WO1996022309A1 - Anti-tpo monoclonal antibody - Google Patents

Description

抗 T P 0 モ ノ ク 口 ー ナ ル抗体 発明の背景

発明の技術分野

本発明 は、 T P O の検出、 精製、 ま た は定量に 有用 な抗 T P

0 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 に 関す る

従来技術の 開示

ヒ ト T P O ( t r 0 Di b 0 p 0 i e t i n ) は 、 サ イ ト 力 イ ン の レ セ プ タ ー ス ー ノ 一 フ ァ ミ リ ー の ひ と つ で あ る M p 1 の リ ガ ン ド と し て ク ロ ー ニ ン グ さ れた タ ン パ ク 質であ る （ de Sauva geら 、 Na tu re (London) 369巻、 533 - 565 頁、 （1994)、 B a r t 1 e y, T. D. ら 、 Ce l l 77 巻、 1117-1124 頁、 （1994) ) 。 こ れ ら の M p 1 リ ガ ン ド は いずれ も 血小板減少症の動物 （ ヒ ト 、 マ ウ ス 、 ィ ヌ ） の血清や血漿中 に検出 さ れ、 巨核球形成や血小板形成への関与 が確認 さ れて い る。

血小板減少症の治療剤の 開発を念頭に お い て、 本出願人 も 、 ラ ッ ト 骨儺 よ り 高度 に純化 た 巨核球前駆細胞か ら の 巨核球生 成を促進す る 活性を指標 に し て、 血小板減少症の ラ ッ ト 血漿よ り ラ ッ ト T P O を精製 し 、 そ の部分ア ミ ノ 酸配列 に基づいて、 、j、 ト T P O c D N A 、 さ ら に は ヒ ト T P O c D N A を ク ロ ー ニ ン グ し 、 遺伝子組換え技術に よ っ て大量 に 均一な ヒ 卜 T P O を取得す る に 功 し た H. M i y a z a k i り 、 E x . H e m a t o

22巻、 8 頁、 （19 ) ) 。 本出願人が取得 に成功 し た こ の ヒ ト T P O は、 前述の ヒ 卜 M p 1 の リ ガ ン ド と し て取得 さ れた因子 と 同一の ァ ミ ノ 酸配列を有す る こ と が判明 し て い る （配列表 ： 配列番号 1 )

こ の よ う な状況下、 遺伝子組換え技術に よ っ て大量に均一 な ヒ ト T P O を取得 し 、 そ の製造 さ れた T P O の評価、 な ら びに 薬剤 と し ての 開発の た め に は、 T P O の侵れ た検出手段、 精製 手段、 お よ び定量法が必要 と さ れて い る 。

発明の概要

そ こ で、 本発明者は、 T P O に つ い て、 そ の検出、 精製、 ま た は定量に有用 な抗 T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を得 る べ く 研究 し た。 そ の結果、 大腸菌で産生 さ れ た変異型 ヒ ト T P O タ ン パ ク 質 （以下、 「 h 6 T ( 1- 163 ) 」 と い う 。 ） に よ り 免疫 さ れ た実験動物の抗体産生細胞 と ミ エ ロ ー マ細胞 と の ハ イ プ リ ド — マ が、 h 6 T ( 1 - 163 ) の み な ら ず、 C H O 細胞で発現 さ せ た 配列番号 1 に 示 さ れた ア ミ ノ 酸配列を有す る ヒ ト T P O タ ン パ ク 質 （以下、 「 C H O ( 1 - 332 ) 」 と い う 。 ） や 同 じ く C H O 細胞で発現 さ せ た配列番号 1 の 1 位か ら 1 6 3 位に相当す る ァ ミ ノ 酸配列 を 有す る ヒ ト T P O タ ン パ ク 質 （以下、 「 C H O

( 1-163 ) J と い ) 等を認繊す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を生 成 し 、 該モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体は そ の精製、 定量に 使用 す る こ がで き る こ と を見いだ し た

h 6 T ( 1- 163 ) は配列番号 1 に 示 さ れ る ヒ ト T P O の 1 位 か ら 1 6 3 位 に 相 当 す る ア ミ ノ 酸配列 に 対 し て 、 そ の 1 位、 及 び 3 位 の ァ ミ ノ 酸で あ る S e r 残基、 A 1 a 残基が そ れぞ れ A 1 a 残基 、 V a 1 残基 に 置換 さ れて お り 、 かつ N 末端 に M e t 残基 と L y s 残基が付加 さ れた ア ミ ノ 酸配列 （配列表 ： 配列番号 2 ) を有 し て い る 。 h 6 T ( 1-163 ) の製造方法につ い て は後述の実施例 1 に示 し た。

し たが っ て、 本発明 は ヒ ト T P O に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体を提供す る 。 ま た、 本発明 は、 ヒ ト T P O に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 い る ァ フ ィ 二 テ ィ 一 ク ロ マ ト グラ フ ィ 一 に よ り T P O 含有物質か ら T P O を単離す る こ と か ら な る T P O の精 製法を提供す る。 さ ら に、 本発明 は、 ヒ ト T P O に対す る モ ノ ク 口 ー ナ ル抗体を用 い る T P 0 の免疫化学的定量及び検出法を 提供す る

図面の簡単な説明

図 1 は、 C H O ( 1 - 163 ) 、 C H O ( 1 - 332 ) そ れぞれの添 加量に伴 う 450/570nm の吸光度変化を示す図 で あ る 。

図 2 は、 C H O ( 1 - 163 ) 、 C H O ( 1 - 332 ) 、 M K T ( 卜 163 ) 、 M K T ( 1 - 332 ) そ れ ぞれの含有量に伴 う 450/570nm の吸光度変化を示す図で あ る

図 3 は、 本発明モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の C H O ( 1 - 332 ) と 組 換え ヒ ト エ リ ス ロ ポ イ エ チ ン に対す る 反応性を 450/570 nm の吸 光度 に よ っ て比較 し た図で あ る 。

発明の詳細な説明

以下、 本発明を詳細 に説明す る 。

本発明の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体の製造は以下の と お り に 行 う 。

( 1 ) 免疫化動物細胞の調製

マ ウ ス 、 ラ ッ ト な ど を ヒ ト T P O で免疫 し て、 そ の動物か ら 脾細胞を調製す る 。 ヒ ト T P O は 、 例え ば、 組換え D N A 技術 を用 いて大腸菌で製造 し た も の （実施例 1 参照） を使用す る 。 免疫の方法は、 マ ウ ス 、 ラ ッ ト 、 ま た は ゥ サ ギの皮下あ る い は 静脈 内 あ る い は 腹腔内 あ る い は F o o t P a d に 、 適当 な ア ジ ュ バ ン ト と と も に ヒ ト T P 0 5 〜 1 0 O u g Z匹を投与す る 。 免疫は 1 回 ま た は適当 な 間隔で、 好 ま し く は 1 〜 2 週間隔 ( F o o t P a d の埸合 は 2 〜 3 日 間隔） で複数回繰 り 返 し 行 っ て も よ い。

