UA65542C2 - Спосіб пригнічення надлишкового продукування фактора некрозу пухлин альфа , спосіб полегшення шкідливих ефектів надлишкового продукування фактора некрозу пухлин альфа та спосіб лікування запального стану або захворювання, пов'язаного з фактором некрозу пухлин. - Google Patents

Abstract

Способи пригнічення надлишкового продукування фактора некрозу пухлин альфа, полегшення шкідливих ефектів надлишкового продукування фактора некрозу пухлин альфа у ссавців, а також лікування запального стану або захворювання, пов'язаного з фактором некрозу пухлин, передбачають введення терапевтично ефективної кількості сполуки А, похідного індолкарбазолу К-252а, представленого формулою:

Description

Изобретение относится к замещенньім в кольце производньім К-252а для использования в способах, направленньх на облегчениеє повреждающих воздействий различньїх заболеваний, расстройств и состояний. 1. Индолокарбазол К-252а

К-252а представляєт собой соединение, имеющее индолокарбазольньй скелет. |Японские публикации непрошедших зкспертизу патентньїх заявок Ме41489/85 (США Ме4555402)| со стереохимией, показанной в формуле І. н

М

(в)

М М

(в)

Нас, ); м " сбюсном

Ранее сообщалось, что К-252а является мощньім ингибитором протеинкиназьї С (РКС), играющей центральную роль в регуляции клеточньїх функций, и имеет различнье видь активности, такие как ингибирующее действиеє на сокращение гладкой мускулатурь! (Урп. У. Рпагтасої. 43 (зиррі.): 284, 1987), ингибирующее действиеєе на секрецию серотонина (Віоспет. Віорпуз. Нев5. Соттип., 144:35, 1987) ингибирующее действие на удлинение аксонов (нейронов) (У. Мецйгозсіепсе, 8:715, 1988), ингибирующее действие на вьісвобождение гистамина (АїПегду, 43:100, 1988), ингибирующее действие на МІ СК гладкой мускулатурь (9. Віої. Спет., 263:6215, 1988) противовоспалительное действие (Асіа РПпузіої. Нипд 80:423, 1992) и способность влиять на вьїживание клеток (у. Меигоспегаїзігу, 64:1502, 1995). Также в Ехрегітепіа!

Сеї! Незеагспі. 193:175-182, 1991 бьіло показано, что К-252а подавляеєт вьіработку интерлейкина 2.

Кроме того, сообщалось, что производньюе К-252а подавляют активность РКС, ингибируют секрецию гистамина (Японские публикации непрошедших озкспертизу патентньх заявок Мо295588/88|, имеют противоопухолевую активность |Японские публикации непрошедших зкспертизу патентньхх заявок

Ме168689/89 (США 4 877 776), МО 88/07045, (США 4 923 986), УУО94/04541, способньі увеличивать количество тромбоцитов (ММО 94/06799 (ЕР 630898 А)), имеют вазодепрессорную активность (Японские публикации непрошедших зкспертизу патентньїх заявок Ме120388/87/89|, способньі ускорять холинергические функции нейронов (МО 94/02483 (США 5461146 и США 5621100)) и оказьівать лечебньй зффект при раке предстательной железь! (МО 94/27982 (США 5 516 771)|. Отобраннье аминосодержащие тринденовье соединения бьли полученьй перегруппировкой Бекмана из соответствующих стауроспориновьїх оксимов (МО 97/05140).

Индолокарбазольй в целом липофильнь. Благодаря зтому свойству, индолокарбазоль! способнь! относительно легко, по сравнению с белками, проникать через биологические мембраньі. Также индолокарбазоль в целом имеют более длинньй, чем у белков, период полувьіведения іп мімо.

Кроме того, сам К-252а, различнье его производнье бьли синтезированьй и исследованьі на биологическую активность. Показано, что среди производньїх К-252а биологическую активность имеет соединение раскрьтое І ем/ї5 еї аі., в патентах США МоМо 5 461 146 и 5 621 100 и РСТ публикациий УМО 94/02488, и именуемое в них как «соединение 1І-51». Показано, что соединение 1І-51 усиливает функцию холинергических нейронов, стриарньїхх нейронов и сенсорньїх нейронов. 2. Нейродегенеративньсе заболевания и расстройства

Болезнь Паркинсона является нейродегенеративньм расстройством, при котором происходит прогрессирующая и избирательная потеря допаминергических нейронов нигро-стриарного пути (Адіа,

Гапсеї: 337:1991). Введение 1-метил-4-фенил-1,2,3,5-тетрагидропиридина (МРТР) мьшам приводит к дегенерации допаминергических нейронов, и служит в качестве зкспериментальной модели потери допаминергических нейронов и нарушений поведения, наблюдаеємьх при болезни Паркинсона.

Периферическое о применение МРТР приводит ок вьісокоизбирательной дегенерации системь! допаминергических нигро-стриарньїх нейронов у людей, обезьян и мьішей (Неїккіїа еї а!., 5сіепсе 224; 1451- 1453, 1984; Вигпз єї а)!., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 80:4546-4550, 1983).

Дегенерация нейронов, вьізванная МРТР на модели у мьішей, достаточно полно описана. Системное введение МРТР вьіїзьівает избирательную селективную потерю содержания допамина (и метаболитов), активности тирозингидроксилазьь и участков поглощения допамина в допаминергических нейронах полосатого тела мьіши (НеїкККіїа еї аї., Маїшге: 311:467-469, 1984а,0; Тірюп еї аї., У. Мешгоспет. 61:1191- 1206, 1993). Зтот зффект является дозо-зависимьмм. Максимальная потеря происходит между третьим и седьмьм днем после поражения (Часк5оп-Іемів еї аіІ., Мепгодедепегайоп 4:257-269, 1955). Органелль! допаминергических клеток черной субстанции менее чувствительнь! к токсическому действию МРТР, чем их соответствующие нервнье окончания. При вьісоких дозах МРТР или множественньїх иньекциях МРТР существенная потеря ТН-иммуноположительньїх клеток в черной субстанции, происходит в пределах 1 недели (Неїккіїа еї аї., Зсіепсе 224; 1451-1453, 1984; УЧасквоп-І емів еї аї., Мейгодедепегайоп 4:257-269, 1995). При более низких дозах МРТР или при однократной иньекции потеря черной субстанции тирозингидроксилаза-положительньх клеток происходит позднее (Тацоп еї аї., У. Мепгозсіепсе. Нез. 30:666- 672, 1991). Таким образом, при более низких дозах МРТР и коротком периоде после повреждения стриарное поражение может наблюдаться в отсутствие потери тирозингидроксилаза-положительньх клеток черной субстанции. Зта неиродегенеративная последовательность сходна с последовательностью, наблюдаємой при заболеваний. Модель является признанной и широко используемой моделью для изучения болезни Паркинсона с использованием МРТР у мьішей.

Нехолинергические нейроньї использующие в качестве нейротрансмиттера гамма аминомасляную кислоту (ГАМК) (так назьваемье ГАМК-ергические нейроньі) распространеньі по всему обьему мозга.

Например, они обнаружень! в крупноклеточном базальном узле у грьізунов (аналогичная область в мозге человека назьівается базальное ядро Мейнерта), область базального отдела переднего мозга, играющая важную роль для функций внимания и памяти. Повреждение ГАМК-ергических нейронов в базальном отделе переднего мозга также может вьзьшвать нарушение поведения при нейродегенеративньх заболеваниях, такие как болезнь Альцгеймера (ОеккКег еї аї!., Мейгозсі апа Віореп. Кем., 15:299-317, 1991;

СаПаднег еї аї., Зетіпагв іп Мейигозсієпсе 6:351-358, 1994, Тоїтез еї а)., Мепйгозсіепсе, 63:95-122, 1994).

