UA44696C2 - Поліпептид, glp - 1-молекулярний комплекс на його основі, фармацевтична композиція (варіанти ) та спосіб одержання glp - 1-молекулярного комплексу - Google Patents

Abstract

Поліпептид, який застосовується для підвищення експресії інсуліну і GLP-молекулярний комплекс, що складається з катіона двохвалентного метала, асоційованого та здатного до сумісного осадження із зазначеним поліпептидом. Фармацевтичні композиції для лікування ювенільного цукрового діабету у ссавців, зокрема, у людини.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к области фармацевтической и органической химии, а, в частности, к 2 новім соєдинениям й фармацевтическим композициям, которьіе могут бьіть использованьі для увеличения зкспрессиий инсулина из островковьіїх В-клеток поджелудочной железьі млекопитающего и для лечения ювенильного сахарного диабета у млекопитающих.

Внутренняя секреция островков Лангерганса находится под комплексньім контролем, осуществляемьм не только посредством метаболитов крови /глюкозьі, аминокислот, катехоламинов, и т.п./, но и также посредством 710 локальной паракринной регуляции. Главнье гормоньй островков Лангерганса (глюкагон, инсулин, и соматотропин) взаймодействуют друг с другом в их специфических клетках (А-, В- и Ю-клетках, соответственно), модулируя секреторньійй ответ, опосредованньій вьішеуказанньми метаболитами. Хотя секреция инсулина регулируется, главньім образом, уровнями глюкозьі в крови, однако, глюкозо-опосредованная секреция инсулина ингибируется соматостатином. Кроме того, помимо предполагаемой межостровковой паракринной 19 регуляции секреции инсулина, имеются основания предположить о существованиий инсулинотропньїх факторов в кишечнике. Зто предположение бьіло сделано на оснований наблюдений, которье показали, что глюкоза введенная перорально, является более сильньім стимулятором секреции инсулина, чем то же самое количество глюкозьі, введенное внутривенно.

Гормон человека, глюкагон, продуцируемьй А-клетками поджелудочной железьі, представляет собой пептид, состоящий из 29 аминокислот. Зтот гормон принадлежит к мультигенному семейству структурно родственньїх пептидов, таких, как секретин; пептид, угнетающий секрецию желудка; вазоактивньй интестинальньй пептид; и оглицентин. Указаннье пептидь по-разному регулируют углеводньій обмен, гастроинтестинальную подвижность, и секреторное процессирование. Однако, главной из известньїх функций глюкагона поджелудочной железьі является стимулирование гликогенолиза и глюконеогенеза в печени, что с 29 приводит к повьішению уровней сахара в крови. С п зтой точки зрения, действие глюкагона является Го) противоположньім регулирующему действию инсулина, и стимулирует гипергликемию, являющуюся симптомом сахарного диабета ((І па, Р.К. и др., Ргос. Маї). Асад. Зсі. О.5.А., 79: 345-349, (1982).

Бьіло установлено, что глюкагон может связьїваться со специфическими рецепторами, расположенньіми на поверхности клеток, продуцирующих инсулин. Связьшаясь с зтими рецепторами, глюкагон стимулирует о бьістрьій синтез САМР зтими клетками. Бьіло также установлено, что САМР, в свою очередь, стимулирует Ф) зкспрессию инсулина (Оогтеп, І.М., и др., Оіаре(евз, 34: 717-722 (1985)), а инсулин способствует подавлению синтеза глюкагона |Сапопо, МУ.Р., Кеміеж ої Меадіса! РНузіоїсду, Гапде Рибіїсайоп, іо5 АПМов, Саїйогпіа, ке, р.273 (1979)). Таким образом, зкспрессия глюкагона строго регулируется инсулином, и в конечном счете чЕ уровнем глюкозь в сьіворотке.

Зо Первоначальная трансляция гена глюкагона происходит из предшественника, имеющего 360 пар оснований, т и в результате зтой трансляции синтезируется полипептид препроглюкагона (І па и др., Ргос. Маї). Асад.

Зсіи.5.А., 79: 345-349 (1982)). Затем, зтот полипептид подвергается посттрансляционному процессингу с образованием проглюкагона. После зтого, как бьіло показано РаїгейС. и др. Мпайшге, 282:260-266 (1979)|, « образовавшийся проглюкагон расщепляется на глюкагон и второй полипептид. В своих последующих работах З 70 Їцпа Р.К. и др., Горе І.С. М др., Ргос. Май. Асад. Зсі. О.5.А., 80: 5485-5489 (1983), и ВеїЇб.1. и др., с Майте 302: 716-718 (1983) продемонстрировали, что молекула проглюкагона расщепляется на участке, "з расположенном непосредственно после дипептидньїх остатков лизина-аргинина. Исследования проглюкагона, продуцируемого кошачьим сомиком (Ісіаішгиз рипсіайга) показали, что глюкагон, полученньїй от зтого животного, также бьл протеолитически отщеплен на участке, расположенном непосредственно после дипептидньх лизин-аргининовьїх остатков |АпагемезР.С. и др., Т.ВіоЇї.Спет., 260; 3910-5914 (1985), Іорег2.Сб. и др., т Ргос.МайН.Асай. Зсі. О.5.А., 80: 5485-5489 (1983))| Вей с... и др. (см. вьіше) обнаружили, что проглюкагон їх млекопитающего расщепляется у лизин-аргининовьіїх или аргинин-аргининовьїх дипептидов, и показали, что молекула проглюкагона состоит из трех дискретньїх и вьісокогомологичньїх пептидньїх молекул, которьім бьіли б дань следующие названия: глюкагон, глюкагоноподобньй пептид 1 (СІ Р-1) и глюкагоноподобньій пептид 2 (Се) 250 (СІ Р-2). На оснований зтого, І оре, и др. бьіл сделан вьівод, что глюкагоноподобньй пептид 1 имеет длину в 37 аминокислотньхх остатков, а глюкагоноподобньій пептид 2 имеет длину в 34 аминокислотньїх остатков.

Фо Аналогичнье исследования структурьі препроглюкагона крьіс вьіявили сходную картину протеолитического расщепления, происходящего на участкее между смежньми дипептидньмми лизин-аргининовьІми аргинин-аргининовьми остатками, и приводящего к образованию глюкагона, (І Р-1 и СІ Р-2 (Неїпгісно. еї аї., 99 Епдосгіпоії., 115: 2176-2181 (1984)) Бьіло установлено, что у человека, крьісь, бька и хомячка,

ГФ) последовательности СІ Р-1 являются идентичньіми (СпПідіопем., еї аї., Оіабейфіодіа, 27: 599-600 (1984)). т Вьівод относительно размера последовательности (Сі Р-1, вьісказанньій оре и др., бьіл подтвержден работой ОКепіпа!.О., и др. (9У.СіІпй. ЕпдосгіпоІЇ. Мегйарої., 61: 472-479, - ОКепійаІ! ГО. и др. исследовали молекулярнье формь! С Р-1, которне присутствуют в поджелудочной железе человека. Результать! зтого 60 исследования показали, что СІ Р-1 и СІ Р-2, присутствующие в поджелудочной железе, представляют собой пептидьї, состоящие, соответственно, из 37 и 34 аминокислот.