免疫 し た動物の血清中の該抗原 に対す る 抗体価を測定 し 、 抗 体価が十分高 く な っ た動物を抗体産生細胞の ソ ー ス と し て用 い る が、 最終免疫後、 3 〜 4 日 後の動物由来の抗体産生細胞を用 い る こ と が好 ま し い。

こ こ で用 い る 抗体価の測定方法 と し て は、 放射性同位元素免 疫定量法 （ R I A ) 、 固相酵素免疫定量法 （ E L I S A 法） 等 種々 の公知技術を挙げ る こ と がで き る が、 本発明 に お いて は、 固相酵素免疫定量法を用 い た。

( 2 ) 骨 «腫細胞の調製

骨 «腫細胞 と し て は、 一般的 に は、 マ ウ ス 力、 ら 得 ら れた株化 細胞、 た と え ば、 8 — ァ ザ グァ ニ ン耐性マ ウ ス （ BALB/c由来） 骨 « 腫 細 胞 株 P 3 — X 6 3 A g 8 - U l ( P 3 - U l )

[ C u r r e n t t o i c s i n i c r o c i o l o g y a n d I mmu n o l o g y 81 1 - 7 (1978) ] 、 P 3 - N S I / 1 - A g 4 . 1 ( N S - 1 ) [ Eu r o P e a n J . I mm u n o l o g y 6 511 - 519 ( 1976 ) ] 、 S P 2 Z 0 — A g 1 4 ( S P - 2 ) [ N a t u r e 216 269 - 270 ( 1978) ] 、 P 3 - X 6 3 - A g 8 . 6 5 3 ( 6 5 3 ) [ J. I mmu n o l o y 123 1548 - 1550 ( 1979 ) ] 、 P 3 - X 6 3 - A g 8 ( X 6 3 ) [ Na t u r e 256

495 - 497 ( 1975 ) ] な ど を 用 い る こ と が好 ま し い 。 こ れ ら の 細胞 株 は 、 適 当 な 培地、 例 え ば 8 — ァ ザ グ ァ ニ ン 培地 [ R F M I - 1 6 4 0 培地 に グ ノレ 夕 ミ ン （ 1 . 5 m M ) 、 2 — メ ノレ カ プ ト ェ 夕 ノ ー ル （ 5 x 1 0 — ⁵ M ) 、 ジ ェ ン タ マ イ シ ン （ l O ju g / m l ) お よ び 牛 胎 児 血清 （ F C S ； 1 0 % ) を 加 え た 正 常 培 地 に 8 — ァ ザ グ ァ ニ ン を 加 え た 培 地 ] 、 I M D M [ I s c e M o d i f i e d D u l b e c c o ' s M e d i u m ] ま た は デ ュ ノレ べ 'ソ コ

( Du 1 b e c c o' s) M E M で 、 継代す る が、 細 胞 融合 の 3 〜 4 曰 前 に 正常培地 に 継代 し 、 融 合 当 日 2 x 1 0 ⁷ 以 上 の 細胞数 を 確保 す る 。

( 3 ) 細胞融合

( 1 ) で免疫 し た 動物 に 、 例 え ば、 マ ウ ス の 場 合 に は 、 5 〜 1 0 0 u g Z 匹 の ヒ ト T P O を 腹腔 内 投与 あ る い は 皮下投与 し ， 3 〜 4 曰 後 に 脾職 を 摘 出 し 、 脾钿胞 を 調製 す る 。 こ の 脾細胞 と ( 2 ) で 得 ら れ る 骨髄腫細胞 を 培養培地、 ま た は P B S で よ く 洗浄 し 、 細胞数 が脾細 胞 ： 骨髄腫細胞 = 5 〜 1 0 ： 1 程度 に な る よ う に混合 し 、 遠心分離に か け る 。 上清を捨て、 沈澱 し た钿 胞群を よ く ほ ぐ し た後、 3 7 て で撹拌 し な が ら ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル （ P E G : 分子量 1 0 0 0 〜 4 0 0 0 ) と D M E Mな どの培地 と の混液を 0 . 1 〜 1 . O m l 中の脾細胞数力、' 1 0 ⁸ 個 と な る よ う に 1 〜 2 分で撹拌 し な が ら 加え、 ひ き つ づ き 1 〜 2 分撹拌す る 。 撹拌後、 培地 l 〜 3 m l を 1 〜 3 分撹拌 し な が ら 加 え 、 更 に 7 〜 1 0 m 1 を ゆ つ く り 加え る 。 3 7 で 5 〜 1 0 分 間静 置 後、 遠心分離 に か け る 。 上澝 を す て F C S 添加 培地 に懸菊 し 、 遠心分離 に か け る 。 こ の操作を 2 〜 3 回行 う 。

FCS 添加培地を 5 0 〜 2 0 0 m 1 加え、 緩やか に細胞 を懸 » し こ の懸 ¾液を培養 プ レ ー 卜 に半容量 穴ずつ分注 し 、 3 〜 7 % C 0 2 イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中、 3 5 〜 3 8 で 1 0 〜 1 8 時間培 養す る 。 培養 プ レ ー ト に半容量 Z穴の H A T培地 （正常培地 に . ヒ ポ キ サ ン チ ン （ 1 0 —⁶〜 ： Ι Ο —^Μ ) 、 ア ミ ノ ブ テ リ ン 1 0 — ⁸ 〜 ： L 0 _⁷M ) 、 チ ミ ジ ン （ 1 0 — ⁶〜 ； L O -⁴M ) を加え た培地） を加え、 さ ら に 1 0 〜 3 0 時間培養す る 。 以後 1 〜 4 日 間 1 0 〜 3 0 時間 ご と に、 培養上淸半容量を捨て、 新た に 同量の H A T 培地 を 加 え 、 3 〜 7 % C 0 ₂ イ ン キ ュ ベ ー タ 一 中 、 3 5 〜 3 8 でで 1 0 〜 1 4 日 間培養す る 。 コ ロ ニ ー 状 に 生育 し て き た ハ イ プ リ ド ー マ の 認 め ら れ る 穴 に つ い て 、 上淸半容量 を 捨 て 、 H T 培地 （ H A T 培地 か ら ァ ミ ノ プ テ リ ン を 除 い た 培 地 ） を 同 量 加 え 、 以 後 ：！ 〜 3 日 間 1 0 〜 3 0 時間 目 ご と に H T 培地へ の 変換 を 行 う 。

