WO2003084569A1 - Drug containing antibody composition - Google Patents

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WO2003084569A1 PCT/JP2003/004503 JP0304503W WO03084569A1 WO 2003084569 A1 WO2003084569 A1 WO 2003084569A1 JP 0304503 W JP0304503 W JP 0304503W WO 03084569 A1 WO03084569 A1 WO 03084569A1
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Rinpei Niwa
Kenya Shitara
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention is based on N-glycoside-linked complex type sugar chains produced from cells that do not have resistance to lectins that recognize a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end and the 1-position of fucose are ⁇ -linked.
  • the present invention relates to a medicament adapted to a patient or a disease which cannot be treated with a medicament containing the antibody composition as an active ingredient, and a method for screening the patient using the medicament.
  • Antibodies have high binding activity, high binding specificity, and high stability in blood, and have been applied to the diagnosis, prevention and treatment of various human diseases [Monoclonal Antibodies] : Principles 'and' Applications (Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Chapter 2.1 (1995)) Also, using gene recombination technology, antibodies from humans Attempts have been made to produce humanized antibodies such as human-type chimeric antibodies or human-type complementarity-determining regions (hereinafter referred to as CDRs) transplanted antibodies. Region) is an antibody of a non-human animal, and a constant region (hereinafter, referred to as a C region) is a human antibody. Less than Antibody der was replaced with the CDR of an antibody of the animal of Ru.
  • IgM mammalian antibodies
  • IgD blood is used for diagnosis, prevention and treatment of various human diseases.
  • Antibodies of the human IgG class are mainly used because of their long half-life and functional properties such as having various effector functions. [Monoclonal Antibodies: Principles and Principles Applications), Wiley-Liss, Inc., Chapter 1 (1995)].
  • Antibodies of human IgG class are further classified IgGl, the four subclasses of I g G2, I g G3, IgG4.
  • ADCC activities antibody-dependent cytotoxic activities
  • CDC activities complement-dependent cytotoxic activities
  • IgG class antibodies antibody-dependent cytotoxic activities
  • ADCC activities antibody-dependent cytotoxic activities
  • CDC activities complement-dependent cytotoxic activities
  • ADCC activity was almost induced when the number of HER2 on the target cells was 10 4.
  • No significant ADCC activity was induced when the number of HER2 on the target cells was 10 5 or more, and strong ADCC activity was induced when the number of HER2 on the target cells was 10 6 It was shown that it was about the number.
  • Herceptin shows strong ADCC activity against human breast cancer cell line SK-BR-3 expressing 9.0 X 10 5 HER2 molecules, but 2.2 X 10 4 HER2 molecules.
  • Herceptin did not show ADCC activity against the expressing human breast cancer cell line MCF7 [Cancer Immunology and Immunotherapy (Cancer Immunol. Iramunother.), 37, 255 (1993), Herceptin TM Injection 150 pamphlet, HER. II. 1.2 (June 2001)].
  • Herceptin was significantly more effective in patients with high HER2 expression in tumor tissue than in patients with low HER2 expression by immunohistochemistry or fluorescence in situ hybridization. It is known to be high [Procedings of America ',' Society ',' Crycal ', Oncologi (Proc. Am. Soci. Clin. Oncol.), 20, 22a (2001)].
  • no therapeutic effect is shown for patients with low HER2 expression, indicating that noreceptin is limited to patients with HER2 overexpression.
  • Antibody drugs known so far include Herceptin, as well as the anti-CD20 antibody Rituxan and the anti-CD52 antibody Campath. All of these antibodies aim to obtain a therapeutic effect by destroying target cells, but ADCC activity is the main mechanism in all of them.
  • CD52 also has 1 to 5 x 10 5 [Seminars in Oncology, 26 (5 Suppl 14), 52 (1999)], all of which are 10 5 or more. Therefore, known antibody drugs require that at least 10 5 antigens be expressed in target cells for ADCC activity to be expressed, but less than 10 5 antigens There is no known therapeutic agent containing an antibody against an expressed target cell as an active ingredient. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to the following (1) to (21).
  • the antibody according to (5), wherein the amount that is not sufficient for the antibody composition to exert a therapeutic effect is an amount that is not sufficient for the antibody composition to exhibit antibody-dependent cytotoxicity.
  • the lectin-resistant cells are cells in which the activity of a protein selected from the group consisting of the following (a), (b) and (c) is reduced or deleted, (1) to (6) The medicament according to any one of the above.
  • lectin is at least a lectin selected from the group consisting of (a), (b), (c) and (d) below.
  • the cell is a cell selected from the group consisting of yeast, animal cells, insect cells, and plant cells.
  • the antibody composition is an antibody composition containing, as an active ingredient, an antibody molecule selected from the group consisting of the following (a), (b), (c) and (d): 10) The medicament according to any one of the above.
  • the antibody composition having a high antibody-dependent cytotoxicity is characterized in that, among all N-dalicoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition, N-acetylacetyl saccharide at the reducing end of the sugar chain is used.
  • the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to samin recognizes the sugar chain structure in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-daricoside-linked complex-type sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked.
  • the medicament according to (13) which is higher than an antibody composition produced from a cell having no resistance to lectin.
  • the sugar chain to which fucose is not bonded is a sugar chain in which the 1-position of the fucose is not ⁇ -linked to the 6-position of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end of ⁇ -daricoside-bonded complex type sugar chain. , (14).
  • the antibody-dependent cytotoxic activity is high, and the antibody composition is a sugar chain reducing terminal N-acetyl of all N-daricoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • the medicament according to any one of (13) to (15), wherein the proportion of a sugar chain in which position 1 of fucose is not a-linked to position 6 of darcosamine is 20% or more.
  • an antibody composition in which the proportion of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyltilcosamine at the sugar chain reducing end is 20% or more is an antibody composition produced by CH0 cells, (16)
  • the drug is a diagnostic, prophylactic or therapeutic agent for a disease associated with a tumor, a disease associated with allergy, a disease associated with inflammation, an autoimmune disease, a cardiovascular disease, a disease associated with a viral infection or a disease associated with a bacterial infection.
  • the drug according to any one of (1) to (17), which is a drug.
  • a method for measuring the activity of a drug that has reacted with a target cell is a method for measuring an activity selected from the group consisting of the following (a), (b), (c) and (d): ).
  • the present invention provides a lectin-resistant cell that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-glycidol-linked glycan at the reducing end of N-glycoside-linked complex type sugar chain and the 1-position of fucose are linked (hereinafter, al, 6-fucose Z-lectin-resistant cells) containing an antibody composition produced as an active ingredient, 6-position of ⁇ -acetyltilcosamine of ⁇ ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal and 1 of fucose Contains an antibody composition produced from a cell that does not have metamura in the lectin that recognizes the ⁇ -linked bran chain structure (hereinafter abbreviated as al, 6-fucose ⁇ lectin intolerant cell) as an active ingredient
  • the present invention relates to a medicament characterized by being adapted to a patient who cannot be treated with a medicament (hereinafter, referred to as “conventional antibody medicine
  • the ⁇ 1,6-fucose / lectin-resistant cells of the present invention include cells capable of producing an antibody composition such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, and ⁇ -glycoside-linked complex-type sugar chains. Any cell may be used as long as it is a lectin-resistant cell that recognizes a sugar chain structure in which the 6th position of ⁇ -acetyltylcolasamine at the reducing end and the 1st position of fucose are a-linked.
  • Hypridoma which is resistant to a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of ⁇ ⁇ -glycidol-linked glycan linked to the reducing end of ⁇ -acetyldarcosamine is linked to the 1-position of fucose Cells
  • host cells for producing human antibodies and humanized antibodies embryonic stem cells and fertilized egg cells for producing transgenic non-human animals for producing human antibodies, trans cells for producing human antibodies
  • Examples include plant callus cells, myeloma cells, cells derived from transgenic non-human animals, and the like, for producing geuc plants.
  • Myeloma cells can be used as fusion cells when producing hybridoma cells.
  • transgenic non-human movements The animal can be immunized with an antigen, and the spleen cells of the animal can be removed and used to produce hybridoma cells.
  • Lectin-resistant cells are cells whose growth is not inhibited even when cell culture is carried out by applying an effective concentration of lectin to a culture medium.
  • the effective concentration of lectin that does not inhibit the growth may be appropriately determined depending on the cell line, but is usually 10 ⁇ 1 to 10. And preferably 0.5 to 2.0 mg / ml.
  • the effective concentration of lectin when a mutation is introduced into the parent cell line is not less than the concentration at which the parent cell cannot grow normally, preferably the same concentration as the concentration at which the parent cell cannot grow normally, more preferably 2 to 5 Times, more preferably 10 times, most preferably 20 times or more.
  • the parent cell is a cell before any treatment, that is, a cell before performing the step of selecting al, 6-fucose lectin-resistant cells used in the present invention, and a gene for reducing or deleting the above-mentioned enzyme activity. Refers to cells before engineering treatment.
  • the parent cell is not particularly limited, but specific examples of the parent cell of various cell lines are shown below.
  • NS0 cells Parent cells of NS0 cells are described in the literature such as Bio / Technology (BI0 / TECHN0L0GY), 10, 169 (1992), and Biotechnology 'Bioengineering (Biotechnol. Bioeng.), 73, 261, (2001). NS0 cells. Also, there are the NS0 cell line (RCB0213) registered with the RIKEN Cell Development Bank, or a substrain obtained by adapting these strains to a growth medium.
  • the parental cells of SP2 / 0-Agl4 cells include J. Immunol. (J. Immunol.), 126, 317 (1981), Nature, 276, 269 (1978), and Hyman Anti Ibodizu 'en de' Nono Ipuri Domazu (Human Antibodies and Hybridomas), 3 , 129 (1992) SP2 / 0- a g 14 cells that have been described in the literature, and the like. Also, there are SP2 / 0-Agl4 cells (ATCC CRL-1581) registered with the ATCC, or a substrain (ATCC CRL-1581.1) obtained by adapting these strains to a growth medium.
  • CH0 cells derived from Chinese hamster ovary tissue include Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968), Genetics, 55, 513 (1968). , Chroraosoma, 41, 129 (1973), Methods in Cell Science, 18, 115 (1996), Radiation Research, 148, 260 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968), Cell, 6, 121 (1975), Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (p883_900), and the like.
  • CH0-K1 strain ATCC CCL-61
  • DUXB11 strain ATCC CRL-9096
  • Pro-5 strain ATCC CRL-1781
  • commercially available CHO-S strain Lifetechnologies Cat. # 11619
  • the parent cell line of the rat myeloma cell line YB2 / 3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 cell includes a cell line established from Y3 / Agl. 2.3 cell (ATCC CRL-1631). Specific examples thereof include YB2 / 3HL. ⁇ 2.Gil.16Ag. Described in references such as J. Cell. Biol., 93, 576 (1982) and Methods Enzymol., 73B, 1 (1981). There are 20 cells. Also, there are YB2 / 3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 cells (ATCC CRL-1662) registered with the ATCC, or substrains obtained by adapting these strains to a medium in which they can grow.
  • a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain and the 1-position of fucose are ⁇ -linked a lectin that can recognize the sugar chain structure If so, any lectin is included.
  • Specific examples include lentil lectin LCA (Lentil Agglutinin from Lens Culinaris), endum bean lectin PSA (Pea Lectin from Pi sum sativum), Broad bean lectin VFA (Agglutinin from Vicia faba), Hylochawantake Lectin ML (Lectin from Aleuria aurantia) and the like.
  • al, 6-fucose / lectin-resistant cells may be any cells that do not inhibit growth in the presence of a certain effective concentration of lectin.
  • at least one of the following proteins may be used.
  • Cells whose activity is lower or deleted than the parent cell line. (a) Enzyme proteins involved in the synthesis of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose (hereinafter referred to as “GDP-fucose synthase”);
  • GDP-fucose transport protein Intracellular sugar nucleotide A protein involved in the transport of GDP-fucose to the Golgi apparatus
  • GDP-fucose synthase includes any enzyme that is involved in the synthesis of sugar nucleotides GDP-fucose, which is the source of fucose to sugar chains in the cell. Enzymes that affect lipase.
  • the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose is supplied by the de novo synthesis pathway or the Salvage synthesis pathway. Therefore, all enzymes involved in these synthetic pathways are included in GDP-fucose synthase.
  • the GDP-fucose synthase involved in the de novo synthesis pathway includes GDP-mannose 4-dehydratase (GDP-mannose 4-dehydratase; hereinafter referred to as GMD), GDP-keto-6-deoxymannose 3,5 -epimerase, 4-reductase (GDP-keto-teoxymannose 3,5-epimerase, 4-reductase; hereinafter, referred to as GMD), GDP-keto-6-deoxymannose 3,5 -epimerase, 4-reductase (GDP-keto-teoxymannose 3,5-epimerase, 4-reductase; hereinafter, referred to as Fx).
  • GMD GDP-mannose 4-dehydratase
  • Fx 4-reductase
  • GDP-beta-L-fucose pyrophosphorylase GDP-beta-L-fucose pyrophosphorylase; hereinafter referred to as GFPP
  • Fucokinase Fucokinase
  • Enzymes that affect the synthesis of intracellular sugar nucleotide GDP-fucose include those that affect the activity of the enzymes involved in the above-described intracellular sugar nucleotide GDP-fucose synthesis pathway and substances that serve as substrates for the enzyme. Enzymes that affect structure are also included.
  • any enzyme can be used as long as it is an enzyme involved in the reaction between the 6-position of N-glycidyl-linked complex-type sugar chain reducing terminal N-acetyltilcosamine and the 1-position of fucose. Included.
  • the enzyme include any enzyme that affects the reaction in which the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain and the 1-position of fucose are bonded.
  • Specific examples include (3 ⁇ 41,6-fucosyltransferase ⁇ ⁇ -L-fucosidase).
  • Examples of the enzyme that influences the ⁇ - bond between the 6-position of N-glycidol-linked glycan at the reducing end of N-glycoside-linked glycan and the 1-position of fucose include the ⁇ -dalicoside-linked glycan described above.
  • An enzyme that affects the activity of an enzyme involved in the reaction in which the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the chain reducing end, or that affects the structure of a substance that is a substrate of the enzyme are also included.
  • the GDP-fucose transport protein includes any protein that is involved in the transport of intracellular sugar nucleotides GDP-fucose to the Golgi apparatus, and specifically includes the GDP-fucose transporter.
  • proteins that influence the reaction of transporting the intracellular sugar nucleotide GDP-fucose into the Golgi are also included in the GDP-fucose transport protein, and specifically, the above-mentioned intracellular sugar nucleotide GDP-fucose is transported to the Golgi apparatus. And proteins that affect the activity of the proteins involved in the expression or the expression.
  • any method can be used as long as it can select 1,6-fucose / lectin-resistant cells.
  • Specific examples include a method of reducing or deleting the activity of the above-described protein. Techniques for reducing or deleting the activity of the above-mentioned proteins include:
  • the amount of the antigen recognized by the antibody composition in the target cells of the patient is expressed only in an amount that is not sufficient for the antibody composition to exert a therapeutic effect. There are no patients.
  • the antigen in the present invention also includes any antigen that is expressed on target cells and reacts with the antibody composition.
  • the target cell in the present invention includes any cell expressing an antigen to which the antibody composition reacts, which is involved in a patient's disease.
  • the disease in the present invention includes any disease in which the target cell is directly or indirectly involved in the formation of the disease state.
  • malignant tumors involving tumor cells, neovascular cells, stromal cells, etc. allergies involving immune cells, inflammation and autoimmune diseases, cardiovascular diseases involving vascular cells, platelets, smooth muscle cells, etc., viral infections And bacterial infection.
  • Effective medicament of the present invention is the upper limit of the expression level of the antigen is small target cells expressing the antigen, per target cell preferably 10 5, more preferably 5X10 4 cells, yet good Mashiku 2X10 4 And particularly preferably 10 4 , most preferably 5 ⁇ 1.
  • CCR4 human chemokine receptor per target cell preferably 10 5, more preferably 5X10 4, even more preferably 2X10 4, particularly preferably 10 4 And most preferably 5 ⁇ 10 3 .
  • CD20 human CD20
  • preferably 10 5 cells, more preferably 5 ⁇ 10 4 cells, more preferably 3 ⁇ 10 4 cells, particularly preferably 2 ⁇ 10 4 cells, most preferably 10 4 cells per target cell Individuals are given.
  • HER2 human HER2
  • HER2 preferably 5 ⁇ 10 5 cells, more preferably 10 5 cells, more preferably 5 ⁇ 10 4 cells, particularly preferably 3 ⁇ 10 4 cells, most preferably 2 ⁇ 10 cells per target cell
  • HER2 preferably 5 ⁇ 10 5 cells, more preferably 10 5 cells, more preferably 5 ⁇ 10 4 cells, particularly preferably 3 ⁇ 10 4 cells, most preferably 2 ⁇ 10 cells per target cell
  • HER2 preferably 5 ⁇ 10 5 cells, more preferably 10 5 cells, more preferably 5 ⁇ 10 4 cells, particularly preferably 3 ⁇ 10 4 cells, most preferably 2 ⁇ 10 cells per target cell
  • HER2 preferably 5 ⁇ 10 5 cells, more preferably 10 5 cells, more preferably 5 ⁇ 10 4 cells, particularly preferably 3 ⁇ 10 4 cells, most preferably 2 ⁇ 10 cells per target cell
  • Effective medicament of the present invention is the lower limit of the expression level of the antigen of the target cells expressing less antigenic, per target cell preferably one, more preferably 10 2, rather more preferably is 3X10 2 , particularly preferably 10 3 and most preferably 3X10 3 and the like.
  • CCR4 it is preferably 1 cell, more preferably 10 2 cells, more preferably 5 ⁇ 10 2 cells, particularly preferably 10 3 cells, most preferably 3 ⁇ 10 cells per target cell. There are three .
  • per target cell preferably one, more preferably two to 10, more preferably 10 3, particularly preferably 2 X 10 3, most preferably 5 X 10 3 and the like.
  • per target cell preferably one, more preferably 10 2, more preferably 10 3, particularly preferably 5 X 10 3 and most preferably 1 X 10 4 or the like.
  • the expression level of the antigen of the target cell in the patient or disease to be treated with the medicament of the present invention is determined by the antibody-antigen binding reaction, such as flow cytometry, Scatchard plot, immunohistochemistry, and immunoassay.
  • the measurement can be performed using any method as long as it is an immunological method using the method. .
  • the ligand for the antigen can be measured by detecting the binding activity of the ligand to the target cells by a method such as flow cytometry, Scatchard plotting, immunohistochemical staining, or Immunity assay. it can.
  • the amount that is not sufficient for the antibody composition to exert a therapeutic effect refers to an amount that is not sufficient for the antibody composition to exhibit ADCC activity.
  • the antibody composition is not sufficient to exert ADCC activity means that the antibody composition cannot damage target cells in a patient.
  • the antibody composition includes any composition containing an antibody molecule having an N-glycoside-linked complex type sugar chain in the Fc region.
  • An antibody molecule is a tetramer in which two types of polypeptide chains of a heavy chain and a light chain (hereinafter, referred to as an H chain and an L chain, respectively) are associated with each other by two molecules. About one-fourth of the N-terminal side of the H chain and about one-half of the N-terminal side of the L chain (each more than 100 amino acids) are called V regions, which are rich in diversity and directly involved in antigen binding I do. Most of the part other than the V region is called the C region.
  • Antibody molecules are classified into IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE classes according to the homology of the C region. The IgG class is further classified into IgG1 and IgG4 subclasses based on the homology of the C region.
  • Figure 1 shows a schematic diagram of an IgGl class antibody molecule.
  • the H chain is divided into four immunoglobulin domains of VH CH1 CH2 CH3 from the N-terminal side.
  • the structural unit consisting of CH2 and CH3 after the hinge region is called the Fc region, to which N-glycoside-linked sugar chains are bound. This region is where the Fc receptor and complement bind.
  • sugar chains of glycoproteins are linked to asparagine (N-glycoside-linked sugar chains) and sugar chains linked to serine, threonine, etc. (0-glycosyl-linked sugar chains), depending on the mode of binding to the protein part.
  • N-glycoside-linked sugar chains have a common basic core structure as shown in the following structural formula (I) [Biochemical Experimental Method 23-Glycoprotein Glycan Research Method (Society Press Center), edited by Reiko Takahashi (1989 )].
  • the N-glycoside-linked sugar chain may be any as long as it has the core structure of the above structural formula (I), but a high mannose type core structure in which only mannose is bonded to the non-reducing end of the core structure.
  • Gal-GlcNAc galactose-N-acetyldarcosamine
  • Complex (complex type) having a structure such as N-acetilda lucosamine, non-reduced powder of core structure Examples include the hybrid type, which has both high mannose and complex type branches at the end.
  • the Fc region of the antibody molecule has a region where N-daricoside-linked sugar chains bind one by one, two sugar chains are bound per antibody molecule. Since the N-darcoside-linked sugar chain that binds to the antibody molecule includes any sugar chain containing the core structure represented by the structural formula (I), two N-darcoside-linked sugar chains that bind to the antibody are included. Has many combinations of sugar chains.
  • an antibody composition produced using 1,6-fucose Z lectin-resistant cells is an antibody molecule having a single sugar chain structure as long as the effects of the present invention can be obtained. Or an antibody molecule having a plurality of different sugar chain structures.
  • the antibody molecule includes any molecule that contains the Fc region of the antibody.
  • Specific examples include an antibody, an antibody fragment, and a fusion protein containing an Fc region.
  • Antibodies include antibodies secreted by hybridoma cells produced from spleen cells of immunized animals by immunizing animals with antigens, antibodies produced by genetic recombination technology, that is, antibodies into which the antibody it gene has been inserted. Examples include an antibody obtained by introducing an expression vector into a host cell. Specific examples include antibodies produced by hybridomas, humanized antibodies, and human antibodies.
  • a hybridoma is a monoclonal antibody having a desired antigen specificity, obtained by cell fusion of B cells obtained by immunizing a non-human mammal with an antigen and myeloma cells derived from mice, rats, etc. Refers to cells that produce
  • humanized antibody examples include a human chimeric antibody and a human CDR-grafted antibody.
  • the human chimeric antibody is composed of a non-human animal H chain V region (hereinafter, also referred to as HV or VH) and an antibody L chain V region (hereinafter, also referred to as LV or VL) and a human antibody H chain C region (hereinafter, also referred to as LV or VL).
  • HV or VH non-human animal H chain V region
  • LV or VL antibody L chain V region
  • LV or VL human antibody H chain C region
  • CL human antibody H chain C region
  • Non-human animals include mice, rats, and hams Any material, such as tar, rabbit, etc., can be used as long as it can produce a hybridoma.
  • cDNAs encoding VH and VL are obtained from hybridomas that produce monoclonal antibodies, and inserted into host cell expression vectors containing genes encoding human antibodies CH and CL.
  • a human-type chimeric antibody expression vector can be constructed, expressed by introducing it into a host cell, and produced.
  • any CH may be used as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter, referred to as hlg), but those of the hlgG class are preferable, and hIgGl, hIgG2, and hIgG3 belonging to the hlgG class are suitable. And hIgG can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and a ⁇ class or L class can be used.
  • the human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting the amino acid sequences of CDRs of VH and VL of an antibody of a non-human animal at appropriate positions of VH and VL of a human antibody.
  • the human CDR-grafted antibody constructs a cDNA encoding the V region obtained by grafting the VH and VL CDR sequences of a non-human animal antibody to the VH-VL CDR sequence of any human antibody,
  • a human CDR-grafted antibody expression vector is constructed by inserting each into a host cell expression vector having genes encoding human antibody CH and human antibody CL, and introducing the expression vector into a host cell.
  • the transplant antibody can be expressed and manufactured.
  • the CH of the human-type CDR-grafted antibody may be any CH as long as it belongs to hlg, but the hlgG class is preferable, and any subclass such as hIgGl, hIgG2, hIgG3, hIgG belonging to the hlgG class may be used. it can.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and a ⁇ class or another class can be used.
  • Human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but human antibody phage produced by recent advances in genetic, cell engineering, and developmental engineering technologies
  • the library also includes antibodies obtained from human antibody transgenic non-human animals or human antibody transgenic plants.
  • Antibodies present in the human body can be obtained, for example, by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting EB virus and the like, immortalizing, and cloning, thereby culturing lymphocytes producing the antibodies.
  • the antibody can be purified.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and single chain antibodies are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. From the library, a phage expressing an antibody fragment having the desired antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody transgenic non-human animal refers to an animal in which a human antibody gene has been integrated into cells.
  • a human antibody transgenic non-human animal can be produced by introducing a human antibody gene into mouse embryonic stem cells, transplanting the embryonic stem cells into the early embryo of another mouse, and then developing the embryo. it can.
  • a human antibody transgenic non-human animal can be produced by introducing a human antibody gene into a fertilized egg of an animal and generating the fertilized egg.
  • a method for preparing a human antibody from a human non-human transgenic non-human animal is to obtain and cultivate a human antibody hybridoma by a conventional method for preparing a hybridoma in a mammal other than a human. This allows human antibodies to accumulate in the culture.
  • transgenic non-human animals examples include magpies, sheep, goats, pigs, magmas, mice, rats, -birds, monkeys, and egrets.
  • the antibody fragment refers to a fragment containing at least a part of the Fc region of the antibody.
  • the Fc region means a C-terminal region of the H chain of an antibody, a CH2 region and a CH3 region, and includes a natural type and a mutant type thereof. At least a part of the Fc region preferably refers to a fragment containing the CH2 region, more preferably a region containing the first aspartic acid present in the CH2 region.
  • the IgG class Fc region is described in Kabat et al. Index [Shikenshizu-off ,,-Protein's O Breakfast, Imunorojikaru-Intaresu Bok (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , 5 th Ed.
  • Na Numbering means from Cys at position 226 to the C-terminus or from Pro at position 230 to the C-terminus.
  • antibody fragments include H chain monomers and H chain dimers.
  • a fusion protein having a part of the Fc region is defined as a substance obtained by fusing an antibody or a fragment of the antibody containing a part of the Fc region of an antibody with a protein such as an enzyme or cytokin (hereinafter referred to as Fc Fusion protein).
  • the present invention provides: a; an antibody composition produced from 1,6-fucose Z lectin metastatic cells; and an antibody composition produced from 1,6-fucose Z lectin intolerant cells as an active ingredient.
  • the present invention relates to a drug which is an antibody composition having higher ADCC activity than a drug.
  • An antibody composition having a higher ADCC activity than an antibody composition produced from a 1,6-fucose / lectin intolerant cell is produced using the above ⁇ 1,6-fucose / lectin resistant cell. Can be obtained.
  • ADCC activity means that in vivo, an antibody bound to a cell surface antigen such as a tumor cell activates an effector cell through the binding between the antibody Fc region and the Fc receptor present on the effector cell surface.
  • Monoclonal Antibodies Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., Capter 2.1 (1995) ].
  • the effector cells include immune cells such as natural killer cells, macaque phage, monocytes, dendritic cells, and granulocytes.
  • Fc receptors include Fca receptor I, Fc ⁇ receptor I, Fc £ receptor II, (; 0 / Receptor 1, Fey receptor IIa, Fey receptor IIb, Fcy receptor IIc, Fe y receptor IIIa, Fcy receptor IIIb, Fc receptor n, etc.
  • Fcy receptor Ilia is mainly expressed on natural killer cells and is one of the important Fc receptors for ADCC activity Monoclonal 'Anti Bodies: Principles'and' Practice (Monoclonal Antibodies: Principles and practice), Third Edition, Acad. Press, 1996 (hereinafter abbreviated as Monoclonal Antibody).
  • cytotoxic activity of the antibody composition examples include, in addition to ADCC activity, CDC activity (monoclonal antibodies) and activity of inhibiting the growth of antigen-expressing cells by binding to the antigen.
  • Antiproliferative activities include those that promote apoptosis induction and differentiation induction of target cells [Cancer's Research (Cancer Research) 60, 7170 (2000), Nature Medicine 1, 644 (1995), Cell Cell Growth Differ. 3, 401 (1992)].
  • the ratio of sugar chains in which fucose is not linked to N-acetyltyldarcosamine at the sugar chain reducing end is 1,6-fucose
  • the antibody composition is higher than the antibody composition produced from a / lectin-intolerant cell, it has higher ADCC activity than the antibody composition produced by a1,6-fucose lectin intolerant cell.
  • ADCC activity of the antibody composition is increased.
  • fucose binds to N-acetyldarcosamine at the reducing end of the sugar chain among all N-glycoside-linked complex sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition
  • the antibody composition having high ADCC activity produced by CH0 cells includes N-acetyl at the reducing terminal of the sugar chain among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the antibody composition.
  • the ratio of sugar chains in which fucose is not bound to darcosamine is preferably 20% or more, more preferably 30% or more, still more preferably 40% or more, particularly preferably 50% or more, and most preferably 100%.
  • the ratio of the sugar chain in which fucose is not bound to N-acetyldarcosamine at the sugar chain reducing end of the total N-glycoside-linked complex type sugar chain binding to the Fc region contained in the antibody composition is defined as The total number of N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region contained in the composition, relative to the total number of complex-type sugar chains, The ratio of the number.
  • the ratio of sugar chains preferably refers to the ratio of sugar chains in which the 1-position of fucose is not ⁇ - linked to the 6-position of N-acetinolegnorrecosamine at the reducing end of the sugar chain.
  • ⁇ -Glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal ⁇ -acetyldarcosamine has no fucose bonded to it, and the sugar chain is ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal ⁇ -acetyldarco.
  • the ratio of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyltylcolasamine at the sugar chain reducing end contained in a composition comprising an antibody molecule having ⁇ -daricoside-linked complex sugar chains in the Fc region is determined by the ratio of the antibody Using known methods such as hydrazinolysis and enzymatic digestion from molecules [Biochemical Experimental Method 23—Glycoprotein Sugar Chain Research Method (Academic Publishing Center), Reiko Takahashi (1989)], release sugar chains and release the released sugars. It can be determined by labeling the chain with a fluorescent label or an isotope, and separating the labeled sugar chain by chromatography. The released sugar chains can also be determined by analyzing the released sugar chains by the HPAED-PAD method [Journal 'Ob' Liquid 'Chromatography (J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577 (1983)].
  • the antibody is an antibody that recognizes a tumor-associated antigen, an antibody that recognizes an antigen that is associated with allergy or inflammation, an antibody that recognizes an antigen that is associated with a cardiovascular disease, or an antibody that is associated with an autoimmune disease.
  • An antibody that recognizes an antigen or an antibody that recognizes an antigen associated with a viral or bacterial infection is preferable, and the class of the antibody is preferably IgG.
  • Antibodies that recognize tumor-associated antigens include anti-GD2 antibody (Anticancer Res., 13, 331-336, 1993) and anti-GD3 antibody (Cancer Immunol. Immunother., 36, 260-266, 1993), anti-GM2 antibody (Cancer Res., 54, 1511-1516, 1994), anti-HER2 antibody (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992), anti-CD52 antibody (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992), anti-MAGE antibody (British J.
  • Antibodies that recognize antigens associated with allergy or inflammation include anti-interleukin-6 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992) and anti-interleukin-6 receptor antibody (Molecular Immunol., 31, 371- 381, 1994), anti-interleukin 5 antibody (Immunol. Rev., 127, 5-24, 1992), anti-interleukin 5 receptor antibody, anti-interleukin 4 antibody (Cytokine, 3, 562-567, 1991), Anti-interleukin-4 receptor antibody (J. Immunol.
  • anti-tumor necrosis factor antibody Hybridoma, 13, 183-190, 1994
  • anti-tumor necrosis factor receptor antibody Molecular Pharmacol., 58, 237-245, 2000
  • anti-CCR4 antibody Nature, 400, 776-780, 1999
  • anti-chemokine antibody J. Immunol. Meth., 174, 249-257, 1994
  • anti-chemokine Receptor antibody J. Exp. Med., 186, 1373-1381, 1997)
  • an antibody that recognizes an antigen associated with cardiovascular disease is an anti-GpIIb / IIIa antibody (J. Immunol., 152, 2968-2976,
  • Antibodies that recognize antigens associated with viral or bacterial infection include anti-gp120 antibody (Structure, 8, 385-395, 2000), anti-CM antibody (J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998), anti-CCR4 Antibodies, anti-verotoxin antibodies (J. Clin. Microbiol., 37, 396-399, 1999) and the like.
  • the present invention also relates to a method for treating a patient using the medicament of the present invention. Treating a patient with a drug means treating the patient by administering the drug.
  • the present invention relates to a discriminating method for predicting the effect of the medicament of the present invention before administration to a patient. Specifically, a method including the following steps can be mentioned.
  • Host cells for producing the antibody composition used in the present invention can be prepared by the method described below.
  • Host cells can be prepared by targeting the gene for GDP-fucose synthase, a1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein and using a gene disruption method.
  • GDP-fucose synthase include GMD, Fx, GFPP, and Fucokinase.
  • ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme include ⁇ 1,6-fucosyltransferase, a-L-fucosidase and the like.
  • GDP-fucose transport proteins include GDP-fucose transporters.
  • the gene referred to here includes DNA or RNA.
  • the method for gene disruption includes any method capable of disrupting the gene of the target enzyme. Examples include the antisense method, the liposome method, the homologous recombination method, the RNA-DNA oligonucleotide (RD0) method, the RNA interference (RNAi) method, a method using a retrovirus, and a method using a transposon. Can be Hereinafter, these will be described in detail.
  • Host cells target the gene for GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein.
  • Cell engineering 1-239 (1993), Biotechnology (BI0 / TECHN0L0GY) , 17, 1097 (1999), Human 'Molecular' Genetics (Hum. Mol. Genet.), 5, 1083 (1995), Cell Engineering,, 255 (1994), Puguchi Seedings' ob '' The 'National' Academy Using the antisense method or the ribozyme method described in “Ob” Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1886 (1999) and the like, for example, it can be prepared as follows.
  • a suitable DNA fragment containing GDP-fucose synthase, ⁇ , 6-fucose modifying enzyme, or a DNA fragment encoding GDP-fucose transport protein, untranslated region or intron Design a length antisense gene or lipozyme construct.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the prepared DNA fragment or full length downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • host cells by selecting transformants based on the activity of GDP-fucose synthase, a 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein Can be.
  • host cells can also be obtained by selecting transformants using the sugar chain structure of the glycoprotein on the cell membrane or the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index.
  • Host cells used to produce host cells include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, and other target GDP-fucose synthase, 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport Any protein having a protein gene can be used. Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • the expression vector those which can replicate autonomously in the above-mentioned host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a designed antisense gene or a promoter containing a promoter at a position where the ribozyme can be transcribed are used. Specific examples include the expression vectors described in 3. below.
  • the method for introducing a thread-recombinant vector suitable for various host cells described in 3. below can be used.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index include the method described in 1 (5) below.
  • Sugar chain structure of produced antibody molecule Examples of a method for selecting a transformant using the structure as an index include the method described in 5 below and 6 described later.
  • Examples of a method for preparing cDNA encoding GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein include the following methods.
  • Total RNA or mRNA is prepared from tissues or cells of a human or non-human animal.
  • a cDNA library is prepared from the prepared total RNA or mRNA as follows.
  • the cDNA library can be screened to obtain DNA encoding GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein.
  • RNA of human or non-human animal tissues or cells commercially available ones (for example, manufactured by Clontech) may be used, or guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymology (Methods in Enzymology)] ), 154, 3 (1987)], Guadine acid thiocyanate 'Phenol', Cloth-form (AGPC) method [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987); Experimental Medicine, 1937 (1991)], total RNA is prepared from tissues or cells of human or non-human animals, and oligo (dT) -immobilized cellulose column method (Molecular Cloning No. 2 ) is obtained from the obtained total RNA. Version) and the like to prepare mRNA as poly (A) + RNA.
  • Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen)
  • Quick Prep mRNA can also be prepared by using a kit such as the mRNA Purification Kit (Pharmacia).
  • Methods for preparing cDNA libraries from prepared human or non-human animal tissue or cell mRNA include the methods described in Molecular 'Cloying's 2nd edition, Current' Protocols' in Molecular Biology, or ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ An R kit, for example, a method using a Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (manufactured by Life Technologies), a method using a ZAP-cDNA Synthesis Kit (manufactured by STRATAGENE) and the like can be mentioned.
  • any phage vector or plasmid vector can be used as long as it can replicate autonomously in E. coli K12 strain.
  • ZAP Express [STRATAGENE, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research], 17, 9494 (1989) )], Lambda ZAP II (manufactured by STRATAGENE); Lgtl0; Lgtll [DNA cloning, A Practical Approach], 1, 49 (1985)], ⁇ TriplEx (Clontech), Eh ExCell (Pharmacia), PT7T318U (Pharmacia), pcD2 [Molecular 'Cellular Biology (Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] and pUC18 [Gene (Gene), 33, 103 (1985)].
  • Escherichia coli As a host microorganism for producing a cDNA library, any microorganism can be used, but Escherichia coli is preferably used. Specifically, Escherichia coli XLl-Blue MRF '[STRATAGENE, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli circle 522 [Giananoleob molecular] 'Biology (J. Mol.
  • This cDNA library can be used as is for subsequent analyses, but in order to reduce the percentage of incomplete-length cDNAs and obtain full-length cDNAs as efficiently as possible, the oligocap method developed by Sugano et al. [Gene , 138, 171 (1994); Gene, 200, 149 (1997); Protein nucleic acid enzyme, ⁇ , 603 (1996); Experimental medicine, ⁇ , 2491 (1993); cDNA cloning (Yodosha) (1996) ); Preparation of gene library (Yodosha) (1994)].
