, Q ili S; X31je F, W, Y, H ili L; i X32je D, A ili G. U određenim poželjnim primerima izvođenja, FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 47-49, 63, 73, 74, i 78.
[0103] Saglasno tome, u određenim primerima izvođenja ovaj pronalazak obezbeđuje anti-miostatin adnektin koji obuhvata BC petlju, (Z)x, sa sekvencom X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7i DE petlju, (Z)y, sa sekvencom G-R-G-X8, kakva je prethodno definisana. U određenim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34, i 36-38, i DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 39 i 42. U jednom primeru izvođenja, BC i DE petlje obuhvataju aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 34 i 39, respektivno.
[0104] U određenim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata BC petlju, (Z)x, sa sekvencom X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7i FG petlju, (Z)z, sa sekvencom X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, kakva je prethodno definisana. U određenim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34, i 36-38, i FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 46, 50-62, 64-72, 75-77, i 79. U jednom primeru izvođenja, BC i FG petlje obuhvataju aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 34 i 75, respektivno.
[0105] U određenim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata DE petlju, (Z)y, sa sekvencom G-R-G-X8i FG petlju, (Z)z, sa sekvencom X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, kakva je prethodno definisana. U određenim primerima izvođenja, DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 39 i 42, i FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 46, 50-62, 64-72, 75-77, i 79. U jednom primeru izvođenja, DE i FG petlje obuhvataju aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 39 i 75, respektivno.
[0106] U određenim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata BC petlju, (Z)x, sa sekvencom X1-L-P-X2-X3-X4-X5-X6-X7, DE petlju, (Z)y, sa sekvencom G-R-G-X8i FG petlju, (Z)z, sa sekvencom X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, kakva je prethodno definisana. U određenim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 7, 11-21, 23-31, 34, i 36-38, DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 39 i 42, i FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 46, 50-62, 64-72, 75-77, i 79. U jednom primeru izvođenja, BC, DE, i FG petlje obuhvataju aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno.
2
[0107] U drugim primerima izvođenja, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-miostatin adnektin koji obuhvata obuhvata BC petlju, (Z)x, sa sekvencom X19-X20-P-X21-G-X22-A i DE petlju, (Z)y, sa sekvencom X23-G-R-G-X24, kakva je prethodno definisana. U određenim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 8-10, 22, 32, 33, i 35 i DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 40, 41, i 43-45.
[0108] U drugim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata BC petlju, (Z)x, sa sekvencom X19-X20-P-X21-G-X22-A i FG petlju, (Z)z, sa sekvencom X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, kakva je prethodno definisana. U određenim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 8-10, 22, 32, 33, i 35 i FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 47-49, 63, 73, 74, i 78.
[0109] U drugim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata DE petlju, (Z)y, sa sekvencom X23-G-R-G-X24i FG petlju, (Z)z, sa sekvencom X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, kakva je prethodno definisana. U određenim primerima izvođenja, DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 40, 41, i 43-45 i FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 47-49, 63, 73, 74, i 78.
[0110] U drugim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata BC petlju, (Z)x, sa sekvencom X19-X20-P-X21-G-X22-A, obuhvata DE petlju, (Z)y, sa sekvencom X23-G-R-G-X24i FG petlju, (Z)z, sa sekvencom X25-X26-R-X27-G-X28-X29-X30-X30-X32, kakva je prethodno definisana. U određenim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 8-10, 22, 32, 33, i 35, DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 40, 41, i 43-45, i FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 47-49, 63, 73, 74, i 78.
[0111] U određenim poželjnim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 5 ili 6, u kojoj su BC, DE i FG petlje kakve su predstavljene sa (Z)x, (Z)y, i (Z)z, respektivno, zamenjene respektivnim skupom BC, DE, i FG petlji sa konsenzus sekvencama od SEQ ID NO: 7-38, 39-45, i 46-79, respektivno.
[0112] U drugim poželjnim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 5 ili 6, u kojoj su BC, DE i FG petlje kakve su predstavljene sa (Z)x, (Z)y, i (Z)z, respektivno, zamenjene respektivnim skupom BC, DE, i FG petlji sa sekvence najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičnih BC, DE ili FG petljama sekvence klonova navedenih u tabeli 1.
[0113] U primernim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin kakav je ovde opisan je definisan pomoću SEQ ID NO: 5 i ima respektivan skup BC, DE i FG petlji sekvence iz bilo kojih klonova navedenih u tabeli 1. Na primer, klon 1979_B06 u tabeli 1 obuhvata BC, DE, i FG petlje kakve su navedene u SEQ ID NO: 7, 39, i 46, respektivno. Na taj način, anti-miostatin adnektin baziran na ovim petljama može da obuhvata SEQ ID NO: 5 ili 6, u kojem (Z)xobuhvata SEQ ID NO: 7, (Z)yobuhvata SEQ ID NO: 39, i (Z)z
2
obuhvata SEQ ID NO: 46. Slični konstrukti su razmatrani koristeći skup BC, DE i FG petlji iz drugih klonova u tabeli 1, ili konsenzus sekvenci od SEQ ID NO: 7-38, 39-45, i 46-79, respektivno. Skafold regioni takvih anti-miostatin adnektina mogu da obuhvataju bilo gde od 0 do 20, od 0 do 15, od 0 do 10, od 0 do 8, od 0 do 6, od 0 do 5, od 0 do 4, od 0 do 3, od 0 do 2, ili od 0 do 1 supstitucije, konzervativne supstitucije, brisanja ili dodavanja u odnosu na skafold aminokiseline ostataka od SEQ ID NO: 4. Takve skafold modifikacije mogu biti izrađene, dokle god je anti-miostatin adnektin sposoban da veže miostatin sa poželjnom KD.
[0114] U poželjnim primerima izvođenja, BC petlja anti-miostatin adnektina ovog pronalaska obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine: SWSLPHAGHVN (SEQ ID NO: 7), SWVSPRGRAR (SEQ ID NO: 8), SWEVPRGLAR (SEQ ID NO: 9), SWWAPLGLAR (SEQ ID NO: 10), SWTLPHAGLAH (SEQ ID NO: 11), SWYLPYPAHMN (SEQ ID NO: 12), SWSLPFAGHLN (SEQ ID NO: 13), SWSLPYSGLAN (SEQ ID NO: 14), SWSLPHAGHAH (SEQ ID NO: 15), SWTLPNFGLIN (SEQ ID NO: 16), SWTLPHAGRAH (SEQ ID NO: 17), SWSLPYAGHLN (SEQ ID NO: 18), SWSLPYAAHMN (SEQ ID NO: 19), SWSLPYPGHLN (SEQ ID NO: 20), SWSLPYAGHAH (SEQ ID NO: 21), SWDAPGGLAR (SEQ ID NO: 22), SWSLPTPGLAH (SEQ ID NO: 23), SWSLPHRGVAN (SEQ ID NO: 24), SWSLPSSGVAH (SEQ ID NO: 25), SWSLPHHGFGH (SEQ ID NO: 26), SWSLPHAGDAH (SEQ ID NO: 27), SWSLPHNGVAH (SEQ ID NO: 28), SWSLPRQGLAN (SEQ ID NO: 29), SWSLPGPGHFH (SEQ ID NO: 30), SWSLPHPGLGH (SEQ ID NO: 31), SWDAPRGLAR (SEQ ID NO: 32), SWDAPAGLAR (SEQ ID NO: 33), SWSLPHQGKAN (SEQ ID NO: 34), SWDAPKGLAR (SEQ ID NO: 35), SWSLPNPGIAH (SEQ ID NO: 36), SWSLPRPGNAH (SEQ ID NO: 37), i SWSLPNPGNAH (SEQ ID NO: 38).
[0115] U nekim primerima izvođenja, BC petlja anti-miostatin adnektina ovog pronalaska obuhvata podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NO: 7-38, kako je prikazano u tabeli 1. U jednom primeru izvođenja, BC petlja obuhvata podvučeni deo od SEQ ID NO: 34.
[0116] U nekim primerima izvođenja, DE petlja anti-miostatin adnektina ovog pronalaska obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine: PGRGVT (SEQ ID NO: 39), PGRGST (SEQ ID NO: 40), LGRGST (SEQ ID NO: 41), PGRGLT (SEQ ID NO: 42), IGRGST (SEQ ID NO: 43), FGRGTT (SEQ ID NO: 44), i VGRGNT (SEQ ID NO: 45). U nekim primerima izvođenja, DE petlja anti-miostatin adnektina ovog pronalaska obuhvata podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NO: 39-45, kako je prikazano u tabeli 1. U jednom primeru izvođenja polipeptida ovog pronalaska, DE petlja obuhvata podvučeni deo od SEQ ID NO: 39.
[0117] U nekim primerima izvođenja, FG petlja anti-miostatin adnektina ovog pronalaska obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine: TLTKSQMIHYMP (SEQ ID NO: 46), TIYRDGMSHHDP (SEQ ID NO: 47), TVYRDGPLLLAP (SEQ ID NO: 48), TIFRTGMVQYDP (SEQ ID NO: 49), TLTNSEIILYKP (SEQ ID NO: 50), TLTKSQILHHRP (SEQ ID NO: 51), TLTRSKIIHYMP (SEQ ID NO: 52), TLTHSNIIRYVP (SEQ ID NO: 53), TVSSTKVIVYLP (SEQ ID NO: 54), TITKSTIIIYKP (SEQ ID NO: 55), TVTTTSVILYKP (SEQ ID NO: 56), TLTKSQLIHYMP (SEQ ID NO: 57), TLTRSQVIHYMP (SEQ ID NO: 58),
2
TLTKSKIIHYMP (SEQ ID NO: 59), TVSSTKVIHYKP (SEQ ID NO: 60), TLTKSKVIHYMP (SEQ ID NO: 61), TVTTTKVIHYKP (SEQ ID NO: 62), TIDRDGVNHFAP (SEQ ID NO: 63), TVTHHGVIGYKP (SEQ ID NO: 64), TLTGANVIIYKP (SEQ ID NO: 35), TVTNTGVIIYKP (SEQ ID NO: 66), TVTATGIIIYKP (SEQ ID NO: 67), TVTRAGFYRYKP (SEQ ID NO: 68), TVTREEVISYKP (SEQ ID NO: 69), TVTAAGVIIYKP (SEQ ID NO: 70), TVTANQPIIYKP (SEQ ID NO: 71), TITPETIIVYKP (SEQ ID NO: 72), TIDRDGTRSFDP (SEQ ID NO: 73), TIFRDGPVTWDP (SEQ ID NO: 74), TVTDTGYLKYKP (SEQ ID NO: 75), TLTGSDTIFYKP (SEQ ID NO: 76), TVTGKDVIKYKP (SEQ ID NO: 77), TIFRDGVVNYGP (SEQ ID NO: 78), i TVTDTGFITYKP (SEQ ID NO: 79).
[0118] U nekim primerima izvođenja, FG petlja anti-miostatin adnektina ovog pronalaska obuhvata podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NO: 46-79, kako je prikazano u tabeli 1. U jednom primeru izvođenja, FG petlja obuhvata podvučeni deo od SEQ ID NO: 75.
[0119] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata jednu sekvencu BC petlje odabranu od BC petlje sekvence sa SEQ ID NO: 7-38, ili podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NO: 7-38, kako je prikazano u tabeli 1; jedna sekvenca DE petlje odabrana od DE petlje sekvence sa SEQ ID NO: 39-45, ili podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NO: 39-45 kako je prikazano u tabeli 1; i jedna FG sekvence petlje odabrana od FG petlje sekvence sa SEQ ID NO: 46-79, ili podvučeni deo bilo koje od SEQ ID NO: 46-79 kako je prikazano u tabeli 1. U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata aminokiselinske sekvence BC, DE i FG petlje najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identične bilo kojoj od SEQ ID NO: 7-38, 39-45, i 46-79, respektivno. U drugim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata aminokiselinske sekvence BC, DE i FG petlje najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identične podvučenom delu bilo koje od SEQ ID NO: 7-38, 39-45, i 46-79, respektivno, kako je prikazano u tabeli 1.
[0120] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 80-123, 228-239, i 252-273 (sekvence pune dužine iz Tabela 2, 5, i 6). U jednom primeru izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 273.
[0121] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu bilo kojoj od SEQ ID NO: 80-123, 228-239, i 252-273. U drugim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu regionima ne-BC, DE, i FG petlje od SEQ ID NO: 80-123, 228-239, i 252-273.
[0122] U jednom primeru izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje kakve su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno. U još jednom primeru izvođenja, antimiostatin adnektin obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO: 273 [PRD-1474], SEQ ID NO: 118 [3116_A06], SEQ ID NO: 281 [sekvenca jezgra adnektina koju deli PRD-1474 i 3116_A06, kojoj prethodi N-terminalna ekstenziona sekvenca (GVSDVPRDL) i praćena C-terminalnim repom (EI)] ili SEQ
2
ID NO: 331 [sekvenca jezgra adnektina od PRD-1474 i 3116_A06 bez N-terminalne vodeće sekvence ili C-terminalnog repa]. sekvenca jezgra adnektina od PRD-1474 i 3116_A06 navedena je u nastavku:
[0123] U još jednom primeru izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identičnu regionima ne-BC, DE, i FG petlje od SEQ ID NO: 118, 273, 281, ili 331.
[0124] U jednom primeru izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska i ovde opisan, može biti opisan u vezi sa anti-miostatin adnektin-om koji obuhvata BC, DE, i FG petlje kakve su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75.
[0125] Saglasno tome, u nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje kakve su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, u kojoj BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. Saglasno tome, u nekim primerima izvođenja, BC petlja je definisana sekvencom konsenzusa X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, u kojoj X33predstavlja T ili Y; X34predstavlja Y, N, R, F, G, S, ili T; X35predstavlja A, P, S, F, H, N, ili R; X36predstavlja A; X37predstavlja H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38predstavlja L, G, M, F, I, ili V; a X39predstavlja H.
[0126] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu DE petlja obuhvata 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija. Saglasno tome, u nekim primerima izvođenja, DE petlja je definisana sekvencom konsenzusa G-R-G-X40, pri čemu X40predstavlja L.
[0127] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu FG petlja obuhvata 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. Saglasno tome, u primerima izvođenja FG je definisana sekvencom koncenzusa X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, u kojoj X41je L ili I; X42je S; X43je K, R, A, G, S, H, N, T, ili P; X44je S, A, E, H, K, ili N; X45je K, Q, D, E, N, T, ili S; X46je V, I, F, L, M, P, ili T; X47je I ili Y; X48je H, I, V, L, R, F, G, S, ili T; X49je H; i X50je M, L, R, ili V.
[0128] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije, a DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija. U nekim primerima izvođenja, BC petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, u kojoj X33predstavlja T ili Y; X34predstavlja Y, N, R, F, G, S, ili T; X35predstavlja A, P, S, F, H, N, ili R;
X36predstavlja A; X37predstavlja H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38predstavlja L, G, M, F, I, ili V; a X39predstavlja
2
H, a DE petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X40, u kojoj X40predstavlja L.
[0129] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije, a FG petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, u kojoj X33predstavlja T ili Y; X34predstavlja Y, N, R, F, G, S, ili T; X35predstavlja A, P, S, F, H, N, ili R; X36predstavlja A; X37predstavlja H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38predstavlja L, G, M, F, I, ili V; i X39predstavlja H, a FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, u kojoj X41predstavlja L ili I; X42predstavlja S; X43predstavlja K, R, A, G, S, H, N, T, ili P; X44predstavlja S, A, E, H, K, ili N; X45predstavlja K, Q, D, E, N, T, ili S; X46predstavlja V, I, F, L, M, P, ili T; X47predstavlja I ili Y; X48predstavlja H, I, V, L, R, F, G, S, ili T; X49predstavlja H; a X50predstavlja M, L, R, ili V.
[0130] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, u kojoj i DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija, a FG petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima izvođenja, DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X40, u kojoj X40predstavlja L, a FG petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, u kojoj X41predstavlja L ili I; X42predstavlja S; X43predstavlja K, R, A, G, S, H, N, T, ili P; X44predstavlja S, A, E, H, K, ili N; X45predstavlja K, Q, D, E, N, T, ili S; X46predstavlja V, I, F, L, M, P, ili T; X47predstavlja I ili Y;
X48predstavlja H, I, V, L, R, F, G, S, ili T; X49predstavlja H; a X50predstavlja M, L, R, ili V.
[0131] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, pri čemu BC petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije, a DE petlja ima 1 aminokiselinsku supstituciju, kao što je konzervativna aminokiselinska supstitucija, a FG petlja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ili 8 aminokiselinskih supstitucija, kao što su konzervativne aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima izvođenja, BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X33-L-P-X34-X35-X36-X37-X38-X39, u kojoj X33predstavlja T ili Y; X34predstavlja Y, N, R, F, G, S, ili T; X35predstavlja A, P, S, F, H, N, ili R; X36predstavlja A; X37predstavlja H, L, R, V, N, D, F, ili I; X38predstavlja L, G, M, F, I, ili V; i X39predstavlja H; DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X40, u kojoj X40predstavlja L; a FG petlja ima aminokiselinsku sekvencu prema formuli X41-X42-X43-X44-X45-X46-X47-X48-X49-X50, u kojoj X41predstavlja L ili I; X42predstavlja S; X43predstavlja K, R, A, G, S, H, N, T, ili P;
X44predstavlja S, A, E, H, K, ili N; X45predstavlja K, Q, D, E, N, T, ili S; X46predstavlja V, I, F, L, M, P, ili T; X47predstavlja I ili Y; X48predstavlja H, I, V, L, R, F, G, S, ili T; X49predstavlja H; i X50predstavlja M, L, R, ili V.
[0132] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje kako su navedene u SEQ ID NO: 34, 39, i 75, respektivno, i ima aminokiselinske supstitucije u BC, DE I FG petljama koje omogućavaju anti-miostatin adnektin-u da održava vezivanje za miostatin. Takve aminokiselinske supstitucije mogu biti određene, npr. dubokim mutacionim skeniranjem, kako je opisano u primeru 8.
[0133] Saglasno tome, u nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC petlju koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54/X55-X56-X57-X58-X59, u kojoj: X51je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X52je odabrano iz grupe koju čine L, M, i V; X53je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, i Y; X54je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X55je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X56je odabrano iz grupe koju čine G i S; X57je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X58je odabrano iz grupe koju čine A, C, G, L, M, S, i T; i X59je odabrano iz grupe koju čine A, C, F, H, N, P, Q, R, S, i Y. U poželjnom primeru izvođenja, X51je odabrano iz grupe koju čine C, F, I, S, V, W, i Y; X52je odabrano iz grupe koju čine L; X53je odabrano iz grupe koju čine P; X54je odabrano iz grupe koju čine C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X55je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X56je odabrano iz grupe koju čine G; X57je odabrano iz grupe koju čine A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W, i Y; X58je odabrano iz grupe koju čine A, G, L, M, i S; i X59je odabrano iz grupe koju čine C, H, N, Q, S, i Y. U poželjnijem primeru izvođenja, X51je odabrano iz grupe koju čine F, S, i W; X52je odabrano iz grupe koju čine L; X53je odabrano iz grupe koju čine P; X54je odabrano iz grupe koju čine C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W, i Y; X55je odabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, i Y; X56je odabrano iz grupe koju čine G; X57je odabrano iz grupe koju čine A, C, H, K, L, M, N, R, V, W, i Y; X58je odabrano iz grupe koju čine A, G, i L; i X59je odabrano iz grupe koju čine H, N, i Q.
[0134] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata DE petlju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, u kojoj je X60odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T, i V. U poželjnom primeru izvođenja, X60je odabrano iz grupe koju čine C, E, I, L, M, Q, T, i V. U poželjnom primeru izvođenja, X60je odabrano iz grupe koju čine C, E, I, L, M, i V.
[0135] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata FG petlju koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, u kojoj X61je odabrano iz grupe koju čine A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W, i Y; X62je odabrano iz grupe koju čine A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X63je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X64je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X65je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X66je odabrano iz grupe
1
koju čine A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W, i Y; X67je odabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X68je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X69je odabrano iz grupe koju čine F, W, i Y; i X70je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y. U poželjnom primeru izvođenja, X61je odabrano iz grupe koju čine A, C, I, L, M, i V; X62je odabrano iz grupe koju čine C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W, i Y; X63je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, i Y; X64je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X65je odabrano iz grupe koju čine A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y; X66je odabrano iz grupe koju čine C, F, I, L, M, P, T, V, W, i Y; X67je odabrano iz grupe koju čine C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, i Y; X68je odabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X69je odabrano iz grupe koju čine W i Y; i X70je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, i V. U poželjnijem primeru izvođenja, X61je odabrano iz grupe koju čine I i V; X62je odabrano iz grupe koju čine C, F, I, L, M, T, V, W, i Y; X63je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, i V; X64je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y; X65je odabrano iz grupe koju čine A, G, S, T, i W; X66je odabrano iz grupe koju čine F, I, V, W, i Y; X67je odabrano iz grupe koju čine F, H, I, L, M, V, W, i Y; X68je odabrano iz grupe koju čine A, C, F, G, I, K, L, M, T, V, i W; X69je odabrano iz grupe koju čine W i Y; i X70je odabrano iz grupe koju čine A, G, K, L, M, P, Q, i R.
[0136] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje, u kojoj BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, u kojoj, X51je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, F, H, I, K, L, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X52je odabrano iz grupe koju čine L, M, i V; X53je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, i Y; X54je A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X55je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X56je odabrano iz grupe koju čine G i S; X57je A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X58je A, C, G, L, M, S, i T; i X59je A, C, F, H, N, P, Q, R, S, i Y; DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, u kojoj X60je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, I, K, L, M, N, Q, S, T, i V; i FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, u kojoj X61je odabrano iz grupe koju čine A, C, F, I, L, M, Q, T, V, W, i Y; X62je A, C, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X63je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X64je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X65je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X66je odabrano iz grupe koju čine A, C, F, H, I, L, M, N, P, S, T, V, W, i Y; X67je odabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X68je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X69je odabrano iz grupe koju čine F, W, i Y; i X70je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y.
2
[0137] U poželjnom primeru izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje, u kojoj BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, u kojoj, X51je odabrano iz grupe koju čine C, F, I, S, V, W, i Y; X52je L; X53je P; X54je odabrano iz grupe koju čine C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X55je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X56je G; X57je odabrano iz grupe koju čine A, C, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, V, W, i Y; X58je odabrano iz grupe koju čine A, G, L, M, i S; i X59je odabrano iz grupe koju čine C, H, N, Q, S, i Y; DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, u kojoj X60je odabrano iz grupe koju čine C, E, I, L, M, Q, T, i V; i FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, u kojoj X61je odabrano iz grupe koju čine A, C, I, L, M, i V; X62je C, F, H, I, L, M, Q, R, S, T, V, W, i Y; X63je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, i Y; X64je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; X65je odabrano iz grupe koju čine A, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y; X66je odabrano iz grupe koju čine C, F, I, L, M, P, T, V, W, i Y; X67je odabrano iz grupe koju čine C, F, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W, i Y; X68je odabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; X69je odabrano iz grupe koju čine W i Y; i X70je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y.
[0138] U poželjnijem primeru izvođenja, anti-miostatin adnektin ovog pronalaska obuhvata BC, DE, i FG petlje, u kojoj BC petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X51-X52-X53-X54-X55-X56-X57-X58-X59, u kojoj, X51je odabrano iz grupe koju čine F, S, i W; X52je L; X53je P; X54je odabrano iz grupe koju čine C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W, i Y; X55je odabrano iz grupe koju čine A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, i Y; X56je G; X57je odabrano iz grupe koju čine A, C, H, K, L, M, N, R, V, W, i Y; X58je odabrano iz grupe koju čine A, G, i L; i X59je odabrano iz grupe koju čine H, N, i Q; DE petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli G-R-G-X60, u kojoj X60je odabrano iz grupe koju čine C, E, I, L, M, i V; i FG petlja obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli X61-X62-X63-X64-X65-X66-X67-X68-X69-X70, u kojoj X61je odabrano iz grupe koju čine I i V; X62je C, F, I, L, M, T, V, W, i Y; X63je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, i V; X64je odabrano iz grupe koju čine A, C, D, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y; X65je odabrano iz grupe koju čine A, G, S, T, i W; X66je odabrano iz grupe koju čine F, I, V, W, i Y; X67je odabrano iz grupe koju čine F, H, I, L, M, V, W, i Y; X68je odabrano iz grupe koju čine A, C, F, G, I, K, L, M, T, V, i W; X69je odabrano iz grupe koju čine W i Y; i X70je odabrano iz grupe koju čine A, G, K, L, M, P, Q, i R.
[0139] U nekim primerima izvođenja anti-miostatin adnektinima, anti-miostatin adnektin je kodiran sekvencom nukleinske kiseline kako je navedeno u bilo kojoj od SEQ ID NO: 124-167, 240-251, i 284-305 (sekvence pune dužine iz Tabela 2, 5, i 6). U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 100% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 124-167, 240-251, i 284-305.
[0140] Fibronektin prirodno vezuje određene tipove integrina kroz svoj integrin-vezujući motiv, "argininglicin-asparaginska kiselina" (RGD). U nekim primerima izvođenja, polipeptid obuhvata<10>Fn3 domen kome nedostaje (RGD) integrin vezujući motiv. Integrin vezujući domen može biti uklonjen menjanjem RGD sekvence sa aminokiselinskom supstitucijom, brisanjem ili umetanjem.
[0141] U nekim primerima izvođen ja, BC, DE i/ili FG petlja aminokiselinske sekvence identična podvučenom delu bilo koje od SEQ ID NO: 7-38, 39-45, i 46-79, respektivno, kako je prikazano u tabeli 1, nakalemljene su na ne-<10>Fn3 domen protein skafolde. Na primer, jedna ili više petlja aminokiselinske sekvence je zamenjena za ili umetnuta u jednu ili više CDR petlji antitela teškog ili lakog lanca ili njegovog fragmeta. U drugim primerima izvođenja, proteinski domen u kojem su jedna ili više aminokiselinskih sekvenci petlje zamenjene ili umetnuta uključuje, ali se ne ograničava na, konsenzus Fn3 domene (Centocor ,US), ankirin ponavljajuće proteine (Molecular Partners AG, Zurich Switzerland), domenska antitela (Domantis, Ltd, Cambridge, MA), jedno domenska kamelid nanotela (Ablynx, Belgium), Lipokaline (npr., antikalini; Pieris Proteolab AG, Freising, Namačka), Avimere (Amgen, CA), affitela (Affibody AG, Sweden), ubikvitin (npr., afilini; Scil Proteini GmbH, Halle, Namačka), proteinske epitop mimetike (Poliphor Ltd, Allschwil, Switzerland), spiralne snop skafolde (npr. alfatela, Complix, Belgium), Fyn SH3 domene (Covagen AG, Switzerland), ili atrimere (Anaphor, Inc., CA).
[0142] SEQ ID NO za BC, DE i FG petlje primernih anti-miostatin adnektina ovog pronalaska date su u tabeli 1.
Tabela 1
4
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
[0143] SEQ ID NO za primerne anti-miostatin monoadnektin-e ovog pronalaska date su u tabeli 2.
Tabela 2
4
4
4
4
adnektini koji unakrsno ulaze u kompeticiju i/ili adnektini koji se vezuju na istom mestu vezivanja adnektina
[0144] U jednom primeru izvođenja, adnektini ovog pronalaska ulaze u kompeticiju (npr., unakrsnoulaze u kompeticiju) za vezivanje sa miostatinom sa određenim ovde opisanim anti-miostatin adnektinima. Takvi adnektini koji ulaze u kompeticiju mogu biti identifikovani na bazi njihove sposobnosti da kompetitivno inhibiraju vezivanje ovde opisanih adnektina sa miostatinom u standardnim ogledima vezivanja miostatina. Na primer, standardni ELISA ogledi mogu se primeniti u kojima je rekombinantan miostatin protein imobilizovan na ploči, jedan adnektina je fluorescentnono obeležen, i procenjuje se sposobnost ne-obeleženih adnektina koji se takmiče sa vezivanjem obeleženih adnektina.
[0145] U jednom primeru izvođenja, kompetitivni ELISA format može se izvesti za određivanje bilo da se dva anti-miostatin adnektina vezuju preklapajući mesta vezivanja adnektina na miostatinu. U jednom formatu, adnektin #1 je obložen na ploču, koja je zatim blokirana i oprana. Ovoj ploči dodaje se ili sam miostatin, ili miostatin prethodno inkubisan zasićenom koncentracijom adnektina #2. Nakon poželjnog perioda inkubacije, ploča je oprana i sondirana poliklonalnim anti-miostatin antitelom, kao što je
4
biotinilovano kozje anti-miostatin poliklonalno antitelo (R&D Systems), praćeno detekcijom sa streptavidin-HRP konjugatom i standardnim procedurama razvoja tetrametilbenzidina. Ukoliko je OD signal isti sa ili bez predinkubacije sa adnektin-om #2, tada se ta dva adnektina vezuju nezavisno jedan od drugog, i njihova mesta vezivanja adnektina se ne preklapaju. Međutim, ukoliko je OD signal za bazenčiće koji su ispunjeni mešavinama miostatin/adnektin#2 niži od onih koji su ispunjeni samo sa miostatinom, onda je potvrđeno da vezivanje adnektina #2 blokira vezivanje adnektina #1 sa miostatinom.
[0146] Alternativno, sličan eksperiment je sproveden površinskom plazmonskom rezonancom (SPR, npr., BIAcore). Adnektin #1 je imobilizovan na SPR površina čipa, praćeno ubrizgavanjima ili samog miostatina ili miostatina prethodno inkubisanog sa zasićenom koncentracijom adnektina #2. Ukoliko je signal vezivanja za mešavine miostatin/adnektin#2 isti ili viši od onog koji se šalje samo miostatin, tada se ta dva adnektina vezuju nezavisno jedan od drugog, a njihova mesta vezivanja adnektina se ne preklapaju. Međurim, ako je signal vezivanja za mešavine miostatin/adnektin#2 niži od signala vezivanja za sam miostatin, onda je potvrđeno da vezivanje adnektina #2 blokira vezivanje adnektina #1 sa miostatinom. Osobina ovih eksperimenata je upotreba zasićene koncentracije adnektina #2. Ako miostatin nije zasićen adnektin-om #2, onda gornji zaključci nisu održivi. Slični eksperimenti se mogu primeniti za određivanje da li se dva miostatin vezujuća proteina vezuju preklapajući se sa mestima vezivanja adnektina.
