SE456741B - Saett att framstaella human-specifikt typ ii-interferon - Google Patents

Description

lO 15 20 25 30 35 456 741 2 Föreliggande uppfinnare har undersökt förfaranden som lätt skulle kunna användas för kommersiell produktion av human-specifikt typ ll-interferon och har studerat möjligheterna för detta interferon som terapeutiskt och profylak- tiskt medel. Dessa undersökningar har resulterat i upptäckten, att man inte kan uppnå någon stor mängd typ II-interferon med hög titer genom att överföra och föröka etablerade typ ll-interferonproducerande humana celler i ett odlings- medium in vitro men att däremot detta lätt kan uppnås genom att transplantera cellerna till ett icke-humant varmblodigt djur och utfodra djuret för att tillåta de humana cellerna att utnyttja djurets näringskroppsvätska för sin förökning enligt det förfarande som beskrivs i stamansökningen 8000213-9, eller genom att, i enlighet med föreliggande uppfinning, suspendera de humana cellerna i en diffusionskammare av konventionell typ, inkorporera eller placera kammaren i eller på ett icke-humant varmblodigt djur på ett sådant sätt att djurets näringskroppsvätska tillförs till de humana cellerna inuti kammaren och utfodra djuret för att tillåta de humana cellerna att utnyttja näringskroppsvätskan för sin förökning. Det har visat sig att det vid detta förfarande utvunna typ II- interferonet är ett utmärkt terapeutiskt och profylaktiskt medel för typ II- interferon-känsliga sjukdomar.

Särskilt avser föreliggande uppfinning ett sätt att framställa human- specifikt typ ll-interferon, som består i att man suspenderar en human cellinje kapabel att producera human-specifikt typ lI-interferon i en diffusionskammare av konventionell typ med en filteranordning, i vilken näringskroppsvätskan från ett icke-humant varmblodigt djur tillförs till den humana cellinjen, inkorporerar eller placerar diffusionskammaren i eller på ett icke-humant varmblodigt djur pä sådant sätt att djurets näringskroppsvätska tillförs till den humana cellinjen i diffusionskammaren, utfodrar djuret för att tillåta den humana cellinjen att utnyttja näringskroppsvätskan för sin förökning, utsätter de förökade humana cellerna för en typ ll-interferon-inducerare in vivo eller in vitro för att inducera produktion av human-specifikt typ II-interferon, och uppsamlar och renar det resulterande human-specifika typ II-interferonet på konventionellt sätt.

Eftersom vid sättet enligt uppfinningen en livskraftig human cellinje lätt kan förökas under utnyttjande av den näringskroppsvätska som tillförs från kroppen av ett icke-humant varmblodigt djur, kräver sättet inget eller mycket mindre näringsmedium kompletterat med dyrbart serum, och upprätthàllandet och regleringen av betingelserna under förökningen av de etablerade humana cellerna blir mycket lättare, jämfört med konventionella förfaranden, där en sådan human cellinje förökas på ett näringskulturmedium in vitro. Vidare har förfarandet enligt uppfinningen de ytterligare fördelarna, att förökningshastig- heten för de humana cellerna är högre och stabilare, och att aktiviteten för det ”tf-i 10 l5 20 25 30 35 40 3 456 741 inducerade typ Il-interferonet och dess utbyte per cell är mycket högre.