  • a cDNA library prepared using the method described above may be used for the following analysis.
  • the DNA library was designed using the generated cDNA library as a type III DNA polymerase by PCR (PCR Protocols, Academic Press (1990)). By performing the amplification, a gene fragment encoding GDP-fucose synthase, oil, 6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein can be obtained.
  • That the obtained gene fragment is a DNA encoding GDP-fucose synthase, ⁇ ; 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein
  • a commonly used nucleotide sequence analysis method for example, Sanger. Dididoxy method [Procedures 'ob' the 'Nashinanore' academy 'ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA),, 5463 (1977)] or ABIPRISM377 DNA sequencer (PE Biosysteras) It can be confirmed by analysis using a base sequence analyzer such as the above.
  • a cDNA or a cDNA library synthesized from mRNA contained in human or non-human animal tissues or cells using DNA as a probe is used for co-primary hybridization / plaque hybridization (molecular weight).
  • Cloning (2nd edition) can provide DNA for GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein.
  • GDP-fucose synthase, al, 6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose Using the primers used to obtain the gene fragment encoding the transport protein, using a cDNA or cDNA library synthesized from mRNA contained in tissues or cells of human or non-human animals as a type I, PCR method By performing the screening in this manner, DNA of GDP-fucose synthase, ⁇ ; 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein can also be obtained.
  • the nucleotide sequence of the obtained DNA encoding the GDP-fucose synthase, the 1,6-fucose modifying enzyme, or the GDP-fucose transport protein can be converted from the end to a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the method of Sanger et al.
  • the dideoxy method [Procedinations 'ob' the 'National' academy 'ob' science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74, 5463 (1977)] or ABIPRISM377 DNA sequencer (PE Biosystems)
  • the nucleotide sequence of the DNA is determined by performing analysis using the nucleotide sequence analyzer described above.
  • a homology search program such as BLAST to search base sequence databases such as GenBank, EMBL and DDBJ, GD p-fucose synthesis among the genes in the database Genes encoding enzymes, 0: 1,6-fucose modifying enzymes, or GDP-fucose transport proteins can also be determined.
  • GD P- fucose synthase alpha 1, 6 - genomic DNA of fucose modifying enzyme, or GDP- fucose transport ⁇ white matter, for example, in Molecular 'Kuroengu second plate and Current' Protocols 'in' Molecular Biology, etc.
  • the known methods described above can be mentioned. It can also be prepared by using a genomic DNA library screening system (Genome Systems) or Universal GenomeWalker TM Kits (CL0NTECH).
  • Host cells can also be obtained by introducing oligonucleotides or liposomes directly into the host cells.
  • the antisense oligonucleotide or ribozyme can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer. Specifically, of the nucleotide sequences of cDNA and genomic DNA encoding GDP-fucose synthase, 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein, 5 to 150 contiguous bases, preferably 5 An oligonucleotide corresponding to a sequence complementary to the oligonucleotide (antisense oligonucleotide) or the oligonucleotide based on the sequence information of the oligonucleotide having a sequence corresponding to 6060 bases, more preferably 10 to 40 bases Can be prepared by synthesizing a ribozyme containing the sequence of
  • oligonucleotide examples include an oligonucleotide and a derivative of the oligonucleotide (hereinafter, referred to as an oligonucleotide derivative).
  • Oligonucleotide derivatives include oligonucleotide derivatives in which the phosphodiester bond in the oligonucleotide is converted to a phosphorothioate bond, and phosphodiester bonds in the oligonucleotide to the ⁇ 3'-P5 'phosphoramidate bond.
  • oligonucleotide derivative in which ribose and phosphoric acid diester bond in oligonucleotide is converted to peptide nucleic acid bond
  • oligonucleotide derivative in which peracyl in oligonucleotide is substituted by 5-piperperacyl oligo Derivatives in which peracyl in nucleotides is substituted with C-5 thiazole peracyl
  • Oligonucleotides oligonucleotide derivatives in which cytosines in oligonucleotides are substituted with C-5 probucytosine, in oligonucleotides
  • Oligonucleotide derivatives in which tosin is substituted with phenoxazine-modified cytosine oligonucleotide derivatives in which the ribose is substituted with 2, -0-propylribose, or oligonucleotides in which the
  • Host cells are prepared by targeting the gene for GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein, and modifying the target gene on the chromosome using homologous recombination. be able to.
  • ES cells Abbreviation of “used mutant mouse” The modification of the target gene on the chromosome is described in the Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (hereinafter abbreviated as "manipulating the mouse Embryo A laboratory manual”). ), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Biomanual Series 8 Gene Targeting, Generation of Mutant Mice Using ES Cells, Yodosha (1995) (hereinafter referred to as “ES cells Abbreviation of “used mutant mouse”) and the like, for example, as follows.
  • a target gene to be modified eg, GDP-fucose synthase, ⁇ ; 1,6-fucose modifying enzyme, or structural gene of GDP-fucose transport protein, or promoter gene
  • a target gene to be modified eg, GDP-fucose synthase, ⁇ ; 1,6-fucose modifying enzyme, or structural gene of GDP-fucose transport protein, or promoter gene
  • a host cell can be prepared by introducing the prepared target vector into a host cell and selecting a cell in which homologous recombination has occurred between the target gene and the target vector.
  • yeast animal cells, insect cells, plant cells and the like, GDP targeting - as it has a gene of fucose modifying enzyme, or GDP- fucose transport protein - fucose synthase, alpha 1, 6 Any of them can be used.
  • Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • the method for preparing genomic DNA of GDP-fucose synthase, al, 6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein includes the method of preparing genomic DNA described in (1) (a) of 1) above. And so on.
  • Target vectors for homologous recombination of the target gene can be prepared according to the methods described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), Production of Mutant Mice Using ES Cells, etc. it can.
  • the target vector may be either a replacement type or an insertion type.
  • the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3. below can be used.
  • Methods for efficiently selecting homologous recombinants include, for example, the gene selection method described in Gene Targeting, A Practical Approach, ⁇ RL Press at Oxford University Press (1993), the production of mutant mice using Itoda vesicle, and the like. Methods such as selection, negative selection, and poly A selection can be used. Methods for selecting the desired homologous recombinants from the selected cell lines include Southern hybridization (genomic DNA cloning, 2nd edition) for genomic DNA and PCR.
  • the host cell can be prepared using the RD0 method, targeting the GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or the gene for GDP-fucose transport protein, for example, as follows.
  • an appropriate length including a portion encoding GDP-fucose synthase, a 1,6-fucose-modifying enzyme, or a GDP-fucose transport protein, an untranslated region or an intron.
  • RD0 construct and synthesize.
  • the synthesized RD0 is introduced into host cells, and the target enzyme, ie, GDP-fucose synthase, 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein is mutated.
  • the target enzyme ie, GDP-fucose synthase, 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein is mutated.
  • Host cells include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc., as long as they have the target GDP-fucose synthase, ⁇ 1- fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein gene. Can also be used. Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • RD0 For the introduction of RD0 into various host cells, the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3 below can be used.
  • Method for preparing DNA and the like.
  • Methods for preparing genomic DNA of GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein include, for example, genomic DNA described in (a) of (1) above. And the like.
  • the DNA base sequence is digested with an appropriate restriction enzyme and the like, cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), and subjected to a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method of Sanger et al. [Proceding of the National 'Academy' of Science (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74, 5463 (1977)], etc.
  • the nucleotide sequence of the DNA can be determined by analysis using ALF DNA Sequencer (Pharmacia) or the like.
  • RD0 can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer.
  • RD0 As a method for introducing RD0 into host cells and selecting a transformed strain in which the gene for the targeted enzyme, GDP-fucose synthase, al, 6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein has been mutated, For example, there is a method for directly detecting a mutation of a gene on a chromosome described in Molecular 'Cloning 2nd edition, Current' protocol, In. Molecular.
  • transformants are selected based on the activity of GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein described in (a) of (1) above.
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as described in 1 (5) below as an index can also be used.
  • RD0 The construction of RD0 is described in Science, 273, 1386 (1996); Nature Medicine, 4, 285 (1998); Hepatology, 25, 1462 (1997). Gene'Therapy, 5, 1960 (1999); Gene'Therapy, 5, 1960 (1999); Journal of the Molecular, Medicine (J. Mol. Med.), 75 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8774 (1999); Proceedings' op 'the' National. ⁇ Academy ⁇ Ob'Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768 (1999); Nuku Reitsk 'Acid' Research (Nuc. Acids. Res.), 27, 1323 (1999); Invest. Dematol., 111, 1172 (1998); Nature Biotechnology. tech.), 16, 1343 (1998); Nature Biotech., 18, 43 (2000); Nature's Biotech., 18, 555 (2000), etc. Can be designed according to
  • Host cells should target the gene for GDP-fucose synthase, al, 6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein, and be prepared using the RNAi (RNA interference) method, for example, as follows: Can be.
  • RNAi RNA interference
  • RNAi gene of appropriate length, including a portion encoding GDP-fucose synthase, al, 6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein or an untranslated region.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the host cell As the host cell, as it has a yeast, animal cells, insect cells, plant cells and the like, GDP-fucose synthase targeting, alpha 1, 6- fucose modifying enzyme or GDP-gene fucose transport protein Any of them can be used. Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • RNAi gene As the expression vector, those which can replicate autonomously in the above host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position where the designed RNAi gene can be transcribed are used. Specific examples include the expression vectors described in 3. below.
  • the method for introducing a transfection vector suitable for various host cells described in 3. below can be used.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index include the method described in 1 (5) below. Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5 below or 6 described below.
  • Methods for preparing cDNA for GDP-fucose synthase, 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein include, for example, the DNA preparation described in (a) of (1) above. Method.
  • Host cells can also be obtained by directly introducing the RNAi gene designed based on the nucleotide sequence of the element or the GDP-fucose transport protein into the host cell.
  • the RNAi gene can be prepared by a conventional method or by using a DNA synthesizer.
  • the RNAi gene construct is described in [Nature, 391, 806 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA], 95, Science, Proc. Natl. Acad. Sci. , 15502 (1998); Nature, 395, 854 (1998); Puguchi Seedings' Ob 'The' National 'Academy ⁇ ⁇ Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96 , 5049 (1999); Senore (Cell), 95, 1017 (1998); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the host cell can be prepared using the transposon system described in Nature Genet., 25, 35, (2000), etc., using GDP-fucose synthase, 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP- Host cells can be prepared by selecting mutants based on the activity of the fucose transport protein or the antibody chain produced or the sugar chain structure of the glycoprotein on the cell membrane.
  • the transposon system is a system in which a foreign gene is randomly inserted into a chromosome to induce mutation.
  • a foreign gene contained in a transposon is used as a vector to induce mutation, and this gene is used as a gene.
  • a transposase expression vector for random insertion into the chromosome is simultaneously introduced into the cells.
  • Any transposase can be used as long as it is suitable for the sequence of the transposon to be used.
  • any gene can be used as long as it can induce mutation in the DNA of the host cell.
  • Host cells include yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc. that have the gene for the target GDP-fucose synthase, a 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein. Any of them can be used. Specific examples include the host cells described in 3. below. For the introduction of the gene into various host cells, the method for introducing a recombinant vector suitable for various host cells described in 3. below can be used.
  • Methods for selecting mutants based on the activity of GDP-fucose synthase, 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein include, for example,
  • a method for selecting a mutant using the sugar chain structure of a glycoprotein on a cell membrane as an index includes, for example, the method described in 1 (5) below.
  • Examples of a method for selecting a mutant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5 below or 6 described later.
  • Host cells can be prepared by targeting the gene for GDP-fucose synthase, al, 6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein and introducing a dominant negative form of the enzyme.
  • GDP-fucose synthase include GMD, Fx, GFPP and Fucokinase.
  • 1,6-fucose modifying enzymes include, specifically, ⁇ 1,6-fucosyltransferase, ⁇ -L-fucosidase and the like.
  • Specific examples of the GDP-fucose transport protein include the GDP-fucose transporter.
  • dominant negatives can be prepared by comparing homology and predicting the three-dimensional structure based on amino acid sequence information. Genes incorporating such amino acid substitutions can be prepared using the site-directed mutagenesis method described in Molecular 'Clawing, 2nd edition, Current' Protocols in 'Molecular biology, etc. .
  • the host cells were prepared using the dominant-negative gene of the target enzyme prepared as described above, using molecular cloning 'cloning 2nd edition, current' protocols' in 'molecular uraichi' biology, and According to the gene transfer method described in the 2nd edition and the like, for example, it can be prepared as follows.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the protein is prepared as necessary.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or the full-length DNA downstream of an appropriate expression vector promoter.
  • a transformant is obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the host cell used in the present invention can be prepared.
  • yeast animal cells, insect cells, plant cells and the like, GDP-fucose synthase targeting, alpha 1, 6 - as it has a gene of fucose modifying enzyme or GDP-fucose transport protein Any of them can be used.
  • Specific examples include the host cells described in 3. below.
  • the expression vector those which can replicate autonomously in the above-mentioned host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position capable of transcribing the DNA encoding the desired dominant negative body are used. Specific examples include the expression vectors described in 3. below.
  • Methods for selecting a transformant using the activity of GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein as an index include, for example, the method described in (1) (a) above. The method described above can be used.
  • a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the bran protein on the cell membrane as an index includes, for example, the method described in 1 (5) below.
  • Examples of a method for selecting a transformant using the sugar chain structure of the produced antibody molecule as an index include the method described in 5 below or 6 described below.
  • the host cell is a method for introducing a mutation in the gene for GDP-fucose synthase, al, 6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein, and selecting a desired cell line in which the enzyme has been mutated.
  • GDP-fucose synthase include GMD, Fx, GFPP and Fucokinase.
  • Specific examples of the 1,6-fucose modification enzyme include Q; 1,6-fucosyltransferase, ⁇ -L-fucosidase and the like.
  • Specific examples of the GDP-fucose transport protein include the GDP-fucose transporter.
  • Methods for introducing mutations into enzymes include the following: 1) From a mutant obtained by treating a parent strain by a mutagenesis treatment or a spontaneously occurring mutant, a GDP-fucose synthase, a 1,6- A method for selecting a desired cell line using the activity of a fucose modifying enzyme or GDP-fucose transport protein as an index, 2) From a mutant obtained by treating a parent strain by a mutagenesis treatment or a naturally occurring mutant A method of selecting a desired cell line using the sugar chain structure of a produced antibody molecule as an index, 3) a cell membrane of the cell from a mutant or a spontaneously generated mutant obtained by treating a parent strain by mutagenesis treatment. A method of selecting a desired cell line using the sugar chain structure of the above glycoprotein as an index may be mentioned.
  • any treatment that induces a point mutation, deletion or frame shift mutation in the DNA of the cell line of the parent strain can be used.
  • Spontaneously occurring mutants include those spontaneously generated by continuing subculturing under normal cell culture conditions without special mutagenesis treatment. .
  • Host cells target the gene for GDP-fucose synthase, al, 6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein, and use antisense RNA / DNA technology in radio science and industry, 322 (1992). ), Eigaku, 681 (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992), Cell engineering, 16, 1463 ( 1997)], triple helix technology [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)] and the like to suppress the transcription or translation of the target gene.
  • GDP-fucose synthase examples include GMD, Fx, GFPP, and Fucokinase.
  • al, 6-fucose modifying enzyme examples include ctl, 6-fucosyltransferase, CK-L-fucosidase and the like.
  • GDP-fucose transport proteins include, specifically, GDP-fucose transporters.
  • a method for selecting a strain that is resistant to a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetyldarcosamine and the 1-position of fucose at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain are ⁇ -linked It is prepared by using a method that selects a strain that is resistant to a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end of ⁇ -glycoside-linked sugar chain and the 1-position of fucose are linked be able to.
  • Methods for selecting a strain that is resistant to a lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of ⁇ -glycidyl-linked glycan-linked sugar chain reducing end and 1-acetyldarcosamine at the 1-position of fucose are ⁇ -linked include, for example, A method using a lectin described in Somatic Cell “Mole. Genet.”, 12, 51 (1986) and the like.
  • any lectin can be used as long as it recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of ⁇ ⁇ -glycidyl-linked glycan at the reducing end and the 1-position of fucose are linked.
  • specific examples are Lentil Lectin LCA (Lentil Agglutinin from Lens Culinaris), Endome Lectin And PSA (Pe sum sativum-derived Pea Lectin), broad bean lectin VFA (Vicia faba-derived Agglutinin), and Hilochawantake lectin AAL (Aleuria aurantia-derived Lectin).
  • the cells are cultured in a medium containing the above lectin at a concentration of 1 ⁇ g / ml to 1 mg / ml for 1 day to 2 weeks, preferably for 1 day to 1 week, and surviving cells are subcultured.
  • the colony is picked up, transferred to another incubator, and further cultured in a lectin-containing medium, whereby N-glycoside-linked sugar chain reducing terminal N-acetyldarcosamine at position 6 is linked to position 1 of fucose.
  • a strain that is resistant to a lectin that recognizes the resulting sugar chain structure can be selected.
  • Methods for confirming lectin-resistant cells include methods for confirming the expression of GDP-fucose synthase, a 1,6-fucose modifying enzyme or GDP-fucose transport protein, and culturing cells in a medium containing lectin directly. And the like. Specifically, the expression level of ⁇ 1,6-fucosyltransferase mRNA, one of the al, 6-fucose modifying enzymes, is measured in cells, and if mRNA expression is reduced, lectin-resistant cells are used. It can be said that there is.
  • the antibody composition used in the present invention has an activity of at least one protein selected from the group consisting of GDP-fucose synthase, ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme and GDP-fucose transport protein. It can be produced using a transgenic non-human animal or plant whose genomic gene has been modified so as to reduce or delete it, or a progeny thereof. Transgenic non-human animals or plants or their progeny can be prepared using the same method as described in 1., targeting the gene of the protein described above.
  • the target non-human animal for example, embryonic stem cells such as a pig, a sheep, a goat, a pig, a pig, a mouse, a rat, a chick, a monkey, a rabbit, etc.
  • embryonic stem cells such as a pig, a sheep, a goat, a pig, a pig, a mouse, a rat, a chick, a monkey, a rabbit, etc.
  • the activity of GDP-fucose synthase, 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein is reduced.
  • a deleted or deleted embryonic stem cell can be produced.
  • a gene encoding a GDP-fucose synthase, a 1,6-fucose modifying enzyme, or a GDP-fucose transport protein on a chromosome is subjected to a known homologous recombination technique [for example, Nature, 326, 6110, 295 (1987), Cell, 51, 3, 503 (1987), etc.] to produce a mutant clone inactivated or substituted with an arbitrary sequence.
  • a mutant clone inactivated or substituted with an arbitrary sequence.
  • chimeric individuals comprising embryonic stem cell clones and normal cells are prepared by a technique such as injection chimera method or assembly chimera method of injecting fertilized eggs of animals into blastocyst. be able to.
  • Target vectors for homologous recombination of target genes can be prepared according to the methods described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), ⁇ ⁇ Preparation of Mutant Mouse Using Cells, etc. it can.
  • As the target vector any of a replacement type, an insertion type, and a gene trap type can be used.
  • any method for introducing a target vector into embryonic stem cells any method can be used as long as DNA can be introduced into animal cells.
  • electoporation method Cytotechnology, 3, 133 ( 1990)
  • phosphoric acid method Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2-227075
  • riboxoxy method Procedures of the National Academy of Sciences ( proc . Natl. Acad. Sci.
  • Methods for efficiently selecting homologous recombinants include, for example, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), and methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, and poly-A selection described in the production of mutant mice using ES cells can be used.
  • a target vector containing the hprt gene after transfection into embryonic stem cells lacking the hprt gene, the embryonic stem cells are cultured in a medium containing aminopterin, hypoxanthine and thymidine, and an aminobuterin-resistant strain is obtained.
  • an aminobuterin-resistant strain is obtained.
  • a target vector containing a neomycin resistance gene embryonic stem cells into which the vector has been introduced are cultured in a medium containing G418, and G418-resistant strains are selected to select homologous recombinants containing the neomycin resistance gene. Positive selections can be made.
  • the embryonic stem cells into which the vector has been introduced are cultured, and the growing strain is selected.
  • the recombinant inserted into the chromosome at random other than homologous recombination is the DT gene Since the DT gene is integrated into the chromosome and cannot be grown due to the toxicity of DT), it is possible to perform a negative selection for selecting a homologous recombinant containing no DT gene.
  • Methods for selecting the desired homologous recombinant from the selected cell lines include the Southern hybridization method for genomic DNA (Molecular Cloning, 2nd edition) and the PCR method [PCAll Protocols]. (PCR Protocols), Academic Press (1990)] and the like.
  • embryonic stem cells When embryonic stem cells are incorporated into a fertilized egg by using the chimeric assembly method, it is generally preferable to use a fertilized egg at a developmental stage before the 8-cell stage. When embryonic stem cells are incorporated into a fertilized egg using the injection chimera method, it is generally preferable to use a fertilized egg from the 8-cell stage to the stage of blastocyst development.
  • Pseudopregnant female mice can be obtained by natural mating, but are mated with male mice after administration of luteinizing hormone-releasing hormone (hereinafter abbreviated as LHRH) or an analog thereof. Induces fertility Pseudopregnant female mice can also be obtained.
  • LHRH luteinizing hormone-releasing hormone
  • LHRH As analogs of LHRH, for example, [3,5-Dil-Tyr5] -LHRH, [Gln8] -LHRH, [D-Ala6] -LHRH, des-GlylO- [D-His (Bzl) 6] -LHRH ethylamide And the like.
  • a method similar to the method described in 1. is applied to the target non-human animal, for example, a fertilized egg cell such as a red sea lion, a sheep, a goat, a stag, a poma, a mouse, a rat, a chicken, a monkey, or a rabbit.
  • a fertilized egg cell such as a red sea lion, a sheep, a goat, a stag, a poma, a mouse, a rat, a chicken, a monkey, or a rabbit.
  • the fertilized egg cells thus prepared are transplanted into the oviduct or uterus of a pseudopregnant female using the method of embryo transfer described in Mar-Purifying 'Mouse' Amplio 2nd Ed.
  • Transgenic non-human animals having reduced or deleted activity of ⁇ 1,6-fucose modifying enzyme or GDP-fucose transport protein can be produced.
  • the target plant virulent cells or cells can be treated with GDP-fucose synthase, ai, e-cose-modifying enzyme, or GDP-fucose by using the same method as described in 1.
  • Virucius in which the activity of the transport protein is reduced or deleted can be produced.
  • the prepared calli were used in a known method [tissue culture, ⁇ (1994); tissue culture, 21 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)]. Similarly, by culturing the cells in a medium containing auxin and cytokaiyun, the activity of GDP-fucose synthase, 1,6-fucose modifying enzyme, or GDP-fucose transport protein is reduced or absent. Lost transgenic plants can be produced. 3. Production method of antibody composition
  • Antibody compositions are described in Molecular 'Cloating Second Edition, Current' Protocols' in Molecule> ⁇ Nodilon, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (hereinafter abbreviated as Antipodis), Monoclonal Noreantevoice, Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (hereinafter abbreviated as Antibody Engineering), etc. And can be obtained.
  • a full-length cDNA of the antibody molecule is prepared, and a DNA fragment of an appropriate length containing a portion encoding the antibody molecule is prepared.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the DNA fragment or full-length cDNA downstream of the promoter of an appropriate expression vector.
  • a transformant producing an antibody molecule By introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector, a transformant producing an antibody molecule can be obtained.
  • the host cell As the host cell, the host cell described in 1 above, which can express a target gene, such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, is used.
  • a target gene such as yeast, animal cells, insect cells, and plant cells.
  • those which can replicate autonomously in the above-mentioned host cells or can be integrated into the chromosome, and which contain a promoter at a position where the DNA encoding the antibody molecule of interest can be transcribed are used.
  • cDNA is prepared from human or non-human animal tissues or cells using a probe primer specific for the target antibody molecule, etc., according to the DNA preparation method described in (1) (a) above. can do.
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419) and the like. Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains. For example, promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter , The gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock protein promoter, MF al promoter, CUP 1 promoter and the like can be mentioned.
  • the host cell Saccharomyces, Schizosaccharomyces genus, Kuryui base mouth Mrs. genus, bird Kosuporon genus, Shuwa - yeast belonging to Omisesu genus like, for example, accharomvces cerevi ⁇ iae, schizosaccharomyces pombs, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans s Schwanniomyces alluvius You can give S, etc.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast. For example, an electoporation method [Methods.
  • examples of expression vectors include pcDNAI, pcDM8 (commercially available from Funakoshi), AGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3 -3 [Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075], pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [Journal of Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210 and the like.
  • any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • the promoter of the immediate early (IE) gene of cytomegalovirus (CMV) the early promoter of SV40, the promoter of retro-inoles, Meta mouth thionein promoter, heat shock promoter, SR o; promoter and the like.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Host cells include Namalwa cells, human cells, COS cells, monkey cells, CH0 cells, Chinese hamster cells, HBT5637 (Japanese 63-299), rat myeloma cells, mouse myeloma cells, Syrian hamsters, kidney-derived cells, embryonic stem cells, and fertilized egg cells.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it introduces DNA into animal cells. Examples thereof include electoporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and calcium phosphate.
  • Method Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075
  • Lipofxion method Lipofxion method [Procedin's' ob 'the' national 'academy 1 ' science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 84. 7413 (1987)]
  • Injection method manipulating 'the' mouse 'Emprio' a 'laboratory' manual
  • method using particle gun (gene gun)
  • Japanese Patent No. 2606856 Japanese Patent No.
  • the current protocol is used, such as, for example, Molecule Fufu // Zolo, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992),
  • the protein can be expressed by the method described in Bio / Technology, 6, 47 (1988).
  • the recombinant gene transfer vector and paculovirus are co-transfected into insect cells to obtain the recombinant virus in the culture supernatant of insect cells, and then the insect virus is further infected with the recombinant virus to express the protein. be able to.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitorogen) and the like.
  • the baculovirus for example, Autographa californica nucii ear polyhedrosis virus, which is a virus that infects insects of the night roth moth family, such as Autographa californica nucaria ear polyhedrosis virus, can be used.
  • Insect cells include Sf9 and Sf21, which are ovarian cells of Spodopterafrugiperda [current protoconoles 'in' molecular / biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)], Trichoplusia Ni 5 ovarian cells such as High 5 (manufactured by Invitrogen) can be used.
  • Examples of a method for co-transferring the above-mentioned recombinant gene introduction vector and the above-mentioned paculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include a calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), a ribofusion method [Proceedings 'Op' The 'Na' Nanole 'Academy' 'Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 84, 7413 (1987)].
  • examples of the expression vector include Ti plasmid and tobacco mosaic virus vector.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) and the geneactin 1 promoter.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • Examples of the host cell include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, abrana, alfa alfa, rice, wheat, and wheat.
  • any method for introducing DNA into plant cells can be used.
  • a method using Agrobacterium Japanese Patent Laid-Open No. 59-140885, 60-78080, W094 / 00977
  • electoral-portion method JP-A-60-251887
  • method using particle gun Japanese Patent No. 2606856, Japanese Patent No. 2517813
  • a method for expressing the gene in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression between the Fc region and other proteins, and the like can be performed according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition.
  • an antibody molecule having a sugar or a sugar chain attached thereto by the introduced gene can be obtained.
  • the antibody composition can be produced by culturing the transformant obtained as described above in a medium, producing and accumulating antibody molecules in the culture, and collecting from the culture.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing host cells.
  • the medium for culturing the transformant obtained by using the yeast as a host is a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like, which can be used by the yeast, and which can efficiently culture the transformant. If so, either a natural medium or a synthetic medium may be used.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by the yeast, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and the like. Alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other inorganic or organic acid ammonium salts, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, Yeast extract, cone chip liquor, casein hydrolyzate, soybean lees soybean lees hydrolysate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium potassium phosphate potassium potassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, man sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the cultivation temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the cultivation time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using an inorganic or organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • culturing yeast transformed with a recombinant vector using the lac promoter culturing yeast transformed with isopropyl-i3-D-thiogalatatopyranoside or the like using the recombinant vector using the trp promoter is used. When doing so, it may be possible to add indol acrylic acid or the like to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host a commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American] (The Journal of the American) Medical Association), 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], around Danorebecco's modified MEM medium [Virology], 8, 396 (1959) ], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine], 73, 1 (1950)], Whitten medium [Development Engineering Experiment How to Make Your-Transjeuc Mouse (Kodansha) Motoya Katsuki (ed., 1987)] or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to these mediums can be used.
  • Culture is carried out usually p H6 ⁇ 8, 30 ⁇ 40 ° C, 5 % C0 2 present 1 to 7 days under conditions such as lower. If necessary, an antibiotic such as kanamycin or penicillin may be added to the medium during the culture.
  • Culture media for transformants obtained using insect cells as hosts include commonly used TNM-FH media (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies), ExCell400, ExCell405 (All manufactured by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] and the like can be used.
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6 to 7 and 25 to 30 ° C for 1 to 5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ. Examples of a medium for culturing the transformant include commonly used Murashige 'and' Stag (MS) medium, white (White) medium, and medium obtained by adding plant hormones such as auxin and cytokinin to these mediums. Can be used.
  • Cultivation is usually performed at pH 5 to 9 and 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • an antibiotic such as kanamycin or hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from a yeast, animal cell, insect cell or plant cell having a recombinant vector into which DNA encoding the antibody molecule has been incorporated is cultured according to a conventional culture method, and the antibody composition is prepared.
  • the antibody composition can be produced by producing, accumulating, and collecting the antibody composition from the culture.
  • Methods for producing the antibody composition include a method of producing the antibody composition in a host cell, a method of secreting the antibody out of the host cell, and a method of producing the antibody composition on the host cell outer membrane. The method can be selected by changing the structure.
  • the DNA encoding the antibody molecule and the DNA encoding the signal peptide suitable for the expression of the antibody molecule are added to the expression vector using a gene recombination technique.
  • the desired antibody composition can be positively secreted out of the host cell.
  • the production amount can be increased by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the transgenic animal or plant cells are redifferentiated to create an animal (transgenic non-human animal) or plant (transgene plant) into which the gene has been introduced. Can be used to produce an antibody composition.
  • the transformant is an animal or plant individual
  • the animal is bred or cultivated according to a conventional method to produce and accumulate the antibody composition, and the antibody composition is collected from the animal or plant individual.
  • the antibody composition can be produced.
  • an antibody composition is produced and accumulated in the animal, and the antibody composition is collected from the animal.
  • An antibody composition can be produced.
  • the production and accumulation site in the animal include milk (eg, JP-A-63-309192) and eggs of the animal.
  • Any promoter that can be used in this case can be used as long as it can be expressed in animals. Examples of such promoters include the mammary gland cell-specific promoters, the casein promoter, the j3 casein promoter, the ⁇ ratatoglobulin promoter, and whey acid.
  • a protein promoter or the like is preferably used.
  • Methods for producing an antibody composition using plant individuals include, for example, transgenic plants into which DNA encoding antibody molecules has been introduced [Tissue culture, ⁇ (1994); Tissue culture, ⁇ 1 (1995). ); Cultivated according to Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)] to produce and accumulate the antibody composition in the plant, and to obtain the antibody composition from the plant.
  • a method of producing an antibody composition by collecting the antibody can be mentioned.
  • An antibody composition produced by a transformant into which a gene encoding an antibody molecule has been introduced is, for example, when the antibody composition is expressed in a lysed state in cells, after completion of the culture, the cells are collected by centrifugation. After suspension in an aqueous buffer, the cells are disrupted with an ultrasonic crusher, French press, Mentongaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using a resin such as getylaminoethyl (DEAE) -Sepharose, DIAI0N HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation), and a resin using a resin such as S-Sepharose FF (manufactured by Pharmacia) Ion-exchange chromatography, hydrophobic mouth chromatography using resins such as butinoresepharose, pheninoresepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity mouth chromatography, chromatofocusing, isoelectrics Using a method such as electrophoresis such as point electrophoresis alone or in combination, a purified sample of the antibody composition can be obtained.
  • a resin such as getylaminoethyl (DEAE) -S
  • the cells are similarly collected, crushed, and centrifuged to collect the insoluble substance of the antibody composition as a precipitate fraction.
  • the recovered insoluble form of the antibody composition is solubilized with a protein denaturant.
  • a purified sample of the antibody composition can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the antibody composition or a derivative thereof can be collected in the culture supernatant. That is, a soluble fraction is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation in the same manner as described above.
  • a purified sample of the antibody composition can be obtained.
  • Examples of the antibody composition thus obtained include an antibody, a fragment of the antibody, a fusion protein having an Fc region of the antibody, and the like.
  • an antibody composition a composition of a humanized antibody and a method of producing an Fc fusion protein will be described, but other antibody compositions are obtained in the same manner as the above method. You can also.
  • a humanized antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which genes encoding human antibody CH and CL have been incorporated, and the gene encoding human antibody CH and CL has been added to the animal cell expression vector. Each can be constructed by cloning.
  • the C region of a human antibody can be CH and CL of any human antibody.
  • the C region of the IgGl subclass of the H chain of a human antibody hereinafter referred to as hCy1
  • human And the C region of the ⁇ class of the L chain of the antibody hereinafter referred to as hC / c).
  • genes encoding CH and CL of the human antibody chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used, and cDNA can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express the gene encoding the C region of the human antibody.
  • PAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [Journal 'Op' Piochemistry (J. Biochem.), 101, 1307 (1987)]
  • PHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proceedings of the National Academy of Sciences ( proc . Natl. Acad. Sci. USA), 78, 1527 (1981)]
  • pSGl ⁇ d2-4 Site Technology (Cytotechnology), 4.173 (1990)].
  • the promoters and enhancers to be used include the early promoter and enhancer of SV40 [Journal 'Op', Piochemistry (J. Biochem.), 101, 1307 (1987)], Moroni mouse leukemia virus LTR radiochemical 'and'. “Research” Communications (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 149, 960 (1987)], Immunoglobulin H chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and Enhancer [ Cell, 33> 717 (1983)].
  • the vector for expressing a humanized antibody can be either a type in which the antibody H chain and the L chain are present on separate vectors or a type in which the antibody is present on the same vector (hereinafter referred to as a tandem type). Tandem-type humans because of the ease of constructing a humanized antibody expression vector, the ease of introduction into animal cells, and the balance between the expression levels of antibody H and L chains in animal cells. Preferred is a vector for expressing a conjugated antibody [Journal "Immunological" Methods (J. Immunol. Methods), 167, 271 (1994)].
  • the constructed humanized antibody expression vector can be used for expression of a human-type chimeric antibody or a human-type CDR-transplanted antibody in animal cells.
  • CDNAs encoding non-human animal antibodies for example, VH and VL of mouse antibodies, can be obtained as follows.
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing the desired mouse antibody, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • each recombinant plasmid is isolated.
  • the entire nucleotide sequence of VH and VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH and VL is deduced from the nucleotide sequence.
  • any animal can be used as long as hybridoma cells can be produced, such as mice, rats, hamsters, and egrets.
  • Methods for preparing total RNA from hybridoma cells include guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzyraol., 154, 3 (1987)], and mRNA from total RNA.
  • kits for preparing mRNA from hybridoma cells include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia), and the like.
  • cDNA For the synthesis of cDNA, use a standard method for preparing a cDNA library [Molecular Cloning 2nd Edition, Current 'Protocols in' Molecular Biology, Supplement 1-34], or a commercially available kit. For example, a method using a Super Script TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL) or a ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene) can be used.
  • any vector can be used as a vector for incorporating a cDNA synthesized as a type III mRNA extracted from a hybridoma cell, as long as the vector can incorporate the cDNA.
  • any Escherichia coli can be used as long as the cDNA library can be introduced, expressed and maintained.
  • XL1-Blue MRF [Strategy Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [Journal 'Op Molecular' Biology (J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983)], K802 [Journal of Molecular Biol., 16, 118 ( 1966)] and J1105 [Gene, 38, 275 (1985)].
  • Methods for selecting cDNA clones encoding VH and VL of non-human animal antibodies from cDNA libraries include colony hybridization or plaque hybridization using isotope or fluorescently labeled probes. Method (Molecular 'Claw Young 2nd Edition).
  • primers are prepared, and cDNA synthesized from mRNA or cDNA library is designated as type I, and the VH and VH are synthesized by Polymerase Chain Reaction (hereinafter referred to as PCR method; Molecular Cloning 2nd Edition, Supplement 1-34).
  • CDNA encoding VL can also be prepared.
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, Sanger ( Sanger) et al. [Proceedings of the National Academy Off, Science (Proc. Natl. Acad. Sci., USA), 74, 5463 (1977)]
  • the base sequence of the cDNA can be determined by analysis using an automatic base sequence analyzer such as ALF DNA Sequencer (Pharmacia).
  • the cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody is cloned upstream of the gene encoding CH and CL of the human antibody in the humanized antibody expression vector described in (1) of Section 3
  • Type chimeric antibody expression vectors can be constructed.
  • the cDNA encoding the VH and VL of the antibody of a non-human animal can be obtained by combining the nucleotide sequence at the 3 'end of the antibody of a non-human animal VH and VL with the 5' end of the CH And linked to a synthetic DNA having a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at each end, and ligated to each of the human antibody of the vector for expressing a humanized antibody described in (1) of item 3 of this section.