В более ранних исследованиях, исходя из аналогий между (СІ Р-1 и глюкагоном, бьло сделано предположение, что (| Р-1 также может обладать биологической активностью. М хотя некоторьми исследователями бьіло установлено, что СІ Р-1 индуцируется клетками головного мозга крьісь! с последующим бо синтезом сАМР КНоозеїп М.М., еї аїЇ., Рерз. Гей. 178; 83-86. (1984)), однако, другим исследователям не удалось вьіявить какую-либо физиологическую роль СІ Р-1 (Іорелі.С., ей аІ). Зта безуспешная попьітка идентифицировать какие-либо физиологические функции СІ Р-1 поставила исследователей перед решением важной задачи, а именно: является ли на самом деле СІ Р-1 гормоном, и имеется ли действительно родство между глюкагоном и СІ Р-1, либо предполагаемое родство является лишь артефактом.

Кроме того, бьіли также получень и исследовань! варианть! СІ Р-1 (7-37) и их аналоги. Такими вариантами и аналогами являются, например,СІп 9 -- СІ Р-1 (7-37), О-С1Іп? - СІ Р-1 (7-37), ацетил-І ув? - СІ Р-1 (7-37), Тиг!9 -

І ув'в.. СІ Р-1 (7-37), Іув'!8.. СІ Р-1 (7-37) и т.п., а также их производнье, включая, кислье аддитивнье соли, карбоксилатнье соли, низшие алкиловьіе сложнье зфирь, и амидь (см., например, УУО 91/11457). Известно, 70 что, в основном, вьішеуказаннье формь! стимулируют секрецию (инсулинотропное действие) и образование

САМР Ксм., например, Мо|зоху5., Іпї.). Рерііде Ргоївіп Кезеасі, 40, 333-343 (1992)|.

При зтом, важно отметить, что многими исследователями бьла проиллюстрирована связь между лабораторньми зкспериментами и инсулинотропньми ответами млекопитающих, в частности человека, на введение СІ Р-1, а конкретно СІ Р-1 (7-36) МНь и СІ Р-1 (7-37) |(см., например, МаискМ.А. еї аї., 75 Віарейфюіодіа, 36: 741-744 (1993); Сщцшіпіакм., еї аі. Мем Епдіапа 9. ої Меадісіпе , 326(20):1316-1322 (1992); манискм.А., еї аї., У,Сііп.Іпмеві., 91:301-307 (1993); и ТнпогепеВ., еї а!., Оіабеїйев, 42:1219-1225 (1993)).

В частности, бьіло показано, что главньми нарушениями, вьізьівающими гипергликемию при заболеваний ювенильньмм диабетом, являются уменьшение секреции зндогенного инсулина и резистентность к действию инсулина в мьішцах и печени |(СаїІомжау -.5., Оіаре(ез Саге, 13: 1209-1239 (1990)). Последнее из указанньх нарушений приводит к чрезмерному продуцированию глюкозьії в печени. Так, например, у здорового индивидуума, вьісвобождение глюкозь! происходит со скоростью примерно 2мг/кг/мин., тогда, как у пациентов с ювенильньїм диабетом, количество вьісвобождаемой глюкозь! обьічно превьішаєт 2,5мг/кг/мин., что приводит к избьіточному продуцированию глюкозьії, составляющему, по крайней мере, 70 грамм глюкозь! за 24 часа. Факт существования исключительно вьісокой степени корреляции между продуцированием глюкозь! в печени, с содержанием глюкозьі в крови натощак, и полньїм метаболическим контролем, как показали измерения о гликогемоглобина |((СаїІомжауу.А., см. вьіше; и СаїЇоулау)д.А. и др., СіІїп. Тпегар., 12: 460-472 (1990)), со всей очевидностью свидетельствует о том, что регулирование уровня глюкозьі в крови натощак является необходимьїм условием для достижения полной нормализации обмена веществ, которая является достаточной для предупреждения осложнений гипергликемии. Однако, если учитьівать тот факт, что существующие формь! (Се) инсулина редко нормализуют продуцирование глюкозьі в печени, не стимулируя, при зтом, значительной гиперинсулинемийи и гипогликемии (саїІомау.).А., и (заІоуауу.А. и др., см. вьіше), то необходимо разработать Ф другие альтернативнье способь! регулирования уровней глюкозь в крови. (Се)

Внутривеннье вливания (І Р-1 (7-36)МН 5 с продуцированием сьівороточньїх концентраций, вдвое превьиішающих нормальную концентрацию, показали результать!, представленнье в нижеприведенной таблице. ч « 22222200 ожельнне диву Падменти з ювенильном дияветом) тим 00001000 пониження « 00 одеркнивтюоранающко 111113 тонюкенноє 00111 Оодержанивтлюкатюнапослепривмалищий)! 77171711 пониженнову но) с . и? (1) сціліак М., и др., см. вьіше. (2) Оашск М.А. и др., Оіарею|одіа, см. вьіше. «їз» (3) ОгеКомсС. и др., ЮОіабей(ез,42: 658-661, (1993).

Однако, стабильность (з! Р-1, а в частности стабильность СІ Р-1 как компонента фармацевтической шк композиции, предназначенной для введения млекопитающим, не является достаточно долговременной. Й

Ге») действительно, при хранении при температуре 4"С, уже через 11 месяцев после получения образцов бьли обнаружень побочнье продуктьї (І Р-1 (7-37) (Моівом5., см. вьіше). Позтому совершенно очевидно, что о необходимо получить более стабильное соединение СІ Р-1, которое можно бьло бь без всякого риска вводить

Ф млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении.

Кроме того, биологическое время полужизни молекул СІ Р-1, а в частности, молекул, подвергающихся воздействию дипептидил-пептидазь ІМ (ОРР ІМ), является очень непродолжительньм. Например, биологическое время полужизни (С Р-1 (7-37) составляет лишь 3-5 минут, и кроме того, после его парентерального введения млекопитающему, он бьістро абсорбируются. Позтому, желательно также получить іФ) такое соединение СІ Р-1, абсорбция которого происходит через более длительньій промежуток времени после ко его введения млекопитающему.

В соответствии с вьішеуказанньм необходимо отметить, что настоящее изобретение позволяет разрешить бо проблемьї, связаннье с нестабильностью нативньїх молекул СІ Р-1, присутствующих в сьіворотке, а также с их непродолжительньм временем полужизни. Кроме того, соединения настоящего изобретения после их парентерального введения, обладают замедленной абсорбцией, а значит и более продолжительньм биологическим временем полужизни. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединения настоящего изобретения, а также к способам использования зтих б5 соединений.

