UA67854C2 - A process for preparation of pravastatin from compactin by micromonospora strain - Google Patents

Description

Опис винаходу

Цей винахід стосується нового мікробного процесу для одержання правастатину. 2 Зокрема, цей винахід стосується мікробного процесу для одержання правастатину формули (І) н ч В «йо ' Ку У "і 70 На о й

Ся но ча й () зі сполуки загальної формули (ІЇ) пон - йо о

Св с () о де К може бути лужним металом або іоном амонію з мікроорганізмом, де вищезгаданий мікроорганізм -- це прокаріот з роду Місготопозрога, котрий здатний гідроксилювати сполуку загальної формули (ІІ) у 6В-положенні.

Гіперхолестеролаемія була визнана головним фактором ризику при атеросклеротичній хворобі, зокрема М коронарній хворобі серця. Протягом останніх двох декад З-гідрокси-3-метилглутарил-кофермент А редуктазу ю (НМО-СоА редуктаза КФ 1.1.1.34) ретельно вивчали як головний обмежуючий швидкість фермент в біосинтезі холестеролу. Було виявлено, що мевінолін і споріднені сполуки, які біосинтезувалися певними штамами різних со видів грибів, є конкурентними інгібіторами цього ферменту (Епдо, А, ей аїЇ. У. Апіібіоїйсв 29, 1346-1348 Кк (1976); Епао, А. егаІ., РЕВ5 І ей. 72, 323-326 (1976): Кио, С.Н. ега)!., У, Огу. Спет. 48,1991-1998 (1983)). 3о Правастатин також належить до родини інгібіторів НМО-СоА редуктази. Спочатку, правастатин був відкритий ее, як мінорний сечовий метаболіт компактину у собак (ТапаКа, М. еї аї., неопубліковано) під час метаболічних досліджень компактину (Агаї, М. ес аІ. Запкуо Кепкуизпо Метро, 40,1-38 (1988)).

Головною характерною властивістю правастатину як гідроксильованого продукту компактину є його тканинна /«ф селективність. Ці ліки сильно інгібують синтез стеринів в печінці й кишках, але слабо в інших органах. Є З перевагою, що правастатин має нижчу токсичність ніж інші інгібітори НМО-СоА редуктази. с Було опубліковано, що мікробне гідроксилювання компактину може бути виконано різними способами

Із» кількома штамами видів, що належать до різних родів грибів, ії штамами видів актиноміцет, які належать до родів Мосагаїа, Асіпотайдига і бігеріотусез, серед інших бігеріотусез гозеоспготодепез і Бігеріотусев сагрорпійив (Патент США Мо5179013, Патент США Мо4448979, Патент США Мо4346227, Патент США Мо4537859, 42 Патент Японії Мо58010572). б Проблемою використання грибів для одержання правастатину з компактину є те, що ці організми загалом не -І переносять високі концентрації компактину в рідкому культуральному середовищі, очевидно внаслідок його протигрибкової активності |Зегілаумла, М. ей аї.,, 9. Апііріоїсв 36, 887-891 (1983) Було виявлено, що в бо Зігеріотусез сагрорпіййз цитохром Р450 система необхідна для гідроксилювання компактину в правастатин сл 20 ІМаївиока, Т. еї а!., Еиг. У. Віоспет. 184, 707-713 (1989)). Складнощами генетичного модулювання здатності до гідроксилювання з використанням такого ферменту є те, що це є комплексом білків, а не одним білком.

Т» Дані дослідження були спрямовані на пошук штаму актиноміцетів, котрий синтезував би правастатин з солей кислої форми компактину з більшим виходом і з допомогою застосування більшої концентрації субстрату в біоперетворенні ніж ті, що є відомими з попередніх патентних заявок. 29 Під час скринінгу, в якому було використано приблизно 6000 актиноміцет, головним чином ізоляти з зібрань

ГФ) авторів, але також оригінальні штамами з міжнародних зібрань штамів, п'ять Зігеріотусев і п'ять

Місготопогзрога були відібрані для подальших досліджень, тому, що вони виявились здатними гідроксилювати о натрієву сіль кислої форми компактину в правастатин. Ці десять штамів актиноміцет, з котрих вісім штамів визначили таксономічно на рівні видів у лабораторії, де працюють автори, були такими: 60 Зігеріотусез міоіасеиз (згідно з Катргег еї а), 1991), штам Мо1/43.

Зігеріотусез госпеї (Вегдег еї аї, 1949; М/акзтап і І еспемаїіег. 1953), штам Мо1/41. зЗітеріотусезгев/5їотус/сив(І іпаепреїп,1952), штам Мо1/44.

Зігеріотусез вр., штам Мо1/28.

Зігеріотусез Іапайшв, (Гготтег, 1959), штам Мо1/16. бо Місготопозрога зр., штам МоІОК-Р з.

Місготопогзрога ригригеа (І цпедетапп і ВгодзКу, 1964), штам Мо ІЮОК-Ру.

Місготопозрога еспіпозрога (І цедетапп і Вгоазку. 1964), штам Мо ІЮОК-Рбв.

Місготопозрога тедатісеа (УУеїіпвіеїп еї аї, 1969), штам Мо ІЮОК-Рв.

Місготопозрога гозагіа (Ногап і Вгоазку, 1986), штам Мо ІОК-Р».

Нині немає жодних даних в літературі щодо здатності Місготопозрога перетворювати солі кислої форми компактину на правастатин, автори ретельно вивчили не лише цю певну ферментативну здатність, але також таксономічне положення цих вищезгаданих штамів Місготопозрога.

Таксономічне положення штамів ІОК-Р з, -Р; -Р 5, -Рв і-Р7 на рівні споріднення. 70 Усі ці штами утворювали добре розвинутий міцелій, що складався з розгалужених гіфів приблизно 0,4-0,7мкм в діаметрі. Повітряний міцелій відсутній або спостерігається лише в слідовій кількості. Нерухомі спори утворюються поодиноко на спорофорах. Гіфи субстратного міцелію є Грам-позитивними й не кислотостійкими.