  • a human-type chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning upstream of the genes encoding CH and CL so that they can be expressed in an appropriate form.
  • CDNA encoding VH and VL of the human CDR-grafted antibody can be constructed as follows. First, the amino acid sequence of the VH and VL framework (hereinafter referred to as FR) of a human antibody to which the VH and VL CDRs of the desired non-human animal antibody are transplanted is selected. As the amino acid sequence of FRs of VH and VL of a human antibody, any amino acid sequence can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • Amino acid sequences of FRs of VH and VL of human antibodies registered in databases such as Protein Data Bank, and common amino acid sequences of FR subgroups of V regions of H and L chains of human antibodies (Sequences 'op') Protein's 'immunological' interest).
  • the VH and VL FRs of the antibody of the target non-human animal antibody are required. It is desirable to select an amino acid sequence having as high a homology as possible (at least 60% or more) with the amino acid sequence.
  • the amino acid sequences of the CDRs of the VH and VL of the antibody of the non-human animal of interest are transplanted into the amino acid sequences of the FRs of the selected human antibody VH and VL, and the VH and VL of the human CDR-grafted antibody are grafted.
  • the amino acid sequence of is designed.
  • the designed amino acid sequence is converted into a DNA sequence in consideration of the frequency of codon usage (sequences, protein, protein, immunological, interest) found in the nucleotide sequence of the antibody gene, and human CDR grafting is performed. Design the DNA sequence encoding the VH and VL amino acid sequences of the antibody.
  • the amplification product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), the nucleotide sequence is determined by the method described in (2) of this section 3, and the desired human CDR-grafted antibody is obtained.
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL is obtained.
  • the VH and VL of the human CDR-grafted antibody constructed in (5) of this section are located upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibody in the humanized antibody expression vector described in (1) of this section.
  • the VH By introducing appropriate restriction enzyme recognition sequences into the 5 'ends of the synthetic DNAs located at both ends of the synthetic DNAs used for constructing VL and VL, the humanization described in (1) of this section 3 can be achieved.
  • a human CDR-grafted antibody expression vector can be constructed by cloning upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibody in the antibody expression vector so that they can be expressed in an appropriate form. .
  • a human chimeric antibody or a human CDR-grafted antibody (hereinafter, also referred to as a humanized antibody) ) Can be obtained stably.
  • Examples of a method for introducing a humanized antibody expression vector into animal cells include an electroporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891; Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the like.
  • the animal cell into which the humanized antibody expression vector is introduced the animal cell prepared in the above item 1 capable of producing a humanized antibody can be used.
  • G418 G418 sulfate
  • SIGMA G418 sulfate
  • the medium for animal cell culture includes RPMI1640 medium (Nissui Pharmaceutical), GIT medium (Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (JRH), IMDM medium (GIBCO BRL), Hybridoma-SFM A medium (manufactured by GIBCO BRL) or a medium obtained by adding various additives such as fetal bovine serum (hereinafter also referred to as FBS) to these mediums can be used. Traits obtained By culturing the transformant in a medium, a humanized antibody can be produced and accumulated in the culture supernatant.
  • the production amount of the humanized antibody and the antigen-binding activity in the culture supernatant can be measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (hereinafter referred to as ELISA method; Antipodis, Chapter 14, Monoclonal Antibody).
  • ELISA method enzyme-linked immunosorbent assay
  • the transformant can increase the production of humanized antibody using a DHFR gene amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • Humanized antibodies can be purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A column (Antibodies, Chapter 8, Monoclonal Antibody).
  • other purification methods usually used for protein purification can be used.
  • purification can be performed by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration.
  • the molecular weight of the purified humanized H-chain, L-chain or whole antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis [hereinafter referred to as SDS-PAGE; Nature, 227, 680 (1970)] or Western blot. It can be measured by the blotting method [Antibodies, Chapter 12, Monoclonal 'Antibodies].
  • An Fc fusion protein expression vector is an expression vector for animal cells into which a gene encoding a protein to be fused with the Fc region of a human antibody has been incorporated, and a protein to be fused to the expression vector for animal cells with the Fc region of a human antibody. It can be constructed by cloning the gene encoding
  • the Fc region of a human antibody includes a region containing the CH2 and CH3 regions, as well as a region containing the hinge region and a part of CH1.
  • the at least one amino acid deletion also CH2 or CH3, substituted, added or ⁇ may be any as long as it has a binding activity to substantially Fc Y receptor.
  • Chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used as the gene encoding the protein to be fused with the Fc region of the human antibody, and cDNA must be used. Can also.
  • each gene sequence is used as a type II PCR method ( recruiter's Clawing, 2nd edition; Current 'Protocols',' Moleculara 1 ⁇ . Biology, Supplement 1-34 ).
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express the gene encoding the C region of the human antibody. For example, PAGE107 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAGE103 [J.
  • promoters and enhancers used in expression vectors for animal cells include the early promoter and enhancer of SV40 [Jananole 'ob' Nanochemistry (J. Biochem.), 101, 1307 (1987)], Moroni et al.
  • DNA encoding a protein to be fused with the Fc region of a human antibody can be obtained as follows.
  • MRNA is extracted from cells and tissues expressing the protein to be fused with the desired Fc, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having a cDNA encoding the target protein is isolated using the gene sequence portion of the target protein as a probe.
  • Recombinant phage or The entire nucleotide sequence of the target protein on the recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence is estimated from the nucleotide sequence.
  • any animals such as mice, rats, hamsters, and egrets, can be used as long as cells and tissues can be removed therefrom.
  • Methods for preparing total RNA from cells and tissues include guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], and mRNA from total RNA.
  • Examples of the method for preparing the same include the Oligo (dT) immobilized cellulose column method (Molecular 'Clawing second edition) and the like.
  • Examples of kits for preparing mRNA from cells and tissues include Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia) and the like.
  • kits for the synthesis of cDNA and the preparation of a cDNA library, the usual method (Molequira-1 'CloJung 2nd edition; Ryrent' Protocols' in 'Molekiura' ⁇ Biology, Supplement 1-34) or commercially available kits include a method using a Super Script TM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL) and a ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene).
  • any vector can be used as a vector for incorporating a cDNA obtained by synthesizing fflRA extracted from cells or tissues as type III as long as the cDNA can be incorporated.
  • ZAP Express [Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ zapll ( Stratagene), gtlO, gtll [DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49 (1985)], Lambda BlueMid (Clontech), L ExCell, pT7T3 18U (Pharmacia), cD2 [Molecular 'and' Cellular 'biology (Mol, Cell. Biol.), 3, 280 (1983)], pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)], etc.
  • Escherichia coli to which a cDNA library constructed by a phage or a plasmid vector is introduced should be capable of introducing, expressing and maintaining the cDNA library.
  • Any material can be used.
  • Methods for selecting cDNA clones encoding the desired protein from the cDNA library include colony 'hybridization' or plaque hybridization (Moleculara Cloning 2nd edition) using an isotope or fluorescently labeled probe. Can be selected.
  • primers can be prepared, and a cDNA or cDNA library synthesized from mRNA can be used as a type III cDNA to prepare a cDNA encoding the target protein by PCR.
  • a PCR method can be used as a method for fusing the target protein with the Fc region of a human antibody. For example, set an arbitrary synthetic oligo DNA (primer) on the 5 'and 3' sides of the gene sequence of the target protein and perform PCR to obtain a PCR product. Similarly, an arbitrary primer is set for the gene sequence of the Fc region of the human antibody to be fused, and a PCR product is obtained. At this time, primers are set so that the same restriction enzyme site or the same gene sequence exists on the 3 'side of the PCR product of the protein to be assimilated and the 5' side of the PCR product of the Fc region. When amino acid modification around the junction is required, the mutation is introduced by using a primer into which the mutation has been introduced. Two types of obtained
  • PCR is performed using the PCR fragment to ligate both genes.
  • ligation can be performed by performing ligation after the same restriction enzyme treatment.
  • the gene's sequence linked by the above method is cut with an appropriate restriction enzyme and the like, and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, Sanger The dideoxy method [Proc Seedings 'Ob The National' Academy 'Ob' Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74. 5463 (1977)] or ABI PRISM 377 DNA sequencing.
  • the base sequence of the DNA can be determined by performing analysis using a base sequence analyzer such as Quenser (manufactured by PE Biosystems).
  • a transformant that stably produces the Fc fusion protein can be obtained.
  • Examples of a method for introducing the Fc fusion protein expression vector into animal cells include the electoporation method [Japanese Patent Laid-Open No. 2-257891; Cytotechnology, 3, 133 (1990)] and the like.
  • any animal cell that can produce the Fc fusion protein can be used. Specifically, it is derived from mouse myeloma cells NS0 cells, SP2 / 0 cells, chick hamster ovary cells CHO / dhfr- cells, CH0 / DG44 cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, IR983F cells, and Syrian hamster kidney.
  • BHK cells which are human myeloma cells, and the like, preferably, CH0 / DG44 cells, which are Chinese hamster monoovary cells, rat myeloma YB2 / 0 cells, and the method of the present invention according to the above item 1. And the like.
  • a transformant that stably produces the Fc fusion protein can be selected using a medium for culturing animal cells containing a drug such as G418 according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • Animal cell culture media include RPMI1640 medium (Nissui Pharmaceutical), GIT medium (Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (JRH), IMDM medium (GIBCO BRL), Hybridoma-SFM medium (Manufactured by GIBCO BRL) or a medium obtained by adding various additives such as fetal bovine serum to these media.
  • the Fc fusion protein can be produced and accumulated in the culture supernatant by culturing the obtained transformant in a medium.
  • the production amount and antigen-binding activity of Fc fusion protein in the culture supernatant It can be measured by an ELISA method or the like.
  • the transformant can increase the production of an Fc fusion protein using a dhfr gene amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-257891.
  • the Fc fusion protein can be purified from the culture supernatant of the transformed strain using a protein A column or a protein G column (Antibodies, Chapter 8, Monoclonal Antibody).
  • a protein A column or a protein G column Antibodies, Chapter 8, Monoclonal Antibody
  • other purification methods usually used for protein purification can be used.
  • purification can be performed by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, ultrafiltration, and the like.
  • the molecular weight of the entire purified Fc fusion protein molecule is measured by SDS-PAGE [Nature, 227, 680 (1970)], Western blotting (Antibodies, Chapter 12, Monoclonal Antipodes), etc. be able to.
  • the method for producing an antibody composition using animal cells as a host has been described.
  • yeast, insect cells, plant cells, or individual animals or individual plants can be prepared using the same method as that for animal cells. Can be manufactured.
  • the host cell already has the ability to express the antibody molecule, after preparing a cell for expressing the antibody composition using the method described in 1 above, the cell is cultured, and By purifying the antibody composition described above, an antibody composition contained as an active ingredient in the therapeutic agent of the present invention can be produced.
  • the binding activity to an antigen and the binding activity to an antigen-positive cultured cell line can be determined by ELISA and immunofluorescence [Cancer Immunology] Immunotherapy (Cancer Therapy). Immunol. Iramunother.), 36, 373 (1993)] and the like. Cytotoxic activity against antigen-positive cultured cell lines is CDC The activity can be evaluated by measuring the ADCC activity, etc. [Cancer Immunol. Immunotherapy (Cancer Immunol. Iramunother.), 36, 373 (1993)].
  • the number of antigens on cells involved in disease can be determined by Scatchard analysis [Immunological Methods Vol. 2, New York Academy Press, (1981)] or quantitative flow cytometry [ Komieke It can be quantified by "Shions' In Clinicanole * Communications in Clinical Cytometry, 26, 22 (1996)].
  • Comparison of the therapeutic effects of different drugs can be performed by in vivo experiments using disease models using experimental animals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, porpies, dogs, pigs, and monkeys. It can also be carried out by measuring in vitro cytotoxic activity targeting cells involved in the disease or cell lines thereof.
  • In vivo experiments are performed by implanting target cells such as cells involved in the disease or their cell lines into the body of an experimental animal, administering the drug intraperitoneally, intravenously, subcutaneously, etc., and observing the pathology of the experimental animal. It can be carried out.
  • the therapeutic effect of a drug can be examined by measuring the growth of tumors, the days of survival of experimental animals, blood component concentrations of the drug, organ weight, and the like.
  • In vitro cytotoxic activity can be obtained by measuring ADCC activity, CDC activity and the like.
  • the sugar chain structure of the antibody molecule expressed in various cells can be determined according to the analysis of the sugar chain structure of a normal glycoprotein.
  • the sugar chains bound to IgG molecules are composed of neutral sugars such as galatose, mannose, and fucose, amino sugars such as N-acetyldarcosamine, and acidic bran such as sialic acid.
  • the analysis can be performed using techniques such as composition analysis and sugar chain structure analysis using a two-dimensional sugar chain mapping method or the like.
  • composition analysis of the sugar chain of the antibody molecule neutral sugar or amino sugar is released by performing acid hydrolysis of the bran chain with trifluoroacetic acid or the like, and the composition ratio can be analyzed.
  • BioLC sugar composition analyzer
  • HPAEC-PAD high performance anion-exclusion chromatography-pulsed amperome trie detection
  • the composition ratio can also be analyzed by a fluorescent labeling method using 2-aminopyridine. Specifically, a sample obtained by acid hydrolysis according to a known method [Agricultural 'and' biological 'chemistry (Agruc. Biol. Chem.), 55 (1), 283-284 (1991)] is used. The composition ratio can be calculated by fluorescent labeling by aminopyridylation and HPLC analysis.
  • Structural analysis of the sugar chains of antibody molecules can be performed using the two-dimensional sugar chain mapping method [Analytical's Biochemistry., 171, 73 (1988), Biochemistry Experiments] 23-Branch protein sugar chain research method '(Society Publishing Center), edited by Reiko Takahashi (1989)].
  • the two-dimensional glycan map method for example, plots the retention time or elution position of a reverse-phase chromatography monosaccharide on the X-axis, and the retention time or elution position of the sugar chain by normal-phase chromatography on the Y-axis. This is a method of estimating the sugar chain structure by comparing the results with those of known sugar chains.
  • the antibody is hydrazinolyzed, the sugar chain is released from the antibody, and the sugar chain is fluorescently labeled with 2-aminopyridine (hereinafter abbreviated as PA) [Journal of Biochemistry (J. Biochem.), 95, 197 (1984)], and the sugar chains are separated from excess PA-Dani reagent and the like by gel filtration, followed by reversed-phase chromatography. Next, normal phase chromatography is performed on each peak of the separated sugar chain.
  • PA 2-aminopyridine
  • mass spectrometry of each sugar chain such as MALDI-TOF-MS can be performed to confirm the structure estimated by the two-dimensional sugar chain mapping method.
  • the antibody composition is composed of antibody molecules having different sugar chain structures binding to the Fc region of the antibody.
  • the antibody composition contained as an active ingredient in the therapeutic agent of the present invention is characterized in that, among all N-glycoside-linked complex-type sugar chains that bind to the Fc region, the first position of fucose is located at the sixth position of the reducing end N-acetyldarcosamine. aThe ratio of non-linked sugar chains is 20% or more, and it is characterized by high ADCC activity.
  • Such an antibody composition can be identified by using the method for analyzing the sugar chain structure of an antibody molecule described in the above 5. It can also be identified by using an immunological quantification method using lectin.
  • a lectin that recognizes the sugar chain structure of the antibody molecule constituting the antibody composition is labeled, and the labeled lectin is allowed to react with the sample antibody composition. Next, the amount of the complex of the labeled lectin and the antibody molecule is measured.
  • Lectins used to identify the sugar chain structure of the antibody molecule include, for example, WGA (wheat-germ agglutinin from T. vulgaris), ConA (concanavalin A from C. ensiformis), and RIC (toxin from R. communis) , L-PHA (from P. vulgaris leukoagglutinin), LCA (lentil agglutinin from L. culinaris), PSA (Pea lectin from P.
  • AAL Aleuria aurantia Lectin
  • ACL Amaranthus caudatus Lectin
  • BPL Bauhinia purpurea Lectin
  • DSL Daturin stratum
  • DBA Dolichos biflorus Agglutinin
  • EBL Elderberry Balk Lectin
  • ECL Erythrina cristagalli Lectin
  • EEL Euonymus europaeus Lectin
  • GNL Galanthus nivalis Lectin
  • GSL Griffonia simplicifolia Lectin
  • GSL Griffonia simplicifolia Lectin
  • N HHL Hippeastrum Hybrid Lectin
  • Jacalin ⁇ LTL Litus tetragonolobus Lectin
  • LEL Lycopersicon esculentum Lectin
  • MAL Meackia amurensis Lec
  • a lectin that specifically recognizes a sugar chain structure in which fucose is bound to N-acetyldarcosamine at the reducing end of N-dalcoside-linked complex sugar chain is used.
  • Specific examples thereof include lentil bean lectin LCA (Lentil Agglutinin from Lens Culinaris), enduma lectin PSA (Pea Lectin from Pi sum sativum), fava bean lectin VFA (Agglutinin from Vicia faba), AAL (Lectin from Aleuria aurantia) can be mentioned.
  • target cells involved in the disease are collected from the patient's body, contacted with the medicament of the present invention or a conventional antibody medicament, and reacted with the target cells.
  • Activity of the drug of the invention or conventional antibody drug This is a method for selecting patients for which the medicament of the present invention is effective by comparing the activity of a conventional antibody drug with the activity of the medicament of the present invention.
  • a non-resistant lectin that recognizes a sugar chain structure in which the 6-position of N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex-type sugar chain and the 1-position of fucose are linked.
  • Examples of a method for measuring the activity of the drug of the present invention or a conventional antibody drug include a method for measuring ADCC activity, Fy receptor Ilia binding activity, CDC activity and growth inhibitory activity.
  • ADCC activity can be measured by simultaneously contacting unlabeled or radiolabeled target cells, antibodies or effector cells with radioisotopes, fluorescent substances or dyes, and the physiological activity of the enzyme released from the impaired target cells. Measuring the activity of a labeling substance can be mentioned.
  • the amount of binding between the recombinant Fey receptor Ilia protein or the Fey receptor Ilia expressed on viruses, bacteria, or cell surfaces and the antibody reacted with the target cell is measured. Measurement and the like. Examples of the measurement method include immunohistochemical staining, Enzymimnoassay, radioimmuno, a fluorescent antibody method using a flow cytometer, 'Includes any immunoassay such as lotting, agglutination, complement fixation, hemolysis, sedimentation, gold colloid, and chromatography.
  • a label such as an enzyme, a fluorescent substance, a dye, a tag peptide, or a radioisotope
  • detection can be further facilitated.
  • target cells labeled with an unlabeled or radioisotope, a fluorescent substance, a dye, etc. are simultaneously brought into contact with an antibody, serum containing a complement component, etc., and released from the damaged target cells. Measuring the physiological activity of the enzyme or the activity of the labeling substance can be mentioned.
  • Methods for measuring growth inhibitory activity include measuring the bioactivity of intracellular enzymes, staining with providium iodide, detection using changes in cell membrane permeability, TUNEL method, detection of annexin V, and DNA fragmentation. Detection, detection of mitochondrial membrane potential change, detection of intracellular ATP and ADP levels, and the like.
  • a patient in which the medicament of the present invention is effective is selected by the method shown in 7 above, and then the following therapeutic agents are administered to the selected patients. And the like.
  • the drug is mixed with one or more pharmaceutically acceptable carriers. It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation manufactured by any method.
  • intravenous administration is preferred.
  • Dosage forms include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Formulations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsion and syrups include water, sucrose, sorbitol, fructose and other sugars, polyethylene glycol, propylene glycol and other daricols, sesame oil, olive oil, soybean oil and other oils, P -It can be manufactured using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters and flavors such as strawberry flapper and peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders, granules, etc. are excipients such as lactose, glucose, sucrose, mantole, etc., disintegrants such as starch, sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc , Polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin and the like, a surfactant such as a fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • Injectables are prepared using a carrier consisting of a salt solution, a pudose solution, or a mixture of both.
  • a powder injection can be prepared by freeze-drying the antibody composition according to a conventional method and adding sodium chloride thereto.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids. Sprays are prepared using the antibody composition itself or a carrier that does not irritate the oral and respiratory tract mucosa of the recipient and disperses the antibody composition as fine particles to facilitate absorption.
  • the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dryino soda can be made.
  • the components exemplified as additives in the oral preparation can be added.
  • Dose or frequency of administration the desired therapeutic effect, administration method, treating period, age, varies depending body weight and the like, as the amount of active ingredient for an adult person is generally 1 day 10 ug / k g ⁇ 20mg / kg.
  • the present invention will be described more specifically with reference to the following examples, which are merely illustrative of the present invention and do not limit the scope of the present invention.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of a human IgG1 molecule.
  • FIG. 2 is a diagram of a histogram of CCR4 expression in EL-4 cells of the transfatant cells and parent strains having different CCR4 expression levels analyzed by a flow cytometer.
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity, and the vertical axis indicates the number of cells.
  • the white outline shows the histogram when the antibody was not added, and the gray one shows the histogram when the biotinylated KM2760-1 was added.
  • FIG. 3 is a diagram showing ADCC activities of KM2760-1 and KM3060 using cell lines having different CCR4 expression levels as target cells.
  • the vertical axis shows cytotoxic activity (% :), and the horizontal axis shows the number of CCR4 molecules on target cells.
  • ⁇ indicates KM2760-1, indicates KM3060, and indicate cytotoxic activity when no antibody was added.
  • FIG. 4 shows the results of sugar chain analysis of each anti-CCR4 chimeric antibody.
  • Fig. 4A shows the results for KM2760-1 and
  • Fig. 4B shows the results for KM3060.
  • FIG. 5 shows the results of glycan analysis of anti-CCR4 chimeric antibodies having different proportions of glycans in which the 1-position of fucose is not ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyltyldarcosamine at the reducing end.
  • Figure 6 shows the results obtained by measuring the antigen-binding activity of anti-CCR4 chimeric antibodies with different proportions of sugar chains in which the position 1 of fucose is not conjugated to the position 6 of ⁇ -acetyltilcosamine at the reducing end by ELISA. It is.
  • the vertical axis shows the CCR4 peptide binding activity
  • the horizontal axis shows the antibody concentration.
  • Fist indicates the binding activity of the anti-CCR4 chimeric antibody (8%)
  • ⁇ indicates the binding activity of the anti-CCR4 chimeric antibody (27%)
  • ⁇ indicates the binding activity of the anti-CCR4 chimeric antibody (46%).
  • FIG. 7 is a diagram showing ADCC activity of anti-CCR4 chimeric antibodies having different ratios of ⁇ ⁇ , 6-fucose-free sugar chains, using cell lines having different CCR4 expression levels as target cells.
  • the vertical axis shows cytotoxic activity (%), and the horizontal axis shows the number of CCR4 molecules on target cells.
  • Panels A, B, and C show the ADCC activity using mononuclear cells collected from venous blood of healthy donors A, B, and C, respectively, as a single cell.
  • FIG. 8 shows the results of evaluating the ADCC activity of an anti-CCR4 chimeric antibody produced by a lectin-resistant strain.
  • the vertical axis indicates cytotoxic activity, and the horizontal axis indicates antibody concentration.
  • the mouth indicates the activity of the 5-03 strain
  • the open circle indicates the activity of the CH0 / CCR4-LCA strain
  • the open circle indicates the activity of the antibody produced by the CH0 / CCR4-AAL strain
  • the open triangle indicates the activity of the antibody produced by the CH0 / CCR4-PHA strain.
  • FIG. 9 shows the results of evaluating the ADCC activity of the anti-CCR4 chimeric antibody produced by the lectin-resistant strain.
  • the vertical axis shows cytotoxic activity, and the horizontal axis shows antibody concentration.
  • the mouth indicates the activity of the antibody produced by the YB2 / 0 strain (KM2760 # 58-35-16), ⁇ indicates the activity of the 5-03 strain, and Hata indicates the activity of the antibody produced by the CH0 / CCR4-LCA strain.
  • FIG. 10 is a diagram showing the construction process of plasmid PKANTEXCD20.
  • hCk represents the human ⁇ chain C region gene
  • hCyl represents the human IgGIC region gene
  • Pmo represents the Moro-I mouse leukemia Winores promoter.
  • FIG. 11 is a histogram of CD20 expression in transfectant cells having different expression levels of CD20 and EL-4 cells of a parent strain analyzed by a flow cytometer.
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity, and the vertical axis indicates the number of cells.
  • the outline is the mouse IgG2a, and the gray is the histogram when the anti-CD20 antibody was added.
  • FIG. 12 is a diagram showing ADCC activities of various anti-CD20 chimeric antibodies using cell lines having different CD20 expression levels as target cells.
  • the vertical axis shows cytotoxic activity, and the horizontal axis shows the number of CD20 molecules per cell.
  • Mouth is Rituxan TM, Qin is anti-CD20 chimeric antibody (44%), ⁇ is
  • KM3065, ⁇ indicate cytotoxic activity when no antibody was added.
  • FIG. 13 is a diagram showing a construction process of plasmid pBS-2B8L.
  • FIG. 14 is a diagram showing the construction process of plasmid pBS-2B8Hm.
  • FIG. 15 is a diagram showing a process of constructing plasmid pKANTEX2B8P.
  • FIG. 16 shows the binding activity of three types of anti-CD20 chimeric antibodies to CD20-expressing cells using the fluorescent antibody method.
  • FIG. 6 is a diagram measured by changing the values of.
  • the vertical axis is the binding activity to CD20, the horizontal axis Indicates the antibody concentration, respectively.
  • the mouth indicates KM3065, the open square indicates anti-CD20 chimeric antibody (44%), and the open square indicates Rituxan TM activity.
  • Example 1 Target cytotoxicity of ADCC activity of anti-CCR4 chimeric antibody composition depending on antigen expression level
  • the animal cell stable expression vector CAG-CCR4 / pcDNA3 (W001 / 64754) for the CCR4 gene was introduced into mouse thymoma cell line EL-4 cells (ATCC TIB-39) by the electroporation method.
  • EL-4 cells were suspended in PBS (-) (GIBCO BRL) at 1 ⁇ 10 7 cells / 500 ⁇ L
  • CAG-CCR4 / pcDNA3 was added at 10 / zg, left in water for 10 minutes
  • the gene was placed in a special cuvette (manufactured by Biorad) and transfected at 260 V, 500 ⁇ FD.
  • RPMI1640 medium manufactured by Life Technologie
  • fetal calf serum manufactured by Le Technologie
  • RPMI1640-FBS 10% fetal calf serum
  • FIG. 2 shows histograms of the fluorescence intensity of EL-4 cells of each cell line and the parent line.
  • the number of CCR4 molecules expressed in each cell line obtained in this section (1) was quantified using a flow cytometer.
  • Six each cell line LxlO added W001 / sixty-four thousand seven hundred and fifty-four description of the anti-CCR4 mouse monoclonal antibodies KM2160 and 60 ⁇ ⁇ / ⁇ , human IgG (manufactured by Uerufuaidone earth) to prevent Oyopi nonspecific staining with 3. 75 mg / mL
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ L of the FACS buffer, dispensed into a 96-well U-shaped plate, and reacted on ice for 60 minutes.
  • an anti-human VEGF receptor Flt-II mouse monoclonal antibody KM1732 (W098 / 22616; a monoclonal antibody produced by Hypridoma FERM BP-5698) was added instead of KM2160.
  • FITC-labeled anti-mouse IgG (manufactured by DAK0) diluted 4-fold with FACS buffer was added at 100 / z L / well.
  • the relationship between the ADCC activity of KM2760-1 and KM3060 and the number of antigens was measured as follows using the cell lines having different CCR4 expression levels obtained in Example 1. (2) as target cells.
  • RPMI1640- FBS and IX 10 6 cells of different cell lines of expression of CCR4 cultured in medium ⁇ Ka ⁇ the (IO) medium 500 microns g / ml concentration of G418 sulfate (manufactured by Nacalai Tesque) was prepared, radioactive the Na 2 51 Cr0 4 is a substance reacted for 60 minutes at 3.7MBq eq addition 37 ° C, the cells were radiated Izumi labeled. After the reaction, suspend the cells in RPMI1640-FBS (IO) medium, wash by centrifugation three times, resuspend in medium, and leave on ice at 4 ° C for 30 minutes to spontaneously dissociate the radioactive material. I let it. After centrifugation, 5 ml of RPMI1640-FBS (IO) medium was added to adjust to 2 ⁇ 10 5 cells / ml, which was used as a target cell solution. (2) Preparation of effector cell solution
  • the amount of spontaneously dissociated 51 Cr was determined by performing the same operation as above using only the medium instead of the effector one-cell solution and the antibody solution, and measuring the amount of 51 Cr in the supernatant. All dissociated 51 Cr amount, only medium instead of the antibody solution, the effector cells 1 N hydrochloric acid was ⁇ Ka ⁇ Ri in place of the solution, subjected to the same operation as above, child measured amount of 51 Cr in the supernatant And asked for.
  • ADCC activity was determined by the following equation (1). 51 Cr content in sample supernatant-spontaneous dissociation 51 Cr content
  • ADCC activity (%) X 100 (1)
  • KM3060 exhibited 7.4% cytotoxic activity against KC1062 (CCR number: 54200 cells / cell), which had the highest CCR4 expression. By substituting this value into the number y, and calculating the number of CCR4s required for KM2760-1 to exhibit the same cytotoxic activity, it is 3360 cells / cell. That is, KM2760-1 is about 16 times smaller than KM3060. It was clarified that the ADCC activity was equivalent with the number of CCR4 of 1. Also, even when the number of CCR4 per cell was high, the cytotoxic activity of KM3060 did not reach the cytotoxic activity of 2760-1, and the activity was low. It became clear that the saturation occurred.
  • the lOO ⁇ ug antibody was placed in a test tube for Hydraclub S-204, and dried by a centrifugal concentrator.
  • the test tube in which the sample was dried was subjected to hydrazine decomposition using a HONEN hydra club. Hydrazine was reacted at 110 ° C for 1 hour using a hydrazine-decomposing reagent manufactured by Honen [Method of Enzymology, 83.263, 1982]. After the reaction, hydrazine was distilled off under reduced pressure, and the reaction vessel was left for 30 minutes to return to room temperature.
  • acetylation reagent 2501 of acetylation reagent, an acetylation reagent manufactured by Honen, and 25 of acetic anhydride were added, stirred well, and reacted at room temperature for 30 minutes. Furthermore, 250 ⁇ l of acetylation reagent and 25 ⁇ l of acetic anhydride were added, and the mixture was stirred well and reacted at room temperature for 1 hour. Samples were frozen in a _80 ° C freezer and lyophilized for approximately 17 hours. Sugar chains were recovered from the freeze-dried sample using a TaKaRa cellulose cartridge Darican Preparation Kit.
  • 2-aminoviridine solution is 2- ⁇ 11 (17601 was added to minopyridine lg (1 XPA solution), and the solution was diluted 10-fold with reverse osmosis purified water (10-fold diluted PA solution).
  • the sodium cyanoborohydride solution was Prepared by adding 1 solution 1 to 10 mg of sodium cyanoborohydride and 430 ⁇ 1 purified water from reverse osmosis, and adding 67 1 of a 10-fold diluted PA solution to the sample, reacting it at 100 ° C for 15 minutes, and let it cool. Thereafter, 2 ⁇ l of sodium cyanoborohydride solution was added, and the mixture was reacted at 90 ° C.
  • the fluorescently-labeled sugar chains were subjected to Surperdex Peptide HR 10 Separation from excess reagent using a 30/30 column (Pharmacia) Eluent: lOraM ammonium bicarbonate, flow rate: 0.5 ml / min, column temperature: room temperature, fluorescence detector: excitation wavelength 320 nm, emission wavelength 400 nm Collect the eluate 20 to 30 minutes after adding the sample. After centrifugation to dryness, the purified PA-linked glycans were purified by reverse phase HPLC using a CLC-0DS column (Shimadzu, 6.0 nm x 150 nm).
  • the analysis was performed at a column temperature of 55 ° C, a flow rate of lml / ml, a fluorescence detector at an excitation wavelength of 320 nm, and a fluorescence wavelength of 400 nm.
  • the column was equilibrated with lOmM sodium phosphate buffer (pH 3.8).
  • each PA-glycan was identified by matrix-assisted laser ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI -TOF-MS analysis), Post Source Decay analysis, comparison of elution position with PA-glycan standard manufactured by TaKaRa, and digestion of each PA-glycan with various enzymes, then reverse phase Performed by HPLC analysis.
  • MALDI -TOF-MS analysis matrix-assisted laser ionization time-of-flight mass spectrometry
  • Post Source Decay analysis Comparison of elution position with PA-glycan standard manufactured by TaKaRa
  • digestion of each PA-glycan with various enzymes then reverse phase Performed by HPLC analysis.
  • the sugar chain content was calculated from the peak area of each PA-linked sugar chain in reverse phase HPLC analysis.
  • PA-glycans having a reducing end other than N-acetyl-darcosamine were excluded from the peak area calculation because they were derived from impurities or were by-products during the preparation of PA-glycans.
  • the content of sugar chains in which the 1-position of fucose is not ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end of KM2760-1 is 87%, and the ⁇ -acetate of the reducing end of 603060
  • the content of sugar chains in which the position 1 of fucose was not ⁇ -linked to the position 6 of tildarcosamine was 8%.
  • FIG. 4 shows elution diagrams obtained by reverse phase HPLC analysis of glycated oligosaccharides prepared from # 2760-1 and # 3060, respectively.
  • Buffer B (%) 0 60 60 0 0
  • peaks (1) to (8) indicate the following structures (1) to (8), respectively.
  • V 6 an ⁇ 1-4G1CNACJ8 l-4GlcNAc-PA
  • GlcNAc is N-acetyl darcosamine
  • Gal is galactose
  • Man is mannose
  • Fuc fucose
  • PA is a pyridylamino group.
  • the ratio of sugar chains in which the 1-position of fucose is not ⁇ -bonded to the 6-position of N-acetyltyldarcosamine at the reducing end is (1) to (4) among (1) to (8).
  • Occupied by the peak and the ratio of sugar chains in which the 1st position of fucose is not a-linked to the 6th position of ⁇ -acetylsulcosamine at the reducing end is (5) to (8) )
  • the percentage of sugar chains in which the 1-position of fucose was not ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyltilcosamine at the reducing end was 87% for KM2760-1 and 8% for KM3060.
  • the results of this example indicate that an antibody composition having a high ratio of sugar chains in which the 1-position of fucose is not ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyltyldarcosamine at the reducing end should be used in this experiment.
  • Higher cytotoxic activity against target cells at all antigen expression levels than antibody compositions with a low percentage of sugar chains in which the position 1 of fucose is not ⁇ -linked to position 6 of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end Is shown.
  • an antibody composition having a low ratio of sugar chains in which the position 1 of fucose is not ⁇ -linked to the position 6 of ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end can be used for target cells with a low antigen expression level that cannot exert ADCC activity.
  • ADCC activity can be exerted.
  • the antibody composition produced from the 1,6-fucose / lectin-resistant cells is composed of an antigen which cannot produce ADCC activity by the antibody composition produced from the 1,6-fucose / lectin-insensitive cells. It shows that ADCC activity can be exerted on target cells with low expression levels.
  • position 1 of fucose is a-linked to position 6 of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end of ⁇ 2 / 0 cell-produced anti-CCR4 antibody KM2760-1.
  • the percentage of non-sugar chains is 87%, and the ratio of sugar chains in which fucose 1 is not a-linked to position 6 of N-acetylglucosamine at the reducing end of CH0 / DG44 cell-produced anti-CCR4 chimeric antibody KM2760-1 was 8%.
  • these samples are referred to as an anti-CCR4 chimeric antibody (87%) and an anti-CCR4 chimeric antibody (8%).
  • anti-CCR4 chimeric antibody 87%
  • anti-CCR4 chimeric antibody 22:57, 32:47, 42: 37%
  • Fig. 5 shows the results of sugar chain analysis of each sample.
  • the ratio of the sugar chain in which the 1-position of fucose is not bonded to the 6-position of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end was determined by averaging the results of two times.
  • Example 1 The CCR partial peptide of the anti-CCR4 chimeric antibody (27%), anti-CCR4 chimeric antibody (39%), anti-CCR4 chimeric antibody (46%), and anti-CCR4 chimeric antibody (8%) prepared in Example 1 The binding activity to was measured according to the method described in Example 1, paragraph 2.
  • the ADCC activity of the anti-CCR4 chimeric antibody (27%), anti-CCR4 chimeric antibody (39%), anti-CCR4 chimeric antibody (46%), and anti-CCR4 chimeric antibody (8%) prepared in Example 1 We measured the relationship between the number of antigens and the proportion of carbohydrates in which the 1-position of fucose was not ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end by measuring cell lines with different expression levels of the target cells. .
  • KC1067 CCR4 molecule expression level is 4650 cells / cell
  • KC1063 CCR4 molecule expression level is 15300 cells / cell) Cells
  • KC1062 CCR4 molecule expression level is 54200 cells / cell.
  • Four types of anti-CCR4 chimeric antibodies with different proportions of unlinked sugar chains at position 6 of fucose at position 6 of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end The ADCC activity of the body was measured according to the method described in Example 1, paragraph 2. Effector cells were collected from the peripheral blood of three healthy donors A, B, and C, and the final antibody concentration at the time of ADCC activity measurement was 1 / g / mL.