Настоящее изобретение относится к комплексу, состоящему из катиона двухвалентного металла,

ассоциированного и способного к совместной преципитации с соединением формуль!:

Кк -Х-СІц-с1у-Тиг-РПе-Тиг-Зег-Азр-Ма!-Зег-зетг- Гуг-Г еш-у-О1у-с1Іп-Аа-Аїа-Ї уз-2-РНе-Пе-Аїа-Ттр-І еи-Ма!-Ї ув-С1у-Ага-К 2 где: Кі вьбирают из огруппьі, включающей в себя І-гистидин, О-гистидин, дезамино-гистидин, 2-амино-гистидин, р-гидрокси-гистидин, гомогистидин, альфа-фторометил-гистидин, и альфа-метил-гистидин,

Х вьібирают из группьї, включающей в себя Аа, Су, Маї, Тпг, Пе, и альфа-метил-Аїа;

ХМ внібирают из группьї, включающей в себя Си, Сп, Аа, ТНг, Зег, и Су; 7 внібирают из группьії, включающей в себя Си, (зп, Аа, ТНг, Зег, и Су; 70 ЕК» вьібирают из группьї, включающей в себя МН», и СІуУ-ОН, при условийи, что указанное соединение имеет изозлектрическую точку в диапазоне от около 6,0 до около 9,0, и при условии, что если К. является Нів, Х является Аа, У является Сім, а 7 является СМ, то Ко должен представлять собой МН».

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей соединение настоящего изобретения в комбинации с одним или несколькими фармацевтически пригмлемьми носителями, 7/5 разбавителями, или наполнителями.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу увеличения зкспрессии инсулина, заключающемуся в обеспечении островковьіїх В-клеток поджелудочной железьі зффективньїмм количеством соединения настоящего изобретения, а также к способу лечения ювенильного диабета, заключающемуся во введений млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, зффективного количества соединения настоящего Мзобретения.

В одном из вариантов своего осуществления, настоящее изобретение относится к комплексу, состоящему из молекуль! ЗІ /Р-1, имеющей изозлектрическую точку в диапазоне от около 6,0 до около 9,0, и из катиона двухвалентного металла.

Мспользуемьій в настоящем описаний отермин "молекула СІ Р-1" оотносится ко натуральньм с глюкагоноподобньмм пептидам 1 (СГ Р-1) (7-36) МНо и СГР-1 (7-37), к натуральньм или денатуральньм функциональньїми аналогам и производньїм зтих пептидов, и к их солям. Аминокислотная последовательность о пептида СІ Р-1 (7-36) МНо хорошо )известна специалистам, однако, для удобства читателя, зта последовательность приводится ниже:

Нів "-АІа-СІн-С1у19-Тпг-Рпе-Тнг-Зег-Авр 12-Ма!-Зег-Зег-Туг-І еи20-(3|Іц-С1у-сіІп-АІа-АЇІа25-І| ув-СІш-РНе-ІПе-Аїа 39 Ге) -Ттр-еи-Маї-І ув-СІу 35-Агд-МН». Ф

В случає СІ Р-1 (7-37), карбокси-концевая амидная функциональная группа Агу 39 заменена на Су в 37-положений молекуль! СІ Р-1 (7-36) МН». ре)

Кроме того, существование и получение многочисленньїх защищенньїх, незащищенньх и частично « защищенньїх натуральньїх и ненатуральньїх функциональньхх аналогов и производньїх молекул Сі Р-1 (7-36)

МН» и СІ Р-1 (7-37) раскриьіваются в литературе (см., например, патентьї США МоМо5120712 и 5118666, которне « вводятся в настоящее описание посредством ссьілки; и ОгеКкомС., и др., У.ВіоЇ.Спет., 264(22): 12826-12829 (1989), и МО 91/11457 (Вискіеу0р.І., и др., опубл. 8 авг. 1991)). Известно, что аминокислотнье остатки могут существовать в защищенной форме, в которой обе амино- и карбокси-группьь имеют соответствующие « защитнье группьі; в частично-защищенной группе, в которой либо амино-, либо карбокси-группа имеет соответствующую защитную группу; или в незащищенной форме, в которой ни амино-, ни карбокси-группа не в) с имеет соответствующей защитной группь. В литературе описано множество реакций, используемьх для "» образования и удаления защитньїх групп; см., например, такие работьі, как "Ргоїесіїме Сгоцрз іп Огдапіс " Спетівігу", Ріепит Ргезз (Гопдоп апа Мем МЖогК, 1973); ОСгеепТ.Н., "Ргоїесіїме ОСгоцрв іп Огдапіс Зупіпевів",

УМіеу (Нем/ ХогкК, 1981); 9 "Те Реріїідев", моіІ.1, Зепгодег 8. І црКе, Асадетіс Ргезз (І опдоп апа Оем/ МогК, 1965).

Характерньми аминозащитньми группами являются, например, формил, ацетил, изопропил, те бутоксикарбонил, флуоренилметоксикарбонил, карбобензилокси, и т.п. їх Характерньми карбоксизащитньми группами являются, например, бензиловьій сложньій зфир, метиловьй сложньй зфир, зтиловьій сложньй зфир, т-бутиловьій сложньій зфир, п-нитрофениловьй сложньй зфир, и т.п. іа Помимо защищенньх форм, в которьїх амино- и карбокси-группьі имеют соответствующие защитньсе группь,

Ге) 20 термин "защищенньй" также относится к таким молекулам 01 Р-1, в которьїх нейтрализуется или ингибируется активность дипептидил-пептидазьі ІМ |(см., например, МепіеїпкК., и др., Еиг.ОВіоспет., 214: 829-835 (1993)). щи Помимо СІ Р-1 (7-36) МН», предпочтительньмми являются молекуль, которне защищень от активности ОРР М, а более предпочтительньми являются Сіу 8 - (СІ Р-1(7-36) МН», МаїІ8-СІ Р-1(7-37)ОН, о-метил-Аїа8-СІ Р-1 дво (Т-З6)МНо й сіу8-віІп21-І Р-1 (7-37 )ОН.

Производньіми природньїх молекул СІ Р-1 являются такие пептидьі, которье могут бьіть полученьі путем (Ф) фрагментации нативной последовательности, или путем синтеза, проводимого на оснований имеющихся г данньх о природной аминокислотной последовательности из генетического материала (ДНК или РНК), кодирующего зту последовательность. Термин "производнье" также относится к химическим модификациям во натуральной или ненатуральной молекуль! СІ Р-1. Способь! получения таких производньїх хорошо известнь специалистам в области органической и пептидной химии (см., например, УУО 91/11457, см.вьіше).