Штами МеІОК Рі-Р7 є аеробними, хемо-органотропними й чутливими до рН нижче ніж 6,0. Стінки містять мезо-діамінопімелову кислоту. Вищезгадані діагностичні властивості - як ключові - явно показують, що ці 7/5 Моноспорні штами актиноміцет є типовими членами роду Місготопозрога.

Таксономічний опис Місготопозрога зр. штаму Мо1ОБ-Рз.

Мікроморфологічні властивості: субстратний міцелій складається з добре розвинутих, скоріше викривлених, ніж прямих, моноподно розгалужених філаментів. Спори на спорофорах є одинокими, сферичними близько 1,в6мкм у діаметрі й поширені приблизно рівномірно на гіфальних філаментах. Спори є або сидячими, або на 2о Кінцях коротких спорофор. У бульйонних культурах спори не спостерігалися на гіфах очевидно тому, що вивільнення зрілих спор є дуже швидким.

Культурно-макроморфологічні властивості:

Чапек-цукрозний агар: середній ріст, колонії мають червоне забарвлення, вкриті крапкоподібними чорними зонами спорилювання. с

Глюкоза-аспарагіновий агар: ріст записували як крапкоподібні й збільшені, червонувато-коричневі або чорні колонії. Червонуваті дифузні пігменти. і)

Поживний агар: задовільний ріст, збільшені, червонувато-коричневі або /- чорні колонії.

Червонувато-коричневий екзопігмент у середовищі.

Солодовий дріжджовий екстрактний агар (ІЗР Меа.2): добре розвинуті, збільшені й зморщені, коричневі «Е

Зо Колонії, вкриті частково чорними зонами спорулювання або "псевдо-повітряним міцелієм" (що з'являються як обмежений білуватий або сіруватий пушок). Коричнювато або коричнювато-червоний розчинний пігмент. о

Неорганічна сіль-кукурудзяний агар (ЗР Меа.4): середній ріст червонувато-коричневих збільшених і со зморщених колоній. Світло-червонуватий розчинний пігмент.

Гліцерин-аспарагіновий агар (ІЗР Меа.5): ріст лише як сліди, сіро-білого або світло-оранжевого ї- забарвлення, плоскі колонії, світло-рожевий розчинний пігмент. «о

Використання джерела вуглецю: хороший ріст на позитивне використання І-арабінози, О-галактози,

О-фруктози, ЮО-глюкози, ЮО-ксилози, лактози, мелібіози, цукрози, О-манітолу, дульцитолу, гліцерину й інозитолу.

Ріст з І -ламнозою, О-рафінозою й інуліном було дещо кращим, ніж у негативному контрольному середовищі.

Використання джерела азоту: задовільний ріст з дріжджовим екстрактом і М2-Аміном, без використання або « незначне додавання мамо». з с Інші фізіологічно-біохімічні властивості: целюлоза й крохмаль гідролізуються, молоко перетравлюється дуже сильно. Тест на відновлення нітратів - негативний. Жодного росту на картопляних зрізах без карбонату кальцію ;» (рН 5,8-6,0). Жодного утворення меланоїдного пігменту.

Цей штам МоІ0К-Рз Місготопогрога зр. виділяли із зразка бруду озера Ваїаюп (Угорщина).

Систематичне положення: подальші порівняльні систематичні дослідження були б необхідними для б визначення точного таксономічного положення цього штаму серед видів роду Місготопозрога. На основі певних властивостей видається неможливим, щоб штам ІОК-Рз представляв нові види в межах роду Місготопозрога. ш- Диференційно-діагностичний опис і визначення штамів Місготоповзрога ІЮОК-Ру, -Рв, -Рв і-Р7

Го! Штам ІОК-Р.А

На вищезгаданих діагностичних середовищах, загалом, хороший ріст, помаранчеві до о помаранчево-червоного, червоні, інколи жовтуваті або рожеві колонії. Розчинні пігменти й повітряний міцелій ї» не утворюється. Кількість поодиноких спор є досить низькою. Вони зустрічаються на кінцях спорофор.

Субстратний міцелій складається з добре розгалужених гіфів. Повітряний міцелій відсутній. Немає росту на

О-мелібіозі, рафінозі, манітолі, гліцерині, лактозі, І-рамнозі але хороший ріст на ОЮ-арабінозі, глюкозі, дв О-ксилозі й слабкий ріст на О-галактозі і О-фруктозі. На основі цих загальноприйнятих діагностичних властивостях автори визначали цей штам як член видів Місготопозрога ригригеа (І цедетаптп і ВгоадзкКу, 1964).

Ф) Штам ІОВ-Р5 ка Цей штам утворює головним чином поодинокі спорофори й сферичні темно-коричневі до чорних спори (0,8-1,5мкм у діаметрі), котрі міцно прилипають до спорофор і таким чином дозрівають. Згідно з бо електронно-мікроскопічними спостереженнями авторів, на поверхні цих спор можна побачити бородавчаті структури або вирости ("тупі колючки" згідно з МоіІ.4 Вегдеуз Мапица! ої Бузі. Васі. 1989, сс.2448), котрі є дуже характерними для спор Місготопозрога еспіпозрога. Отже, культурноморфологічні й фізіологічно діагностичні властивості цього штаму є також дуже подібними до М, еспіпозрога. Колір добре розвинутих колоній стандартних діагностичних середовищ є помаранчево-коричневим або темно-пурпурним. Спороутворюючий шар 65 8 чорним або пурпурно-чорним, восковим. Повітряний міцелій відсутній. Пігмент меланін не утворюється. Молоко перетравлюється. Хороший ріст на ЮО-ксилозі, О-арабінозі, О-глюкозі й цукрозі, але росту немає з І-рамнозою,

рафінозою, О-галактозою, Ю-фруктозою, ЮО-мелібіозою та гліцерином. Ми вважаємо цей штам як типовий член

Місготопозрога еспіпозрога.