Нейронь! в базальном отделе переднего мозга погибают при нескольких заболеваниях центральной нервной системьї, в частности, при болезни Альцгеймера. (Агепаї еї а!., Асіа Меигораїної. (Веп.) 61:101-108, 1983; Ігаїго7 еї аї., Меигозсіепсе, 43:33-40, 1991; Модеїв еї аї., Меигобіої. Адіпуд 11:3-13, 1990). Важньм фактором, влияющим на гибель таких нейронов, является связанная с перевозбуждением токсичность глутамата, т.е. гиперстимуляция нейронов избьтком глутамата (Спої, Мецгоп 1:623-634, 1988).

Соответственно в ряде зкспериментальньїх моделей болезни Альцгеймера, глутамат или его аналоги используются для моделирования зксцитотоксической гибели клеток в базальньїх отделах переднего мозга, где и происходит гибель нейронов, т.е. в крупноклеточном базальном узле (М/епКк, Веп. Вгаіп Кев., 72:17-24, 1996).

Сначала патология нейронов при болезни Альцгеймера рнаблюдаеєется в коре, и по мере прогрессирования заболевания потеря нейронов в зтой области становится вьіраженной (Вгаак еї аї!., Асіа

Мешгораїйпої, 82:239-259, 1991; Нутап еї аїЇ., Апп Меигої. 20:472-481, 1986). Нейроньй во 2-ом слое знторинальной корь! проецируются в зубчатую извилину гиппокампа, и зтот нейронньй путь играет важную роль в формирований памяти (І емізоппеї а!., Вгаїп Ке5. 564:230-244, 1991; Оіюп еї а!., Вгаіп. Нев. 139:295- 308, 1978; 5іемагї єї аї., Вгаіп. Не5. Вий., 2:41-48, 1977). Нейроньії во 2-ом слое знторинальной корь, подобно множеству других нейронов корьї головного мозга, используют глутамат в качестве нейротрансмиттера (Майзоп еї аїЇ., Меигоп 1:865-876, 1988; М/ніе еї аї., Машге 270:356-357, 1977). Таким образом, потеря глутаматергичєских нейронов в знторинальной коре влияєт на нарушения поведения, наблюдаемьсе при болезни Альцгеймера и других неврологических расстройствах. 3. Периферические невропатии.

Периферической невропатией обьчно именуют как расстройство, поражающее периферические нервьії, наиболее часто проявляющиеся как изолированноеє или комбинированное нарушение моторной, сенсорной, сенсорномоторной или автономной функций. Каждое из широкого разнообразия морфологии, проявляющееся при периферических невропатиях, может бьть удивительно связано с большим множеством причин. Например, периферические невропатийи могут бьіть приобретень! генетически, могут возникать в результате системньх заболеваний или могут бьть вьзвань токсическим агентом.

Нейротоксические воздействия могут оказьівать лекарственнье препарать, противоопухолевье средства, примеси в пищевьх продуктах или медикаментах, факторьй загрязнения окружающей средь и промьішленньсе загрязняющие факторь!.

В частности, известньь химиотерапевтические средства, являющиеся причиной сенсорньх и/или моторньїх невропатий, включая винкристин, противоопухолевое средство, используемое для лечения злокачественньїх гематологических заболеваний и сарком. Нейротоксичность зависит от дозь! и проявляеєется в виде сниженной моторики кишечника и периферической невропатии, в особенности, дистальньїх мьішуц кистей рук и стоп как постуральной гипотониий и атоний мочевого пузьіря. Сходнье нарушения бьіли отмеченьї при использований таксола и цисплатина (МоїІтап, 1990 Мем Епад. доцг. Мед.

З22:126-1267), хотя связанная с цисплатином неиротоксичность может бьїть облегчена фактором роста нервов (МИ) (Арієї єї аї., 1992, Аппаїє пепйгоісіоду 31:76-80). Хотя неиротоксичность иногда является обратимой после отмень нейротоксичного агента, восстановление может бьть очень медленньм процессом (Гедпа 1986, Медіса! ТохісоІоду 1:421-427; Оівеп єї аі!., 1991 Огид Заїєїу 6:302-314).

Существует ряд наследственньхх периферических невропатий, включая болезнь Рефсума, А- беталипопротеинемию, болезнь Танжера, болезнь Краббса, метахроматическую лейкодистрофию, болезнь

Фабри, синдром Дежерена-Соттаса и другие. Среди всех наследственньїх невропатий известньїх издавна наийболее частьм являєтся болезнь Шарко-Мари-Туса (для дополнительной информации по периферическим невропатиям см. также патент США Мо 5 420 112). 4. Цитокинь

Как известно, фактор некроза опухолей альфа(ТтМЕ-5х) и интерлейкин-1р (1/-13) являются полипептидами, вовлеченньїми в ряд воспалительньх и метаболических процессов іп мімо. Имформацию о роли ТМЕ-о в воспалительньїх заболеваниях, включая септический шок, см. также в Апп. Кеу. Ітиппої. 7:625(1980), и Сіїпіса! Та! г Тгеатепі ої Зервіз, Зірраїй М/.). апа Міпсепі 9.-І. (Едв), Зрііпдег-Мепад Вепіп

Неїдеїрегоу 1995. Принято считать, что избьточная или неадекватная вьіработка ТМЕ-о; ответственна за ряд патологических состояний, включая септический шок (Зроопег еї аїЇ., Сіїпісаї Іттипоюду апа

Іттипораїпоіоду 62:р. 5ІІ (1992) и различнье другие аллергические и воспалительнье состояния или заболевания, включая, но не ограничиваясь ревматоидньм артритом, остеоартритом, астмой, бронхитом, хроническим обструктивньм заболеванием дьхательньх путей, псориазом, аллергическим ринитом, дерматитом и воспалительньм заболеванием кишечника и другими аутоиммунньми заболеваниями (Іттипої. Вев. 10:122 (1991), Зсієпсе 229:896 (1985) апа Ргос. Маї|!. Асад. 5сі. 89:7375 (1992).

В целом, изобретение представляет способьі! облегчения вредньїх зффектов различньїх заболеваний, расстройств и состояний с помощью лечения нуждающегося в нем субьекта терапевтически зффективнь!м количеством соединения А.

Более конкретно изобретение представляет способ лечения вредньх зффектов заболеваний, расстройств и состояний, приводящих к смерти или являющихся ее причиной, либо приводящих к подавлению функций определенньх нейронов или являющихся его причиной с помощью усиления функции или вьїживания допаминергических, ГАМК-ергических или глутаматергических нейронов у млекопитающих, включающий озтап контактирования нейрона с соединением А. Обьічно млекопитающим, у которого обнаруживаєтся нейрон, является человек. Обьічно функция допаминергических, ГАМК-ергических или глутаматергических нейронов, контактировавших с соединением А, нарушена или им угрожаєт риск гибели из-за нейродегенеративного заболевания. Обьічно нейродегенеративнь!м заболеванием является болезнь Паркинсона или болезнь Альцгеймера.

Более конкретно изобретениеє также представляет способ уменьшения периферической невропатии, включающей введение млекопитающему количества соединения А, уменьшающего невропатию.

Хотя уже сообщалось, индолокарбазольное соединение К-252а снижаєт летальность в результате введения зндотоксина, зту способность связьівали со способностью К-252а ингибировать протеинкиназь, в особенности протеинкиназу С (Іпаба еї аї., Урп. 9. 5игд. 23-234 (1993). Неожиданно бьіло обнаружено, что соединение А, которое обладает небольшим ингибирующим действием на РКС или вообще его не имеет, проявляет удивительно вьісокую активность в качестве ингибитора вьіработки ТМЕ-о и цитокина 1--1р.