К молекулам СІ Р-1 настоящего изобретения также относятся аналоги СІ Р-1 (7-36)МН » и СІ Р-1 (7-37), где одна или несколько аминокислот, не присутствующих в исходной последовательности, являются добавленньми; либо одна или несколько аминокислот являются делетированньми; а также производнье дь / Указанньх аналогов. В частности, в виішеуказанньїх молекулах, предпочтительно, если Ку представляет собой

Нів и дезамино-гистидин, при условийи, что изозлектрическая точка всей молекуль! находится в диапазоне от около 6 до 9. Кроме того, предпочтительно, если в положений "Х" присутствуют Аа, 5ІуУ и Маї, при условии, что изозлектрическая точка всей молекульй находится в диапазоне от около б до 9. Аналогичньм образом, предпочтительно, если в положение "У" присутствуют Сі и Сп, при условийи, что изозлектрическая точка всей Молекуль! находится в диапазоне от около б до 9. Также предпочтительно, если в положениий "7," присутствуют

Сім и Сп, при условийи, что изозлектрическая точка всей молекуль! находится в диапазоне от около 6 до 9. Й наконец, предпочтительно, если Ко представляет собой СІуУ-ОН, при условии, что изозлекстрическая точка всей молекуль! находится в диапазоне от около 6 до 9.

Кроме того, настоящее изобретение включаєт в себя солевье формь! молекуль! СІ Р-1. (ЗІ Р-1 молекуль! /о настоящего изобретения могут иметь достаточно кислотнье, достаточно основнье, или кислотнье и основнье функциональньсе группь/; и в соответствий с зтим, указанньіе молекуль! могут вступать в реакцию с любьми из соответствующих неорганических оснований, и неорганических и органических кислот с образованием соли. Для образования кисльїх аддитивньїх солей обьічно используют неорганические кислоть!І, такие, как соляная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, и т.п.; /5 М органические кислоть!, такие, как п-толуолсульфоновая кислота, метан-сульфоновая кислота, щавелевая кислота, п-бромофенилсульфоновая кислота, угольная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота, и т.п. Примерами таких солей могут служить сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, монобифосфат, дибифосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, иодид, ацетат, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формат, изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, бутин-1,4-дисоат, гексин-1,6-дисат, бензоат, хлоробензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фталат, сульфонат, ксилолсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, гаммагидроксибутират, гликолат, тартрат, метансульфонат, пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, манделат, и т.п. Предпочтительньми являются кислье аддитивнье соли, образованнье минеральньми с об кислотами, такими, как хлористоводородная и бромистоводородная кислота, а предпочтительно, о хлористоводородная кислота.

Основньїми аддитивньми солями являются соли, образованнье неорганическими основаниями, такими, как гидроксидьї, карбонать!, и бикарбонатьї аммония, щелочньїх металлов и щелочно-земельньїх металлов, и т.п.

Основаниями, которье могут бьіть использованьі для получения солей настоящего изобретения, являются «о зо гпидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, карбонат калия, и т.п. Соединения настоящего изобретения в виде соли являются особенно предпочтительньми. б»

Если соединения настоящего изобретения используются в фармакотерапевтических целях, то само собой «о разумеется, что зти соединения также могут бьть полученьії в виде соли, но зти соли должнь! бьть фармацевтически приемлемьми. -

Так, например, помимо вьішеуказанньїх СІ Р-1 молекул, настоящее изобретение также включает в себя «г молекуль! СІ Р-1, которне обладают функциональной инсулинотропной активностью. Термин "инсулинотропная активность" означает способность данного соединения стимулировать или индуцировать стимуляцию синтеза или зкспрессийи инсулина.

Инсулинотропнье свойства соединения могут бьіть определень! путем обработки клеток животного данньім « соединением, или путем иньецирования данного соединения животному с последующим наблюдением в с вьісвобождения иммунореактивного инсулина (ІК!) в среду или в систему кровообращения животного, соответственно. Присутствие ІКІ может бьть обнаружено с помощью радисиммуноанализа, позволяющего ;» осуществлять специфическую детекцию инсулина.

Хотя в целях настоящего изобретения может бьіть использован любой радисиммунньй анализ, способньй обнаруживать присутствие ІКІ, однако, предпочтительно использовать модификацию аналитического метода їх АїЇрапо, 9У.О.М. ей аї. КАсіа Епадостгіпої!., 70:487-509 (1972)! Зта модификацияПпредусматриваєт применение фосфатно-альбуминового буфера с рН 7,4. Среду для инкубации приготавливают путем последовательного ве добавления 500мкл фосфатного буфера, 5бОмкл перфузируемого образца или стандартную норму крьІсиного

Ге» инсулина в перфузате, 100мкл антиинсулиновой антисьіворотки (У/еПсоте Іарогайгіев; разведение 1:40000), и

Обмкл (1254)-инсулина; в результате чего получают полньій обьем 750мкл в стеклянной пробирке (10 х 75мм) і, для одноразового использования,. После инкубации в течение 2-3 дней при 4"С, свободньій инсулин отделяют

Ф от инсулина, связанного с антителом, методом разделения с использованием активированного угля.

Чувствительность анализа составляет 1-2МмкЕд/мл. Для оценки вьісвобождения ІКІ в культуральную среду клеток, виіращиваемьїх в тканевой культуре, предпочтительно вводить в проинсулин радиоактивную метку. В ЗТтИиХх целях может бьіть использована любая радисактивная метка, способная к мечению полипептида; однако, для получения меченного проинсулина предпочтительно использовать З д-лейцин. Мечение может бьть (Ф, осуществлено в течение любого периода времени, достаточного для образования обнаруживаемого меченного ка пула проинсулиновьіїх молекул; но, тем не менее, инкубирование клеток в присутствий радисоактивной метки предпочтительно проводить в течение 60 минут. 60 Для оценки инсулинотропньїх свойств соединения могут бьіть использованьї многие клеточнье линии, способнье зкспрессировать инсулин, однако, предпочтительно использовать клетки инсулиномь! крьсь, а особенно клетки инсулиномь! крьісь! КІМ-38. Зти клетки могут бьіть культивировань!ї в любой подходящей среде, но тем не менее, предпочтительной является ОМЕ -- среда, содержащая 0,1 75 ВЗА и 25мМм глюкозь.