Штам ІОК-Ре

На більшості діагностичних середовищ помірний до слабкого ріст. Помаранчеві або помаранчево-червоні колонії складаються з довгих розгалужених філаментів (приблизно О,бмкм у діаметрі) і обмеженої кількості поодиноких, сферичних, темнозабарвлених спор (0,6-1,О0мкм у діаметрі). Не утворює повітряного міцелію. У певних середовищах утворюються світло--ервоні або рожеві розчинні пігменти. На тирозиновому агарі меланоїдні пігменти не утворюються. На базальному середовищі для цього штаму використовувались такі /о джерела вуглецю: О-ксилоза й О-фруктоза; лише слабо: Ю-мелібіоза, манітол і галактоза, але жодного або спорадичного росту не спостерігали з гліцерином, І -рамнозою, лактозою й рафінозою (див. також Каул"атоїйо, І. еї а: Адгіс. Віої. Спет., 47, 203-215, 1983). Штам МоІОК-Ро виявив значну подібність до видів Місготопозрога гпедаіютісеа, (УУеіпзівїп, 1972) і автори вважають його членом цього виду.

Штам ІОК-Р;

Хороший до помірного ріст на агарі Веппей, Сларек цукрозному агарі, глюкоза-аспарагіновому агарі, поживному агарі, агарі на вівсяному борошні, картопляно-декстрозному агарі тощо. Колір пігментів вегетативного міцелію має діапазон від червонувато-коричневого до блідувато-коричневого. На певних середовищах утворюються винно-червоні дифузійні пігменти. На поверхні колоній часто утворюються чорні крапки. Вегетативні гіфи (середній діаметер О,5мкм) інтенсивно розгалужені. Спори (1,4-1,7мкм у діаметрі) го утворюються поодиноко, у положенні "сидячі" або на коротких спорофорах, і зустрічаються вздовж довжини гіфів. Ріст і споруляція відкритого мережевого типу | цедетапп. Для цих штамів використовуються такі сполуки як єдине джерело вуглецю в середовищі: О-глюкоза, лактоза, ЮО-манітол, І-рамноза, цукроза й О-ксилоза.

Дульцитол, гліцерин, О-мелібіоза й Ю-рафіноза не використовуються. Автори визначили штам МоІОК-Р 7 як типовий член Місготопозрога гозагіа (Ногап і ВгодзКу, 1986). сч

Вищенаведені штами Місготопозрога було внесено до Національної колекції сільськогосподарських та промислових мікроорганізмів (МСАІ!М), Будапешт, Угорщина, під нижченаведеними числовими позначеннями: і)

Місготопозрога зр. ІЮОК-Рз МСАЇМ (Р) В 001 268

Місготопозрога ригригеа ІЮОК-Р; МСАЇМ (Р) В 001271

Місготопозрога еспіпозрога зр. еспіпозрога ІОК-Р5 МСАЇ!ЇМ (Р) В 001272 «г зо Місготопозрога тедаотісеа зр. підга ІПК-Ре МСА!ЇМ (Р) В 001273

Місготопозрога гозагіа ІОК-Р7 МСАЇМ (Р) В 001274 о

Виходячи з вищезгаданого винахід стосується нового мікробного процесу для одержання правастатину со формули (І) ча ш

Й (Се) на "Ж ги щі « ча З - с ;» () зі сполуки загальної формули (І), (22) -І со ів) с 50 с»

ІФ) де К може бути лужним металом або іоном амонію, іме) за допомогою зануреного культивування штаму, котрий здатний 6В-гідроксилювати сполуку формули (Ії) шляхом аеробного ферментування, виділення та очищення сполуки формули (І), яка утворилася в процесі 60 біоперетворення, що включає в себе такі етапи: а) культивування штаму виду, що належить до роду Місготопозрога, котрий здатний бр-гідроксилювати сполуку формули (Ії), де К - як визначено вище - на поживному середовищі, що містить здатні засвоюватися при 25-327"С вуглець, джерела азоту й мінеральні солі; б) харчування субстратом, який перетворюється на культури, що розвиваються; 65 в) гідроксилювання субстрату до кінця біоконверсії; г) відокремлення сполуки формули (І) з рідкого середовища культури, у разі потреби очищення сполуки.

Об'єм винаходу стосується диких штамів і будь-яких видів мутантів, що належать до роду Місготопозрога, котрі здатні гідроксилювати натрієву сіль кислотної форми компактину в правастатин.

Згідно з кращим втіленням цього винаходу правастатин утворюється за допомогою штаму Місготопогзрога, вибраного з такої групи: Місготопозрога зр. ІОК-Рз (ІМСАТМ (Р) В 001268) Місготопозрога ригригеа ІЮК-Р

ІМСАЇМ (Р) В 001271), Місготопозрога еспіпозрога ІЮОК-Р5 |МСАІМ(Р) В 0012721, Місготопозрога тедаіотісеа

ІоОК-Ре ІМСАЇМ (Р) В 001273) і Місготопозрога гозагіа ІОК-Р7 |(МСАЇМ (Р) В 001274).

Згідно з найкращим втіленням винаходу правастатин утворюється штамом Місготопозрога зр. ІЮК-Р з

ІМСА!М (Р) В 0012681). 70 Цей винахід може бути здійснений шляхом ферментування іп зіш, де гідроксилювання відбувається за участю активно зростаючої культури Місготопозрога.

Гідроксилювання можна проводити за допомогою струшування для культур, що зростають в колбах для струшування, або шляхом аерування й струшування у ферментерах, коли сполуку формули (Ії) додають до культур, які зростають. У таких випадках може бути використаний агент, що запобігає піноутворенню. 75 Відповідної густини культури цього штаму досягають, використовуючи придатне середовище, що містить доступний вуглець, джерела азоту, неорганічні солі, а також слідові елементи.

Наприклад, глюкоза, гліцерин, декстрин, крохмаль, рамноза, ксилоза, цукроза й розчинний крохмаль виявляють здатність засвоюватися як джерела вуглецю, а соєве борошно, кукурудзяний екстракт, пептон, дріжджовий екстракт, м'ясний екстракт, цитрат амонію й сульфат амонію як придатні джерела азоту. Неорганічні солі, такі як карбонат кальцію, фосфати натрію, фосфати калію та подібні, можуть бути додані до культурального середовища. Кращими середовищами для росту цього вибраного штаму є ті, що описані в прикладах.