Humana cellinjer som kan användas vid uppfinningen är sådana som lätt förökas i diffusionskammaren under utnyttjande av den näringskroppsvätska som tillförs från ett icke-humant varmblodigt djur. Speciellt föredras humana lymfoblastoidcellinjer. Exempel på sådana cellinjer är HPB-ALL, MOLT-3, PIZ/lchikawa, HPB-MLT, PX/Seki, JBL, l-lCL och PIO/Shibata, beskrivna i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", vol. 23, nr. 6, sid. 697-711 (1978), Namalva, beskriven i "Journal of Clinical Endocrinology", vol. l, sid. ll6-l17 (1975), och BALL-l, TALL-l och NALL-d, beskrivna i I. Myoshi, "Nature", vol. 267, sid. M3- 844 (1977). Av de ovannämnda cellinjerna finns t.ex. MOLT-B, PlZ/lchikawa, P8 Seki och P10/Shibata tillgängliga från Dept. of Int., The National Cancer Center, Tsukiji S-l-l, Chuo-ku, Tokyo-mil, och HCl finns tillgänglig från Dept. of Microbiol., Kumamoto Univ. Sch. of Med., Kumamoto-SGO. Dessa cellinjer kan användas var för sig eller i kombination. Humana leukocyter från färskt blod kan blandas med dessa cellinjer. Den inducerade typ ll-interferonaktiviteten kan ökas genom kombinerad användning med humana leukocyter, särskilt lymfocyter, som innehåller B-lymfocyter (B-celler) och/eller T-lymfocyter (T-celler).

Vid sättet enligt uppfinningen kan man använda vilket som helst icke- humant varmblodigt djur, så länge som dessa humana cellinjer kan förökas däri.

Exempel på sådana icke-humana varmblodiga djur är fåglar såsom kycklingar och duvor, och däggdjur såsom hundar, katter, apor, getter, grisar, nötkreatur, hästar, kaniner, marsvin, råttor, hamstrar, möss och nakna möss.

Den ovan angivna cellinjen kan lätt förökas genom att man suspenderar den i en diffusionskammare av konventionell typ, till vilken näringskroppsvätska från ett icke-humant varmblodigt djur tillförs till cellinjen, och inkorporerar kammaren, t.ex. intraperitonealt i djuret. De kammare som kan användas vid sättet enligt uppfinningen kan ha olika form och storlek, och förses med ett eller flera filterorgan, t.ex. membranfilter, ultrafilter eller hålfibrer, för att undvika utläckning av celler. Särskilt föredragna är diffusionskammare försedda med ett eller flera filterorgan med porstorlekar på ca 10-7 - 10-5 m.

Diffusionskammaren kan vara så utformad och placerad, t.ex. på djurkroppens yta, att djurets närande kroppsvätska kan cirkulera genom kamma- ren, och celltillväxten i diffusionskammaren kan observeras genom ett genom- synligt sidofönster, som är utformat i kammarväggen. Diffusionskammaren kan även vara utformad och anordnad så att den sekventiellt kan utbytas mot en ny för att föröka de humana cellerna under djurets hela liv, utan att man i onödan behöver avliva djuret och även för att öka cellutbytet per djur.

På grund av avsaknaden av direkt kontakt med djurcellerna har sättet enligt uppfinningen den ytterligare fördelen att de förökade humana cellerna lätt kan insamlas samt att man kan använda olika icke-humana varmblodiga djur utan förbehandling för att nedsätta deras immunreaktion.

Enligt uppfinningen kan maximal cellförökning erhållas genom att man l0 15 20 25. 30 35 456 741 4 utfodrar djuret på sedvanligt sätt i ca en till tio veckor. Antalet förökade humana celler är ca 107 - 1012 eller mer per djur. I själva verket ökar de humana cellerna ca 10 - 106 gånger eller mer än vid ympning och förökning av humana celler i ett näringsodlingsmedium in vitro.

De på så sätt erhållna livskraftiga humana cellerna utsätts för inverkan av en typ Il-interferon-inducerare in vivo eller in vitro. De förökade humana cellerna kan utsättas för en typ Il-interferon-inducerare i diffusionskammaren, och det erhållna typ II-interferonet utvinns från kroppsvätskan, t.ex. ascites, följt av rening. Alternativt utvinns de förökade humana cellerna från diffusions- kammaren, suspenderas i ett näringskulturmedium, förvärmt till ca 20 - 40°C, för att ge en cellkoncentration på ca 105 - 108 celler per ml, och utsätts för en typ ll-interferon-inducerare in vitro. Det inducerade typ ll-interferonet utvinns från den resulterande kulturen, följt av rening.

Mängden inducerat typ ll-interferon kan ökas ytterligare genom kända metoder såsom genom ”priming” med användning av human-specifikt interferon och/eller superinduktionsmetoden med användning av en metabolisk inhibitor.