[0147] Oba navedena ogleda takođe se mogu izvesti u obrnutom redosledu u kojem je adnektin#2 imobilizovan, a miostatin-adnektin#1 dodaju se u ploču. Alternativno, adnektin #1 i/ili #2 mogu biti zamenjeni monoklonalnim antitelom i/ili rastvorivim receptor-Fc fuzioni proteinom.
[0148] U drugom primeru izvođenja, kompeticija može biti određena upotrebom HTRF sendvič ogleda, kako je opisano u primeru 4.
[0149] U drugim primerima izvođenja, adnektin koji ulazi u kompeticiju može biti neki adnektin koji se vezuje na istom mestu vezivanja adnektina na miostatinu kao određeni ovde opisani anti-miostatin adnektin. Standardne tehnike mapiranja, kao što je proteaza mapiranje, mutacionalna analiza, x-zračna kristalografija i 2-dimenzonalna nuklearna magnetna rezonanca, mogu se primeniti za određivanje bilo da se adnektin vezuje se na istom mestu vezivanja adnektina kao referentni adnektin (videti, npr., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
[0150] Kandidat koji ulaze u kompeticiju anti-miostatin adnektina mogu da inhibiraju vezivanje antimiostatin adnektina ovog pronalaska sa miostatinom za najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99%. % kompeticije može se odrediti upotrebom prethodno opisanih postupaka.
4
[0151] U nekim primerima izvođenja, molekuli koji ulaze u kompeticiju sa anti-miostatin adnektinima ovog pronalaska ne moraju biti adnektin, već mogu biti bilo koji tip molekula koji se vezuje za miostatin, kao što je, ali se ne ograničava na, antitelo, mali molekul, peptid, i slično.
[0152] U nekim primerima izvođenja, adnektini ovog pronalaska vezuju se za isprekidano mesto vezivanja adnektina na miostatinu. U nekim primerima izvođenja, polipeptidi se vezuju za region unutar aminokiselina 55-66 miostatina (SEQ ID NO: 3). U nekim primerima izvođenja, polipeptidi se vezuju za region unutar aminokiselina 85-101 miostatina (SEQ ID NO: 3). U nekim drugim primerima izvođenja, polipeptidi se vezuju unutar dva regiona, aminokiseline 85-101 i 55-66, miostatina (SEQ ID NO: 3).
[0153] U nekim primerima izvođenja, polipeptidi ovog pronalaska ne ulaze u kompeticiju za vezivanje sa miostatinom sactRIIB. U nekim primerima izvođenja, polipeptidi ovog pronalaska ulaze u kompeticiju za vezivanje sa miostatinom saLK4 i/ili ALK5.
II. Ekstenzione sekvence
[0154] U određenim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin molekuli ovog pronalaska mogu biti modifikovani da obuhvataju N-terminalnu ekstenzionu sekvencu i/ili C-terminalnu ekstenziju. Na primer, MG sekvenca može biti smeštena na N-terminusu od<10>Fn3 definisana sa SEQ ID NO: 4. M se obično cepa, ostavljajući G na N-terminusu. Alternativno, prvih 10 aminokiselina anti-miostatin adnektina prikazane u tabeli 2 mogu biti zamenjene sa alternativnom N-terminalnom sekvencom, ovde označena kao N-terminalne ekstenzije, kako je prikazano u tabeli 7. Pored toga, M, G ili MG mogu takođe biti smeštene N-terminalno na bilo koju od N-terminalnih ekstenzija kako je prikazano u tabeli 7. Ovde opisani anti-miostatin adnektini mogu takođe da obuhvataju alternativne sekvence C-terminalnog repa, ovde označene kao C-terminalne ekstenzione sekvence. Na primer, anti-miostatin adnektin sekvence prikazane u tabeli 2 mogu biti skraćene na treoninu koji odgovara T94 u SEQ ID NO: 4 (tj., skraćen nakon INYRT (SEQ ID NO: 168) dela sekvence). Takva skraćena verzija može se primeniti kao terapeutski molekuli u skraćenom obliku, ili alternativno, C-terminalne ekstenzije mogu se dodati nakon ostatka treonina. Primerne C-terminalne ekstenzione sekvence prikazane su u tabeli 7. Primerni anti-miostatin adnektini koji obuhvataju C-terminalne ekstenzione sekvence prikazane su u tabeli 2 kao SEQ ID NO: 80-123. Na primer, SEQ ID NO: 80 (klon 1979_B06) obuhvata prirodnu C-terminalnu ekstenzionu EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211) praćena His6 tagom (SEQ ID NO: 328). Međutim, treba shvatiti da je His6 tag potpuno opcion.
[0155] U određenim primerima izvođenja, C-terminalne ekstenzione sekvence (takođe nazvane "repovi"), obuhvataju E i D ostatke, i mogu biti između 8 i 50, 10 i 30, 10 i 20, 5 i 10, i 2 i 4 aminokiseline u dužini. U nekim primerima izvođenja, rep sekvence uključuju ED-bazirane veznike kod kojig ta sekvenca obuhvata tandem ponavljanja od ED. U primernim ostvarenjima, rep sekvenca obuhvata 2-10, 2-7, 2-5, 3-10, 3-7, 3-5, 3, 4 ili 5 ED ponavljanja. U određenim primerima izvođenja, ED-bazirane rep
4
sekvence mogu takođe da uključuju dodatne aminokiselinske ostatke, kao što je, na primer: EI, EID, ES, EC, EGS, i EGC. Takve sekvence bazirane su, delom, na poznatim adnektin rep sekvencama, kao što je EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211), u kojima su ostaci D i K uklonjeni. U primernim ostvarenjima, ED-baziran rep obuhvata E, I ili EI ostatke pre ED ponavljanja.
[0156] U drugim primerima izvođenja, N- ili C-terminalne sekvence mogu biti kombinovan sa poznatim veznim sekvencama (npr., SEQ ID NO: 181-227 u tabeli 4) ako je potrebno prilokom konstruisanja antimiostatin adnektin fuzioni molekul. U nekim primerima izvođenja, sekvence mogu biti smeštene na C-terminusue<10>Fn3 domena kako bi se omogućilo vezivanje farmakokinetičke grupe. Na primer, cistein koji sadrži veznik kao što je GSGC (SEQ ID NO: 189) može se dodati C-terminusu kako bi se omogućila na mestu usmerena PEGilacija na cisteinskom ostatku. Primerni anti-miostatin adnektini koji obuhvataju cistein koji sadrži veznik, prikazani su u tabeli 5 kao SEQ ID NO: 228-239.
III. Farmakokinetičke Grupe
[0157] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-miostatin adnektin-e koji dalje obuhvataju farmakokinetičku (PK) grupu. Poboljšani farmakokinetici mogu se odrediti u skladu sa uočenom terapeutskom potrebom. Često je poželjno da se poveća biodostupnost i/ili poveća vreme između doze, moguće povećavanjem vremena tokom kojeg protein ostaje dostupan u serumu nakog doziranja. U nekim slučajevima, poželjno je da se poboljša kontinuitet koncentracije proteina u serumu tokom vremena (npr., smanjivanje razlike u koncentraciji proteina u serumu neposredno nakon davanja i neposredno pre sledećeg davanja). Anti-miostatin adnektin može biti vezan za grupu koja smanjuje brzinu klirensa polipeptida kod sisara (npr., miša, pacova, ili čoveka) za više od dva-puta, više od tri-puta, više od četiri-puta ili više od pet-puta u odnosu na nemodifikovan anti-miostatin adnektin. Druga merenja poboljšana farmakokinetika mogu da uključuju serumski pol-život, koji je često podeljen na alfa fazu i beta fazu. Bilo koja ili obe faze mogu biti značajno poboljšane dodavanjem pogodne grupe. Na primer, PK grupa može da poveća serumski polu-život polipeptida za više od 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 400, 600, 800, 1000% ili više u odnosu na sam Fn3 domen.
[0158] Grupe koje usporavaju klirens proteina iz krvi, ovde označene kao "PK grupe", uključuju polioksialkilen grupe (npr., polietilen glikol), šećere (npr., sijalinska kiselina), i proteinske grupe koje se dobro tolerišu (npr., Fc i fragmenti i njihove varijante, transferin, ili serumski albumin). Anti-miostatin adnektin takođe može biti fuzionisan sa albuminom ili fragmentom (delom) ili varijantom albumina kako je opisano u U.S. objavi Br. 2007/0048282, ili može biti fuzionisan sa jednim ili više vezujućim adnektinom koji vezuje serumski albumin, kakav je ovde opisan.
[0159] Druge PK grupe koje se mogu primeniti na ovaj pronalazak uključuju one opisane u Kontermann et al., (Current Opinion in Biotechnology 2011;22:868-76). Takve PK grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na, fuzije humanog serumskog albumina, konjugate humanog serumskog albumina, veziva humanog serumskog albumina (npr., adnektin PKE, AlbudAb, ABD), XTEN fuzije, PAS fuzije (tj., rekombinantne PEG mimetike bazirane na tri aminokiseline prolin, alanin, i serin), ugljenohidratne konjugate (npr., hidroksietil talk (HES)), glikosilacioni, konjugati polisijalinske kiseline, i konjugati masnih kiselina.
[0160] Saglasno tome, u nekim primerima izvođenja ovaj pronalazak obezbeđuje anti-miostatin adnektin fuzionisan sa PK grupom koja je polimerni šećer. U nekim primerima izvođenja, PK grupa je polietilen glikolna grupa ili Fc region. U nekim primerima izvođenja PK grupa je protein koji vezuje serumski albumin kao što su oni opisani u U.S. objavama Br.2007/0178082 i 2007/0269422. U nekim primerima izvođenja PK grupa je humani serumski albumin. U nekim primerima izvođenja, PK grupa je transferin.
Polietilen glikol
[0161] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin obuhvata polietilen glikol (PEG). PEG je dobro poznat, u vodi rastvoriv polimer koji je komercijalno dostupan ili se može pripremiti polimerizacije otvaranjem prstena na etilen glikolu u skladu sa postupcima dobro poznatim u stanju tehnike (Sandler i Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol.3, strane 138-161). Pojam "PEG" upotrebljava se u širokom smilsu kako bi obuhvatio bilo koji molekul polietilen glikola, bez obzira na veličinu ili modifikaciju na kraju PEG-a, i može biti predstavljen formulom: X-O(CH2CH2O)n-1CH2CH2OH, u kojoj n je 20 do 2300 i X je H ili terminal modifikacija, npr., C1-4alkil. PEG može da sadrži dalje hemijske grupe koje su potrebne za reakcije vezivanja, koje rezultuju iz hemijske sinteze molekula; ili koje deluju kao spejseri za optimalno rastojanje delova molekula. Pored toga, takav PEG može se sastojati od jednog ili više PEG bočnih-lanaca koji su međusobno vezani. PEG-ovi sa više od jednog PEG lanca nazivaju se višekraki ili razgranati PEG-ovi. Razgranati PEG-ovi opisani su u, na primer, Evropskoj Objavljenoj Prijavi Br.473084A i U.S. Pat. Br.5,932,462.
[0162] Jedan ili više PEG molekula može biti vezano na različitim položajima na proteinu, a takva vezivanja mogu se postići regovanjem sa aminima, tiolima ili drugim pogodnim reaktivnim grupama. Aminske grupe mogu biti, na primer, primarni amin nađen na N-terminusu polipeptida ili amin grupa prisutna u aminokiselini, kao što je lizin ili arginin. U nekim primerima izvođenja, PEG grupa je vezana na položaju na polipeptidu odabranom iz grupe koju čine: a) N-terminus; b) između N-terminusa i naj N-terminalnijeg beta lanca ili beta-sličnog lanca; c) petlja postavljena na strani polipeptida naspram ciljanog mesta vezivanja; d) između C-terminusa i naj C-terminalnijeg beta lanca ili beta-sličnog lanca; i e) na C-terminusu.
[0163] PEGilacija se može postići putem na mestu usmerene PEGilacije, u kojem se pogodna reaktivna grupa uvodi u protein da bi se stvorilo mesto na kojem se PEGilacija pre svega javlja. U nekim primerima izvođenja, protein je modifikovan radi uvođenja cisteinskog ostatka na poželjnom položaju,
1
omogućavajući na mestu usmerenu PEGilacija na cisteinu. Mutacije mogu biti uvedene u protein kodirajuće sekvence radi generisanja cisteinskih ostataka. Ovo se može postići, na primer, mutacijom jednog ili više aminokiselinskih ostataka u cistein. Poželjne aminokiseline za mutaciju u cisteinski ostatak uključuju serin, treonin, alanin i druge hidrofilne ostatke. Poželjno, ostatak koji je mutiran u cistein je površinski-izložen ostatak. U struci su dobro poznati algoritmi za pretpostavljanje površinske pristupačnosti ostataka baziranih na primarnoj sekvenci ili proteinu. Alternativno, površina ostataka može se pretpostaviti poređenjem aminokiselinskih sekvenci vezujućih polipeptida, pod uslovom da je struktura kristala okvira, na osnovu koje se konstruišu i razvijaju vezujući polipeptidi, razrešena (videti Himanen et al., Nature 2001;414:933-8) i tako da su površinski-izloženi ostaci identifikovani. PEGilacija cisteinskih ostataka može se izvesti upotrebom, na primer, PEG-maleimida, PEG-vinilsulfona, PEG-jodoacetamida, ili PEG-ortopiridil disulfida.
[0164] PEG je tipično aktiviran pogodnom aktivirajućom grupom koja je pogodna za kuplovanje na poželjnom mestu na polipeptidu. Postupci PEGilacije dobro su poznati u ovoj oblasti i dalje opisani u Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poli(Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides" in Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992), i u Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16: 157-182.
[0165] PEG može široko da varira u molekulskoj masi i može biti razgranat ili linearan. Tipično, prosečna molekulska masa PEG-a je od oko 100 Daltona do oko 150,000 Daltona. Primerne prosečne molekulske mase za PEG uključuje oko 20,000 Daltona, oko 40,000 Daltona, oko 60,000 Daltona i oko 80,000 Daltona. U određenim primerima izvođenja, molekulska masa PEG-a je 40,000 Daltona. Razgranate verzije PEG-a sa bilo kojom prethodno navedenom ukupnom molekulskom masom, takođe se mogu primeniti. U nekim primerima izvođenja, PEG ima dve grane. U drugim primerima izvođenja, PEG ima četiri grane. U još jednom primeru izvođenja, PEG je bis-PEG (NOF Corporation, DE-200MA), u kojem su konjugovana dva adnektina (videti, npr., Primer 1 i ATI-1341 iz Tabele 5).
[0166] Konvencionalne tehnike odvajanja i prečišćavanja poznate u ovoj oblasti mogu se primeniti za prečišćavanje PEGilovanih anti-miostatin adnektina, kao što je isključivanje po veličini (npr., gel filtracija) i jonoizmenjivačka hromatografija. Proizvodi mogu takođe biti izdvojeni upotrebom SDS-PAGE. Proizvodi koji se mogu izdvojiti uključuju mono-, di-, tri-, poli- i ne-PEGilovane adnektin-e, kao i slobodne PEG. Procenat mono-PEG konjugata može se kontrolisati pulovanjem širih frakcija oko elucionog pika radi povećanja procenta mono-PEG-a u kompoziciji. Oko 90% mono-PEG konjugata predstavlja dobar balans prinosa i aktivnosti.
[0167] U nekim primerima izvođenja, PEGilovani anti-miostatin adnektini poželjno zadržavaju najmanje oko 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% biološke aktivnosti povezane sa nemodifikovanim anti-miostatin adnektin-om. U nekim primerima izvođenja, biološka aktivnost odnosi se na njegovu sposobnost da se vezuju za miostatin, kako je određeno putem KD, kon, ili koff. U nekim
2
primerima izvođenja, PEGilovani anti-miostatin adnektin pokazuje povećanje u vezivanju sa miostatinom u odnosu na nePEGilovani anti-miostatin adnektin.
[0168] Primerni PEG-modifikovani anti-miostatin adnektini prikazani su u tabeli 5.
Imunoglobulinski Fc domen (i fragmenti)
[0169] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin je fuzionisan sa imunoglobulinskim Fc domenom, ili njegovim fragmentom ili varijantom. Kako se ovde koristi, "funkcionalan Fc region" je Fc domen ili njegov fragment koji je zadržao sposobnost da veže FcRn. U nekim primerima izvođenja, funkcionalan Fc region vezuje se za FcRn, ali ne poseduje efektorsku funkciju. Sposobnost Fc regiona ili njegovog fragmenta da se vežu za FcRn može se odrediti standardnim ogledi vezivanja poznatim u ovoj oblasti. U drugim primerima izvođenja, Fc region ili njegov fragment vezuje se za FcRn i poseduje najmanje jednu "efektorsku funkciju" nativnog Fc regiona. Primerne "efektorske funkcije" uključuju C1q vezivanje; komplement zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptili Vezivanje; antitelo-zavisnu ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju receptora ćelijske površine (npr., B ćelijski receptor; BCR), itd. Takve efektorske funkcije generalno zahtevaju da se Fc region kombinuje sa vezujućim domenom (npr., anti-miostatin adnektin) i mogu se odrediti upotrebom raznih ogleda poznatih u ovoj oblasti za evaluaciju takvih antitelo efektorskih funkcija.
[0170] " Fc region nativne sekvence" obuhvata aminokiselinsku sekvencu identičnu aminokiselinskoj sekvenci Fc regiona pronađenog u prirodi. "Varijantni Fc region" obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od Fc regiona nativne sekvence na osnovu najmanje jedne aminokiselinske modifikacije. Poželjno, varijanta Fc regiona ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa Fc regionom nativne sekvence ili sa Fc regionom roditeljskom polipeptidu, npr., od oko jedan do oko deset aminokiselinskih supstitucija, a poželjno od oko jedan do oko pet aminokiselinskih supstitucija u Fc regionu nativne sekvence ili u Fc regionu roditeljskog polipeptida. Varijanta Fc regiona poželjno će imati najmanje oko 80% sekvencionog identiteta sa Fc regionom nativne sekvence i/ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida, a najpoželjnije najmanje oko 90% sekvencionog identiteta sa njima, poželjnije najmanje oko 95% sekvencionog identiteta sa njima.
[0171] U primernom ostvarenju, Fc domen je izveden iz IgG1 potklase, međutim, i drugi potklase (npr., IgG2, IgG3, i IgG4) takođe se mogu primeniti. U nastavku je prikazana sekvenca humanog IgG1 imunoglobulinskog Fc domena:
[0172] Zglobna sekvenca jezgra je podvučena, a CH2 i CH3 regioni napisani su običnim tekstom. Treba shvatiti da je C-terminalni lizin opcioni.
[0173] Fuzije se mogu formirati vezivanjem anti-miostatin adnektina za ili na kraju Fc molekula, tj., Fcanti-miostatin adnektin ili anti-miostatin adnektin-Fc redosled. U određenim primerima izvođenja, Fc i anti-miostatin adnektin fuzionisani sz putem veznika. Primerne vezne sekvence uključuju GAGGGGSG (SEQ ID NO: 181), EPKSSD (SEQ ID NO: 182), D, ESPKAQASSVPTAQPQAEGLA (SEQ ID NO: 183), ELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 184), GQPDEPGGS (SEQ ID NO: 185), GGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 186), ELQLEESAAEAQEGELE (SEQ ID NO: 187), GSGSG (SEQ ID NO: 188), GSGC (SEQ ID NO: 189), AGGGGSG (SEQ ID NO: 190), GSGS (SEQ ID NO: 191), QPDEPGGS (SEQ ID NO: 192), GSGSGS (SEQ ID NO: 193), TVAAPS (SEQ ID NO: 194), KAGGGGSG (SEQ ID NO: 195), KGSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 196), KQPDEPGGS (SEQ ID NO: 197), KELQLEESAAEAQDGELD (SEQ ID NO: 198), KTVAAPS (SEQ ID NO: 199), KAGGGGSGG (SEQ ID NO: 200), KGSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 201), KQPDEPGGSG (SEQ ID NO: 202), KELQLEESAAEAQDGELDG (SEQ ID NO: 203), KTVAAPSG (SEQ ID NO: 204) AGGGGSGG (SEQ ID NO: 205), AGGGGSG (SEQ ID NO: 206), GSGSGSGSGSGSG (SEQ ID NO: 207), QPDEPGGSG (SEQ ID NO: 208), i TVAAPSG (SEQ ID NO: 209).
[0174] U nekim primerima izvođenja, Fc region korišćen u anti-miostatin adnektin fuzijama obuhvata zglobni region Fc molekula. Kako se ovde koristi, "zglobni" region obuhvata zglobne ostatke jezgra koji se pružaju položajima 1-16 od SEQ ID NO: 169 (DKTHTCPPCPAPELLG; SEQ ID NO: 170) IgG1 Fc regiona. U određenim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin-Fc fuzija usvaja multimernu strukturu (npr., dimer) koju duguje, delom, cisteinskim ostacima na položajima 6 i 9 od SEQ ID NO: 169 unutar zglobnog regiona. U drugim primerima izvođenja, zglobni region kako se ovde koristi, može dalj da uključi ostatke izvedene iz CH1 i CH2 regiona koji poravnavaju zglobnu sekvencu jezgra, kako je prikazano u SEQ ID NO: 169. U nekim drugim primerima izvođenja, zglobna sekvenca je GSTHTCPPCPAPELLG (tj., zglobna sekvenca za PRD-932; SEQ ID NO: 180).
[0175] U nekim primerima izvođenja, zglobna sekvenca, može da uključuje supstitucije koje potvrđuju poželjne farmakokinetičke, biofizičke, i/ili biološke osobine. Neke primerne zglobne sekvence uključuju EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 171; zglobni region jezgra podvučen), EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO 172; zglobni region jezgra podvučen), EPKSSGSTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 173; zglobni region jezgra podvučen), DKTHTCPPCPAPELLGGPS (SEQ ID NO: 174; zglobni region jezgra podvučen), i DKTHTCPPCPAPELLGGSS (SEQ ID NO: 175; zglobni region jezgra podvučen). U jednom primeru izvođenja, ostatak P na položaju 18 od SEQ ID NO: 169 zamenjen je sa S kako bi se ukinula Fc efektorska funkcija; ova zamena je prikerna u zglobovima sa bilo kojom od SEQ ID NO: 172, 173, i 175. U još jednom primeru izvođenja, ostatci DK na položajima 1-2 od SEQ ID NO: 169 zamenjeni su sa GS radi uklanjanja potencijalnog klipnog mesta; ova zamena data je kao primer u SEQ ID NO: 173. U još jednom primeru izvođenja, C na položaju 103 od SEQ
4
ID NO: 176, koji odgovara kstantnom regionu teškog lanca humanog IgG1 (tj., domeni CH1-CH3), zamenjen je sa S radi sprečavanja nepravilnog formiranja cisteinske veze u odsustvu lakog lanca; ova zamena je prikazana u SEQ ID NO: 171-173.
[0176] U određenim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin-Fc fuzije mogu imati sledeće konfiguracije: 1) anti-miostatin adnektin-zglobni-Fc ili 2) zglobni-Fc-anti-miostatin adnektin. Tako, bilo koji anti-miostatin adnektin ovog pronalaska može biti fuzionisan sa Fc regionom koji obuhvata zglobnu sekvencu prema ovim konfiguracijama. U nekim primerima izvođenja, veznik se može primeniti za spajanje anti-miostatin adnektina za zglobnu-Fc grupa, na primer, primerni fuzioni protein može imati konfiguraciju anti-miostatin adnektin-veznik-zglobni-Fc ili zglobni-Fc-veznik-anti-miostatin adnektin. Dodatno, zavisno od sistema u kojem se proizvodi fuzioni polipeptid, vodeća sekvenca može biti smeštena na N-terminus fuzionog polipeptida. Na primer, ako je fuzija proizvedena u sisarskom sistemu, vodeća sekvenca kao što je METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 177) može se dodati N-terminusu fuzionog molekula. Ako je fuzija proizvedena u E. coli, fuzionj sekvenci će prethoditi metionin.
[0177] Sledeće sekvenca daje kao primer anti-miostatin adnektin-zglobni-Fc konstrukt:
Vodeća sekvenca je podebljana, anti-miostatin adnektin sekvenca je zakošena, i zglobni region je podvučen. Treba shvatiti da je C-terminalni lizin opcioni.
[0178] Ovde, Fc domen obuhvata humane IgG1 CH2 i CH3 regione kako sledi:
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 178) i zglobnu sekvencu DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 170).
[0179] Sledeće sekvenca predstavljaju Fc-anti-miostatin adnektin konstrukt:
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPEL QLEESAAEAQEGELEGVSDVPKDLEVVAATPTSLLISWSLPHQGKANYYRITYGETGGNS PVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTDTGYLKYKPISINYRTEI (PRD-1474; SEQ ID NO: 273). Zglobni region je podvučen, vodeća sekvenca je podebljana, a anti-miostatin adnektin sekvenca je zakošena.
[0180] Ovde, Fc domen obuhvata humane IgG1 CH2 i CH3 regione kako sledi:
VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP (SEQ ID NO: 179) i zglobnu sekvencu DKTHTCPPCPAPELLG (SEQ ID NO: 170).
[0181] Primerne anti-miostatin adnektin-Fc fuzije i Fc-anti-miostatin adnektin fuzije prikazane su u tabeli 6 (SEQ ID NO: 252-273). Sve sekvence mogu početi metioninom ili vodećom sekvencom sisara (npr., SEQ ID NO: 177).
adnektini
[0182] U nekim primerima izvođenja PK grupa je još jedan adnektin specifičan, na primer, serumskom proteinu (npr., humani serumski albumin), kako je opisano u US 2012/0094909. Druge PK grupe koje se mogu primeniti sa adnektinima ovog pronalaska opisane su Kontermann et al. (Current Opinion in Biotechnology 2011;22:868-76), kako je prethodno razmatrano. Na primer, takve PK grupe na bazi adnektina mogu biti direktno ili indirektno vezane za anti-miostatin adnektin putem polipeptidnog veznika. Pogodni veznici za spajanje Fn3 domena su oni koji omogućavaju da se odvojeni domeni saviju nezavisno jedan od drugo i obrazuju tro dimenzonalnu strukturu koja omogućava vezivanje visokog afiniteta za ciljanji molekul. Primerni polipeptidni veznici uključuju PSTSTST (SEQ ID NO: 210), EIDKPSQ (SEQ ID NO: 211), i GS veznike, kao što je GSGSGSGSGS (SEQ ID NO: 213) i njihovi multimeri. U nekim primerima izvođenja, veznik je veznik na bazi glicin-serina. Ovi veznici obuhvataju glicin i serin ostatke i mogu biti između 8 i 50, 10 i 30, i 10 i 20 aminokiselina u dužini. Primeri uključuju veznike kao aminokiselinske sekvence (GS)7(SEQ ID NO: 215), G(GS)6(SEQ ID NO: 216), i G(GS)7G (SEQ ID NO: 217). Drugi veznici sadrže glutaminsku kiselinu, i uključuju, na primer, (GSE)s(SEQ ID NO: 218) i GGSEGGSE (SEQ ID NO: 219). Drugi primerni glicin-serin veznici uključuju (GS)4(SEQ ID NO: 212), (GGGGS)7(SEQ ID NO: 220), (GGGGS)s(SEQ ID NO: 221), i (GGGGS)3G (SEQ ID NO: 222). U nekim primerima izvođenja, veznik je veznik na bazi glicin-prolina. Ovi veznici obuhvataju glicinske i prolinske ostatke i mogu biti između 3 i 30, 10 i 30, i 3 i 20 aminokiselina u dužini. Primeri uključuju veznike kao aminokiselinska sekvenca (GP)3G (SEQ ID NO: 223), (GP)sG (SEQ ID NO: 224), i GPG. U drugim primerima izvođenja, veznik može biti veznik na bazi prolin-alanina sa između 3 i 30, 10 i 30, i 3 i 20 aminokiselina u dužini. Primeri prolin alanin baziranih veznika uključuju, na primer, (PA)3(SEQ ID NO: 225), (PA)6(SEQ ID NO: 226) i (PA)9(SEQ ID NO: 227). Optimalna dužina veznika i aminokiselinska kompozicija mogu se odrediti rutinskim ekspreminetisanjem u pogledu ovde obezbeđenih saznanja. U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin je vezan, na primer, za anti-HSA adnektin putem polipeptidnog veznika sa mestom proteaze koje se može cepati proteazom u krvi ili ciljanom tkivu. Takvi primeri izvođenja mogu se primeniti za oslobađanje anti-miostatin adnektina radi bolje dostave ili terapeutske osobine ili efikasnije proizvodnje.
[0183] Dodatni veznici ili spejseri, mogu biti uvedeni na N-terminusu ili C-terminusu Fn3 domena između Fn3 domena i polipeptidnog veznika.
[0184] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin može biti direktno ili indirektno vezan na primer, za anti-HSA adnektin putem polimernog veznika. Polimerni veznici mogu se primeniti optimalno varirajući u rastojanju svake komponente fuzije da bi se stvorio protein fuzije sa jednom ili više sledećih karakteristika: 1) smanjen ili povećana prostorna prepreka vezivanja jednog ili više domena proteina u vezivanju za ciljani protein, 2) povećana stabilnosti ili rastvorivost proteina, 3) smanjena agregacija proteina, i 4) povećana ukupna težnja ili afinitet proteina.
[0185] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektin je vezan, na primer, za anti-HSA adnektin, putem biokompatibilnog polimera kao što je polimerni šećer. Polimerni šećer može da uključi mesto cepanja enzimom koje se može pocepati enzimom u krvi ili ciljanom tkivu. Takvi primeri izvođenja mogu se primeniti za oslobađanje anti-miostatin adnektina radi bolje dostave ili terapeutske osobine ili efikasnije proizvodnje.