Біоперетворення компактину на правастатин може бути здійснено різними способами ферментування, наприклад, культивуванням культури клітин, культивуванням з підживленням культури. Перевага віддається, с якщо використовується культура, занурена та перемішана в рідині. Краща температура становить приблизно 25-37"С, найкраще, якщо приблизно 25- 3276. і)

Перевага віддається, якщо рН становить приблизно 6,0-9,0, найкраще, якщо приблизно 7,0-8,5. Кращими умовами струшування визнано приблизно 200-400 обертів/хвилину, найкраще, якщо приблизно 250 обертів/хвилину. «Е зо У винаході запропоновано спосіб перетворення кислої натрієвої солі компактину на правастатин. Кисла натрієва сіль компактину може бути використана в цьому винаході у будь-яких концентраціях, що забезпечать юю утворення правастатину. Краще, якщо концентрації компактину становлять 0,1-1Ог/літер, ще краще, якщо со приблизно 0,3-3,Ог/літер.

Винахід покриває будь-який відсоток перетворення компактину в правастатин штамами Місготопогзрога згрр., - щонайменше 3095 і найкраще, якщо щонайменше приблизно 90905. «о

В процесі ферментації склад рідкого культурального середовища контролюється шляхом рідинної хроматографії високої роздільної здатності (НРІ С). Згідно зі способом НРІС зразок рідкого культурального середовища розводять у подвійному метанолі, центрифугують і супернатант використовується для аналізу.

Параметри НРІС системи, що використовували для аналізу, такі: обладнання "МУай(еге апаїуйіса! НРІС", « завантаження колонки: МУамеге Момараск Ся бмкм; вимірювання при 237нм; об'єм ін'єкції ТОмкл; швидкість з с потоку 0,6-0,бмл/хв лінійного градієнту; використовується елююванні градієнтами, елюенти: розчинник

А:ацетонітрил -0,1М Ман»оРОо, у воді (25:75), розчинник В - ацетонітрил - вода (рН 2 з НЗзРО,) (70:30). ;» Параметри градієнтного елюювання:

Ф о 11110616 о 2141110 - 17081105 со пи с пи ПО ВОЄН 11108100

ФО лою с»

Час затримки: правастатин (Ма сіль) 10,бхв.; компактин (кисла Ма сіль) 19,5хв.; правастатин (форма лактону) 17,3хв., компактин (форма лактону) 23,5х8в.

Будь-який відомий спосіб може бути використаний для виділення правастатину, наприклад, екстракція-повторна екстракція, аніон-обмінна хроматографія, осадження. (Ф) Для виділення продукту з рідкого культурального середовища є перевагою те, що під час біоперетворення

Ге правастатин утворюється в його кислотній формі, таким чином, він може бути виділений з фільтрату рідкого культурального середовища його адсорбцією на аніон-обмінній хроматографічній колонці. Для виділення до продукту переважно використовують сильно основну аніон-обмінну смолу, котра є полістирол-дивінілбензоловим полімером, що несе активні групи четвертинного амонію, наприклад Юожех АЇ 400 (ОН-), Оожех 1х2 (ОН-), Оожех 2х4 (ОН-), амберлітові ІКМА 900 (0Н-) смоли. Продукт, адсорбований на іон-обмінній смолі, може бути елюйований з колонки водною оцтовою кислотою або хлоридом натрію, що містить суміш ацетон-вода, краще, якщо 195 хлоридом натрію, що містить суміш ацетон-вода (1:1). Правастатин, що містить фракції, змішують і ве ацетон в елюаті випаровують у вакуумі. рН концентрату доводять 1595 сірчаною кислотою в діапазоні 3,5-4,0 і окислений водний розчин екстрагують етилацетатом. З екстракту етилацетату правастатин може бути екстрагований 1/10 і 1/20 об'ємним співвідношенням 595 гідрокарбонату натрію або слабо лужною водою (рн 7,5-8,0). Було виявлено, що правастатин може бути виділений в чистій формі з одержаного вище лужного водного екстракту колонковою хроматографією на неіїонній адсорбційній смолі. Перевага віддається такому способу: спочатку етилацетат, розчинений у водній фазі видаляють дистилюванням у вакуумі з лужного водного екстракту й потім водний екстракт завантажують на колонку Оіаїп НР-20. Правастатин, адсорбований на колонці, очищають елююванням за допомогою водного ацетону, в якому вміст ацетону поступово підвищується, потім хроматографічні фракції, що містять правастатин як єдиний компонент, змішують і концентрують у вакуумі.

Концентрат очищують деревним вугіллям і ліофілізують, потім кристалізують з суміші етанол -етилацетат, 7/0 одержуючи правастатин, придатний для фармацевтичного застосування.

Після завершення біоперетворення правастатин може бути екстрагований або з ферментативного рідкого культурального середовища, або з фільтрату, одержаного після відокремлення маси міцелію. Останній може бути видалений шляхом фільтрування або центрифугування, проте перевага віддається, зокрема в промисловості, проводити в цілому екстракцію рідкого культурального середовища. Перед екстрагуванням рн 7/5 ферментативного рідкого культурального середовища або фільтрату рідкого культурального середовища доводили до 3,5-3,7 за допомогою мінеральної кислоти, переважно розведеною сірчаною кислотою. Екстракцію виконують за допомогою естеру оцтової кислоти за допомогою аліфатичного спирту, що містить 2-4 атомів вуглецю, переважно з етилацетатом або ізобутилацетатом. Етилацетатний екстракт промивали водою й висушували за допомогою безводного сульфату натрію. Потім з правастатину одержують лактонову похідну. 2о Замикання кільця лактону виконують у висушеному розчині етилацетату за кімнатної температури, під час безперервного перемішування, викликаючи утворення лактону каталітичною кількістю трифтороцтової кислоти.