Инсулинотропная способность соединения может бьіть также определена путем панкреатического вливания. в; по 8йи - вьделенную перфузируемую поджелудочную железу крьісьь получали в соответствий с модифицированньім методом Реппозв.).С. еї а). Оіаре(ез, 18:733-738 (1969). Бельїх криіс-самцов штамма Спагіев

Кімег, весом 350-600, и находящихся на голодной диете, анестезируют путем внутрибрюшинной иньекции амиталнатрия (Атуїа! бБодішт) (Еїї Шу 5 Со., 1бОнг/кг). Почки, надпочечник, желудок, и кровеноснье сосудь! нижней части толстой кишки лигируют. Весь кишечник удаляют за исключением примерно 4см двенадцатиперстной кишки, и нисходящей ободочной и прямой кишки. Позтому, лишь небольшая часть кишечника подвергается перфузии, что минимизирует возможное влияние кишечного материала на глюкагоноподобную реактивность. Перфузат представляет собой модифицированньй по способу

Кребсарингера бикарбонатньй буфер, содержащий 495 декстранаї70 и 0,276 альбуминабьчьей сьіворотки (фракция М), и барботированньій 9595 05 и 596 СО» При зтом используют 4-канальньй перистальтический /о насос, дающий непульсирующий поток (Виспіег роїузіайс ВиспіІег Іпвігитепів Оімівіоп, Мисіеаг-Спісадо Согр.), а переключение с одного источника перфузата на другой осуществляют с помощью трехходового запорного крана. Перфузию, слежение, и анализ осуществляют по методу УУеїго.С. еї аї., 9У.Сііп. Іпевіїдаї., 54: 1403-1412 (1974), которьій вводится в настоящее описание посредством ссьлки.

При зтом, необходимо, чтобь! СІ Р-1-молекульь настоящего изобретения имели в своем амино-конце 7/5 Пистидиновьіе функциональнье группь. (СГ Р-1-1-молекульь настоящего изобретения, могут также иметь модифицированнье гистидиновьіе функциональнье группь! вместо требуемьх гистидиновьїх функциональньх групп.

Термин "модифицированньій гистидин" относится к гистидиновой функциональной группе, которая бьла изменена химическим или биологическим способом, либо к уже измененной гистидиновой функциональной 20 Группе, которая бьіла синтезизована де помо, но которая, при зтом, сохранила свою способность связьваться с металлом.

Многие из таких модифицированньїх гистидиновьїх функциональньїх групп, а также способь! их получения являются известньми, например, О-гистидин (МО 91/11457), дезамино-гистидин (УУО 92/18531), 2-амино-гистидин (І еміпе-Ріпою Н., ег аї., Віоспет.Віорпуз.Кев.Соттип., 103(4):1121-1130 сч 25 (1981)), Д-гидрокси-І-гистидин МОма Т., еї аЇ., СНетівігу Іецегв рр. 1873-1874 (1988)), І-гомогистидин

МКАШтап .)., ек аїІ., Зупіпейс Соттип., 19 (11512):2069-2076 (19893), о-фторометил-гистидин (патент США і)

Мо4347374), и д-метилгистидин КО Ооппеї! М.)., Зупіпейс Соттип., 19(78):1157-1165 (1989).

Кроме того, необходимо, чтобь! СІ Р-1-молекуль! настоящего изобретения имели изозлектрическую точку в диапазоне от около 6,0 до около 9,00 о В литературе описаньй многие молекульй СЗІР-1, имеющие «( 30 изозлектрическую точку в указанном диапазоне, например: б

СІ Р-1 (7-36 )ЇМН» суб Р-1 (7-36 )МН» ісе) сіІп?-ОІ Р-1 (7-37) «т р-сіп?-І Р-1 (7-37) 35 о « ацетил -І ув7-О Р-1 (7-37)

ТАг9-вІ Р-1 (7-37 р-тиго-вІ Р-1 (7-37)

Авп?-ОІ Р-1 (7-37) « 40 О-Авп?-01 Р-1 (7-37) - с Зег2-Аго?З-Агд?7-1п26- (зі р-1 (7-37) "» Тиг16-| ув18-(5| Р-1 (7-37) " І ув 18-01 Р-1 (7-37)

Ага?23-1 Р-1 (7-37) їх Ага21-сІ Р-1 (7-37), и т.п. (например, УХО 91/11457, см. вьіше). Кроме того, если СІ Р-1 молекуль! настоящего изобретения вместо гистидиновьїх функциональньх групп имеют вьшеуказаннье модифицированнье пи гистидиновье функциональнье группьї, то их изозлектрическая точка должна находиться в вьішеуказанном

ФО диапазоне. Способь!ї вбічисления или зкспериментального определения изозлектрической точки других молекул

СІ Р-1 хорошо известнь!і специалистам. се) Способьії получения СІ Р-1 молекул настоящего изобретения также хорошо известньі любому специалисту в

Ф области пептидной химии.

В одном из таких способов, молекуль! СІ Р-1 получают в соответствии с хорошо известньмми процедурами твердофазного петидногр синтеза, описанного Мегтійе!й 9О.М., Спет. бос., 85:2149 (1962), и Бієежшай «5 Уоипа, зЗоїй Рпазе Реріїде БЗупіпезів, рр. 24-66, ГРгеетап (Сан-Франциско, 1969). Однако, отдельнье фрагменть проглюкагонового полипептида или СІ Р-1 (1-37) могут бьїть также полученьі путем фрагментации нативной (Ф. аминокислотной последовательности с использованием, например, протеолитического фермента. Кроме того, ко нужнье фрагменть! проглюкагонового пептида или СІ Р-1 (1-37) могут бьіть полученьї с использованием техники рекомбинантньїх ДНК, описанной МапіаїйізТ., еї аіІ, МоїІесшаг Віоіоду:-А Іарогаюгу Мапиаі СН (Соїй 5бргіпад во Нагбо, 1982),

Более того, пользуясь достижениями современной молекулярной биологии, каждьй специалист может использовать и другие средства для получения соединений настоящего изобретения. И хотя, как указьівалось вьше, для получения: соединений настоящего изобретения могут бьіть использовань! методь! твердофазного пептидного синтеза или рекомбинантнье методьі, однако, благодаря возможности получить более вьісокие 65 /ВНІХОДЬ, рекомбинантнье методь! могут оказаться предпочтительньми. Рекомбинантньійй метод продуцирования включает в себя следующие стадии:

а) вьіделение натуральной ДНК-последовательности, кодирующей (І Р-1-молекулу, или конструирование синтетической или полусинтетической ДНК-последовательности, кодирующей 01 Р-1 молекулу;

Б) введение кодирующей последовательности в зкспрессирующий вектор, подходящий для зкспрессий белков либо в изолированном виде, либо в виде гибридньх белков; с) трансформация соответствующей зукариотической или прокариотической хозяйской клетки с использованием зкспрессирующего вектора; а) культивирование трансформированной хозяйской клетки в условиях, благоприятствующих зкспрессийи молекуль! І Р-1; и 70 е) вніделение и очистка рекомбинантно продуцированной молекуль! 1 Р-1.

Как бьіло указано вьіше, кодирующие последовательности могут бьіть полностью синтезировань, либо, они могут бьть полученьй в результате модификации более крупной нативной глюкагон-кодирующей ДНК.

ДНК-последовательность, кодирующая препроглюкагон, приводится в работе І па и др. (ргос. Май). Асад. 5сі.