Позтому, еще одной особенностью изобретения является то, что оно предоставляєт способ подавления вьтработки ТМЕ-е и І--1Д у млекопитающего, и способ лечения или облегчения воспалительньїх состояний или заболеваний, включая, но не ограничиваясь, септическим шоком, ревматоидньм артритом, остеоартритом, астмой, бронхитом, хроническим обструктивньм заболеванием дьхательньїх путей, псориазом, аллергическим ринитом, дерматитом, воспалительньм заболеванием кишечника и другими аутоиммунньми заболеваниями, причем способ включаєт введениє указанному млекопитающему зффективного количества соединения А и его фармацевтически приемлемьх солей в комбинации с фармацевтически приемлемьм носителем.

Использованньй здесь термин «соединение А» обозначаєт соединение, химическая структура которого представлена ниже. н

М

(в) наснесЗн С снаСнНоснУ ви х

М М о вас, / но сосну

Соединение А также именуется соединением 1І-51 (І ем/і5 еї аі., патентьї США Мо 5 461 146 и 5 621 100;

МО 94/02488).

Использованньй здесь термин «облегчать» или «облегчающий» обозначают терапевтически улучшать и/или терапевтически уменьшить, и/или делать более терапевтически переносимьм.

Использованньй здесь термин «вредньй» обозначаєт повреждающий и/или опасньй, и/или отрицательньй.

МИспользованное здесь слово «избьточная вьработка», когда используется для обозначения изменений вьработки ТМЕ-ох и/или 1-13, обозначаєт вьработку ТМЕ-х и/или І-18, приводящую к патологическим состоянияМм, таким, например, как септический шок, аллергические состояния, воспалительнье состояния и т.д.

Использованнье здесь терминь! «ингибировать» или «ингибирующий» означают, что наличие соединения А оказьшваєт сравнительно больший зффект на уменьшениєе и/или прекращение, и/или предотвращение вьработки материала, контактирующего с соединением А, чем сравнительного материала, не контактировавшего с соединением А.

Использованнье здесь терминь «усиливать» или «усиливающий», при использований для модификации терминов «функция» или «вьживание» обозначаєт, что наличие соединения А имеет сравнительно больший зффект на функцию и/или вьїживание определенного нейрона, чем сравнительного нейрона, не контактировавшего с соеєдинением А. Например (но не в виде ограничения), что касается вьіживания, например, допаминергического нейрона, соединение А должно свидетельствовать об усилений функции популяции допаминергических нейронов, под угрозой гибели (вследствие повреждения, патологического состояния, дегенеративного состояния или естественного прогрессирования) при сравнений с популяцией допаминергических нейронов, не контактировавших с соединением А, если подвергшаяся его действию популяция имеет относительно больший период функциональности, чем не обработанная популяция.

Использованньй здесь термин «допаминергическии нейрон» обозначаеєт нейрон, использующий в качестве нейротрансмиттера допамин.

Использованньй здесь термин «ГАМК-ергический нейрон» обозначаєт нейрон, использующий в качестве нейротрансмиттера гамма-аминомасляную кислоту.

Использованньй здесь термин «глутаматергический нейрон» обозначаєт нейрон, использующий в качестве нейротрансмиттера глутам.

Использованньй здесь термин "прт" обозначает крупноклеточное базальное ядро.

В случає отсутствия других определений, все использованнье здесь технические и научнье терминь! имеют такое же значение как и терминь, обьічно понятнье рядовому специалисту в зтой области, которому предназначено зто изобретение. Хотя способь! и материаль! аналогичнье или зквивалентньї описанньм здесь, далеє могут использоваться на практике или при испьітаний настоящего изобретения, ниже описань! предпочтительньюе способь! и материальі. Все публикации, заявки на патентьї, патенть! и другие ссьлки, упомянутье здесь, включень! в качестве ссьлок. В случає конфликта настоящий документ, включая определения, будет служить контролем. При отсутствий других определений, описаннье здесь материальі, способь! и примерьі! являются только иллюстративньми и не предназначень для ограничения. Различнье признаки и прейимущества изобретения станут очевидньї из следующего подробного описания и из формуль! изобретения.

Фиг.1 представляєт собой графическое представление данньїх, показьвающих, что соединение А не является ингибитором моноаминоксидазь А. ИК5о для клоргилина составило 2інМоль. Треугольники вверх вершиной клоргилин; перевернутье треугольники соединение А; квадрать І -депренил.

Фиг.2 представляєт собой графическое представление данньїх, показьвающих, что соединение А не является ингибитором моноаминоксидазь В. ИКоо для клоргилина составило 2інМоль. Треугольники вверх вершиной клоргилин; перевернутье треугольники соединение А; квадрать І -депренил.

Фиг.3 представляєт собой столбцовую диаграмму, показьвающую, что животнье, получавшие соединениє А (светлье столбики), имели значительно больше меченньх фторзолотом нейронов в клювовидной части поврежденного пот (более 400мкм от средней точки повреждения), по сравнению с имеющими повреждение животньми, получавшими только носитель (темнье столбики). "-Р«к0,05 по критерию Мем/тап-Криїв.

Фиг.4 представляет собой столбцовую диаграмму, показьвающую общее количество ошибок, совершенньїх при вьшполнении меняющегося задания в Т-образном лабиринте с вознаграждаємьм чередованием, по сравнению с контрольной группой, ложно оперированньми животньми, животньми с хирургическим повреждением, получавшими только носитель («повр.») и животньми с хирургическими повреждениями, получавшими соединение А в дозе 0,1мг/кг 1 р/д («0,1»). Число животньїх в каждой группе показано в скобках "-Р«е0,05 по сравнению с ложно оперированньми 11-Р«0,01 в сравнений с (повр.) с помощью критериев Мем/тап-Кепів.

Фиг.5 показьівает влияние соединения А на вьізванную акриламидом периферическую невропатию.

В целом, в изобретениий описьшваются способьй облегчения вредньх воздействий различньх заболеваний, расстройств и состояний с помощью лечения нуждающегося в нем субьекта терапевтически зффективнь!м количеством соединения А.

Зто изобретение предоставляєт способ лечения вредньїх воздействий заболеваний, расстройств и состояний, которне отрицательно воздействуют на функцию и/или вьїживание нейронов, которьім угрожает гибель вследствие таких заболеваний и расстройств путем усиления функции или вьживания специфических типов нейронов центральной нервной системьй млекопитающих. Более конкретно изобретение предоставляєт способ усиления функции или вьіїживания допаминергических нейронов, ГАМК- ергических нейронов и глутаматергических нейронов у млекопитающего с помощью введения млекопитающему соединения А, замещенного в кольце производного К-252а со следующей химической структурой: й ' М о насньсвнІє (Фі, С ствСНІсну

Ох

Ге) наст нот

Сон соединение А

Допаминергические нейронь, ГАМК-ергические нейроньі, глутаматергические нейроньй широко распространеньі в центральной нервной системе млекопитающих. Каждьй из зтих трех типов нейронов претерпевает нарушение функций или даже гибель, при одном или нескольких нейродегенеративньх заболеваний центральной нервной системь. При болезни Паркинсона происходит прогрессирующая потеря допаминергических нейронов нигростриарного пути. При болезни Альцгеймера происходит гибель различньїх типов нейронов, включая ГАМК-ергические нейроньі в базальном ядре Мейнерта базального отдела переднего мозга. При болезни Альцгеймера также происходит гибель глутаматергических нейронов в знторинальной области корь! головного мозга.