H T 培地 で 3 〜 4 曰 培 養後 、 培 養上澝 の 一部 を と り 上記酵素 免 疫測 定法 に よ り 、 抗 T P O 抗体 の 抗体価 を 測 定 す る 。

上記枋 体価 の 測定 に よ り 、 特異 的抗体 を 産 生 す る こ と が 判 明 し た ハ イ プ リ ド ー マ を 、 別 の プ レ ー ト に 移 し 、 ク ロ ー ニ ン グ を 行 う 。 こ の ク ロ ー ニ ン グ方法 と し て は 、 限界 希釈 に よ り 1 穴 に 1 個 の ハ イ プ リ ド ー マ が含 ま れ る よ う に 希釈 し て ま き こ む 方法 钦寒 天培地上 に ま き こ む コ ロ ニ ー を 取 る 钦寒 天法、 マ イ ク ロ マ ニ ビ ュ レ ー タ ー に よ っ て 1 個 の 細胞 を 取 り 出 し ま き こ む方法、 セ ノレ ソ ー タ ー に よ っ て 1 個 の 細 胞 を 分離す る 「 ソ ー タ ー ク 口 — ン 」 等が挙 げ ら れ る が、 限界 希釈 法が簡便 で あ り 、 好 ま し い 。 抗体価 の 認 め ら れ た 穴 に つ い て 、 例 え ば 限 界 希釈法 に よ り ク 口 — ニ ン グ を 2 ~ 4 回繰 り 返 し 、 安定 し て 抗体価 の 認 め ら れ た も の を 抗 T P O 抗体産 生 ハ イ プ リ ド ー マ 株 と し て 選択 す る 。

( 4 ) モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 の 調製

( 3 ) で 得 た ハ イ プ リ ド ー マ は H T 培地 よ り 通常 の 培地 に 変 え て培養 さ れ る 。 大量培養 は、 大型培養瓶を用 い た 回転培養あ る い は ス ピ ナ一培養で行わ れ る 。 こ の大量培養 に お け る 上清に ゲル慮過な ど を行い 、 I g G 画分を集め精製す る こ と に よ り 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を得 る こ と がで き る 。

あ る い は 、 免疫 し た動物がマ ウ ス で あ れば、 そ れ と 同系統の マ ウ ス （例え ば、 B a 1 b / c , N u / N u ) の腹腔内 で増殖 さ せ る こ と も で き る の場合、 プ リ ス タ ン 処理 し た 4 〜 8 週 令の雌マ ウ ス に （ 3 ) で得 ら れた抗 T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 産生ハ イ プ リ ド ー マ細胞 4 x 1 0 ⁴ 〜 1 0 ⁷ 個 /匹を腹腔内注 射す る と 、 2 〜 3 週間後に は、 ハ イ プ リ ド ー マ は腹水癌化す る こ の マ ウ ス か ら 腹水を採取 し 、 遠心分離 し て固形分を除去後、 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 と し て ヒ ト T P O の検出、 精製、 ま た は定 量に使 う こ と がで き る 。 更 に精製が必要な場合は 、 上記遠心分 離上澄み液を D E A E — セ フ ァ ロ ー ス カ ラ ム 、 プ ロ テ イ ン A — セ フ ァ ロ ー ス カ ラ ム 等を用 い て、 I g G 画分を集め る 。

抗 体 の イ ソ タ イ プ 、 サ ブ ク ラ ス の 決 定 は ォ ク タ □ ニ ー

( u c t e r l ony ) 法 （免疫学実験入門、 生物化学実験法 1 5 学会出版セ ン タ ー刊、 7 4 頁、 1 9 8 1 年） や E I A 法に よ て行 う タ ン パ ク 質 の 定量 は 、 フ ォ ー リ ン ロ ウ リ ー 法 お よ び 2 8 0 nm で の 吸 光度 [ 1 . 4 ( 0 D ₂₈0 ) = ィ ム ノ グ ロ ブ リ ン l m g Z m l ] よ り 算 出 す る 。

以下 の 実施例 に 、 本発 明 の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗体 の 作成方法 を 示す が、 こ こ で 得 ら れ た ハ イ プ リ ド ー マ 株 L 3 及 び L 4 か ら 得 ら れ る モ ノ ク ロ ー ナ ノレ 抗体 （ 命 名 L 3 - 1 及 び L 4 - ) は そ れ ぞ れ G 2 a 、 I g G 2 b の サ ブ ク ラ ス に 属 す る こ と が判 明 し た

こ の よ う に し て 得 ら れ た モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 L 3 - 1 及 び し 4 の 抗原 特異性 は 以下 の 実施例 に 示 す と お り で あ る 本発 明 の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 は 、 ヒ ト T P O の 精製 · 単離 の た め の ァ フ ィ 二 テ ィ 一ク ロ マ ト グ ィ 一 法 に お け る リ ガ ン ド し て 用 い る が可能 で あ る の 尸' フ ィ ニ " ィ 一ク ロ マ 卜 ダ ラ フ ィ 一 に お い て 有 用 な 固 定 化 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 は 各 種 夕 ン パ ク 質 の 固 定 化 方 法 に 準 じ て 行 う こ と が で き 、 例 え ば

C N B r 活性化 セ フ ァ ロ ー ス — 4 B ( Pha rma c i a F i ne C h e m i c a 1 s社製） な ど の ゲ ル担体 や膜担体 を 使用 す る 方 法が利 用 で き る こ の 固定 化 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 用 い て 実 際 に ヒ ト T P O を 精 製す る た め に は 、 こ れ を カ ラ ム に 充填後 、 こ れ に ヒ ト T P O を 含む溶液を添加す る 。 そ の後、 非結合物質を洗浄 し た後、 例 え ば 、 グ リ シ ン 一 H C I 緩衝液 （ p H 2 . 5 ) 、 塩化ナ ト リ ウ ム 溶液、 プ ロ ピオ ン酸、 ジ ォ キ サ ン 、 エ チ レ ン グ リ コ ー ル、 カ オ ト ロ ピ ッ ク 塩、 塩酸 グァ ニ ジ ン ま た は尿素な どを用 い て、 カ ラ ム に桔合 し た T P O を溶出す る こ と がで き る 。

本発明の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 は、 固相サ ン ド ウ イ ツ チ法に よ る 酵素免疫測定法な ど に よ り ヒ ト T P O を定量す る た め に使用 で き る 。