[0186] Kratak pregled monoadnektina i njihovih modifikovanih oblika odgovarajućih PK grupa (npr., PEGilovane i Fc fuzije) dat je u tabeli 3.
Tabela 3
Nemodifikovani monoadnektini imaju adnektin sekvencu jezgra kojoj prethodi N-terminalna ekstenziona sekvenca (MGVSDVPRDL; SEQ ID NO: 306) a praćena je C-terminalnim repom (EIDKPSQHHHHHH; SEQ ID NO: 325), kako je prikazano u tabeli 2. sekvenca jezgra adnektina odgovara monoadnektin sekvenci kojoj nedostaju N-terminalne ekstenziona i C-terminalna repna sekvenca.<b>adnektini sa cisteinskim mutantima imaju adnektin sekvencu jezgra od monoadnektina u prvoj koloni, a kojoj prethodi N-terminalna ekstenziona sekvenca (MGVSDVPRDL; SEQ ID NO: 306), a praćena je C-terminalnim repom (GSGC[Modifikacija]HHHHHH; SEQ ID NO: 326 ili EGSGC[Modifikacija]HHHHHH; SEQ ID NO: 327), kako je prikazano u tabeli 5.
<c>adnektini sa Fc grupom na C-terminusu ima adnektin sekvencu jezgra od monoadnektina u prvoj koloni, kojoj prethodi N-terminalna ekstenziona sekvenca (GVSDVPRDL; SEQ ID NO: 307), a praćena je C-terminalnim repom (EI), koji je praćeno veznik sekvencom (Tabela 4) i sekvencom Fc regiona, kako je opisano u tabeli 6.
<d>adnektini sa Fc grupom na N-terminusu imaju sekvencu Fc regiona kojoj prethodi N-terminalna zglobna sekvenca, a praćena je veznikom (Tabela 4), i adnektin sekvencu jezgra od monoadnektina u prvoj koloni, kojoj samoj prethodi N-terminalna ekstenziona sekvenca (GVSDVPRDL; SEQ ID NO: 307), a praćena je C-terminalnim repom (EI), kako je prikazano u tabeli 6.
[0187] SEQ ID NO primernih veznika ovog pronalaska dati su u tabeli 4.
Tabela 4
1
2
[0188] SEQ ID NO za primerne E PEGilovanE anti-miostatin adnektin-e ovog pronalaska, date su u tabeli 5.
Tabela 5
PEGilovani Anti-Miostatin adnektini
4
[0189] SEQ ID NO za primerne Fc-fuzionisane anti-miostatin adnektin-e ovog pronalaska, date su u tabeli 6.
Tabela 6
1
2
4
1
2
4
[0190] SEQ ID NO primernih vodećih (N-terminalne ekstenzione) i C-terminalnih repnih sekvenci ovog pronalaska, date su u tabeli 7.
Tabela 7
IV. Fuziona tehnologija nukleinska kiselina-protein
[0191] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje adnektin koji obuhvata domene fibronektinskog tipa III koji vezuju miostatin. Jedan način da se rapidno izrade i ispitaju Fn3 domeni sa osobinama specifičnog vezivanja je fuziona tehnologija nukleinske kiseline-proteina od Adnexus, Bristol-Myers Squibb R&D Company. Ovaj pronalazak koristi in vitro ekspresiju i tehnologiju tagovanja, pod nazivom 'PROfuzija' koja koristi fuzije nukleinska kiselina-protein (RNK- i DNK-proteinske fuzije) da bi se identifikovali novi polipeptidi i aminokiselinski motivi koji su značajni za vezivanje sa proteinima. Fuziona tehnologija nukleinska kiselina-protein je tehnologija koja kovalentno kupluje protein sa njegovom kodirajućom genetskom informacijom. Za detaljan opis fuzione tehnologije RNK-protein i postupaka za skrining biblioteke skafold proteina na bazi fibronektina videti Szostak et al., U.S. Pat. Br.6,258,558, 6,261,804, 6,214,553, 6,281,344, 6,207,446, 6,518,018 i 6,818,418; Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997;94:12297-12302; i Kurz et al., Molecules, 2000;5:1259-64.
V. Vektori i Polinukleotidi
[0192] Nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od različitih ovde opisanih proteina ili polipeptida mogu biti hemijski sintetizovani. Upotreba kodona može biti odabrana tako da poboljša ekspresiju u ćeliji. Takva upotreba kodona zavisiće od odabranog ćelijskog tipa. Specijalizovani šabloni upotrebe kodona razvijeni su za E. coli i druge bakterije, kao i sisarske ćelije, biljne ćelije, ćelije kvasca i ćelije insekta. Videti na primer: Mayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan.21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (October 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (October 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (September 1996); and Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (October 1991).
[0193] Opšte tehnike za manipulaciju nukleinskom kiselinom opisane su u, na primer, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-go izdanje, Vol.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), ili Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing i Wiley-Interscience, New York (1987) i periodične dopune. Generalno, DNK koja kodira polipeptid je operativno vezana za pogodne transkripcione ili translacione regulatorne elemente izvedene iz sisarskih, virusnih, ili gena insekata. Takvi regulatorni elementi uključuju transkripcioni promoter, opcionu operatorsku sekvencu radi kontrole transkripcije, sekvencu koja kodira pogodno mRNK ribozomalno mesto vezivanja, i sekvence koje kontrolišu terminaciju transkripcije i translacije. Sposobnost da se replicira u domaćinu, obično je potvrđena izvorom replikacije, a odabir gena kako bi se omogućilo prepoznavanje transformanata dodatno je uključen.
[0194] Ovde opisani proteini mogu se proizvesti rekombinantno ne samo direktno, već takođe kao fuzioni polipeptid sa heterolognim polipeptidom, koji je poželjno signalna sekvenca ili drugi polipeptid sa specifičnim mestom cepanja na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Odabrana heterologna signalna sekvenca poželjno je ona koja je prepoznata i obrađena (tj., pocepana signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. Primerna N-terminalna vodeća sekvenca za proizvodnju polipeptida u sisarskom sistemu: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 177), koji se uklanja ćelijom domaćina nakon ekspresije.
[0195] Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i ne obrade nativnu signalnu sekvencu, signalna sekvenca supstituisana je odabranom prokariotskom signalnom sekvencom, na primer, iz grupe alkalne fosfataze, penicilinaze, 1 pp, ili toplotno stabilne enterotoksin II lidera.
[0196] Za sekreciju kvasca, nativne signalna sekvenca može biti supstituisana pomoću, npr., lidera invertaze kvasca, faktor lidera (koji uključuju Saccharomyces i Kluyveromyces alfa-faktor lidere), ili lider fosfataze lidera, lidera C. albicans glukoamilaze, ili signalne sekvence opisani u U.S. Pat. Br.5,631,144. Kod ekspresije ćelija sisara,dostupne su sisarske signalne sekvence kao i virusni sekretorni lieri, na primer, herpes simpleks gD signal. DNK za takve prekursore ili regione mogu biti vezani u okviru čitanja za DNK koja kodira taj protein.
[0197] I ekspresioni i klonirajući vektori sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava da se vektili Replicira u jednu ili više odabranih ćelija domaćina. Generalno, kod klonirajućih vektora, ova sekvenca je ona koja omogućava da se vektili Replicira nezavisno hromozomalne DNK domaćina, i uključuje izvore replikacija ili autonomno replikujuće sekvence. Takve sekvence dobro su poznate za različite bakterije, kvasac, i viruse. Poreklo replikacije iz plazmida pBR322 pogodno je za većinu Gramnegativnih bakterija, izvor 2 mikron plazmida je pogodno za kvasac, a razni izvori virusa (SV40, poliom, adenovirus, VSV ili BPV) korisna su za kloniranje vektora u sisarskim ćelijama. Generalno, poreklo replikacione komponente nije potrebno za sisarske ekspresione vektore (SV40 izvor može se tipično primeniti samo iz razloga što sadrži rani promoter).
[0198] Ekspresioni i klonirajući vektori mogu da sadrže selekcioni gen, koji se takođe naziva selektabilni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) dodeljuju rezistenciju prema antibioticima ili drugim toksinima, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat, ili traciklin, (b) komplement auksotrofne deficijencije, ili (c) dostavljaju kritične nutrijente koji nisu dostupni iz medijuma kompleksa, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacile.
[0199] Ekspresioni i klonirajući vektori obično sadrže promoter koji se prepoznaje od strane organizma domaćina i koji je operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira protein ovog pronalaska, npr., skafold protein na bazi fibronektina. Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promoterske, beta-laktamaza i laktoza promoterske sisteme, alkalin fosfataza, triptofan (trp) promoterski sistem, i hibrid promotere kao što je tan promoter. Međutim, drugi poznati bakterijski promoteri su takođe pogodni. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima takođe sadrže Shine-Dalgarno (S.D.) sekvencu operativno vezanu za DNK koja kodira protein ovog pronalaska. Promoter sekvence su poznate za eukariote. Virtuelno svi eukariotski geni imaju AT-bogat region smešten približno 25 do 30 baza uzvodno od mesta na kojem je započeta transkripcija. Još jedna sekvenca otkrivena 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region u kojem N može biti bilo koji nukleotid. Na 3' kraju većine eukariotskih gena AATAAA sekvenca je ta koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodirajućih sekvenci. Sve ove sekvence pogodno se umeću u eukariotske ekspresione vektore.
[0200] Primeri pogodnih promovišućih sekvenci za upotrebu sa domaćinima kvasca uključuju promotere za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što je enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triosefosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza, i glukokinaza.
[0201] Transkripcija iz vektora u sisarskim ćelijama domaćinima mogu biti kontrolisane, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa kao što je polioma virus, kokošiji virus, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papilloma virus, virus ptičijeg sarkoma, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus i najpoželjniji Simian Virus 40 (SV40), od heterolognih sisarskih promotera, npr., promoter aktina ili imunoglobulinski promoter, od promotera toplotnog šoka, pod uslovom da su ovakvi promoteri kompatibilni sa ćelijskim sistemima domaćina.
[0202] Transkripcija DNK koja kodira protein ovog pronalaska višim eukariotima često je povećana umetanjem pojačivačke sekvence u vektor. Mnoge ojačivačke sekvence sada su poznate iz sisarskih gena (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein, i insulin). Međutim, tipično se koristi pojačivač iz virusa eukariotske ćelije. Primeri uključuju SV40 pojačivač na zadnjoj strani replikacionog izvor (bp 100-270), pojačivač rabog promotera citomegalovirusa, polioma pojačivač na zadnjoj strani replikacionog izvora, i pojačivače adenovirusa. Videti takođe Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) o elementima ojačavanja za aktivaciju eukariotskih promotera. Taj pojačivač može biti splajsovan u vektoru na položaju 5' ili 3' u peptid-kodirajuću sekvencu, ali je poželjno smešten na mesto 5' iz promotera.
[0203] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina (npr., kvasac, gljivice, insekti, biljke, životinje, ljudi, ili nukleisane ćelije iz drugih višećelijskih organizama) takođe sadrže sekvence potrebne za terminaciju transkripcije i za stabilizovanje mRNK. Takve sekvence uobiajeno su dostupne iz 5' i, povremeno 3', netranslantiranim regionima eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkriptovane kao poliadenilisani fragmenti u netranslatiranom delu mRNK koji kodira protein ovog pronalaska. Korisna transkripciona terminaciona komponenta je poliadenilacioni region goveđeg hormona rasta. Videti WO 94/11026 i ekspresioni vektor opisan u njemu.
[0204] Rekombinantna DNK takođe može da uključuje bilo koji tip proteinske tag sekvence koja može biti korisna za prečišćavanje proteina. Primeri proteinskih tagova uključuju, ali se ne ograničavaju na, histidinski tag, FLAG tag, myc tag, HA tag, ili GST tag. Pogodni klonirajući i ekspresioni vektori za upotrebu sa bakterijski, gljivičnim, kvasca, i sisarskim ćelijama domaćina mogu se pronaći u Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York (1985)).
[0205] Ekspresioni konstrukt uvodi se u ćeliju domaćina upotrebom postupka pogodnog za tu ćeliju domaćina, što je jasno stručnjaku iz ove oblasti. Različiti postupci za uvođenje nukleinskih kiselina u ćelije domaćina poznate su u ovoj oblasti, koji uključuju, ali se ne ograničavaju na, elektroporacija; transfekcija koja uključuje kalcijum hlorid, rubidijum hlorid, kalcijum fosfat, DEAE-dekstran, ili druge supstance; mikroprojektilsko bombardovanje; lipofekcija; i infekcija (kod koje je vektili Invektivni agens).
[0206] Pogodne ćelije domaćini uključuju prokariote, kvasac, sisarske ćelije, ili bakterijski ćelije. Pogodne bakterije uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme, na primer, E. coli ili Bacillus spp. Kvasac, poželjno iz Saccharomyces vrste, kao što je S. cerevisiae, mogu se takođe primeniti za proizvodnja polipeptida. Razni sistemi za uzgajanje sisarskih ili ćelija insekata takođe se mogu primeniti za eksprimiranje rekombinantnih proteina. Bakuloviralni sistemi za proizvodnju heterolognih proteina u ćelijama insekata razmatrane su od strane Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988)). Primeri pogodnih sisarskih linija ćelija domaćina uključuju ndotelijalne ćelije, COS-7 majmunske ćelije bubrega, CV-1, L ćelije, C127, 3T3, jajnici kineskog hrčka (CHO), ćelije humanog embriona embriona, HeLa, 293, 293T, i BHK ćelijske linije. Ćelijski polipeptidi pripremaju se uzgajanjem pogodnih sistema domaćin/vektili Radi eksprimiranja rekombinantnih proteina. Za mnoge primene, mala veličina mnogih polipeptida koji su ovde opisani mogli bi da učine ekspresiju u E. coli poželjnim postupkom za ekspresiju. Taj protein se zatim prečišćava od medijuma kulture ili ćelijskih ekstrakata.
VI. Proizvodnja proteina
[0207] Ovaj pronalazak takođe je usmeren na ćelijske linije koje eksprimiraju anti-miostatin adnektin ili njegov fuzioni polipeptid. Stvaranje i izolovanje ćelijskih linija koje proizvode anti-miostatin adnektin mogu se izvesti upotrebom standardne tehnike poznate u ovoj oblasti, kao što su one opisane ovde.
[0208] Ćelije domaćina transformisane su ovde opisanom ekspresionim ili klonirajućim vektorima radi proizvodnje proteina i uzgajanje u konvencionalnim medijumima za prehranu modifikovani po potrebi za indukovanje promotera, biranje transformanta, ili amplifikovanje gena koji kodiraju poželjne sekvence. U ovde prikazanim primerima, ćelije domaćini upotrebljene za proizvodnju proteina visoke propusnosti (HTPP) i proizvodnju srednje skale su one iz HMS174-bakterijskog soja.
[0209] adnektini ovog pronalaska takođe mogu biti dobijeni u aglikolizovanom obliku proizvodnjom adnektina u, npr., prokariotskim ćelijama (npr., E. coli). Određenije, aglikolizovani oblici adnektina ovog pronalaska pokazuju isti afinitet, potenciju, i mehanizam dejstvovanja kao glikolizovani adnektini prilikom in vitro testiranja.
[0210] Ćelije domaćini upotrebljene za proizvodnju proteina prema ovom pronalasku mogu biti uzgajane u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medijumi kao što je Ham-ov F10 (Sigma), Minimalni Esencijalni Medijum ((MEM), (Sigmsa), RPMI-1640 (Sigma), i Dulbecco-ov Modifikovan Eagleov Medijum ((DMEM), Sigma)) pogod i za uzgajanje ćelija domaćina. Pored toga, mnogi medijumi opisani u Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980), U.S. Pat. Br.4,767,704, 4,657,866, 4,927,762, 4,560,655, 5,122,469, 6,048,728, 5,672,502, ili U.S. Pat. Br. RE 30,985 mogu se primeniti kao medijumi za uzgajanje za ćelije domaćina. Bilo koji od ovih medijuma mogu biti dopunjeni ukoliko je potrebno sa hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što je insulin, transferin, ili epidermalni faktili Rasta), solima (kao što je natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum, i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što je adenozine i timidin), antibioticima (kao što je lek gentamicin), elementima za praćenje (definisani kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u konačnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu), i glukozom ili ekvivalentnim energetskim izvorom. Bilo koji drugi potrebi suplementi takođe mogu biti uključeni u pogodnim koncentracijama koje su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi uzgajanja, kao što je temperatura, pH, i slično, su oni koji su prethodno opisani sa ćelijom domaćina odabranom za ekspresiju, i očigledni su stručnjaku iz ove oblasti.
[0211] Ovde opisani proteini takođe mogu biti proizvedeni upotrebom sistema za translaciju ćelija. Za takve svrhe, nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid moraju se modifikovati da bi omogućile in vitro transkripcije za proizvodnju mRNK i da bi omogućile bezćelijsku translaciju mRNK u određeni bezćelijski sistem koji se upotrebljava (eukariotski kao što je sisarski ili kvasca translacioni sistem oslobođen od ćelija ili prokariotski kao što je bakterijski translacioni sistem oslobođen od ćelija.
[0212] Proteini ovog pronalaska takođe mogu biti proizveden hemijskom sintezom (npr., postupcima opisano u Solid Phase Peptide Synthesis, 2-go izdanje, The Pierce Chemical Co., Rockford, I11. (1984)). Modifikacije na proteinu takođe mogu biti proizvedene hemijskom sintezom.
[0213] Proteini ovog pronalaska mogu biti prečišćeni postupcima izolovanja/prečišćavanja za proteine generalno poznati u oblasti proteinske hemije. Neograničavajući primeri uključuju ekstrakciju, rekristalizaciju, oslobađanje od soli (npr., amonijum sulfatom ili natrijum sulfatom), centrifugiranje, dijaliza, ultrafiltracija, adsorpciona hromatografija, jonoizmenjivačka hromatografija, hidrofobna hromatografija, hromatografija normalne faze, reverzno-fazna hromatografija, gel filtracija, gel propusna hromatografija, afinitetna hromatografija, elektroforeza, distribucija suprotnog toka ili bilo koja njihova kombinacija. Nakon prečišćavanja, polipeptidi mogu biti zamenjeni u različitim puferima i/ili koncentrovani bilo kojim različitim postupcima poznatim u struci, koji uključuju, ali se ne ograničavaju na, filtraciju i dijalizu.
[0214] Prečišćeni polipeptid je poželjno najmanje 85% čist, ili poželjno najmanje 95% čist, i najpoželjnije najmanje 98% čist. Bez obzira na tačnu numeričku vrednost čistoće, polipeptid je dovoljno čist za upotrebu kao farmaceutski proizvod.
VII. Biofizička i Biohemijska Karakterizacija
[0215] Vezivanje anti-miostatin adnektina ovog pronalaska za ciljani molekul (npr., miostatin) mogu se odrediti u smislu konstanti ravnoteže (npr., disocijacija, KD) i u smislu konstanti kinetike (npr., konstanta brzine vezivanja, koni konstanta brzine otpuštanja, koff). Adnektin se generalno vezue se za ciljani molekul sa KDod manje od 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 200 pM, ili 100 pM, iako se više KDvrednosti mogu tolerisati kada je koffdovoljno niska ili je kon, dovoljno visoka.
In vitro Ogledi za afinitet vezivanja
[0216] Anti-miostatin adnektini koji se vezuju za i antagonišu miostatin mogu biti identifikovani upotrebom raznih in vitro ogleda. Poželjno, ogledi su visoko-propusni ogledi koji omogućavaju skrining više adnektina kandidata simultano. U nekim primerima izvođenja, BMP-11, koji deli 90% aminokiselinskog identiteta sa miostatinom, može se primeniti kao surogat za miostatin u in vitro
1
ogledima kada je ogled izveden pod zasićenim uslovima. Određenije, anti-miostatin adnektini fuzionisani sa Fc domenima mogu da vezuju i miostatin i BMP-11, dok se monoadnektini vezuju pre svega sa miostatinom. Bez vezivanja za teoriju, ovo može da utiče na povećanu težnju bivalentno Fcfuzionisanih adnektina u poređenju sa monovalentnim adnektina. Slično osnažebez vezivanja za BMP11 zapaženo je sa bivalentnim PEGilovanim adnektina, kao što je ATI-1341, koji obuhvataju adnektin-e fuzionisane sa dva kraja 20kDa PEG grupe.
[0217] Primerni ogledi za određivanje afiniteta vezivanja anti-miostatin adnektina opisani su u primerima koji slede, i uključuju, ali se ne ograničavaju na, postupke faze rastvora kao što je ogled kinetičkog isključivanja (KinExA) (Blake et al., JBC 1996;271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004;328:35-43), površinska plazmonska rezonanca (SPR) sa Biacore sistemom (Uppsala, Sweden) (Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991;23:1; Morton i Myszka, Methods in Enzymology 1998;295:268) i ogledi homogene vremenski razložene fluorescencije (HTRF) (Newton et al., J Biomol Screen 2008;13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008;6:55-68).
[0218] U nekim primerima izvođenja, biomolekularne interakcije mogu se pratiti u realnom vremenu putem Biacore sistema, koji koristi SPR da detektuje promene u uglu rezonancije svetla na površini tankog filma zlata na staklenoj podlozi zbog promene u refraktivnom indeksu površine do 300 nm udaljene. Biacore analiza generiše konstantne brzine asocijacije, konstantne brzine disocijacije, konstante disocijacije ravnoteže, i konstante afiniteta. Afinitet vezivanja dobija se određivanjem konstanti brzine asocijacije i disocijacije upotrebom Biacore sistema površinske plazmonske rezonance (Biacore, Inc.). Biosenzorni čip aktivira se za kovalentno kuplovanje mete. Ta meta se zatim razblažuje i ubrizgava preko čipa kako bi se obezbedio signal u jedinicama odgovora imobilizovanog materijala. Kako je signal jedinicama rezonance (RU) proporcionalan masi imobilizovanog materijala, to predstavlja opseg imobilizovanih ciljanih gustina na matrici. Podaci asocijacije i disocijacije su podešeni simultano u globalnoj analizi kako bi se razrešila brzina mrežne ekspresije za 1:1 bimolekularne interakcije, dajući najbolje vrednosti podešavanja za kon, koffi Rmax(maksimalni odgovili Pri zasićenosti). Konstante disocijacije ravnoteže za vezivanje, KDizračunavaju se iz SPR merenja kao koff/kon.
[0219] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska pokazuju KDu SPR afinitetnom ogledu opisan u primeru 6 od 500 nM ili manje, 400 nM ili manje, 300 nM ili manje, 200 nM ili manje, 150 nM ili manje, 100 nM ili manje, 90 nM ili manje, 80 nM ili manje, 70 nM ili manje, 60 nM ili manje, 50 nM ili manje, 40 nM ili manje, 30 nM ili manje, 20 nM ili manje, 15 nM ili manje, 10 nM ili manje, 5 nM ili manje, ili 1 nM ili manje. Poželjno, KDje 15 nM ili manje. Poželjnije, KDje 2.0 nM ili manje.
[0220] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska pokazuju IC50 u HTRF ogledu opisanom u primeru 4 od 5 nM ili manje, 4 nM ili manje, 3 nM ili manje, 2.5 nM ili manje, 2 nM ili
2
manje, 1.5 nM ili manje, 1 nM ili manje, 0.5 nM ili manje, 0.2 nM ili manje, ili 0.1 nM ili manje. Poželjno, IC50 je 1.5 nM ili manje. Poželjnije, IC50 je 0.5 nM ili manje.
[0221] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska pokazuju KDu ogledu kinetičkog isključivanja opisanom u primeru 7 od 2 nM ili manje, 1.5 nM ili manje, 1 nM ili manje, 900 pM ili manje, 850 pM ili manje, 800 pM ili manje, 750 pM ili manje, 700 pM ili manje, 650 pM ili manje, 600 pM ili manje, 550 pM ili manje, 500 pM ili manje, 450 pM ili manje, 400 pM ili manje, 350 pM ili manje, 340 pM ili manje, 330 pM ili manje, 300 pM ili manje, 250 pM ili manje, 200 pM ili manje, 150 pM ili manje, ili 100 pM ili manje. Poželjno, KDje 850 pM ili manje.
[0222] Treba shvatiti da su ovde opisani ogledi dati kao primer, i da bilo koji postupak poznat u ovoj oblasti za određivanje afiniteta vezivanja između proteina (npr., transfer na bazi fluorescencije (FRET), enzim-vezani imunosorbentni ogled, i kompetitivni ogledi vezivanja (npr., radioimunoogledi)) mogu se primeniti za određivanje afiniteta vezivanja anti-miostatin adnektina ovog pronalaska.
In vitro Ogledi za Antagonističku Aktivnost
[0223] Sposobnost anti-miostatin adnektina da antagonišu aktivnost miostatina može se lako odrediti upotrebom raznih in vitro ogleda. Poželjno, ogledi su visoko-propusni ogledi koji omogućavaju skrining više adnektina kandidata simultano. U nekim primerima izvođenja, antagonist efekti anti-miostatin adnektina na aktivnost miostatina mogu se odrediti ćelijski-bazirani aktivin responsivni element (ARE)-luciferaza reporter ogledima, kako je opisano u primeru 3. U određenim primerima izvođenja, antimiostatin adnektini ovog pronalaska snižavaju miostatin-indukovanu ARE-luciferaza aktivnost za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% ili više u odnosu na kontrolu nakon zajedničkog inkubisanja miostatina sa anti-miostatin adnektin-om pre stimulisanja ćelija sa mešavinom. Primerna kontrolna reakcija uključuje tretiranje ćelije samo sa miostatinom ili miostatinom prethodno inkubisanim sa viškom benčmark miostatin inhibitora kao što je Humani Aktivin RIIB Fc Chimera (R&D Systems) ili ActRIIb-Fc kako je opisano u Morrison et al. (Experimental Neurology 2009; 217:258-68). U drugim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska inhibiraju ARE-luciferaza reporter aktivnost sa IC50 od 500 nM ili manje, 400 nM ili manje, 300 nM ili manje, 200 nM ili manje, 100 nM ili manje, 50 nM ili manje, 10 nM ili manje, 5 nM ili manje, 1 nM, 0.5 nM ili manje, 0.4 nM ili manje, 0.3 nM ili manje, 0.2 nM ili manje, ili 0.10 nM ili manje, kako je opisano u primeru 3.
[0224] U drugim primerima izvođenja, antagonistički efekti anti-miostatin adnektina na aktivnost miostatina mogu se odrediti merenjem zastupljenosti SMAD fosforilacije u miostatin-tretiranim ćelijama, kako je opisano u primeru 5. U određenim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska snižavaju miostatin-indukovanu SMAD fosforilaciju za najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 97% ili više u odnosu na kontrolu nakon zajedničkog inkubisanja miostatina sa anti-miostatin adnektin-om pre stimulisanja ćelija mešavinom. Primerna kontrolna reakcija uključuje tretiranje ćelije samo sa miostatinom ili miostatinom prethodno inkubisanim sa viškom benčmark miostatin inhibitorom kao što je Human Aktivin RIIB Fc Chimera (R&D Systems) ili ActRIIb-Fc kako je opisano u Morrison et al. (Experimental Neurology 2009;217:258-68). U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska inhibiraju SMAD fosforilacija sa IC50 od 1 nM ili manje, 0.8 nM ili manje, 0.6 nM ili manje, 0.4 nM ili manje, 0.3 nM ili manje, 0.2 nM ili manje, ili 0.1 nM ili manje in a 12-tačka ili 4-tačka inhibicioni odgovor, kako je opisano u primeru 5. U drugim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska pri 10 nM inhibiraju SMAD fosforilaciju miostatinom za najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, ili najmanje 98% ili više, kako je opisano u primeru 5.
[0225] Dodatno, poznato je više sistema in vitro modela koji koriste ćelijsku, tkivnu kulturu i histološke postupke za ispitivanje bolesti motornih neurona. Na primer, organotipski isečak kičmene moždine pacova podvrgnut glutamatnoj ekscitotoksičnosti, koristan je kao sistem modela za ispitivanje efektivnosti anti-miostatin adnektina u sprečavaju degeneracije motornih neurona. Corse et al., Neurobiol. Dis. (1999) 6:335346. Za objašnjenje in vitro sistema za upotrebu u ispitivanju ALS, videti, npr., Bar, P. R., Eur. J. Pharmacol. (2000) 405:285295; Silani et al., J. Neurol. (2000) 247 Suppl 1:12836; Martin et al., Int. J. Mol. Med. (2000) 5:313.
[0226] Treba shvatiti da ovde opisani ogledi su dati kao primer, i da bilo koji od postupaka poznatih u ovoj oblasti koji može da služi za očitavanje aktivnosti miostatina mogu biti pogodni za upotrebu u ispitivanju miostatin antagonizirajućih efekata anti-miostatin adnektina ovog pronalaska (npr., RT-PCR za mRNK od SMAD ciljanih gena u realnom vremenu (npr., Smad 7; Ciarmela et al., Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2011;96;755-65) ili mRNK od gena koji sadrže ARE).
In vivo modeli
[0227] Postoje razni u struci poznati životinjski modeli koji rekapituliraju simptome bolesti, poremećaja, i stanja povezanih sa gubljenjem mišićne mase povezani sa, na primer sa mišićnim, neuromišićnim, neurološkim i metaboličkim poremećajima. Ovi modeli mogu se primeniti za ispitivanje efikasnosti antimiostatin adnektina ovog pronalaska.
[0228] Na primer, neograničavajući primeri takvih životinjski modeli su, npr., model X-vezane distrofije mišića miša (mdx) (US2011/0008375, Gehrig et al., Nature 2012;484:394-8), koji uključuje 4 dodatna soja mdx miša-mdx2cv, mdx3cv, mdx4cv, ili mdx5cv miš (Phelps et al., Human Molecular Genetics. 1996;5(8):1149-1153), mdx miš sa dodatnom ablacijom distrofin homolog utrofina (mdx/utr<-/->) (Deconinck et al., Cell.1997;90(4):717-727), alfa-SG-nulti C57BL/6 miš (Duclos et al.i(1998) J. Cell Biol.