Замикання кільця лактону перевіряють тонкошаровою хроматографією (ТІ С). Після завершення утворення лактону розчин етилацетату промивали спочатку 596 розчином водного гідрокарбонату натрію, потім водою, висушували за допомогою безводного сульфату натрію й випаровували у вакуумі. Залишок очищали колонковою с ов Ххроматографією з силікагелем, що використовували як суміші елюенту етилацетату - н-гексану, вміст етилацетату поступово збільшували. Правастатин одержують з лактону правастатину за допомогою гідролізу і) при кімнатній температурі в ацетоні з еквівалентною кількістю гідроксиду натрію. Після утворення натрієвої солі правастатину його осаджують за допомогою ацетону. Потім осад фільтрують і промивають ацетоном та н-гексаном й висушують у вакуумі, після чого кристалізують із суміші етанол -етилацетат. «г зо Було виявлено, що хроматографія на Зерпадех І Н-20 гелі є найкращою для очищення правастатину.

Застосовуючи цей спосіб, правастатин може бути одержаний з чистотою 99,595 (що вимірювали НРІ С). юю

У ході наших досліджень даний винахід було виявлено: со в екстракті органічного розчиннику, переважно в екстрактах етилацетату або ізобутилацетату рідкого культурального середовища, або у фільтраті рідкого культурального середовища штаму Місготопозрога зр. -

ІОК-Рз, котрий здатний до бВ-гідроксилювання сполуки загальної формули (Ії), правастатин може бути «о одержаний як кристалічна сіль з вторинними амінами. Далі було виявлено, що для утворення солі придатні кілька вторинних амінів, що містять алкіл-, циклоалкіл-, аралкіл- або арил-замісники.

Придатні нетоксичні вторинні аміни були відібрані серед, таких як наприклад, діоктиламін, дициклогексиламін, дибензиламін. Виділення проміжних речовин органічних вторинних солей аміну, наприклад, « дибензиламінова сіль, виконують додаванням дибензиламіну в 1,5 еквівалентній кількості щодо вмісту екстракту шву с правастатину, потім екстракт концентрують дистилюванням у вакуумі до 5905 його вихідного об'єму, потім ще одну . кількість дибензиламіну додають в концентрат в 0,2 еквівалентному співвідношенні. Кристалічну а дибензиламінову сіль осаджують з концентрату.

Кристалічний сирий продукт фільтрують і висушують у вакуумі, очищують деревним вугіллям в розчині

Метанолу або ацетону. Потім рекристалізацією очищеного продукту з ацетону може бути одержана

Ге» хроматографічно чиста дибензиламінова сіль правастатину.

Органічні вторинні амінові солі правастатину можуть бути перетворені в правастатин гідроксидом натрію або ш- алкоксидом натрію, краще, якщо етоксидом натрію.

Го! Виділення правастатину через проміжну речовину, вторинну змінну сіль, значно простіша процедура, ніж будь-яка з інших відомих процедур виділення. Під час процедури артефакти не утворюються, й відокремлення о правастатину від побічних продуктів біоперетворення та різних метаболічних продуктів, біосинтезованих ї» гідроксилюючим мікроорганізмом, може бути успішно вирішено.

Процес згідно з винаходом наведений нижче у прикладах.

Приклад 1

Спори одержували з поверхні 7-10 добової культури штаму Місготопозрога зр. ІЮОК-Рз (МСА!М (Р) В 001268 в розчинному крохмалевому агарі (ЗМ) і суспендували в 5 мл стерильної дистильованої води. Цю суспензію

Ф) використовували для посіву в 100мл стерильного середовища в 50Омл колбі Егпептеуег. іме)

Бмст ем середовищяї й 65 в 1000мл дистильованої води рН середовища доводили до 7,0 перед стерилізацією, й суміш стерилізували при 1217С протягом 25 хвилин. й Вмсттісередовища |. в 1000 мл водопровідної води рН доводили до 7,0 перед стерилізацією й нагрівали при 1217С протягом 25 хвилин. 70 Культуру, що розвивається, перемішували на роторному шейкері (250 обертів/хвилину; і амплітуда: 2,5см) протягом З днів при 32"С, потім 5мл її аліквоти використовували для посіву в 10 колб ЕПептеуег 500мл об'єму кожна, що містить 100мл ТТ середовища, стерилізованого при 1217 протягом 25 хвилин.

Вміст ттсередовища з 2 в 1000 мл водопровідної води рН доводили до 7,0 перед тепловою стерилізацією.

Інкубацію проводили при 32"С протягом 72 годин, потім 5Омг кислої натрієвої солі компактину додавали до кожної колби в дистильованій воді, і культивування здійснювали протягом 96 годин. Швидкість перетворення с 29 кислої натрієвої солі компактину в правастатин, що вимірювали НРІ С, становила 8295. Го)

Після завершення ферментування культури об'єднували з одержаним спільним ферментативним рідким культуральним середовищем, що містило 41Омг правастатину, виділення останнього здійснювали таким чином: ферментативне рідке культуральне середовище центрифугували при 2500 обертів/хвилину протягом 20Охв.

Супернатант рідкого культурального середовища і масу міцелію відокремлювали, потім останній З ресуспендували в 250мл води, одержану суспензію перемішували протягом години й фільтрували. РН змішаних центрифугованого середовища й фільтрату доводили 1595 сірчаною кислотою до 4,0, потім кислотний фільтрат екстрагували ЗхЗООмл етилацетатом. Змішані екстракти етилацетату промивали ЗООмл води, висушували за со допомогою безводного сульфату натрію й концентрували у вакуумі до 100 мл об'єму. Потім правастатиновий /-Їч« лактон одержували з правастатину додаванням трифтороцтової кислоти в каталітичній кількості за кімнатної температури під час безперервного перемішування. Утворення лактону правастатину перевіряли за допомогою ї-о