  • Figure 7 shows the ADCC activity of anti-CCR4 chimeric antibodies with different proportions of sugar chains in which the 1-position of fucose is not linked to the 6-position of N-acetyltyldarcosamine at the reducing end by three healthy donors ( The results measured using the effector cells A, B, and C) are shown.
  • the ADCC activity of the anti-CCR4 chimeric antibody has a tendency to increase in correlation with the number of antigens and the ratio of sugar chains in which fucose is not bound to N-acetyldarcosamine at the reducing end. Indicated.
  • Y AX Ln (X) -B (3)
  • X is the number of antigens
  • Y is the ADCC activity corresponding to X
  • a and B are coefficients.
  • the values of A and B in each plot were calculated using spreadsheet software Excel (manufactured by Microsoft).
  • the values of A and B in each plot, and the value of X obtained by substituting the ADCC activity value of the anti-CCR4 chimeric antibody (8%) against KC1062 (54200 cells / cell) for YC in the approximate formula at that time
  • Table 3 shows the values of, and X + 54200.
  • the value of X obtained at this time was the same as the ADCC activity of the anti-CCR4 chimeric antibody (8%) against the target cell of 54200 antigens / cell.
  • the ADCC activity was 27% and the anti-CCR4 chimeric antibody (27%). 39%) and the number of antigens required to obtain using the anti-CCR4 chimeric antibody (46%).
  • the value of X + 54200 indicates that the anti-CCR4 chimeric antibody (27%), anti-CCR4 chimeric antibody (39%), and anti-CCR4 chimeric antibody (46%) each had the same ADCC activity as the anti-CCR4 chimeric antibody (8%). Represents the ratio of the number of antigens that can be expressed. Table 3
  • the value of X is such that the 1-position of fucose is ⁇ -linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end. decreases as the proportion of non sugar increases, but decreases the value of chi + 54200, anti-CCR4 chimeric antibody (2 7%), anti-CCR4 chimeric antibody (39%), anti-CCR4 chimeric antibody (46%) It was clarified that all showed ADCC activity equivalent to that of anti-CCR4 chimeric antibody (8%) with about 1/10 the number of antigens.
  • an antibody composition in which the proportion of sugar chains in which the position 1 of fucose is not ⁇ -linked to position 6 of N-acetyldarcosamine at the reducing end that binds to the Fc region of the antibody composition is 20% or more,
  • the ratio of sugar chains in which the position 1 of fucose is not ⁇ - linked to position 6 of N-acetyl darcosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked complex type sugar chain to be bound is less than 10% compared to an antibody composition with less than 20% It shows that equivalent ADCC activity can be obtained with one antigen.
  • IMDM- FBS (IO) - HT (1) medium [FBS and 10%, HT supplement (GIBCO BRL Co.) IMDM medium containing 1-fold concentration] for adherent culture in flasks 7 5 cm 2 (Manufactured by Greiner) and grown to just before confluence. After washing the cells with 5 mL of PBS (manufactured by Invitrodin), add 1.5 mL of 0.05% trypsin (manufactured by Invitrodin) diluted with PBS, and allow to stand at 37 ° C for 5 minutes. Peeled off the bottom of the incubator.
  • PBS manufactured by Invitrodin
  • trypsin manufactured by Invitrodin
  • the detached cells are collected by centrifugation performed in a normal cell culture, and suspended by adding IMDM-FBS (10) -HT (1) medium to a density of 1 ⁇ 10 5 cells / mL. Thereafter, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (hereinafter, referred to as MNNG, manufactured by Sigma), which is an unadded or 0.1 lig / mL alkylating agent, was added.
  • MNNG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin
  • Each well contains lmg / mL of lentil agglutinin (Lens culinaris agglutinin; hereinafter referred to as LCA, manufactured by Vector) at the final concentration in the medium, or lmg / mL of Aleuria aurantia Lectin (hereinafter ML). Notation, manufactured by Vector) or lmg / mL kidney bean agglutinin (Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin; hereinafter, referred to as L-PHA, manufactured by Vector) was added.
  • LCA lentil agglutinin
  • ML Aleuria aurantia Lectin
  • Notation manufactured by Vector
  • L-PHA Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin
  • the LCA-resistant strain was named CHO-LCA strain
  • the AAL-resistant strain was named CH0-AAL strain
  • the L-PHA-resistant strain was named CHO-PHA strain.
  • the CH0-LCA strain and the CH0-AAL strain are lectins that recognize the same sugar chain structure as those recognized by LCA and AAL, that is, N-acetyldarcosamine residues at the reducing terminal of N-glycoside-linked sugar chains. It also exhibited resistance to lectins that recognize a sugar chain structure in which the 1-position of the group and the 6-position of fucose have been added by an ⁇ -linkage.
  • the CH0-LCA strain and the CHO-AAL strain show resistance even in a medium supplemented with lignite agglutinin (Pisum sativum Agglutinin; hereinafter, referred to as PSA, manufactured by Vector) at a final concentration of lmg / mL. It was found to survive.
  • PSA lignite agglutinin
  • the alkylating agent fraction NG was not added, it was possible to obtain a lectin-resistant strain by increasing the number of cells subjected to the above treatment. Thereafter, these strains were used in the following examples.
  • the anti-CCR4 chimeric antibody expression plasmid pKANTEX2160 was introduced into the three types of lectin-resistant strains obtained in Example 1 by the method described in Item 1 of Reference Example 1, and gene amplification was performed by the drug MTX. An anti-CCR4 chimeric antibody producing strain was produced. The antibody expression level was measured using the ELISA method described in Section 2 of Reference Example 1, and CHO-LCA strains, CH0-ML strains, and CH0-PHA strains were used to obtain transformed strains expressing the antibodies.
  • the transformant derived from the CHO-LCA strain was the CH0 / CCR4-LCA strain, and the transformant derived from the CH0-AAL strain was the CH0 / CCR4-AAL strain, and the CHO-PHA strain.
  • the derived transformant was named CH0 / CCR4-PHA strain.
  • the CH0 / CCR4-LCA strain is the name of Nega-13, and was registered on September 26, 2001 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Central No. 6 ) Has been deposited as FERM BP-7756. 3. Production of high ADCC antibody by lectin-resistant CH0 cells
  • Purified antibodies were obtained using the three types of transformants obtained in section 2 of this example by the method described in section 3 of reference example 1.
  • the antigen-binding activity of the purified anti-CCR4 chimeric antibody was evaluated using the ELISA method described in Reference Example 1 (2).
  • the antibodies produced by any of the transformants exhibited the same antigen binding activity as the antibody produced by the production strain 5-03 using the normal CH0 / DG44 cells prepared in Reference Example 1 as a host.
  • the ADCC activity of each anti-CCR4 chimeric antibody was evaluated according to the method described in Example 1, paragraph 2. The results are shown in FIG.
  • the antibody produced by the CH0 / CCR4-LCA strain and the CH0 / CCR4-AAL strain showed an approximately 100-fold increase in ADCC activity.
  • no significant increase in ADCC activity was observed for the antibody produced by the CH0 / CCR4-PHA strain.
  • the ADCC activity of the antibodies produced by the CH0 / CCR4-LCA strain and the YB2 / 0 cell-derived strain was compared according to the method described in item 2 of Example 1. The CH0 / CCR4-LCA strain was produced. The antibody was found to show the same high ADCC activity as the antibody KM2760-1 produced by the YB2 / 0 cell-derived production strain prepared in Reference Example 1 (FIG. 9).
  • Example 3 The sugar chain analysis of the anti-CCR4 chimeric antibody purified in Example 3 was performed according to the method described in Example 1, section 3.
  • Table 4 shows that the 1-position of fucose is not ⁇ - linked to the 6-position of N-acetyldarcosamine at the reducing end obtained as a result of sugar chain analysis of anti-CCR4 chimeric antibodies produced by various lectin-resistant strains. Indicates the sugar chain ratio (%).
  • Antibody-producing cells Percentage of sugar chains without 1,6-fucose (%)
  • the antibody produced by the CH0 / CCR4-LCA strain has a sugar chain in which the 1-position of fucose is not ⁇ -linked to the 6-position of the reducing terminal N-acetyldarcosamine. Increased from 9% to 48%.
  • the proportion of sugar chains without al, 6-fucose increased from 9% to 27%.
  • the CH0 / CCR4-PHA strain little change was observed in the bran chain pattern and the ratio of sugar chains without ⁇ 1,6-fucose compared to the 5-03 strain.
  • the antibody composition having 20% or more of the ratio of the sugar chain in which the 1-position of fucose was not ⁇ -linked to the 6-position of ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end was used in the experiment. Even for target cells with different antigen expression levels, higher cytotoxicity than antibody compositions with a low proportion of sugar chains in which the position 1 of fucose is not linked to the 6-position of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end It shows activity. In particular, position 1 of fucose is Q at position 6 of ⁇ -acetyl darcosamine at the reducing end; the amount of antigen expression at which an antibody composition containing less than 20% of unbound sugar chains cannot exhibit ADCC activity.
  • the antibody composition produced from the lectin-resistant CH0 cells, CH0 / CCR4-LCA strain or CH0 / CCR4-AAL strain, according to the present example produced the parental cell, CH0 / DG44 cell strain 5-03.
  • the antibody composition described above can exert ADCC activity even on target cells with a low antigen expression level that cannot exert ADCC activity.
  • Example 4 Antigen expression level-dependent target cytotoxic activity by ADCC activity of anti-CD20 chimeric antibody composition
  • CD20 Cloning of a gene containing a region encoding the amino acid sequence of human CD20 (hereinafter, referred to as CD20) was performed by the following procedure.
  • the PCR was performed for 45 cycles, with a reaction consisting of 94 ° C for 40 seconds, 55 ° C for 40 seconds, and 74 ° C for 75 seconds as one cycle.
  • the reaction solution was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis, and about 950 bp of the specific amplified fragment was recovered with about 70 sterile water.
  • the recovered specific amplified fragment as type I, the DNA fragment was further amplified by PCR.
  • reaction solution was purified using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) and dissolved in 20 L of sterilized water. After digestion with restriction enzymes l (Takara Shuzo) and ⁇ SHI (Takara Shuzo), the mixture was subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to recover about 950 bp of the specific amplified fragment.
  • plasmid pBluescriptll SK (-) 2.5 / g (Stratagene) was digested with restriction enzymes Pstl (Takara Shuzo) and (Takara Shuzo), and then subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis to obtain about 2. A 9 kbp fragment was recovered.
  • the ligation reaction was performed on the amplified fragment derived from the cDNA of CD20 obtained above and the fragment derived from the plasmid pBluescriptll SK (-) using DNA Ligation Kit Ver. 2.0 (Takara Shuzo). Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the reaction solution, and plasmid DNA was isolated from the obtained ampicillin-resistant colonies according to a known method. The nucleotide sequence of the cDNA inserted into each plasmid was determined using DNA Sequencer-377 (Parkin Elmer) and BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer) according to the attached manual.
  • the CD20 expression vector was constructed as follows.
  • the nucleotide sequence of the cDNA inserted into each plasmid was determined using DNA Sequencer-377 (Parkin Elmer) and BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer) according to the attached manual. It was confirmed that all plasmids sequenced by this method contained the cDNA of the target CD20.
  • the resulting expression vector is hereinafter referred to as pKANTEXCD20.
  • the construction method of pKANTEXCD20 described in this section is shown in FIG. (3) Selection of clones with different expression levels of CD20
  • PKANTEXCD20 a vector for stably expressing the CD20 gene in animal cells, prepared in this section (2) was introduced into mouse thymoma cell line EL-4 cells (ATCC TIB-39) by the electroporation method.
  • EL-4 cells are suspended in PBS (-) (GIBC0 BRL) at 1 ⁇ 10 7 cells / 500 zL, 10 g of PKANTEXCD20 is added, and the mixture is left on ice for 10 minutes. (Bio-Rad) and transfected at 260V, 500 ⁇ .
  • the cells were suspended in 200 mL of RPMI1640-FBS (IO) medium and dispensed at 100 L / well into a 96-well cell culture plate. Twenty-four hours later, the culture supernatant was removed at 100 ⁇ l / well, and a 10% FCS-RPMI medium containing lmg / ml G418 was dispensed at 100 ⁇ l / ⁇ l at a final concentration of 0.5 mg / ml. Two weeks later, dozens of single clones were selected and expanded.
  • G418 was added at 0.5 mg / mL, and DHFR inhibitor MTX (SIGMA) was used to increase antibody production using the dhfr gene amplification system in order to increase CD20 expression.
  • SIGMA DHFR inhibitor MTX
  • the MTX concentration was gradually increased to 200 nmol / L and 1000 nmol / L, and finally the RPMI1640-SFM-FBS (IO) medium containing G418 at 0.5 mg / mL and MTX at a concentration of 200 nmol / L or 1000 nmol / L.
  • IO RPMI1640-SFM-FBS
  • the number of CD20 molecules expressed in each cell line obtained in this section (3) was quantified using a flow cytometer.
  • the suspension was suspended in 100 iL of the FACS buffer added in step (1), dispensed into a 96-well U-shaped plate, and reacted on ice for 60 minutes.
  • mouse IgG2a manufactured by DAK0
  • FITC-labeled anti-mouse IgG (manufactured by DAK0) diluted 20-fold with FACS buffer was added at 100 L / well. After reacting for 60 minutes in the light protected from ice, wash three times with 200 iL / ⁇ ⁇ , and finally suspend in 500 ⁇ L of PBS (-), and use a flow cytometer EPICS XL-MCL (manufactured by COULTER). was used to measure the fluorescence intensity.
  • KC1156, KC1157, KC1158, KC1160, KC1162, KC1163, and KC1164 in ascending order of expression level.
  • KC1160 and KC1163 are clones derived from MTX200nM resistant strain
  • KC1164 is a clone derived from MTXIOOOnM resistant strain.
  • FIG. 11 shows histograms of the fluorescence intensity of EL-4 cells of each cell line and the parent line.
  • the number of CD20 molecules expressed in each cell line selected in (4) of this section was quantified using a flow cytometer.
  • standard beads DK0 QIFIKIT, DAK0
  • FITC-labeled anti-mouse IgG was reacted under the conditions described in (4) of this section. After washing, the fluorescence intensity was measured with a flow cytometer. Calculate the correlation formula between the fluorescence intensity and the number of mouse IgG molecules adsorbed on the beads according to the instructions attached to the standard beads, and substitute the fluorescence intensity of each cell line obtained in this section (4) to obtain the The number of CD20 was calculated.
  • the number of CD20 when mouse IgG2a was reacted as a packed background was also calculated and subtracted from the number of CD20 when mouse anti-human CD20 monoclonal antibody was reacted, and finally the number of CD20 expressed in each cell line was calculated. did.
  • Table 5 shows the number of CD20 molecules expressed in each cell line obtained as a result of the measurement.
  • Each of the anti-CD20 chimeric antibodies KM3065, anti-CD20 chimeric antibody (44%) and Rituxan TM obtained in Reference Example 2 (fucose at position 6 of N-acetyl dalcosamin at the reducing end that binds to the Fc region) (The proportion of sugar chains not linked at position 1 is 96%, 44%, and 6 %, respectively) .
  • the relationship between ADCC activity and the number of antigens is different in the expression level of CD20 obtained in section 1 of this Example. The measurement was performed as follows using the cell line as a target cell.
  • the suspension was washed three times with RPMI1640-FBS (IO) medium by suspending and centrifuging, resuspended in the medium, and left on ice at 4 ° C for 30 minutes to allow the radioactive substances to dissociate spontaneously. . After centrifugation, 5 ml of RPMI1640-FBS (IO) medium was added to adjust to 2 ⁇ 10 5 cells / ml, which was used as a target cell solution.
  • the plate was centrifuged, and the amount of 51 Cr in the supernatant was measured using a ⁇ / -counter.
  • the amount of spontaneously dissociated 51 Cr was determined by performing the same operation as above using only the medium instead of the effector cell solution and the antibody solution, and measuring the amount of 51 Cr in the supernatant.
  • the total amount of dissociated 51 Cr was determined by adding only the medium instead of the antibody solution and adding 1 N hydrochloric acid instead of the effector cell solution, and performing the same operation as above, and measuring the amount of 51 Cr in the supernatant.
  • ADCC activity was determined by the above equation (1).
  • Rituxan TM showed 41.8% cytotoxic activity against KC1163 (205,000 CD20 cells / cell). Substituting this value into equations (4) and (5) gives the number of CD20s required for KM3065 or the anti-CD20 chimeric antibody (44%) to show cytotoxic activity on KC1163 equivalent to that of Rituxan TM. The calculated values are 38500 cells / cell and 46100 cells / cell, respectively. In other words, it was revealed that KM3065 or the anti-CD20 chimeric antibody (44%) showed equivalent ADCC activity with about one fifth of the CD20 number of Rituxan TM. In addition, it was revealed that the cytotoxic activity of Rituxan TM did not reach the cytotoxic activity of KM3065 or anti-CD20 chimeric antibody (44%) even at high CD20 counts, and was saturated at a low level and activity value.
  • an antibody composition in which an antibody composition having a low proportion of a sugar chain in which position 1 of fucose is not ⁇ -linked to position 6 of ⁇ ⁇ -acetyldarcosamine at the reducing end cannot exert ADCC activity is shown. This shows that ADCC activity can be exerted even on a low amount of target cells.
  • the antibody composition produced from the 1,6-fucose Z lectin-resistant cells is the antigen expression level at which the antibody composition produced from the al, 6-fucose no-lectin intolerant cells cannot exert ADCC activity. It shows that ADCC activity can be exerted on target cells with low levels.
  • Reference Example 1 Preparation of anti-CCR4 chimeric antibody
  • G418 was added to a concentration of 1 mg / mL, followed by culturing for 1 to 2 weeks.
  • the culture supernatant was recovered from the cells in which growth of the transformants showing G418 resistance appeared, and the antigen-binding activity of the anti-CCR4 chimeric antibody in the supernatant was determined by the ELISA method described in Example 2. It was measured.
  • the concentration was increased by the same method as described above, and finally, Hybridoma-SFM containing ⁇ at a concentration of 200 ⁇ -A transformant which can grow in FBS (5) medium and highly produces anti-CCR4 chimeric antibody was obtained.
  • the obtained transformant was transformed into a single cell (cloning) by the limiting dilution method twice, and the obtained clone was named KM2760_1 # 58-35-16.
  • the al, 6-fucosyltransferase gene transcript quantification method shown in Example 8 of W000 / 61739 was used, and a strain having a relatively low amount of the transcript was selected and used as a superior strain.
  • the selected strain was a lectin-resistant strain.
  • IMDM_dFBS 10 ml of IMDM_dFBS (10) -HT (1) [suspended in IMDM medium (manufactured by Invitrogen) containing 10% of dFBS (manufactured by Invitrogen) and 1-fold concentration of HT supplement (manufactured by Invitrogen)] was added. ⁇ / ⁇ well was dispensed into a culture plate (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.).
  • IMDM-dFBS 10 nM containing 50 nM MTX
  • the cells were suspended in a medium at a concentration of 1-2 ⁇ 10 5 cells / ml, and 0.5 ml was dispensed into 24-well plates (manufactured by Iwaki Glass Co., Ltd.). After culturing at 37 ° C. for 1 to 2 weeks in a 5% CO 2 incubator, a transformant showing 50 nM MTX resistance was induced.
  • Compound 1 (SEQ ID NO: 1) was selected as a human CCR4 extracellular domain peptide to which the anti-CCR4 chimeric antibody can react.
  • a conjugate with BSA Bovine Serum Albumin (manufactured by Nacalai Testa) was prepared by the following method and used as an antigen for use in measuring the activity by the ELISA method.
  • Tween-PBS Tween 20
  • the transformed cell clone ⁇ 2760-1 # 58-35-16 expressing the anti-CCR4 chimeric antibody obtained in Section 1 of this Reference Example contained 200 nM MTX and Daigo's GF21 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) at a concentration of 5%.
  • Hybridoma-SFM manufactured by Invitrogen
  • the anti-CCR4 chimeric antibody was purified from the culture supernatant collected by culturing for 8 to 10 days, using a Prosep-A (Millipore) column and gel filtration.
  • the purified anti-CCR4 chimeric antibody was named KM2760-1.
  • the transformed cell line 5-03 that produces the anti-CCR4 chimeric antibody obtained in Reference Example 1 was used at 5 ° / 182 cm 2 flask (Greiner) in IMDM-dFBS (10) medium. C0 and cultured at 37 ° C with 2 ink Yubeta within one. Several days later, when the cell density reached confluence, the culture supernatant was removed, the cells were washed with 25 ml of PBS buffer, and 35 ml of EXCELL301 medium (manufactured by JRH) was injected. 5% C0 7 days after culturing at 37 ° C in the incubator, the culture supernatant was recovered. The anti-CCR4 chimeric antibody was purified from the culture supernatant using a Prosep-A (Millipore) column according to the attached instructions. The purified anti-CCR4 chimeric antibody was named KM3060.
  • Antibody has a molecular weight of about 150Kd under non-reducing conditions, and under reducing conditions, the S-S bond in the molecule is cleaved, resulting in an H chain having a molecular weight of about 50Kd and an L chain having a molecular weight of about 25Kd.
  • Antibodies, In accordance with Chapter 14, Monoclonal 'Antipodis it was confirmed that the anti-CCR4 chimeric antibody was expressed as a correctly structured antibody molecule and purified.
  • Reference Example 2 Production of anti-CD20 human chimeric antibody
  • a cDNA encoding the amino acid sequence of VL of the anti-CD20 mouse monoclonal antibody 2 ⁇ described in W094 / 11026 (described in SEQ ID NO: 6) was constructed by PCR as follows.
  • the binding base sequence of the amplification primer for PCR at the 5 'end and 3' end of the VL base sequence described in W094 / 11026 (including the restriction enzyme recognition sequence for cloning into a humanized antibody expression vector) was added. Divide the designed base sequence into a total of 6 base sequences of about 100 bases from the 5 'end side (adjacent base sequences should have an overlapping sequence of about 20 bases at their ends), Actually, six synthetic DNAs of SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, and 12 were prepared (consigned to GENSET) in the order of alternating antisense strands.
  • Each oligonucleotide was adjusted to a final concentration of 0.1 so that 50 // L of the reaction solution [PCR Buffer # 1 with K0D DNA Polymerase (Toyobo), 0.2 niM dNTPs, lmM magnesium chloride, 0.1 mM 5 M M13 primer M4 (Takara Shuzo), 0.5 ⁇ ⁇ Ml3 primer RV (Takara Shuzo)] and the DNA thermal cycler GeneArap PCR System 9600 (Perkin Elmer).
  • DNAO.l ⁇ ug obtained by restriction enzyme Smal (Takara Shuzo) from plasmid pBluescriptll SK (-) (Stratagene) and PCR product about O.l ⁇ ig obtained above was added to sterile water to 7.5, and 7.5 I / L of TAKARA ligation kit ver. 2 solution I (Takara Shuzo) and 0.3 ⁇ L of restriction enzyme 1 (Takara Shuzo) were added. The reaction was performed at 22 ° C for 2 hours. The recombinant plasmid DNA solution thus obtained was used to transform Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • Each plasmid DNA was prepared from the clone of the transformant, and reacted using BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems) according to the attached instructions. Then, the DNA sequencer ABI PRISM 377 was used. The nucleotide sequence was analyzed. Thus, the plasmid pBS-2B8L shown in FIG. 13 having the target nucleotide sequence was obtained.
  • VH H chain V region
  • SEQ ID NO: 13 The cDNA encoding the amino acid sequence of the H chain V region (hereinafter referred to as VH) of the anti-CD20 mouse monoclonal antibody 2B8 described in W094 / 11026 (described in SEQ ID NO: 13) was obtained by PCR using the following method.
  • 2B8 is a monoclonal antibody having the same V region as Rituxan TM, which is the source of the commercially available anti-CD20 chimeric antibody Rituxan TM.
  • the base sequence of the primer for amplification at the time of PCR at the 5 'end and 3' end of the VH base sequence described in W094 / 11026 (including the restriction enzyme recognition sequence for closing to the humanized antibody expression vector) was added. Divide the designed base sequence into a total of 6 base sequences of about 100 bases from the 5 'end side (adjacent base sequences should have an overlapping sequence of about 20 bases at their ends), Six synthetic DNAs of SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17, 18, and 19 were produced (consigned to GENSET) in the order of alternating antisense strands.
  • Each oligonucleotide was adjusted to a final concentration of ⁇ . ⁇ with a 50 / iL reaction mixture [PCR Buffer # 1 with K0D DNA Polymerase (Toyobo Co., Ltd.), 0.2 mM dNTPs, ImM magnesium chloride, 0.5 ⁇ M13 primer M4 (Takara Shuzo) and 0.5 ⁇ M13 primer RV (Takara Shuzo)], and using DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer), After heating at 94 ° C for 3 minutes, 2.5 units of K0D DNA Polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is added, and the mixture is heated at 94 ° C for 30 seconds and 55 ° C for 30 seconds.
  • K0D DNA Polymerase manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • DNAO.l ⁇ g obtained by restriction enzyme Smal (manufactured by Takara Shuzo) from plasmid pBluescriptll SK (-) (manufactured by Stratagene) and about O.l ⁇ ug of the PCR product obtained above were sterilized.
  • Escherichia coli DH5a strain (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed using the recombinant plasmid DNA solution thus obtained.
  • Each plasmid DNA was prepared from the clone of the transformant, reacted with BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (manufactured by Applied Biosysteras) according to the attached instructions, and then sequenced using the DNA sequencer ABI PRISM 377 of the company. Was analyzed.
  • the plasmid pBS_2B8H shown in FIG. 14 having the desired base sequence was obtained.
  • 0.54 L of the 0.44 kb PCR product and 0.63 kb PCR product obtained above were separately added to 47.5 zL reaction solution [LA PCR Buffer II (Takara Shuzo), 0.4 mM dNTPs , 2.5 mM magnesium chloride], and heated at 90 ° C for 10 minutes using GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer), then heated to 37 ° C over 60 minutes. After cooling, the DNA was annealed by holding at 37 ° C for 15 minutes. 2.
  • the anti-human antibody expression vector PKANTEX93 (Mol. Immunol., 37, 1035, 2000) and the plasmids pBS-2B8L and pBS-2B8Hm obtained in Sections (1) and (2) of this Reference Example were used for anti- An expression vector PKANTEX2B8P for a CD20 human chimeric antibody (hereinafter referred to as an anti-CD20 chimeric antibody) was constructed as follows.
  • the plasmid pBS-2B8L-2 obtained in section 1 (1) of this reference example was reacted with 10 units of the restriction enzyme BsiWI (manufactured by New England Biolabs) at 55 ° C for 1 hour, and further reacted for 10 hours.
  • the reaction was carried out at 37 ° C for 1 hour using a unit of restriction enzyme (Takara Shuzo).
  • the reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and a BsiWI-EcoRI fragment of about 0.41 kb was recovered.
  • reaction solution was fractionated by agarose gel electrophoresis, and an Apal-Notl fragment of about 13.16 kb was recovered.
  • the BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (manufactured by Applied Biosystems) was used to analyze the nucleotide sequence using the DNA Sequencer-377. As a result, the target DNA was cloned. It was confirmed that the plasmid pKANTEX2B8P shown in FIG. 15 was obtained.
  • plasmid PKANTEX2B8P After introducing 10 ⁇ g of plasmid PKANTEX2B8P into 4 ⁇ 10 6 rat myeloma cell line YB2 / 0 cells (ATCC CRL1662) by the electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 40 ml of The cells were suspended in an H-SFM (GIBC0-BRL) medium (fetal calf serum (FCS) added at 5%), and dispensed into a 96-well microtiter plate (Sumitomo Bakelite) in 200 ⁇ l / well. After culturing at 37 ° C.
  • H-SFM GIBC0-BRL
  • FCS fetal calf serum
  • G418 was added to lmg / mL and the dhfr gene product dihydrogen in order to increase antibody expression using the dhfr gene amplification system. It becomes 1-2 x 10 5 cells / ml in H-SFM medium containing 50 nM of methotrexet (hereinafter referred to as MTX: SIGMA), an inhibitor of folate reductase (hereinafter referred to as DHFR) And dispensed into a 24-well plate (manufactured by Greiner) in lmL portions. After culturing at 37 ° C.
  • the resulting transformant was transformed into a single cell (cloning) by the limiting dilution method to obtain a clone KM3065 expressing an anti-CD20 chimeric antibody.
  • a strain having a relatively low amount of the transcript was selected as a superior strain.
  • the selected strain was a lectin-resistant strain.
  • a goat anti-human IgG (H & L) antibody (American Qualex) was diluted with Phosphate Buffered Saline (hereinafter referred to as PBS) to 1 ⁇ g / mL, and a 96-well ELISA plate (Glyna Co., Ltd.) was used. ), Dispensed at 50 L / ⁇ ⁇ , and left at 4 ° C for adsorption. I let it. After washing with PBS, add PBS containing 1% bovine serum albumin (hereinafter, referred to as BSA; manufactured by AMPC) (hereinafter, referred to as 1% BSA_PBS) at 100 ⁇ L / ⁇ ⁇ , and add 1% at room temperature.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • BSA bovine serum albumin
  • H-SFM containing 200 nM of MTX and 5% of Daigo's GF21 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) in the transformed cell clone KM3065 expressing the anti-CD20 chimeric antibody obtained in section 2 (1) of this reference example.
  • GIBC0-BRL 5% C0 cultured for 7 days at 37 ° C for within 2 incubator, the culture supernatant was recovered when they became Konfuruento.
  • the anti-CD20 chimeric antibody KM3065 was purified from the culture supernatant using a Prosep-A (Millipore) column according to the attached instructions. About 3 ⁇ g of the obtained anti-CD20 chimeric antibody KM3065 was subjected to electrophoresis according to a known method [Nature, 227, 680 (1970)], and the molecular weight and the degree of purification were examined. As a result, the purified anti-CD20 chimeric antibody KM3065 was approximately 150 kilodaltons (Kd) under non-reducing conditions, and two bands of approximately 50Kd and approximately 25Kd were observed under reducing conditions. .
  • Kd kilodaltons
  • the size of these proteins is that IgG-type antibodies have a molecular weight of about 150 Kd under non-reducing conditions, and disulfide bonds (hereinafter referred to as S-S bonds) in the molecule are cut under reducing conditions.
  • S-S bonds disulfide bonds
  • the electrophoresis pattern of the commercial anti-CD20 chimeric antibody Rituxan TM Rituxan TM From these results, it was confirmed that the anti-CD20 chimeric antibody KM3065 was expressed as an antibody molecule having the correct structure.
  • the sugar chain analysis of the anti-CD20 chimeric antibody purified in Reference Example 3 was performed according to the method described in Example 1, Section 3.
  • the commercially available anti-CD20 chimeric antibody Rituxan TM (purchased from Zinentech) produced in CH0 / DG44 cells contained 6% non-a-1,6-fucose-bound glycans and ⁇ 1,6-fucose-bound saccharides.
  • the chain content was 94%.
  • the content of sugar chains not bound to al, 6-fucose in # 3065 was 96%, and the content of sugar chains bound to al, 6-fucose was 4%. From the above results, it was found that ⁇ 3065 had a higher percentage of sugar chain content to which c3 ⁇ 4l, 6-fucose was not bound compared to Rituxan TM.
  • the antigen-binding activities of the three purified CD20 chimeric antibodies KM3065, anti-CD20 chimeric antibodies (44%) and Rituxan TM obtained in Section 3 of this Reference Example were evaluated by a fluorescent antibody method using single-site cytometry.
  • Raji cells (JCRB9012), human lymphoma cell lines, which are CD20-positive cells, were dispensed into 96-well U-shaped plates (Falcon) at 2 ⁇ 10 5 cells each.
  • Anti-CD20 chimeric antibody in FACS buffer 1% BSA-PBS, 0.02% EDTA, 0.05% NaN 3
  • the diluted antibody solution (concentration: 0.039 to 40 ig / mL) was added at 50 L / mL, and the mixture was reacted on ice for 30 minutes. After washing twice with FACS buffer at 200 ⁇ / ⁇ , 50 ⁇ L / ⁇ of 100-fold diluted ⁇ -labeled anti-human IgG antibody (manufactured by Coulter) using FACS buffer was added. .
  • 6-position of ⁇ ⁇ -glycoside-linked complex type sugar chain reducing terminal and 1-acetyldarcosamine at position 1 and fucose at position 1 are ⁇ ; produced from cells that do not have resistance to lectin that recognizes the linked sugar chain structure. It is possible to provide a medicament adapted to a patient or a disease that cannot be treated with a medicament containing an antibody composition as an active ingredient, and a method for screening the patient using the medicament.