4
142, 1461-1471), i oni koji su nedavno obrađeni od strane Nakamura et al., (J Biomed Biotechnol.2011; Predmet ID No: 184393), npr., mdx52 miš, kod kojeg ekson 52 mišjeg DMD gena je obrisan, model distrofije mišića kod zlatnog retrivera (GRMD), model X-Vezane Distrofije mišića kod pasa (CXMDJ), i model Hipetrofije Distrofije mišića kod mačaka (HFMD) (npr., Shelton et al., Neuromuscular Disorders.
2005; 15(2): 127-138).
[0229] Životinjski modeli za ispitivanje motoneuronskih poremećaja kao što je ALS su transgeni miševi sa ALS-vezanom mutant Cu/Zn superoksid dismutaza (SOD1) genom (mSOD1G93A i/ili mSOD1G37R). Ovi miševi imaju razvijen dominantno inherentan paralitički poremećaj koji se javlja kod odraslih jedinki sa mnogim kliničkim i patološkim osobinama sličnim sa ALS. (npr., Gurney et al., Science (1994) 264:1772 1775; Nagano et al., Life Sci (2002) 72:541548). Drugi životinjski modeli uključuju dva prirodna mišja modela za progresivnu motornu neuronopatiju (pmn) i trzavicu (Haegggeli i Kato, Neurosci. Lett. (2002) 335:3943). Za pregled raznih životinjskih modela za upotrebu u izučavanju motoneuronskih bolesti kao što je ALS, videti, npr., Jankowsky et al., Curr Neurol Neurosci. Rep. (2002) 2:457464; Elliott, J. L., Neurobiol. Dis. (1999) 6:31020; i Borchelt et al., Brain Pathol. (1998) 8:735757.
[0230] Životinjski modeli drugih neurodegenerativnih ili neuropatoloških bolesti pored ALS uključuju transgeni mišji model za evaluaciju spinalne i bulbarne mišićne atrofije (SBMA) (Katsuno et al., Neuron (2002) 35:843854), životinjski modeli za humani paralitički poliomijelitis (Ford et al., Microb. Pathog. (2002) 33:97107), životinjski modeli spinalne mišićne atrofije (Schmid et al., J. Child Neurol.22, 1004-1012, 2007), životinjski modeli za distalnu miopatiju i naslednu inkluzionu telesnu miopatiju (Malicdan et al., Acta Myol.2007 December; 26(3): 171-175), mišji model genetski demijelinacione bolesti (Suzuki et al., Microsc. Res. Tech.1995;32:204-214), i one opisane od strane Meyer ZuHörste et al. (Curr. Opin. Neurol.2006;19:464-473).
[0231] Životinjski modeli za ispitivanje efikasnosti anti-miostatin adnektina ovog pronalaska protiv gubitka mišićne zapremine zbog atrofije i/ili neaktivnost uključuju, ali se ne ograničavaju na, mišje modele unilateralne imobilizacije (Madaro et al., Basic Applied Myology 2008;18:149-153), rasecanje Ahilove pete (tenotomija) (Bialek et al., Physiol Genomics 2011;43:1075-86), i one opisane u Powers et al. (Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005;288:R337-44), kao što je, suspenzija zadnjih udova kod životinja, imobilizacija udova, i kontrolisana mehanička ventilacija.
[0232] Relevantni životinjski modeli za ispitivanje efikasnosti anti-miostatin adnektina ovog pronalaska u lečenju metaboličkih poremećaja uključuju, ali se ne ograničavaju na, one opisane u Ramaro et al. (Indian J Med Res 2007;125:451-472) i Kennedy et al. (Disease Models & Mechanisms 2010;3:156-166). Neograničavajući primeri takvih životinjskih modela su Lep<ob/ob>miševi, Lepr<db>miševi, Kuo Kondo miševi, KK/<Ay>miševi, Novozelandski gojazni (NZO) miševi, NONcNZO10 miševi, Tsumara Suzuki Gojazni Dijabetični (TSOD) i Tsumara Suzuki ne-gojazni (TSNO)miševi, M16 miševi, Zucker debeli pacovi, Zucker dijabetični debeli pacovi, SHR/N- cp rat, JCR/LA -cp pacovi, Otsuka Long Evans Tokushima Debeli pacovi, Gojazni rezus majmuni, Cohen dijabetični pacovi, Goto-Kakizaki pacovi, i ne-gojazni mutant C57 BL/6 (Akita) miševi. Tip 2 dijabetes takođe može biti indukovan ishranom pomoću, npr., davanjem ishrane sa visokim sadržajem masnoća ne-gojaznim, ne-dijabetičnim C57BL6 miševima (Surwit et al., Diabetes 1988;37:1163-7). Tip 2 dijabetes takođe može biti hemijski indukovan, npr., aurotioglukozom (Le Marchand Brustel et al., Am J Physiol 1978;234:E348-58) ili streptozotocinom, ili indukovana hirurški (npr., delimično pakcreatomizovane dijabetične životinje) (McNeil JH., Experimental models of diabetes. Florida, US: CRC Press LLc; 1999; Sasaki et al., In Vivo 2000;14:535-41). Mnogi genetski životinjski modeli takođe su poznati da rekapituliraju simptome i fenotipove metaboličkih poremećaja, kao što su obrađeni od strane Kennedy et al., 2010 (iznad).
[0233] U nekim primerima izvođenja, efikasnost anti-miostatin adnektina ovog pronalaska za povećanje mišićne mase ili zapremina može se ispitati davanjem subkutane injekcija miševima, kako je opisano u primeru 9. Pod uslovom da su inhibicija miostatina povećava mišićnu masu, očekuje se da anti-miostatin adnektini ovog pronalaska povećavaju telesnu masu i mišićnu masu, do mere do koje se mogu primeniti za određivanje potencije adnektina.
[0234] U nekim primerima izvođenja, određenije kada su anti-miostatin adnektini imunogeni kod miševa (npr., zbog upotrebu humanog domena fibronektinskog tipa III) i kada su poželjna hronična lečenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska mogu se davati SCID miševima, koji ne mogu da ugrade ćelijske ili humoralne imunološke odgovore. U nekim primerima izvođenja, SCID miševi mogu biti ukršteni sa nekim drugim genetskim modelima, kao što su oni opisani ovde (npr., dijabetični miševi), da bi se razvio imunokompromitovani mišji model popustljiv na hronično lečenje sa anti-miostatin adnektinima ovog pronalaska.
VIII. Terapeutske primene
[0235] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje anti-miostatin adnektin-e korisne za lečenje miostatin-povezane bolesti ili poremećaja, npr., poremećaja gubljenja mišićne mase, atrofije mišića, metaboličkih poremećaja, i degenerativnih poremećaja kostiju. Saglasno tome, u nekim primerima izvođenja ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za ublažavanje ili inhibiranje sa miostatinom povezane bolesti ili poremećaja kod subjekta, koji obuhvataju davanje efektivne količine miostatin-vezujućeg polipeptida, tj., anti-miostatin adnektina, subjektu. U nekim primerima izvođenja, subjekat je čovek. U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini su farmaceutski prihvatljivi sisarima, određenije čoveku. "Farmaceutski prihvatljiv" polipeptid odnosi se na polipeptid koji se daje životinji bez značajne štetne medicinske posledice, kao što je suštinski bez endotoksina, ili veoma niskim nivoima endotoksina.
[0236] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska će se davati subjektu u kombinaciji (jednovremeno ili odvojeno) sa agensom poznatim u ovoj oblasti koji je korisan za određeni poremećaj ili bolest koja se tretira.
[0237] U nekim primerima izvođenja, ciljana populacija pacijenata za anti-miostatin adnektin terapiju je ona koja je nije podložna standardnoj terpiji za bolest, poremećaj, ili stanje koje se tretira zbog, npr., starosti, prethodno postojećih stanja, genetski dorađivanja, i/ili ko-morbiditeta. Anti-miostatin adnektini ovog pronalaska mogu da služe kao alternative postojećim terpijama koje su povezane sa suštinskim sporednim efektima (npr., reproduktivna performansa) ili bezbednosnim pitanjima.
[0238] Primerne bolesti, poremećaji, i stanja za koja će anti-miostatin adnektini ovog pronalaska biti korisni, opisani su detaljnije u nastavku.
Mišićne, Neurološke, i Metaboličke Bolesti i Poremećaji
[0239] Anti-miostatin adnektini ovog pronalaska mogu se primeniti za lečenje mišićnih, neuroloških i metaboličkih poremećaja povezanih sa gubljenjem mišićne mase i/ili atrofijom mišića. Na primer, prekomerna ekspresija miostatina in vivo indukuje znakove i simptome karakteristične za kaheksiju, i vezivanje miostatin agenasa može delimično rešiti efekat miostatina u gubljenju mišićne mase (Zimmers et al., Science 2002;296:1486-8). Pacijenti sa SIDA takođe pokazuju povećane serumske nivoe miostatin imunoreaktivnog materijala u poređenju sa pacijentima bez SIDA ili sa SIDA pacijentima koji ne pokazuju pokazuju gubitak mase (Gonzalez-Cadavid et al., PNAS 1998;95:14938-43). Takođe je zapaženo da srcespecifično eliminisanje miostatina smanjuje skeletalnu atrofiju mišića kod miševa sa otkazivanjem srca, i obrnuto, određenije prekomerno eksprimiranje miostatina u srcu je dovoljn da indukuje gubljenje mišićne mase (Breitbart et al., AJP-Heart; 2011;300:H1973-82). Nasuprot tome, miostatin nokaut miševi pokazuju povećanu mišićnu masu, i sa godinama zavisno snižavanje akumulacije masti u poređenju sa njihovim parnjacima divljeg tipa (McPherron et al., J. Clin. Invest.2002;109:595-601).
[0240] Primerni poremećaji koji se mogu biti tretirati u skladu sa postupcima ovog pronalaska uključuju miopatije i neuropatije, koje uključuju, na primer, bolest motornih neurona, neuromišićne i neurološke poremećaje.
[0241] Na primer, anti-miostatin adnektini mogu se primeniti za lečenje nasleđene miopatije i neuromišićnih poremećaja (npr., distrofija mišića (Gonzalez-Kadavid et al., PNAS, 1998;95:14938-43), poremećaji motornih neurona, kongenitalne miopatije, zapaljenske miopatije i metaboličke miopatije), kao i stečene miopatije (npr., lekom indukovana miopatija, toksinom indukovana miopatija, infekcijom indukovana miopatija, paraneoplastična miopatija i druge miopatije povezane sa kritičnim bolestima).
[0242] Takvi poremećaji uključuju, ali se ne ograničavaju na, Dišenovu mišićnu distrofiju, progresivnu distrofiju mišića, Bekerov tip mišićne distrofije, Dejerine-Landouzy mišićne distrofije, Erbove mišićne distrofije, Emeri-Drajfusove mišićne distrofije, distrofija mišića pojasa udova, okulofaringealne distrofije mišića (OPMD), facioskapulohumeralne distrofije mišića, kongenitalne distrofije mišića, infantilne neuroaksonalne distrofije mišića, miotonične dsitrofije (Steinertova bolest), distalne distrofije mišića, vlaknaste miopatije, porodične periodične paralize, nedistrofične miotonije, periodičnih paraliza, atrofije kičmenih mišića, atrofije kičmenih mišića (SMA), amiotrofične lateralne skleroze (ALS), primarne lateralne skleroze (PLS), progresivne mišićne atrofije (PMA), , distalne miopatije, miotubularne/centronuklearne miopatije, vlaknaste miopatije, bolesto mini jezgara, bolesti centralnog jezgra, desminopatije, miozitisa sa inkluzionim telašcima, dermatomiozitisa, polimiozitisa, mitohondrijalne miopatije, kongenitalnog miasteničnog sindroma, miastenije gravis, post-polio mišićne disfunkcije, steroidne miopatije, alkoholne miopatije, perioperativne mišićne atrofije i ICU neuromiopatije.
[0243] Nasleđene i stečene neuropatije i radikulopatje koje se mogu tretirati sa anti-miostatin adnektinima uključuju, ali se ne ograničavaju na, sindroma krute kičme, mišić-oko-mozak bolest, nasledna motorna i senzorna neuropatija, Carcot-Marie-Tooth bolest, hronična zapaljenske neuropatija, progresivna hipertrofična neuropatija, tomakulozna neuropatija, lupus, Guillain-Barre sindrom, hronična zapaljenska demijelinizirajuća polineuropatija, više skleroze, sarkoidoza, dijabetična neuropatija, alkoholna neuropatija, sa bolešću povezane neuropatije (npr., HIV/SIDA, Lajmova bolest), sa toksinom povezane neuropatije (npr., teški metali, hemoterapija), kompresione neuropatije (npr., tumori, stežuća neuropatija), i neuropatije povezane sa povredom ili traumom (npr., kauda ekvin sindrom, paraplegija, kvadriplegija).
[0244] U nekim primerima izvođenja, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska mogu se primeniti za lečenje mišićnih distrofija (npr., Dišenova mišićna distrofija, Bekerov tip mišićne distrofije), ALS, i sarkopenije.
[0245] Dodatni poremećaji povezani sa gubljenjem mišićne mase koji se mogu tretirati sa anti-miostatin adnektinima ovog pronalaska uključuju kaheksiju, sindrom mršavljena, sarkopeniju, kongestivnu opstuktivnu bolest pluća, cističnu fibrozu (pulmonarna kaheksija), bolesti srca ili otkazivanje srca (srčana kaheksija), kancer, mršavljenje zbog SIDA, mršavljenje zbog otkazivanja bubrega, bolest bubrega, klaudikaciju, kaheksiju povezanu sa dijalizom, uremiju, reumatoidni artritis, mišićna povreda, operaciju, popravljanje oštećenog mišića, slabosti, dislociranu atrofiju, osteoporozu, osteoartritis, rast i popravka ligamenata.
[0246] Postupci ovog pronalaska takođe se mogu primeniti radi povećanja mišićne zapremine kod subjekata koji boluju od atrofije mišića zbog neupotrebe. Neupotrebne atrofije mogu biti rezultat brojnih uzroka koji uključuju bilo koji poremećaj ili stanje koje vodi ka produženoj imobilnosti ili neupotrebi, koji uključuju, ali se ne ograničavaju na produženo ležanje zbog bolesti, vezanosti za invalidska kolica, imobilizacije udova, punjenja dijafragme putem mehaničke ventilacije, transplantacije čvrstog organa, zamene zglobova, šloga, sa CNS oštećenjem povezane slabosti, oštećenja kičmene moždine, oporavka od teških opekotina, sedentarne hronične hemodijalize, post-traumatskog oporavka, post-septičkog oporavka i izlaganju mikrogravitaciji (Powers et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005;288:R337-44).
[0247] Pored toga, sa starenjem povezano povećanje odnosa masnoće prema mišićima, i sa starenjem povezane mišićne atrofije smatraju se povezani sa miostatinom. Na primer, prosečan serumski miostatin-imunoreaktivan protein povećava se sa godinama u grupi mladih (19-35 godina starih), sredovečnih (36-75 godina starih), i starijih (76-92 godina starih) muškaraca i žena, dok se prosečna mišićna masa i masa bez masti smanjuje sa godinama u ovim grupama (Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002)). Saglasno tome, subjekti sa atrofijom mišića zbog starenje, i/ili subjekti koji su slabi zbog, na primer, sarkopenije, takođe bi trebalo da osete poboljšanje iz lečenja sa anti-miostatin adnektinima ovog pronalaska.
[0248] Takođe su predviđeni postupci za povećanje mišićne mase kod životinja koje se koriste za ishranu davanjem efektivne doze anti-miostatin adnektina ovim životinjama. Kako je zreli C-terminalni miostatin polipeptid identičan kod svih vrsta, očekuje se da anti-miostatin adnektini mogu efektivno da povećaju mišićne mase i rredukuju masti u bilo kojim agrikulturalno značajnim vrstama, na primer, bez ograničavanja, stoka, kokoške, ćurke, i svinje.
[0249] Efikasnost anti-miostatin adnektina u lečenju poremećaja gubljenja mišićne mase ili atrofije mišića može se odrediti, na primer, jednim ili više postupaka za merenje povećanja mišićne mase ili zapremine, povećanja broja mišićnih ćelija (hiperplazija), povećanja veličine mišićnih ćelija (hipetrofija) i/ili povećanje mišićne snage. Na primer, efekti anti-miostatin adnektina ovog pronalaska u povećavanju mišićne zapremine pokazani su u Primerima opisanim u nastavku. Postupci za određivanje "povećane mišićne mase" dobro su poznate u ovoj oblasti. Na primer, mišić sadržaj mogu e izmeriti pre i nakon davanja anti-miostatin adnektina ovog pronalaska upotrebom standardnih tehnika, kao što je podvodno merenje (videti, npr., Bimain et al. New Eng. J. Med. (1996) 335:1-7) i dvostruka-energetska x-zračna apsorpciometrija (videti, npr., Bimain et al. Mol. Endocrinol. (1998) 83:3155-3162). Povećanje veličine mišića može se dokazati dobijanjem na težini od najmanje oko 5-10%, poželjno najmanje oko 10-20% ili više.
Metabolički poremećaji
[0250] Anti-miostatin adnektini ovog pronalaska, koji redukuju aktivnost miostatina i/ili signalizaciju, korisni su za lečenje metaboličkih poremećaja, kao što je gojaznost, dijabetes melitus tip II, poremećaja povezanih sa dijabetesom, metaboličkog sindroma, i hiperglikemije.
[0251] Miostatin je uključen u patogenezi dijabetesa melitusa tipa II. Miostatin je eksprimiran u adipoznom tkivu i miševi kojima nedostaje miostatin pokazuju smanjenu akumulaciju masti kako stare. Štaviše, unos glukoze, akumulacija masti, i ukupna telesna masa su smanjeni kod aguti letalnih žutih i gojaznih (Lep<ob/ob>) miševa kojima nedostaje miostatin (Yen et al., FASEB J.8:479, 1994; McPherron et al., 2002). Kako je opisano u US2011/0008375, miostatin antagonisti mogu da snize odnos masoće prema mišićima u modelu ostarenih miševa, sačuvaju masu skeletnih mišića i nemasnu telesnu masu, i da umanji bubrežnu hipetrofiju kod STZ-indukovanih dijabetičnih miševa.
[0252] Kako se ovde koristi, "gojaznost" je stanje kod kojeg je višak telesne masnoće akumuliran do takve mere da to može negativno uticati na zdravlje. Uobičajeno je definisano kao indeks telesne mase (BMI) od 30 kg/m2 ili viši što se razlikuje od stanja prekomerne težine kakva je definisana pomoću BMI od 25 kg/m2 ili viši (videti, npr., World Health Organization (2000) (PDF). Technical report series 894: Obesity: Preventing and managing the global epidemic. Geneva: World Health Organization).
Prekomerna telesna masa je povezana sa raznim bolestima, određenije sa kardiovaskularnim bolestima, dijabetesom melitusom tipom II, opstruktnivnom apnejom tokom spavanja, određenim tipovima kancera, i osteoartritisom.
[0253] Subjekat koji je gojazan može se identifikovati, na primer, određivanjem BMI (BMI se izračunava deljenjem mase subjekta sa kvadratom njegove ili njene visine), obima struka i odnosa struk-kuk (apsolutni obim struka (>102 cm kod muškaraca i >88 cm kod žena) i odnos struk-kuk (obim struka podeljen sa obimom kuka od >0.9 za muškarce i >0.85 za žene) (videti, npr., Yusuf S, et al., (2004). Lancet 364: 937-52), i/ili procenta telesne masnoće (ukupna telesna masnoće eksprimirana kao procenat ukupne telesne mase: muškarci sa više od 25% telesne masnoće i žene sa više od 33% telesne masnoće su gojazni; procenat telesne masnoće može se odrediti iz pojedinčevog BMI sledećim formulom: telesna masnoća% = (1.2 * BMI) (0.23 * starost) - 5.4 - (10.8 * pol), gde je pol 0 ukoliko je u pitanju ženski pol, a 1 ukoliko je u pitanju muški pol). Tehnike merenja procenta telesne masnoće uključuju , na primer, kompjuterizovanu tomografiju (CT skener), snimanje magnetnom rezonancom (MRI), i dvostruko energetske X-zračne apsorpciometrije (DEXA).
[0254] Pojam "tip II dijabetes" odnosi se na hroničnu, dugoročnu bolest koja rezultuje kada telesni insulin ne funkcioniše efektivno. Glavna komponenta tipa II dijabetesa je "insulinska rezistencija," pri čemu insulin proizveden od strane pankreasa ne može da se veže sa ćelijama masti i mišića kako bi se omogućilo da glukoza u njima proizvede energiju, što izaziva hiperglikemiju (visok nivo glukoze u krvi). Da bi se to kompenzovalo, pankreas proizvodi još insulina, a ćelije, koje osećaju poplavu insulina, postaju još rezistentnije, što rezultuje u opasnom ciklusu viokih nivoa glukoze i često visokih nivoa insulina.
[0255] Izraz "poremećaji povezani sa dijabetesom" ili "poremećaji povezani sa dijabetesom" ili "dijabetes povezane poremećaji," kako se ovde koristi, odnosi se na stanja i druge bolesti koji su obično povezane sa ili u vezi sa dijabetesom. Primer poremećaja povezanih sa dijabetesom uključuju, na primer, hiperglikemiju, hiperinsulinanemiju, hiperlipidanemiju, insulinsku rezistenciju, oslabljen metabolizam glikoze, gojaznost, dijabetične retinopatije, makularnu degeneraciju, katarakte, dijabetične nefropatije, glomerulosklerozu, dijabetičnu neuropatiju, erektilne disfunkcije, premenstrualni sindrom, vaskularnu restenozu, ulcerativni kolitis, koronarne bolesti srca, hipertenziju, anginu pektoris, infarkt
1
miokarda, šlog, poremećaje kože i veznih tkiva, ulceraciju stopala, metaboličku acidozu, artritis, i osteoporozu.
[0256] Efikasnost anti-miostatin adnektina u lečenju metaboličkih poremećaja može se odrediti, na primer, jednim ili više postupaka merenja povećanja osetljivosti na insulin, povećanja apsorpcije glukoze od strane ćelija iz subjekta, smanjenja nivoa glukoze u krvi, i smanjenja masnoće u telu.
[0257] Na primer, kod subjekata sa tipom II dijabetesa ili koji su u riziku od razvijanja dijabetesa, mogu se pratiti HbA1c nivoi. Pojam "hemoglobin 1AC" ili "HbA1c" kako se ovde koristi odnosi se na proizvod ne-enzimatske glikacije hemoglobinskog B lanca. Poželjni ciljani opseg HbA1c nivoa za ljude sa dijabetesom može se odrediti iz smernica Američke asocijacije dijabetičara (ADA), tj., the Standards of Medical Care in Diabetes (Diabetes Care 2012;35(Suppl 1):S511-563). Trenutni HbA1c ciljani nivoi su generalno <7.0% za ljude sa dijabetesom, a ljudi koji nemaju dijabetes tipično imaju HbA1c vrednosti od manje od 6%. Saglasno tome, efikasnost anti-miostatin adnektina ovog pronalaska može se odrediti zapaženim snižavanjem HBAlc nivoa kod subjekta.
[0258] Postupci ovog pronalaska dalje uključuju davanje anti-miostatin adnektina samog, ili u kombinaciji sa drugim agensima koji su poznati u ovoj oblasti za kontrolu glikemije (npr., insulin, GLP1) ili za lečenje u struci poznatih sa dijabetesom povezanih komplikacija.
Drugi poremećaji
[0259] Miostatin nokaut miševi pokazuju povećanu mišićnu masu, kao i povećani sadržaj minerala i gustinu mišjeg humerusa, i povećani sadržaj minerala i trabekularne i korikalne kosti u regionima u kojima su pričvršćeni mišići (Hamrick et al. Calcif Tissue Intl 2002;71:63-8). Ovo navodi da povećanje mišićne mase može da poboljša jačinu kostiju i redukuje osteoporozu i druge degenerativnim bolesti kostiju.
[0260] Dodatne bolesti ili poremećaji za koje su anti-miostatin adnektini ovog pronalaska korisni uključuju zarastanje rana, anti-fibrotičnu bolest, Lambert-Eaton Sindrom, i Parkinsonovu bolest.
Kombinovane terapije
[0261] Ovde obezbeđeni anti-miostatin adnektini mogu biti uključeni u kombinaciji sa antidijabetičnim agensima, anti-hiperglikemičnim agensima, anti-hiperinsulinemičnim agensima, anti-retinopatijskim agensima, anti-neuropatijskim agensima, anti-neurodegenerativnim agensima, anti-nefropatijskim agensima, anti-atheroskleroznim agensima, anti-ishemijskim agensima, anti-hipertenzivnim agensima, anti-gojaznim agensima, anti-dislipidemičnim agensima, anti-dislipidemičnim agensima, antihiperlipidemičnim agensima, anti-hipertrigliceridemičnim agensima, anti-hiperholesterolemičnim agensima, anti-restenotičnim agensima, anti-pankreatitičnim agensima, agensima za snižavanje lipida, anorektičnim agensima, agensima za sonaživanje pamćenja, anti-demencija agensima, ili agensima za
1 1
promovisanje kognicije, supresantima apetita, neuro- ili muskulo-restorativnim terapijama, terapijama za otkazivanje srca, terapijama za periferne arterijske bolesti i anti-zapaljenskim agensima.
[0262] Antidijabetični agensi korišćeni u kombinaciji sa anti-miostatin adnektinima uključuju, ali se ne ograničavaju na, insulin sekretagozi ili insulin sensitizeri, GPR40 receptor modulatori, ili drugi antidijabetični agensi. Ovi agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, dipeptidil peptidaza IV (DP4) inhibitore (na primer, sitagliptin, saksagliptin, alogliptin, vildagliptin i slično), bigvanide (na primer, metformin, fenformin i slično), sulfonil uree (na primer, gliburid, glimepirid, glipizid i slično), glukosidaza inhibitore (na primer, akarboza, miglitol, i slično), PPARγ agoniste kao što je tiazolidinedioni (na primer, roziglitazon, pioglitazon, i slično), PPAR α/γ dvostruke agoniste (na primer, muraglitazar, tesaglitazar, aleglitazar, i slično), glukokinaza aktivatore (kako je opisano u Fyfe et al., Drugs of the Future, 34(8):641-653 (2009)), GPR119 receptor modulatore (MBX-2952, PSN821, APD597 i slično), SGLT2 inhibitore (dapagliflozin, kanagliflozin, remagliflozin i slično), amilinske analoge kao što je pramlintid, i/ili insulin. Pregledi trenutnih i nastajućih terapija za lečenje dijabetesa mogu se pronaći u: Mohler et al., Medicinal Research Reviews, 29(1):125-195 (2009), i Mizuno et al., Current Medicinal Chemistry, 15:61-74 (2008).
[0263] Anti-miostatin adnektini ovog pronalaska mogu takođe biti opciono uključeni u kombinaciji sa jednim ili više hipofagnim agensima kao što je dietilpropion, fendimetrazin, fentermin, orlistat, sibutramin, lorkaserin, pramlintid, topiramat, MCHR1 receptor antagonisti, oksumodulin, naltrekson, Amilin peptid, NPY Y5 receptor modulatori, NPY Y2 receptor modulatori, NPY Y4 receptor modulatori, cetilistat, 5HT2c receptor modulatori, i slično. Anti-miostatin adnektini ovog pronalaska mogu takođe biti uključeni u kombinaciji sa agonistom glukagon-sličnim peptid-1 receptorom (GLP-1 R), kao što je eksenatid, liraglutid, GPR-1(1-36) amid, GLP-1(7-36) amid, GLP-1(7-37) (kako je opisano u U.S. Pat. Br.
5,614,492 od Habener), koji se mogu davati putem injektovanja, intranazalno, ili transdermalnim ili bukalnim uređajima. Pregledi trenutnih i terapija u razvoju za lečenje gojaznosti mogu se naći u:
Melnikova et al., Nature Reviews Drug Discovery, 5:369-370 (2006); Jones, Nature Reviews: Drug Discovery, 8:833-834 (2009); Obici, Endocrinology, 150(6):2512-2517 (2009); i Elangbam, Vet. Pathol., 46(1):10-24 (2009).
[0264] Anti-miostatin adnektini ovog pronalaska takođe se mogu davati sa jednom ili više dodatnih terapeutskih agenasa, kako je pogodno za određenu bolest ili poremećaj koji se tretira.
Neograničavajući primeri dodatnih agenasa uključuju one koji su korisni za lečenje metaboličkih poremećaja kao što je tip II dijabetes i sarkopenija i uključuju, ali se ne ograničavaju na, GLP-1, GLP-1-slične, amilin, i FGF21; one koji su korisni za lečenje anti-fibrotične bolesti, neuromišićne bolesti, bolesti motornih neurona, i sarkopenije i uključuju, ali se ne ograničavaju na, grelin, SARM, Riluzolu, testosteron, androgene, hormone rasta, hormonske zamenske terapije, COX-2 inhibitore, troponin aktivatore, β2 agoniste, CTLA4-Ig (npr., abetacept, belatacept) i anti-TGFβ antitela; one koji su korisni za lečenje kaheksije i drugih sindroma mrđavljenja i uključuju, ali se ne ograničavaju na, TGFβ receptor
1 2
kinaza inhibitore, anti-IL-6, i ubikvitin-proteazoma inhibitore; one koji su korisni za lečenje mišićnih grčeva povezani sa miotonijom i PLS uključuju, ali se ne ograničavaju na fitoin, kvinin, Baklofen i tizanidin; one koji su korisni za neuropatije uključuju antidepresante (npr., triciklike i selektivne serotonin-norepinefrin re-apsorpcione inhibitore (SNRI)), antikonvulzante, kanbinoide, botulinum toksin Tip A, NMDA antagoniste (npr., ketamin), dijetetske suplemente (npr., alfa lipoična kiselina i benfotiamin); one koji su korisni za lečenje hroničnih zapaljenskih neuropatija uključuju, ali se ne ograničavaju na, kortikosteroide, intravenzni imunoglobulin, i imunosupresivne lekove (npr., ciklofosfamid, ciklosporin, azatiprin, mikofenolat mofetil, anti-timocitni globulin, rituksimab); i one koji su korisni za lečenje Guillain Barré sindroma, sarkopenije, loma, i gubitka kostiju i uključuju, ali se ne ograničavaju na, Boniva (ibandronat) i PTH.