Одним из методов лечения болезни Паркинсона или болезни Альцгеймера, является введение соединения, которое усиливает функцию или вьіживание допаминергических нейронов, ГАМК-ергических нейронов или глутаматергических нейронов. Соединение А фармакологически активно в биологических количественньіїх определениях и моделях іп мімо усиленной функции или вьиіживания допаминергических нейронов, ГАМК-ергических нейронов и глутаматергических нейронов. Таким образом, настоящее изобретение применимо для лечения болезни Паркинсона или болезни Альцгеймера. Изобретение, однако, не ограничено лечением зтих болезней. Использование соединения А для усиления функций или вьживания допаминергических нейронов, ГАМК-ергических нейронов или глутаматергических нейронов, чья нарушенная функция или риск гибели происходит в результате иньїх причин, нежели болезнь

Паркинсона или болезнь Альцгеймера, также находится в обьеме притязаний настоящего изобретения.

Изобретение таюке раскрьвает способ уменьшения периферической невропатии. Способ включает введение млекопитающему уменьшающего невропатию количества соединения А. В различньх предпочтительньїх вариантах реализации млекопитающее является человеком или сельскохозяйственньм или домашним млекопитающим, у которого развиваеєтся невропатия, например, в результате лечения новообразования химиотерапевтическим средством. Соединение А может вводиться способом, считающимся зффективньм, специалистом в данной области, предпочтительньм способом введения является подкожная иньекция.

Используемьм здесь термином «периферическая невропатия», именуется расстройство, поражающее сегмент периферической нервной системь). Изобретение включаєт использование соединения А для уменьшения нейротоксичности, включая, но не ограничиваясь, дистальную сенсорно-двигательную невропатию или вегетативнье невропатии, такие как снижение сократительной способности желудочно- кишечного тракта или атонию мочевого пузьгря.

Предпочтительнье невропатии, которье могут зффективно излечиваться соединением А, включают невропатии, связанньсе с системньім заболеванием, например, постполиомиелитньй синдром; генетически приобретеннье невропатии, например, болезнь Шарко-Мари-Туса; и невропатии, вьізьіваемье токсическим агентом, например, акриламидом или химиотерапевтическим средством, например, винкристином.

При использований соединения А для лечения невропатии, вьізванной токсическим агентом, оно может вводиться перед, одновременно или после воздействия токсического агента, или перед, во время или после введения химиотерапевтического средства. Предпочтительно, соединениеє А и химиотерапевтическое средство вводятся через зффективнье интервальй времени, во время перекрьвающего периода лечения. Соединение А может вводиться млекопитающему после воздействия нейротоксического агента или после химиотерапии, для восстановления, по меньшей мере, части неврологической функции, нарушенной нейротоксическим или химиотерапевтическим агентом.

Химиотерапевтическим может бьіть любой химиотерапевтический агент, оказьиівающий нейротоксическое действие, такой как винкристин, таксол, дидеоксиинозин или цисплатин.

Под «токсическим агентом» или «нейротоксическим агентом» подразумеваеєтся вещество, которое посредством своего химического действия повреждаєт, нарушаєт или подавляєт активность компонента нервной системь». Существует длинньй перечень нейротоксических агентов, которье вьізьівают невропатии, включающий, но не ограничивающийся, противоопухолевье средства, такие как винкристин, винбластин, цисплатин, таксол или дидеокси соединения, например, дидеоксиинозин; спирт; металль!; промьішленньсєе токсинь, контакт с которьіми имеется в промьішленной или окружающей среде; примеси в пище или лекарственньхх средствах; или передозировка витаминов или терапевтических препаратов, например, антибиотиков, таких как пенициллин или хлорамфеникол, или мегадозь! витаминов А, О или Вб.

Обширньй, хотя и не полньій перечень химических соединений с неиротоксическими побочньіми зффектами представлен в Таблице 1. Хотя зтот перечень представляєт примерь! нейротоксических соединений, он предназначен служить примером, а не ограничивать диапазон притязаний изобретения.

Другие токсические агенть! могут вьізьявать невропатиий и могут характеризоваться с помощью способов, известньїх специалистам в зтой области. Под «воздействием токсического агента» подразумеваеєтся, что токсический агент становится доступньм или вступает в контакт с млекопитающим изобретения.

Воздействиєе токсического агента может происходить путем прямого введения, например, проглатьняванием или введением с о пищей, лекарственньм или терапевтическим средством, например, химиотерапевтическим средством, при случайном загрязнениий или контактом с окружающей средой, например, посредством контакта с воздухом или водой.

Несмотря на несопоставимую морфологию и причиньї, виізььівающие периферические невропатии іп мімо, заявители предположили, что соединение А может бьіть зффективньім средством профилактики или лечения таких невропатий у млекопитающего.

ТАБЛИЦА 1 средство чалнннин ення охвнюсня син пряник

Адриамицин Неорганический свинец средство и т.д. рекреационное средство средство средство средство мк 000 вот нення ення 0 рон ' промежуточньй продукт ляетютння щен фитоннни |нтпртенню нт

Ауротиоглюкоза Метронидазол Антипротозойное средство средство средство есе 0 Днеенияни ФДихетннтн они

Жостер Токсичная ягода Нитрофурантоин - мочевьіводящих путей

Противоопухолевое

Карбамать! Инсектицидь! Азотистьй иприт средство, нервно- паралитический газ токсическоеє вещество

Антибактериальное Фосфорорганические средство средство средство средство средство

Амебицидное,

Клиохинол антибактериальное Парагексиллин малеат |Антиритмическое средство средство ншнни Те С ннн":ИИ ТЕТ

Компонент лекарственньх

Колхицин Средство от подагрь! Платина р препаратов

Противосудорожное

Колистин Антимикробное средство Примидон р ред римид средство

Антибактериальное Противоопухолевое

Циклосерин Прокарбазин средство средство

Противоопухолевоє

Циторабин р У Пиридоксин Витамин Вб средство

Дерматологическое Состав для лечения

Дапсон средство включая лечение |Цианат натрия серповидно-клеточной проказь! анемий

Противоопухолевоє

Дидеоксицитидин р У Стрептомицин Антимикробное средство средство

Противоопухолевое Сульфонаийламиднье идеоксиинозин Антимикробное средство

Дид средство препарать р ред

Противоопухолевое

Дидеокситимидин Противовирусное средство |ІСурамин средство

Средство для лечения Противоопухолевоє

Дисульфирам ред ДІ Тамоксифен р У алкогольной зависимости средство

Противоопухолевое Противоопухолевое оксорубицин Таксол щ рузиц средство средство

Антибактериальное Средство для лечения

Зтамбутол р Талидомид ред д средство подагрь!

Антибактериальное - -

Зтионамид р Таллий Крьісиньй яд средство

Седативное, снотворное Средство, усиливающее

Глутетими ' Триаметерен '

УТ д средство р р диурез

Противоревматическое -

Золото р ц Триметилолово Токсичньій металл средство

Гексауглеродь! Растворители Ї -триптофан Оздоровительная добавка

Гормональнье Противоопухолевое

Винкристин контрацептивь! средство

Огнестойкое

Противоопухолевое

Гексаметилолмеламин | противоусадочное Винбластин средство вещество

Средство для лечения Противоопухолевое

Гидралазин Виндезин др гипертоний д средство

Противоревматическое

Гидроксихлорохин Витамин А Сверх вьісокие дозь средство нишнпн ПН ЕТ ЕТ Сверх вьісокие дозь

Бьіло также показано, что соединение А подавляеєет вьіработку цитокина ТМЕ-со, несмотря на отсутствие или низкую подавляющую активность против РКС. Соединение А также подавляєт вьіработку цитокина ІІ-- 1рф8. Виіработка ТМЕ-о связана с множеством заболеваний и расстройств, так что ее подавление с помощью соединения А может оказать благоприятноеє воздействие на субьекта, нуждающегося в подавлений вьіработки ТМЕ-о..