ТІ. С: адсорбент: Кіезеїде! 60 Роб. ОС (Мегск) алюмінієва фольга; розчинник, що розвивається: суміш ацетон - бензол - оцтова кислота (50:50:1,5); виявлено: фосфомолібденовою кислотою. МК ; значення лактону правастатину становило 0,7. Після завершення утворення лактону етилацетат промивають 2х20мл 5905 водного « гідрокарбонату натрію, потім промивають 20мл води, висушують за допомогою безводного сульфату натрію й -о 70 випаровують у вакуумі. Одержували 0,5г залишку випаровування, котрий хроматографували на 10г колонці, що с містить Кіезеіде! б6О адсорбент (діаметр колонки: 1,2см, висота адсорбенту: 17см). Для елюювання з використовували суміші етилацетат - н-гексан, у якому вміст етилацетату поступово збільшували. Лактон правастатину елюювали з колонки сумішшю бОбо етилацетат - 4095 н-гексан. Фракції, що містять лактон правастатину змішували й випаровували у вакуумі. Одержаний залишок, котрий містив 23Омг лактону б» 395 правастатину, розчиняли в 5мл ацетону, потім під час перемішування 11Омоль 95 гідроксиду натрію, додавали в 1М розчин етанолу. Розчин перемішували протягом З0 хвилин за кімнатної температури. Потім, розчин - І концентрували до 2мл об'єму і 4мл ацетону додавали до концентрату. Суміш підтримували при 5"С протягом со ночі. Осад фільтрували, промивали 2мл ацетону й потім 2мл н-гексану й висушували у вакуумі за кімнатної температури. Сирий правастатин, що утворився, розчиняли в етанолі, очищували деревним вугіллям, потім (9) 50 кристалізували з суміші етанол - етилацетат. Таким чином одержували 17Омг правастатину.

ЧТ» Точка плавлення 170-1737С (декомп.) Іво - н1567 (с - 0,5, у воді).

Спектр УФ-поглинання (20мкг/мл, в метанолі): Хтлах-291, 237, 245 нм (Подр-4,263; 4,311; 4,136), Спектр

ІЧ-поглинання (КВг): «ОН 3415, УСН 2965, УС-О 1730, /«СОО-1575см7.

ТН-ЯМР спектр (020, 5, млн"): 0,86, 4, ЗН (2-СНз); 5,92, да, - 10,0 і 5,4 Гц, 1Н (3-Н); 5,99, й, у -

ГФ) 10,0 Гц, 1Н (4-Н); 5,52, Бг, 1Н (5-Н); 4,24, т, 1Н (6-Н); 5,34, Бг, 1Н (8-Н); 4,06, т, 1Н (В-Н), 3,65, т, 1Н (5-Н); 1,05, юю а, зн (2-СНу); 0,82, ЬЗН (4-Н»). 1ЗС-ЯМР спектр (020, 5, млн"): 15,3, д (2-СНз); 139,5, й (С-3); 129,5, а (С-4); 138,1, в (С-4а); 127,7, 4 во (С-5); 66,6, а (0-6); 70,1, а (С-8); 182,6, 8(СО00-); 72,6, а (С- В); 73,0, а (С-5); 182,0, в (0-1); 18,8, да (2-СН»У); 13,7, а (0-4).

Позитивний ЕАВ мас-спектр (характерні іони): ІМ-Ма)" 469; МАНІ" 447.

Негативний РАВ мас-спектр (характерні іони): (М-НІ 445, М-Маї 423, м/з 101 |2-метил-масляної кислоти-НІ.

Приклад 2 65 У 10 ЕпПептеуег 50О0мл колб, кожна з яких містить Т0О0мл МТ 4 середовища для перетворення, висіяли культури, одержані, як описано в Прикладі 1, потім інкубували при 28"С протягом 96 годин, 5Омг кислої натрієвої солі компактину додавали до кожної колби в дистильованій воді, потім гідроксилювання здійснювали протягом 72 годин, в той час як інші 50-Б60мг субстрату додавали до культур у дистильованій воді й ферментування продовжували протягом 72 годин. - й о в 1000 мл водопровідної води рН середовища для біоперетворення доводили до 7,0 перед стерилізацією. Суміш стерилізували при 1217С протягом 25 хвилин.

Після завершення періоду біоперетворення культури об'єднували й правастатин виділяли з об'єднаного рідкого середовища згідно з описаною нижче процедурою:

Об'єднане рідке середовище, що містить 750мг правастатину згідно з НРІ С аналізом центрифугували за 2500 обертів/хвилину протягом 20хв. Відокремлену масу міцелію перемішували з 250мл води протягом години, потім фільтрували. Центрифуговане середовище й фільтрат змішували, рН розчину, що утворився, доводили до значення 3,5-4,0 1595 сірчаною кислотою, потім розчин екстрагували ЗхЗООмл етилацетату. Потім 150моль 90 дибензиламіну, перевіреного на кількість вмісту правастатину, додавали до етилацетатного екстракту.

Етилацетатний екстракт випаровували до приблизно ЗОмл об'єму й суспензію тримали протягом ночі при 0-570. сч

Осаджену дибензиламінову сіль правастатинової кислоти фільтрували й промивали на фільтрі охолодженим етилацетатом і н-гексаном, після чого висушували у вакуумі В ЗЗмл ацетону розчиняли 1,1г сирої о) дибензиламінової солі правастатинової кислоти й при 62-667С температурі, а розчин очищали 0,1г деревного вугілля протягом 30 хвилин. Потім деревне вугілля видаляли за допомогою фільтрування з розчину. Кристали осаджені з очищеного розчину, розчиняли знову за вищевказаної температури, потім розчин тримали при 5'С « зо протягом ночі. Осад фільтрували, промивали охолодженим ацетоном та н-гексаном і висушували у вакуумі.