[0265] Anti-miostatin adnektini ovog pronalaska mogu se davati sa jednim ili više dodatnih agenasa korišćenih u simptomatičnoj terapiji. Neograničavajući primeri takvih agenasa za lečenje simptoma ALS uključuju aktivatote pora mitohondrijalne permeabilne tranzicije (MPT), brze skeletalne troponin aktivatore, regulatore makrofaga (npr., NP001), agense za lečenje bolesti skladištenja lizozoma (npr., NP003), i nikotinski acetilholinske receptor (nAchR) antagoniste. Neograničavajući primer dodatnog agensa za upotrebu u lečenju simptoma DMD/BMD je agens koji povećava ATP nivo.
[0266] Anti-miostatin adnektini ovog pronalaska takođe se mogu davati sa jednim ili više dodatnih agenasa korišćeni u terapijama za modifikaciju bolesti. Neograničavajući primeri takvih agenasa za lečenje ALS uključuju čistače slobodnih radikala (npr., edaravon (norfenazon), CV-3611), VEGF agoniste (npr., sNN0029), Nogo-A protein I (npr., GSK122324), SOD1 inhibitore (npr., ISIS-SOD1Rx), i PGE sintaza 1 inhibitore (npr., AAD-2004). Neograničavajući primeri takvih agenasa za lečenje DMD/BMD uključuju one koji promovišu preskakanje eksona (npr., antisenzitivni molekuli kao što je drisapersen (PRO051/GSK2402968), PRO044, Eteplirsen, AVI-4658, AVI-5038, Ataluren (PTC124)), agensi gensih terapija, anti-zapaljenski agensi (npr., CRD007), i anti-fibrotični agensi (npr., HT-100).
[0267] Kako je prethodno opisano, agensi koji promovišu ekson-preskakanje mogu se primeniti u kombinaciji sa anti-miostatin adnektinima ovog pronalaska za lečenje Dišenove mišićne distrofije i Bekerovog tipa mišićne distrofije. Primeri specifičnih eksona koji se mogu ciljati radi restoracije funkcionalnog distrofina uključuju eksone 7, 8, 17, 43, 44, 45, 46, 50, 51, 52, 53, i 55 (videti, npr., Lu et al., Molecular Therapy 2011;19:9-15). U nekim primerima izvođenja, više od jednog agensa, npr., antisenzitivni oligonukleotidi, mogu se primeniti za idnukovanje multi-ekson preskakanja.
IX. Farmaceutske kompozicije
[0268] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju anti-miostatin adnektin ili njegove fuzione proteine, gde je ta kompozicija suštinski bez endotoksina, ili najmanje sadrži
1
ne više od prihvatljivih nivoa endotoksina kako je određeno od strane odgovarajuće regulatorne agencije (npr., FDA).
[0269] Kompozicije ovog pronalaska mogu biti u obliku pulule, tablete, kapsule, tečnosti, ili tableti sa održivim oslobađanjem za oralno davanje; tečnosti za intravenzno, subkutano ili parenteralno davanje; ili gel, losion, mast, krem, ili polimer ili drugi nosač za osdrživo oslobađanje za lokalno davanje.
[0270] Postupci dobro poznati u ovoj oblasti pripremanja kompozicija mogu se naći u, na primer, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.). Kompozicije za parenteralno davanje mogu, na primer, da sadrže ekscipijense, sterilnu vodu, slani rastvor, polialkilen glikole kao što je polietilen glikol, ulja biljnog poreklan, ili hidrogenovane naptalene. Biokompatibilni, biodegradabilni laktid polimer, laktid/glikolid kopolimer, ili polioksietilen-polioksipropilen kopolimeri se mogu primeniti za kontrolu oslobađanja jedinjenja. Nanočestične kompozicije (npr., biodegradabilne nanočestice, čvrste lipidne nanočestice, lipozomi) se mogu primeniti za kontrolu biodistribucije jedinjenja. Drugi potencijalno korisni parenteralni sistemi dostave uključuju etilen-vinil acetat kopolimerne čestice, osmotske pumpe, implantabilne infuzione sisteme, i lipozomes. Koncentracija jedinjenja u kompoziciji varira zavisno od brojnih faktora, koji uključuju dozu leka koji se daje, i putanje davanja.
[0271] Prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili stabilizatori su netoksični za primaoce pri dozama i koncentracijama koje se koriste, i uključuju pufere kao što je fosfatni, citratni, i drugih organskih kiselina; antioksidanse koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; prezervative (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-cresol); polipeptide niske molekulske mase (manja od oko 10 ostataka); proteine, kao što je serumski albumin, želatin, ili imunoglobuline; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljenohidrate koji uključuju glukozu, manozu, ili dekstrane; agense heliranja kao što je EDTA; šećere kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-jone za formiranje soli kao što je natrijum; metalne komplekse (npr., Zn-proteinski kompleksi); i/ili ne-jonske surfaktante kao što je Tween, PLURONIC™ ili polietilenglikol (PEG).
[0272] Polipeptidi ovog pronalaska mogu biti opciono davani kao farmaceutski prihvatljiva so, kao što je ne-toksične kisele adicione soli ili metalni kompleksi koji se uobičajeno koriste u farmaceutskoj industriji. Primeri kiselih adicionih soli uključuju organske kiseline kao što je sirćetna, mlečna, pamoična, maleinska, limunska, malična, askorbinska, sukcinična, benzojeva, palmitinska, suberična, salicilna, tartarna, metanesulfonska, toluenesulfonska, ili trifluorosirćetna kiselina ili slično; polimerne kiseline kao što je tanična kiselina, karboksimetil celuloza, ili slično; i neorgansku kiselinu kao što je hlorovodonična kiselina, bromovodonična kiselina, sumporna kiselina, fosforna kiselina, ili slično.
1 4
Metalni kompleksi uključuju cink, železo, i slično. U jednom primeru, polipeptid je formulisan u prisustvu natrijum acetata radi povećanja toplotne stabilnosti.
[0273] Aktivni sastojci takođe mogu biti zatvoreni u mikrokapsulu pripremljenu, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozna ili želatinskamikrokapsula i poli-(metilmetacilatna) mirokapsula, respektivno, u koloidnom sistemu za dostavu leka (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike opisane su u Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
[0274] Preparati sa održivim oslobađanjem mogu se pripremiti. Pogodni primeri preparata sa održivim oslobađanjem uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže proteine ovog pronalaska, koje matrice su obliku raznik predmeta, npr., filmova, ili mirokapsula. Primeri matrica sa održivim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. Br.3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i y etil-L-glutamat, ne-degradabilni etilen-vinil acetat, degradabilne kopolimere mlečne kiseline-glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (injektabilne mikrosfere sastavljene od kompolimera mlečna kiselinaglikolna kiselina i leuprolid acetat), i poli-D-(-)-3-hidroksibutirna kiselina. Dok polimeri kao što je etilenvinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom više od 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine tokom kraćih vremenskoh perioda. Kada enkapsulirani proteini ovog pronalaska mogu da ostanu u telu tokom dugog vremenskog perioda, oni mogu da denaturišu ili agregiraju kao rezultat izlaganja vlazi na 37°C, što za rezultat ima gubitak biološke aktivnosti i moguće promene u imunogenosti. Racionalne strategije mogu se ostvariti kroz uređaje za stabilizaciju zavisno od uključenog mehanizma. Na primer, ako je otkriveno da je mehanizam agregacije intermolekulsko formiranje S-S veze kroz tio-disulfid izmenu, stabilizacija se može postići modifikovanjem sulfhidril ostataka, liofilizovanjem kiselih rastvora, kontrolisanjem sadržaja vlage, upotrebom pogodnih aditiva, i razvijanjem specifičnih kompozicija polimernih matrica.
[0275] Kompozicije ovog pronalaska za oralnu upotrebu uključuju tablete koje sadrže aktivan sastojak(ke) u mešavini sa ne-toksičnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima. Ovi ekscipijensi mogu biti, na primer, inertni razblaživači ili punioci (npr., saharoza i sorbitol), agensi podmazivanja, glidanti, i anti-adhezivi (npr., magnezijum stearat, cink stearat, stearinska kiselina, silicijum dioksidi, hidrogenovana biljna ulja, ili talk). Kompozicije za oralnu upotrebu mogu se takođe obezbediti kao žvakaće tablete, ili kao čvrste želatinaste kapsule pri čemu je aktivan sastojak umešan sa inertnim čvrstim razblaživačem, ili kao meke želatinaste kapsule pri čemu je aktivan sastojak umešan sa vodom ili uljnim medijumom.
[0276] Farmaceutska kompozicija koja se koristi za in vivo davanje tipično mora biti sterilna. To se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija
1
upotrebom ovog postupka može se sprovesti ili pre ili posle liofilizacije i rekonstituisanja. Kompozicija za parenteralno davanje može se uskladištiti u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Pored toga, parenteralne kompozicije generalno se smeštaju u kontejner sa sterilnim pristupnim otvorom, na primer, kesa sa intravenoznim rastvorom ili bočica sa poklopcem koji se može probušiti hipodermnom injekcionom iglom.
[0277] Kada je farmaceutska kompozicija formulisana, ona se može uskladištiti u sterilne bočice kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta materija, ili dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu se uskladištiti ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovane) koji se mora rekonstituisati pre davanja.
[0278] Ovde opisane kompozicije takođe mogu da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja ako je potrebno za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno ona sa komplementarnim dejstvima koja ne utiču štetno jedno na drugo. Takvi molekuli su poželjno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efektivne za namenjenu svrhu.
PRIMERI
[0279] Ovaj pronalazak je sada opisan pozivanjem na sledeće primere, koji su samo ilustrativnog karaktera, i nisu namenjeni da ograniče ovaj pronalazak.
Primer 1 - Proizvodnja proteina
Proizvodnja proteina visoke propusnosti (HTPP)
[0280] Odabrani veziva klonirana u PET9d vektoru uzvodno od HIS6taga i transformisan u E.coli BL21 DE3 plysS ćelijama inokulisani su u 5 ml LB medijuma koji sadrži 50 µg/mL kanamicina formatu sa 24-bazenčića i uzgajane na 37°C preko noći. Sveže 5 ml LB medijum (50 µg/mL kanamicina) kulture pripremljene su za induciblnu ekspresiju aspiracijom 200 µl iz kulture preko noći i istakanjem u pogodni bazenčić. Kulture su uzgajane na 37°C do A6000.6-0.9. Nakon indukovanja sa 1 mM izopropil-βtiogalaktozidom (IPTG), kultura je eksprimirana tokom 6 sati na 30°C i sakupljena centrifugiranjem tokom 10 minuta na 2750 g na 4°C.
[0281] Ćelijski peleti (u formatu 24-bazenčića) lizirani su resuspendovanjem u 450µl lizionog pufera (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x Complete ™ Protease Inhibitor Cocktail-EDTA free (Roche), 1 mM PMSF, 10 mM CHAPS, 40 mM imidazol, 1 mg/ml lizozim, 30 µg/ml DNKaza, 2 µg/ml aprotonin, pH 8.0) i protresani na sobnoj temperaturi 1-3 sata. Lizati su razbristreni i re-razbijeni u formatu 96-bazenčića transferom u 96-bazenčića Whatman GF/D Unifiltera opremljen sa 96-bazenčića, 1.2 ml ploči za hvatanje i filtriran pozitivnim pritiskom. Razbristreni lizati transfektovani su u Nikl ili Kobaltnu-helirajuću Ploču sa 96-bazenčića koji su ekvilibrisani sa ekvilibracionim puferom (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 40 mM imidazol, pH 8.0) i inkubisani tokom 5 min. Nevezani materijal je uklonjen pozitivnim pritiskom.
1
Smola je oprana dva puta sa 0.3 ml/bazenčić puferom za pranje #1 (50 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 5 mM CHAPS, 40 mM imidazol, pH 8.0). Svako pranje je uklonjeno pozitivnim pritiskom. Pre eluiranja, svaki bazenčić je opran sa 50 µl Elucionog pufera (PBS 20 mM EDTA), inkubisan tokom 5 min, i ovo pranje je odbačeno pozitivnim pritiskom. Protein je eluiran primenom dodatnih 100 µl Elucionog pufera u svaki bazenčić. Nakon 30 minutne inkubacije na sobnoj temperaturi, ploča(e) su centrifugirane tokom 5 minuta na 200 g i eluirani protein sakupljen u pločama za hvatanje sa 96-bazenčića koji sadrže 5µl 0.5 M MgCl2dodatog na dno elucione ploče za hvatanje pre eluiranja. Eluirani protein je kvantifikovan upotrebom ogleda ukupnog proteina sa divlji tipom<10>Fn3 domena kao proteinskog standarda.
Ekspresija i prečišćavanje nerastvorivog skafold proteina na bazi fibronektinskih veziva
[0282] Za ekspresija, odabrani klon(ovi), praćeni HIS6tagom, klonirani su u pET9d vektili I eksprimirani u E.coli BL21 DE3 plysS ćelijama. Dvadeset ml inokulum kulture (generisana iz jedne zasejane kolone) korišćeno je za inoculat 1 litra LB medijuma ili TB-Medijuma za ekspresiju preko noći (auto indukcija) koji sadrži 50 µg/ml Kanamicina i 34 µg/ml hloramfenikola. Kulture u LB medijumu inkubisane su na 37°C do A6000.6-1.0 kada su indukovane sa 1 mM izopropil-β-tiogalaktozidom (IPTG) i uzgajane tokom 4 sata na 30°C. Kulture uzgajane u TB-Medijumima za ekspresiju preko noći inkubisane su na 37°C tokom 5 sati, kada je temperatura snižena do 18°C i uzgajane tokom 19 sati. Kulture su sakupljene centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥10,000 g na 4°C. Ćelijski peleti su zaleđeni na -80°C. Nakon odmrzavanja, ćelijski pelet je resuspendovan u 25 ml lizionog pufera (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x Complete ™ Protease Inhibitor Cocktail-EDTA free (Roche), pH 7.4) upotrebom Ultra-turrax homogenizatora (IKA works) na ledu. Ćelijska lizija postignuta je homogenizacijom visokog pritiska (≥18,000 psi) upotrebom Model M-110S Microfluidizera (Microfluidics). Nerastvoriva frakcija izdvojena je centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥23,300 g na 4°C. Nerastvoriv pelet izolovan iz centrifugiranja lizata opran je sa 20 mM natrijum fosfata/500 mM NaCl, pH7.4. Pelet je ponovo rastvoren u 6 M gvanidin hidrohloridu u 20 mM natrijum fosfatu/500 mM NaCl pH 7.4 sa sonikacijom, praćeno inkubacijom na 37 stepeni tokom 1-2 sata. Ponovo rastvoreni pelet filtriran je sa a 0.45 µm filterom i uveden u Histrap kolonu ekvilibrisanu sa 20 mM natrijum fosfat/500 mM NaCl/6 M gvanidin pH7.4 pufear. Nakon uvođenja, kolona je oprana za dodavanje 25 kolona zapremine sa istim puferom. Vezani protein je eluiran sa 50 mM imidazolom u 20 mM natrijum fosfat/500 mM NaCl/6 M gvanidin-HCl, pH 7.4. Prečišćen protein je ponovo savijen dijalizom naspram 50 mM natrijum acetata/150 mM NaCl, pH 4.5 ili PBS, pH 7.2.
Ekspresija i prečišćavanje rastvorivog skafold proteina na bazi fibronektinskog veziva
[0283] Kao alternativa prečišćavanju nerastvorivog veziva, prečišćavanje rastvorivog veziva može se takođe koristiti. Za ekspresiju, odabrani klon(ovi), praćeni HIS6tagom, klonirani su u pET9d vektoru i eksprimirani u E.coli BL21 DE3 plysS ćelijama. Dvadeset ml inokulum kulture (generisana iz jedne
1
zasejane kolone) korišćeni su za inokulaciju 1 litra LB medijuma ili TB-Medijuma za ekspresiju preko noći (auto indukcija) koji sadrži 50 µg/ml Kanamicina i 34 µg/ml hloramfenikola. Kulture u LB medijumu inkubisane su na 37°C do A6000.6-1.0, praćeno indukcijom sa 1 mM izopropil-β-tiogalaktozidom (IPTG) i uzgajane tokom 4 sata na 30°C. Kulture uzgajane u TB-medijumu za ekspresiju preko noći inkubisane su na 37°C tokom 5 sati, nakon čega je temperatura snižena do 18°C i one su uzgajane tokom 19 sati. Kulture su sakupljene centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥10,000 g na 4°C. Ćelijski peleti su zaleđeni na -80°C. Odmrznuti ćelijski pelet je resuspendovan u 25 ml lizionog pufera (20 mM NaH2PO4, 0.5 M NaCl, 1x Complete™ Protease Inhibitor Cocktail-EDTA free (Roche), pH 7.4) upotrebom Ultra-turrax homogenizatora (IKA works) na ledu. Ćelijska lizija postignuta je homogenizacijom visokog pritiska (≥18,000 psi) upotrebom Modela M-110S Mikrofluidizera (Microfluidics). Rastvoriva frakcija je izdvojena centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥ 23,300 g na 4°C. Supernatant je razbistren upotrebom 0.45 µm filtera. Razbistren lizat je uveden u Histrap kolonu (GE) pre-ekvilibrisan sa 20 mM natrijum fosfat/500 mM NaCl, pH 7.4. Kolona je zatim oprana sa 25 kolona zapremine istog pufera, praćeno 20 kolona zapremine od 20 mM natrijum fosfat/500 mM NaCl/25 mM imidazol, pH 7.4 a zatim 35 kolona zapremine od 20 mM natrijum fosfat/500 mM NaCl/40 mM imidazol, pH 7.4. Protein je eluiran sa 15 kolona zapremine od 20 mM natrijum fosfat/500 mM NaCl/500 mM imidazol, pH 7.4, frakcije su pulovane na bazi apsorbance na A280, i dijalizovane protiv 1x PBS ili 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.5 ili 50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, pH4.5. Precipitati su uklonjeni filtriranjem sa 0.22 µm filterom.
Na mestu specifična PEGilacija adnektina sa polietilen glikolom (PEG)
[0284] adnektini koji sadrže kostruisan cisteinski ostatak konjugovani su sa PEG ili cistein-blokirajućim reagensom putem Michael-hemije dodavanja između tiol grupe na cistein i maleimid funkcionalnoj grupi PEG ili n-etilmaleimida (NEM). Za PEGilaciju sa 2-razgranatim 40kDa PEG (NOF Corporation, P/N GL2-400MA), PEG je dodat u molarnom višku proteinskom rastvoru pod blago kiselim ka neutralnim uslovima. Toj reakciji je omogućeno da se nastavi na sobnoj temperaturi 2 sata do preko noći. Ta reakcija je zatim primenjena na jono izmenjivačkoj koloni na odvojenom PEGilovanom adnektin-u iz nereagovanog PEG-maleimida i ne-PEGilovanog adnektina. Za PEGilaciju sa 4-razgranata 40kDa PEG (NOF, P/N GL4-400MA) ili 20kDa bis-PEG (NOF corporation, P/N DE-200MA), adnektin je prečišćen od SP FF u citratnom puferu, pH 6.5. Praćeno redukcijom sa DTT, uzorak je desalinizovan na G25 koloni u istom puferu kako bi se uklonio DTT i reagovan sa 20kDa bis-PEG ili 4-razgranatim 40K PEG pri 2:1 (PEG:adnektin) odnosu tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, i reakcija je zaustavljena dodavanjem viška BME. Uzorak je prečišćen Resource 15S kolonom (GE #17-0944-10) da bi se selektivno uklonile ne-PEGilovane vrste (i mono-PEGilovane vrste u slučaju 20kDa bis-PEG reakcije). Finalna preparativna SEC kolona (GE #17-1071-01, Superdex200, 26/60) korišćena je (ako je potrebno) da bi se uklonile visoko molekularne vrste i nereaktivan adnektin. Da bi se pripremio CYS-blokiran adnektin, 10-puta molarni
1
višak NEM (Pierce Chemical) dodat je odmah nakon prethodno pomenute faze desalinizacije G25 u citratnom (pH 6.5) puferu. To je inkubisano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i reakcija je zaustavljena dodavanjem viška BME. Uzorak je zatim detaljno dializiran protiv PBS. Prečišćeni konjugovani adnektini analizirani su putem SDS-PAGE i ekskluzinom hromatografijom po veličini.
Prečišćavanje i PEGilacija ne-tagovanog skafold proteina na bazi fibronektinskog veziva
[0285] Odabrana veziva klonirana su u pET9d vektoru bez HIS6taga i eksprimirana u E.coli BL21 DE3 plysS ćelijama.25 ml inokuluma kulture prethodno izolovani iz jedne zasejane kolone uzgajani su u 125 ml fioli do OD 600 nm dostizanja 1-2, upotrebom pH 6.85 medijuma 50ug/ml kanamicina (Amonijum Hlorid, Limunska Kiselina, Fero Amonijum Citrat, Magnezijum Sulfat, Natrijum Fosfat Monobazni Monohidrat, Dekstroza Anhidrovana, Glicerol, Fiton Pepton, Granulisani Ekstrakt Kvasca, Kanamicin Sulfat, Amonijum Sulfat za pH podešavanje).10 L fermentor (7.5 L početna zapremina serijskih medijuma) inokulisan je pri finalnom OD 600 nm od 0.003. Kultura je uzgajana preko noći na 25°C sa konstantnim mešanjem na 650 rpm i rastvorenim O2nivoima od >30%, održavajući pH. Narednog dana, temperatura je pomerena na 37°C i kultura je uzgajana do OD 600 nm dostignutog od 20-25. Kada je postignut ciljani OD, temperatura je pomerena na 30°C i kultura indukovana sa IPTG (finalna koncentracija: 1 mM). A hranljivi medijumi (Glicerol, Fiton Pepton, Granulisani Ekstrakt Kvasca, Kanamicin Sulfat, i Fosforna kiselina za pH podešavanje) dodati su pri brzini od 40 ml medijumi/L formiranje zapremine/h. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem na 10,000g tokom 30min na 4°C. Ćelijski peleti su zaleđeni na -80°C.
[0286] Ćelijska pasta odmrznuta u 1x PBS pri odnosu od 10 ml pufera/g ćelijske paste. Kada je odmrznut, uzorak prekidan UltraTurrax homogenizatorom (IKA works) do homogenosti. Rastvor je zatim propušten dva puta kroz mikrofluidizer na 18,000 psi. Rastvoriva frakcija je izdvojena centrifugiranjem tokom 30 minuta na ≥ 10,000g na 4°C. Supernatant je razblažen 1:1 sa natrijum acetatom (pH 4.5), i razbistren sa 0.2 µm filterom. Razbistren lizat je uveden u SP FF kolonu (SP1; GE) pre-ekvilibrisan sa 50 mM natrijum acetatom (pH 4.5). Kolona je zatim oprana sa 2 zapremine kolone istog pufera, praćeno sa 8 zapremina kolone od 50 mM natrijum acetata/350 mM NaCl, pH 4.5. Protein je eluiran sa 50 mM natrijum acetatom/700 mM NaCl, pH 4.5. Eluati su pulovani na bazi apsorbance na A280.
[0287] SP1 eluat je razblažen 1:5 sa 20 mM natrijum fosfatom (pH 6.7) i uveden u SP FF kolonu (SP2) pre-ekvilibrisan sa 20 mM natrijum fosfatom/100 mM NaCl, pH 6.7. Kolona je zatim oprana sa 2 zapremine kolone istog pufera. Protein je eluiran iz kolone sa 20 mM natrijum fosfata/0.5 M NaCl, pH 6.7. Eluati su pulovani na bazi apsorbance na A280.
[0288] SP2 eluat je razblažen do 100 mM NaCl sa 20 mM natrijum fosfatom (pH 6.7) i uveden u Q FF kolonu (GE) pre-ekvilibrisan sa 20 mM natrijum fosfata/100 mM NaCl, pH 6.7. FT pik (koji sadrži proizvod) je sakupljen. Kolona je oprana ekvilibracionim puferom do povratka FT pika na osnovnu liniju.
1
[0289] adnektini koji sadrže kostruisan cisteinski ostatak su konjugovani sa PEG putem Michael-hemije dodavanja između tiol grupe na cisteinu i maleimid funkcionalne grupe PEG reagensa. Q FT frakcija je PEGilovana sa 40kDa razgranatim PEG pri molarnom odnosu od 2:1 PEG prema proteinu. Uzorak je inkubisan preko noći na sobnoj temperaturi. PEGilaciona reakcija je razblažen sa 2 dela 50 mM natrijum acetata (pH 4.5) i uvedena u SP FF kolonu (GE) pre-ekvilibrisanu sa 50 mM natrijum acetata (pH 4.5). Kolona je oprana sa 2 zapremine kolone istog pufera. PEGilovani protein je eluiran iz kolone sa 50 mM natrijum acetatom/200 mM NaCl, pH 4.5). Eluati su pulovani na bazi apsorbance na A280. PEGilovani protein je koncentrovan upotrebom 30kDa Millipore Biomax membrane. Uzorak je filtriran preko 0.22 µm filtera i uskladišten, na primer, na 4°C, -20°C, ili -80°C.
Tranzijentna ekspresija i prečišćavanje Fc-formatiranog skafold proteina na bazi fibronektinskog veziva
[0290] Za generisanje DNK, odabrani kandidati klonirani su u pDV-16 plazmidu iz kojeg su transformisane E. coli Top 10 ćelije. pDV-16 je modifikovana verzija pTT5 (Yves Durocher, NRC Canada), u koju su uvodene humane IgG1-Fc kodirajuće sekvence, kojima prethodi signalna sekvenca, a restrikciona mesta su uključena da omoguće umetanje adnektin kodirajućih sekvenci na ili terminusu Fc. Transformisane ćelije su proširene inokulisanjem 1 L Luria bujona koji sadrži 100 µg/ml Ampicillina i inkubisanjem u rotirajućem inkubatoru pri 225 rpm tokom 18 sati na 37°C. Bakterijski peleti su sakupljeni centrifugiranjem na >10000g tokom 30 minuta na 4°C. Prečišćena DNK plazmida izolovana je upotrebom QIAGEN Plazmid Plus Mega Kompleta (QIAGEN) kako je opisano protokolu proizvođača. Prečišćena DNK je kvantifikovana upotrebom apsorbance na 260nm i zamrznute na -80°C pre upotrebe.
[0291] HEK 293-EBNA1 (klon 6E) (Yves Durocher, NRC Canada) ćelije ekspandirane su na 2x10<6>ćelije/ml u 2 L F17 medijumima u 10 L GE Healthcare Wave kesi na 37°C, 5% CO2, i umešane protresanjem pod uglom od 8 stepeni pri 18 rpm.
[0292] DNK je pripremljena za transfekciju kako sledi: F17 medijuma je zagrejano do 37°C. DNK i PEI transfekcioni reagens odmrznuti su sterilnoj biobezbednosnoj haubi. DNK (2.25 mg) je dodata u 100 ml zagrejanim F17 medijumima u sterilnoj polipropilenskoj fiolu za uzgajanje i nežno umešana umešavanjem. U odvojenoj fioli, 6.75 mg PEI (1 mg/ml) je kombinovana sa 100 ml prethodno zagrejanih F17 medijuma i nežno umešane umešavanjem. Fiole su ostavljene da se slegnu tokom 5 minuta pre kombinovanja sadržaja dodavanjem PEI rastvora u fiolu koja sadrži DNK i nežnim mešanjem umešavanjem.
[0293] Sadržaji fiole koja sadrži mešavinu DNK:PEI, dodate su u wave torbu koja sadrži HEK 293-6E ćelije nakon inkubisanja na sobnoj temperaturi 15 minuta u biozaštitnoj haubi. Torba koja sadrži transfektovane HEK 293-6E ćelije inkubisana je tokom dvadeset četiri sata na 37°C, 5% CO2, i umešana protresanjem pod uglom od 8 stepeni na 18 RPM. Nakon 24 sata, 100 ml sterilnog filtriranog 20%
11
Triptona N1 (Organotechnie, Canada) rastvorenog u F17 medijumima, aseptično je dodat u kulturu. Ćelije i medijumi su sakupljeni nakon dodatna 72 sata inkubacije kako je prethodno opisano.
Alternativno, tranzijentna HEK ekspresija u fioli za protresanje (0.5 L medijuma u 2 L fioli) može se izvesti sa DNK:PEI odnosom od 1:2. Ćelije su izdvojene iz kondicioniranih medijuma centrifugiranjem na 6000g tokom 30 minuta na 4°C. Kondicionirani medijumi su zadržani, filtrirani kroz 0.2 µM filter, i uskladišteni na 4°C.
[0294] Kondicionirani medijumi naneti su na 10 ml hromatografsku kolonu koja sadrži GE MabSelect Sure smolu pred-ekvilibrisanu u PBS pri brzini od 5 ml/minut. Nakon uvođenja filtriranih kondicioniranih medijuma, kolona je oprana sa najmanje 100 ml PBS na sobnoj temperaturi. Prečišćeni proizvod je eluiran iz kolone nanošenjem 100 mM Glicin/100 mM NaCl, pH 3.0. Frakcije su neutralisane u pH ili sakupljanjem u epruvetama koje sadrži 1/6 zapremine 1M Tris pH 8, ili pulovanjem prema A280 apsorbanci praćeno dodavanjem 1M Tris pH 8 u 100 mM. Ako je sadržaj vrste visoke molekulske mase veći od 5% nakon Protein A eluiranja, tada je uzorak dalje prečišćen Superdex 200 (26/60) kolonom (GE Healthcare) u PBS. SEC frakcije koji sadrže monomere su pulovane i koncentrovane. Dobijeni protein A ili SEC pul iscrpno su dijalizovani protiv PBS na 4°C, i sterilno filtriran upotrebom 0.22 µm isečenog filtera pre zamrzavanja na -80°C.