本発明の実施態様に よ り 、 本発明の定置法は、 T P O に対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を T P O を含む試料 と 接触 さ せ 、 形成 さ れ る 免疫学的複合体を検出す る こ と を包含す る 。

固相サ ン ドィ ツ チ法の手順は以下の と お り で あ る 。

固相サ ン ド イ ッ チ法 と は非競合固相酵素抗体法の一種で、 同 一抗原の異 な る ェ ピ ト ー プを認識す る 二種類の抗体で抗原 を検 出 · 定量す る 方法であ る 。 つ ま り 第一段階で T P O を認識す る 抗体を固相に 不溶化 し 、 第二段階で T P O を固相に固定化 さ れ た抗体 と 免疫複合体を形成 さ せ吸着抽出す る 。 第三段階で第一 段階で使用 し た抗体 と は別の T P O ェ ビ ト ー ブを認識す る 抗体 や そ の抗体 フ ラ グ メ ン ト に マ レ イ ミ ド ， ヒ ン ジ法等に よ り 西洋 ヮ サ ビペ ルォ キ シ ダ ー ゼ等の酵素な どを 直接標識 し た も の 、 或 い は ア ビ ジ ン · ビォ チ ン法等 に よ り 酵素を 間接に 標識 さ せ た も の を反応 さ せ T P 0 を検出 · 定量す る 方法 で あ る 。

実施例

以下、 実施例で本発明 を さ ら に詳細 に 説明す る

実施例 抗原 タ ン パ ク 質、 h 6 T ( 1- 163 ) の調製

配列表 （配列番号. 3 ) に 示 さ れた h 6 T ( 1 - 163 ) を コ ー ド す る D N A を 化学台成 し 、 Xba l、 H i n d 1 I I で消化 し た p C F M 5 3 6 ( ATCC No. 39934 、 特表昭 6 0 - 5 0 1 9 8 8 号参照） に ク ロ ー ニ ン グ し た [宿主 は p M W l (ATCC No. 39933 ) で予 め 形質転換 さ れた E . c 0 1 i M l 0 9 を使用 し た ] で得 ら れた ク ロ ー ン を p C F M 5 3 6 Z h 6 T ( 1-163 ) と し こ の発現ベ ク タ ー を有す る 大腸菌株を h 6 T ( 1- 163 ) 発現用 の形質転換体 と し た。

発現プ ラ ス ミ ド p C F M 5 3 6 の発現制御 は 、 ；i PLプ ロ モ ー タ ー に よ る が、 こ れ 自 体が、 c 1857 リ ブ レ ッ サ ー遗伝子 の制御 下に あ る 。 上記の形質転換株を ア ン ピ シ リ ン 5 0 μ g / m 1 、 テ ト ラ サ イ ク リ ン を含む L B 培地 6 0 m 1 に 3 0 V で一晚振 ¾培養 し 、 こ の培養液 2 5 m l を ア ン ピ シ リ ン 5 0 g / m 1 を含む L B 培地 1 0 0 0 m 1 に加え て 、 O D は Α _{60 ί)} が l. D- 1. 2 に至 る ま で 3 0 で振通培養 し た。 次い で最終温度 が、 4 2 に な る よ う に 6 5 °C の約 3 3 0 m 〗 L B 培地を添加 し 、 さ ら に 3 時間 4 2 で振通培養 し て h 6 T ( 1 - 163 ) の発 現を誘導 し た。

h 6 T ( 1 - 163 ) 生産組換体凍桔菌体 0 . 6 g に 水 3 in 1 を 加え て けん濁 し 、 高圧破砕機で菌体を破砕 し た。 遠心分離 に よ り 沈澱画分を 回収 し 、 大部分の混在蛋 白質、 菌体成分等を 除去 し た。 回収 さ れた h 6 T ( 1- 163 ) を含む沈澱画分 に水 2 m l を加えて懸滴 し 、 1M T r i s -HC I 緩衝液 p H 8. 5 を 0. 5m l、 1 OM U r e a l Om lを加え室温下で 5 分撹拌 し た。 そ の懸濁液 " I に 20mM

T r i s - HC I 緩衝液 p H 8. 5 を 2 8 m l 、 1 M U r e a を含む 20m M Tr i s - HC I緩衝液 p H 8. 5 を 8 m l 加え、 4 で でー晚ゆ っ く り 撹 拌 し た。 遠心分離に よ り 沈澱画分を回収 し 、 回収 さ れた h 6 T ( 1 -163 ) を含む沈澱画分に 、 8 M グァ ニ ジ ン 、 5 % ァ セ ト ニ ト リ ル 、 0 . 3 % E D T A を 含む 0. 5M T r i s -HC l 緩衝液 p H 8. 5 を 2 0 0 // 1 加 え 、 室温に て可溶化 し 、 2 0 m g の D T T を 加 え 6 0 で で 1 時間還元処理 し た。 次 に こ れを 展開溶媒 A

( 0 % T F A ) ： 展開溶媒 B ( 0 . 0 5 % T F A を含む n― p r OH) を用 い 2 5 % B で平衡化 し た Ca pc e l l P a k CI 300 A (資 生堂製 、 C a . N o. C I T Y P E： S G 300 A ^ φ 6 150mm ) カ ラ ム に 1 0 0 〃 1 注入 し 、 2 5 % B 力、 ら 4 0 % B ま で 5 0 分の 直線濃 度勾配で流速 0. 4ml/mi n で展開 し 、 h 6 T ( 1-163 ) の ピ ー ク で あ る 約 2 8 % か ら 3 0 % n-P〖OHで溶出 さ れ る 画分を 回収 し た。 そ の画分 に 5 0 % グ リ セ ロ ー ノレを 1 0 0 1 加え、 遠心エバ ポ レ ー シ ヨ ン に よ り T F A 及び n- PrOHを除去 し 、 h 6 T ( 1-163 ) を調製 し 、 抗原 と し て用 い た 実施例 2 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体産生ハ イ プ リ ド ー

マ の作製

( 1 ) マ ウ ス へ の 免疫操作

実施例 1 で 得 ら れ た 500 g の h 6 T ( 1 - 163 ) を 、 1000 1 の m V 1 AD j τ ( CH EM RESEARCH 社製、 Ca. No

52017700 ) と 良 く 混和 し ェ マ ル ジ ヨ ン をつ く っ た。 次に 5 n il he adの抗原を Ba l b/c f ema l e ( 4 週齢） の f oo t padに エ ー テ ノレ 麻酔下で注射 し た。 追加免疫を 同様の方法で 3 日 間の ィ ン タ ー バ ルで行い、 計 8 回の抗原投与を行 っ た。 最終追加免疫の 際、 human I L- 6を 5 〃 g/he ad皮下投与 し た。 最終免疫の 3 日 後 に眼 窩よ り へマ ク リ ッ ト 毛細管をつ か っ て採血 し 、 血清を分離 し て 血中抗体価及び h 6 T ( 1-163 ) への反応性を 酵素抗体法 に よ り 測定 し た。 抗体価及び Τ Ρ 0 へ の反応性が 1 : 1GG()以上あ る も の に つ い て細胞融合を行 つ た。