Таким образом, соединение А может также использоваться для подавления вьіработки ТМЕ-о у млекопитающего и/или в способе лечения или облегчения воспалительньїх состояний или заболевания, включая, но не ограничиваясь, септическим шоком, ревматоидньм артритом, остеоартритом, астмой, бронхитом, хроническим обструктивним заболеванием дьхательньх путей, псориазом, аллергическим ринитом, дерматитом и воспалительньм заболеванием кишечника и другими аутоиммунньми заболеваниями, причем способ включаєт введение указанному млекопитающему терапевтически зффективного количества соединения А.

Для применения в настоящем изобретений соединениєе А может бьіть составлено в фармацевтическую композицию с помощью смешивания с фармацевтически приемлемьми не токсичньіми наполнителями и носителями. Такая композиция может бьть получена для введения любьм из различньїх путей. Пути введения и предпочтительнье лекарственнье формь включают следующие: парентеральньй, предпочтительно в форме жидких растворов или суспензий; оральньїйй, предпочтительно в форме таблеток или капсул; интраназальньй, предпочтительно в форме порошков, капель в нос или азрозолей; и дермальньй, например, с помощью трансдермальньх систем.

Соединение А может для удобства вводиться в виде стандартной дозь! препарата с помощью любого способа, хорошо известного в фармации, например, как описано в Кетіпдіоп'є Рпагтасецшіса! Зсіепсе5 (Маск Риб. Со., Еазтет, РА, 1980). Композиции для парентерального введения могут содержать в качестве обьічньхх наполнителей стерильную воду или солевой раствор, полиалкиленгликоли, такие как полизтиленгликоль, масла растительного происхождения, гидрогенизированнье нафталинь и им подобнье. В частности, для контроля вьісвобождения активньх соединений могут использоваться: биосовместимьй, биодеградируемьй лактидньій полимер, лактид /гликолидньій сополимер или полиоксизтилен-полиоксипропиленовье сополимерь». Другие системь, которье потенциально могут использоваться для доставки соединения А, включают частиць! зтиленвинилацетатного сополимера, осмотические насось, имплантируемье инфузионньюе системь! и липосомь». Композиции для ингаляционного введения в качестве наполнителей содержат, например, лактозу или могут бьіть водньіми растворами, содержащими, например, лактозу, или могут бьть водньми растворами, содержащими, например, простой полиоксизтилен-9-лауриловьій зфир, гликохолат и дезоксихолат, или маслянистье растворь! для введения в форме капель в нос, или в виде геля для интраназального введения. Композиции для парентерального введения могут также включать гликохолат для трансбуккального введения, салицилат для ректального введения или лимонную кислоту для вагинального введения. Композиции для транедермальньх систем представляют собой предпочтительно липофильнье змульсии. 28

Соединение А может о применяться в качестве единственного активного ингредиента в фармацевтической композиции. Альтернативно, оно может применяться в комбинации с другими активньіми ингредиентами, как например, факторами роста, способствующими вьіїживанию нейронов или регенерации аксонов при заболеваниях или расстройствах.

Концентрация соединения А, применяемая в терапевтической композиции при осуществлений зтого изобретения, может варьировать. Концентрация будет зависеть от таких факторов, как общая доза препарата, которую предполагаєтся ввести, и путь введения. Обьчно соединение А должно предоставляться в водном физиологическом буферном растворе для парентерального введения, содержащем приблизительно от 0,1 до 1090масс/об. Обьчнье диапазонь! дозьі составляют от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 1 г/кг массь! тела в сутки; предпочтительньй диапазон дозьї составляет от приблизительно 0,01мг/кг до 100мг/кг массь! тела в сутки. Вероятно, предпочтительная доза соединения А, которую предполагаеєтся вводить, зависит от таких факторов как тип и степень тяжести заболевания или расстройства, общего состояния здоровья конкретного пациента, относительной зффективности соединения А при подлежащем лечению конкретном заболеваний или расстройстве, и пути введения.

Соединение А для применения в настоящем изобретениий предпочтительно получают в соответствий со способами, описанньіми в патенте США Мо 5 461 146, вьіданном І! ем/із еї аї.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами. Зти примерь! не следует расценивать ни как ограничивающие диапазон притязаний изобретения, ни как ограничивающие диапазон притязаний прилагаємой к нему формуль! изобретения.

ПРИМЕРЬ

Пример 1

Фармакологическая Активность при действий на Допаминергические Нейронь!

Зксперименть! проводят с использованием соединения А на поврежденньїх МРТР допаминергических нейронах у мьішей, модель с использованием МРТР у мьішей. Однократная доза МРТР (20мг/кг) введенная подкожно черньмм мьішам линии С57, вьізвала потерю активности приблизительно на 6095 гидоксилазь полосатого тела. Введение соединения А в ежесуточной дозе в диапазоне от 0,01 до 1Омг/кг (подкожно), таким мьішам, получавшим МРТР, снизило потерю активности тирозин гидроксилазь! полосатого тела. Зти данньсе показань! в Таблице 2.

ТАБЛИЦА 2

Активность тирозингидроксилазь! полосатого тела у мьішей, получивших низкие дозьї МРТРУ тела (МЕТ контроля

Повреждение МРТР

Повреждение МРТР ж соединение А (0,01 мг/кг) 776-123 41553 а - Средняя трех зкспериментов по исследованию зависимости реакции от дозь.

Мьшам вводят МРТР (20мг/кг подкожно) через 4-6 часов после первой иньекции соединения А.

Соединение А затем вводят ежедневно до конца зксперимента, продолжавшегося 7д. Проводят оценку активности фермента тирозингидроксилазьй полосатого тела. Звездочка показьшвает статистически достоверное различие (р«е0,05) от животньїх, получавших МРТР-Носитель.

В отдельном зксперименте активность соединения А оценивают на модели с введением мьішам вьісоких доз МРТР. Однократная иньекция 40мг/кг МРТР вьіїзьівала через 7д. после иньекций снижение активности фермента тирозингидроксилазьі! полосатого тела на 9595. Введение соединения А в дозе от 0,03 до 3З,Омг/кг в сутки дозозависимьим образом уменьшало величину поражения. Зти даннье представлень в Таблице 3.

ТАБЛИЦА З

Активность Тирозингидроксилазь! полосатого тела у мьішей, получавших вьісокую дозу МРТРУ тела (МЕТ контроля контроль носитель

Повреждение МРТР ж соединение А (0,0Змг/кг) 1,8-0,6 852,5 а Даннье одного зксперимента

Мьшам вводят МРТР (40мг/кг подкожно) через 4-6 часов после первой инфекции соединения А.

Соединение А затем вводят ежедневно до конца зксперимента, продолжавшегося 7д. Проводят оценку активности фермента тирозингидроксилазьій полосатого тела. Звездочка показьмшвает статистически достоверное различие (р«е0,05) от животньїх, получавших МРТР-Носитель.