Grupna proizvodnja: Ekspresija kod siara i primarno izdvajanje: UCOE CHO Sistem
[0295] Banka ćelija sisara za ispitivanje (RCB) pripremljena je transfektovanjem anti-miostatin adnektin-Fc fuzija kloniranih u pUCOE vektoru koji sadrži sveprisutni element otvaranja hromatina (UCOE) [Modifikovan UCOE vektili Iz Millipore] u CHO-S ćelijama. RCB je utvrđen ekspanzijom ćelija u selekconim medijumima (0.04% (v/v) L-Glutamin (Invitrogen) i 0.01% (v/v) HT Suplement (Invitrogen) u CD CHO medijumu (Invitrogen)) koji sadrži 12.5 µg/mL puromicina. Ćelije malog broja prolaska aseptično su izolovane centrifugiranjem, resuspendovane u medijumima banke (0.04% (v/v) L-Glutamin (Invitrogen), 0.01% (v/v) HT Supplement (Invitrogen) i 7.5% (v/v) DMSO u CD CHO medijumu (Invitrogen)) do konačne koncentracije od 1 x 10<7>ćelije/mL. Ove ćelije inicijalno su zamrznute u 70% izopropil alkoholnoj kupki na -80°C preko noći, a zatim transferovane u tečni azot za dugoročno skladištenje sledećeg dana.
[0296] Ćelijska kultura inicirana je odmrzavanjem jedne RCB bočice u 25 mL selekcionoh medijuma koji sadrži 12.5 µg/mL puromicina i ekspandirajuću kulturu u istim medijumima. Ćelijama je omogućeno da dostignu koncentraciju između 1-2 x 10<6>ćelije/mL pre deljenja na 0.2 x 10<6>ćelije/mL. Ćelije su generalno održavane između 2-4 nedelje pre zasejavanja u bioreaktoru. Ekspanziona kultura pasažirana je finalni put i omogućeno joj je da raste do tačke u kojoj 15 L bioreaktor koji sadrži 8 L proizvodnih medijuma (Invitrogen CD CHO medijumi koji sadrže 0.01% (v/v) HT Supplement (Invitrogen), 0.04% (v/v) Glutamax (Gibco), i 0.005% (v/v) Pluronic F-68 (Gibco)) može biti zasejan pri konačnoj gustini od 0.2 x 10<6>ćelije/mL. Bioreaktorska kultura je praćena dnevno na VCD (gustina vijabilnih ćelija), procenat Vijabilnosti, pH, i koncentraciju glukoze. Bioreaktorska kultura je dopunjena dana 3 i 6 sa 10% ukupnom zapreminom bolus dodavanja hranljivih medijuma. Kultura je sakupljena između Dana 7 i Dana 9 sa procentom vijabilnosti od >70%. Tokom uzgajanja, bioreaktorska kultura je kontrolisana na pH od 7.1, temperaturi od 37°C, %DO2 od 40%, i konstantni RPM od 100.
[0297] Na dan sakupljanja, bioreaktorske kulture direktno su propuštene kroz 6.0/3.0 µm filter dubine praćeno sterilnom 0.8/0.2 µm filtracijom u sterilnoj kesi. Razbistrena sterilna kultura uskladištena je preko noći na 2-8°C. Razbistrena kultura je zatim koncentrovana ravnim pločama TFF upotrebom 30,000 kDa membrane. Približna koncentracija bila je 6x, zavisno od titra sakupljanja. Koncentrovan supernatant zatim je sterilno filtriran u PETG boce i ili obrađen direktno ili uskladišten na -80°C.
Prečišćavanje Anti-miostatin-adnektin-Fc fuzije
[0298] Sakupljen supernatant (čist ili koncentrovan) uveden je u MabSelect Protein A kolonu prethodno ekvilibrisanu sa PBS. Kolona je oprana sa 5CV 50mM Tris pH8.0, 1M Ureeom, 10% PG. adnektin-Fc fuzija je eluirana sa 100 mM Glicin pH 3.3, sakupljajući pik u kontejner koji je prethodno napunjen sa 1CV 200 mM Natrijum Acetata pH 4.5. Pik eluiranja baziran je na apsorbanci na A280.
[0299] Eluat proteina A je razblažen do pH 3.0 sa dodavanjem 2 M Limunske kiseline i ostavljen na sobnoj temperaturi 1 sat, radi inaktivacije virusa. Uzorak je zatim razblažen sa 200 mM Natrijum Fosfatnim Tribaznim do dostitanja pH 4.5. Ako je potrebno, rastvor je dalje razblažen vodom do niže provodljivosti ispod 10ms/cm.
[0300] Razblažen eluat proteina A je propušten preko Tosoh Q 600C AR (Tosoh Bioscience), prethodno kondicioniran sa 50mM Natrijum Acetatom pH 4.5, u negativnom modu hvatanja. Prolazni pik je sakupljen, bazirano na apsorbanci na A280. Kolona je oprana sa 50mM Natrijum Acetatom i stripovano sa 0.2N NaOH.
[0301] Q 600C AR protok je formulisan upotrebom tangencijalne protočne filtracije koristeći 30K NMWCO membranu praznih vlakana (GE), sa veoma nežnim mešanjem retenata. adnektin-Fc fuzije diafiltrirane su u 25mM Natrijum Fosfatu 150mM Trehalozi pri pH 7.0 tokom 6 diazapremine, a zatim koncentrovane za ciljanu proteinsku koncentraciju.
Primer 2 – Biofizičko određivanje anti-miostatin proteina
[0302] Ekskluziona hromatografija po veličini: Standardna ekskluziona hromatografija po veličini (SEC) izvedena je na adnektini kandidatima dobijenih iz proseca srednje skale. SEC materijala srednje skale izvedena je upotrebom Superdex 20010/30 ili na Superdex 7510/30 koloni (GE Healthcare) na Agilent 1100 ili 1200 HPLC sistemu sa UV detekcijom na A214 nm i A280 nm i sa fluorescencionom detekcijom (ekscitacija 280 nm, emisija 350 nm). Pufer od 100 mM natrijum sulfat/100 mM natrijum fosfat/150 mM natrijum hlorid, pH 6.8 korišćen je pri pogodnoj brzini protoka za uposlenu SEC kolonu. Gel filtracioni standardi (BioRad Laboratories, Hercules, CA) korišćeni su za kalibraciju molekulske mase. Dobijen rezultat SEC na srednjoj skali prečišćenog adnektina pokazuje predominantno monomerni adnektin i eluat u približnom opsegu od 10 kDa vs. globularni Gel Filtracioni standardi (BioRad) kako je prikazano u Tabelama 9 i 10.
[0303] Termostabilnost: Analiza Toplotnom Skenirajućom Fluorescencijom (TSF) HTPP adnektina, izvedena je njihovim skrinovanjem na relativne toplotne stabilnosti. Uzorci su normalizovani na 0.2 mg/ml u PBS.1 µl Sypro orange boje razblažene 1:40 sa PBS dodato je u 25 µl svakog uzorka i ploča je zatvorena sa providnim adhezivnim poklopcem mikroploče sa 96 bazenčića. Uzorci su skenirani upotrebom BioRad RT-PCR uređaja obezbeđivanjem temperature od 25°C-95°C, pri brzini od 2 stepena po minuti. Podaci su analizirani upotrebom BioRad CFX manager 2.0 softvera. Th vrednosti dobijene putem TSF pokazale su da su u vezi sa bazenčićem sa Tm vrednostima dobijenim sa DSC preko opsega topljenja od 40°C do 70°C. Ovo se smatra prihvatljiv radnim opsegom za ovu tehniku. Rezultat ND ("bez podataka") dobijen je kada je nagib tranzicione krive premali da omogući njegov derivativni pik (brzina promene fluorescencije u vremenu) da bi se razlikovao iz buke. "ND" rezultat se ne može shvatiti kao pokazatelj termostabilnosti. Analize Diferencijalne Skenirajuće Kalorimetrije (DSC) dijalizovane HTPP'd i adnektina srednje skale izvedene su za određivanje njihove respektivne Tm's.0.5 mg/ml rastvor je skeniran u VP-Kapilarnom Diferencijalnom Skenirajućem kalorimetru (GE Microcal) obezbeđivanjem temperature od 15 °C do 110°C, pri brzini od 1 stepena po minutu pod pritiskom od 70 p.s.i. Podaci su analizirani vs. Izvođenje kontrola pogodnog pufera upotrebom najboljeg podešavanja upotrebom Origin Softver (OriginLab Corp). Rezultati TSF i DSC analiza sumirani su u Tabelama 8-10. Kako je prikazano u Tabelama 8-10, mnogi klonovi pokazali su temperature nesavijanja od preko 60°C, što ukazuje na veoma biofizički stabilnu strukturu pogodnu za medicinsku formulaciju. Adnektini su generalno tolerantni na PEG-ailaciju ili Fc-formatiranje bez očiglednog gubitka u stabilnosti. U nekim slučajevima, ovi formati obezbeđuju poboljšane stabilnosti. Na primer, 3116_A07 kao nemodifikovani adnektin ima Tm od strane TSF od 60°C, ali kada je PEGilovan (ATI-1377) Tm od strane DSC je 68°C, a u Fc-X formatu (PRD-1286) Tm od strane DSC je 66°C.
Primer 3 – Ogled luciferaze baziran na ćelijama
[0304] Luciferaza reporter plazmid, Aktivin-Responsivni Element (ARE)-luc, generisana je ligacijom devet ponavljanja ARE u tandemu u luciferaza reporteru vilinog konjica. Plazmid je tranzijentno transfektovan u HepG2 ćelijama. Plazmid pGL4.74[hRluc/TK] je ko-transfektovan radi normalizacije za transfekcionu efikasnost.10,000 ćelija je zasejano po bazenčiću u ploči sa 96-bazenčića. Kada je protein kao što je miostatin, aktivin, ili BMP-11, dodat u ćelije i vezuje se za njegov kognatni receptor, nishodna SMAD signalizacija se trigeruje, što dovodi do vezivanje fosforilovanog SMAD kompleksa sa ARE. Količina, npr.,
11
miostatina, izložena ćelijama je direktno proporcionalna količini luciferaza proteinu koji je proizveden i, kao posledica, meri se luciferaza aktivnost. Kada je miostatin antagonist (npr., anti-miostatin adnektin) dodat jednovremeno sa miostatinom u ćelije, aktivacija ARE se snižava, što dovodi do smanjene proizvodnje luciferaze i aktivnosti.
[0305] U ovom eksperimentu, (1) Anti-miostatin adnektin i miostatin, (2) anti-miostatin adnektin i aktivin A, ili (3) anti-miostatin adnektin i BMP-11 prethodno su inkubisani pre dodavanja u ćelije.
Miostatin (R&D Systems) je korišćen pri 10-500 pM, aktivin A (R&D Systems) pri 10-500 pM, i BMP-11 (R&D Systems) pri 10-500 pM. Nakon inkubacije preko noći sa ovim raznim kombinacijama, ćelije su lizirane, a luciferaza aktivnost (luminescencija) izmerena upotrebom dvostrukog-Glo Luciferaza Oglednog Sistema® (EnVision). IC50 je definisan kao koncentracija adnektina koja je potreba za dostizanje 50% inhibicije miostatin-indukovane ARE-luciferaza aktivnosti.
[0306] Kako je prikazano u Tabelama 8-10, anti-miostatin adnektini inhibiraju miostatin-posredovano povećanje u ARE-luc reporter aktivnosti.
Primer 4 - Ogled vezivanja HTRF
[0307] HTRF ogled je korišćen za merenje afiniteta vezivanja anti-miostatin adnektina sa miostatinom. Ogled je kompetitivni HTRF ogled koji koristi Eu-W1024 oznaku kao donor fluorofora i Alexa Fluor® 647 kao primalački fluorofor. Biotinilovan adnektin 1889E01 i Alexa Fluor® 647 obeležen rhActRIIb-Fc mogu vezati miostatin simultano na dva distinktivna mesta vezivanja. Eu-W1024 obeležen Streptavidin upotrebljen je za vezivanje biotinilovanog 1889E01. Dva fluorofora, Eu-W1024 i Alexa Fluor® 647, dovedeni su zajedno formiranjem 1889E01/miostatin/ActRIIb-Fc kompleksa, a HTRF signal se može očitati na En Vision čitaču ploča (Perkin Elmer) upotrebom HTRF protokola. U prisustvu kompetitivnog adnektina, HTRF signal se snižava. IC50 su dati u Tabelama 8-10.
Tabela 8: Rezultati Biofizičke karakterizacije, Ogleda ARE-luciferaza reportera, i HTRF ogleda vezivanja za anti-miostatin mono-adnektin-e.
11
Tabela 9: Rezultati Biofizičke karakterizacije, Ogleda ARE-luciferaza reportera, i HTRF ogleda vezivanja za PEGilovane anti-miostatin adnektin-e.
11
Tabela 10: Rezultati Biofizičke karakterizacije, Ogleda ARE-luciferaza reportera, i HTRF ogleda vezivanja za Fc-fuzionisane anti-miostatin adnektin-e.
11
11
11
Primer 5- SMAD2 Fosforilacija indukovana Anti-miostatin adnektin-posredovanom inhibicijom miostatina
[0308] Humane rabdomosarkoma RH41 ćelije (DSMZ, Braunschweig, Namačka) korišćene su za analizu inhibicionog odgovora sa 12-, 2-, i 4-tačaka opisanu ispod. Ćelije su uklonjene od medijuma kulture i oprane kako bi se uklonio serum i ostavljene da se slegnu u oglednim medijumima koji sadrže BSA tokom 4 sata. Ćelije su podignute iz fiole upotrebom versene rastvora i transferovane u propilenske ploče V-dna sa 96-bazenčića pri 5x10<5>ćelije/bazenčić. Za 12-tački inhibicioni odgovor, 100 pM rekombinantnog miostatina (R&D Systems), prethodno inkubisanog tokom 1 sata sa 5-strukim opsegom koncentracije razblaženja adnektina počevši od 1000 nM (tj., 1000 nM, 200 nM, 40 nM, 8 nM, 1.6 nM, 0.32 nM, 0.064 nM, 0.0128 nM, 0.00256 nM, 0.000512 nM, 0.000102 nM, .0000204 nM), dodato je u ćelije. Za 4-tački inhibicioni odgovor, 100 pM miostatina, prethodno inkubisanog tokom 1 sata sa koncentracionim opsegom adnektina (30 nM, 3 nM, 0.1 nM ili 0.001 nM), dodat je u ćelije. Za 2-tački inhibicioni odgovor, 100 pM miostatina, prethodno inkubisan tokom 1 sata sa koncentracionim opsegom adnektina (10nM ili 0.5nM), dodat je u ćelije. Ćelije su tretirani miostatin-adnektin mešavinom tokom 1 sata na 37°C da bi se indukovala SMAD2 fosforilacija (pSmad2). Stimulacija je zaustavljena smeštanjem ćelija na ledu i dodavanjem ledeno hladnog PBS. Ćelije su peletirane i lizirane prateći standardne protokole i SMAD2 fosforilacija detektovana je upotrebom ELISA ogleda (Cell Signaling Technologies). Inhibicija postignuta koncentracionim opsegom adnektina prikazana je u grafikonu upotrebom GraphPad Prism Softvera i normalizovanjem tačaka podataka prema kontrolama koje daju 100% i 0% inhibicije. IC50 je definisan kao koncentracija adnektina potrebna da se dostigne 50% inhibicije miostatin-indukovane SMAD2 fosforilacije. Podaci prikazani u tabeli 11 pokazuju da adnektini izvedeni iz afinitetne optimizacije roditeljskih klonova 1979_B06 i 2062_G02 i potentno i potpuno inhibiraju miostatin-indukovanu pSMAD fosforilaciju i pokazuju IC50 vrednosti u opsegu od 0.78 nM do 0.06 nM. To predstavlja više od 16-75 struko poboljšanje u IC50 vrednostima u odnosu na roditeljske klonove 1979_B06 (IC50 = 12.8 nM) i 2062_G02 (IC50 = 59.1 nM).
Tabela 11. Inhibicija SMAD2 fosforilacije (pSMAD2) anti-miostatin adnektinima
12
Primer 6 - SPR Afinitetna Merenja za Anti-miostatin adnektin-e kinetike vezivanja adnektin-a upotrebom SPR formata A
[0309] Anti-humano Fc antitelo (Biacore/GE) imobilizovano je na Biacore CM5 čipu putem NHS/EDC kuplovanja u skladu sa instrukcijama proizvođača. ActRIIb-Fc (R&D Systems) je uhvaćen i na referentnim i na ćelijama aktivnog protoka, praćeno hvatanjem humanog miostatina (R&D Systems), humanog BMP-11 (GDF-11; R&D Systems), ili humanog Aktivin A (R&D Systems) samo na ćelijama aktivnog protoka (svaka rastvorena u skladu sa predloženim protokolom proizvođača i razblažene u HBSP radnom puferu). Koncentracioni opseg anti-miostatin adnektina primenjen je među svim ćelijama protoka u HBSP radnom puferu. Regeneracija površine čipa između ciklusa postignuta je sa dva 30 sekundarna pulsa od 3M MgCl2. Kinetički tragovi referentnih-oduzetih senzorgrama podešeni su na 1:1 vezujući model upotrebom Biaevaluation softvera. Kratak pregled Biacore kinetičkih podataka prikazan je u tabeli 12.
[0310] Podaci prikazani u tabeli 12 ukazuju da optimizovano nasledstvo adnektina vezuje miostatin čvrsto, sa KDs u opsegu od 0.06-1.47 nM, u poređenju sa roditeljskim adnektinima 1979_B06 i 2062_G02, koji prikazuju KDs od 29 i 49 nM, respektivno.
[0311] Nakon PEGilacije, postoji neki gubitak u miostatin afinitetu, sa KDs koji se kreće od 0.76 do 14.4 nM, iako nema efekta PEG-ailacije na potenciju u ARE-luciferaza ogledu (videti Tabele 8 i 9).
[0312] adnektin selektivnost u odnosu na BMP-11 kreće se od potpuno ne-selektivno do 17-strukog, dok je vezivanje za aktivin ili ekstremno slabo ili nepostojeće, što sugeriše na visoku selektivnost u odnosu na aktivin.
Kinetike vezivanja adnektina upotrebom SPR formata B (korisne za Fc-formatirane adnektin-e)
[0313] Humani miostatin (R&D Systems), humani BMP-11 (GDF-11; R&D Systems), ili humani Aktivin A (R&D Systems) rastvoren je u skladu sa predloženim protokolom proizvođača i imobilizovan na Biacore CM5 čipu pri 1-10 µg/mL u acetatnom (pH 4.0 ili 4.5) puferu upotrebom standardnog NHS/EDC kuplovanja. Koncentracioni opseg anti-miostatin adnektina primenjen je u HBSP radnom puferu.
Regeneracija površine čipa između ciklusa postignuta je sa 60 sekundi 10-50 mM NaOH. Kinetički tragovi referentno-oduzetih senzograma podešeni su na 1:1 vezujući model upotrebom Biaevaluation softvera. Za Fc-formatirani adnektini, interakcione kinetike pokretani su težnjom bivalentnog Fc i dimernog miostatina čak i pri niskoj gustini imobilizacije. Kratak pregled Biacore kinetičkih podataka prikazan je u tabeli 12. Podaci prikazani u tabeli 12 ukazuju da neki adnektina koji su primenjeni u ovom SPR formatu vezuju miostatin i BMP-11, a takođe i aktivin sličnim afinitetima. Suštinska selektivnost u odnosu na aktivin u ARE-luciferaza ogledu, ipak sugeriše da afinitet prema aktivinu može biti veštački istaknut u ovom SPR oglednom formatu.
Tabela 12. Kratak pregled SPR kinetičkih podataka za anti-miostatin adnektin-e. Formati A i B opisani su u primeru 6.
t
12
Primer 7- Afinitet faze rastvora za Anti-miostatin adnektin-e
[0314] Afinitet rastvora PRD-1474, Fc-fuzionisan anti-miostatin adnektin, za miostatin izmeren je upotrebom Ogleda kinetičkog isključivanja (KinExA). Kvadriduplikatne titracije PRD-1474 izvedene su sa miostatinom pri monomernoj koncentraciji od 2 nM (n=2), 1 nM (n=1), i 0.7 nM (n=1). Relativna koncentracija nevezanog miostatina, izmerena je pomoću hvatanja na ATI-1310 čvrstoj matrici (kuplovana sa poliakrilamidnim perlama putem kostruisanog slobodnog cisteina) praćeno detekcijom sa fluorescentno-obeleženim konstruktom miostatin ko-receptora, ActRIIB-Ig koji može da veže miostatin simultano sa adnektin-om. ATI-1310 je povezani adnektin koji ulazi u kompeticiju sa PRD-1474 za vezivanje sa miostatinom i omogućava hvatanje nevezanog miostatina. Globalna Kd analiza prikazana u tabeli 13 daje Kd od 170 pM sa 95% konfidencionih intervala od 330-60 pM. Afiniteti PRD-1177 i ATI-1338 takođe su izmereni upotrebom istog oglednog formata. Triplikatne titracije PRD-1177 izvedene su sa miostatinom pri monomernoj koncentraciji od 1 nM (n=2) i 0.8 nM (n=1). Triplikatne titracije ATI-1338 izvedene su sa miostatinom pri monomernoj koncentraciji od 5 nM (n=1), 1.6 nM (n=1), i 1.4 nM (n=1). Ove analize ukazuju da PRD-1177 vezuje miostatin sa globalnom Kd vrednošću od 250 pM i 95% konfidencionim intervalom od 340-130 pM (Tabela 13). ATI-1338 vezuje miostatin sa globalnom Kd vrednošću od 850 pM i 95% konfidencionim intervalom od 1400-330 pM.
Tabela 13. Merenja afiniteta KinExA faze rastvora za vezivanje miostatina.
Primer 8 - Mutacionalna Analiza za 3116_A06
[0315] Kako bi se shvatila relativna tolerancija položaja petlji prema mutaciji, sprovedene su dve slične, ali odvojene studije. Prva je bila tradicionalno skeniranje alaninom, u kojem se vezivanje i efikasnost odvojene alanin mutacije u petljama adnektina 3116_A06 (SEQ ID NO: 118) određuju u biohemijskim i ogledima baziranim na ćelijama. Druga studija sastoji se od dubokog mutacionog skeniranja kod kojeg je stvorena biblioteka mutacije jednog mesta u istim položajima za 3116_A06 (SEQ ID 118), ali je supstituisan svaki položaj sa 20 mogućih aminokiselina. Ove komponente biblioteke zatim su eksprimirane kao protein-mRNK fuzije i podvrgnute jednoj rundi mRNK displeja (kako je opisano u Sekciji IV), odvajajući komponente biblioteke povezane sa biotinilovanim miostatinom iz onih preostalih nevezanih upotrebom streptavidin magnetskih perli. U ovom pristupu, sekvenciranje sledeće generacije inputa i vezane populacije omogućeno je radi određivanja relativnog obogaćivanja/trošenja svake sekvence, što ukazuje na njihov unutrašnji afinitet ka miostatinu.
[0316] Skeniranje alanina: PCR na mestu usmerena mutageneza korišćena je da bi se stvorilo jedno mesto alanin mutacije u 3116_A06 (SEQ ID NO: 118) u BC petlji (ostatci 25-33), DE petlji (ostaci 55-58), i FG petlji (ostaci 80-89). Klonovi su eksprimirani u E. coli i prečišćeni putem HTPP kako je opisano u primeru 1. Ekskluziona hromatografija po veličini (SEC, kako je opisano u primeru 2) potvrđuje da su svi alanin-supstituisani proteini predominantno monomerni (Tabela 14). I ARE-luciferaza (Primer 3) i HTRF ogledi (Primer 4) su sprovedeni. U ogledu HTRF kompeticionog vezivanja, potencije su se kretale od IC50 = 1.5 nM do >100 nM (Tabela 14). Većina položaja toleriše alanin supstituciju u HTRF ogledu do nekog stepena, sa izuzetkom od Gly55, Arg56, i Gly57 DE petlji, za koje je vezivanje drastično smanjeno (IC50s >100 nM). Manji efekat javio se u položajima Gly30 BC petlje, i Val80, Thr81, i Tyr88 FG petlje, koji i dalje pokazuje vezivanje ali sa >10-strikog povećanja u IC50 u odnosu na roditeljsku sekvencu ("WT"). U ARE-luciferaza ogledima baziranim na ćelijama, mutanti potencije krežu se od IC50 = 0.6 nM do >100 nM (Tabela 14). Uticaj alanin mutacije je generalno veći u ogledu baziranom na ćelijama u odnosu na HTRF ogled. Gly55, Arg56, i Gly57 DE petlje i Val80 i Tyr88 FG petlje sve značajno pokazuju drastično smanjenu potenciju u ovom ogledu, sa IC50s >100 nM. Umereniji efekat zapažene je za BC položaje Leu26, Pro27, His28, Gly30, i Asn33, i FG položaje Thr81, Tyr85, i Leu86, koji svi imaju IC50s >10-strukog u odnosu na one od roditeljske sekvence.
Tabela 14: Biohemijska karakterizacija i potencije bazirane na ćelijama za alanin mutante 3116_A06
12
*SEC 1: Visoko monomerni; SEC 2: Uglavnom monomerni
[0317] Duboko mutaciono skeniranje: Sekvenciranje visoke propusnosti kombinovano je sa proteinskim displejom kako bi se omogućilo simultano merenje relativne sposobnosti svakog mogućeg mutanta
12
petlje na jednom položaju, na skali koja bi bila teška za tradicionalni pristup kakav je prethodno opisan (za pregled pristupa "Dubokog mutacionog skeniranja", videti Araya et al., Trends in Biotechnology 29: 435-442, 2011; sličan pristup dalje dat kao primer u Forsyth et al., mAbs 5: 523-532, 2013).
[0318] Konstrukcija i selekcija biblioteke: Tri odvojene biblioteke kreirane su koje sadrže svaku moguću mutaciju jednog mesta u svakoj od tri petlje 3116_A06 (SEQ ID NO: 118): BC petlja (položaji 25-33), DE petlja (položaji 55-58), i FG petlja (položaji 80-89). Za svaku petlju, više oligonukleotida je dizajnirano koji su pojedinačno inkorporirani u NNK kodon na svakom položaju, u kojem N=A, C, G, T i K=G, T. Upotreba ovih degenerativnih kodona omogućava kodiranje svih 20 aminokiselina (plus zaustavnog kodona) na položaju na kojem je NNK inkorporiran. Oligonukleotidi su sastavljeni preklapanjem ekstenzione PCR radi generisanja biblioteke adnektina pune dužine, u kojoj Lib-BC sadrže svaku pojedinačnu mutaciju aminokiselinske BC petlje od 3116_A06, Lib-DE koji sadrži svaku pojedinačnu mutaciju aminokiselinske DE petlje od 3116_A06, i Lib-FG koji sadrži svaku pojedinačnu mutaciju aminokiselinske FG petlje od 3116_A06. Te tri biblioteke eksprimirane su kao mRNK-proteinski fuzioni molekuli upotrebom PROfuzije prema Xu et al., Chemistry & Biology 9: 933-942, 2002. Lib-BC, Lib-DE, i Lib-FG PROfuzioni molekuli odvojeni su odabiranjem prema 3 nM biotinilovanom miostatinu, i vezujući molekuli naknadno su uhvaćeni na streptavidin magnetim perlama. Veziva su eluirana iz perli upotrebom 100 mM KOH. Molekuli eluirani iz perli predstavljaju varijante 3116_A06 koje se i dalje vezuju za miostatin, dok one prisutne u inicijalnoj biblioteci ali ne i u eluatu, predstavljaju varijante 3116_A06 koji se ne vezuju kao bazenčić sa miostatinom.
[0319] NGS barkodovanje i mešanje: Dve populacije, input (pre vezivanja sa miostatinom) i veziva (eluirana iz perli post-selekcije), izvedene iz svake od tri biblioteke (Lib-BC, Lib-DE, i Lib-FG), sakupljene su i odvojeno amplifikovane. Svaka populacija je pričvrćena sa 5'- TruSeq Universal Adaptorom, 3'-Truseq Adaptorom II, i unikatnim 6-nukleotidnim barkodom putem PCR. Ukupno šest barkodovanih populacija zatim je pojedinačno kvantifikovano i umešano (Lib-BC: Lib-DE: Lib-FG = 9:4:10) na bazi broja randomizovanih ostataka u svakoj petlji, kako bi se obezbedili slični brojevi sekvenci po randomizovanom položaju na statistički način. Pulovan uzorak je sekvencioniran sekvencioniranjem sledeće generacije MiSeq 150bp uparenog-kraja (Illumina).
[0320] AnalizaNGS podataka: Unapred-pročitane sekvence iz sekvenciranja sledeće generacije smeštene su prema populaciji, položaju mutacije, i identitetu mutiranih aminokiselina. Sve sekvence slabog kvaliteta i one koje sadrže više mesta mutacija eliminisane su iz analize. Dalje, frekvencija svake sekvence u post-selekcionoj populaciji podeljena je njihovom frekvencijom u input populaciji da bi se izveo odnos obogaćenja (ER). Poređenje ER roditeljskih sekvenci (WT, koja funkcioniše kao pozitivna kontrola) i sekvenci koje sadrži stop kodon (koji funkcionišu kao negativna kontrola, predstavljajući pozadinsku buku slučajnog preživljavanja) pokazuje da odnos signala prea pozadini (S/B) varira između tri petlje, verovatno jer je svaka biblioteka petlje smeštena kroz selekcionu pojedinačnost. Iz ovog
12
razloga, svaka sekvenca je normalizovana do prosečnog stop i prosečnog wt ER radi svoje sopstvene specifične petlje, da bi se dobio ER<norm>.
[0321] Duboko mutaciono skeniranje potvrđeno je poređenjem relativne sposobnost alanin mutanata jednog položaja sa biohemijskim podacima iz tradicionalnog alanin skena. Ukupno, korelacija je bila veoma snažna (Fig.8). NGS ER definišu profil obogaćenja i trošenja alanin mutanata kroz petlje koje su u korelaciji sa bazenčićem sa uticajem zapaženim u HTRF i ARE-luciferaza ogledima.
[0322] Biohemijska HTRF IC50 takođe je prikazan u grafikonu direktno naspram NGS ER<norm>za svaki alanin mutant, kako je prikazano na Fig.9.