О.5.А., 79:345-349 (1982)), 6 может бьіть использована в качестве исходного материала в полусинтетическом 75 продуцирований соєдинений настоящего изобретения путем модификации нативной последовательности с получением нужньїх результатов.

Синтетические геньі, которье посредством іп мйго или іп мімо-транскрипции и трансляции продуцируют молекулу СІ Р-1 могут бьіть сконструированьії известньми способами. Каждому специалисту известно, что вследствие естественного вьірождения генетического кода, может бьіть сконструировано вполне определенное число ДНК-последовательностей, кодирующих молекуль! 1 Р-1.

Методика конструирования синтетического гена хорошо известна специалистам. См., например, Вгом/п и др. (1979) Меййодз іп Епгутоіоду, Асадетіс Ргезв, М.у., Мої. 68, рр. 109-151. ДНК-последовательности, кодирующие молекулу СІ Р-1, могут бьіть сконструированьі исходя из аминокислотньїх последовательностей, раскрьтьсх в настоящем описаний. После осуществления генетических построений, сама последовательность может бьть Га

Ггенерирована с использованием стандартной аппаратурьі для ссинтеза ДНК, например, такой, как

ДНЕК-синтезаторь! модели З8ОА или 3808 (РЕ-Арріїед Віозувіетв, Іпс., 850 І іпсоїп Сепіег Огіме, Ровіег СПУ, СА і) 94404).

Для осуществления зкспрессий молекуль! СІ Р-1, сконструированную синтетическую

ДНК-последовательность вставляют в один из многих зкспрессируюших векторов, подходящих для зкспрессии (Те) рекомбинантной ДНК, с использованием соответствующих рестриктирующих зндонуклеаз. См., например,

Мапіаїізз и др. (1989) МоіІесшціаг Сіопіпоу; А І арогаїогу Мапиаї, Сода Зргіпдоз Нагброг І арогаїогу Ргезв, М.Уу., Мої. 1-3. о

Райтьї рестрикции зндонуклеазьі конструируют на любом конце ДНК, кодирующей молекулу СІ Р-1, для (Се) облегчения ее вьіделения из известньїх амплифицирующих и зкспрессирующих векторов, и интеграции в зти векторь. Вьібор конкретньхх зндонуклеаз может бьть осуществлен исходя из рестрикционной карть З используемого исходного вектора зкспрессии, Рестрикционнье сайть! вьібирают так, чтобьї кодирующая «І последовательность бьіла правильно ориентирована по отношению к регуляторньім последовательностям для осуществления правильного считьшания с сохранением рамки и зкспрессии нужного белка. Кодирующая последовательность должна бьіть вставлена с сохранением рамки считьявания по отношению к промотору и « сайту связьівания с рибосомой зкспрессирующего вектора, которне являются функциональньми в хозяйской клетке, предназначенной для зкспрессии белка. - с Для зффективного осуществления транскрипции синтетического гена, зтот ген должен бьіть правильно ц присоединен к области промотора-оператора. Позтому, область промотора-оператора синтетического гена "» помещают в той же самой ориентации по отношению к инициирующему кодону АТО синтетического гена.

Для трансформации прокариотических и зукариотических клеток могут бьіть использованьі! различнье

Ззкспрессирующие векторьі, хорошо известнье специалистам. См., например, Те Рготеда Віоіодіса! Кезеагсі

Її Ргодисів Сафаюдне (1982) (Рготеда Согр., 2800 УУоосдз НоПом Коад, Мадізоп, М/І, 53711-5389); и Те 5ігаїадепе їз Сіопіпд бувіетвз Саїйаіодце (1992) (Бігаїадепе Согр., 11011 Мой Топеу Ріпез Коадй, а доМПа, СА, 92037).

Кроме того, в патенте США Мо4710473 описаньї трансформирующие кольцевье ДНК-плазмиднье векторьї,

Ге) используемье для зкспрессийи зкзогенньїх генов в Е.соїї с внісокими уровнями зкспрессии. Указаннье плазмидь! с 50 могут бьіть использовань! в качестве трансформирующих векторов при продуцированийи рекомбинантньїх ДНК, и (а) несут в себе способность к автономной репликации в клетке-хозяине; 42) (о) регулируют автономную репликацию плазмидь при температуре, при которой содержатся культурь клеток-хозяев; (с) обеспечивают сохранение плазмидь! в популяциях клеток-хозяев; (4) регулируют синтез белкового продукта, что свидетельствует о сохранений плазмидь в популяции клеток-хозяев; о (е) обеспечивают распознавание серией рестриктируюших зндонуклеаз сайтов, уникальньїх для данной ко плазмидьі; и () обеспечивают терминацию транскрипции мРНК. бо Указаннье кольцевье ДНК-плазмидьі могут бьіть использованьії в качестве векторов при продуцирований рекомбинантньїх ДНК для обеспечения вьісоких уровней зкспрессии зкзогенньх генов.

После того, как вектор для зкспрессии молекуль! СІ Р-1 будет сконструирован, его необходимо ввести в соответствующую клетку в целях создания рекомбинантной хозяйской клетки для зкспрессии полипептида.

Техника трансформации клетки с использованием рекомбинантньх ДНК-векторов хорошо известна 65 специалистам, и описана в таких фундаментальньх работах, как Мапіаїйз и др. (см. вьіше). Клетки-хозяева могут бьіть сконструировань из зукариотических или прокариотических клеток.

В основном, прокариотические клетки-хозяева продуцируют более вьісокие уровни белка, и легче поддаются культивированию. Белки, продуцируемье в бактериальньїх системах с вьісоким уровнем зкспрессии, обьічно представляют собой агрегать типа гранул или тел включения, которье содержат вьісокие уровни сверхпродуцированного белка. Указанньюе белковье агрегатьї, как правило, должнь! бьіть солюбилизировань, денатурировань и подвергнуть! повторной укладке с использованием известной техники. См., например, Ктгецйдег еї аї., (1990), "Ргоїеіп Роїдіпд" Сіегазсп 5 Кіпо, еав., рр.136-142, Атегісап Авзосіайоп їог (Ше Адмуапсетепі ої

Зсіепсе Рибіїсайоп Мо 89-185, Ууазпіпдюп, О.С., и патент США Мо4923967.

После получения нужной молекуль! І Р-1, имеющей изозлектрическую точку в пределах от около 6,0 до 7/0 около 9,0, изготавливают комплексь! настоящего изобретения, содержащие указанную СІ /Р-1 молекулу и катион двухвалентного металла, с использованием хорошо известной методики комплексообразования. Примерами указанньїх катионов двухвалентного металла могут служить 7п77, Ми", Бе?7?7, Со?7", са, Мі?" и т.п. Из зтих металлов предпочтительнь!м является 7п"7.