Допаминергическая токсичность, опосредованная МРТР, зависит от оопосредованного МАО- превращения МРТР в МРР" (йон 1-метил-4-фенилпиридина) и захвата МРР" в допаминергические нейроньі. Соединения с обнаруженной активностью на модели у мьішей, получавших МРТР, не должнь! определяться как ингибиторь МАО или захвата допамина. Как бьіло установлено, соединение А не ингибирует моноаминоксидазу А и В іп міго (фиг.1 и 2) или не блокирует захват катехоламинов в нервнье окончания, что указьшаєт на то, что зто соединение не предотвращаєт метаболическое превращение

МРТР в МРР" или не ингибирует активньй захват МРР" в допаминовье нейроньі. Зти данньє, подтверждающие зффективность соединения А на модели повреждения допаминергических нейронов

МРТР у мьішей, указьявают на возможность использования соединения А в лечениий нейродегенеративньмх расстройств, таких как болезнь Паркинсона.

Пример2

Фармакологическая активность при действии на ГАМК-ергические нейронь!

Соединение А исследуют на его способность предотвращать истощение или увеличивать вьіживание

ГАМК-ергических нейронов в крупноклеточном базальном ядре, используя хорошо изученную модель поражения иботеновой кислотой. Иботеновая кислота (зксцитотоксин) как известно уменьшаєт количество

ГАМК-зкспрессирующих нейронов в области порт (Гіпде ге еї аї., Мецйгозсі. Гей. 135:262-264, 1992;

Зпацйдпезву еї а!., Вгаіп Вез., 637:12-26, 1994).

Взросльім самцам крьс линии Зргадое-Оаулеу производят иньекцию иботеновой кислоть! (5,0г) в прт с одной стороньі. Крисам затем путем подкожной иньекции вводят соединение А (0,0Змг/кг) начиная с 18ч после поражения и продолжая введение 1 раз до 18д. после поражения. Затем по всему рострально- каудальному протяжению прт делают срезьй и обрабатьвают их для вьіявления декарбоксилазь глутаминовой кислотьї, фермента, требуемого для биосинтеза ГАМК. Количество нейронов, зкспрессирующих декарбоксилазу глутаминовой кислотьії затем подсчитьввают по всему рострально- каудальному протяжению пріт в области, где нейроньії порт, зкспрессирующие глутамат декарбоксилазу, легко отличимь! от нейронов прилегающих структур, зкспрессирующих глутамат декарбоксилазу (белое вещество медиальное и вентралльное от діорих раїїїдив5). Результат вьіражают в виде процента нейронов с пораженной осторонь, зкспрессирующих декарбоксилазу глутаминовой кислотьі от количества на противоположной, непораженной стороне. Результать! также рассчитьвают отдельно для рострального отдела прт, среднего отдела порт и каудального отдела порт.

В среднем по подсчетам в ростральном отделе порт животньїх, получавших соединениєе А, обнаруживают 78 (ж416)96о нейронов, содержащих декарбоксилазу глутаминовой кислотьї, в сравнениий с 34 (419)95 у животньїх, получавших только носители , что, по критерию ї Стьюдента, является статистически достоверньім различием (р«0,05). В среднем или каудальном отделах порт не наблюдают статистически достоверньїх различий между животньіми, получавшими соединение А, и животньіми, получавшими только носитель (контроль).

Зти результать! показьівают, что соединение А может защищать от потери ГАМК-ергических нейронов в результате зксцитотоксического поражения и, следовательно, оказьшвает неиротротрофическое воздействиєе на популяцию нейронов.

Пример З

Фармакологическая активность при действий на нейроньі прот

Для прямого исследования способности соединения А предотвратить зксцитотоксическую гибель нейронов, нейроньї прот взросльїх самцов крьіс линии Зргадпе-Оаміеу сначала метят стойким маркером.

Зто осуществляют с помощью иньекции фторозолота (Ф3), маркера нейронов, захватьяваемого нервньіми окончаниями и транспортируемого в обратном направлений к телу клеток (Воок еї аї., У. Меигораїй. Ехр.

Меийгоіоду, 53:95-102, 1994), в области-мишени нейронов порт в лобной и теменной коре. Спустя 7-10 дней у животньїх с помощью введения 5мкг иботеновой кислоть! вьізьівают одностороннеє повреждение прт.

Через 18ч после зтого повреждения посредством подкожной иньекции животньм начинают введение соединения А (0,0З3мг/кг) и производят его 1 раз в 2 дня до 18 дня после повреждения. По всему рострально-каудальному протяжению пріт с обеих сторон мозга делают срезьі ткани и подсчитьївают количество нейронов прт с меткой ФЗ3. С помощью стандартньїх методик делают поправку расчетов на различия размера и результать! витражают в виде процентной доли меченньїх нейронов в порт на стороне повреждения каждого животного относительно числа меченньїх нейронов в прот на противоположной, не поврежденной стороне мозга.

В сравнений с животньми, имеющими повреждения и получавшими только носитель, у животньх, получавших соединение А, в ростральной части поврежденного прт (более 400мкм от средней точки повреждения) бьіло значительно больше нейронов, меченньїх ФЗ (фиг.3). В повреждении средней и каудальной части зффект соединения А снижался.

Зти даннье являются прямь!м доказательством того, что соединение А может предотвратить потерю предварительно меченньїх нейронов в прт в результате зксцитотоксического поражения.

Пример 4

Длительное функциональное улучшение после кратковременного введения соединения А Сначала взросльїх самцов крьіс линии Зргадое-бСам/еу обучают чередующимся реакциям в стандартном заданий в

Т-образном лабиринте с вознаграждаемьм чередованием (Неїрег еї аї., У. Меиговсі., 5:866-873, 1985).

Затем для нарушения вьіполнения заданий в Т-образном лабиринте у животньх вьізьівают двухсторонние повреждения крупноклеточного базального ядра (см., например, Заіатопе еї аї., Вепаум. Вгаїіп Нез., 13:63- 70, 1984). Через 18ч после зтого повреждения посредством подкожной иньекции животньм начинают введение соединения А (0,1мг/кг) и производят его 1 раз в 2 дня до 12 дня после повреждения. Через 24 ч. после последней иньекции всех животньїх один раз в сутки помещают в Т-образньй лабиринт до тех пор, пока их чередующееся вьіполнение не достигнет предоперационного уровня, что занимает приблизительно от З до 10д. После достижения критерия животньх на 8-10нед. не подвергают дальнейшим исследованиям.

В зтот момент животньїх снова один раз в сутки помещают в Т-образньй лабиринт до тех пор, пока они не достигнут предоперационного вьіполнения задания. Общее число ошибок, совершенньїх животньми во время зтого исследования, показано на фиг.4. Животнье с повреждением, получавшиє только носитель, совершили значительно больше ошибок, чем не оперированнье или ложно оперированнье животньє, тогда как животнье с повреждением, за 10-12нед. до зтого получавшие соединение А, не отличались от нормальньх животньх.

Зти даннье показьвают, что соединение А вьїзьіваєт стойкое улучшение поведения, отражающееся в улучшений внимания или памяти через несколько месяцев после прекращения введения.

Пример 5

Зффективность соединения А на модели повреждения знторинальной корь!

Содержащие глутамат нейроньі во 2 слое знторинальной корьї проецируются в молекулярньй слой зубчатой извилиньі, где они образуют синапсь! на дендритах нервньїх клеток-зерен зубчатой извилинь.

Повреждение во 2 слое знторинальной корь! может бьїіть вьізвано с помощью стереотаксической иньекции зкситотоксина М-метил-О-аспартата (ММОА). В условиях анестезий пентобарбиталом натрия крьсам производят иньекцию ММОА (15нМ/участок) в каждьй из 2 участков в знторинальной коре. Через 2нед. крьіс забивают и перфузируют раствором, содержащим 50мМ сульфида натрия. Мозг удаляют, производят срезьї толщиной 40мкм в горизонтальной плоскости и окрашивают крезилом фиолетовьм или красителем

Тимма. Вьїживание нейронов во 2 слое знторинальной корьї оценивают в срезах, окрашенньїх крезилом фиолетовьм, тогда как целостность окончаний их аксонов в молекулярном слое зубчатой извилинь измеряют в чередующихся срезах, окрашенньх красителем Тимма.