[0323] Bazirano na alanin korelacijama, tri kategorije su utvrđene u kojima sve aminokiselinske mutacije jednog položaja mogu biti smeštene putem njihovih odnosa NGS obogaćenja: Najpoželjnije mutacije (ER<norm>> 0.8), poželjnije mutacije (ER<norm>> 0.5), i poželjne mutacije (ER<norm>> 3 standardna devijacija proseka petlji ERstop). Niže granice ER<norm>definišu poslednju kategoriju koja se razlikuje za tri petlje: BC = 0.25; DE = 0.15; FG = 0.35. Svi mutanti jednog položaja u petljama 3116_A06 smeštene su u skladu sa njihovim normalizovanim odnosima obogaćenja radi određivanja relativne tolerancije svakog položaja prema mutaciji (Tabela 15).
Tabela 15: Mutacije na jednom položaju u petljama sekvenci od 3116_A06 koje održavaju vezivanje sa miostatinom
12
[0324] Upotrebom potpunih podataka dubokog mutacionog skeniranja, položaji BC petlje 25, 26, 27, 30, 32, i 33, položaji DE petlje 55, 56, i 57, i položaji FG petlje 80 i 88 smatraju se najočuvanijim, pri čemu sa jedan ili nekoliko tipova aminokiseline u ovim položajima održavaju vezivanje sa miostatinom. Sa druge strane, drugi položaji su visoko tolerantni na mutaciju, koji uključuju položaje BC petlje 28, 29, i 31, i položaje FG petlje 82, 83, i 87.
Primer 9 - Evaluacija farmakokinetika anti-miostatin adnektina
[0325] Da bi se ispitao farmakokinetički profil adnektina sa različitim PEGilovanim formatima, antimiostatin adnektin 2987_H07 je formatiran sa 2-razgranata 40 KD PEG (ATI-1338), 4-razgranata 40 KD
12
PEG (ATI-1339), i Bis 20 KD PEG (ATI-1341). Jedno dozna ispitivanja subkutanog davanja sa ova tri PEGilovana adnektina, izvedena su na C57BL6 miševima. Ukupne koncentracije leka određene su ELISA ogledom. Bioanalitički PK imunoogled za kvantifikaciju ATI-1338 koristi standardni sendvič format ELISA ogleda, u kojem je 1338 uhvaćen monoklonalnim antitelom za HIS-TAG protein, zatim detektovan poliklonalnim anti-PEG antitelom. Kako je prikazano u tabeli 16, dva 40 KD PEGilovana formata, ATI-1338 i ATI-1339, obezbeđuju istaknutije farmakokinetičko osnaživanje (tj., duži poluživot (t1/2) i više dozom normalizovano izlaganje) od Bis-20 KD PEGilovanog formata, ATI-1341.
Tabela 16. Farmakokinetičko poređenje tri PEGilovana formata za adnektin 2987_H07
PK Parametri ATI-1338 ATI-1339 ATI-1341
[0326] Jedno dozna ispitivanja praćena intravenoznim i subkutanim davanjem Fc-fuzionisanih antimiostatin adnektina (PRD-1177, PRD-1286, i PRD-1474) sprovedena su na C57BL6 miševima radi procene efekata Fc-fuzije na farmakokinetičke parametre. Ukupne koncentracije leka određene su ELISA ogledima. Bioanalitički PK imunoogled za kvantifikaciju Fc konjugata za PRD1177, 1474, i 1286 svi su koristili standardni sendvič format ELISA ogleda upotrebom ECL tehnologije, u kojoj je 1177 uhvaćen poliklonalnim antitelom na skafold adnektin-u, zatim detektovan anti-humani IgG antitelom. Kako je prikazano u tabeli 17, sva tri Fc-fuzionisana adnektina imaju duži polu život (58 -172 h) od PEGilovanog adnektina ATI-1338 (25 h). Niža SC biodostupnost verovatno utiče na proteoliziju tokom intersticijalnog i limfatičnog tranzita biološkog molekula. SC biodostupnosti Fc-fuzionisanih adnektina su unutar razumnog opsega bazirani na objavljenoj literaturi (npr., Richter et al., AAPS J.2012;14:559-70).
Tabela 17. Farmakokinetičko poređenje tri Fc-fuzionisana anti-miostatin adnektina
1
Primer 10 - Mehanizam inhibicije anti-miostatin adnektina
[0327] Kompetitivna ELISA: Kompetitivni ogledi vezivanja za procenu sposobnosti anti-miostatin adnektina da ulaze u kompeticiju sa ActRIIB receptorom vezivanja sa miostatinom, izvedeni su upotrebom kompetitivne ELISA. Nunc Maxisorp ploče su obložene sa 2 µg/mL ActRIIb-Fc (R&D Systems) u 0.2M natrijum karbonatu pri pH 9.6 pufera preko noći na 4°C. Nakon pranja sa PBS-T (PBS koji sadrži 0.05% Tween-20), bazenčići su blokirani sa OptEIA puferom (BD Biosciences) tokom 1 h na 25°C uz protresanje. Miostatin (10 nM; R&D Systems) je prethodno inkubisan sa koncentracionim opsegom adnektina ili ActRIIb-Fc kompetitora (0.2 pM do 1 µM) u OptEIA puferu tokom 1 h na 25°C uz protresanje. Blokirana i obložena ogledna ploča oprana je sa PBS-T, a zatim su dodate miostatin/kompetitor mešavine i inkubisane tokom 30 min na 25°C uz protresanje. Ogledna ploča oprana je sa PBS-T, nakon čega je vezan miostatin detektovan sa 1:1000 biotinilovanim kozjim antimiostatin poliklonom (R&D Systems) razblažen u OptEIA, tokom 1 h na 25°C uz protresanje. Nakon pranja sa PBS-T, 1:5000 Streptavidin-HRP (Thermo/Pierce) razblažen u OptEIA je dodat, praćeno inkubacijom tokom 30 min na 25°C uz protresanje. Ogledna ploča je razvijena sa TMB (BD Biosciences), ugašena sa 2N sumpornom kiselinom, a apsorbanca očitana na A450. Kako je prikazano na Fig.10, ActRIIb-Fc u rastvoru potpuno blokira vezivanje miostatina za ActRIIb-Fc obložen na ploči, kako je očekivano. Suprotno tome, međutim, PRD-1288 (razlikuje se od PRD-1474 samo u veznoj sekvenci), PRD-1285, i PRD-1286 pri koncentracijama do 1 µM ne blokiraju miostatin od vezivanja ActRIIb.
[0328] Kompeticija SPR: Kompetitivni ogledi vezivanja za procenu sposobnosti anti-miostatin adnektina da uđu u kompeticiju sa Tip I i Tip II receptorima za vezivanje sa miostatinom ili BMP11, kao surogat miostatinu, takođe su sprovedene upotrebom SPR na Biacore T100 instrumentu, u dva različita eksperimentalna formata. U "SPR Formatu A", senzorne površine čipa pripremljene su imobilizacijom 100 ug/ml proteina A (Pierce) u 10 mM acetatu pH 4.5 za 4500 RU na CM5 senzornom čipu (Biacore/GE Healthcare) upotrebom standardne etil(dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukcinimid (NHS) hemije, sa etanolaminskim blokiranjem. ALK4-Fc (R&D Systems), ALK5-Fc (R&D Systems), ActRIIB-Fc (proizvedeni interno), anti-miostatin/BMPII monoklonalno antitelo (mAb-A) koje ulazi u kompeticiju za vezivanje sa miostatinom sactRIIB, ali ne ulazi u kompeticiju sa 3116A06 za vezivanje sa mizotatinom (proizveden interno), ili adnektin-Fc PRD-1474 pri koncentracijama od 7-13 µg/ml zarobljeni su putem Fc repa pri površinskim gustinama od 1600 - 4300 RU upotrebom 60 s ubrizgavanja pri 10 µl/min.
Kompeticioni eksperimenti izvedeni su potapanjem 100 nM miostatina (R&D Systems) ili BMP11 (R&D Systems) preko ovih površina u odsustvu ili prisustvu 200 nM adnektin ATI-1523 pri brzini protoka od 30
1 1
µl/min sa 180 s vremenima asocijacije i disocijacije. Radni pufer za imobilizacione i kompeticione eksperimente bio je 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, i 0.05% v/v Surfaktant P20, pH 7.4, i površine su regenerisane između ciklusa upotrebom dva ubrizgavanja 10 mM glicina pH 1.5 tokom 30 s pri 30 µl/min.
[0329] U SPR Formatu A, BMP11 se vezuje određenije za ALK4-Fc, ALK5-Fc, ActRIIB-Fc, mAb-A, i PRD-1474 površine, dok se miostatin vezuje određenije za ActRIIB-Fc, mAb-A, i PRD-1474, ali ne ALK4-Fc ili ALK5-Fc. Da bi procenio efekat ATI-1523 na miostatinu ili BMP11 vezivanje, odgovori vezivanja za svaki protein na kraju 180 s faze asocijacije svaki su normalizovani do 100%, i u poređenju sa odgovorima vezivanja za miostatin ili BMP11 u prisustvu ATI-1523 (Tabela 18). ATI-1523 potpuno blokira vezivanje miostatina ili BMP11 na kontrolnoj PRD-1474 površini, kako je očekivano. U ogledima za određivanje sposobnosti ATI-1523 da blokira interakcije miostatina saLK4-Fc ili ALK5-Fc, BMP-11, koji se takođe vezuje za ALK4-Fc i ALK5-Fc, korišćen je kao surogat za miostatin, budući da se sam miostatin ne vezuje značajno za ALK4-Fc i ALK5-Fc pod ovim eksperimentalnim formatom. ATI-1523 značajno smanjuje vezujući signal za BMP11 prema ALK4-Fc (98% redukcija) i ALK5-Fc (69% redukcija), što sugeriše da adnektin ulazi u kompeticiju za vezivanje sa miostatinom sa Tip I receptorima. Nasuprot tome, povećani vezujući odgovor zapažen je za miostatin/ATI-1523 ili BMP11/ATI-1523 komplekse na ActRIIB-Fc ili mAb-A površinama, što sugeriše da miostatin/ATI-1523 ili BMP11/ATI-1523 kompleksi mogu da se vežu za ove površine, tj., adnektin je ne-kompetitivan sa ActRIIB-Fc ili mAb-A. Veliko povećanje u vezujućem odgovoru (>1000% povećanje) za miostatin/ATI-1523 kompleks na ActRIIB-Fc i mAb-A površinama je konzistentan sa adnektin-om sa rastvorivim efektom na miostatinu.
Tabela 18: SPR vezujući odgovor za 100 nM miostatin ili 100 nM BMP11 u odsustvu ili prisustvu 200 nM ATI-1523 on ALK4-Fc, ALK5-Fc, ActRIIB-Fc, mAb-A, ili PRD-1474 površina.
[0330] adnektin kompeticija upotrebom "SPR formata B": mehanizam dejstvovanja za anti-miostatin adnektini je procenjen u "SPR Formatu B", u kojem su miostatin ili BMP11 (10 µg/ml u 10 mM acetatu pH 4.5) direktno imobilizovani na CM5 senzornoj površini čipa upotrebom EDC/NHS hemije kuplovanja do gustine od 985 RU (miostatin) ili 530 RU (BMP11). Ovde, vezujući odgovor za receptore ALK4-Fc (R&D
1 2
Systems), ALK5-Fc (R&D Systems), ili ActRIIB-monomer (proizveden interno) injektovan sam (2 µM za 180 s pri 30 µl/min), upoređeni su vezujućim odgovorima za ove receptore praćeno pred-vezivanjem adnektina-Fc fuzije PRD-1474 za površinu (1 µM tokom 480 s pri 30 µl/min). Radni pufer za eksperimente imobilizacije i kompeticije bio je 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, i 0.05% v/v Surfaktant P20, pH 7.4, a površine su regenerisana između ciklusa upotrebom 4 ubrizgavanja 50 mM NaOH tokom15 s pri 30 µl/min.
[0331] U odsustvu PRD-1474, svaki receptili Vezan je određenije za imobilizovan BMP11, dok je samo ALK5-Fc i ActRIIB-monomer, ali ne ALK4-Fc, vezan za imobilizovan miostatin. Pred-vezivanje PRD-1474 značajno je smanjilo signal vezivanja za ALK4-Fc prema BMP11 (70% redukcija) a takođe smanjilo vezivanje ALK5-Fc prema miostatinu ili BMP11 (35-41% redukcija), ali je imalo minimalan uticaj na ActRIIB-monomer vezivanje za ili miostatin ili BMP11 površine, Tabela 19. Ovi podaci, uzeti zajedno sa podacima SPR kompeticije iz "SPR Formata A" (Tabela 18), podaci kompetitivne ELISA (Fig.10), i signalizacija potupune inhibicije miostatina zapažena u ARE-luciferaza ogledu (Fig.11), pokazuju da adnektin mehanizam dejstvovanja jeste blokada regrutovanja Tip I signalizirajućih receptora (ALK4/5), i da adnektini ne ulaze u kompeticiju sa vezivanjem Tip II receptora (ActRIIB).
Tabela 19: SPR vezujući odgovor za 1 µM ALK4-Fc, ALK5-Fc, ili ActRIIB-monomer na imobilizovane miostatin ili BMP11 površine sa ili bez pred-vezanog PRD-1474.
[0332] Kako ovi adnektini predstavljaju sekvencione familije date kao primer u ovom pronalasku, i pojedinačni klonovi unutar bazenčić-navedene sekvencione familije održavaju isto mesto vezivanja, sekvence pokrivene ovim pronalaskom deluju blokiranjem ALK4/5 regrutovanja za miostatin-ActRIIb kompleks.
[0333] Farmakokinetički podaci dalje ukazuju da se nivoi miostatin-adnektin kompleksa vremenom akumuliraju i da se ovi kompleksi vezuju za ActRIIb, čime deluju kao dominantno negativan inhibitor signalizacije nezavisno od slobodog leka. Ovaj jedinstven mehanizam razlikuje anti-miostatin adnektin-e ovog pronalaska od anti-miostatin antitela opisanih u literaturi (npr., US 7632499), i ukazuje da antimiostatin adnektini ovog pronalaska imaju povećanu aktivnost.
1
Primer 11: Mapiranje mesta vezivanja adnektina na miostatinu upotrebom HDX-MS:
[0334] Mesto vezivanja adnektina na miostatinu dalje je procenjeno upotrebom vodonik-deuterijum izmenjivačke masene spektrometrije (HDX-MS).
[0335] Postupak vodonik-deuterijum izmenjivačke masene spektrometrije (HDX-MS) ispituje proteinsku konformaciju i konformacione dinamike u rastvoru praćenjem deuterijum izmenjivačke stope i mere u amidnim vodonicima kičme. Nivo HDX zavisi od pristupačnosti rastvarača amidnih vodonika kičme i konformacije proteina. Maseno povećanje proteina nakon HDX može se precizno izmeriti pomoću MS. Kada je ova tehnika uparena sa enzimatskom digestijom, stukturalne osobine na peptidnom nivou se mogu dobiti, čime se omogućava diferencijacija na površini izloženih peptida od onih savijenih unutra, ili od onih sekvestiranih u međuprostoru protein-protein kompleksa. Tipično, deuterijumsko obeležavanje i naknadni eksperimenti gašenja su izvedeni, praćeno onlajn pepsin digestijom, peptidnim odvajanjem, i MS analizom.
[0336] Kako je sam miostatin nađen kao nepogodno nisko rastvoriv za HDX-MS pod uslovima fiziološke kondiciono relevantne pH (< 10 µg/ml), korišćena je alternativna strategija povećavanja miostatin rastvorivosti kompleksovanjem proteina sa Fab fragmentima iz mAb-A (Fab-A), koji je prikazan kao nekompetitivan sa adnektin-om upotrebom SPR eksperimenata opisanih u primeru 10. Oligomerno stanje HDX-MS uzoraka okarakterisano je eksluzionom hromatografijom po veličini kuplovanom sa detektorom više-ugaonog prelamanja svetla (SEC-MALS), pri čemu je MALS-određena masa miostatin/Fab-A kompleksa (-120 kDa) bila konzistentna sa očekivanom stroihiometrijom jednog miostatin homodimera vezanog za dva Fab-A molekula, a MALS-određena masa miostatin/Fab-A/3116_A06 kompleksa (142 kDa) bila je konzistentna sa očekivanom stoihiometrijom jednog miostatin homodimera vezanog za dva Fab-A molekula plus dva 3116_A06 molekula.
[0337] Pre mapiranja mesta vezivanja adnektina na miostatinu prepoznato od strane adnektin 3116_A06 od HDX-MS, ne-deuterisani eksperimenti izvedeni su da generišu listu uobičajenih peptičnih peptida za miostatin iz miostatin/Fab-A (1:1 molarni odnos od 30 µM svaki) i miostatin/Fab-A/3116_A06 (1:1:1 molarni odnos od 30 µM svaki) uzorke, postižući sekvenciono pokrivanje od 83.5% za miostatin. U ovom eksperimentu, 10 mM fosfatni pufer (pH 7.0) korišćen je tokom faze obeležavanja, praćeno dodavanjem pufera za gašenje (200 mM fosfatni pufer sa 4M GdnCl i 0.5M TCEP, pH 2.5, 1:1, v/v). Za eksperimente mapiranja mesta vezivanja adnektina, 5 µL svakog uzorka (miostatin/Fab-A ili miostatin/Fab-A/3116_A06) umešano je sa 65 µL HDX obeležavajućim puferom (10 mM fosfatni pufer u D2O, pD 7.0) kako bi se započele reakcije obeležavanja na sobnoj temperaturi (∼25°C). Reakcije su izvedene za različite vremenske periode: 20 sec, 1 min, 10 min, 60 min, i 240 min. Na kraju svakog perioda reakcije obeležavanja, reakcija je ugašena dodavanjem pufera za gašenje (1:1, v/v) i ugašeni
1 4
uzorak injektovan je u Waters HDX-MS sistem za analizu. Uobičajeni zapaženi peptidi praćeni su na njihove niove apsorpcije deuterijuma u odsustvu/prisustvu 3116_A06.
[0338] Eksperimentalni podaci dobijeni iz HDX-MS merenja ukazuju da adnektin 3116_A06 prepoznaje isprekidano mesto vezivanja adnektina obuhvaćeno sa dva peptidna regiona u miostatinu:
Region 1: LYFNGKEQIIYGKIPAM (85-101); SEQ ID NO: 329
Region 2: PHTHLVHQANP (56-66); SEQ ID NO: 330
[0339] Na bazi relativnog nivoa apsorpcije deuterijuma, dva peptidna regioni mogu se odrediti kao region 1 > 2, pri čemu region 1 ima najznačajnije promene u apsorpciji deuterijuma.
Primer 12 - In silico spajanje adnektina 3116_A06 na miostatin
[0340] Komputacioni pristup korišćen je za generisanje stukturalnog modela 3116_A06-miostatin kompleksa koja je bila konzistentna sa HDX-MS podacima (Fig.13). Proteinsko vezivanje 3116_A06 u strukturu humanog miostatina (PDB 3HH2 uzet iz podataka banke proteina, www.rcsb.org; Cash et al., EMBO J.28:2662-2676, 2009) izvedeno je upotrebom ZDOCK (Chen i Wang, Proteins 47:281-294, 2002) kako je implementirano u Accelrys softver Discovery Studio v3.5 (Accelrys). ZDOCK protokol koristi čvrsto telesno vezivanje dve proteinske strukture (ligand = 3116_A06 i receptor = miostatin). Vezujuće poze filtrirane su za komplekse koji sadrže konformacije 3116_A06 FG (ostaci Thr79 do Tyr88) i BC (ostaci Ser25 do N33) petlje. Poželjan kompleks odabran je na bazi komplementarnosti međuprostornih ostataka kuplovanih sa poželjnim supstitucijama korelacionih petlji identifikovane adnektin mutagenezom. Fig.13A prikazuje ALK4 mesto vezivanja i ActRIIB mesto vezivanja mapirana na miostatin strukturi (sivo). Region 1 i Region 2, koji su identifikovani putem HDX-MS eksperimenata kako je opisano u primeru 11, označeni su crnom bojom. Fig.13B prikazuje poželjan kompleks iz vezivanja, sa BC, DE i FG petljom 3116_A06 (crno) dat kao stubić, a Regioni 1 i 2 miostatina (sivo) predstavljeni su u ispunjenom prostoru. Nekoliko ostataka koji su identifikovani kao poželjne mutacije petlje pokazuju ključne doprinose. Na primer, u BC petlji 3116_A06, ostaci Ser25, Leu26, i Pro27 su značajni kao stukturalna ograničenja za održavanje ukupne konformacije petlje. Nasuprot Ala32 podešavanjima u malom hidrofobnom rascepu formiranom u međuprostoru kompleksa i ostatka kičme formira vodonične veze sa miostatinom. Najpoželjnije supstitucije na položaju 32 su Gly ili Leu, i one su predviene da fituju u bazenčić na mestu alanina. Slično, Asn33 je uključen sa vodoničnim veze blizu triptofan ostacima miostatina. Najpoželjnije supstitucije na položaju 33 su His i Gln, koji takođe sadrže bočne lance koji mogu doprineti kao donori vodoničnih veza. Ostaci u DE petlji su kritični: najpoželjnije supstitucije ograničene su na Gly55, Arg56, i Gly 57, a samo konzervativne supstitucije su poželjne za Val58. U modelnoj strukturi, Arg56 je kritičan ostatak koji doprinosi pi katjon interakcijama sa Y86 miostatinom u Regionu 1 kao i dodatnim vodoničnim vezama sa kičmom i bočnim lancem drugih ostataka Regiona 1. Za mnoge ostatke FG petlje, najpoželjnije supstitucije su konzervativne zamene. Jedan kritični položaj
1
identifikovan bio je Tyr88, koji ima pi katjon interakcije i pi-pi interakcije sa Y55 i drugim ostacima iz Regiona 2 miostatina. FG petlja je takođe uključena sa nekoliko hidrofobnih interakcija sa oba Regiona 1 i 2 identifikovani u eksperimentima mutageneze. Ove kalkulacije pokazuju dobro slaganje sa HDX-MS i SPR eksperimentalnim podacima.
Primer 13 - In vivo mišji model muskuloskeletalne efikasnosti
[0341] Mužijaci B6.SCID miševa (9-13 nedelja stari, Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) smešteni su u temperaturno-kontrolisanu sobu obrnutim 12 časovnim ciklusom svetlost/tama. Voda i uobičajena granulasta hrana bili su dostupni ad libitum. Miševi su randomizovani i raspoređeni na tretmanske grupe koje su primale ili kontrolu ili test jedinjenja ovog pronalaska na bazi telesne masa (oko 20-22 g). Kako bi se demonstrirala in vivo efikasnost jedinjenja ovog pronalaska, jedinjenja su davana ili svake nedelje (Fcfuzije anti-miostatin adnektina) ili dva puta nedeljno (PEGilovani anti-miostatin adnektini) subkutanom injekcijom. Test jedinjenja su davana životinjama u Fosfat-Puferovanom Slanom rastvoru (PBS). Kontrole su tretirane samo rekonstitucionim puferom. Test životinje (n=8-10 miševi/grupa) dozirani su tokom 14 dnevnog vremenskog okvira subkutano, sa npr., 5, 6 ili 10 mg/kg/nedelja jedinjenja ovog pronalaska. Merenja telesne mase zabeležena su pre-randomizacije, na dan randomizacije, i dva to tri puta nedeljno tokom perioda tretiranja i na kraju ispitivanja. Smanjena mišićna masa u nogama zabeležena je iz telesnih trupova na kraju ispitivanja analizom slikanja kvantitativnom magnetnom resonancijom (MRI, Echo Medical Systems, Tex). Test grupe su poređene sa kontrolnom grupom. Rezultati pokazuju da antimiostatin adnektini ovog pronalaska povećavaju procenat telesna masa od osnovne linije (Fig.14) i da imaju značajne anabolične efekte na zapreminu skeletnih mišića (Fig.15), u poređenju sa kontrolnim miševima (npr., približno 7-10% povećanje u mišićnim zapreminama u poređenju sa kontrolom.
Slikanje magnenom rezonancom (MRI)
[0342] MRI za merenja zapremine nožnog mišića izvedena su na Bruker PharmaScan 4.7 Tesla sa 16 cm otvorom (Bruker Biospin, Billerica, Ma. USA). Spirala 62 mm zapremine korišćena je kao transmiter i primalac. Nakon sakupljanja lokalizovanih slika donje noge, T2 izmerene slike dobijene su upotrebom površine aksijalnog isečka. Brza spin-eho (RARE) sekvenca sastoji se od 90° Hermite pulsa praćeno 180° Hermite pulsom sa TR/TE = 2000/23ms. Jedanaest aksijalnih isečaka sakupljeno iz gornjeg kolena ka vrhu zgloba sa dimenzijama matrice od 256 x 128 tačaka podataka. Polje gledanja bilo je 5 cm sa 2.5 cm, sa 1.25 mm debljine isečaka i RARE faktorom od 4 i 8 signalnih proseka. Zapremine nožnih mišića izračunate su sumiranjem svih površina aksijalnih isečaka pomnoženo sa 1.25 mm debljinom isečaka za ukupnu mišićnu zapreminu u svakoj nozi. Slike su analizirane kao prosek površine regiona-od-interesa (ROI) Analizom Snimanja Sekvenci (ISA, Bruker Biospin, Billerica, Ma.). Ručni ROI nacrtani su oko mišiža
1
noge sa izuzetkom površine kože i subkutane masnoće. Ukupne prosečne mišićne zapremine za obe noge, prikazane su na Fig.15.
[0343] MRI za srčane zapremine kao bezbednosna krajnja tačka, takođe je izvedena istim MRI skenerom. Nakon dobijanja inicijalnih lokalizatorkih slika površine toraksa, 9 aksijalnih slika je sakupljeno iz velikih sudova do apeksa srca. Slično analizi mišića nogu, aksijalne površine su dodate i pomnožene sa debljinom isečaka od 1.25 mm da bi se obezbedila ukupna zapremina srca za svaku životinju. MRI nije zapazio značajnu promenu u zapremini srca.
Statistike
[0344] Razlike između grupa određene su upotrebom 2 ukrojene uparene analize studentovog t-testa.
Primer 14 - Efikasnost PRD-1474 na rast mišića in vivo
[0345] Mužijaci B6.SCID miševiva (n=10/grupa) održavani su i tretirani kako je opisano u primeru 10, sa izuzetkom da je PRD-1474 davan u raznim dozama kako je označeno na Fig.16, a trajanje lečenja bilo je 28 dana. PRD-1474 pri 1 mg/kg pokazuje značajno 11.1% povećanje u zapremini donjeg nožnog mišića u poređenju sa PBS kontrolnom grupom (p<0.0001). Značajna povećanja u zapremini donjeg nožnog mišića od 27.7%, 29.7%, i 32.8% takođe su zapažena sa PRD-1474 pri 10 mg/kg, 30 mg/kg, i 100 mg/kg, respektivno. Nije zapažena promena u zapremini srca u svim tretmanskim dozama grupe u odnosu na kontrolu. Podaci su dati kao srednja vrednost ± standard devijacija. Razičite doze grupe upoređene su upotrebom ANOVA. (*p< 0.0001;<#>beznačajno između grupa).
[0346] Podaci pokazuju da su anti-miostatin adnektini ovog pronalaska efektivne pri značajno nižim dozama od miostatin inhibitora koji su prethodno opisani (npr., US 7632499, J. Clin. Onclo.
30(Suppl):Abstr.2516, 2012). Na taj način, anti-miostatin adnektini ovog pronalaska obezbeđuju povećanu efikasnost pri nižim dozama kombinovanim sa smanjenim nepoželjnim sporednim efektima, kada se daju sami ili u kombinaciji sa drugim miostatin inhibitorima ili drugim lekovima, za lečenje ovde opisanog gubljenja mišićne mase i metaboličkih bolesti.
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
21
21
21
22
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
��
��
24
��
24
24
��
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
�
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi 1. Polipeptid koji obuhvata deseti (<10>Fn3) domen fibronektina tipa III, pri čemu taj polipeptid vezuje miostatin sa KDmanjom od 500 nM a jedna od BC, DE i FG petlje<10>Fn3 domena ima jednu aminokiselinsku supstituciju u odnosu na odgovarajuće aminokiselinske sekvence od SEQ ID NO: 34, 39 i 75, respektivno, i pri čemu je: (a) jedna aminokiselinska supstitucija u BC petlji u kojoj je (i) serin na položaju 3 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, F, I, V, W, i Y; (ii) histidin na položaju 6 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W, i Y; (iii) glutamin na položaju 7 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W, i Y; (iv) lizin na položaju 9 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, G, H, I, L, M, N, Q, R, S, V, W, i Y (v) alanin na položaju 10 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine G, L, M, i S; ili (vi) asparagin na položaju 11 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, H, Q, S, i Y; (b) jedna aminokiselinska supstitucija u DE petlji u kojoj je (valin na položaju 5 u DE petlji (SEQ ID NO: 39) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, E, I, L, M, Q, i T; ili (c) jedna aminokiselinska supstitucija u FG petlji u kojoj je (i) valin na položaju 2 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, I, L, i M; (ii) treonin na položaju 3 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, F, H, I, L, M, Q, R, S, V, W, i Y; (iii) asparginska kiselina na položaju 4 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisana aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, S, T, V, W, i Y; (iv) treonin na položaju 5 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, i Y; (v) glicin na položaju 6 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, D, E, F, H, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y; (vi) tirozin na položaju 7 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, F, I, L, M, P, T, V, i W; (xii) leucin na položaju 8 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, F, H, I, L, M, N, Q, R, T, V, W, i Y; (xiii) lizin na položaju 9 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, E, F, G, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, i Y; (ix) tirozin na položaju 10 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan sa W; ili (x) lizin na položaju 11 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, D, E, G, H, L, M, N, P, Q, R, S, T, i V.