Обьічно, нужную СІ Р-1-молекулу, имеющую требуемую изозлектрическую точку, обьеединяют со смесью 75 соответствующего буфера и соответствующей формой катиона металла.

Подходящими для зтой цели являются такие буферь, которніе способньії поддерживать рН смеси в пределах от около 6,0 до около 9,0, и которье, кроме того, не оказьвают неблагоприятного действия на реакцию.

Предпочтительньіми являются буферь Гуда, в частности НЕРЕ5, а также Трис- и Трис-ацетатньіїй буферні.

Подходящими формами катионов металлов являются любье формь! катиона двухвалентного металла, которне способньі образовьивать комплексьі с СІ Р-1-молекулой настоящего изобретения. Для зтих Ццелей, предпочтительной использовать избьточное количество катионной соли двухвалентного металла, такой, как хлорид цинка, в молярном соотношении, составляющем примерно до 50 молекул катиона двухвалентного металла на каждую молекулу СІ Р-1-субстрата.

Температура, используемая на зтой стадии, должна бьіть достаточной для полного завершения реакции. с

Обьічно, такую реакцию проводят при комнатной температуре. о

Продукт, полученньй в результате зтой реакции, и представляющий собой кристаллическую или аморфную суспензию, вьіделяют и очищают с использованием стандартной техники.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение настоящего изобретения в комбинации с фармацевтически приемлемьм носителем, разбавителем, или (Се) наполнителем. Такие фармацевтические композиции могут бьїть полученьй в соответствии со стандартной техникой, обвічно используемой в фармацевтической практике, и введень! пациенту либо отдельно, либо в Ф сочетаний с о другими терапевтическими средствами, предпочтительно парентерально. Особенно «(о предпочтительньі!м является внутримьішечное и подкожное введение.

Суточная парентеральная доза, предпочтительно, разовая суточная доза составляет от около 1пг/кг до ч около 1000мкг/кг веса тела, хотя могут бьіть также использованьії меньшие или более вьісокие дозьі. Требуемая Й доза зависит от тяжести состояния пациента, а также от таких факторов, как рост пациента, его вес, пол, возраст, и история болезни.

При изготовлений композиций настоящего изобретения, активньій ингредиент, содержащий, по крайней « мере, одно соединение настоящего изобретения, обьічно смешивают с наполнителем, или разводят наполнителем. Если наполнитель используют в качестве разбавителя, то зтот наполнитель может бьть - с твердьм, полутвердьм или жидким материалом, действующим как растворитель, носитель, или среда для а активного ингредиента. ,» При изготовлений композиции, может оказаться необходимьмм измельчить активное соединение в целях получения нужньїх размеров частиц перед смешиванием зтого соединения с другими ингредиентами. Если активное соединение является, в основном, нерастворимь!/м, то обьічно, его измельчают до образования частиц т. размером приблизительно менее, чем 20Омеш. Если активное соединение является, в основном, їз водорастворимьм, то зто соединение размальшают с получением размеров частиц, имеющих однородньй гранулометрический состав в данной композиции, и составляющих, например, около 4Омеш. (22) Примерами подходящих наполнителей являются лактоза, декстроза, сахароза, трегалоза, сорбит и маннит. с 50 Композиции настоящего изобретения могут бьіть изготовлень! в виде препаратов с бьістрьім, замедленньі!м или пролонгированньм вьісвобождением активного ингредиента после введения зтих препаратов пациенту, и 4) способь! изготовления таких композиций хорошо известнь! специалистам.

Предпочтительно, если композиции настоящего изобретения изготавливают в виде разовой унифицированной лекарственной формьі, которая обьічно содержит от около 50Омкг до около 10Омг, а, в основноМм, от около мг до около 1Омг активного ингредиента. Термин "разовая унифицированная лекарственная форма" относится к физически дискретньм единичньмм формам, используемьм в качестве о разовьїх лекарственньїх доз для введения человеку и другим млекопитающим; причем, каждая из указанньїх іме) единичньїх лекарственньїх форм содержит заранее определенное количество активного ингредиента, достаточное для продуцирования нужного терапевтического зффекта, в сочетаний с подходящим 60 фармацевтическим наполнителем.

Композиции, предназначеннье для парентерального введения, и содержащие соединение настоящего изобретения, предпочтительно смешивают с дистиллированной водой, а рН доводят до значения, составляющего от около 6,0 до около 9,0.

Для регулирования продолжительности вьісвобождения, могут бьіть использовань! дополнительнье методь! 65 фармацевтической практики. Препаратьі с регулируемьм вьісвобождением могут бьть получень! с использований полимеров для образования комплексов с соединениями настоящего изобретения или для абсорбции соединений настоящего изобретения. Регулируемая доставка активного ингредиента к нужньм органам или тканям может бьіть обеспечена посредством вьібора соответствующих макромолекул (например, сложньїх полизфиров, полиаминокислот, поливинилпирролидона, зтиленвинилацетата, метилцеллюлозь,

Ккарбоксиметилцеллюлозьі, и протаминсульфата); концентрации зтих макромолекул, а таюке методов включения.

Другим возможньм методом получения препаратов с пролонгированньм вьісвобождением является введение соединения настоящего изобретения в полимернье частиць! таких материалов, как сложнье полизфирьі, полиаминокислоть!, гидрогели, сополимерьі поли молочной кислоть) и сополимерь! зтилена и 7/0 Винилацетата.

Альтернативно, вместо введения в указанньіе полимернье частицьі, соединения настоящего изобретения могут бьіть введень в микрокапсульі, полученнье, например, с использованием техники коасервации или межфазной полимеризации, а именно, в гидроксиметилцеллюлознье или желатиновье капсульї, соответственно; либо соединения настоящего изобретения могут бьіть, введень! в виде коллоидальньїх систем /5 доставки лекарственного средства, например, таких, как липосомь, альбуминовье микросферьі, микрозмульсиий, наночастицьі, и нанокапсуль; или в виде макрозмульсий. Техника изготовления таких препаратов описана в Кетіпдіоп'є Ріпагтасеціїса!| 5сіепсез (1980).

Соединения настоящего изобретения обладают инсулинотропной активностью. Позтому, в другом варианте своего осуществления, настоящее изобретение относится к способу увеличения зкспрессии инсулина, 2о Заключающемуся в том, что В-клетки панкреатических островков млекопитающего обрабатьвают зффективньм количеством соединения настоящего изобретения.