Utbytet av typ Il-interferon per djur kan förbättras genom följande metod eller metoder: 1) en metod, där de förökade humana cellerna sekventiellt utsätts för inverkan av en typ II-interferon-inducerare in vivo eller in vitro, och 2) en metod, där en diffusionskammare, som är inkorporerad i eller ansluten till djurkroppen, sekventiellt utbyts mot en ny.

Exempel på typ ll-interferon-inducerare är mitogener, såsom fyto- hemagglutinin, konkanavalin A, kermesbärsmitogen, lipopolysackarider, poly- sackarider, endotoxiner och bakterier. Ett antigen verkar som typ Il-interferon- inducerare på humana celler som sensibiliserats därmed. Dessa typ II-interferon- inducerare används vanligtvis i en koncentration på ca 0,001 pg - 10 mg per ml.

Kombinerad användning med en eller flera typ I-interferon-inducerare, t.ex. virus, nukleinsyror och polynukleotider, ökar utbytet av det inducerade typ ll- interferonet ytterligare, samt möjliggör samtidig inducering av typ l-interferon och typ Il-interferon.

Det sålunda erhållna inducerade typ lI-interferonet kan lätt renas och separeras genom konventionella renings- och separationsmetoder, t.ex. utsalt- ning, dialys, filtrering, centrifugering, koncentrering och/eller frystorkning. Om man önskar ett i högre grad renat typ II-interferon, kan typ ll-lnterferon med högsta renhet erhållas genom användning av dessa metoder i kombination med ett eller flera andra förfaranden, t.ex. adsorption och desorption med hjälp av jonbyte, gelfiltrering, affinitetskromatografi, fraktionering med hjälp av iso- elektrisk punkt och/eller elektrofores. p. 10 15 20 25 30 35 5 456 741 verkningarna av humanspecifika typ I- och typ II-interferoner bestämdes genom den konventionella plackreduktionsmetoden med användning av humana amnionceller, beskriven i "Protein, Nucleic Acid and Enzyme", vol. 20, nr. 6, sid. 616-643 (1975), utgiven av Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., Tokyo, Japan.

Hemagglutinationsenheten bestämdes enligt den metod som rapporterats av SLE. Salk, "Journal of lmmunology", vol. #9, sid. 87-98 (19%).

Uppfinningen belyses ytterligare med hjälp av de följande utförings- exemplen.

Exempel 1 En human cellinje, JBL, suspenderades med fysiologisk saltlösning i 10 milliliters cylindriska diffusionskammare av plast försedda med ett membran- filter med porstorleken 0,5 p, och diffusionskamrarna inkorporerades intraperito- nealt i olika vuxna råttor. Råttorna utfodrades på sedvanligt sätt i 4 veckor, varefter diffusionskamrarna avlägsnades. Cellkoncentrationen i diffusionskam- rarna var ca 5 x 109 celler per ml, vilket var ca 1000 gånger och mer högre än vad som uppnås med en in vitro-kultur med användning av en COz-inkubator.

Nyfödda hamstrar injicerades var för sig med ett antiserum framställt från kanin på sedvanligt sätt för reduktion av deras immunreaktion, trans- planterades subkutant med en human cellinje MOLT-B och utfodrades på sedvanligt sätt i 3 veckor. Efter utvinning från hamstrarnas kroppar transplante- rades de förökade MOLT-B-cellerna i 10 dagar gamla nakna möss. De nakna mössen utfodrades i ytterligare 5 veckor, och deras ascites utvanns under bedövning, följt av centrifugering.