Иньекция ММОА разрушала 62511956 2 слоя знторинальной корь и уменьшала площадь среднего молекулярного слоя зубчатой извилинь!ї на 1924695. Ежесуточное введение соединения А (1мг/кг подкожно) при первой иньекции, произведенной сразу после иньекциий ММОА, уменьшало потерю нейронов 2 знторинального слоя до 22511095 (ре0.05 по ї критерию Стьюдента) и предотвращало уменьшение площади среднего молекулярного слоя (р«е0.05 по Її критерию Стьюдента). Следовательно, соединение А защищало нейроньї в знторинальной коре от зксцитотоксического повреждения и поддерживало целостность окончаний их аксонов в зубчатой извилине.

Зти даннье показьвают зффективность соединения А в защите глутаматергических нейронов знторинальной корьї. На зкспериментальньїх моделях бьло показано, что повреждения знторинальной корьї вьізь'вают нарушения памяти, а при болезни Альцгеймера происходят тяжелье дегенеративнье изменения зтих нейронов. Зто подтверждает точку зрения, что соединение А может использоваться при лечении неврологических расстройств, связанньх с потерей или повреждением глутаматергических нейронов и нейронов корь! головного мозга, включая болезнь Альцгеймера, инсульт и черепно-мозговую травму, но не ограничиваясь ими.

Пример 6

Влияние соединения А на периферическую невропатию, вьізванную акриламидом

Акриламид вьізьваеєт у людей и животньїх центрально-периферическую дистальную невропатию с «отмираниеєм в обратном направлений». Повреждение представляеєт собой смешанную сенсорно- двигательную невропатию, характеризующуюся у людей слабостью, тремором и атаксией. У животньх акриламид вьізьшаєт изменения поведения (сенсорнье, двигательнье и дроприоцептивньє), паралогические изменения структурь и злектрофизиологических характеристик ткани и потерю массь тела. На периферии акриламид прейимущественно поражаєт волокна Ар большого диаметра с длинньіми аксонами. По данньм измерения увеличения расставления лап при приземлений (РЛП), являющегося показателем проприоцепции, у крьіс введение акриламида вьізьіваєт аксонопатию.

Невропатия, вьїзванная акриламидом, является моделью токсического воздействия химических соединении. Она отличаеєтся от других моделей действия химических соединений (таких как химиотерапевтические модели) тем, что ее продолжительность относительно короткая (Знед.), и животнье относительно хорошо себя чувствуют. Акриламид не вьізьіваєт значительное системное токсическое действие.

В начале зксперимента используют самцов крьіс линии Ззргадое-Оамлеу с массой тела 250г. Акриламид (5Омг/кг внутрибрюшинно) вводят З раза в неделю в течение трех недель. Животньїх бросают с вьсоть!

ЗОсм и регистрируют расстояние между следами задних лап (Едулага5 Р.М. апа Рагкег М.Н. (1977): «Простой, чувствительньій и обьективньйй способ ранней оценки акриламидной невропатии у крьс» (Тохісо! Аррі Рпаптасої, 40:589-591). Соединение А (0,1, 0,3 или 1,0мг/кг подкожно в 595 солутоле) вводят один раз в сутки в течение всего зксперимента. У животньїх, получавших акриламид, расстояние РЛП бьіло больше, чем у животньїх, получавших носитель. Соединение А (0,Змг/кг/сутки) уменьшало степень увеличения РЛП, вьіїзванного акриламидом (фиг.5).

Зти данньюе показьвают, что соединение А может использоваться для лечения периферических невропатий.

Пример 7

Неспособность соединения А подавлять протеинкиназу іп міго

Количественное определение протеинкиназьії С и подавление под воздействием протеинкиназь! С К- 252а раскрьто в патенте США Ме 4 923 968 и в работе Казе Н. еї а). (єдв.) дарап 5сіепійіс босієйез Ргевв5,

Токуо, рр 93-296 (1988). Посредством по существу аналогичного количественного определения бьло установлено, что К-252а подавляєт протеинкиназу С с ПК»о, составляющей 0,028мММ, тогда как ПКо соединения А составляеєт 16,0мкМ, т.е., его активность ниже в 570 раз. В качестве ингибитора вьіработки

ТМЕ-х ПК5БО соединения А составляєт 139НМ, а в качестве ингибитора вьіработки І--1р величина ПК»о составляет 261нМ. Зто концентрации, при которьїх соединение А не активно в качестве ингибитора протеинкиназь С.

Пример 8

Подавление іп міго вьіработки ТМЕ-о; и І--1р соевдинением А

Способность соединения А подавлять индукцию ТМЕ-ох бьла показана с помощью применения методики стандартного фармакологического исследования іп міїго, как описано ниже. Маточнье растворь, состоящие из 4мММ соединения А в 10095 диметилсульфоксиде (ОМ50О) хранят при 4"С. Среда КМРІ 1640 для клеточной культурь! (Медіа Тесп, Нептпаоп, Ма) и фетальная телячья сьіворотка (Нусіопе, Годап, ОТ) составляют среду для исследования. Используют липополисахарид (І РБ) (Зідта, 51. Гоці5, МО) серотипа 011184 БЕ. соїї, зкстрагированньїйй трихлоруксусной кислотой. Маточньсе растворь І Р5 готовят и хранят при 4"Сб в солевом растворе с фосфатньм буфером (РВ5). Наборь иммуноферментного анализа для количественного определения фактора некроза опухоли альфа (ТМЕ-о) и І--1р закупают у компаний

Воепгіпде/--Мапппеїт (Іпаіапароїї5, ІМ) и используют в соответствии с инструкциями производителя. Клетки

ТНР-1, клеточную линию, происходящую из моноцитов человека, получают из Атегісап Туре Сийиге

СоПесіоп (АТОС ТІВ 202). Клетки вьращивают в КМРІ 1640, содержащей 10956 фетальную телячью сьіворотку (среду) в увлажненной атмосфере 5956 СО2:9595 воздуха при 37". Зксперименть! проводят в 24- ячеечньїх культуральньїх планшетах (Мипс) при концентрации 5х105 клеток ТНР-1 на 1їмл средьі. Для индукции ТМЕ-о; клетки инкубируют с І Р5 при концентрации 2мкг/мл. После 3-часового периода инкубации клетки и среду центрифугируют при 1000 х д в течение 5мин, и либо сразу проводят количественное определение полученной в результате надосадочной жидкости на ТМЕ-ос, или хранят ее при -70'С и количественное определениеєе проводят позднеєе. С помощью иммуноферментньїх количественньх определений измеряют содержание ТМЕ-о и І--1р в образцах средь!.

Для исследования соединения А на способность подавлять индукцию ТМЕ-ох клетки перед добавлением ГРЗ инкубируют в течение 1ч с меняющимися концентрациями соединения А. Соединения разводят так, что в среде для клеточной культурьь никогда нет ОМ5О в концентрации вьіше 0,195.

Исследование и количественное определение соединения А проводят, как описано вьіше, на способность подавлять вьіработку ТМЕ-о и 1--1р.