  2. 2. Polipeptid prema zahtevu 1, pri čemu je (a) jedna aminokiselinska supstitucija u BC petlji i u kojoj je (i) serin na položaju 3 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine F, i W; (ii) histidin na položaju 6 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, F, G, I, K, L, M, N, R, S, T, V, W, i Y; (iii) glutamin na položaju 7 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, E, F, H, I, K, L, M, P, R, S, T, V, i Y; (iv) lizin na položaju 9 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, H, L, M, N, R, V, W, i Y; (v) alanin na položaju 10 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine G i L; (vi) asparagin na položaju 11 u BC petlji (SEQ ID NO: 34) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine H i Q; (b) jedna aminokiselinska supstitucija je u DE petlji u kojoj je (vii) valin na položaju 5 u DE petlji (SEQ ID NO: 39) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, E, I, L, i M; ili (c) jedna aminokiselinska supstitucija je u FG petlji u kojoj je (i) valin na položaju 2 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan sa I; (ii) treonin na položaju 3 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine C, F, I, L, M, V, W, i Y; (iii) asparginska kiselina na položaju 4 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisana aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, E, F, G, H, I, L, M, N, Q, S, T, i V; (iv) treonin na položaju 5 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V, W, i Y; (v) glicin na položaju 6 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, S, T, i W; (vi) tirozin na položaju 7 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine F, I, V, i W; (vii) leucin na položaju 8 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine F, H, I, M, V, W, i Y; (viii) lizin na položaju 9 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, C, F, G, I, L, M, T, V, i W; (ix) tirozin na položaju 10 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan sa W; ili (x) lizin na položaju 11 u FG petlji (SEQ ID NO: 75) supstituisan aminokiselinom izabranom iz grupe koju čine A, G, K, M, P, Q, i R.
  3. 3. Polipeptid prema zahtevu 1 ili 2, u kojem<10>Fn3 domen dalje obuhvata N-terminalnu ekstenzionu sekvencu koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 307.
  4. 4. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-3, u kojem<10>Fn3 domen dalje obuhvata C-terminalnu ekstenzionu sekvencu koja obuhvata aminokiselinsku sekvencu EI.
  5. 5. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-4, u kojem polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu bilo kojoj od SEQ ID NO: 331, 273, 281 ili 118.
  6. 6. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-5, koji dalje obuhvata jednu ili više farmakokinetičkih (PK) grupa izabranih iz grupe koju čine polietilenglikol, sijalinska kiselina, Fc, Fc fragment, transferin, serumski albumin, vezujući protein serumskog albumina, i vezujući protein serumskog imunoglobulina.
  7. 7. Polipeptid prema zahtevu 6, u kojem su PK grupa i polipeptid povezani veznikom koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 181-187.
  8. 8. Polipeptid prema zahtevu 7, u kojem PK grupa predstavlja Fc.
  9. 9. Kompozicija koja obuhvata polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-8 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
  10. 10. Nukleinska kiselina koja kodira polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-5 i 7.
  11. 11. Ćelija koja obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 10.
  12. 12. Polipeptid prema bilo kom od zahteva 1-8 ili kompozicija prema zahtevu 9, za upotrebu u postupku lečenja mišićnog, neurološkog ili metaboličkog poremećaja povezanog sa gubitkom mišića i/ili mišićnom atrofijom, ili degenerativnog poremećaja kostiju.
  13. 13. Polipeptid ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 12, pri čemu subjekat ima mišićnu distrofiju.
  14. 14. Polipeptid ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 13, pri čemu subjekat ima Dišenovu mišićnu distrofiju.
  15. 15. Polipeptid ili kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 12-14, pri čemu se polipeptid sastoji od aminokiselinske sekvence od SEQ ID NO: 273.
RS20210753A 2012-09-13 2013-09-12 Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin RS62009B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261700697P 2012-09-13 2012-09-13
US201361780005P 2013-03-13 2013-03-13
EP19162848.6A EP3564258B1 (en) 2012-09-13 2013-09-12 Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62009B1 true RS62009B1 (sr) 2021-07-30

Family

ID=49253416

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210753A RS62009B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin
RS20240550A RS65556B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Proteini domena skele na bazi fibronektina koji vezuju miostatin
RS20190618A RS58801B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240550A RS65556B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Proteini domena skele na bazi fibronektina koji vezuju miostatin
RS20190618A RS58801B1 (sr) 2012-09-13 2013-09-12 Skafold domenski proteini na bazi fibronektina koji se vezuju za miostatin

Country Status (33)

Country Link
US (9) US8853154B2 (sr)
EP (4) EP3835310B1 (sr)
JP (2) JP6346895B2 (sr)
KR (3) KR102187714B1 (sr)
CN (2) CN104768969B (sr)
AU (2) AU2013315482B2 (sr)
BR (1) BR112015005466B1 (sr)
CA (1) CA2884730C (sr)
CL (1) CL2015000500A1 (sr)
DK (3) DK3835310T3 (sr)
EA (1) EA033536B1 (sr)
ES (3) ES2879387T3 (sr)
FI (1) FI3835310T3 (sr)
HR (3) HRP20190845T1 (sr)
HU (3) HUE043482T2 (sr)
IL (3) IL270110B (sr)
LT (3) LT3835310T (sr)
MX (2) MX390017B (sr)
MY (2) MY189682A (sr)
NZ (1) NZ628446A (sr)
PE (1) PE20150954A1 (sr)
PH (1) PH12015500397B1 (sr)
PL (3) PL3564258T3 (sr)
PT (3) PT3835310T (sr)
RS (3) RS62009B1 (sr)
SG (3) SG10201913685YA (sr)
SI (3) SI3835310T1 (sr)
SM (1) SMT202400214T1 (sr)
TN (1) TN2015000086A1 (sr)
TW (2) TWI633117B (sr)
UY (2) UY40128A (sr)
WO (1) WO2014043344A1 (sr)
ZA (1) ZA201501457B (sr)

Families Citing this family (73)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN2014DN10515A (sr) 2006-03-31 2015-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
MX336725B (es) 2007-09-26 2016-01-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos medinate la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
TWI700293B (zh) 2008-04-11 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 重複結合複數個抗原的抗體
ES2573108T3 (es) 2010-05-26 2016-06-06 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de armazón a base de fibronectina que tienen estabilidad mejorada
KR102568454B1 (ko) 2010-11-30 2023-08-18 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하는 항원 결합 분자
EP2697257B1 (en) 2011-04-13 2016-10-19 Bristol-Myers Squibb Company Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements
TWI855488B (zh) 2012-08-24 2024-09-11 日商中外製藥股份有限公司 FcγRIIb特異性Fc區域變異體
EP3597747B1 (en) 2012-08-24 2023-03-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Mouse fcgammarii-specific fc antibody
US8853154B2 (en) 2012-09-13 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
WO2014116981A1 (en) 2013-01-25 2014-07-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Follistatin in treating duchenne muscular dystrophy
US20150361159A1 (en) 2013-02-01 2015-12-17 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins
US10787498B2 (en) 2013-02-06 2020-09-29 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin type III domain proteins with enhanced solubility
EP3299378B1 (en) 2013-02-12 2019-07-31 Bristol-Myers Squibb Company High ph protein refolding methods
AU2014250434B2 (en) 2013-04-02 2019-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
SMT202100008T1 (it) 2013-05-06 2021-03-15 Scholar Rock Inc Composizioni e metodi per la modulazione di fattore di crescita
MX378753B (es) 2014-03-20 2025-03-10 Bristol Myers Squibb Co Dominios de fibronectina tipo iii que se unen a albúmina de suero.
CN115322253A (zh) 2014-03-20 2022-11-11 百时美施贵宝公司 稳定化的基于纤连蛋白的支架分子
WO2015161108A1 (en) * 2014-04-16 2015-10-22 The Scripps Research Institute Pparg modulators for treatment of osteoporosis
WO2016018917A2 (en) 2014-07-28 2016-02-04 The Regents Of The University Of Califoria Compositions and methods of making polymerized nucleic acids
US10980744B2 (en) 2014-08-08 2021-04-20 The Regents Of The University Of California High density peptide polymers
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
LT3221346T (lt) 2014-11-21 2020-11-10 Bristol-Myers Squibb Company Antikūnai, apimantys modifikuotas sunkiosios grandinės pastoviąsias sritis
HUE050596T2 (hu) 2014-11-21 2020-12-28 Bristol Myers Squibb Co Antitestek CD73 ellen és azok felhasználásai
ES2822990T3 (es) 2014-11-25 2021-05-05 Bristol Myers Squibb Co Novedosos polipéptidos de unión a PD-L1 para obtención de imágenes
EA034516B1 (ru) 2014-11-25 2020-02-14 Бристол-Маерс Сквибб Компани Способы и композиции для мечения радиоактивным изотопомf биологических препаратов
TWI656133B (zh) 2014-12-19 2019-04-11 日商中外製藥股份有限公司 抗肌抑素之抗體、含變異Ｆｃ區域之多胜肽及使用方法
AR103268A1 (es) 2014-12-23 2017-04-26 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra tigit
WO2016125495A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US10993993B2 (en) * 2015-05-28 2021-05-04 Immunoforge Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treating muscle atrophy or sarcopenia including glucagon-like peptide (GLP-1) or GLP-1 receptor agonist
UY36687A (es) 2015-05-29 2016-11-30 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Anticuerpos contra ox40 y sus usos
KR20180021833A (ko) 2015-06-29 2018-03-05 더 락커펠러 유니버시티 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체
WO2017040332A1 (en) * 2015-08-28 2017-03-09 University Of Massachusetts Quantifying net axonal transport in motor neuron pathologies
ES2809125T3 (es) * 2015-09-23 2021-03-03 Bristol Myers Squibb Co Moléculas de armazón a base de fibronectina de unión a glipicano-3
JP2018536404A (ja) 2015-11-09 2018-12-13 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｃｈｏ細胞において産生したポリペプチドの品質特性を操作する方法
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
IL295230A (en) 2016-03-04 2022-10-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
IL261602B2 (en) 2016-03-04 2024-06-01 Univ Rockefeller Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
RU2613420C1 (ru) * 2016-04-13 2017-03-16 Сергей Михайлович Юдин Рекомбинантный белок Мио-ГСД, способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы сельскохозяйственных животных, птицы и животных семейства псовых, а также способ использования препарата
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10513537B2 (en) 2016-05-11 2019-12-24 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation matrix
CN109311949B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 储存分离基质的方法
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
JP7031934B2 (ja) 2016-05-11 2022-03-08 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックス
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
WO2017194593A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix
KR102397783B1 (ko) 2016-06-01 2022-05-12 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Pd-l1 결합 폴리펩티드에 의한 pet 영상화
US10994033B2 (en) 2016-06-01 2021-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18F-radiolabeled biologics
JP2019528311A (ja) * 2016-08-03 2019-10-10 ネクストキュア インコーポレイテッド Ｌａｉｒシグナル伝達を調節するための組成物及び方法
CN109689099B (zh) 2016-08-05 2023-02-28 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
US12448411B2 (en) 2016-09-30 2025-10-21 Cytiva Bioprocess R&D Ab Separation method
CN110234334B (zh) * 2016-12-05 2024-02-06 大塚制药株式会社 肌肉萎缩抑制组合物
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
TWI897843B (zh) * 2017-05-03 2025-09-21 美商必治妥美雅史谷比公司 結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物
MX2019013132A (es) 2017-05-25 2020-01-27 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos que comprenden regiones constantes pesadas modificadas.
CN111788227B (zh) 2017-12-27 2025-02-25 百时美施贵宝公司 抗cd40抗体及其用途
MX2020005193A (es) 2018-01-25 2020-08-20 I Mab Biopharma Us Ltd Fusiones de anticuerpo anti-pd-l1 e il-7.
CN108593615A (zh) * 2018-05-02 2018-09-28 浠思（上海）生物技术有限公司 利用htrf一步法筛选pd1/pd-l1阻断剂的方法
JP7051656B2 (ja) 2018-09-28 2022-04-11 三菱重工コンプレッサ株式会社 タービンステータ、蒸気タービン、及び仕切板
MY205758A (en) 2018-11-16 2024-11-12 Bristol Myers Squibb Co Anti-nkg2a antibodies and uses thereof
US20220106400A1 (en) 2018-11-28 2022-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
US12516145B2 (en) 2019-09-30 2026-01-06 Northwestern University Bioactive peptide brush polymers via photoinduced reversible-deactivation radical polymerization
WO2021183428A1 (en) 2020-03-09 2021-09-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
US20230192867A1 (en) 2020-05-15 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
US11566346B2 (en) * 2020-06-25 2023-01-31 Philip David Rodley Protein scaffold
EP4247851A1 (en) * 2020-11-20 2023-09-27 Zoetis Services LLC Bovine antibody variants
CA3255225A1 (en) 2022-04-04 2023-10-12 The Regents Of The University Of California COMPOSITIONS AND METHODS OF GENETIC COMPLEMENTATION
WO2025177263A1 (en) 2024-02-25 2025-08-28 Biohaven Therapeutics Ltd. Myostatin-binding proteins
WO2025219859A1 (en) 2024-04-14 2025-10-23 Biohaven Therapeutics Ltd. Combination therapy to treat overweight, obesity, and related health conditions

Family Cites Families (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US5672502A (en) 1985-06-28 1997-09-30 Celltech Therapeutics Limited Animal cell culture
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
US5614492A (en) 1986-05-05 1997-03-25 The General Hospital Corporation Insulinotropic hormone GLP-1 (7-36) and uses thereof
US5514581A (en) 1986-11-04 1996-05-07 Protein Polymer Technologies, Inc. Functional recombinantly prepared synthetic protein polymer
US5641648A (en) 1986-11-04 1997-06-24 Protein Polymer Technologies, Inc. Methods for preparing synthetic repetitive DNA
US5770697A (en) 1986-11-04 1998-06-23 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
US5589173A (en) 1986-11-04 1996-12-31 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US6018030A (en) 1986-11-04 2000-01-25 Protein Polymer Technologies, Inc. Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
JP3051145B2 (ja) 1990-08-28 2000-06-12 住友製薬株式会社 新規なポリエチレングリコール誘導体修飾ペプチド
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5506134A (en) 1990-10-22 1996-04-09 Corvas International, Inc. Hypridoma and monoclonal antibody which inhibits blood coagulation tissue factor/factor VIIa complex
US5792742A (en) 1991-06-14 1998-08-11 New York University Fibrin-binding peptide fragments of fibronectin
WO2002081494A1 (en) 2001-03-26 2002-10-17 Sirna Therapeutics, Inc. Oligonucleotide mediated inhibition of hepatitis b virus and hepatitis c virus replication
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO1994017097A1 (en) 1993-01-19 1994-08-04 Regents Of The University Of Minnesota Synthetic fibronectin fragments as inhibitors of retroviral infections
US6673534B1 (en) 1995-10-26 2004-01-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods for detection of mutations in myostatin variants
ES2201076T3 (es) 1993-03-19 2004-03-16 The Johns Hopkins University School Of Medicine Factor-8 de diferenciacion del crecimiento.
US6465239B1 (en) 1993-03-19 2002-10-15 The John Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptides from aquatic species and non-human transgenic aquatic species
US6607884B1 (en) 1993-03-19 2003-08-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods of detecting growth differentiation factor-8
US7393682B1 (en) 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US20030074680A1 (en) 1993-03-19 2003-04-17 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US5994618A (en) 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
US7332575B2 (en) 1994-03-18 2008-02-19 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 nucleic acid and polypeptide from aquatic species, and transgenic aquatic species
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
ATE529509T1 (de) 1997-01-21 2011-11-15 Gen Hospital Corp Selektion von proteinen unter verwendung von rna- protein-fusionen
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
WO1998033887A1 (en) 1997-02-05 1998-08-06 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8
US7749498B2 (en) 1997-03-10 2010-07-06 Genentech, Inc. Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
WO1998056915A2 (en) 1997-06-12 1998-12-17 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
AU3463699A (en) 1998-04-03 1999-10-25 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
AU765214B2 (en) 1998-05-06 2003-09-11 Metamorphix International, Inc. Methods for treating diabetes by inhibiting gdf-8
US7115396B2 (en) 1998-12-10 2006-10-03 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
DK1137941T4 (da) 1998-12-10 2014-01-06 Brystol Myers Squibb Company Protein-scaffolds til antistof-mimetika og andre bindingsproteiner
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
JP2003528632A (ja) 2000-03-31 2003-09-30 インスティティ・パスツール 血管内皮成長因子（ｖｅｇｆ）−媒介性脈管形成を阻害するペプチド、該ペプチドをエンコードするポリヌクレオチド及びその使用方法
AU7786701A (en) 2000-07-11 2002-01-21 Res Corp Technologies Inc Artificial antibody polypeptides
JP2004526419A (ja) 2000-10-16 2004-09-02 フィロス インク． 抗体模倣物および他の結合タンパク質のためのタンパク質骨格
US7598352B2 (en) 2000-11-17 2009-10-06 University Of Rochester Method of identifying polypeptide monobodies which bind to target proteins and use thereof
EP1572718A4 (en) 2001-04-04 2006-03-15 Univ Rochester ALPHA NU BETA-3 INTEGRIN BINDING POLYPEPTIDE ANTIBODY AND THEIR USE
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
WO2003104418A2 (en) 2002-06-06 2003-12-18 Research Corporation Technologies, Inc. Reconstituted polypeptides
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US20070178082A1 (en) 2002-11-08 2007-08-02 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
US20080220049A1 (en) 2003-12-05 2008-09-11 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins
JP5006651B2 (ja) 2003-12-05 2012-08-22 ブリストル−マイヤーズ スクウィブ カンパニー ２型血管内皮増殖因子受容体の阻害剤
EP1729795B1 (en) 2004-02-09 2016-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20070178095A1 (en) 2004-03-23 2007-08-02 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
WO2005118646A2 (en) 2004-04-26 2005-12-15 Centocor, Inc. Epitope directed selection of antibodies to murine tissue factor
EP1804751A2 (en) 2004-10-04 2007-07-11 QLT USA, Inc. Ocular delivery of polymeric delivery formulations
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
BRPI0610248A2 (pt) 2005-04-25 2010-06-08 Pfizer anticorpos contra miostatina, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, linhas celulares que os produzem , moléculas de ácido nucleico codificantes dos mesmos bem como seus usos
EP1915397B1 (en) 2005-08-19 2015-01-14 Wyeth LLC Antagonist antibodies against gdf-8 and uses in treatment of als and other gdf-8-associated disorders
ES2533464T3 (es) 2005-10-06 2015-04-10 Eli Lilly And Company Anticuerpos anti-miostatina
UA92504C2 (en) 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
CA2632544C (en) 2005-12-06 2014-09-23 Amgen Inc. Use of myostatin antagonist for treating the effects of hypogonadism
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
UA98308C2 (en) 2006-09-05 2012-05-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin antibody
WO2008031098A1 (en) 2006-09-09 2008-03-13 The University Of Chicago Binary amino acid libraries for fibronectin type iii polypeptide monobodies
EP2121743B1 (en) 2006-11-22 2015-06-03 Bristol-Myers Squibb Company Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including igf-ir
ATE516814T1 (de) 2007-02-02 2011-08-15 Bristol Myers Squibb Co 10fn3 domain zur behandlung von krankheiten begleitet von unerwünschter angiogenese
JP5591691B2 (ja) 2007-05-22 2014-09-17 アムジエン・インコーポレーテツド 生物活性を有する融合タンパク質を作製するための組成物及び方法
EP2222846B1 (en) 2007-08-10 2017-05-03 Protelix, Inc. Universal fibronectin type iii binding-domain libraries
US8470966B2 (en) 2007-08-10 2013-06-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin type III binding-domain libraries
US8680019B2 (en) 2007-08-10 2014-03-25 Protelica, Inc. Universal fibronectin Type III binding-domain libraries
EP2197476A2 (en) 2007-08-20 2010-06-23 Bristol-Myers Squibb Company Use of vegfr-2 inhibitors for treating metastatic cancer
KR100857861B1 (ko) * 2007-10-15 2008-09-11 주식회사 바이오리더스 Ｍｙｏ－２ 펩타이드 중합체와 마이오스타틴의 융합단백질표면발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미생물
MX2010004374A (es) 2007-10-31 2010-04-30 Medimmune Llc Armazones proteinicos.
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
WO2009073115A1 (en) 2007-11-28 2009-06-11 Bristol-Myers Squibb Company Combination vegfr2 therapy with mtor inhibitors
CA2709994A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Non-antibody scaffold protein fusions phage display via fusion to pix of m13 phage
EA201000979A1 (ru) 2007-12-27 2011-02-28 Новартис Аг Улучшенные связывающие молекулы на основе фибронектина и их применение
EP2080812A1 (en) 2008-01-18 2009-07-22 Transmedi SA Compositions and methods of detecting post-stop peptides
KR20100128291A (ko) 2008-02-14 2010-12-07 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｅｇｆｒ에 결합하는 조작된 단백질을 기초로 하는 표적화된 치료제
CN102076713B (zh) 2008-05-02 2015-03-25 诺华股份有限公司 改进的基于纤连蛋白的结合分子及其用途
CN102099373A (zh) 2008-05-22 2011-06-15 百时美施贵宝公司 基于纤连蛋白的多价支架结构域蛋白
BRPI0919881B1 (pt) 2008-10-31 2021-09-08 Centocor Ortho Biotech Inc Proteína de arcabouço e seu método de geração, biblioteca e seu método de construção, molécula de ácido nucleico, vetor de ácido nucleico, célula hospedeira, composição, dispositivo médico e artigo de fabricação
US8415291B2 (en) 2008-10-31 2013-04-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-TNF alpha fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
US20110275535A1 (en) 2008-12-16 2011-11-10 Novartis Ag Yeast Display Systems
UY32341A (es) * 2008-12-19 2010-07-30 Glaxo Group Ltd Proteínas de unión antígeno novedosas
EP2396000A1 (en) 2009-02-11 2011-12-21 Bristol-Myers Squibb Company Combination vegfr2 therapy with temozolomide
BRPI1008532B1 (pt) 2009-02-12 2021-12-14 Janssen Biotech, Inc Arcabouço de proteína isolada, método para construção de uma biblioteca de arcabouço de proteína isolada, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de ácido nucleico isolado, célula hospedeira de bactéria ou fungo, composição, dispositivo médico e artigo de manufatura para uso farmacêutico ou de diagnóstico em seres humanos
US8067201B2 (en) 2009-04-17 2011-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Methods for protein refolding
US20120270797A1 (en) 2009-08-13 2012-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Engineered proteins including mutant fibronectin domains
EP3434769B1 (en) 2009-10-30 2020-11-25 Novartis AG Universal fibronectin type iii bottom-side binding domain libraries
WO2011051466A1 (en) 2009-11-02 2011-05-05 Novartis Ag Anti-idiotypic fibronectin-based binding molecules and uses thereof
US20110123545A1 (en) 2009-11-24 2011-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Combination of vegfr2 and igf1r inhibitors for the treatment of proliferative diseases
WO2011092233A1 (en) 2010-01-29 2011-08-04 Novartis Ag Yeast mating to produce high-affinity combinations of fibronectin-based binders
WO2011100700A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 University Of Rochester Antigenic mimics of discontinuous epitopes of pathogen recognized by broadly neutralizing antibodies
BR112012019881A2 (pt) 2010-02-18 2017-06-27 Bristol Myers Squibb Co proteínas de domínio estrutural baseadas na fibronectina que ligam-se à il-23
KR20130056871A (ko) * 2010-04-13 2013-05-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Ｐｃｓｋ９에 결합하는 피브로넥틴 기반 스캐폴드 도메인 단백질
ES2755398T3 (es) 2010-04-13 2020-04-22 Medimmune Llc Andamios multiméricos específicos de TRAIL R2
EP3103478B1 (en) 2010-04-30 2019-04-17 Janssen Biotech, Inc. Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
ES2573108T3 (es) 2010-05-26 2016-06-06 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de armazón a base de fibronectina que tienen estabilidad mejorada
CA2805862A1 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Novartis Ag Fibronectin cradle molecules and libraries thereof
SG187867A1 (en) 2010-08-16 2013-03-28 Amgen Inc Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
WO2012088006A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domain proteins that bind il-23
EP2697257B1 (en) 2011-04-13 2016-10-19 Bristol-Myers Squibb Company Fc fusion proteins comprising novel linkers or arrangements
EP2710382B1 (en) 2011-05-17 2017-10-18 Bristol-Myers Squibb Company Improved methods for the selection of binding proteins
US20140187488A1 (en) 2011-05-17 2014-07-03 Bristol-Myers Squibb Company Methods for maintaining pegylation of polypeptides
MX387605B (es) 2011-09-27 2025-03-18 Janssen Biotech Inc Supercontigos de proteina basados en repeticiones de fibronectina tipo iii con superficies de union alternativas
JP2015525230A (ja) 2012-06-11 2015-09-03 アムジエン・インコーポレーテツド デュアル受容体アンタゴニスト性抗原結合タンパク質およびその使用
CN104487453B (zh) 2012-06-15 2018-09-28 辉瑞公司 经改良的抗gdf-8的拮抗剂抗体及其用途
US8853154B2 (en) 2012-09-13 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
TWI897843B (zh) 2017-05-03 2025-09-21 美商必治妥美雅史谷比公司 結合至肌肉生長抑制素以纖維連接蛋白為主之支架結構域蛋白質的穩定調配物

Also Published As

Publication number Publication date
PH12015500397A1 (en) 2015-04-27
NZ800822A (en) 2025-02-28
MX2015002894A (es) 2015-06-03
AU2018201273A1 (en) 2018-03-15
CN108409856B (zh) 2022-03-04
HUE043482T2 (hu) 2019-08-28
HRP20240676T1 (hr) 2024-10-11
SG10201913685YA (en) 2020-03-30
US20150231211A1 (en) 2015-08-20
HRP20210990T1 (hr) 2021-09-17
PL3835310T3 (pl) 2024-06-03
JP2015530390A (ja) 2015-10-15
TN2015000086A1 (en) 2016-06-29
AU2013315482A1 (en) 2015-03-12
ES2879387T3 (es) 2021-11-22
IL270110B (en) 2022-08-01
IL237559B (en) 2019-10-31
US8853154B2 (en) 2014-10-07
EP2895503B1 (en) 2019-03-27
NZ628446A (en) 2017-06-30
PT3835310T (pt) 2024-05-20
SI3564258T1 (sl) 2021-07-30
MX390017B (es) 2025-03-11
PE20150954A1 (es) 2015-06-20
BR112015005466A2 (pt) 2017-08-08
PT3564258T (pt) 2021-06-30
BR112015005466B1 (pt) 2023-04-11
MY189682A (en) 2022-02-25
KR102751864B1 (ko) 2025-01-07
DK3564258T3 (da) 2021-06-21
CN108409856A (zh) 2018-08-17
LT2895503T (lt) 2019-07-25
JP6346895B2 (ja) 2018-06-20
JP6793680B2 (ja) 2020-12-02
PH12015500397B1 (en) 2021-02-19
AU2018201273B2 (en) 2020-04-09
EP3835310B1 (en) 2024-03-20
US11813315B2 (en) 2023-11-14
CA2884730A1 (en) 2014-03-20
TW201416376A (zh) 2014-05-01
PT2895503T (pt) 2019-06-03
HUE054699T2 (hu) 2021-09-28
IL294314B1 (en) 2026-02-01
EP2895503A1 (en) 2015-07-22
CL2015000500A1 (es) 2015-07-31
HUE067383T2 (hu) 2024-10-28
EA201590543A1 (ru) 2015-06-30
ES2984405T3 (es) 2024-10-29
MX366666B (es) 2019-07-19
DK2895503T3 (da) 2019-05-27
US8993265B2 (en) 2015-03-31
LT3835310T (lt) 2024-04-25
EP3835310A1 (en) 2021-06-16
EA033536B1 (ru) 2019-10-31
EP3564258B1 (en) 2021-04-28
TW201823269A (zh) 2018-07-01
DK3835310T3 (da) 2024-06-03
CN104768969B (zh) 2021-04-16
ZA201501457B (en) 2021-09-29
US20170354718A1 (en) 2017-12-14
WO2014043344A1 (en) 2014-03-20
US9662373B2 (en) 2017-05-30
US9493546B2 (en) 2016-11-15
US20240316161A1 (en) 2024-09-26
KR20200138435A (ko) 2020-12-09
SG11201501741YA (en) 2015-04-29
UY40128A (es) 2023-04-28
SMT202400214T1 (it) 2024-07-09
US20140107020A1 (en) 2014-04-17
US20140309163A1 (en) 2014-10-16
AU2013315482B2 (en) 2018-03-15
HRP20190845T1 (hr) 2019-08-09
US8933199B2 (en) 2015-01-13
IL237559A0 (en) 2015-04-30
US20150072919A1 (en) 2015-03-12
SI2895503T1 (sl) 2019-08-30
KR20220107082A (ko) 2022-08-01
TWI694085B (zh) 2020-05-21
KR102424590B1 (ko) 2022-07-27
CA2884730C (en) 2023-07-04
UY35027A (es) 2014-03-31
SG10201701970TA (en) 2017-05-30
PL3564258T3 (pl) 2021-10-25
RS58801B1 (sr) 2019-07-31
PL2895503T3 (pl) 2019-09-30
US20140105896A1 (en) 2014-04-17
FI3835310T3 (fi) 2024-05-31
CN104768969A (zh) 2015-07-08
KR20150054938A (ko) 2015-05-20
RS65556B1 (sr) 2024-06-28
US10245302B2 (en) 2019-04-02
ES2727453T3 (es) 2019-10-16
EP4397675A3 (en) 2024-10-16
EP3564258A1 (en) 2019-11-06
MX2019008391A (es) 2019-09-09
JP2018183138A (ja) 2018-11-22
US10406212B2 (en) 2019-09-10
US20170088602A1 (en) 2017-03-30
IL294314A (en) 2022-08-01
TWI633117B (zh) 2018-08-21
MY172863A (en) 2019-12-13
EP4397675A2 (en) 2024-07-10
IL270110A (sr) 2019-12-31
US20190307855A1 (en) 2019-10-10
KR102187714B1 (ko) 2020-12-07
SI3835310T1 (sl) 2024-07-31
LT3564258T (lt) 2021-08-25
HK1212717A1 (en) 2016-06-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240316161A1 (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
HK40107892A (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
HK40055226B (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
HK40055226A (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
HK1212717B (en) Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
EA042548B1 (ru) Основанные на фибронектине каркасные доменные белки, которые связываются с миостатином