Till suspensionen av de förökade JBL-cellerna sattes de förökade MOLT- B-cellerna i suspension för att ge en cellkoncentration på ca 20% (v/v), och blandningen tvättades med "Eagle's minimal essential medium" (pH 7,2) korn- pletterat med 596 (v/v) hurnanserum. Blandningen omsuspenderades vid 37°C i ett färskt medium med samma sammansättning, så att man fick en cellkoncentration på ca 5 x 106 celler. Till denna suspension sattes ett partiellt renat human- specifikt interferon i en dos av ca 100 enheter per ml, och blandningen inkuberades i ca 2 timmar vid denna temperatur. Därpå sattes fytohemagglutinin till blandningen i en mängd av ca 200 pg per ml, och blandningen inkuberades vid denna temperatur i ytterligare tre dagar för inducering av typ Il-interferon- produktion. Den erhållna kulturen centrifugerades vid ca 1000 g och 4°C för eliminering av fast substans, och supernatanten dialyserades i 24 timmar mot en fysiologisk saltlösning innehållande 0,01M fosfatbuffert (pH 7,2), renades, koncentrerades och frystorkades till ett pulver. Pulvrets typ Il-interferon- aktivitet var ca 4.000.000 enheter per råtta. 456 741 6 Exempel 2 Tabletter framställdes på konventionellt sätt genom tablettering av en blandning av ett typ II-interferonhaltigt pulver, framställt såsom beskrivs i Exempel l, stärkelse och maltos, så att man fick en typ II-interferonaktivitet på ca 1.000 enheter per tablett (ca 100 mg). 5 Tabletterna är lämpliga för behandling och förebyggande av virala sjukdomar, som förekommer i matsmältningssystemet.

Claims (11)

l0 15 20 25 30 7 456 741. PÅTENTKRAV

1. Sätt att framställa human-specifikt typ II-interferon, kännetecknat avattman: suspenderar en human cellinje kapabel att producera human-specifikt typ ll-interferon i en diffusionskammare av konventionell typ med en filteranordning, i vilken näring i kroppsvätska från ett icke-humant varmblodigt djur tillförs till den humana cellinjen, ' inkorporerar eller placerar diffusionskammaren i eller på ett icke- humant varmblodigt djur på sådant sätt att näring i kroppsvätska från djuret tillförs till den humana cellinjen i diffusionskammaren, utfodrar djuret för att tillåta den humana cellinjen att utnyttja näringen i kroppsvätskan för sin förökning, utsätter de förökade humana cellerna för en typ II-interferon-inducerare in vivo eller in vitro för att inducera produktion av human-specifikt typ Il- interferon, och ' uppsamlar och renar det resulterande human-specifika typ II-interferonet på konventionellt sätt.

2. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att den humana cellinjen är en human lymfoblastoid- linje.

3. Sätt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t av att den humana cellinjen är MOLT-3, PIZ/lchikawa,

4. P8/Seki, HCL, PIO/Shibata, Namalva, BALL-l, TALL-l, NALL-l eller JBL. ll. Sätt enligt något av patentkraven 1 till 3, k ä n n e t e c k n a t av att mer än ett slags humana cellinjer används.

5. Sätt enligt något av patentkraven l till ll, k ä n n e t e c k n a t av att det icke-humana varmblodiga djuret är en fågel eller ett däggdjur.

6. Sätt enligt något av patentkraven l till 5, k ä n n e t e c k n a t av att det icke-humana varmblodiga djuret är kyckling, duva, hund, katt, apa, gris, nötkreatur, häst, get, kanin, marsvin, råtta, hamster, mus eller naken mus.

7. Sätt enligt något av patentkraven l till 6, 10 456 741 * 8 k ä n n e t e c k n a t av att man använder en typ i-interíeron-inducerare och en typ II-interferon-inducerare i kombination.

8. Sätt enligt något av patentkraven l till 7, kännetecknat är 0,001 ng till 10 mg/ml. av att koncentrationen av typ Il-interferon-induceraren

9. Sätt enligt något av patentkraven 1 till 8, k ä n n e t e c k n a t av att de íörökade humana cellerna utsätts för typ ll- interferon-induceraren vid en temperatur av ca 20-40°C.

10. Sätt enligt något av patentkraven 1 till 9, k ä n n e t e c k n a t av att porstorleken hos filteranordningen ligger i inter- ~ Valle: m” m1 104 m.

11. ll. Sätt enligt något av patentkraven 1 till 10, k ä n n e t e c k n a t av att typ II-interferon-induceraren är ett mitogen.