( 2 ) 骨髄腫細胞株の調製

ミ エ ロ ー マ 細 胞 （ P 3X63 -A g * 8 - 653 ) を 解 凍 し 、 10¾F C S

( Hy c l。ne 社製、 Ca. No. A-l 115-L ) 添加 DMEM培地 に 懸濁 し 、 30 OG 5分遠心操作を行 っ た。 上淸を除 き 、 li FCS/DMEM に懸濁 し て 37 、 5¾C02 i ncuba t o rで培養 し た。

( 3 ) 細胞融合

定法に従 い細胞融合を行 っ た。 簡単に 明記す る と h 6 T ( 1 - 163 ) を免疫 さ れた マ ウ ス の局所 （膝窩、 鼠径部、 腸管膜） リ ンパ節及 び脾臓を無菌的 に採取 し 、 1Q FCS/DMEM 中 に リ ン パ節 細胞及 び脾臓細胞を そ れぞれ懸獨 し 、 抗体産生細胞を調製 し た _c 次に対数增殖期の ミ エ ロ ー マ細胞を リ ン パ節細胞 ま た は脾臓細 胞の 5 分の 1 量調製 し 混合 し 、 D MEMで洗浄 し 血清を除去後、 ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ー ル （ PEG 1500、 B 0 « h r i n g e r Mannhe im 社製、 C«. No. 783641 ) で細胞融合を行 っ た。 細胞融合後、 及 び 10 η g/m I h uma n 1 L- 6含有 DM EMで 1 x 10⁶ c e I 1 s /m Iに 調製 し 、 96- we l l m i c r o t i t e r l a t e ( Nunc-Immuno P l a t e M a x i S o r p™ I n l e rMe d社製 、 C a. o. 4 - 4240 O に 10 Q / l /we l l播 い た 。 18時 間後 、 2 xHAT (S l GMA 社製 、 C a . N o . H G 262 を 含 む 10 ¾ F C S / 10 n g /m I -h uma n I L— 6/ DMEMを 100m l /we l l添加 し 約 1 (！〜 14日 間 、 37°C 、 5¾ C 02 i n c u b a t o rで 培 養 し た 。

( 4 ) 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 産 生 ハ イ プ リ ド ー マ の ス ク リ ー ニ ン グ

酵素抗体法 に よ り 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 産生 ハ イ プ リ ド ー マ の ス ク リ ー ニ ン グ を 行 っ た 。 h 6 T ( 1 - 163 ) 或 い は C H O ( 1 - 332 ) を P B S に て 20 ;u g/ra l に 調製 し 96- we l l m i c r o l i t e r l a t e (Nu n c - I mmu n o P l a t e Ma x i S o r p^{T M}、 1 n t e r M e d 社製、 Ca. No. 4-4n(H ) の 各 we l l に 50m lずつ 分注 し た 。 マ イ ク 口 プ レ ー ト ミ キ サ ー （ M 1 CR0P LATE M I ER MPM- U 岩城 硝 子株式 会 社製 ） で撹拌 し 各 we l lの 底面 に 抗原 を ゆ き わ た ら せ た 。 プ レ 一 ト シ ー ル （ S U M 1 L 0 N 社製、 C a . N 0. M S - 30020 ) で シ ー ル し 37 *t で 2 時 間 、 或 い は 4 でー晚静 置 し て 抗原 を プ レ ー ト に 吸着 さ せ た 。 次 に 20 mM T r i s -HC 1 /0. 5 N a C I/O. 1 % Tw e e n 20 (pH 7. 5) の wa s h i n g Bu f f e rで 洗浄後、 4 倍希釈 B l k A c e (大 日 本製薬 株式会社製、 Ca. No. DK- B 25) を 各 we l lに 3 μ 1 加 え 、 プ レ ー ト シ ー ル で シ ー ル し 37て で 1 時 間、 或 い は 4 て でー晚静 置 し て ブ ロ ッ キ ン グ処理 し た 。 Wa sh i ng bu f f e rで 4 回 洗 浄後、 ハ イ ブ リ ド ー マ の ク ロ ー ン の 培 養上潸 を 50〃 1 添加 し 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー 撹 拌 後 、 プ レ ー ト シ ー ル で シ ー ノレ し Π °C で 1 時 間、 反 応 さ せ た 。 反 応終 了 後、 wa sh i n g B u f f e rで 4 回洗浄 し 、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ標識 Pro t e i n A ( P RCE社製 、 Ca. No, 32300)を 10倍希釈 B l ock A c e で 500 倍希釈 し て 各 We l lに 50 I 添加 し 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で撹拌後 、 プ レ ー 卜 シ ー ル で シ ー ル し 、 37 で 1 時間反 応 さ せ た 。 反応終了 後 、 wa sh i n g B U H e rで 4 回 洗 浄 し 、 ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ 用 発 色 キ ッ ト ( K i r k e g a a r d & Pe rリ Labor a t or i e s 社製、 Ca. No. 50-80-00) の 発色剤 を 各 We l lに 100 μ. I 添加 し マ イ ク 口 プ レ ー 卜 ミ キ サ ー で撹拌後、 プ レ ー ト シ ー ル で シ ー ル し て 室温下 で 反 応 さ せ た 。 約 30分後 に EL I SA ブ レ ー ト リ ー ダ ー （We l l r e ade i SK 601 、 生化 学工業株式会社製） で 4G5nm の 波長 の 吸収 を 測定 し た 。 h 6 T ( 1-163 ) お よ び C H O ( 1 - 332 ) の 両方 に 陽性 で あ る we l lの ク ロ ー ン を ス ク リ ー ニ ン グ し た 。 ス ク リ ー ニ ン グ さ れ た ク ロ ー ン は ス ケ ー ル ア ッ プ し て 凍結保存 し た 。 ま た 同時 に 、 限界 希釈 法 に よ り ク ロ ー ニ ン グ し た 。 限 界 希 釈 法 の 際 、 培 地 は i x HT ( S I G A 社製、 Ca. No. HO 1 Π)を 含 む 10 FCS/1 On g/ra卜 h una n - 6/DMEMで行 い 、 同様 に 酵素抗体法 に よ り 二 次 ス ク リ ー ニ ン グ を 行 っ た 。 ク ロ ー ン が安定 し た ら 10¾FCS/DMEM で 継 代 し 、 ス ケ ー ル ア ッ プ し て 凍 結保存 し た 。