Аналогично, настоящее изобретение относится к способу лечения ювенильного сахарного диабета у млекопитающих, предпочтительно у человека, заключающемуся в том, что, млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении вводят зффективное количество соединения или композиции настоящего изобретения. сч

Ниже, в целях иллюстрации настоящего изобретения, приводятся соответствующие примерьі. Однако, зти примерь! не должнь! рассматриваться как некое ограничение обьема изобретения. і)

Пример 1

Отдельнье аликвотьі 5 различньїх СІ Р-1-молекул получали хорошо известньмм способом твердофазного пептидного синтеза, а затем лиофилизовали в небольших сосудах. К зтим аликвотам добавляли части 0,1 М Ге зо НЕРЕЗ-буферов (М-2-гидроксизтилпиперазин-М-2-зтансульфоновая кислота) /рН 7,4/, содержащие различнье количества хлорида цинка, с получением концентрации белка около 0,1мг/мл. Полученнье образцьі смешивали б» и хранили при комнатной температуре (2272) в течение приблизительно 18 часов. Затем смеси Ге центрифугировали (Різпег Моде! 235 С тісго-сепігіїциде) в течение 5 минут. Прозрачнье супернатанть пипетировали из пробирок. Содержание белка в супернатантах оценивали путем измерения их оптической -

Зв плОотТНОосТИ при 280нм при помощи спектрофотометра при помощи спектрофотометра (сійога 260). «Е

Теоретическое значение оптической плотности при зтой длине волньї для 0,1мг/мл раствора СІ Р-1-молекул в 1см-кюветах составляет 0,207. Результать! зтого зксперимента представлень в таблице 1. 5

Табіе 1 з що с 280пт Арзограпсе з

Моя! 11111111 ме; сюіене 00000000 степу сувстя гч що рот ол; олвуолвз,олет,

Ф я.

Фо

Ф

Зтот пример проиллюстрировал, что для образования комплекса требуется лишь небольшое количество цинка, и что из указанньїх разведенньїх растворов осаждаєется значительная часть молекул СІ Р-1. іФ) Пример 2. ко 5мг ОСІ Р-1 (7-36) МН» полностью растворяли в 2,5мл О0,1М НЕРЕЗ - буфера /рН 74/, не содержащего цинка.

Затем бьістро добавляли еще 2,5мл 0,1М НЕРЕЗ - буфера /рН 7,4/, содержащего О,бМмМ хлорида цинка. В бо полученном образце, молярное отношение цинка к СІГР-1 /7-36/ МН » составляло приблизительно 1:11. После добавления, раствор сразу становился мутньім, и тотчас стал образовьіваться осадок. Смесь хранили при комнатной температуре /22"С/ в течение 18 часов.

Образовавшийся осадок прочно прикреплялся ко дну стеклянного сосуда. Супернатант полностью декантировали с помощью пипетки. Затем осадок целиком растворяли в 5,Омл 0,01н. соляной кислоть!. Для б5 супернатанта и для растворов вновь растворенного осадка определяли оптическую плотность при 280нм.

Содержание цинка в зтих растворах определяли с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии.

Результать зтого зксперимента представлень в таблице 2. ; 0 отчеаяплотость призво см копцентвация цичка лили я.

В зтом примере показано, что при добавлений цинк-содержащего НЕРЕЗ-раствора, из раствора осаждаєтся большая часть СІ Р-1 /7-36/ МН». Значение оптической плотности при 28Онм, равное 1,932, указьіваєт на то, что то концентрация СІ /Р-1 /7-36/ МН » во вновь растворенном преципитате составляет 0,93З3мг/мл или 283мМкКМ.

Концентрация цинка в зтом же самом растворе, составляющая 13,3 частей на миллион, зквивалентна концентрации цинка 203мкМ. Позтому, молярное отношение цинка к СІ Р-1 /7-36/ МН» в преципитате составляет

Claims (14)

0,717: 1. Формула винаходу

1. Полипептид формуль!:. Ку -Х-СІш-су-Тиг-РПе-Тиг-Зег-Авзр-Ма!І-Зег-Зетг- Туг-І еи-у- СІу-СІп-АІа-Аа-І уз-7-Р пе-Пе-Аіа-Ттр-ї еи-Уаї-і ув-С1у- Ага-К»о, где: Кі вьбран из о группьї, включающей в себя І-гистидин, О-гистидин, дезамино-гистидин, с 29 2-амино-гистидин, В -гидрокси-гистидин, гомогистидин, альфа-фторометил-гистидин и альфа-метил-гистидин; г) Х вьібран из группьії, включающей в себя Маї, ТНг, Пе и альфа-метил-Аїа; ХМ вьібран из группьї, включающей в себя Сім, Сп, Аа, ТАг, Зег и Су; 7 внібран из группьї, включающей в себя Си, Сп, Аа, ТАг, Зег и Су; (се) Е» вьібран из группьії, включающей в себя МН» и СІу-ОН, б» при условийи, что указанное соединение имеет изозлектрическую точку в диапазоне от около 6,0 до около

9,0. (Се)

2. Полипептид по п. 1, где Ку; вьібран из группьї, включающей в себя Нів и дезамино-гистидин. «

3. Полипептид по п. 1, где Х представляет собой Маї.

4. Полипептид по п. 1, где У вьібран из группьії, включающей в себя си и іп. «І

5. Полипептид по п. 1. где 7 вьібран из группьії, включающей в себя Сім и Сп.

6. Полипептид по п. 1, где: Ку представляет собой І -гистидин, « Х представляет собой Маї, У представляеєт собой СІи, - с 7 представляет собой СІМ, и а ЕК» представляет собой СІуУ-ОН. "»

7. Полипептид по п. 1, где: Ку: представляет собой І -гистидин, Х представляет собой Маї, ї У представляеєт собой Сіп, 7 представляет собой СІМ, и ї В ЕК» представляет собой СІуУ-ОН. (22)

8. Полипептид по любому из пп. 1-7, или его фармацевтически приемлемая соль, для использования при с 50 лечений диабета.

9. СІ Р-1-молекулярньй комплекс, состоящий из катиона двухвалентного металла, ассоциированного и 42) способного к совместному осаждению с полипептидом по любому из пп. 1-7.

10. Комплекс по п. 9, отличающийся тем, что указанньійй катион двухвалентного металла представляет собой цинк.

11. Комплекс по п. 9 или п. 10, или его фармацевтически приемлемая соль, для использования при лечений о диабета.

12. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента она содержит їмо) комплекс по п. 9 или п. 10, или его фармацевтически приемлемую соль, в сочетаний с одним или несколькими фармацевтически приемлемьми носителями, разбавителями или наполнителями. 60

13. Способ получения СІ Р-1-молекулярного комплекса по п. 9 или п. 10, включающий смешивание СІ Р-1-молекуль! с катионом двухвалентного металла.

14. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что в качестве активного ингредиента она содержит полипептид по любому из пп. 1-7, или его фармацевтически приемлемую соль, в сочетаний с одним или несколькими фармацевтически приемлемьми носителями, разбавителями или наполнителями. б5 Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2002, М З, 15.03.2002. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України.

с о (Се) Фо (Се) « « ші с ;»

щ» щ» (22) о 50 42)

Ф) іме) 60 б5