Одержану дибензиламінову сіль правастатинової кислоти й (0,7г) суспендували в 1Омл етанолу, потім Я1О0моль М) до гідроксиду натрію додавали до розчину, вливаючи 1М водний розчин. Лужний розчин перемішували протягом с

ЗО хвилин за кімнатної температури. Після завершення утворення натрієвої солі додавали ЗОмл води й рН розчину нейтралізували, потім етанол дистилювали у вакуумі. Водний концентрат хроматографували на колонці, /ї- заповненій 5Омл смоли Оіаїоп НР 20 (діаметер колонки: 1,5см, висота смоли колонки: 28см). Колонку елюювали «о за допомогою сумішей ацетон-деіонізована вода, де концентрацію ацетону підвищували на 595. Правастатин елюювали з колонки 1595 ацетоном, що містив суміш ацетон-деіонізована вода. Фракції перевіряли у спосіб ТІ С, наведений в Прикладі 1. Значення К; правастатину становило 0,5. Фракції, що містили правастатин, змішували, й вміст ацетону випаровували у вакуумі. Ліофілізацією водного залишку одержували З9Омг хроматографічно « 70 Чистого правастатину. з с Приклад З

У лабораторному ферментері стерилізували 4,5 літри ТТ/2 середовища при 1217С протягом 45 хвилин і :з» висівали 50Омл культури, що росте в умовах струшування, одержаної, як описано в Прикладі 1, потім інкубували при 32"С, аерували 250л стерильного повітря/годину й перемішували за допомогою плоского перемішувача при

З00 обертів/хвилину. Інкубацію продовжували протягом 72 годин, і 2,5г натрієвої солі компактинової кислоти

ФО додавали до культури. Після 48 години біоперетворення компактин як субстрат повністю поглинався з ферментативного рідкого культурального середовища, потім 2,5г кислої натрієвої солі компактину знову і додавали в культуру. Друга доза компактину споживалася протягом 24 годин. Швидкість перетворення натрієвої со солі компактинової кислоти в правастатин становила приблизно 9095 в процесі біоперетворення.

Фо їх 8 о ю 60 У 4500 мл водопровідної води

Приклад 4

У лабораторному ферментері стерилізували 4,5 літри ТТ/1 середовища для ферментування при 12170 протягом 45 хвилин і висівали 500мл культури, що росте в умовах струшування, одержаної, як описано в

Прикладі 1, потім інкубували при 28"С, аерували 200л стерильного повітря/годину й перемішували за допомогою 65 / плоского перемішувана при 400 обертів/хвилину.

ох о

У 4500 мл водопровідної води

РН середовища для біопертворення доводили до 7,0 перед стерилізацією.

Культивування продовжували при 287"С протягом 96 годин. За цей час 2,5г натрієвої солі компактинової 75 Кислоти додавали в стерильному фільтрованому водному розчині до культури. На п'ятий день ферментування натрієва сіль компактинової кислоти повністю поглиналася ферментативним рідким культуральним середовищем. Потім субстрат додавали наступні З дні частинами по 2,5г/день. Кисла натрієва сіль компактину як субстрат поступово споживалася протягом чотирьох днів і перетворювалась повністю в правастатин. Згідно з результатами НРІС досліджень наприкінці ферментування з 10г компактину як субстрату утворювалось 9г правастатину.

Після завершення біоперетворення правастатин, що утворився в концентрації 180Опг/мл, виділяли таким чином: при 2500 обертів/хвилину протягом 20хв. центрифугували 5 літрів культурального середовища. Потім 2 літри води додавали до відокремленої маси міцелію й суспензію перемішували протягом години й фільтрували. Цідва су Ффільтрати об'єднували й пропускали зі швидкості потоку 50О0мл/годину через колонку, що містить З00бг (540мл)

Бомжех АЇ 400 (ОН") смоли (діаметер колонки: 4см, висота смоли: 4Зсм), потім смолу промивали 1л деіонізованої о води. Потім колонку елюювали ї1л суміші ацетон-вода (1:11), що містить 10г хлориду натрію, збираючи 5Омл фракції. Фракції перевіряли у ТІ С спосіб, наведений в Прикладі 1. Фракції, що містили продукт, змішували й ацетон віддистильовували у вакуумі. РН концентрату доводили до значення 3,5-4,0 1590 сірчаною кислотою, «І потім екстрагували Зх250мл етилацетату. До змішаного екстракту етилацетату додавали 40мл деіонізованої води, потім рН доводили до значення 7,5-8,0 1М гідроксидом натрію. Після 15хв. перемішування водну і о етилацетатні фази відокремлювали, потім розчин етилацетату екстрагували 2х40мл деіонізованої води, якбуло о описано вище. Потім змішаний лужний водний розчин концентрували до 5Омл об'єму й хроматографували на колонці, заповненій неіонною адсорбентною смолою бООмл Оіап НР2О (Міїзирізпі Со., Японія) (діаметер в

Колонки: З,8см, висота смоли: 53см). Колонку промивали бООмл деіонізованої води, потім елюювали за «о допомогою сумішей ацетон-деіонізована вода, де концентрації ацетону підвищували по 595, збираючи 50мл фракції. Елюат аналізували у ТІ С спосіб, наведений в Прикладі 1. Правастатин елюювали з колонки сумішшю ацетон-деіонізована вода, що містить 1595 ацетону. Фракції, що містять правастатин як одиничний компонент, змішували й розчин концентрували у вакуумі до 15О0мл об'єму. Потім 0,бг деревного вугілля додавали до « концентрованого водного розчину, й правастатин очищали за кімнатної температури протягом 1 години. Потім й) с фільтрували деревинне вугілля, й фільтрат ліофілізували. 6,5г ліофілізованого правастатину, що утворився, й кристалізували двічі з суміші етанолу й етилацетату. Осад фільтрували, промивали 20мл етилацетату і 20мл "» н-гексану й висушували у вакуумі за кімнатної температури. Таким чином одержали 4,6бг хроматографічно чистого правастатину.

Приклад 5

Ге») Спорову суспензію одержували з 5 мл стерильної дистильованої води з поверхні 10-добової культури, - розчиненої в кукурудзяному агарі, як описано в Прикладі 1, штаму Місготопозрога еспіпозрога в5р, еспіпозрога

ІОК-Р;5 (МСАЇМ (Р) В 0012721, здатного до 6В-гідроксилювання кислої натрієвої солі компактину, і одержану о спорову суспензію використовували для посіву 100мл середовища ТІ, стерилізованого в 50Омл Егпептеуег колбі.