( 5 ) 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 の 認識部位

以上 の 方法 よ り 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ 一 ナ ル抗体 が 63ク ロ ー ン 得 ら れ た 。 こ れ ら の ク ロ ー ン の う ち 、 反 応性 の 高 い 13ク ロ ー ン を 選択 し T P O タ ン パ ク の 反 応 領域 を 、 ヒ ト T P O ア ミ ノ 酸 配列 （配列 番号 1 参照） か ら デザ イ ン し 、 合成 し た Mu l t i p l e An t i e n Pe t i de (HT-1, 2, 3, Ί, 5, 6) ( 表 1 参照） を 用 い 、 （ 4 ) と 同 じ 操作 の 酵素抗体 法 に よ り 決定 し た 。 そ の 結果、 ΗΤ- 1 に 反応す る 抗体 が 1 種類 （ L 3 - 1 ) 、 Η Τ - 2に 反 応す る 抗体 が 1 種類

( L4-1) 、 Η Τ - 3に 反 応す る 抗体 が 10種類 （ L 1 - 10 , S 6 - 27. S 3 - 13 , S2-2, L3-15, L2-43, L3-4, L4-13, S4-12, S3-52 ) 得 ら れ た 。

表 1

ヒ ト T P 0 (アミノ酸番号 8— 2 8) ペプチド HT— 1領域

DLRVLS LLRDSHYLHSRLSQ ヒト T P O (アミノ酸番号 4 7— 6 2) ぺプチド HT— 2領域

SLGEWKTQHEET AQD ヒ ト T P 0 (アミノ酸番号 1 08 - 1 2 6) ぺブチド HT— 3領域

LGTQLPPQGRTTAH DPNA ヒ ト T P 0 (アミノ酸番号 1 7 2 - 1 9 0) ぺプチド HT— 4領域

NELPNRTSGLLETNFTASA ヒ ト T P 0 (アミノ酸番号 2 6 2 - 2 8 4) ぺプチド HT— 5領域

SLPPNLQPGYSPSPTHPPTGQYT ヒ ト T P O (アミノ酸番号 3 06 — 3 3 2) ぺプチド HT— 6領域

PSAPTPTPTSPLLNTSYTHSONLSQEG

寄託機関名称 工業技術院生命工学技術研究所

あて名 曰本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号

寄託機関名称 中国寄託機関 ( China Center for Type Culture Collection ) あて名 中華人民共和国、 ウーハン · 430072、 ルォ · ジャ · シャン

Luo Jia Shan. 曹 uhan 430072. China

尚、 上記抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を産生す る /、 イ ブ リ ド ー マ U - 1の サ ブ ク ロ ー ン （ L4 - 1 - 31 ) 及 び L 3- 1の サ ブ ク ロ ー ン （ L 3- 1 -54 ) は、 1 9 9 4 年 1 2 月 2 7 日 付け で 曰 ： *:国の 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に そ れぞれ受吒 番号 F E R M B P — 4 9 5 6 、 F E R M B P — 4 9 5 5 と し て 寄託 さ れ て い る 。 ま た こ れ ら の サ ブ ク ロ ー ン は 、 M o u s e - Mo u s e h y b r i d 0 m a L 4 - 1 - 31 、 Mo u s e - M o u s e h y b r i d o m a L 3 - 1 - 54の 各 名 称で 中 国 寄託機関 （C C T C C) に そ れ ぞ れ受 託番 号 C C T C C - C 95003、 C C T C C - C 95002で 寄 託 さ れ て い る 。

( 6 ) 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗体 の サ ブ ク ラ ス

( 5 ) で 得 ら れ た 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ノレ 抗体 L 3 - 1

L 4 - L 1 0 、 S 6 — 2 7 、 S 3 3 の サ ブ ク ラ ス を E I A 法 （ I N N O G E N E T I C S 社 製 ） に よ り 決定 し た 各培 養上清 を 、 固定 化 ラ ッ ト 抗 マ ウ ス （ サ ブ ク ラ ス 特異的） モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 に 反 応 さ せ 、 ア ル 力 リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ標識 ラ ヅ ト 抗 マ ウ ス （ / 軽 鎖特異 的 ） モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 反 応 さ せ た 。 反 応終 了 後 、 B C I P 基 質 を 加 え 程色 し 、 サ ブ ク ラ ス の 決 定 を 行 っ た 。 そ の 結果 、 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ノレ 抗 体

L 3 - 1 、 し 4 、 L 0 、 S 6 — 2 7 、 S 3 — 1 3 の サ ブ ク ラ ス は 、 そ れ ぞ れ 1 g G 2 a 、 ！ g G 2 b 、 1 g G 3、 I g G 3 ^ 1 g G 3で あ っ た 。

( 7 ) 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 の 精製

抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 産 生 ハ イ プ リ ド ー マ を e RDF培地 1 L 中 に Bo v i n e I n s u l i n 10 m g ゝ Huma n t r a n s f e r r i n 10mg、 Mo n o e t h a n o l am i n e 20 m M 、 S o d i um s e 1 e n i t 5 10 " ⁵ M を 含む無血淸培地で ロ ー ラ ー ボ ト ル （ F a l c o 社製、 Ca. No 3000 ) を用 い た回転培養法で大量培養 し た。 ハ イ プ リ ド ー マ の生存率 が 9 0 %以下に な っ た 時点で、 遠心分離操作を行 い培養上清 を 回収 し 、 0. 22 m メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー で據過 し た。 そ の培養 上淸を 0 . 1 5 M リ ン酸バ ッ フ ァ 一 （ P B S ) で平衡化 し た プ 口 テ ィ ン A カ ラ ム （富士 フ ィ ル タ ー 工業株式会社製） に 流速 1 0 0 m 1 / m i n でかけ た。 培養上清中の抗体を プ ロ テ ィ ン A に吸着 さ せ た ら 、 P B S を流速 1 0 O m 1 / m i n で流 し 、 吸光度 2 8 0 n m の値がベ ー ス ラ イ ン に な る ま で非吸着物質を 洗い流 し た。 非吸着物質を洗い流 し た の ち 0 M 1 y c i n e 容離液 （ p H 2 . 5 ) で抗体を溶出 し 、 回収 し た。 回収 さ れた溶液は、 0 . l M T r i s で中和 し 限外慮過で適当 な 濃度 に調製 し 滅菌 し て - 2 0 でで保存 し た。

実施例 3 抗 ヒ 卜 T P O モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 い た EL I SA