  • SEQ ID NO: 14-Description of artificial sequence Synthetic DNA SEQ ID NO: 15-Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 16-Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 17-Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 18-Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA SEQ ID NO: 19-Artificial Sequence Description: Synthetic DNA SEQ ID NO: 20-Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA

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Description

明 細 書 抗体組成物含有医薬 技術分野
本発明は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さな い細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬では治療できな い患者または疾患に適応する医薬、 およぴ該医薬を用いた該患者のスクリーニン グ方法に関する。 背景技術
抗体は、 高い結合活性、 結合特異性および血中での高い安定性を有することか ら、 ヒ トの各種疾患の診断、 予防および治療への応用が試みられてきた [モノク ローナル · アンティボディズ： プリンシプルズ ' アンド ' アプリケーションズ (Monoclonal Antibodies : Principles and Applications , Wiley-Liss, Inc. , Chapter 2. 1 (1995) ] 。 また、 遺伝子組換え技術を利用して、 ヒト以外の動物の 抗体からヒト型キメラ抗体或いはヒト型相補性決定領域 （以下、 CDR と表記する） 移植抗体の様なヒト化抗体を作製することが試みられている。 ヒト型キメラ抗体 とは、 抗体可変領域 （以下、 V領域と表記する） がヒト以外の動物の抗体で、 定 常領域 （以下、 C領域と表記する） がヒト抗体である抗体である。 ヒト型 CDR移 植抗体とは、 ヒト抗体の CDRをヒト以外の動物の抗体の CDR と置換した抗体であ る。
哺乳類の抗体には、 IgM、 IgD、 IgG、 IgA、 IgEの 5種類のクラスが存在するこ とが明らかとなっているが、 ヒ トの各種疾患の診断、 予防おょぴ治療には血中半 減期が長く、 各種エフェクター機能を有する等の機能特性からヒト IgG クラスの 抗体が主として利用されている [モノクローナル ·アンティボディズ：プリンシ プルス、 · ァンド ' ·アプリケーションズ (Monoclonal Antibodies : Principles and Applications) , Wiley - Liss, Inc. , Chapter 1 (1995) ] 。 ヒト IgGクラスの抗体 は、 更に IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4の 4種類のサブクラスに分類されている。 IgG クラスの抗体のエフェクター機能である抗体依存性細胞障害活性 （以下、 ADCC活 性と表記する） や補体依存性細胞障害活性 （以下、 CDC活性と表記する） につい ては、 これまでに多数の研究が行われ、 ヒト IgGクラスでは、 IgGlサブクラスの 抗体が最も高い ADCC活性、 CDC活性を有していることが報告されている [ケミカ ル 'ィムノロジー（Chemical Immunology) , 65, 88 (1997) ] 。 以上の観点から、 市販の抗 CD20抗体リツキサン （IDEC社/ Genentech社製）、 抗 HER2抗体ハーセプ チン （Roche社/ Genentech社製） を始めとして、 その効果発現に高いエフェクタ 一機能を必要とする抗腫瘍ヒト化抗体の殆どはヒト IgGlサブクラスの抗体である。 また ADCC活性おょぴ CDC活性の程度は、 標的細胞上の抗原の発現量に正の相関 を示すことが知られている [ジャーナル ·ォブ ·ィムノロジー (J. Immunol. ) ,
116， 253 (1976)、 ジャーナル ·ォブ ·ナショナル ·キャンサ fンスティチュ ート （J. Natl. Cancer Inst. ) , 72, 673 (1984) , ジャーナル ·ォブ 'ヌクレア 一 ' メデイシン（J. Nucl. Med. )， 27, 422 (1986) , キャンサー · リサーチ (Cancer Res. ) , 48, 6303 (1988)， プリティッシュ ·ジャーナノレ ·ォブ ·キャン サー （British J. Cancer) , 78, 478 (1998) ]。 また市販されている抗体医薬は、 標的細胞上にある程度の抗原量が存在しなければ治療効果を有さないことが、 ハ ーセプチンを用いた検討により実証されている。
すなわち、 ハーセプチンの ADCC活性と、 標的となる癌細胞上の HER2抗原の発 現量との相関について解析がなされた結果、 標的細胞上の HER2数が 10の 4乗個 レベルでは ADCC活性がほとんど誘導されず、 有意な ADCC活性の誘導が起こるの は標的細胞上の HER2数が 10の 5乗個レベル以上であり、 強い ADCC活性が誘導さ れるのは標的細胞上の HER2数が 10の 6乗個程度であることが示された。 例えば、 HER2分子が 9. 0 X 105個発現しているヒト乳癌細胞株 S K- B R - 3に対してはハー セプチンは強い ADCC活性を示すが、 HER2分子が 2. 2 X 104個発現しているヒト乳 癌細胞株 MCF7 に対してはハーセプチンは ADCC活性を示さなかった [キャンサ 一'ィムノロジー ·ィムノセラピー (Cancer Immunol. Iramunother. ) , 37, 255 (1993)、 ハーセプチン™注射用 150パンフレット， HER. ΡΑ. 1. 2 (2001年 6月）] 。 臨床試験においても、 免疫組織化学法、 または蛍光 in situハイブリダィゼー シヨン法により腫瘍組織の HER2 が高発現と認められた患者に対する方が、 HER2 が低発現の患者に対するよりもハーセプチンの治療効果が有意に高いことが知ら れている [プロシーディングス ·ォブ 'アメリカン 'ソサエティ ·ォプ 'クリエ カル'オンコロジ一 （Proc. Am. Soci. Clin. Oncol. ) , 20, 22a (2001) ] 。 この ように、 HER2低発現の患者に対してほとんど治療効果が示されないことより、 ノヽ ーセプチンの適応は HER2過剰発現患者に限定されている。
これまでに知られている抗体医薬としては、 ハーセプチンの他にも抗 CD20抗体 リツキサン、 抗 CD52抗体 Campathなどがあげられる。 これらの抗体はいずれも標 的細胞を破壊することにより治療効果を得ることを目的としているが、 いずれも ADCC活性がその主なメカニズムとされている。 これらの抗体の治療可能な標的細 胞上の抗原数は、 CD20 では 1〜3 Χ 10ε個 [ジャーナル ·ォブ ·クリェカル ·パソ ロジー （J. Clin. Pathol. ) , 51, 364 (1998) ] 、 CD52でも 1〜5 X 105個 [セミナ ーズ - イン · オンコロジ一 (Seminars in Oncology) , 26 (5 Suppl 14) , 52 (1999) ] でいずれも 10の 5乗個以上である。 したがって、 これまでに知られてい る抗体医薬は ADCC活性の発現に 10の 5乗個以上の抗原が標的細胞中に発現され ていることを必要としているが、 10の 5乗個未満の抗原を発現している標的細胞 に対する抗体を有効成分とする治療薬は知られていない。 発明の開示
本発明は、 以下の （1)〜(21) に関する。
(1) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 から生産された抗体組成物を有効成分として含有する、 N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖 鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を有 効成分として含有する医薬では治療できない患者に適応することを特徴とする医
(2) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細 胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬では治療できない患 者が、 該患者の標的細胞における、 該抗体組成物が認識する抗原が、 該抗体組成 物が治療効果を発揮するには十分ではない量し力発現していない患者である、 （1) に記載の医薬。
(3) 該抗体組成物が治療効果を発揮するには十分ではない量が、 該抗体組成物 が抗体依存性細胞障害活性を発揮するには十分ではない量である、 （2) に記載の
(4) Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 から生産された抗体組成物を有効成分として含有する、 Ν -グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の Νァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が o結合した糖 鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を有 効成分として含有する医薬では治療できない疾患に適応することを特徴とする医
(5) Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細 胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬では治療できない疾 患が、 該疾患に関わる標的細胞における、 該抗体組成物が認識する抗原が、 該抗 体組成物が治療効果を発揮するには十分ではない量しか発現していない疾患であ る、 （4) に記載の医薬。
(6) 該抗体組成物が治療効果を発揮するには十分ではない量が、 該抗体組成物 が抗体依存性細胞障害活性を発揮するには十分ではない量である、 （5) に記載の (7) レクチンに耐性を有する細胞が、 以下の （a)、 (b) および （c) からなる 群から選ばれる蛋白質の活性が低下または欠失した細胞である、 （1)〜(6) のいず れか 1項に記載の医薬。
(a) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
(b) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
(c) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白
(8) レクチンが、 少なくとも、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群 から選ばれるレクチンである、 （1)〜 ） のいずれか 1項に記載の医薬。
(a) レンズマメレクチン；
(b) ェンドウマメレクチン；
(c) ソラマメレクチン；
(d)ヒィロチャワンタケレクチン。
(9) 細胞が、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞おょぴ植物細胞からなる群から選ばれ る細胞である、 （1)〜(8) のいずれか 1項に記載の医薬。
(10) 細胞が、 下記 （a)〜（j) からなる群から選ばれる細胞である、 （1)〜（9) のいずれか 1項に記載の医薬。
(a) チヤィユーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞；
(b) ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞；
(c) マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞；
(d) マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0- Agl4細胞；
(e) シリアンハムスタ一腎臓組織由来 BHK細胞；
(f) 抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞；
(g) ヒ ト白血病細胞株ナマルパ細胞；
(h) 胚性幹細胞；
(i) 受精卵細胞；
(j) 植物細胞。 (11) 抗体組成物が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ば れる抗体分子を有効成分として含有する抗体組成物である、 （1)〜（10) のいずれ か 1項に記載の医薬。
(a) ヒト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a) または （b) の Fc領域を含む抗体の断片；
(d) (a) または （b) の Fc領域を有する融合蛋白質。
(12) 抗体分子のクラスが IgGである、 （11) に記載の医薬。
(13) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 から生産された抗体組成物が、 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν -ァセチ ルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチ ンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障害 活性が高い抗体組成物である、 （1)〜（12) のいずれか 1項に記載の医薬。
(14) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結 合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組 成物よりも高いことを特徴とする、 （13) に記載の医薬。
(15) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が Ν -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 （14) に記載の医薬。
(16) 抗体依存性細胞障害活性が高 、抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合していない糖鎖の割合が 20%以上である、 （13)〜（15) のいずれか 1項に記載の医薬。 (17) 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が 20%以上である抗体組成物が、 CH0細胞が生産した抗体組成物である、 (16) に記載の医薬。
(18) 医薬が、 腫瘍を伴う疾患、 アレルギーを伴う疾患、 炎症を伴う疾患、 自 己免疫疾患、 循環器疾患、 ウィルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に 対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 （1)〜（17) のいずれか 1項に記載の
(19) (1)〜（17) のいずれか 1 項に記載の医薬を製造するための、 N-グリコ シド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1 位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生産され た抗体組成物の使用。
(20) (i) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミン の 6位とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有 さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬あるいは (1)〜（17)のいずれか 1項に記載の医薬と患者から取得したこれら医薬の標的細 胞とを接触させ、 （ii) 該標的細胞と反応した医薬の活性を測定し、 （ii i) N -グ リコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコース の 1位が <¾結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生 産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬が示した活性と （1)〜（17) のいずれか 1項に記載の医薬が示した活性との測定値を比較し、 （iv) N-グリコ シド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1 位が a結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産さ れた抗体組成物を含有する医薬が示した活性が低い患者を選択することにより、 (1)〜（17) のいずれか 1 項に記載の医薬が有効な患者をスクリーニングする方 法。
(21) 標的細胞と反応した医薬の活性を測定する方法が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれる活性を測定する方法である、 （19) に 記載の方法。 (a) 抗体依存性細胞障害活性；
(b) Fc 受容体 Ma結合活性；
(c) 補体依存性細胞障害活性；
(d) 増殖抑制活性。 本発明は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する 細胞 （以下、 a l， 6 -フコース Zレクチン耐性細胞と略記する） から生産された抗 体組成物を有効成分として含有する、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν- ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糠鎖構造を認識する レクチンに而村生を有さない細胞 （以下、 a l， 6 -フコース Ζレクチン不耐性細胞と 略記する） から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬 （以下、 「従 来の抗体医薬」 と呼ぶ） では治療できない患者に適応することを特徴とする医薬 に関する。
本発明の《1, 6 -フコース/レクチン耐性細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫 細胞、 植物細胞など抗体組成物を製造することができる細胞であって、 Ν-グリコ シド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位 が a結合した糖鎖構造を認識するレクチン耐性を有する細胞であればいかなる細 胞でもよい。
具体的には、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν -ァセチルダルコサミン の 6位とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有す る、 ハイプリ ドーマ細胞、 ヒト抗体およびヒト化抗体を製造するための宿主細胞、 ヒト抗体を生産するためのトランスジエニック非ヒト動物を製造するための胚性 幹細胞および受精卵細胞、 ヒ ト抗体を生産するためのトランスジェユック植物を 製造するための植物カルス細胞、 ミエローマ細胞、 トランスジエニック非ヒト動 物由来の細胞などがあげられる。 ミエローマ細胞はハイプリ ドーマ細胞を製造す る際に融合細胞として用いることができる。 また、 トランスジエニック非ヒト動 物に抗原を免疫し、 該動物の脾臓細胞を取り出し、 ハイプリ ドーマ細胞を製造す るために用いることができる。
レクチンに耐性を有する細胞とは、 培養培地にレクチンを有効濃度与えて細胞 培養を行ったときにも、 生育が阻害されな 、細胞をいう。
本発明において、 生育が阻害されないレクチン有効濃度は、 細胞株に応じて適 宜定めればよいが、 通常 10 § 1〜10.
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、 好ましくは 0. 5〜2. 0mg/ml であ る。 親株細胞に変異を導入した場合のレクチンの有効濃度とは、 該親株細胞が正 常に生育できない濃度以上であり、 好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃 度と同濃度、 より好ましくは 2〜5倍、 さらに好ましくは 10倍、 最も好ましくは 20倍以上の濃度をいう。
■ 親株細胞とは、 何らかの処理を施す前の細胞、 すなわち本発明で用いる a l， 6 - フコース レクチン耐性細胞を選択する工程を行う前の細胞、 上述した酵素活性 を低下または欠失するために遺伝子工学的な処理を行う前の細胞をいう。
親株細胞としては、 特に限定はないが、 種々の細胞株の親株細胞の具体例とし て、 以下に示す。
NS0 細胞の親株細胞としては、 バイオ/テクノロジー （BI0/TECHN0L0GY)， 10, 169 (1992)、 バイオテクノロジー'バイオエンジニアリング (Biotechnol. Bioeng. ) , 73, 261, (2001) 等の文献に記載されている NS0細胞があげられる。 また、 理化学研究所細胞開発銀行に登録されている NS0細胞株 （RCB0213)、 ある いはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
SP2/0 - Agl4 細胞の親株細胞としては、 ジャーナル'ォプ 'ィムノロジー （J. Immunol. ) , 126, 317 (1981)、 ネイチヤー（Nature) , 276, 269 (1978)、 ヒュ一マ ン 'アンチイボディズ 'アン ド'ノヽィプリ ドーマズ (Human Antibodies and Hybridomas) , 3, 129 (1992) 等の文献に記載されている SP2/0- Ag14細胞があげ られる。 また、 ATCCに登録されている SP2/0 - Agl4細胞 （ATCC CRL - 1581) あるい はこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株 (ATCC CRL- 1581. 1) などもあげら れる。 チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0 細胞の親株細胞としては、 Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968)、 Genetics, 55, 513 (1968)、 Chroraosoma, 41, 129 (1973)、 Methods in Cell Science, 18, 115 (1996)、 Radiation Research, 148, 260 (1997)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)、 Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968)、 Cell, 6, 121 (1975)、 Molecular Cell Genetics, Appendix I， II (p883_900)等の文献に記載されている CH0細胞などがあげられる。 また、 ATCC に登録されている CH0-K1 株 （ATCC CCL- 61)、 DUXB11 株 （ATCC CRL - 9096) , Pro- 5 株 （ATCC CRL-1781) や、 市販の CHO- S 株 （Lifetechnologies 社 Cat#11619)、 あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげら れる。
ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 細胞の親株細胞としては、 Y3/Agl. 2. 3 細胞 (ATCC CRL - 1631) から榭立された株化細胞が包含される。 その 具体的な例としては、 J. Cell. Biol. , 93, 576 (1982)、 Methods Enzymol. , 73B, 1 (1981) 等の文献に記載されている YB2/3HL. Ρ2. Gil. 16Ag. 20細胞があげられる。 また、 ATCCに登録されている YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞 (ATCC CRL- 1662) あ るいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。
N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1 位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、 該糖鎖構造を認 識できるレクチンであれば、 いずれのレクチンも包含される。 その具体的な例と しては、 レンズマメレクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin)、 エンドゥマメレクチン PSA (Pi sum sativum由来の Pea Lectin) , ソラマメレクチ ン VFA (Vicia faba 由来の Agglutinin)、 ヒィロチャワンタケレクチン ML (Aleuria aurantia由来の Lectin) などがあげられる。
本発明において、 a l，6 -フコース/レクチン耐性細胞としては、 一定の有効濃 度のレクチン存在下で生育が阻害されない細胞であれば、 いずれでもよいが、 例 えば、 以下にあげる少なくとも 1 つの蛋白質の活性が親株細胞よりも低下または 欠失した細胞などがあげられる。 (a) 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースの合 に関与する酵素蛋白質 （以下、 「GDP -フコース合成酵素」 と表記する） ；
(b) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が《結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質 （以下、 「0；1，6- フコース修飾酵素」 と表記する） ；
(c) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質 (以下、 「GDP -フコース輸送蛋白質」 と表記する）。
GDP-フコース合成酵素としては、 細胞内で糖鎖へのフコースの供給源である糖 ヌクレオチド GDP-フコースの合成に関与する酵素であればいかなる酵素も包含し、 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースの合成に影響を与える酵素などがあげられる。 細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースは、 de novo の合成経路あるいは Salvage合成経路により供給されている。 したがって、 これら合成経路に関与す る酵素はすべて GDP -フコース合成酵素に包含される。
de novo の合成経路に関与する GDP-フコース合成酵素としては、 GDP- mannose 4- dehydratase (GDP-マンノース 4-デヒ ドラターゼ；以下、 GMD と表記する）、 GDP-keto-6-deoxymannose 3, 5-epimerase, 4 - reductase (GDP -ケト-テオキシマン ノース 3， 5-ェピメラーゼ， 4-リダクターゼ；以下、 Fx と表記する) などがあげ られる。
Salvage 合成経路に関与する GDP -フコース合成酵素としては、 GDP- beta- L- fucose pyrophosphorylase (GDP-ベータ- L-フコース ピロホスフォリラーゼ；以 下、 GFPPと表記する）、 Fucokinase (フコキナーゼ） などがあげられる。
細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースの合成に影響を与える酵素としては、 上述 の細胞内の糖ヌクレオチド GDP-フコースの合成経路に関与する酵素の活性に影響 を与えたり、 該酵素の基質となる物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
a 1， 6-フコース修飾酵素としては、 N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N - ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が 結合する反応に関与する酵素 であればいかなる酵素も包含される。 N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N - ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が ο;結合する反応に関与する酵素 としては、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6 位とフコースの 1位がひ結合する反応に影響を与える酵素であればいかなる酵素 も包含される。 具体的には、 （¾ 1， 6 -フコシルトランスフェラーゼゃ α—L—フコシ ダーゼなどがあげられる。
また、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合する反応に影響を与える酵素としては、 上述の Ν-ダリ コシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が α結合する反応に関与する酵素の活性に影響を与えたり、 該酵素の基質とな る物質の構造に影響を与える酵素も包含される。
GDP -フコース輸送蛋白質としては、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴル ジ体への輸送に関与する蛋白質であればいかなる蛋白質も包含され、 具体的には、 GDP -フコーストランスポーターなどがあげられる。
また、 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースをゴルジ体内へ輸送する反応に影響 を与える蛋白質も GDP-フコース輸送蛋白質に包含され、 具体的には上述の細胞内 糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の活性に影響 を与えたり、 発現に影響を与える蛋白質などがあげられる。
本発明の製造方法に用いられる細胞を取得する方法としては、 ひ 1， 6 -フコース /レクチン耐性細胞を選択することができる手法であればいかなる手法でも用レ、 ることができる。 具体的には、 上述した蛋白質の活性を低下または欠失させる手 法などがあげられる。 上述の蛋白質の活性を低下または欠失させる手法としては、
(a) 蛋白質の遺伝子を標的した遺伝子破壊の手法；
(b) 蛋白質の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；
(c) 蛋白質についての突然変異を導入する手法；
(d) 蛋白質の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法；などがあげられる。
従来の抗体医薬では治療できない患者としては、 患者の標的細胞における、 該 抗体組成物が認識する抗原の発現量が、 抗体組成物が治療効果を発揮するには十 分ではない量しか発現していない患者があげられる。 本発明における抗原としては、 標的細胞に発現する、 抗体組成物が反応するい かなる抗原も包含される。
本発明における標的細胞とは、 患者の疾患に関与する、 抗体組成物が反応する 抗原を発現するいかなる細胞も包含する。
本発明における疾患とは、 標的細胞が病態形成に直接または間接的に関与する 疾患であればいかなるものも包含される。 例えば腫瘍細胞、 新生血管細胞や間質 細胞等が関与する悪性腫瘍、 免疫細胞が関与するアレルギー、 炎症や自己免疫疾 患、 血管細胞、 血小板や平滑筋細胞等が関与する循環器疾患、 ウィルス感染を伴 う疾患や細菌感染を伴う疾患があげられる。
本発明の医薬が有効な、 抗原の発現が少ない標的細胞の抗原の発現量の上限と しては、 標的細胞あたり好ましくは 105個、 より好ましくは 5X104個、 さらに好 ましくは 2X104個、 特に好ましくは 104個、 最も好ましくは 5X1が個があげられ る。
具体的にはヒトケモカインレセプターの一種 CCR4 (以下 CCR4 と称す） の場合 であれば、 標的細胞あたり好ましくは 105個、 より好ましくは 5X104個、 さらに 好ましくは 2X104個、 特に好ましくは 104個、 最も好ましくは 5X103個があげら れる。
ヒト CD20 (以下 CD20と称す） の場合であれば、 標的細胞あたり好ましくは 105 個、 より好ましくは 5X104個、 さらに好ましくは 3X104個、 特に好ましくは 2X 104個、 最も好ましくは 104個があげられる。
ヒト HER2 (以下 HER2と称す） の場合であれば、 標的細胞あたり好ましくは 5X 105個、 より好ましくは 105個、 さらに好ましくは 5X104個、 特に好ましくは 3X 104個、 最も好ましくは 2X104個があげられる。
本発明の医薬が有効な、 抗原の発現が少ない標的細胞の抗原の発現量の下限と しては、 標的細胞あたり好ましくは 1 個、 より好ましくは 102個、 さらに好まし くは 3X102個、 特に好ましくは 103個、 最も好ましくは 3X103個があげられる。 具体的には CCR4の場合であれば、 標的細胞あたり好ましくは 1個、 より好まし くは 102個、 さらに好ましくは 5 X 102個、 特に好ましくは 103個、 最も好ましくは 3 X 103個があげられる。
CD20の場合であれば、 標的細胞あたり好ましくは 1個、 より好ましくは 102個、 さらに好ましくは 103個、 特に好ましくは 2 X 103個、 最も好ましくは 5 X 103個が あげられる。
HER2の場合であれば、 標的細胞あたり好ましくは 1個、 より好ましくは 102個、 さらに好ましくは 103個、 特に好ましくは 5 X 103個、 最も好ましくは 1 X 104個が あげられる。
本発明の医薬の治療対象である患者もしくは疾患における標的細胞の抗原の発 現量は、 フローサイトメトリー法、 スキャッチヤードプロット法、 免疫組織染色 法、 ィムノアツセィ法等の、 抗体と抗原の結合反応を利用した免疫学的方法であ ればいかなる方法を用いても測定することができる。 .
また抗原に対するリガンドが既知の場合には、 標的細胞に対するリガンドの結 合活性をフローサイトメトリー法、 スキャッチヤードプロット法、 免疫組織染色 法、 ィムノアツセィ法等の方法で検出することにより測定することができる。
抗体組成物が治療効果を発揮するには十分ではない量としては、 該抗体組成物 が ADCC活性を発揮するには十分ではない量をいう。
具体的に抗体組成物が ADCC活性を発揮するには十分でないとは、 患者において、 該抗体組成物が標的細胞を障害できないことを意味する。
本発明において、 抗体組成物としては、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域 に有する抗体分子を含有してなる組成物であればいかなるものも包含される。
抗体分子とは、 重鎖および軽鎖 （以下、 それぞれ H鎖および L鎖と表記する） の 2種類のポリぺプチド鎖がそれぞれ 2分子ずつ会合した 4量体である。 H鎖の N 末端側の約 4分の 1 と L鎖の N末端側の約 2分の 1 (それぞれ 100余アミノ酸） は V領域と呼ばれ、 多様性に富み、 抗原との結合に直接関与する。 V領域以外の 部分の大半は C領域と呼ばれる。 抗体分子は C領域の相同性により IgG、 IgM、 IgA、 IgD、 IgEの各クラスに分類される。 また IgGクラスは C領域の相同性により、 さらに IgGl IgG4のサブクラスに分 類される。 第 1図に IgGlクラスの抗体分子の模式図を示す。
H鎖は N末端側より VH CH1 CH2 CH3 の 4つのィムノグロプリンドメインに 分かれ、 CH1 と CH2 の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域が あり、 CH1 と CH2 とが区切られる。 ヒンジ領域以降の CH2 と CH3からなる構造単 位は Fc領域と呼ばれ、 N-グリコシド結合型糖鎖が結合している。 また、 この領域 は、 Fc レセプター、 補体などが結合する領域である （免疫学イラストレイテッド 原書第 5版、 2000年 2月 10日発行、 南江堂版、 抗体工学入門、 1994年 1月 25日 初版、 地人書館)。
抗体などの糖蛋白質の糖鎖は、 蛋白質部分との結合様式により、 ァスパラギン と結合する糖鎖 （N-グリコシド結合糖鎖） とセリン、 スレオニンなどと結合する 糖鎖 （0 -グリコシル結合糖鎖） の 2 種類に大別される。 N-グリコシド結合糖鎖は、 以下の構造式 （I) に示す基本となる共通のコア構造を有する [生物化学実験法 23—糖蛋白質糖鎖研究法 （学会出版センター） 高橋禮子編 （1989年) ] 。
Man « 1 \ f Man β 1 »-4GlcNAc/3 1 *-4GlcNAc
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構造式 ( 1 ) 上記構造式 （I) において、 ァスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、 反 対側を非還元末端という。
N—グリコシド結合糖鎖としては、 上記構造式 (I) のコァ構造を有するものであ ればいかなるものでもよいが、 コァ構造の非還元末端にマンノースのみが結合す るハイマンノース型、 コア構造の非還元末端側にガラクトース- N-ァセチルダルコ サミン （以下、 Gal- GlcNAc と表記する） の枝を並行して 1ないしは複数本有し、 更に Gal- GlcNAc の非還元末端側にシアル酸、 バイセクティングの N-ァセチルダ ルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型 （複合型）、 コア構造の非還元末 端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイプリッド型な どがあげられる。
抗体分子の Fc領域には、 N -ダリコシド結合糖鎖が 1力所ずつ結合する領域を有 しているので、 抗体 1分子あたり 2本の糖鎖が結合している。 抗体分子に結合す る N -ダルコシド結合糖鎖としては、 前記構造式 （I) で示されるコア構造を含む いかなる糖鎖も包含されるので、 抗体に結合する 2本の N-ダルコシド結合糖鎖に は多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。
したがって、 本発明において、 " 1，6-フコース Zレクチン耐性細胞を用いて製 造された抗体組成物は、 本発明の効果が得られる範囲であれば、 単一の糖鎖構造 を有する抗体分子から構成されていてもよいし、 複数の異なる糖鎖構造を有する 抗体分子から構成されていてもよい。
抗体分子としては、 抗体の Fc領域を含む分子であればいかなる分子も包含され る。 具体的には、 抗体、 抗体の断片、 Fc領域を含む融合蛋白質などがあげられる。 抗体としては、 動物に抗原を免疫し、 免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブ リ ドーマ細胞が分泌する抗体、 遺伝子組換え技術により作製された抗体、 すなわ ち、 抗体 it伝子を挿入した抗体発現ベクターを、 宿主細胞へ導入することにより 取得された抗体などがあげられる。 具体的には、 ハイプリ ドーマが生産する抗体、 ヒト化抗体、 ヒト抗体などをあげることができる。
ハイプリドーマは、 ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された B細胞と、 マウス、 ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、 所望 の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。
ヒト化抗体としては、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体などがあげられ る。
ヒト型キメラ抗体は、 ヒト以外の動物の抗体 H鎖 V領域 （以下、 HVまたは VH とも称す） および抗体 L鎖 V領域 （以下、 LVまたは VLとも称す） とヒト抗体の H 鎖 C領域 （以下、 CHとも称す） およぴヒト抗体の L鎖 C領域 （以下、 CLとも称 す） とからなる抗体をいう。 ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムス ター、 ラビット等、 ハイプリ ドーマを作製することが可能であれば、 いかなるも のも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、 モノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマより、 VH および VLをコードする cDNAを取得し、 ヒト抗体 CHおよぴヒト抗体 CLをコード する遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗 体発現ベクターを構築し、 宿主細胞へ導入することにより発現させ、 製造するこ とができる。
ヒト型キメラ抗体の CHとしては、 ヒトイムノグロブリン （以下、 hlg と表記す る） に属すればいかなるものでもよいが、 hlgG クラスのものが好適であり、 更に hlgG クラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG といったサブクラスのいずれ も用いることができる。 また、 ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すれば いかなるものでもよく、 κクラスあるいは； Lクラスのものを用いることができる。 ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ 酸配列をヒト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいう。
ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR配列を任 意のヒ ト抗体の VHおょぴ VLの CDR配列に移植した V領域をコードする cDNAを構 築し、 ヒト抗体の CHおよびヒト抗体の CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞 用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型 CDR移植抗体を発現させ、 製造することができる。
ヒト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、 更に hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG といったサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型 CDR移 植抗体の CLとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよく、 κクラスあるいは 又クラスのものを用いることができる。
ヒト抗体は、 元来、 ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、 最近の遺伝子ェ 学的、 細胞工学的、 発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージ ライブラリ一ならびにヒ ト抗体トランスジエニック非ヒ ト動物あるいはヒト抗体 トランスジエニック植物から得られる抗体等も含まれる。
ヒ ト体内に存在する抗体は、 例えば、 ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EB ウィル ス等を感染させ不死化、 クローユングすることにより、 該抗体を生産するリンパ 球を培養でき、 培養物中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリ一は、 ヒ ト B細胞から調製した抗体遺伝子をファ ージ遺伝子に挿入することにより Fab、 一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面 に発現させたライブラリーである。 該ライプラリーより、 抗原を固定化した基質 に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現して いるファージを回収することができる。 該抗体断片は、 更に遺伝子工学的手法に より、 2本の完全な H鎖および 2本の完全な L鎖からなるヒ ト抗体分子へも変換 することができる。
ヒ ト抗体トランスジエニック非ヒ ト動物は、 ヒ ト抗体遺伝子が細胞内に組込ま れた動物をいう。 具体的には、 マウス胚性幹細胞へヒ ト抗体遺伝子を導入し、 該 胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、 発生させることによりヒト抗体トラ ンスジヱニック非ヒ ト動物を作製することができる。 また、 動物の受精卵にヒ ト 抗体遺伝子を導入し、 該受精卵を発生させることにヒ ト抗体トランスジエニック 非ヒ ト動物を作製することもできる。 ヒ ト抗体トランスジヱユック非ヒ ト動物か らのヒ ト抗体の作製方法は、 通常のヒ ト以外の哺乳動物で行われているハイプリ ドーマ作製方法によりヒ ト抗体ハイプリ ドーマを得、 培養することで培養物中に ヒト抗体を蓄積させることができる。
トランスジエニック非ヒ ト動物としては、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 -ヮトリ、 サルまたはゥサギ等があげられる。
抗体の断片は、 上記抗体の少なくとも Fc領域の一部を含んだ断片をいう。 Fc 領域とは、 抗体の H鎖の C末端側の領域、 CH2領域および CH3領域を意味し、 天 然型およびその変異型を包含する。 少なくとも Fc 領域の一部とは、 好ましくは CH2領域を含む断片、 より好ましくは CH2領域内に存在する 1番目のァスパラギ ン酸を含む領域をいう。 IgG クラスの Fc 領域は、 カパット （Kabat) らの EU Index [シーケンシズ ·オフ、、 ·プロティンズ ·ォブ ·ィムノロジカル ·インタレス 卜 (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ] のナ ンバリングで 226番目の Cysから C末端、 あるいは 230番目の Proから C末端ま でを意味する。 抗体の断片としては、 H鎖の単量体、 H鎖の 2量体などがあげられ る。
Fc領域の一部を有する融合蛋白質とは、 抗体の Fc 領域の一部を含んだ抗体あ るいは抗体の断片と、 酵素、 サイト力インなどの蛋白質とを融合させた物質 （以 下、 Fc融合蛋白質と称す） を意味する。
また、 本発明は a; 1 , 6-フコース Zレクチン而村生細胞から生産された抗体組成物 が、 1， 6-フコース Zレクチン不耐性細胞から生産された抗体組成物を有効成分 として含有する医薬にくらベて、 ADCC活性が高い抗体組成物である医薬に関する。
a 1, 6-フコース/レクチン不耐性細胞から生産された抗体組成物よりも ADCC活 性が高い抗体組成物は、 上記の α 1, 6-フコース/レクチン耐性細胞を用いて抗体 組成物を製造することにより得ることができる。
ADCC活性とは、 生体内で、 腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、 抗体 Fc領域とエフヱクタ一細胞表面上に存在する Fc受容体との結合を介してェ フエクタ一細胞を活性化し、 腫瘍細胞等を障害する活性をいう [モノクローナ ル · ァンティボディズ ： プリ ンシプルズ ' アン ド ' アプリケーショ ンズ (Monoclonal Antibodies : Principles and Applications) , Wi ley-Liss, Inc. , Capter 2. 1 (1995) ] 。 エフェクター細胞としては、 ナチュラルキラー細胞、 マク 口ファージ、 単球、 榭状細胞、 顆粒球等の免疫細胞があげられる。 また Fc受容体 は Fc a受容体 I、 Fc ε受容体I、 Fc £受容体 II、 (；0/受容体1、 Fe y受容体 IIa、 Fe y受容体 IIb、 Fc y受容体 IIc、 Fe y受容体 IIIa、 Fc y受容体 IIIb、 Fc受容体 n等のタイプに分かれる。 この内 Fc y受容体 Iliaは主にナチュラルキラー細胞上 に発現し、 ADCC活性に重要な Fc受容体の一つである [モノクローナル 'アンティ ボディズ： プリンシプルズ ' アンド 'プラクティス （Monoclonal Antibodies : principles and practice) , Third Edition, Acad. Press, 1996 (以下、 モノク ローナノレ ·アンティボディズと略す) ]。
また、 抗体組成物の有する細胞障害活性としては ADCC活性の他に、 CDC活性 (モノクローナル ·アンティボディズ） や、 抗原に結合することによる抗原発現細 胞の增殖抑制活性などがある。 増殖抑制活性には標的細胞のアポトーシス誘導や 分化誘導を促進するものも含まれる [キャンサー ' リサーチ （Cancer Research) 60, 7170 (2000)、 ネイチヤー ·メディスン （Nature Medicine) 1, 644 (1995)、 セル . グロース 'ディファレンシエーション （Cell Growth Differ. ) 3, 401 (1992) ] 。
抗体分子の Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還 元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 1， 6 -フコース/レクチン不耐性細胞から生産された抗体組成物よりも高い場合、 a 1， 6-フコースノレクチン不耐性細胞が生産する抗体組成物より高い ADCC活性を 有する。
抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖の うち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖 の割合が高いほど、 抗体組成物の ADCC活性が高くなる。 ADCC活性が高い抗体組 成物としては、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合 複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合し ていない糖鎖の割合が、 好ましくは 20%以上、 より好ましくは 30%以上、 さらに 好ましくは 40%以上、 特に好ましくは 50%以上、 最も好ましくは 100%の抗体組 成物があげられる。
また、 CH0細胞が生産する ADCC活性が高い抗体組成物としては、 抗体組成物中 に含まれる Fc領域に結合する全 N -グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元 末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 好ま しくは 20%以上、 より好ましくは 30%以上、 さらに好ましくは 40%以上、 特に 好ましくは 50%以上、 最も好ましくは 100%の抗体組成物があげられる。 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖の うち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖 の割合とは、 該組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ての N-グリコシド結合 複合型糖鎖の合計数に対して、 糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンにフコー スが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。 また、 糖鎖の割合は、 好まし くは、 糖鎖還元末端の N -ァセチノレグノレコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合 していない糖鎖の割合をいう。
Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンにフコースが 結合していなレ、糖鎖とは、 フコースが、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンに α結合していない糖鎖をいう。 好ましくは、 フコース の 1位が Ν -グリコシド結合複合型糖鎖の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合 していない糖鎖があげられる。
Ν-ダリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる組成物中に含 まれる、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合は、 抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法 [生物化学 実験法 23—糖タンパク質糖鎖研究法 （学会出版センター） 高橋禮子編 （1989) ]を 用い、 糖鎖を遊離させ、 遊離させた糖鎖を蛍光標識または同位元素標識し、 標識 した糖鎖をクロマトグラフィー法にて分離することによって決定することができ る。 また、 遊離させた糖鎖を HPAED- PAD法 [ジャーナル'ォブ'リキッド 'クロマト グラフィー （J. Liq. Chromatogr. ) , 6, 1577 (1983) ]によって分析することでも 決定することができる。
また、 本発明において、 抗体が、 腫瘍関連抗原を認識する抗体、 アレルギーあ るいは炎症に関連する抗原を認識する抗体、 循環器疾患に関連する抗原を認識す る抗体、 自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、 またはウィルスあるいは 細菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、 抗体のクラスは IgGが好ましい。
腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、 抗 GD2 抗体 （Anticancer Res. , 13, 331-336, 1993)、 抗 GD3 抗体 (Cancer Immunol. Immunother. , 36， 260-266， 1993)、 抗 GM2抗体 （Cancer Res.， 54, 1511-1516， 1994)、 抗 HER2抗体 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289， 1992)、 抗 CD52抗体 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992)、 抗 MAGE抗体 （British J. Cancer, 83, 493 - 497, 2000)、 抗 HM1. 24抗体 (Molecular Immunol. , 36, 387-395， 1999)、 抗副甲 状腺ホルモン関連蛋白 （PTHrP) 抗体 （Cancer, 88, 2909-2911, 2000)、 抗塩基性 繊維芽細胞増殖因子抗体、 抗 F G F 8 抗体 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911-9915, 1989)、 抗塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、 抗 FGF8受容体抗体 (J. Biol. Chem.， 265, 16455-16463， 1990)、 抗インスリン様増殖因子抗体 （J. Neurosci. Res. , 40, 647-659， 1995)、 抗ィンスリン様増殖因子受容体抗体 （J. Neurosci. Res. , 40, 647-659, 1995)、 抗 PMSA抗体 (J. Urology, 160, 2396 - 2401, 1998)、 抗血管内皮細胞増殖因子抗体 （Cancer Res.， 57, 4593-4599， 1997)、 抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体 (Oncogene, 19, 2138-2146, 2000) などがあげられる。
アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗インター ロイキン 6抗体 (Immunol. Rev. , 127, 5-24， 1992)、 抗インターロイキン 6受容 体抗体 （Molecular Immunol. , 31, 371-381, 1994)、 抗インターロイキン 5抗体 (Immunol. Rev.， 127, 5 - 24， 1992)、 抗インターロイキン 5受容体抗体、 抗イン ターロイキン 4抗体 （Cytokine, 3, 562-567, 1991)、 抗インターロイキン 4受容 体抗体 （J. Immunol. Meth. , 217, 41-50, 1998)、 抗腫瘍壊死因子抗体 (Hybridoma, 13, 183-190， 1994)、 抗腫瘍壌死因子受容体抗体 （Molecular Pharmacol.， 58, 237-245, 2000)、 抗 CCR4抗体 （Nature, 400, 776-780, 1999)、 抗ケモカイン抗体 (J. Immunol. Meth.， 174, 249-257， 1994) または抗ケモカイ ン受容体抗体 （J. Exp. Med. , 186, 1373-1381， 1997) であり、 循環器疾患に関 連する抗原を認識する抗体が抗 GpIIb/IIIa抗体 （J. Immunol. , 152, 2968-2976，