Вміст середовища ТІ було також описано в Прикладі 1. Посаджене середовище струшували на роторному і-й шейкері (250 обертів/хвилину, 2,5см амплітуда) протягом З днів при 28"С, потім бмл аліквоти культури

ГТ» переносили до 100-100мл біоконверсійного середовища ТТ/1 стерилізованого в БООмл Егпіептеуег колбі протягом 2 хв. при 1217С. Вміст середовища ТТ/1 описано в Прикладі 4. Колби струшували на роторному шейкері (250 обертів/хвилину, 2,5см амплітуда) протягом З днів при 25"С, потім 10-10мг компактину як субстрату (кисла натрієва сіль компактину) додавали в стерильному фільтрованому водному розчині в культуру, потім ферментування продовжували протягом 168 годин. іФ) Наприкінці біоперетворення вміст правастатину ферментативного рідкого культурального середовища ко визначали у НРІ С спосіб. За цей час середня концентрація правастатину становила 4Омкг/мл.

Приклад 6 во Ферментування, подача субстрату та біоперетворення здійснювали зі штамом ІОБ-Р в, (МСА!ЇМ (Р) В 001273)

Місготопозрога тедаІотісеа звр. підга, як було описано в Прикладі 5. Вміст правастатину ферментативного рідкого культурального середовища визначали у спосіб НРІ С. Наприкінці біоперетворення вміст правастатину рідкого культурального середовища становив 5Омкг/мл.

Приклад 7 65 5мл аліквоти засівної культури штаму ІЮК-Р.; (МСАЇМ (Р) В 0012711 Місготопозрога ригригеа, одержаного, як описано в Прикладі 1, використовували для висівання 100-100мл ТТ/14 середовища, що міститься в 500мл

Епептеуег колбах, й стерилізованого протягом 25 хвилин при 1212С. ; й .

У 1000мл водопровідної води рН середовища для біоперетворення доводили до 7,0 перед стерилізацією.

Колби струшували на роторному шейкері (250 обертів/хвилину, 2,5см амплітуда) протягом З днів. Подачу субстрату, біоперетворення й визначення вмісту правастатину здійснювали, як описано в Прикладі 5. Наприкінці /5 перетворення вміст правастатину ферментативного рідкого культурального середовища становив 4Омкг/мл.

Приклад 8

Ферментування, подачу субстрату й перетворення виконували зі штамом ІОК-Р 7, |МСАІМ (Р) В 001274)

Місготопозрога гозагіа, як було описано в Прикладі 1. Наприкінці біоперетворення З5Омкг/мл правастатину вимірювали у ферментативному рідкому культуральному середовищі у спосіб НРІ С.

Claims (1)

1. Формула винаходу

   1. Мікробний спосіб одержання сполуки формули (І) сч он марос-та тя о т ; НО. в 1 ЩО яд, "Н вс | под Ф ч І СНз : СН» ІФ) ще со Я: З НО 5 4 їм- зі сполуки загальної формули (ІЇ) Ге) всос с но « -- "н (0) З Фо ен й СН. В СНа и? о 45 де К може бути лужним металом або іоном амонію, за допомогою зануреної культури штаму Місготопозрога, котрий здатний 60 -гідроксилювати сполуку це. формули (Ії) за аеробних умов і шляхом виділення й очищення сполуки формули (І), яка утворилася під час Го) біоперетворення, що включає в себе етапи культивування штаму Місготопозрога, котрий с 50 здатний 68 -гідроксилювати сполуку формули (І), де В може бути лужним металом або іоном амонію, при І» 25-32" на поживному середовищі, що містить доступні джерела вуглецю й азоту, а також мінеральні солі, потім поглинання субстрату, що підлягає перетворенню в культурі, що росте, потім гідроксилювання субстрату до кінця біоперетворення, потім відокремлення сполуки формули (І) з рідкого середовища культури і, у разі потреби, очищення сполуки. 99 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що застосовують штам Місготопозрога зр. ІЮК-Рз, що ГФ) зберігається в Національній колекції сільськогосподарських та промислових мікроорганізмів, Будапешт, юю Угорщина, під номером МСАЇМ (Р) В 001268, або його мутантний штам, котрий здатний 6 -гідроксилювати сполуку загальної формули (ІЇ). во З. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що застосовують штам Місготопозрога ригригеа ІОК-Ру/, що зберігається в Національній колекції сільськогосподарських та промислових мікроорганізмів, Будапешт, Угорщина, під номером МСАЇМ (Р) В 001271, або його мутантний штам, котрий здатний 6 -гідроксилювати сполуку загальної формули (ІЇ).

   4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що застосовують штам Місготопозрога еспіпозрога ззр. есптозрога бо |ОБ-Р5, що зберігається в Національній колекції сільськогосподарських та промислових мікроорганізмів,

   Будапешт, Угорщина, під номером МСАЇМ (Р) В 001272, або його мутантний штам, котрий здатний 90 -гідроксилювати сполуку загальної формули (Ії).

   5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що застосовують штам Місготопозрога тедаІотісеа зр. підга 2 ІОК-Ре, що зберігається в Національній колекції сільськогосподарських та промислових мікроорганізмів, Будапешт, Угорщина, під номером МСАЇМ (Р) В 001273, або його мутантний штам, котрий здатний 50 -гідроксилювати сполуку загальної формули (І).

   6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що застосовують штам Місготопозрога гозага ІЮК-Р7, що 70 Зберігається в Національній колекції сільськогосподарських та промислових мікроорганізмів, Будапешт, Угорщина, під номером МСАЇМ (Р) В 001274, або його мутантний штам, котрий здатний 60 -гідроксилювати сполуку загальної формули (ІЇ).

   7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що сполука формули (І), що утворилася під час ферментування, виділяється з рідкого середовища культури адсорбцією на аніонній іонообмінній смолі або екстракцією за допомогою водорозчинного органічного розчинника, після чого одержують його лактонову похідну або його вторинну амонійну сіль як інтермедіат, або очищенням лужного водного екстракту, одержаного з екстракту органічного розчинника ферментативного рідкого культурального середовища з допомогою хроматографії на неіонній адсорбційній смолі. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2004, М 7, 15.07.2004. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) « ів) (ее) ї- (Се) -

   с . и? (о) -І (ее) 1 с» іме) 60 б5