Пример 9

Подавление ТМР-се и І--1р, индуцированньх ІГР в сьіворотке крови мьішей 60 самок мьішей линии С57ВІ. (возраст 4-бнед.) делят на 6 групп, каждая из которьїх включаєт 10 животньх. Трем группам (1, 3, 5) внутрибрюшинно (в/б) вводят только носитель (РВ5, содержащую 0,195

ТЕА (тетразтиламмоний гидрохлорид)) - по 200мкл на животное. Другим трем группам (2, 4, 6) вводят соединение А (ЗОмг/кг в/0б в 200мкл) носителя (РВ5, содержащей 1095 сложного зтилового зфира 12- гидроксистеариновой кислоть!; солутол). Через 2ч животньм в/б вводят 0,1мг/кг І РБ5 (группьі! 1 и 2), 0,5мг/кг

І Р5 (группьі З и 4) и 1,Омг/кг ГРЗ (группь! 5 и 6). Через 2ч после введения І Р5 всех животньїх забивают, получают образцьі плазмьї и проводят количественноє определение содержания в них ТМЕ-о и 1-1рД.

Количественнье определения проводят как описано в примере 8.

Данньсе сведень! в таблице 4. Числа в скобках представляют собой номера описанньх вьіше групп. М указьшваєт количество животньїх, в плазме которьїх проводили определения. МО - определение не проводилось.

ТАБЛИЦА 4 11111111 | носитель /:.// | / совддА | о носитель /З/ | соедА 01 (1) (2) МТВ) МО 61295676 27144497

М-10 М-10 0,5 (3) (4) МТВ) МО 714131113 37665375"

М-9 М-7 37452610 2399-1399 300587 594197

М-8 М-9 М-8 М-8 х Обозначаєт статистически достоверное отличие от контроля, получавшего носитель (ре0,05)

Как показано в таблице 4, введение І Р5 мьішам вьіїзвало вьіработку ТМЕ-о; у зтих мьішеи, и количество вьіработанного ТМЕ-схй заметно уменьшалось при предварительном введений соединения А за 2ч до исследования. Предварительное введение соединения А также значительно подавляло виьработку 1І--1рД в ответ на введение І РБ5 в дозе 1,Омг/кг.

Пример 10

Предотвращение гибели мьішей, вьізванной І Р5 45 мьшей делят на З группьі, две из которьїх состоят из 10 мьшей и одна группа из 20 мьішей.

Носители, ГРЗ и соединение А вводят внутрибрюшинно. Группе 1 (п-10) исходно (время - 0) вводят носитель (солевой раствор с фосфатньім буфером для І РБ5, 200мкл на мьішь), а через 2ч - носитель для соединения А (200 мкл на мьішь). Мьішам в группе 2 (п-10) исходно (время - 0) вводят носитель для соединения А (200мкл на мьїшь), а через 2ч - І РБ5 (2мг в 200мкл на мьішь). Группе З (п-20) исходно (время - 0) вводят соединение А (ЗОмг/кг в 200мкл носителя), а через 2ч - ГРБ (2мг в 200мкл на мьішь).

Введение ГРБ5 вьізвало 9095 смертность в пределах 20ч и 10095 смертность - через 42ч. В группе животньх, за 2ч до введения ГРО получавших соединение А, через 20ч после введения ГРЗ смертность составила 2595, через 42ч после введения І РО смертность бьіла 7595, и через Тнед, после введения І Р5 смертность составила 8095. Введение носителя хорошо переносилось и не вьізьіївало гибели мьішей.

Специалистам в зтой области будет понятно, что в предпочтительнье варианть! реализации изобретения могут бьіть внесеньї многочисленнье изменения и модификации, и что такие изменения и модификации могут вноситься без отхода от сущности изобретения. Позтому предполагаєется, что прилагаемая формула изобретения охватьшает все зквивалентнье варианть),, укладьвающиеся в истинную сущность и диапазон притязаний изобретения. Материаль, приводимье во всем описаний зтой патентной заявки, включень! в него в виде ссьІлки. 2 ї

ЯМ ПРОДУКТА/нг | і о. - В

ЛКАНИ -4 жк 1 к ші гої 1 2 З 4

ЛОГАРИФМ КОНЦЕНТРАЦИЙ МНГИБИТОРА (ВМ) зиг.:ї

З

М ПРОДУКТА/М»

В.Й 2 ад ннвннн нн Ше

ТКАНИ 2 . ; ять 13 ? о "

А б 1 2 З 4

ЛОГАРИФМ КОНЦЕНТРАЦИИ ИНГИБИТОРА (ЯМ) зиг.2

« остАВШИХСЯ ВЕЙРОНОВ 100 М (ПОРАЖЕННАЯ СТОРОНА/ зо Й

ПРОТИВОПОЛОЖНАЯ во 70 ; | !

КОНТРОЛЬНАЯ СТОРОНА) ! ка І во ! ГК . ГУ в 40 -х х 30 и 20 Я а

ДЖ

0--- і - шо ХА

РОСТРАЛЬНОВ СРЕДНЕК КАУДАЛЬНОЮВ

(5400 мкм) пПОвВРЕЖДЕНИЕ (5400 МКМ)

Фиг.З 20 шиБКИ - І 10 с.

З - | Я (В ! / по. що гі. КЗ ! й ШО

НОРМА лЛОЖНАЯ ЛОВРЕЖДЕ- 0.1

ОПЕРАЦИЯ НИЖ

(6) (6) (6) (8) 10-12 НЕД. ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ виг. влиянив сСОошдДИнНЕНИЯ Б НА РАССТАБНИШНИ ЛАП БО ВРЕМЯ пРИЗЕМЛЕНИЯ ПРИ ПЕРИФЕРИЧНОКОЙ НЕВРОПАТИЙ,

ВБЗВАННОЙ АКРИЛАМИДОМ ддд срок тт нт стен тн няння "ро в'свАвнЕНИИЙ С , цій АКРИЛАМИДОМ/НОСИТЕЛЕМ

Еньі 120 г й й ї

КУ даиньгі й " ка я 180 - | е о

РАССТОЯНИК ! у З У (мм) во АХ Я - пер у Гл и г в'я 7 хх р 4 з т З ; З І ! | Їх 5 ! 5 ! ж - й | й в. ДУ и 55 АЧХ

М мл ми о дл дю дю дл їч - БЖ ВОЗДЕЙСТВИЯ, У-НОСИТЕЛЬ, В-АКРИПАМИД, ЛОЗА СОБДИНЕМНЯ А му/кт

Ффиг.Б

Claims (5)

1. Способ подавления избьточной вьіработки фактора некроза опухолей альфа у млекопитающего, включающий стадию введения нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически-зффективного количества соединения А, представленного формулой: п М о нзснасвнос о СУ з сНноЗСНоСНУ А М о М нас 7 ноя сбну

2. Способ облегчения вредньх зффектов избьточной вьработки фактора некроза опухолей альфа у млекопитающего, включающий стадию введения нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически- зффективного количества соединения А, представленного формулой: щі М о нзснс5нас - (б, - СНоБСНосСну А М М о. нас ); но СОН

З. Способ по п. 2, где указаннье вреднье зффекть! вьібрань из группьї, включающей септический шок, ревматоидньій артрит, остеоартрит, астму, бронхит, хроническое обструктивное заболевание дьхательньх путей, псориаз, аллергический ринит, дерматит и воспалительное заболевание кишечника.

4. Способ по п. 2, в котором указанньй вредньїй зффект представляет собой аутоиммунное заболевание.

5. Способ лечения воспалительного состояния или заболевания, связанного с фактором некроза опухоли, включающий стадию введения нуждающемуся в нем млекопитающему терапевтически-зффективного количества соединения А, представленного формулой: п М о нзсносЗнас - (б, й СНоБСНоСна А М М о. нас ); ноя СОН