1994)、 抗血小板由来増殖因子抗体 （Science, 253, 1129-1132， 1991)、 抗血小板 由来増殖因子受容体抗体 （J. Biol. Chem. , 272, 17400-17404, 1997)、 抗血液凝 固因子抗体 （Circulation, 101, 1158-1164, 2000) などがあげられる。 ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 g p l20 抗体 （Structure, 8, 385-395， 2000)、 抗 CM 抗体 （J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998)、 抗 CCR4抗体、 抗ベロ毒素抗体 (J. Clin. Microbiol. , 37, 396-399, 1999) などがあげられる。
また、 本発明は、 本発明の医薬を用いて患者を治療する方法に関する。 医薬を 用いて患者を治療するとは、 医薬を投与することにより患者を治療することであ る。
さらに、 本発明は、 本発明の医薬を患者へ投与前に効果を予測するための判別 方法に関する。 具体的には、 以下の工程を含む方法があげられる。
(i) 従来の抗体医薬または本発明の医薬と、 患者から採取した標的細胞とを接触 させ、 （ii) 該標的細胞が反応した医薬の活性を測定し、 （iii) 従来の抗体医薬が 示した活性と本発明の医薬が示した活性とを比較する。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1. 宿主細胞の作製
本発明で用いられる抗体組成物を製造するための宿主細胞は、 以下に述べる手 法により作製することができる。
(1) 酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壌の手法
宿主細胞は、 GDP-フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フ コース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 遺伝子破壊の方法を用いることにより作 製することができる。 GDP-フコース合成酵素としては、 具体的には、 GMD、 Fx, GFPP、 Fucokinase などがあげられる。 α 1, 6 -フコース修飾酵素としては、 具体的 には、 α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ、 a-L-フコシダーゼなどがあげられる。 GDP -フコース輸送蛋白質としては、 具体的には、 GDP-フコーストランスポーター などがあげられる。
ここでいう遺伝子とは、 DNAまたは RNAを含む。 遺伝子破壊の方法としては、 標的とする酵素の遺伝子を破壊することができる 方法であればいかなる方法も包含される。 その例としては、 アンチセンス法、 リ ポザィ ム法、 相同組換え法、 RNA- DNA oligonucleotide (RD0) 法、 RNA interference (RNAi) 法、 レトロウイルスを用いた方法、 トランスポゾンを用い た方法等があげられる。 以下これらを具体的に説明する。
(a) アンチセンス法またはリボザィム法による宿主細胞の作製
宿主細胞は、 GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6 -フコース修飾酵素、 または GDP-フ コース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 細胞工学， 1¾ 239 (1993)、 バイオ Ζテ クノロジー （BI0/TECHN0L0GY)， 17, 1097 (1999)、 ヒューマン 'モレキュラー ' ジエネテイクス （Hum. Mol. Genet. ) , 5, 1083 (1995)、 細胞工学， ， 255 (1994)、 プ口シーデイングス'ォブ 'ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 96, 1886 (1999) 等に記載されたアンチセン ス法またはリボザィム法を用いて、 例えば、 以下のように作製することができる。
GDP-フコース合成酵素、 ct l，6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質をコードする cDNAあるいはゲノム DNAを調製する。
調製したあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
決定した DNA の配列に基づき、 GDP-フコース合成酵素、 α ΐ, 6-フコース修飾酵 素、 または GDP-フコース輸送蛋白質をコードする DNA部分、 非翻訳領域の部分あ るいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリポザィム のコンス トラクトを設計する。
該アンチセンス遺伝子、 またはリボザィムを細胞内で発現させるために、 調製 した DNA の断片、 または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷入 することにより、 組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り形質転換体を得る。
GDP-フコース合成酵素、 a 1, 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の活性を指標として形質転換体を選択することにより、 宿主細胞を得ること ができる。 また、 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造 を指標として形質転換体を選択することにより、 宿主細胞を得ることもできる。 宿主細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆 虫細胞、 植物細胞など、 標的とする GDP -フコース合成酵素、 ひ 1, 6-フコース修飾 酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子を有しているものであればいずれ も用いることができる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。 発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 設計したアンチセンス遺伝子、 またはリボザィムを転写 できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述 の 3. に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、 後述の 3. に記載の各種宿主細 胞に適した糸且換えべクターの導入方法を用いることができる。
GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、 文献 ほ生化学実 験講座 3—糖質 I，糖タンパク質 （東京化学同人） 日本生化学会編 （1988) ] 、 文献 [細胞工学， 別冊， 実験プロトコールシリーズ， グライコバイオロジー実験プロト コール， 糖タンパク質 ·糖脂質 ·プロテオダリカン （秀潤社製） 谷口直之 ·鈴木明 美 ·古川清 ·菅原一幸監修 （1996) ]、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (以下、 モレキュ ラー.クローニング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997 (以下、 カレント 'プロトコールズ'イン'モレキュ ラー'バイオロジーと略す） 等に記載された生化学的な方法あるレ、は遺伝子工学的 な方法などがあげられる。 生化学的な方法としては、 例えば、 酵素特異的な基質 を用いて酵素活性を評価する方法があげられる。 遺伝子工学的な方法としては、 例えば、 酵素遺伝子の mRNA量を測定するノーザン解析や RT-PCR法等があげられ る。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法として は、 例えば、 後述の 1の （5) に記載の方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構 造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 5 または後 述の 6に記載の方法があげられる。
GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質をコードする cDNAを調製する方法としては、 例えば、 以下に記載の方法があ げられる。
DNAの調製方法
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞から全 RNAまたは mRNAを調製する。 調製した全 RNAまたは mRNAから以下のようにして cDNAライブラリ一を作製す る。
GDP-フコース合成酵素、 oi l, 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質のアミノ酸配列に基づいて、 デジエネレイティブプライマーを作製し、 作製 した cDNAライブラリーを铸型として. PCR法にて GDP-フコース合成酵素、 α 1， 6- フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取 得する。
取得した遺伝子断片をプローブとして用い、 cDNA ライプラリーをスクリーニン グし、 GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸 送蛋白質をコードする DNAを取得することができる。
ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞の mRNAは市販のもの（例えば Clontech 社製）を用いてもよいし、 チォシアン酸グァ-ジン-トリフルォロ酢酸セシウム法 [メ ソッズ ' イン · ェンザィモロジ一 (Methods in Enzymology) , 154, 3 (1987) ] 、 酸性チォシアン酸グァ-ジン 'フエノール 'クロ口ホルム （A G P C) 法 [アナリティ力ノレ · バイオケミス トリー (Analytical Biochemistry) , 162, 156 (1987)； 実験医学、 ， 1937 (1991) ] などによりヒトまたは非ヒト動物の組 織または細胞から全 RNAを調製し、 得られた得られた全 RNAからオリゴ （dT) 固 定化セルロースカラム法 （モレキュラー . クロー-ング第 2 版） 等により poly (A)+ RNAとして mRNAを調製することができる。
または、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社製）、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製） などのキットを用いることにより mRNA を調製することもできる。
調製したヒトまたは非ヒ ト動物の組織または細胞 mRNAから cDNAライプラリー を作製する方法としては、 モレキュラー 'クローユング第 2 版、 カレント 'プロ トコールズ'イン .モレキュラー ·バイオロジー等に記載された方法、 あるいは 帀 Rのキッ卜、 例えば Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies 社製） 、 ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE社製） を用いる方法などがあげられる。
cDNA ライプラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、 大腸菌 K12 株中で自立複製できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミ ドベクタ 一等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express [STRATAGENE社、 ストラ テジーズ （Strategies) , 5, 58 (1992) ] 、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイツ ク · アシッ ド · リサーチ （Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989) ] 、 Lambda ZAP II (STRATAGENE社製）、 ； L gtl0、 ； L gtll [ディーェヌエー ' クロー二 ング ·ァ ·プラクティカノレ ·アプローチ (DNA cloning, A Practical Approach) , 1, 49 (1985) ] 、 λ TriplEx (Clontech社製）、 え ExCell (Pharmacia 社製）、 PT7T318U (Pharmacia 社製）、 pcD2 [モレキュラー ' セルラー ·バイオロジー (Mol. Cell. Biol. ) , 3, 280 (1983) ] および pUC18 [ジーン （Gene) , 33, 103 (1985) ] 等をあげることができる。
cDNA ライプラリーを作製するための宿主微生物としては、 微生物であればいず れでも用いることができるが、 好ましくは大腸菌が用いられる。 具体的には、 Escherichia coli XLl-Blue MRF' [ STRATAGENE 社、 ス ト ラ テ ジー ズ (Strategies) , 5, 81 (1992) ] 、 Escherichia coli C600 [ジエネテイクス (Genetics) , 39, 440 (1954) ] 、 Escherichia coli Y1088 [サイ エ ンス (Science) , 222, 778 (1983) ] 、 Escherichia coli Y1090 [サイ エ ンス (Science) , 222, 778 (1983) ] 、 Escherichia coli 圈 522 [ジャーナノレ ·ォブ · モレキュラー 'バイオロジー （J. Mol. Biol. ) , 166, 1 (1983) ] 、 Escherichia coli K802 [ジャーナル 'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー （J. Mol. Biol. ) , 16, 118 (1966) ] および Escherichia coli JM105 [ジーン （Gene) , 38, 275 (1985) ] 等が用いられる。
この cDNA ライプラリーを、 そのまま以降の解析に用いてもよいが、 不完全長 cDNA の割合を下げ、 なるべく完全長 cDNA を効率よく取得するために、 菅野らが 開発したオリゴキャップ法 [ジーン （Gene) , 138, 171 (1994)； ジーン （Gene) , 200, 149 (1997) ; 蛋白質核酸酵素， ϋ， 603 (1996)； 実験医学， ϋ, 2491 (1993)； cDNA クローニング （羊土社） (1996)； 遺伝子ライブラリーの作製法 （羊 土社） (1994) ] を用いて調製した cDNAライブラリーを以下の解析に用いてもよい。
GDP-フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質のアミノ酸配列に基づいて、 該ァミノ酸配列をコードすることが予測される 塩基配列の 5'端および 3'端の塩基配列に特異的なデジエネレイティブプライマー を作製し、 作製した cDNAライブラリーを錶型として PCR法 [ピーシーアール ·プ 口トコールズ（PCR Protocols) , Academic Press (1990) ] を用いて DNA の増幅を 行うことにより、 GDP-フコース合成酵素、 oi l, 6-フコース修飾酵素、 または GDP- フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得することができる。
取得した遺伝子断片が GDP -フコース合成酵素、 ο; 1, 6-フコース修飾酵素、 また は GDP-フコース輸送蛋白質をコードする DNAであることは、 通常用いられる塩基 配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーデイング ス'ォブ'ザ 'ナショナノレ 'アカデミー'ォブ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , , 5463 (1977) ] あるいは ABIPRISM377DNA シークェンサ一 （PE Biosysteras社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、 確認する ことができる。
該遺伝子断片を DNA をプローブとして、 ヒトまたは非ヒ ト動物の組織または細 胞に含まれる mRNAから合成した cDNAあるいは cDNAライブラリ一対してコ口-一 ハイプリダイゼーションゃプラークハイブリダィゼーション （モレキュラー 'ク ローニング第 2版） を行うことにより、 GDP-フコース合成酵素、 《1, 6-フコース 修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の DNAを取得することができる。
また、 GDP-フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース 輸送蛋白質をコードする遺伝子断片を取得するために用いたプライマーを用い、 ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞に含まれる mRNAから合成した cDNAある いは cDNAライブラリーを錶型として、 PCR法を用いてスクリーニングを行うこと により、 GDP-フコース合成酵素、 α; 1，6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース 輸送蛋白質の DNAを取得することもできる。
取得した GDP-フコース合成酵素、 ひ 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコー ス輸送蛋白質をコードする DNA の塩基配列を末端から、 通常用いられる塩基配列 解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディンダス 'ォ ブ'ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] あるいは ABIPRISM377DNA シークェンサ一 （PE Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、 該 DNAの 塩基配列を決定する。
決定した cDNAの塩基配列をもとに、 BLAST等の相同性検索プログラムを用いて、 GenBank、 EMBLおよび DDBJなどの塩基配列データベースを検索することにより、 データベース中の遺伝子の中で GDp—フコース合成酵素、 0：1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質をコードしている遺伝子を決定することもできる。 決定された DNA の塩基配列に基づいて、 フォスフォアミダイト法を利用したパ 一キン ·エルマ一社の DNA合成機 model 392等の DNA合成機で化学合成すること により、 GDP-フコース合成酵素、 α 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース 輸送蛋白質の cDNAを取得することもできる。
GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6 -フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質のゲノム DNAは、 例えば、 モレキュラー 'クローエング第 2版やカレント ' プロトコールズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された公知の方法 があげられる。 また、 ゲノム DNA ライブラリースクリーユングシステム (Genome Systems社製） や Universal GenomeWalker™ Kits (CL0NTECH社製） などを用いる ことにより、 調製することもできる。
また、 発現ベクターを用いず、 GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6 -フコース修飾酵 素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計したアンチセンス オリゴヌクレオチドまたはリポザィムを、 直接宿主細胞に導入することで、 宿主 細胞を得ることもできる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザィムは、 常法または DNA合成機 を用いることにより調製することができる。 具体的には、 GDP -フコース合成酵素、 ひ 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP -フコース輸送蛋白質をコードする cDNA お よびゲノム DNAの塩基配列のうち、 連続した 5〜150塩基、 好ましくは 5〜60塩基、 より好ましくは 10〜40塩基に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドの配列情 報に基づき、 該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当するオリゴヌクレオチ ド （アンチセンスオリゴヌクレオチド） または該オリゴヌクレオチドの配列を含 むリボザィムを合成することで調製することができる。
オリゴヌクレオチドとしては、 オリゴ腿および該オリゴヌクレオチドの誘導 体 （以下、 オリゴヌクレオチド誘導体という） 等があげられる。
オリゴヌクレオチド誘導体としては、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステ ル結合がホスフォロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 ォ リゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が Ν3' - P5'ホスフォアミデート結合 に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリボースとリ ン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが 5 プ口ピエルゥラシルで置換されたォリゴ ヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C- 5 チアゾールゥラシ ルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが C - 5 プロビュルシトシンで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌタレ ォチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン （phenoxazine- mod ied cytosine) で置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリ ボースが 2，- 0-プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 ある いはオリゴヌクレオチド中のリポースが 2' -メ トキシエトキシリボースで置換さ れたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる [細胞工学， 16， 1463 (1997) ] 。 (b) 相同組換え法による宿主細胞の作製
宿主細胞は、 GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6-フコース修飾酵素、 または GDP -フ コース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 染色体上の標的遺伝子を相同組換え法を 用い改変することによって作製することができる。
染色体上の標的遺伝子の改変は、 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (以下、 「マニピュレイティング'ザ'マウス'ェンブリオ 'ァ 'ラボラトリ一 · マニュアル」と略す)、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 バイオマニュアルシリーズ 8 ジーンターゲッ ティング， E S細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 （1995) (以下、 「E S細胞 を用いた変異マウスの作製」と略す） 等に記載の方法を用い、 例えば以下のように 行うことができる。
GDP-フコース合成酵素、 （¾ 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質のゲノム DNAを調製する。
ゲノム DNAの塩基配列にも基づき、 改変する標的遺伝子 （例えば、 GDP-フコー ス合成酵素、 ο; 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP -フコース輸送蛋白質の構造遺 伝子、 あるいはプロモーター遺伝子） を相同組換えするためのターゲットベクタ 一を作製する。
作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、 標的遺伝子とターゲットべ クタ一の間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、 宿主細胞を作製 することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP - フコース合成酵素、 α 1， 6 -フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の 遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後 述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
GDP-フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質のゲノム DNAを調製する方法としては、 上記 1の （1) の （a) に記載のゲノ ム DNAの調製方法などがあげられる。 標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 E S細胞 を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。 ターゲットベクターは、 リプレースメント型、 インサーシヨン型いずれでも用い ることができる。
各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、 後述の 3. に記載の各種宿 主細胞に適した組換えべクターの導入方法を用いることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、 例えば、 Gene Targeting, A Practical Approach, 丄 RL Press at Oxford University Press (1993)、 糸田胞 を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、 プロモーター選択、 ネガ ティブ選択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。 選別した細胞株の中 から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、 ゲノム DNA に対するサザ ンハイブリダイゼ一ション法 (モレキュラー ·クローニング第 2 版） や PCR 法
[ピーシーア一ノレ 'プロトコーノレズ (PCR Protocols) , Academic Press (1990) ] 等があげられる。
(c) RD0方法による細胞の作製
宿主細胞は、 GDP-フコース合成酵素、 《1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP -フ コース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 RD0 法を用い、 例えば、 以下のように作 製することができる。
GDP-フコース合成酵素、 ct l， 6 -フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の cDNAあるいはゲノム DNAを調製する。
調製した cDNAあるいはゲノム DNAの塩基配列を決定する。
決定した DNA の配列に基づき、 GDP -フコース合成酵素、 ひ 1， 6-フコース修飾酵 素、 または GDP -フコース輸送蛋白質をコードする部分、 非翻訳領域の部分あるい はイントロン部分を含む適当な長さの RD0のコンストラクトを設計し合成する。 合成した RD0を宿主細胞に導入し、 標的とした酵素、 すなわち GDP-フコース合 成酵素、 ひ 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質に変異が生じ た形質転換体を選択することにより、 宿主細胞を作製することができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP- フコース合成酵素、 α 1 フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の 遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後 述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
各種宿主細胞への RD0 の導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適した 組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP-フコース合成酵素、 （¾ 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の cDNA を調製する方法としては、 例えば、 上記 1 の （1) の （a) に記載の
「DNAの調製方法」 などがあげられる。
GDP-フコース合成酵素、 α 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質のゲノム DNAを調製する方法としては、 例えば、 上記 1の （1) の （a) に記 載のゲノム DNAの調製方法などがあげられる。
DNA の塩基配列は、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-） (Stratagene社製） 等のプラスミドにクローニングし、 通常用いられる塩基配列 解析方法、 例えば、 サンガー (Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーデイング ス ·ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー 'ォブ ·サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. , U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] 等の反応を行い、 塩基配列自動分析装置、 例 えば、 A. L. F. DNA シークェンサ一 （Pharmacia社製） 等を用いて解析すること で該 DNAの塩基配列を決定することができる。
RD0は、 常法または DNA合成機を用いることにより調製することができる。
RD0 を宿主細胞に導入し、 標的とした酵素、 GDP-フコース合成酵素、 a l，6 -フ コース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の遺伝子に変異が生じた形質転 換株を選択する方法としては、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント'プ 口トコールズ 'イン.モレキュラー.パイォロジ一等に記載された染色体上の遺伝子 の変異を直接検出する方法があげられる。
また、 前記 1 の （1) の （a) に記載の、 GDP-フコース合成酵素、 《1，6-フコー ス修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の活性を指標として形質転換体を選 択する方法、 後述の 1の （5) に記載の細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標とし て形質転換体を選択する方法を選択する方法も用いることができる。
RD0 のコンストラク トは、 サイエンス （Science) , 273, 1386 (1996) ; ネイチ ヤー · メ デイ シン （Nature Medicine) , 4, 285 (1998) ; へノ ト ロ ジー (Hepatology) , 25, 1462 (1997)； ジーン 'セラピー （Gene Therapy) , 5, 1960 (1999)；ジーン 'セラピー （Gene Therapy) , 5, 1960 (1999) ; ジャーナル 'ォ ブ 'モレキュラー 'メディシン （J. Mol. Med. ) , 75, 829 (1997) ; プロシーディ ングス 'ォプ 'ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 96, 8774 (1999)； プロシーディングス'ォブ'ザ 'ナショナル ·ァカデ ミー ·ォブ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 96, 8768 (1999) ; ヌク レイツク 'アシッド ' リサーチ (Nuc. Acids. Res. ) , 27, 1323 (1999)； インべ スティゲーション · ォブ · ダーマト口ジー （Invest. Dematol. ) , 111, 1172 (1998)；ネイチヤー 'バイオテクノロジー （Nature Biotech. )， 16, 1343 (1998) ; ネイチヤー ·バイオテクノ口ジー (Nature Biotech. ) , 18, 43 (2000)； ネィチヤ 一'バイオテクノロジー （Nature Biotech. )， 18, 555 (2000) 等の記載に従って 設計することができる。
(d) RNAi方法による宿主細胞の作製
宿主細胞は、 GDP-フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フ コース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 RNAi (RNA interference) 法を用い、 例 えば、 以下のように作製することができる。
GDP-フコース合成酵素、 α 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の cDNAを調製する。
調製した cDNAの塩基配列を決定する。
決定した DNA の配列に基づき、 GDP-フコース合成酵素、 a l，6-フコース修飾酵 素、 または GDP-フコース輸送蛋白質をコードする部分あるいは非翻訳領域の部分 を含む適当な長さの RNAi遺伝子のコンストラクトを設計する。
該 RNAi遺伝子を細胞内で発現させるために、 調製した DNAの断片、 または全長 を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換えべク ターを作製する。
該組換えべクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り形質転換体を得る。
GDP-フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指 標に形質転換体を選択することで、 宿主細胞を得ることができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP- フコース合成酵素、 α 1, 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の 遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後 述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 設計した RNAi遺伝子を転写できる位置にプロモーターを 含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述の 3. に記載の発現ベクター があげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適し た糸且換えべクタ一の導入方法を用いることができる。
GDP-フコース合成酵素、 a l， 6 -フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 前記 1 の (1) の （a) に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法として は、 例えば、 後述の 1の （5) に記載の方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構 造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 5 または後 述の 6に記載の方法があげられる。
GDP-フコース合成酵素、 ひ 1， 6 -フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の cDNAを調製する方法としては、 例えば、 前記 1の （1) の （a) に記載され た DNAの調製方法などがあげられる。
また、 発現ベクターを用いず、 GDP-フコース合成酵素、 《1，6-フコース修飾酵 素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の塩基配列に基づいて設計した RNAi 遺伝子 を、 直接宿主細胞に導入することで、 宿主細胞を得ることもできる。
RNAi遺伝子は常法または DNA合成機を用いることにより調製することができる。 RNAi 遺伝子のコンストラク トは、 [ネイチヤー （Nature) , 391, 806 (1998)； プ口シーデイングス'ォプ 'ザ.ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 95, 15502 (1998) ; ネイチヤー （Nature) , 395, 854 (1998)； プ口シーデイングス 'ォブ 'ザ'ナショナル 'アカデミ^ ^ ·ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 96, 5049 (1999)； セノレ (Cell) , 95, 1017 (1998)； プ口シーデイングス'ォブ 'ザ'ナショナル ·ァ力デミ一'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 96, 1451 (1999)； プロシーディングス'ォブ' ザ 'ナショナノレ 'ァカデミ■ ォプ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 95, 13959 (1998)； ネイチヤー 'セル'パイォォロジー （Nature Cell Biol. ) , _ 70 (2000) ]等の記載に従って設計することができる。
(e) トランスポゾンを用いた方法による、 宿主細胞の作製
宿主細胞は、 ネイチヤー 'ジエネテイク （Nature Genet. ) , 25, 35, (2000) 等 に記載のトランスポゾンのシステムを用い、 GDP-フコース合成酵素、 ひ 1，6-フコ ース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の活性、 あるいは産生抗体分子ま たは細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標に突然変異体を選択することで、 宿主 細胞を作製することができる。
トランスポゾンのシステムとは、 外来遺伝子をランダムに染色体上に挿入させ ることで突然変異を誘発させるシステムであり、 通常、 トランスポゾンに揷まれ た外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、 この遺伝子を染色体 上にランダムに挿入させるためのトランスポゼースの発現ベクターを同時に細胞 の中に導入する。
トランスポゼースは、 用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいか なるものも用いることができる。 外来遺伝子としては、 宿主細胞の DNA に変異を誘起するものであればいかなる 遺伝子も用いることができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP- フコース合成酵素、 a 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の 遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後 述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。 各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いる ことができる。
GDP-フコース合成酵素、 ひ 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP -フコース輸送蛋 白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法としては、 例えば、 前記 1 の
(1) の （a) に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法として は、 例えば、 後述の 1の （5) に記載の方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構 造を指標として突然変異体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 5 または後 述の 6に記載の方法があげられる。
(2) 酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法
宿主細胞は、 GDP -フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フ コース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 該酵素のドミナントネガティブ体を導入 する手法を用いることにより作製することができる。 GDP-フコース合成酵素とし ては、 具体的には、 GMD、 Fx、 GFPP、 Fucokinase などがあげられる。 ο; 1，6-フコ ース修飾酵素としては、 具体的には、 α 1, 6 -フコシルトランスフェラーゼ、 α - L - フコシダーゼなどがあげられる。 GDP-フコース輸送蛋白質としては、 具体的には、 GDP -フコーストランスポーターなどがあげられる。
これらの酵素は、 基質特異性を有したある特定の反応を触媒する酵素であり、 このような基質特異性を有した触媒作用を有する酵素の活性中心を破壊すること で、 これらの酵素のドミナントネガティブ体を作製することができる。 標的とす る酵素のうち、 GMD を例として、 そのドミナントネガティブ体に作製について具 体的に以下に述べる。
大腸菌由来の GMDの立体構造を解析した結果、 4つのアミノ酸 （133番目のトレ ォニン、 135番目のグルタミン酸、 157番目のチロシン、 161番目のリシン） が酵 素活性に重要な機能を担っていることが明らかにされている （Structure, 8, 2, 2000)。 すなわち、 立体構造の情報にもとづきこれら 4つのアミノ酸を異なる他の アミノ酸に置換した変異体を作製した結果、 いずれの変異体においても有意に酵 素活性が低下していたことが示されている。 一方、 GMDの補酵素 NADPや基質であ る GDP-マンノースとの結合能に関しては、 いずれの変異体においてもほとんど変 化が観察されていない。 従って、 GMD の酵素活性を担うこれら 4 つのアミノ酸を 置換することにより ドミナントネガティブ体を作製することができる。 大腸菌由 来の GMD の結果に基づき、 アミノ酸配列情報をもとにした相同性比較や立体構造 予測を行うことにより ドミナントネガティブ体を作製することができる。 このよ うなアミノ酸置換を導入した遺伝子の作製は、 モレキュラー ' クローユング第 2 版、 カレント 'プロトコールズ ·イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載さ れた部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。
宿主細胞は、 上述のように作製した標的酵素のドミナントネガティブ体遺伝子 を用い、 モレキユラ' クローニング第 2版、 カレント 'プロトコールズ'イン'モ レキユラ一'バイオロジー、 マ-ピュレーティング ·マウス ·ェンブリオ第 2版等 に記載された遺伝子導入の方法に従って、 例えば、 以下のように作製することが できる。
GDP-フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP -フコース輸送蛋 白質のドミナントネガティブ体をコードする遺伝子 （以下、 ドミナントネガティ ブ体遺伝子と略記する） を調製する。
調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長 DNA をもとにして、 必要に応じ て、 該蛋白質をコードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。
該 DNA断片、 または全長 DNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷 入することにより、 組換えベクターを作製する。 該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り、 形質転換体を得る。
GDP-フコース合成酵素、 o; l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標 に形質転換体を選択することで、 本発明に用いられる宿主細胞を作製することが できる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする GDP- フコース合成酵素、 α 1, 6—フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の 遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後 述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 目的とするドミナントネガティブ体をコードする DNA を 転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述の 3. に記載の発現ベクターがあげられる。
各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適し た組み換えベクターの導入方法を用いることができる。
GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 前記 1 の (1) の （a) に記載の方法があげられる。
細胞膜上の糠蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法として は、 例えば、 後述の 1の （5) に記載の方法があげられる。 産生抗体分子の糖鎖構 造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 5 または後 述の 6に記載の方法があげられる。
(3) 酵素に突然変異を導入する手法
宿主細胞は、 GDP-フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP -フ コース輸送蛋白質の遺伝子について突然変異を導入し、 該酵素に突然変異を生じ た所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製できる。 GDP-フコース合成酵素としては、 GMD、 Fx, GFPP、 Fucokinase などがあげられ る。 ひ 1， 6-フコース修 酵素としては、 具体的には、 Q; 1， 6-フコシルトランスフ エラーゼ、 α -L -フコシダーゼなどがあげられる。 GDP-フコース輸送蛋白質として は、 具体的には、 GDP-フコーストランスポーターなどがあげられる。
酵素に突然変異を導入する方法としては、 1) 突然変異誘発処理で親株を処理し た突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 GDP-フコース合成酵 素、 ひ 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の活性を指標とし て所望の細胞株を選択する方法、 2) 突然変異誘発処理で親株を処理した突然変異 体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 生産抗体分子の糖鎖構造を指標 として所望の細胞株を選択する方法、 3) 突然変異誘発処理で親株を処理した突然 変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 該細胞の細胞膜上の糖蛋白 質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などがあげられる。
突然変異誘発処理としては、 親株の細胞の DNA に点突然変異、 欠失あるいはフ レームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができ る。
具体的には、 ェチルニトロソゥレア、 ニトロソグァ二ジン、 ベンゾピレン、 ァ クリジン色素による処理、 放射線の照射などがあげられる。 また、 種々のアルキ ル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。 突然変異誘発 物質を細胞に作用させる方法としては、 例えば、 組織培養の技術第三版 （朝倉書 店） 日本組織培養学会編 （1996)、 ネイチヤー ·ジ ネテイクス （Nature Genet. ) , 24, 314, (2000) 等に記載の方法をあげることができる。
自然発生的に生じた突然変異体としては、 特別な突然変異誘発処理を施さない で、 通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる 突然変異体をあげることができる。
GDP-フコース合成酵素、 α 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋 白質の活性を測定する方法としては、 例えば、 前記 1 の （1) の （a) に記載の方 法があげられる。 細胞膜上の糖蛋白質の糖鎖構造を識別する方法としては、 例え ば、 後述の 1の （5) に記載の方法があげられる。 (4) 酵素の遺伝子の転写または翻訳を抑制する手法
宿主細胞は、 GDP-フコース合成酵素、 a l， 6-フコース修飾酵素、 または GDP -フ コース輸送蛋白質の遺伝子を標的とし、 アンチセンス RNA/DNA技術 レィォサイ エンスとイ ンダス ト リ一， ， 322 (1992)、 ィヒ学， ， 681 (1991)、 Biotechnology, 9, 358 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992)、 細胞工学， 16, 1463 (1997) ] 、 ト リプル.ヘリックス技術 [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992) ] 等を用い、 標的とする遺伝子の転写または翻訳を抑制することで作製することができる。
GDP-フコース合成酵素としては、 具体的には、 GMD、 Fx, GFPP、 Fucokinase な どがあげられる。 a l， 6 -フコース修飾酵素としては、 具体的には、 ct l，6-フコシ ルトランスフェラーゼ、 CK -L -フコシダーゼなどがあげられる。 GDP -フコース輸送 蛋白質としては、 具体的には、 GDP-フコース トランスポーターなどがあげられる。
(5) N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコース の 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法 宿主細胞は、 Ν-グリコシド結合糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選 択する手法を用いることにより作製することができる。
Ν-グリコシド結合糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法と しては、 例えば、 ソマテイ ク 'セル ·アン ド'モレキュラー'ジエネテイクス (Somatic Cell Mol. Genet. ) , 12, 51 (1986) 等に記載のレクチンを用いた方法 があげられる。
レクチンとしては、 Ν -グリコシド結合糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミン の 6位とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいず れのレクチンでも用いることができるが、 その具体的な例としては、 レンズマメ レクチン LCA (Lens Culinaris由来の Lentil Agglutinin) , エンドゥマメレクチ ン PSA (Pi sum sativum由来の Pea Lectin)、 ソラマメレクチン VFA (Vicia faba 由来の Agglutinin)、 ヒィロチャワンタケレクチン AAL (Aleuria aurantia 由来 の Lectin) 等をあげることができる。
具体的には、 1 μ g/ml〜lmg/mlの濃度の上述のレクチンを含む培地で 1日〜 2週 間、 好ましくは 1 日〜 1 週間培養し、 生存している細胞を継代培養あるいはコロ ニーをピックアップし別の培養器に移し、 さらに引き続きレクチンを含む培地で 培養を続けることにより、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサ ミンの 6位とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性で ある株を選択することができる。
レクチン耐性細胞であることを確認する方法としては、 GDP -フコース合成酵素、 a 1, 6-フコース修飾酵素または GDP-フコース輸送蛋白質の発現を確認する方法、 直接レクチンを加えた培地に細胞を培養する方法などがあげられる。 具体的には 細胞内の a l， 6-フコース修飾酵素の一つである α 1， 6-フコシルトランスフェラー ゼの mRNAの発現量を測定し、 mRNAの発現が低下していればレクチン耐性の細胞 であるといえる。
2. トランスジエニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作製
本発明で用いられる抗体組成物は、 GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6-フコース修 飾酵素および GDP -フコース輸送蛋白質からなる群から選ばれる蛋白質の少なくと も 1 つ以上の蛋白質の活性が低下または欠失するようにゲノム遺伝子が改変され たトランスジヱニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫を用いて、 製造 することができる。 トランスジエニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子 孫は、 上述の蛋白質の遺伝子を標的として、 1. に記載の手法と同様の手法を用い て作製することができる。
トランスジエニック非ヒト動物の場合、 目的とする非ヒト動物、 例えばゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サル、 ゥサギ等の胚性 幹細胞に、 1. に記載の手法と同様の手法を用いることにより、 GDP-フコース合成 酵素、 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコ^ "ス輸送蛋白質の活性が低下ま たは欠失された胚性幹細胞を作製することができる。
具体的は、 染色体上の GDP-フコース合成酵素、 1， 6-フコース修飾酵素、 また は GDP -フコース輸送蛋白質をコードする遺伝子を公知の相同組換えの手法 [例え ば、 Nature, 326, 6110， 295 (1987)、 Cell, 51, 3, 503 (1987) 等] により不活 化または任意の配列と置換した変異クローンを作製する。 作製した該変異クロー ンを用い、 動物の受精卵の胚盤胞 （blastocyst) への注入キメラ法または集合キ メラ法等の手法により、 胚性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調 製することができる。 このキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、 全身の細 胞で GDP-フコース合成酵素、 ひ 1， 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送 蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジヱニック非ヒト動物を得ることが できる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 ¾ 細胞を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することがで きる。 ターゲットベクターは、 リプレースメント型、 ィンサーション型、 ジー ントラップ型いずれでも用いることができる。
胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、 動物細胞に DNA を 導入する方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレー シヨン法 [サイ トテクノロジー （Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ]、 リン酸力 ルシゥム法 （特開平 2-227075)、 リボフヱクシヨン法 [プロシーディンダス 'ォ ブ.ザ.ナショナル.アカデミー.ォブ.サイエンス （proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. ) , 84, 7413 (1987) ]、 インジェクション法 （マ-ピュレーティング 'マ ウス .ェンブリオ第 2版）、 パーティクルガン (遣伝子銃) を用いる方法 （日本 特許第 2606856、 日本特許第 2517813)、 DEAE -デキストラン法 レィォマニユア ルシリーズ 4一遺伝子導入と発現 ·解析法 （羊土社） 横田崇 ·新井賢一編 (1994) ]、 ウィルスベクター法 （マ-ピュレーティング 'マウス 'ェンプリオ第 2版） 等をあげることができる。
相同組換え体を効率的に選別する方法として、 例えば、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 E S細 胞を用いた変異マゥスの作製等に記載のポジティブ選択、 プロモータ一選択、 ネガティブ選択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。 具体的には、 hprt遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、 hprt遺伝子を欠損した胚性幹 細胞に導入後、 胚性幹細胞をァミノプテリン、 ヒポキサンチンおよびチミジン を含む培地で培養し、 アミノブテリン耐性の株を選別することにより、 hprt遺 伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。 ネ ォマイシン耐性遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、 ベクターを導入し た胚性幹細胞を G418を含む培地で培養し、 G418耐性の株を選別することにより、 ネオマイシン耐性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティブ選択を行な うことができる。 DT遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、 ベクターを導 入した胚性幹細胞を培養し、 生育してきた株を選別する （相同組換え以外のラ ンダムに染色体に挿入された組換え体は、 DT遺伝子が染色体に組み込まれて発 現するため、 DT の毒性により生育できない） ことにより、 DT遺伝子を含まない 相同組換え体を選別するネガティブ選択を行なうことができる。 選別した細胞 株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、 ゲノム DNA に対 するサザンハイブリダィゼーション法 （モレキュラー ·クローニング第 2版） や PCR 法 [ピーシーア一ル ·プロ トコールズ (PCR Protocols) , Academic Press (1990) ] 等があげられる。
胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、 一般に 8 細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。 胚性幹細胞を注入キ メラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、 一般に 8細胞期から胚盤胞の 発生段階の受精卵を用いることが好ましい。
雌マウスへ受精卵を移植する場合には、 精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配さ せることにより、 受精能を誘起された偽妊娠雌マウスに得られた受精卵を人工 的に移植および着床させる方法が好ましく、 偽妊娠雌マウスは自然交配によつ ても得られるが、 黄体形成ホルモン放出ホルモン （以下、 LHRH と略する） ある いはその類縁体を投与後、 雄マウスと交配させることにより、 受精能を誘起さ れた偽妊娠雌マウスを得ることもできる。 LHRH の類縁体としては、 例えば [3, 5-Dil-Tyr5]-LHRH 、 [Gln8] - LHRH 、 [D-Ala6] - LHRH 、 des- GlylO - [D- His (Bzl) 6] -LHRH ethylamide等があげられる。
また、 目的とする非ヒト動物、 例えばゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥマ、 マウ ス、 ラット、 ニヮトリ、 サル、 ゥサギ等の受精卵細胞に、 1. に記載の手法と同様 の手法を用いることにより、 GDP-フコース合成酵素、 a l， 6 -フコース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した受精卵細胞を作製す ることができる。
作製した受精卵細胞を、 マ-ピューレーティング'マウス'ェンプリオ第 2版等 に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させる ことで、 GDP-フコース合成酵素、 α 1, 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコース 輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジエニック非ヒト動物を作製す ることができる。
トランスジェエック植物の場合、 目的とする植物体力ルスまたは細胞に、 1. に 記載の手法と同様の手法を用いることにより、 GDP -フコース合成酵素、 a i, e- コース修飾酵素、 または GDP-フコース輸送蛋白質の活性が低下または欠失した力 ルスを作製することができる。
作製したカルスを、 公知の方法 [組織培養， ^ (1994)； 組織培養， 21 (1995)； ト レン ド ·ィ ン · ノ ィォテクノロジー (Trends in Biotechnology) , 15, 45 (1997) ]に準じてォーキシンぉよびサイトカイユンを含む培地で培養することで再 分ィ匕させ、 GDP -フコース合成酵素、 ひ 1, 6-フコース修飾酵素、 または GDP-フコー ス輸送蛋白質の活性が低下または欠失したトランスジエニック植物を作製するこ とができる。 3. 抗体組成物の製造方法
抗体組成物は、 モレキュラー 'クロー-ング第 2版、 カレント'プロトコールズ' イン ·モレキュフ > ~~ ·ノヽィォロン一、 Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (以下、 アンチポディズと略す）、 モノクローナ ノレアンテボアイス、 Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (以下、 アンチボディエンジニアリングと略 す） 等に記載された方法を用い、 例えば、 以下のように宿主細胞中で発現させて 取得することができる。
抗体分子の全長 cDNAを調製し、 該抗体分子をコードする部分を含む適当な長さ の DNA断片を調製する。
該 DNA断片、 または全長 cDNAを適当な発現べクターのプロモーターの下流に揷 入することにより、 組換えベクターを作製する。
該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り、 抗体分子を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的とする遺伝 子を発現できる前記 1に記載した宿主細胞を用いる。
発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組込が可能で、 目的とする抗体分子をコードする DNA を転写できる位置にプ 口モーターを含有しているものが用いられる。
cDNAは、 上記 1の （1) の （a) に記載の DNAの調製方法に従い、 ヒトまたは非 ヒト動物の組織または細胞より、 目的とする抗体分子に特異的なプローブプライ マー等を用いて調製することができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 YEP13 (ATCC37115) , YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419) 等をあげることができる。 プロモーターとしては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05 プロモーター、 PGK プロモーター、 GAP プロモーター、 ADH プロモーター、 gal 1 プロモーター、 gal 10 プロモーター、 ヒートショック蛋白質プロモーター、 MF a l プロモーター、 CUP 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、 サッカロミセス属、 シゾサッカロミセス属、 クリュイべ口 ミセス属、 トリ コスポロン属、 シュヮ-ォミセス属等に属する酵母、 例えば、 accharomvces cerevi§iae、 schizosaccharomyces pombs、 Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pullulanss Schwanniomyces alluvius等をあげ、ること力 Sできる。 組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DNA を導入する方法であればいず れも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 [メソッズ ·ェンザ ィモロジ一 （Methods. Enzymol. ) , 194, 182 (1990) ] 、 スフエロプラスト法 [プ 口シーディングス.ォブ ·ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A) , M, 1929 (1978) ] 、 酢酸リチウム法 [ジャーナル ' ォブ 'パクテリォロジ一 （J. Bacteriology) , 153, 163 (1983) ] 、 プロシーディ ングス 'ォプ 'ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A) , 75, 1929 (1978) に記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 pcDNAI、 pcDM8 (フナコシ社より市販）、 AGE107 [特開平 3-22979；サイ トテクノロジー (Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ]、 pAS3 - 3 [特開平 2-227075] 、 pCDM8 [ネィ チヤ一 （Nature) , 329, 840 (1987) ] 、 pcDNAI/Amp (Invitrogen 社製）、 pREP4 (Invitrogen 社製）、 pAGE103 [ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリー （J. Biochemistry) , 101, 1307 (1987) ]、 pAGE210等をあげることができる。
プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイトメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺 伝子のプロモーター、 SV40 の初期プロモーター、 レトロゥイノレスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 SR o;プロモータ 一等をあげることができる。 また、 ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモ 一ターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒトの細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞で ある COS細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特開 昭 63- 299)、 ラットミエローマ細胞、 マウスミエローマ細胞、 シリアンハムスタ 一腎臓由来細胞、 胚'生幹細胞、 受精卵細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に DNA を導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 エレクト口ポレーシヨン法 [サイ トテクノ ロジー （Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] 、 リン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075)、 リポフエクシヨン法 [プロシーディンダス 'ォブ 'ザ'ナショナル'ァカデ ミ1 ォプ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84. 7413 (1987) ] 、 ィンジェクシヨン法 （マニピュレイティング'ザ'マウス'ェンプリオ 'ァ 'ラボラト リー'マニュアル）、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （日本特許第 2606856、 日本特許第 2517813)、 DEAE-デキストラン法 レ ィォマニュアルシリー ズ 4一遺伝子導入と発現 ·解析法 （羊土社） 横田崇 ·新井賢一編 （1994) ]、 ウイ ルスベクター法 （マニピユレ一ティング 'マウス ·ェンブリオ第 2版） 等をあげ ることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばカレント ·プロトコールズ'ィ ン · モレキュフー · / づ ォロ ン · ~、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、 ハイォ /ァ クノロジー （Bio/Technology)， 6, 47 (1988) 等に記載された方法によって、 蛋 白質を発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入ベクターおよびパキュロウィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆 虫細胞に感染させ、 蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製） 等をあげることができる。 バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである アウ トグラファ ' カリフォルニ力 · ヌクレアー ' ポリへドロシス · ウィルス (Autographa californica nuc丄 ear polyhedrosis virusリ 等を用いること でき る。 昆虫細胞としては、 Spodopterafrugiperda の卵巣細胞である Sf9、 Sf21 [カレ ント · プロ トコーノレズ 'イン 'モレキュラー · / ィォロジ一、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992) ] 、 Trichoplusia ni の卵巣細胞である High 5 (Invitrogen 社製） 等を用いることができる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べクタ 一と上記パキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法 (特開平 2-227075)、 リボフヱクシヨン法 [プロシーディングス 'ォプ 'ザ'ナショ ナノレ'アカデミー 'ォブ 'サイエンス（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84, 7413 (1987) ] 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 T iプラスミ ド、 タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、 植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 35S プロモー ター、 ィネアクチン 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 ァブラ ナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞をあげることができ る。
組換えベクターの導入方法としては、 植物細胞に DNA を導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 ァグロパクテリゥム （Agrobacterium) を用 いる方法 （特開昭 59- 140885、 特開昭 60- 70080、 W094/00977)、 エレクト口ポレー シヨン法 （特開昭 60-251887)、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用いる方法 （日 本特許第 2606856、 日本特許第 2517813) 等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー · クローニング第 2 版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 Fc領域と他の蛋白質との融合 蛋白質発現等を行うことができる。 糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した酵母、 動物細胞、 昆虫細胞または植物 細胞により発現させた場合には、 導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が付カロ された抗体分子を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中に抗体分子を 生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 抗体組成物を製造することが できる。 形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主細胞の培養に用いられる通常 の方法に従つて行うことができる。
酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 該酵母が資化 し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行え る培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、 該酵母が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分 解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール などのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモ-ゥム、 酢酸ァ ンモニゥム、 リン酸アンモ-ゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンス チープリカー、 カゼイン加水分解物、 大豆粕おょぴ大豆粕加水分解物、 各種発酵 菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩類としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マン癌、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培 養温度は 15〜40°Cがよく、 培養時間は、 通常 16時間〜 7日間である。 培養中の p Hは 3. 0〜9. 0に保持する。 p Hの調製は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。 プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換 した酵母を培養するときには、 必要に応じてィンデューサーを培地に添加しても よい。 例えば、 lac プロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を 培養するときにはイソプロピル - i3 -D-チォガラタトピラノシド等を、 trpプロモ 一ターを用いた組換えベクターで形質転換した酵母を培養するときにはィンドー ルアクリル酸等を培地に添カ卩してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている RPMI1640培地 [ザ ·ジャーナル ·ォブ 'ザ'アメリカン'メデイカ ノレ · ァソシエイション (The Journal of the American Medical Association) , 199, 519 (1967) ] 、 Eagle の MEM 培地 [サイエンス （Science) , 122, 501 (1952) ] 、 ダノレべッコ改変 MEM培地邊 [ヴユウロロジー （Virology) , 8, 396 (1959) ] 、 199 培地 [プロシーディング ·ォブ ·ザ · ソサイエティ ·フォア · ザ · ノ ィォロジカル · メティスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73, 1 (1950) ] 、 Whitten培地 [発生工学実験マ二ユア ル-トランスジェユック ·マウスの作り方 （講談社） 勝木元也編 （1987) ] またはこ れら培地に牛胎児血清等を添カ卩した培地等を用レ、ることができる。
培養は、 通常 p H6〜8、 30〜40°C、 5%C02存在下等の条件下で 1〜7日間行う。 また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に 添カ卩してもよレ、。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている TNM- FH 培地 （Pharmingen 社製）、 Sf-900 II SFM 培地 （Life Technologies社製）、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製）、 Grace' s Insect Medium [ネイチヤー （Nature) , 195, 788 (1962) ] 等を用いるこ とができる。
培養は、 通常 p H6〜7、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。 植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、 細胞として、 または植物の細胞 や器官に分化させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地として は、 一般に使用されているムラシゲ 'アンド 'スターグ （MS) 培地、 ホワイト (White)培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイトカイニン等、 植物ホルモン を添カ卩した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を 培地に添カ卩してもよい。
上記のとおり、 抗体分子をコードする DNA を組み込んだ組換え体べクターを保 有する酵母、 動物細胞、 昆虫細胞あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の 培養方法に従って培養し、 抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物より抗体組成物 を採取することにより、 抗体組成物を製造することができる。
抗体遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー'クローニング 第 2版に記載されている方法に準じて、 分泌生産、 融合蛋白質発現等を行うこと ができる。
抗体組成物の生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に 分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用する宿 主細胞や、 生産させる抗体分子の構造を変えることにより、 該方法を選択するこ とができる。
抗体組成物が宿主細胞内ある Vヽは宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポールソ ンらの方法 [ジャーナル 'ォブ ·バイオロジカノレ 'ケミストリー (J. Biol. Chem. ) , 264, 17619 (1989) ] 、 ロウらの方法 [プロシーディングス 'ォブ 'ザ 'ナ ショナル.アカデミー.ォブ.サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 86, 8227 (1989)； ジーン.デベロップメント （Genes Develop. )， 4, 1288 (1990) ] 、 または特開平 5-336963、 特開平 6-823021 等に記載の方法を準用することにより、 該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 発現ベクターに、 抗体分子をコード する DNA、 および抗体分子の発現に適切なシグナルペプチドをコードする DNA を 挿入し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入の後に発現させることにより、 目的と する抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、 特開平 2 - 227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵素 遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。 さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺 伝子が導入された動物個体 （トランスジエニック非ヒト動物） または植物個体 (トランスジエニック植物） を造成し、 これらの個体を用いて抗体組成物を製造す ることもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育ま たは栽培し、 抗体組成物を生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該抗体 組成物を採取することにより、 該抗体組成物を製造することができる。
動物個体を用いて抗体糸且成物を製造する方法としては、 例えば公知の方法 [ァ メ リカン · ジャーナル · ォブ · クリニ力ノレ ' 二ユートリシヨン (American Journal of Clinical Nutrition) , 63, 639S (1996)； アメリカン'ジャーナル' ォブ · ク リ ニカル · - ユ ー 卜 ジ シヨ ン (American Journal of Clinical Nutrition) , 63, 627S (1996)； バイオ Zテクノロジー （Bio/Technology)， 9, 830 (1991) ] に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物 を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、 例えば、 抗体分子をコードする DNA を導入したトランスジ エニック非ヒト動物を飼育し、 抗体組成物を該動物中に生成蓄積させ、 該動物中 より抗体組成物を採取することにより、 抗体組成物を製造することができる。 該 動物中の生成蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク （特開昭 63-309192)、 卵等をあげることができる。 この際に用いられるプロモーターとしては、 動物で 発現できるものであればいずれも用いることができるが、 例えば、 乳腺細胞特異 的なプロモーターであるひカゼインプロモーター、 j3カゼインプロモーター、 β ラタトグロプリンプロモーター、 ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に 用いられる。 植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、 例えば抗体分子をコー ドする DNA を導入したトランスジュニック植物を公知の方法 [組織培養， ^ (1994)； 組織培養， ^1 (1995)； トレンド ·イン 'パイォテクノ口ジー （Trends in Biotechnology) , 15, 45 (1997) ] に準じて栽培し、 抗体組成物を該植物中に 生成 ·蓄積させ、 該植物中より該抗体組成物を採取することにより、 抗体組成物 を生産する方法があげられる。
抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成 物は、 例えば抗体組成物が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波破砕機、 フレンチ プレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砗し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清か ら、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル (DEAE)-セファロース、 DIAI0N HPA-75 (三菱化学 （株） 製） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー 法、 S - Sepharose FF (Pharmacia社製） 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマ トグラフィ一法、 ブチノレセファロース、 フエニノレセファロース等のレジンを用い た疎水性ク口マトグラフィ一法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティーク 口マトグラフィ一法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動 法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 抗体組成物の精製標品を得ること ができる。
また、 抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞を 回収後破碎し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分として抗体組成物の不溶体 を回収する。 回収した抗体組成物の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。 該可溶 化液を希釈または透析することにより、 該抗体組成物を正常な立体構造に戻した 後、 上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることができる。 抗体組成物が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該抗体組成物あるいは その誘導体を回収することができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等 の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記 と同様の単離精製法を用いることにより、 抗体組成物の精製標品を得ることがで きる。
このようにして取得される抗体組成物として、 例えば、 抗体、 抗体の断片、 抗 体の Fc領域を有する融合蛋白質などをあげることができる。
以下に、 抗体組成物の取得のより具体的な例として、 ヒ ト化抗体の組成物およ ぴ Fc融合蛋白質の製造方法について記すが、 他の抗体組成物を当該方法と同様に して取得することもできる。
A. ヒ ト化抗体組成物の製造
(1) ヒ ト化抗体発現用ベクターの構築
ヒ ト化抗体発現用ベクターとは、 ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子 が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、 動物細胞用発現ベクターにヒ ト 抗体の CHおよび CL をコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより 構築することができる。
ヒ ト抗体の C領域としては、 任意のヒ ト抗体の CHおよび CLであることができ、 例えば、 ヒト抗体の H鎖の IgGlサブクラスの C領域 （以下、 hC y 1 と表記する） およびヒ ト抗体の L鎖の κクラスの C領域 （以下、 hC /cと表記する） 等があげら れる。
ヒ ト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子としてはェキソンとイントロンか ら成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、 ヒ ト抗体の C領域をコードする遺伝子を組 込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE107 [サイ トテクノロジー （Cytotechnology)， 3， 133 (1990) ] 、 pAGE103 [ジャーナル 'ォプ 'パイオケミストリー （J. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ] 、 PHSG274 [ジーン （Gene) , 27, 223 (1984) ] 、 pKCR [プロシーデイングス 'ォ ブ .ザ .ナショナル .アカデミー ·ォプ ·サイエンス （proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 78, 1527 (1981) ] 、 pSGl β d2 - 4 [サイ ト テ ク ノ ロ ジー (Cytotechnology) , 4. 173 (1990) ] 等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに 用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモーターとェンハ ンサー [ジャーナル 'ォプ 'パイオケミストリー （J. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ] 、 モロニ一マウス白血病ウィルスの LTR レ ィォケミカル 'アンド 'ノ ィオフイジ力ノレ ' リサーチ ' コミュニケーショ ンズ (Biochem. Biophys. Res. Commun. ) , 149, 960 (1987) ] 、 免疫グロブリン H鎖のプロモーター [セル (Cell) , 41, 479 (1985) ] とェンハンサー [セル (Cell) , 33> 717 (1983) ] 等が あげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、 抗体 H鎖および L鎖が別々のベクター上に存在 するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ （以下、 タンデム型と表 記する） のどちらでも用いることができるが、 ヒ ト化抗体発現ベクターの構築の 容易さ、 動物細胞への導入の容易さ、 動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現 量のパランスが均衡する等の点からタンデム型のヒ ト化抗体発現用ベクターの方 が好ましい [ジャーナル'ォプ'ィムノロジカル'メソッズ （J. Immunol. Methods) , 167, 271 (1994) ]。
構築したヒ ト化抗体発現用ベクターは、 ヒ ト型キメラ抗体おょぴヒト型 CDR移 植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
(2) ヒト以外の動物の抗体の V領域をコードする cDNAの取得
ヒト以外の動物の抗体、 例えば、 マウス抗体の VHおよび VLをコードする cDNA は以下のようにして取得することができる。
目的のマウス抗体を産生するハイプリ ドーマ細胞より mRNA を抽出し、 cDNA を 合成する。 合成した cDNAをファージ或いはプラスミ ド等のベクターにクローニン グして cDNAライブラリーを作製する。 該ライプラリーより、 既存のマウス抗体の C領域部分或いは V領域部分をプローブとして用い、 H鎖 V領域をコードする cDNA を有する組換えファージ或いは組換えプラスミ ドおよび VL をコードする cDNA を有する組換えファージ或いは組換えプラスミ ドをそれぞれ単離する。 組換 えファージ或いは組換えプラスミ ド上の目的のマウス抗体の VHおよび VLの全塩 基配列を決定し、 塩基配列より VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定する。 ヒ ト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 ハイブリ ドーマ細胞を作製することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。 ハイプリ ドーマ細胞から全 RNA を調製する方法としては、 チォシアン酸グァ- ジン-トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソッズ'イン'ェンザィモロジ一 （Methods in Enzyraol. ) , 154, 3 (1987) ] 、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 オリゴ (dT)固定化セルロースカラム法 （モレキュラー 'クローニング第 2版） 等が あげられる。 また、 ハイプリ ドーマ細胞から mRNA を調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 个土製) 、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製） 等があげられる。
cDNA の合成おょぴ cDNA ライブラリ一作製法としては、 常法 [モレキュラー ' クロー-ング第 2版、 カレント 'プロトコールズ ·イン 'モレキュラー ·バイオ ロジ一， Supplement 1-34] 、 或いは市販のキッ ト、 例えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製） や ZAP - cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製） を用いる方法などがあげられる。 cDNA ライプラリーの作製の際、 ハイブリ ドーマ細胞から抽出した mRNA を錄型 として合成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであ ればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express [ストラテジー ズ （Strategies) , 5, 58 (1992) ]、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイック ·了シ ッズ ' リサーチ （Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989) ] 、 λ zap II (Stratagene 社製）、 L gtl0、 X gtll [ディーェヌエー ·クローニング：ァ 'プラ クティカノレ · アプローチ （DNA Cloning: A Practical Approach) , I, 49 (1985) ] 、 Lambda BlueMid (Clontech社製）、 L ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia 社製）、 pcD2 [モレキュラー ' アンド ' セルラー 'バイオロジー （Mol. Cell. Biol. ) , 3, 280 (1983) ] および pUC18 [ジーン （Gene) , 33> 103 (1985) ] 等が 用いられる。
ファージ或いはプラスミ ドベクターにより構築される cDNAライプラリーを導入 する大腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、 発現および維持できるものであ ればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XL1- Blue MRF， [ストラテジ ーズ （Strategies) , 5, 81 (1992) ] 、 C600 [ジェネティックス （Genetics) , 39, 440 (1954) ] 、 Y1088、 Y1090 [サイエンス （Science) , 222, 778 (1983) ] 、 NM522 [ジャーナル'ォプ ·モレキュラー 'バイオロジー （J. Mol. Biol. ) , 166, 1 (1983) ] 、 K802 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオ口ジー (J. Mol. Biol. ) , 16, 118 (1966) ] および J1105 [ジーン （Gene) , 38, 275 (1985) ] 等が 用いられる。
cDNA ライプラリーからのヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VL をコードする cDNA クローンの選択法としては、 アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用 いたコロニー ·ハイプリダイゼーション法或いはプラーク ·ハイブリダィゼーシ ヨン法 （モレキュラー 'クローユング第 2版） により選択することができる。 また、 プライマーを調製し、 mRNAから合成した cDNA或いは cDNAライプラリーを铸型と して、 Polymerase Chain Reaction (以下、 PCR法と表記する ；モレキュラー ·ク ローニング第 2版， Supplement 1-34) により VHおよび VLをコードする cDNAを 調製することもできる。
上記方法によ り選択された cDNA を、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene 社製） 等のプラスミ ドにクローニングし、 通常 用いられる塩基配列解析方法、 例えば、 サンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·オフ、、 ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. , U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] 等の反応を行い、 塩基配 列自動分析装置、 例えば、 A. L. F. DNA シークェンサ一 （Pharmacia社製） 等を 用いて解析することで該 cDNAの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列から VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定し、 既知の抗体の VHおよび VL の全アミノ酸配列 [シーケンシズ'ォプ'プロテインズ'ォブ'ィムノ ロジカノレ-インタレス 卜 (Sequences of Proteins of Immuno丄 ogicallnterest) , US Dept. Health and Human Services, 1991 (以下、 シーケンシズ 'ォプ 'プロテ インズ'ォブ'ィムノロジカル'インタレストと略記する）] と比較することにより、 取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なァミノ酸配 列をコードしているかを確認することができる。 (3) ヒト以外の動物の抗体の V領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列に関しては、 既知の抗体の VHおよび VLの全ァミノ酸配列 （シーケンシズ'ォプ'プロティンズ' ォブ'ィムノロジカル 'インタレスト） と比較することにより、 分泌シグナル配列 の長さおよび N末端アミノ酸配列を推定でき、 更にはそれらが属するサブグルー プを知ることができる。 また、 VHおよび VLの各 CDRのアミノ酸配列についても、 既知の抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列 （シーケンシズ 'ォプ 'プロティンズ 'ォ ブ.ィムノロジカル ·インタレスト） と比較することによって見出すことができる。
(4) ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項 3の （1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNA をクローユングし、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。 例えば、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを、 ヒト以外の 動物の抗体 VHおよび VLの 3'末端側の塩基配列とヒト抗体の CHおょぴ CLの 5'末 端側の塩基配列とから成り、 かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成 DNAとそれぞれ連結し、 それぞれを本項 3の （1) に記載のヒト化抗体発現用べク ターのヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で 発現するようにクローニングし、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築すること ができる。
(5) ヒト型 CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、 以下のようにして構 築することができる。 まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR を移植するヒト抗体の VHおよび VLのフレームワーク （以下、 FRと表記する） の アミノ酸配列を選択する。 ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列としては、 ヒト抗体由来のものであれば、 いかなるものでも用いることができる。 例えば、 Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒト抗体の VHおよび VL の FRのアミノ酸配列、 ヒト抗体の H鎖および L鎖の V領域の FRの各サブグルー プの共通アミノ酸配列 （シーケンシズ'ォプ'プロテインズ'ォブ'ィムノロジカル' インタレスト） 等があげられるが、 その中でも、 十分な活性を有するヒト型 CDR 移植抗体を作製するためには、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの FR のアミノ酸配列とできるだけ高い相同性 （少なくとも 60%以上） を有するァミノ 酸配列を選択することが望ましい。
次に、 選択したヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列に目的のヒト以外 の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ酸配列を移植し、 ヒト型 CDR移植抗 体の VHおよび VLのアミノ酸配列を設計する。 設計したアミノ酸配列を抗体の遺 伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度 （シーケンシズ'ォブ'プロテインズ' ォブ'ィムノロジカル 'インタレスト） を考慮して DNA配列に変換し、 ヒト型 CDR 移植抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列をコードする DNA配列を設計する。 設計 した DNA配列に基づき、 100塩基前後の長さから成る数本の合成 DNAを合成し、 それらを用いて PCR法を行う。 この場合、 PCRでの反応効率および合成可能な DNA の長さ力、ら、 H鎖、 L鎖とも 6本の合成 DNAを設計することが好ましい。
また、 両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入す ることで、 本項 3の （1) で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクロー二 ングすることができる。 PCR後、 増幅産物を pBluescript SK (-) (Stratagene社 製） 等のプラスミドにクローユングし、 本項 3の （2) に記載の方法により、 塩基 配列を決定し、 所望のヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコー ドする DNA配列を有するプラスミドを取得する。
(6) ヒト型 CDR移植抗体発現べクタ一の構築
本項 3の （1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 本項 3 の （5) で構築したヒト型 CDR移植抗体の VH および VLをコードする cDNAをクローユングし、 ヒト型 CDR移植抗体発現べクタ 一を構築することができる。 例えば、 本項 3の （5) でヒト型 CDR移植抗体の VH および VLを構築する際に用いる合成 DNAのうち、 両端に位置する合成 DNAの 5' 末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、 本項 3の （1) に記載のヒ ト 化抗体発現用ベクターのヒ ト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子の上流にそ れらが適切な形で発現するようにクローユングし、 ヒ ト型 CDR移植抗体発現べク ターを構築することができる。
(7) ヒ ト化抗体の安定的生産
本項 3 の （4) および （6) に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞 に導入することによりヒ ト型キメラ抗体おょぴヒト型 CDR移植抗体 （以下、 併せ てヒト化抗体と称す） を安定に生産する形質転換株を得ることができる。
動物細胞へのヒ ト化抗体発現ベクターの導入法としては、 エレクトロポレーシ ヨン法 [特開平 2-257891 ; サイ トテクノロジー （Cytotechnology)， 3 , 133 (1990) ] 等があげられる。
ヒ ト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、 ヒ ト化抗体を生産'させ ることができる上記 1で作製された動物細胞を用いることができる。
具体的には、 マウスミエローマ細胞である NS0細胞、 SP2/0 細胞、 チヤィニー ズハムスター卵巣細胞 CHO/dhfr-細胞、 CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0 細胞、 IR983F細胞、 シリアンハムスター腎臓由来である BHK細胞、 ヒトミエロー マ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、 好ましくは、 チャイニーズハム スター卵巣細胞である CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0細胞、 5に記載の 宿主細胞等があげられる。
ヒ ト化抗体発現ベクターの導入後、 ヒ ト化抗体を安定に生産する形質転換株は、 特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 G418 sulfate (以下、 G418 と表 記する ； SIGMA社製） 等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。 動 物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地 （日水製薬社製)、 GIT培地 （日本製薬 社製）、 EX- CELL302培地 （JRH社製）、 IMDM培地 （GIBCO BRL社製）、 Hybridoma- SFM培地 （GIBCO BRL社製）、 またはこれら培地に牛胎児血清 （以下、 FBS とも表 記する） 等の各種添加物を添カ卩した培地等を用いることができる。 得られた形質 転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒ ト化抗体を生産蓄積させること ができる。 培養上清中のヒ ト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素免疫抗体 法 （以下、 ELISA 法と表記する ；アンティポディズ， Chapter 14、 モノクローナ ル 'アンティボディズ） 等により測定できる。 また、 形質転換株は、 特開平 2 - 257891に開示されている方法に従い、 DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒ ト化抗体 の生産量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、 形質転換株の培養上清よりプロテイン A カラムを用いて精製す ることができる (アンティボディズ， Chapter 8、 モノクローナル 'アンティボデ ィズ)。 また、 その他に通常、 蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用すること ができる。 例えば、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等 を組み合わせて行い、 精製することができる。 精製したヒ ト化抗体の H鎖、 L鎖 或いは抗体分子全体の分子量は、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 [以下、 SDS - PAGE と表記する ；ネイチヤー （Nature) , 227, 680 (1970) ] やウェスタンブロッ ティング法 [アンティボディズ, Chapter 12、 モノクローナル 'アンティボディ ズ] 等で測定することができる。
B. Fc融合蛋白質の製造
(1) Fc融合蛋白質発現用ベクターの構築
Fc融合蛋白質発現用ベクターとは、 ヒト抗体 Fc領域と融合させる蛋白質と をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、 動物細胞用 発現ベクターにヒ ト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をク ローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体の Fc領域としては、 CH2と CH3領域を含む領域のほか、 ヒンジ領域、 CH1 の一部が含まれるものも包含される。 また CH2または CH3の少なくとも 1つ のアミノ酸が欠失、 置換、 付加または揷入され、 実質的に Fc Y受容体への結合活 性を有するものであればいかなるものでもよい。
ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはェキソン とイントロンから成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いること もできる。 それら遺伝子と Fc領域を連結する方法としては、 各遺伝子配列を铸型 として、 PCR法 （レキユラ一'クローユング第 2版；カレント 'プロトコールズ 'ィ ン 'モレキユラ1 ~.バイオロジー， Supplement 1-34) を行うことがあげられる。 動物細胞用発現ベクターとしては、 ヒ ト抗体の C領域をコードする遺伝子を組 込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE107 [サイトテクノロジー (Cytotechnology) , 3, 133 (1990)]、 pAGE103 [ジ ヤーナル .ォプ .バイオケミストリー （j. Biochem. ), 101, 1307 (1987)]、 PHSG274 [ジーン （Gene), 27, 223 (1984)]、 pKCR [プロシーディングス 'ォブ' ザ 'ナショナル 'アカデミー 'ォブ 'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 78, 1527 (1981)] 、 SGl β d2-4 [サイ ト テ ク ノ ロ ジー (Cytotechnology), 4, 173 (1990)] 等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに 用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモーターとェンハ ンサー [ジャーナノレ 'ォブ 'ノ ィオケミ ス ト リ ー （J. Biochem.), 101, 1307 (1987)]、 モロニ一マウス白血病ウィルスの LTR レィォケミカル'アンド 'パイ オフイジ力ノレ ' リサーチ · コミュニケーションズ (Biochem. Biophys. Res. Coraraun. ), 149, 960 (1987)], 免疫グロブリン H鎖のプロモーター [セル （Cell), 41, 479 (1985)] とェンハンサー [セル （Cell), 33. 717 (1983)] 等があげられ る。