固相抗体 と し て HT- 1領域を認識す る 抗 ヒ ト T P O モ ノ ク ロ 一 ナ ル抗体 （ U- 1の サ ブ ク ロ ー ン L3-レ5 を、 50 ιπΜ Ca r b o n a t e bu f f e r ( H 9. 2) に て 20 / g /ra 1に調製 し 96 - * e I I m i c r o l i t e r p l a t e (Nunc-l mmuno P l a t e M a x i S o r p™ I n t e rMe d社製 、 C a . No. 4- 2404 ) の 各 we l lに 50 // I ず つ 分 注 し た 。 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー （ M1 KR0PLATE MIXER MPM- 1、 岩城 硝 子株式会社製） で 携拌 し 各 we l lの 底面 に 固相 抗 体 を ゆ き わ た ら せ た 。 プ レ ー ト シ ー ル （ S U M 0 N 社製 、 C a . N 0 · M S - 30020 ) で シ ー ル し Π °C で 2 時 間 、 或 い は 4 て でー 晚静 置 し て 固 相 抗体 を プ レ ー ト に 吸着 さ せ た 。 次 に 20 raM Tr i s-HC l/0. 5MNaC I/0. 1% Twe e n 20 (pH 7. 5) の wa sh i n B u f f で洗浄後、 4 倍希釈 B I o e k A c e (大 日 本製 薬株 式会 社製、 Ca. No. UK-B25) を 300 l/w I加 え 、 プ レ ー ト シ一 ル で シ ー ル し Π °C で 1 時 間 、 或 い は 4 て で一晚静 置 し て プ ロ ッ キ ン グ 処 理 し た 。 Wa s h i n g b u f f e〖で 4 回 洗 浄 後 、 10倍 希 釈 B l ock Ac e で 希釈 し た 披検体 ま た は 標準 と す る 濃度既知 TP0 を 各 We l lに 50 // Ι 添加 し 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー 撹拌後、 プ レ ー ト シ ー ル で シ ー ル し 37で で 2 時間、 或 い は 4で で一晚静 置 し て 反 応 さ せ た 。 反 応終 了 後 、 wa sh i ng Bu f f e rで 4 回 洗浄 し 、 ピオ チ ン 標識 し た HT- 2領域 を 認識す る 抗 ヒ ト T P 0 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 （ U- 1の サ ブ ク ロ ー ン L4 -卜 31, 1 次抗体 ） を 10倍希釈 B l oc k A c e で 500ng/m lに 希釈 し て 各 We l lに 50 I 添加 し マ イ ク 口 プ レ ー ト ミ キ サ 一 で撹拌後、 プ レ ー ト シ ー ル で シ ー ル し 37で で 2 時間、 或 い は で一晩静置 し て反応 さ せ た。 反応終了後 wa sh i n g B u f f e rで 4 回洗浄 し 、 ペ ルォ キ シ ダー ゼ標識ア ビ ジ ン ( U l t r a A v i d i n™- Ho r s e ra d i sh Pe rox i da s e、 L e i n c o T e c h n o I o g i e s 社製、 Ca. No. Al flO を 10倍希釈 B l oc k A c e で 2000倍希釈 し て各 We l lに 50〃 I 添加 し 、 マ イ ク ロ ブ レ ー ト ミ キ サ ー で撹拌 後、 プ レ ー ト シ ー ルで シ ー ル し て 37 で 1 時間反応 さ せ た。 反 応終了後、 wa sh i n g Bu f f e rで 4 回洗浄 し た後、 ペ ルォ キ シ ダー ゼ用発色キ ッ ト （ SUM ON 社製、 Ca. No. ML-1120T) の T M B Z 発色剤 に 1/100 容の基質液を加え た発色剤を各 We l lに 100 μ 1 添加 し マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で撹拌後、 プ レ ー 卜 シ ー ルで シ ー ル し て室温下で反応 さ せ た。 約 20分後に反応停止液を各 We I Iに 100 I 加え、 マ イ ク ロ プ レ ー ト ミ キ サ ー で撹拌 し て発色 反応を停止 し た。 EL I SA プ レ ー ト リ ー ダー （We l l r ea de r ¾ K 601 , 生化学工業株式会社製） で 45()/57()niii の波長の吸収を測定 し た _£ 濃度既知の C H O ( 1-163 ) 或い は C H O ( 1 - 332 ) に よ る 吸 収値を も と に標準曲線を作製 し た （図 1 参照） 。 ま た、 前述の C H O ( 1-163 ) 、 C H O ( 1 - 332 ) に加え て、 大腸菌で産生 し た変異型 ヒ ト T P O (例え ば Γ Μ Κ Τ ( 1 - 332 ) 」 、 「 M K T ( 1-163 ) 」 ） に つ い て も 標準曲線を作製 し た （図 2 参照） 。 こ れに よ り 各種 T P O 分子の定量が可能 と な る 。

M K T ( 1 - 332 ) は 、 配列番号 1 に 示 さ れ る ヒ ト T P O の ァ ミ ノ 配 列 に 対 し て 、 そ の N 末端 に M e t 残基 （ 一 2 位） と

L y s 残基 （ 位） が付加 さ れた ア ミ ノ 酸配列を有 し て い る

M K T ( 1- 163 ) は、 配列番号 1 の 1 位か ら 1 6 3 位 に 相当す る ア ミ ノ 酸配列 に対 し て、 そ の N 末端に M e t 残基 （ ― 2 位） と L y s 残基 （ ― 1 位） が付加 さ れた ア ミ ノ 酸配列を有 し て い る

ま た、 配列番号 1 に示 さ れ る ヒ 卜 T P O の N 末端側の ア ミ ノ 酸配列 と 高 い ホ モ 口 ジ ー を有す る ヒ ト E r h r 0 p 0 i e t i n ( h E P 0 ) を用 い て抗原特異性を調べた と こ ろ 、 こ の系 は T P O を特 異的 に検出す る も の で あ る こ と がわか っ た （図 3 参照） 。

更に、 固相抗体 と ピオ チ ン標識 1 次抗体の組み 合わせ と し て L 3- 1と S3- 13 、 S 3 - 13 と L 3- l、 S3- 13 と L 1の組み合わせの サ ン ド イ ッ チ 法 で も L 3 - 1 - 54 と L 4 1 - 31 の 組 み 合 わ せ と 同様 に T P 0 の定性 · 定量を行 う こ と が で き た。

上記の具体例 に よ っ て示 さ れ る よ う に、 本発明の モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体を用 いて、 各種 ヒ ト T P 0 分子を検出、 定量す る こ と がで き る 配 列 表 配列番号： 1

配列の長さ ： 332

配列の型： アミノ酸

起源： ヒ 卜 (H omo S a p i e n s)

配列

Se r Pro A 1 a Pro Pro A I a Cy s Asp Leu Ai Va 1 Leu Se r Ly s leu Leu

1 5 10 15

Arg Asp Se r His Ya I Leu His Se r Arg Leu Ser Gin Cys Pro G I u Va I

20 25 30

His Pro Leu Pro Thr Pro Va I Leu Leu Pro Ala Va 1 Asp P e Ser Leu

35 40 45

Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu

50 55 60

Gly Ai a Ya I Thr Leu Leu Leu Glu Gly Va I Met Ala Ah Arg Gl Gin 65 70 75 80

Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gl Gin Leu Ser Gl， Gin

85 90 95

Va I Arg Leu Leu Leu Gl Al Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr G! n Leu

100 105 110

Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie Phe

115 120 125

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Va I Arg Phe Leu Met Leu

130 135 140

Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160

Va I Pro Ser Arg Thr Ser Leu Va I Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn

165 170 175 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr

180 185 190

Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly P e Arg Ala Lys 11 e

195 200 205

Pro G I y Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin 11 e Pro Gly

210 215 220

Ty r Leu Asn Arg lie His Glu Leu Leu Asn G 1 y Thr Arg G 1 y Leu Phe 225 230 235 240

Pro G I y Pro Ser Arg A r g Thr Leu G 1 y A I a Pro Asp lie Ser Ser Gly

245 250 255

Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr Ser

260 265 270

Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe Pro Leu

275 280 285

Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Va 1 Va I Gin Leu His Pro Leu Leu Pro

290 295 300

Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr 305 310 315 320

Ser Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly

325 330

K列番号： 2

配列の長さ ： 165

配列の型：アミノ酸

滅： ヒ 卜 (H omo S a p i e n s)

配列

Met Lys Ala Pro Va I Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Va 1 Leu Ser Lys

-2 -1 1 5 10

Leu Leu Arg Asp Ser His Va I Leu Hi s Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro

15 20 25 30 - 2 1 -

Gl u Va ! His Pro Leu Pro Thr Pro Va i Leu Leu Pro Ala Va I Asp Phe

35 40 45

Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp

50 55 60

He Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg

65 70 15

G 1 y Gin Leu G 1 y Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser

80 85 90

G I y Gin Va I Arg Leu Leu Leu G I y Ala Leu Gin Ser Leu Leu G I Thr 95 100 105 110

Gin Leu Pro Pro Gin G I y Arg Thr Thr Ala His L s A Pro As n A I a

115 120 125

lie Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Va I Arg Phe Leu

130 135 140

Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr

145 150 155

Thr Ala Val Pro Ser

160 163 配列番号： 3

配列の長さ ： 535

配列の型：核酸

鎖の数：ニ本銷

トポロジー ：直鑛伏

配列の種類：合成 DN A

： ヒト (Homo S a p i e n s)

配列

CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA 28 ATG AAA GCA CCT GTA CCA CCT GCA TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA 76 Met Lys Ala Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys

+1 5 10 091

J 3S oJd |BA «IV U see II D vvvoivvi XDI DOD US IOO 3v

9SI 0S1 SH

c d 0Jd B|v 3 V V 18Λ s naq j i J3S ί 13 i 13 I^A ^η3Ί HfD

80S 33V VD3 933 D39 00 100 X13 331 913 3DV 131 1D9 ODD 119 013 D1V

OH S£I OEI

"31 » 8jy I n sii ί [9 3JV nai naq S!H u|3 3qj jas na] aqa 9| i

09^ DID 311 1DD 113 VVV ODD 193 913 913 3V0 9V3 Oil 101 910 3U 3XV

SH 0Π Sll

ί IV usv o Jd dsy sii S!H B | V l ^J U ^3jV 3 « ! D o^d 0Jd ^Π3Ί ^UI3 i 130 OVV 333 IVD 3VV DVD 139 13V 33V 193 099 9V3 V30 93D 913 9V3

Oil SOI 001 S6

Jij ί|3 Π3ΐ nsq J as u | 9 naq B | y ί | 9 nsq naq nsq 8 J y | BA ^U I 9 ί 19

HC 33V 399 113 313 131 9V3 913 139 399 313 31D 913 ID3 1XD 9VD 399

06 58 08 naq u |g ί |g n3 nsq jss J3S ^η3Ί siQ jqx OJJ i|3 nai U|j) ί o

916 131 913 DVD DD9 113 9ID 331 131 910 DDI DDV 933 D99 113 9V3 399

Si 01 59

ν B I V B [V W I ΒΛ n 19 ^η3Ί ^η3Ί ^Π3Ί ^J Ι«Α «IV 3 ^η3Ί ' 11 92 193 Ϋ39 133 9IV 113 D9D V¥3 913 113 913 13V VI9 Ϋ09 I9D 913 DiV

09 SS OS dsy u|9 Biv siq jqi ti|3 u|9 q s njg ί 19 naq us

3V9 9V0 109 VVV 03V 9V9 VV9 9IV DVD 3DV VVV D91 VV9 I9D DID DDI

St- se

3i dsy I BA B]V 0 Jd na njq | ΒΛ ⁰¹i ^JU ^0J«i ^η3Ί ^0Jd ^S!H l«A "19 1I 311 3V9 DID 139 93D 113 DID 110 D33 33V 933 DID 9D3 0V3 UD VV9

OS SZ OZ SI

oj j s U|3 i as na ¾iy J 3S s!H ^Π3Ί l^BA s !H ³S ^dsV ^{3 J}V ⁿ³l ⁿ³l

DOD D91 DVD 331 913 193 131 3V3 910 919 3V3 13J. 3V9 393 913 913

一 8 2 —

0S000/96df/XDd[ 60€∑∑/96 OAV

Claims

請 求 の 範 囲 ヒ ト T P O に 対す る モ ノ ク ロ一ナ ノレ抗体

2 ヒ ト T P O 対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 用 い る ァ フ ィ 二 テ ィ 一ク ロ マ ト グ ラ フ ィ 一 に よ り 、 T P O 含 有物質 か ら T P O を 単離す る こ と か ら な る T P O の 精製法。

3 ヒ ト T P O に 対す る モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を 用 い る こ と を 特徵 と す る T P 0 の 免疫化学的 定量及 び検 出 法

4 前記 モ ノ ク ロ ー ナ ル抗体 を T P 0 を 含 む 試料 と 接触 さ せ 形成 さ れ る 免疫学的複 合体 を 検 出 す る こ と を 特徵 と す る 請求項

3 記載 の 方法