(2) ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAの取得
ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAは以下のようにして 取得することができる。
目的の Fc と融合させる蛋白質を発現している細胞や組織より mR Aを抽出し、 cDNA を合成する。 合成した cDNA をファージ或いはプラスミド等のベクターにク ローニングして cDNAライプラリーを作製する。 該ライプラリーより、 目的の蛋白 質の遺伝子配列部分をプロープとして用い、 目的の蛋白質をコードする cDNAを有 する組換えファージ或いは組換えプラスミ ドを単離する。 組換えファージ或いは 組換えプラスミ ド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、 塩基配列より全アミ ノ酸配列を推定する。
ヒ ト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 細胞や組 織を摘出することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。
細胞や組織から全 RNAを調製する方法としては、 チォシアン酸グァニジン-トリ フルォロ酢酸セシゥム法 [メ ソッズ'イン'ェンザィモロジ一（Methods in Enzymol. ) , 154, 3 (1987) ] 、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 ォ リゴ (dT)固定ィ匕セルロースカラム法 （モレキュラー 'クローユング第 2版） 等があ げられる。 また、 細胞や組織から mRNA を調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製） 等があげられる。
cDNAの合成及ぴ cDNAライブラリ一作製法としては、 常法 （モレキユラ一'クロ 一ユング第 2版；力レント 'プロトコールズ 'ィン 'モレキユラ' ~ ·バイオロジー， Supplement 1-34)、 或いは市販のキッ ト、 例えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製） や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製） を用いる方法などがあげられる。
cDNA ライブラリーの作製の際、 細胞や組織から抽出した fflR A を鎵型として合 成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであればいか なるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express [ス トラテジーズ (Strategies) , 5, 58 (1992) ] 、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイック ·ァシッ ズ · リ サーチ （Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989) ] 、 λ zapll (Stratagene社製）、 gtlO、 gtll [ディーェヌエー ·クローニング：ァ ·プラ クティカノレ ·アプローチ (DNA Cloning: A Practical Approach) , I, 49 (1985) ]、 Lambda BlueMid (Clontech社製）、 ； L ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia社製）、 cD2 [モレキュラー 'アンド 'セルラー 'バイオロジー（Mol, Cell. Biol. ) , 3, 280 (1983) ] 及び pUC18 [ジーン（Gene) , 33, 103 (1985) ] 等が用いられる。
ファージ或いはプラスミ ドベクターにより構築される cDNAライプラリーを導入 する大腸菌としては該 cDNAライブラリ一を導入、 発現及び維持できるものであれ ばいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XL1- Blue MRF' [ストラテジー ズ （Strategies) , 5, 81 (1992) ] 、 C600 [ジェネティックス （Genetics) , 39, 440 (1954) ] 、 Y1088、 Y1090 [サイエンス （Science) , 222, 778 (1983) ] 、 應 522 [ジャーナル'ォブ'モレキュラー，バイオロジー （J. Mol. Biol. ) , 166, 1 (1983) ] 、 K802 [ジャーナル'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー （J. Mol. Biol. ) , 16, 118 (1966) ] 及び JM105 [ジーン （Gene) , 38, 275 (1985) ] 等が用 いられる。
cDNA ライブラリーからの目的の蛋白質をコードする cDNA クローンの選択法と しては、 ァイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー 'ハイブリ ダイゼーシヨン法或いはプラーク ·ハイブリダイゼーション法 (モレキユラ' ク ローニング第 2版） により選択することができる。 また、 プライマーを調製し、 mRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを錶型として、 PCR法により目 的の蛋白質をコードする cDNAを調製することもできる。
目的の蛋白質をヒト抗体の Fc領域と融合させる方法としては、 PCR法があげら れる。 例えば、 目的の蛋白質の遺伝子配列の 5， 側と 3' 側に任意の合成オリゴ DNA (プライマー）を設定し、 PCR法を行い PCR産物を取得する。 同様に、 融合させ るヒト抗体の Fc領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、 PCR産 物を得る。 このとき、 虫合させる蛋白質の PCR産物の 3' 側と Fc領域の PCR産物 の 5' 側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライ マーを設定する。 この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、 その 変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。 得られた 2 種類の
PCR断片を用いてさらに PCR を行うことで、 両遺伝子を連結する。 もしくは、 同 一の制限酵素処理をした後にライゲーシヨンすることでも連結することができる。 上記方法により連結された遺伝子'配列を、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製） 等のプラスミドにクローニングし、 通常 用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー （Sanger) らのジデォキシ法 [プ 口シーディングス 'ォブ ·ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ'サイエンス （Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 74. 5463 (1977) ] あるいは ABI PRISM 377DNA シー クェンサー （PE Biosystems社製） 等の塩基配列分析装置を用いて分析すること により、 該 DNAの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列から Fc融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、 目的のァミノ 酸配列と比較することにより、 取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む Fc融合 蛋白質の完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
(3) Fc融合蛋白質の安定的生産
前記の （1) 項に記載の Fc融合蛋白質発現ベクターを適当な動物細胞に導入す ることにより Fc融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。 動物細胞への Fc融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、 エレクト口ポレー シヨン法 [特開平 2-257891 ; サイ トテクノロジー （Cytotechnology)， 3, 133 (1990) ] 等があげられる。
Fc融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、 Fc融合蛋白質を生産 させることができる動物細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。 具体的には、 マウスミエローマ細胞である NS0細胞、 SP2/0細胞、 チヤィユー ズハムスター卵巣細胞 CHO/dhfr-細胞、 CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0 細胞、 IR983F細胞、 シリアンハムスター腎臓由来である BHK細胞、 ヒトミエロー マ細胞であるナマルパ細胞などがあげられるが、 好ましくは、 チャイニーズハム スタ一卵巣細胞である CH0/DG44細胞、 ラットミエロ一マ YB2/0細胞、 前記 1項に 記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。
Fc融合蛋白質発現ベクターの導入後、 Fc融合蛋白質を安定に生産する形質転換 株は、 特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 G418等の薬剤を含む動物 細胞培養用培地により選択できる。 動物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地 (日水製薬社製)、 GIT培地 （日本製薬社製)、 EX-CELL302培地 （JRH社製)、 IMDM 培地 （GIBCO BRL社製）、 Hybridoma- SFM培地 （GIBCO BRL社製）、 またはこれら培 地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。 得られ た形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に Fc融合蛋白質を生産蓄積さ せることができる。 培養上清中の Fc 融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性は ELISA法等により測定できる。 また、 形質転換株は、 特開平 2-257891に開示され ている方法に従い、 dhfr遺伝子増幅系等を利用して Fc融合蛋白質の生産量を上 昇させることができる。
Fc融合蛋白質は、 形質転換株の培養上清よりプロティン Aカラムやプロティン Gカラムを用いて精製することができる （アンチボディズ， Chapter 8、 モノクロ ーナル 'アンティボディズ)。 また、 その他に通常、 タンパク質の精製で用いられ る精製方法を使用することができる。 例えば、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグ ラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、 精製することができる。 精製した Fc融合蛋白質分子全体の分子量は、 SDS- PAGE [ネイチヤー （Nature) , 227, 680 (1970) ] やウェスタンブロッティング法 (アンチボディズ， Chapter 12、 モノク ローナル'アンティポディズ） 等で測定することができる。 以上、 動物細胞を宿主とした抗体組成物の製造方法を示したが、 上述したよう に、 酵母、 昆虫細胞、 植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても動物 細胞と同様の方法により抗体組成物を製造することができる。
すでに宿主細胞が抗体分子を発現する能力を有する場合には、 前記 1· に記載 した方法を用いて抗体組成物を発現させる細胞を調製した後に、 該細胞を培養し、 該培養物から目的とする抗体組成物を精製することにより、 本発明の治療剤に有 効成分として含有される抗体組成物を製造することができる。
4. 抗体組成物の活性評価
精製した抗体組成物の蛋白量、 抗原との結合活性あるいはエフヱクタ一機能は を測定する方法としては、 モノクローナルアンチボディズ、 あるいはアンチボデ ィエンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。
その具体的な例としては、 抗体組成物がヒト化抗体の場合、 抗原との結合活性、 抗原陽性培養細胞株に対する結合活性は ELISA法および蛍光抗体法 [キャンサー' ィ ムノ ロジー 'ィムノセラ ピー (Cancer Immunol. Iramunother. ) , 36, 373 (1993) ] 等により測定できる。 抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、 CDC 活性、 ADCC活性等を測定することにより、 評価することができる [キャンサー' ィムノ ロジ一-ィムノセラ ピー (Cancer Immunol. Iramunother. ) , 36, 373 (1993) ]。
疾患に関与する細胞上の抗原数は、 Scatchard解析法 [ィムノロジカル ·メソ ッズ (Immunological Methods Vol. 2， ニューヨーク · ァカテミック · プレス 出版 （1981) ] 、 あるいは定量的フローサイトメ トリー法 [コミユエケーシヨン ズ ' イ ン · ク リ ニカノレ * サイ ト メ ト リ ー (Communications in Clinical Cytometry) , 26, 22 (1996) ] によって定量することができる。
異なる薬剤の治療効果の比較は、 マウス、 ラット、 ハムスター、 モルモット、 ゥサギ、 ィヌ、 ブタ、 サル等の実験動物を用いた疾患モデルを用いた in vivo 実 験より行うことができる。 また疾患に関与する細胞あるいはその株化細胞を標的 とした vitroの細胞障害活性の測定によっても行うことができる。
in vivo実験は疾患に関与する細胞あるいはその株化細胞等の標的細胞を実験 動物の体内に移植し、 薬剤を腹腔内、 静脈内、 皮下等に投与し、 実験動物の病態 を観察することにより行うことができる。 例えば、 腫瘍の増殖や実験動物の生存 日数、 薬剤の血中成分濃度や臓器重量等を測定することにより、 薬剤の治療効果 · を調べることができる。
in vitroの細胞障害活性は、 ADCC活性や CDC活性等を測定することにより得る ことができる。
5. 各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖の分析
各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、 通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解 析に準じて行うことができる。 例えば、 IgG分子に結合している糖鎖はガラタト ース、 マンノース、 フコースなどの中性糖、 N-ァセチルダルコサミンなどのアミ ノ糖、 シアル酸などの酸性糠から構成されており、 糖組成分析および二次元糖鎖 マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。 (1) 中性糖 ·ァミノ糖組成分析
抗体分子の糖鎖の組成分析は、 トリフルォロ酢酸等で、 糠鎖の酸加水分解を行 うことにより、 中性糖またはアミノ糖を遊離し、 その組成比を分析することがで きる。
具体的な方法として、 Dionex社製糖組成分析装置 （BioLC) を用いる方法があ け ら れ る 。 BioLC は HPAEC-PAD (high performance anion-excnange chromatography- pulsed amp erome trie detection) 法 [ンヤーナル ·ォプ · リキ ッド .クロマトグラフィー （J. Liq. Chromatogr. ) , 6, 1577 (1983) ] によって 糖組成を分析する装置である。
また、 2-ァミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができ る。 具体的には、 公知の方法 [ァグリカルチュラル 'アンド 'バイオロジカル' ケミストリー （Agruc. Biol. Chem. )， 55 (1)， 283-284 (1991) ] に従って酸加水分 解した試料を 2-ァミノピリジル化で蛍光ラベル化し、 HPLC分析して組成比を算出 することができる。
(2) 糖鎖構造解析
抗体分子の糖鎖の構造解析は、 2次元糖鎖マップ法 [アナリティカル'バイオ ケミストリー （Anal. Biochem. ) , 171, 73 (1988)、 生物化学実験法 23-糠タンパ ク質糖鎖研究法'（学会出版センター)， 高橋禮子編 （1989年) ] により行うことが できる。 2次元糖鎖マップ法は、 例えば、 X軸には逆相クロマトグラフィ一糖鎖の 保持時間または溶出位置を、 Y軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持 時間または溶出位置を、 それぞれプロットし、 既知糖鎖のそれらの結果と比較す ることにより、 糖鎖構造を推定する方法である。
具体的には、 抗体をヒドラジン分解して、 抗体から糖鎖を遊離し、 2 -アミノビ リジン （以下、 PA と略記する） による糖鎖の蛍光標識 [ジャーナル ·ォブ ·バイ オケミストリー （J. Biochem. ) , 95, 197 (1984) ] を行った後、 ゲルろ過により 糖鎖を過剰の PAィ匕試薬などと分離し、 逆相クロマトグラフィーを行う。 次いで、 分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。 これらの結果 をもとに、 2次元糖鎖マップ上にプロットし、 糖鎖スタンダード （TaKaRa社製）、 文献 [アナリティカル ' バイオケミス トリー （Anal. Biochem. ) , 171, 73 (1988) ] とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
さらに各糖鎖の MALDI- T0F - MSなどの質量分析を行い、 2次元糖鎖マップ法によ り推定される構造を確認することができる。
6. 抗体分子の糖鎖構造を識別する免疫学的定量方法
抗体組成物は、 抗体の Fc領域に結合する糖鎖構造が異なった抗体分子から構成 されている。 本発明の治療剤に有効成分として含有される抗体組成物は、 Fc領域 に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 還元末端の N-ァセチルダルコ サミンの 6位にフコースの 1位が a結合していない糖鎖の割合が 20%以上であり、 高い ADCC活性を示す特徴を有している。 このような抗体組成物は、 上記 5. に記 載の抗体分子の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。 また、 レクチ ンを用いた免疫学的定量方法を用いることによつても識別できる。
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いた抗体分子の糖鎖構造の識別は、 文 献 [モノク口ーナル ·アンティボディズ：プリンシプルズ 'アンド ·アプリケー シヨンズ (Monoclonal Antibodies : Principles and Applications) , Wiley - Liss, Inc. (1995)； 酵素免疫測定法， 第 3版， 医学書院 （1987) ； S女訂版， 酵素抗体法， 学際企画 （1985) ] 等に記載のウェスタン染色、 RIA (Radioimmunoassay) Λ VIA (Viroimmunoassay)、 EIA (Enzymoimmunoassay 、 FIA (i1丄 uoroimmunoassay)、 MIA (Metalloiramunoassay) などの免疫学的定量方法に準じて、 例えば、 以下のように 行うことができる。
抗体組成物を構成する抗体分子の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、 標識 したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。 次に、 標識したレクチンと 抗体分子の複合体の量を測定する。
抗体分子の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、 例えば、 WGA (T. vulgaris 由来の wheat-germ agglutinin) 、 ConA (C. ensiformis 由来の concanavalin A)、 RIC (R. communis 由来の毒素)、 L-PHA (P. vulgaris 由来の leukoagglutinin)、 LCA (L. culinaris 由来の lentil agglutinin)、 PSA (P. sativum由来の Pea lectin)、 AAL (Aleuria aurantia Lectin) ACL (Amaranthus caudatus Lectin)、 BPL (Bauhinia purpurea Lectin)、 DSL (Datura stramonium Lectin)、 DBA (Dolichos biflorus Agglutinin)、 EBL (Elderberry Balk Lectin)、 ECL (Erythrina cristagalli Lectin)、 EEL (Euonymus europaeus Lectin)、 GNL (Galanthus nivalis Lectin)、 GSL (Griffonia simplicifolia Lectin)、 HPA (Helix pomatia Agglutinin; N HHL (Hippeastrum Hybrid Lectin)、 Jacalin^ LTL (Lotus tetragonolobus Lectin)、 LEL (Lycopersicon esculentum Lectin)、 MAL (Maackia amurensis Lectinノ、 MPL (Maclura pomifera Lectin) s NPL (Narcissus pseudonarcissus Lectin) 、 PNA (Peanut Agglutinin) 、 E-PHA (Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin)、 PTL (Psophocarpus tetragonolobus Lectin)、 RCA (Ricinus communis Agglutinin)、 STL (Solanura tuberosum Lectin)、 SJA (Sophora japonica Agglutinin) 、 SBA (Soybean Agglutinin) 、 UEA (Ulex europaeus Agglutinin) 、 VVL (Vicia villosa Lectin) 、 WFA (Wisteria floribunda Agglutinin)力 Sあげられる。
本発明で用いられる抗体組成物を識別するには、 N -ダルコシド結合複合型糖鎖 還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合している糖鎖構造を特異的 に認識するレクチンを用いることが好ましく、 その具体的な例としては、 レンズ マメレクチン LCA (Lens Culinaris 由来の Lentil Agglutinin) エンドゥマメレ クチン PSA (Pi sum sativum 由来の Pea Lectin)、 ソラマメレクチン VFA (Vicia faba 由来の Agglutinin) , ヒィロチャワンタケレクチン AAL (Aleuria aurantia 由来の Lectin) をあげることができる。
7. レクチン耐性細胞で製造された抗体医薬が有効な患者をスクリーニングする方 法
本発明の医薬が有効な患者をスクリーニングする方法としては、 疾患に関与す る標的細胞を患者の体内より採取し、 本発明の医薬あるいは従来の抗体医薬と 接触させ、 該標的細胞と反応した本発明の医薬あるいは従来の抗体医薬の活性 を測定し、 従来の抗体医薬が示した活性と本発明の医薬が示した活性とを比較 することにより、 本発明の医薬が有効である患者を選抜する方法のことである。 具体的には （i) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミ ンの 6位とフコースの 1位が 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を 有さなレ、細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬あるい は本発明の医薬と患者から取得したこれら医薬の標的細胞とを接触させ、 （ii) 該標的細胞と反応した医薬の活性を測定し、 （iii) N-グリコシド結合複合型糖 鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖 鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物を 有効成分として含有する医薬が示した活性と本発明の医薬が示した活性との測 定値を比較し、 （iv) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコ サミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐 性を有さない細胞から生産された抗体組成物を含有する医薬が示した活性が低 い患者を選択することにより、 本発明の医薬が有効な患者をスクリ一二ングす る方法があげられる。 標的細胞を患者の体内より採取する方法としては、 外科 切除や体液からの採取があげられる。
本発明の医薬あるいは従来の抗体医薬の活性を測定する方法としては、 ADCC活 性、 Fe y受容体 Ilia結合活性、 CDC活性や増殖抑制活性を測定する方法等があげ られる。
ADCC活性を測定する方法としては、 未標識あるいは放射性同位体、 蛍光物質や 色素等で標識した標的細胞と抗体、 エフェクター細胞を同時に接触させ、 障害さ れた標的細胞から遊離する酵素の生理活性や標識物質の活性を測定すること等が あげられる。
Fc y受容体 Ilia結合活性を測定する方法としては、 リコンビナント Fe y受容 体 Ilia蛋白質、 あるいはウィルス、 細菌や細胞表面に発現させた Fe y受容体 Ilia と標的細胞に反応した抗体との結合量を測定すること等があげられる。 測定 する方法としては免疫組織染色法、 ェンザィムィムノアッセィ法やラジオィムノ 、 フローサイトメーターを用いた蛍光抗体法、 'ロッテイング法、 凝集反応、 補体結合反応、 溶血反応、 沈降反応、 金コ ロイド法、 クロマトグラフィー法などのいかなる免疫学的測定法も含む。
また、 FC T /受容体 Iliaに酵素、 蛍光物質、 色素、 タグぺプチド、 放射性同位元 素などの標識を付加することにより、 より検出を容易にすることができる。
CDC活性を測定する方法としては、 未標識あるいは放射性同位体、 蛍光物質や 色素等で標識した標的細胞と抗体、 補体成分を含む血清等を同時に接触させ、 障 害された標的細胞から遊離する酵素の生理活性や標識物質の活性を測定すること 等があげられる。
増殖抑制活性を測定する方法としては、 細胞内酵素の生理活性の測定、 ヨウ化 プロビジゥムによる染色、 細胞膜透過性の変化を利用した検出、 TUNEL法、 ァネ キシン V の検出、 DNA の断片化の検出、 ミトコンドリア膜電位変化の検出、 細胞 内 ATPおよび ADPレベルの検出等があげられる。
8. レクチン耐性細胞で製造された抗体医薬を用いて患者を治療する方法
本発明の医薬を用いて患者を治療する方法としては、 上記 7 に示した方法によ り本発明の医薬が有効である患者を選抜した後、 以下に示す治療薬を選抜された 患者に投与する方法等があげられる。
治療薬として該医薬を単独で投与することも可能であるが、 通常は該医薬を薬 理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術 分野において知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望 ましい。
投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投 与、 または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与 をあげることができ、 抗体製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることがで さる。
投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。 経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等があげられる。
乳剤おょぴシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果 糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のダリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油等の油類、 P -ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防 腐剤、 ス トロベリーフレーパー、 ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤とし て用いて製造できる。
カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マン-トー ル等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリゥム等の崩壌剤、 ステアリン酸マグ ネシゥム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒ ドロキシプロピルセル ロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の 可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。
注射剤は、 塩溶液、 プドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用 いて調製される。 または、 抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、 これに塩化ナ トリゥムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。 また、 噴霧剤は該抗体組成物そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜 を刺激せず、 かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる 担体等を用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該抗体組成物および 用いる担体の性質により、 エア口ゾル、 ドライノくゥダ一等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加す ることもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により異なるが、 有効成分の量として、 通常成人 1 日当たり 10 u g/kg〜 20mg/kgである。 以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、 実施例は本発明の単な る例示を示すものにすぎず、 本発明の範囲を限定するものではない 図面の簡単な説明
第 1図は、 ヒト IgGl分子の模式図を示す。
第 2図は、 フローサイトメ一ターにより解析した CCR4の発現量の異なるトラン スフエタタント細胞おょぴ親株の EL - 4細胞の CCR4発現のヒストグラムの図であ る。 横軸は蛍光強度、 縦軸は細胞数をそれぞれ示す。 白抜きは抗体非添加、 灰色 はピオチン化 KM2760- 1添加時のヒストグラムを示す。
第 3 図は、 CCR4 の発現量の異なる細胞株を標的細胞に用いた KM2760- 1 と KM3060の ADCC活性の図である。 縦軸は細胞障害活性（％：)、 横軸は標的細胞上の CCR4分子数をそれぞれ示す。 〇は KM2760- 1、 參は KM3060、 厶は抗体非添加時の 細胞障害活性をそれぞれ示す。
第 4図は、 各抗 CCR4キメラ抗体の糖鎖分析の結果を示す。 第 4A図は KM2760 - 1 の、 第 4B図は KM3060の結果をそれぞれ示す。
第 5図は、 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結 合していない糖鎖の割合の異なる抗 CCR4キメラ抗体の糖鎖分析の結果を示す。 第 6図は、 還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ結 合していない糖鎖の割合の異なる抗 CCR4キメラ抗体の抗原結合活性を ELISA法で 測定した図である。 縦軸は CCR4ペプチド結合活性、 横軸は抗体濃度をそれぞれ示 す。 拳は抗 CCR4 キメラ抗体 （8%)、 〇は抗 CCR4 キメラ抗体 （27%)、 ▲は抗 CCR4キメラ抗体 （39%)、 △は抗 CCR4キメラ抗体 （46%) の結合活性をそれぞれ 示す。
第 7図は、 CCR4の発現量の異なる細胞株を標的細胞に用いた、 α ΐ, 6-フコース を持たない糖鎖の割合の異なる抗 CCR4キメラ抗体の ADCC活性の図である。 縦軸 は細胞障害活性 (％)、 横軸は標的細胞上の CCR4分子数をそれぞれ示す。 パネル A、 B、 C はそれぞれ健常人ドナー A、 B、 C の静脈血より採取した単核球をェフエクタ 一細胞として用いた ADCC活性を示す。 秦は抗 CCR4 キメラ抗体 （8%)、 〇は抗 CCR キメラ抗体 （27%)、 ▲は抗 CCR4キメラ抗体 （39%)、 △は抗 CCR4キメラ抗 体 （46%) の結合活性をそれぞれ示す。
第 8図は、 レクチン耐性株が生産した抗 CCR4キメラ抗体の ADCC活性を評価し た結果を示した図である。 縦軸に細胞障害活性、 横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。 口は 5-03株、 画は CH0/CCR4- LCA株、 ♦は CH0/CCR4- AAL株、 ▲は CH0/CCR4- PHA 株が生産した抗体の活性をそれぞれ示す
第 9図は、 レクチン耐性株が生産した抗 CCR4キメラ抗体の ADCC活性を評価し た結果を示したものである。 縦軸に細胞障害活性、 横軸に抗体濃度をそれぞれ示 す。 口は YB2/0株 （KM2760#58- 35-16)、 △は 5-03株、 秦は CH0/CCR4- LCA株が生 産した抗体の活性をそれぞれ示す。
第 10図は、 プラスミド PKANTEXCD20の構築過程を示した図である。 hCkはヒト κ鎖 C領域遺伝子、 hC y lはヒト IgGIC領域遺伝子、 Pmoはモロ-一マウス白血病 ウイノレスプロモーターを表す。
第 11図は、 フローサイトメ一ターにより解析した CD20の発現量の異なるトラ ンスフヱクタント細胞および親株の EL- 4細胞の CD20発現のヒストグラムの図で ある。 横軸は蛍光強度、 縦軸は細胞数をそれぞれ示す。 白拔きはマウス IgG2a、 灰色は抗 CD20抗体添加時のヒストグラムを示す。
第 12図は、 CD20の発現量の異なる細胞株を標的細胞に用いた各種抗 CD20キメ ラ抗体の ADCC活性の図である。 縦軸に細胞障害活性、 横軸に細胞あたりの CD20 分子数をそれぞれ示す。 口は Rituxan™、 秦は抗 CD20 キメラ抗体 (44%)、 〇は
KM3065, △は抗体非添加時の細胞障害活性をそれぞれ示す。
第 13図は、 プラスミド pBS-2B8Lの構築過程を示した図である。
第 14図は、 プラスミド pBS- 2B8Hmの構築過程を示した図である。
第 15図は、 プラスミド pKANTEX2B8Pの構築過程を示した図である。
第 16図は、 蛍光抗体法を用いて、 α 1, 6-フコースを持たない糖鎖が結合した抗 体分子の割合が異なる 3種類の抗 CD20キメラ抗体の CD20発現細胞に対する結合 活性を抗体濃度を変化させて測定した図である。 縦軸は CD20との結合活性、 横軸 は抗体濃度をそれぞれ示す。 口が KM3065、 騸が抗 CD20キメラ抗体 （44%)、 〇が Rituxan™の活†生をそれぞれ示す。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1. 抗 CCR4キメラ抗体組成物の ADCC活性による抗原発現量依存的な標的 細胞障害活性
1. CCR4の発現量の異なるトランスフエクタント細胞の作製
(1) CCR4の発現量の異なるクローンの選択
CCR4遺伝子の動物細胞安定発現ベクター CAG-CCR4/pcDNA3 (W001/64754) をェ レク ト口ポレーション法でマウス胸腺腫細胞株 EL- 4細胞 (ATCC TIB- 39)に導入し た。 まず EL-4細胞を PBS (-) (GIBCO BRL社製） にて 1 X 107個/ 500 μ Lに懸濁し、 CAG-CCR4/pcDNA3を 10 /z g加えて水中で 10分間放置した後、 専用キュべット（パ ィォラッド社製）に入れ、 260V、 500 μ FD で遺伝子導入を行った。 さらに 10分間 氷中にて放置した後、 10 % ゥシ胎児血清 （L e Technologie 社製） を含む RPMI1640培地 （Life Technologie社製） （以下、 RPMI1640- FBS (10) と略記する） 200mL に懸濁し、 96 ゥヱル細胞培養用プレートに 100 μ L/ゥエルづっ分注した。 2 時間後に培養上清を 100 ^ L/ゥヱル除去し、 lmg/mL の G418 を含む 10%FCS - RPMI培地を 100 μ ΐ7ゥヱルづっ分注し、 最終濃度 0. 5mg/mLとした。 2週間後、 数 十株のシングルクローンを選択して拡大培養した。
(2) CCR4の発現量の異なる細胞株の選択
参考例 1で調製した抗 CCR4キメラ抗体 KM2760- 1を用い、 FACSによる染色性の 有無で CCR4 の発現量の異なる細胞株を選択した。 本項 （1) で選択した数十株の 遺伝子導入細胞各 ΙχΙΟ6個を 96 ゥエル U字プレートに分注した。 公知の方法 (酵 素抗体法：学際企画刊 1985年）でビォチン標識した KM2760-1 を FACS用緩衝液 (1%BSA - PBS、 0. 02%EDTA、 0. 05%NaN3、 pH7. 4) で 3 ;U g/mL に、 また非特異的な 染色を防ぐために、 正常マウス血清 （CEDEKLANE社製） を 5%にそれぞれ希釈した 溶液を 100 μ !7ゥヱルとして加え、 氷中で 60分間反応させた。 陰性対象としてビ ォチン化 KM2760- 1を添カ卩しないゥエルも設定した。 緩衝液にて 200 μ ΐ ゥエルで 2回洗浄後、 FACS用緩衝液で 200倍に希釈した Streptavidin- RED670 (GIBCO BRL 社製） を.100 i L/ゥエルで加えた。 遮光し水中で 60分間反応後、 200 /z L/ゥエル で 3 回洗浄し、 最終的に 500 x L の PBS (-)に懸濁して、 フローサイトメーター EPICS Elite (COULTER社製） で蛍光強度を測定した。 様々な蛍光強度の株を合計 8 種類選択し、 発現量の低い順に KC1058、 KC1057、 KC1068、 KC1067、 KC1065、 KC1063、 KC1055、 KC1062 と名づけた。 各細胞株および親株の EL- 4細胞の蛍光強 度のヒストグラムを第 2図に示す。
(3) CCR4の発現量の異なる細胞株に発現する CCR4分子数の定量
本項（1)で得られた各細胞株に発現している CCR4分子の数を、 フローサイトメ 一ターを用いて定量した。 各細胞株 lxlO6個を、 W001/64754記載の抗 CCR4マウス モノクローナル抗体 KM2160 を 60 μ β/ιΛ、 およぴ非特異的染色を防ぐためにヒト IgG (ゥエルフアイドネ土製） を 3. 75mg/mLで加えた FACS用緩衝液 100 μ Lに懸濁し、 96 ゥエル U字プレートに分注し、 氷中で 60分間反応させた。 陰性対象としては KM2160 の代わりに抗ヒト VEGF受容体 Flt-Ι マウスモノクローナル抗体 KM1732 (W098/22616；ハイプリ ドーマ FERM BP- 5698 により生産されたモノクローナル抗 体） を添加した。 緩衝液にて 200 μ !7ゥエルで 2回洗浄後、 FACS用緩衝液で 4倍 に希釈した FITC標識抗マウス IgG (DAK0社製） を 100 /z L/ゥエルで加えた。 遮光 し氷中で 60分間反応後、 200 // L/ゥヱルで 3回洗浄し、 最終的に 500 しの PBS (- ) に懸濁して、 フローサイトメーター EPICS Elite (COULTER社製） で蛍光強度を 測定した。 また CCR4分子数の定量用の標準試料として、 既知数のマウス IgGがコ ートされた標準ビーズ （MK0 QIFIKIT, DAK0社製） を用い、 FITC標識抗マウス IgG を上記と同様の条件で反応させ、 洗浄後フローサイトメ一ターで蛍光強度を 測定した。 標準ビーズの添付説明書に従い蛍光強度とビーズに吸着したマウス IgG分子数の相関式を算出し、 KM2160 を反応させた各細胞株の蛍光強度を代入す ることにより各細胞株の CCR4 数を算出した。 またバックグラウンドとして KM1732を反応させた場合の CCR4数も算出し、 KM2160を反応させた場合の CCR4数 より差し引いて最終的に各細胞株に発現している CCR4数とした。 結果を第 1表 記す。 第 1表
細胞名 CCR4数
EL-4細胞 6.57X102 KC1058 1.28X103 KC1057 1.63X103 KC1068 2.61X103 KC1067 4.65X103 KC1065 5.80X103 KC1063 1.53X104 KC1055 1.71X104 KC1062 5.42 X 104
単位：個 Z細胞
2. CCR4の発現量の異なる細胞株を標的細胞に用いた ADCC活性の測定
KM2760-1 と KM3060の ADCC活性と抗原数との関係を、 実施例 1. (2) で得られ た CCR4の発現量の異なる細胞株を標的細胞に用いて以下のようにして測定した。
(1) 標的細胞溶液の調製
RPMI1640- FBS(IO) 培地に 500μ g/mlの濃度で G418硫酸塩 (ナカライテスク製) を添カ卩した培地で培養した CCR4 の発現量の異なる細胞株の IX 106細胞を調製し、 放射性物質である Na2 51Cr04を 3.7MBq当量加えて 37°Cで 60分間反応させ、 細胞を 放射泉標識した。 反応後、 RPMI1640- FBS(IO) 培地で懸濁おょぴ遠心分離操作によ り 3回洗浄し、 培地に再懸濁し、 4°Cで 30分間氷中に放置して放射性物質を自然 解離させた。 遠心分離後、 RPMI1640- FBS(IO) 培地を 5ml加え、 2X105細胞/ mlに 調製し、 標的細胞溶液とした。 (2) エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血 50mlを採取し、へパリンナトリウム （武田薬品社製） 0. 5mlを加 え穏やかに混ぜた。 これを Lymphoprep (Nycomed Pharma AS社製） を用いて使用 説明書に従い、 遠心分離して単核球層を分離した。 RPMI1640_FBS (10) 培地で 3回 遠心分離して洗浄後、 培地を用いて 2. 5 X 106細胞/ ml の濃度で再懸濁し、 ェフエ クタ一細胞溶液とした。
(3) ADCC活性の測定
96 ゥヱル U字底プレート （Falcon社製） の各ゥヱルに上記 1) で調製した標的 細胞溶液の 50 μ ΐ (1 X 104細胞/ゥエル） を分注した。 次いで (2) で調製したェ フエクタ一細胞溶液を 100 μ ΐ (2 X 105細胞/ゥエル、 エフェクター細胞と標的細 胞の比は 25 : 1 となる） 添加した。 更に、 参考例 1で得られた抗 CCR4キメラ抗体、 KM2760-1および ΚΜ3060を最終濃度 3 g/ml となるように加え、 37°Cで 4時間反 応させた。 反応後、 プレートを遠心分離し、 上清の51 Cr量を -カウンタ一にて測 定した。 自然解離 51 Cr量は、 エフヱクタ一細胞溶液、 抗体溶液の代わりに培地の みを用いて上記と同様の操作を行い、 上清の 51Cr量を測定することにより求めた。 全解離 51Cr量は、 抗体溶液の代わりに培地のみを、 エフェクター細胞溶液の代わ りに 1規定塩酸を添カ卩し、 上記と同様の操作を行い、 上清の 51Cr量を測定するこ とにより求めた。 ADCC活性は下式 （1) により求めた。 検体上清中の 51Cr量一自然解離 51Cr量
ADCC活性 （％) = X 100 (1)
全解離 51Cr量一自然解離 51Cr量 結果を第 3図に示す。 KM2760- 1および KM3060は、 ともに抗原数依存的な ADCC 活性を示したが、 KM2760- 1の ADCC活性は KM3060の ADCC活性を大幅に上回った。 KM2760-1 のプロッ トはデータ解析ソフ トウエア KaleidaGraph™ (SYNERGY SOFTWARE社製） を用いた結果、 下式 （2) で近似された。 y = (-60. 83/ (1+ (x/9996) 2' 22) ) +63. 23 (2) 式 （2) において、 xは CCR4数、 yは細胞障害活性を表す。
KM3060は最も CCR4発現数の高い KC1062 (CCR 数： 54200個/細胞） に対して 7. 4%の細胞障害活性を示した。 この値を数 y に代入し、 KM2760- 1 が同等の細胞 障害活"生を示すのに必要な CCR4数を算出すると 3360個/細胞である。 すなわち、 KM2760-1は KM3060の約 16分の 1の CCR4数で同等の ADCC活性を示すことが明ら かとなつた。 また細胞あたりの CCR4数が高い条件でも KM3060の細胞障害活性は 2760-1 の細胞障害活性に到達せず、 低い活性値で飽和してしまうことも明らか になった。
3. 抗 CCR4キメラ抗体の糖鎖分析
参考例 1 で調製した、 YB2/0細胞由来の抗 CCR4 キメラ抗体 KM2760-1 と、 CH0/DG44細胞由来の抗 CCR4キメラ抗体 KM3060の糖鎖分析を、 以下の方法に従つ て行った。
lOO^u gの抗体をヒドラクラブ S- 204用試験管に入れ、 遠心濃縮機にて乾固した。 サンプルを乾固させた試験管をホーネン社製ヒドラクラブにてヒドラジン分解を 行った。 ヒドラジンはホーネン社製ヒドラジン分解試薬を用い、 110°C、 1 時間反 応させた [メソッド 'ォブ ·ェンザィモロジ一 （Method of Enzymology) , 83. 263， 1982] ]。 反応後ヒドラジンを減圧留去させて、 反応容器を 30分間放置して 室温に戻した。 試験管にホーネン社製ァセチル化試薬の acetylation reagent を 250 1、 無水酢酸を 25 入れてよく攪拌させ、 室温で 30分間反応させた。 さら に acetylation reagentを 250 μ 1、 無水酢酸を 25 μ 1加えてよく攪拌させ、 室温 で 1時間反応させた。 試料を _80°Cのフリーザーで凍結させ、 約 17時間凍結乾燥 させた。 凍結乾燥した試料から、 TaKaRa社製セルロースカートリッジ ダリカン プレパレーションキットを用いて糖鎖を回収した。 試料糖鎖溶液を遠心濃縮機に て乾固後、 2-アミノビリジンによる蛍光標識を行った [ジャーナル'ォブ 'パイ オケミストリー （J. Biochera. ) , 95， 197, 1984]。 2 -アミノビリジン溶液は 2-ァ ミノピリジン lgに対し 11( 1760 1 を加え （1 XPA溶液）、 その溶液を逆浸透精製 水で 10倍に希釈したものを用いた （10倍希釈 PA溶液)。 シァノ水素化ホウ素ナ トリゥム溶液は、 シァノ水素化ホウ素ナトリゥム 10mgに対し 1 ？ 溶液20 1、 逆浸透精製水 430 ^ 1を加えて調製した。 試料に 10倍希釈 PA溶液を 67 1入れて 100°C、 15分間反応させ、 放冷後にシァノ水素化ホウ素ナトリゥム溶液を 2 μ 1入 れて 90°C、 12時間反応させて試料糖鎖を蛍光標識した。 蛍光標識した糖鎖群 （PA 化糖鎖群） を、 Surperdex Peptide HR 10/30 カラム （Pharmacia社製） を用いて 過剰な試薬と分離した。 溶離液は lOraM炭酸水素アンモニゥム、 流速は 0. 5ml/分、 カラム温度は室温、 蛍光検出器は励起波長 320nm、 蛍光波長 400nmで行なった。 試料添加後 20分から 30分の溶出液を回収し、 遠心濃縮機にて乾固させ、 精製 PA 化糖鎖群とした。 次に、 CLC-0DS カラム （Shimadzu社製、 φ 6. 0nmX 150nm) を用 いて、 精製 PA化糖鎖群の逆相 HPLC分析を行った。 カラム温度は 55°C、 流速は lml/ml, 蛍光検出器は励起波長 320nm、 蛍光波長 400nmで行なった。 lOmM リン酸 ナトリウム緩衝液 （pH3. 8) で力ラムを平衡化し、 0. 5%1 -ブタノールの直線濃度 勾配にて 80分間溶出した。 各 PA化糖鎖の同定は、 分取した各 PA化糖鎖のピーク のマトリックス支援レーザーイオン化飛行時間型質量分析 （MALDI- TOF- MS分析） におけるポストソース分解 (Post Source Decay) 分析、 TaKaRa社製 PA化糖鎖ス タンダードとの溶出位置の比較、 並びに各種酵素を用いて各 PA化糖鎖を消化後、 逆相 HPLC分析により行なつた。
糖鎖含量は、 逆相 HPLC分析における各 PA化糖鎖のピーク面積より算出した。 還元末端が N-ァセチルダルコサミンでない PA化糖鎖は、 不純物由来であるか、 PA化糖鎖調製中の副反応物であるため、 ピーク面積の算出から除外した。 ピーク 面積から計算すると、 KM2760- 1の還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフ コースの 1位が α結合していない糖鎖含量は 87%、 ΚΜ3060の還元末端の Ν-ァセ チルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖含量は 8%で めった。
第 4Α図は ΚΜ2760- 1、 第 4Β図は ΚΜ3060から調製した ΡΑ化糖鎖を、 それぞれ逆 相 HPLCで分析して得た溶離図を示した。 緩衝液 Aとしてリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH3.8)、 緩衝液 Bとしてリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH3.8) + 0.5%1 -プタノール を用い、 以下の第 2表のグラジェントで分析した。
時間 (分) 0 80 90 90.1 120
緩衝液 B (%) 0 60 60 0 0 図中、 （1)〜（8) のピークは、 以下の構造 （1)〜（8) をそれぞれ示す。
(1)
GlcNAcjSl— 2Man«l
V 6 an^ 1-4G1CNACJ8 l-4GlcNAc-PA
GlcNAc81-2 anar
(2)
Gal β l-4GlcNAc β 1 -2Man a 1
\ Man β 1一 4<3cNAc β 1一 4a。NAc— PA
GlcNAc 3 l-2Man
(3)
GlcNAcjgl—2Man 1\
6 ManjS l-4GlcNAc¾8 l-4GlcNAo-PA
Gal/8 l-4GlcNAc¾S l-2Manar (4)
Gal β 1— 4C3cNAc β 1— 2Man a L
\ Man β 1一 43cNAc β 1 - 4<3cNAc — PA
Gal β 1 -4GlcNAo β l-2Manブ
(5)
GlcNAc β 1一 2Man a 1ゝ Fuc a
V 6
¾ Man β 1一 4 HcNAc β 1 - 4GlcNAc 一 PA
GlcNAc β l― 2Manノ
(6)
Gal β 1- 4 HcNAc β 1― 2Man a U FuC a \
\- 6
¾ Man β 1一 43cNAc β 1一 4Glc Ac ― PA
GlcNAc β 1— 2Manノ
(7)
GlcNAc β 1一 2Man 1 Fuc a
V 一 6
¾ Man β 1 4GoNAc β 1一 cNAc 一 PA
Oal β 1- 4C3cNAc β 1一 2Man な V
(8)
Gal β 1 - 4GlcNAc β 1 - 2Man οί Fuc \
V 6
'6 Man β 1— 4GlcNAc β 1— 4GlcNAc—PA
Gal β 1 -4GlcNAc β 1 -2Man of 1
GlcNAc は N -ァセチルダルコサミン、 Gal はガラク トース、 Manはマンノース、 Fucはフコース、 PAはピリジルァミノ基を示す。 第 4図において、 還元末端の N- ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖群の割合 は、 （1)〜(8) のうち （1)〜(4)のピークが占める面積、 還元末端の Ν-ァセチルダ ルコサミンの 6位にフコースの 1 位が a結合していない糖鎖群の割合は、 （1)〜 (8)のうち （5)〜（8) のピークが占める面積から算出した。 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合していな い糖鎖の割合は、 KM2760- 1は 87%、 KM3060は 8%であった。
以上、 本実施例の結果は、 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコー スの 1位が α結合していない糖鎖の割合の高い抗体組成物は、 本実験に用いたす ベての抗原発現量の標的細胞に対しても還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6 位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖の割合の低い抗体組成物よりも高い 細胞障害活性を発揮することを示している。 特に、 還元末端の Ν-ァセチルダルコ サミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖の割合の低い抗体組成物 が ADCC活性を発揮することのできない抗原発現量の低い標的細胞に対しても、 ADCC活性を発揮することができることを示している。
すなわち、 ひ1， 6-フコース/レクチン耐性細胞から生産された抗体組成物は、 a 1， 6-フコース/レクチン不耐性細胞から生産された抗体組成物が ADCC活性を発 揮することのできない抗原発現量の低い標的細胞に対して、 ADCC活性を発揮する ことができることを示している。 実施例 2. 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合 していない糖鎖の割合が異なる抗 CCR4キメラ抗体の ADCC活性および標的細胞に 対する効果
1. 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合してい ない糖鎖の割合の異なる抗 CCR4キメラ抗体の調製
実施例 1 の 3 項に記載にあるように、 ΥΒ2/0 細胞産生抗 CCR4 キメ.ラ抗体 KM2760-1の還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合 していない糖鎖の割合は 87%であり、 CH0/DG44 細胞産生抗 CCR4 キメラ抗体 KM2760-1の還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位にフコースの 1位が a結合 していない糖鎖の割合は 8%であった。 以下、 これらの試料を、 抗 CCR4キメラ抗 体 （87%)、 抗 CCR4キメラ抗体 （8%) と表記する。
さらに、 抗 CCR4 キメラ抗体 （87%) と抗 CCR4 キメラ抗体 （8%) を用い、 抗 CCR4キメラ抗体 （87%) :抗 CCR4キメラ抗体 （8%) =22 : 57、 32 : 47、 42 : 37の割合 でそれぞれ混合した。 これらの試料を実施例 1の 7項の方法にしたがって糖鎖分 析を行なったところ、 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が α結合していない糖鎖の割合は、 それぞれ 27%、 39%、 46%であった。 以下、 これらの試料を抗 CCR4キメラ抗体 （27%)、 抗 CCR4キメラ抗体 （39%)、 抗 CCR4 キメラ抗体 （46%) と表記する。 '
第 5図には、 各試料の糖鎖分析の結果を示した。 還元末端の Ν-ァセチルダルコ サミンの 6位にフコースの 1位が ο;結合していない糖鎖の割合は、 2回の結果を 平均した値を用いた。
2. CCR4部分ペプチドに対する結合活性の評価 （ELISA法）
本実施例 1 項で調製した抗 CCR4 キメラ抗体 （27%)、 抗 CCR4 キメラ抗体 (39%)およぴ抗 CCR4 キメラ抗体 （46%)ならびに抗 CCR4 キメラ抗体 （8%)の CCR 部分ぺプチドに対する結合活性は実施例 1の 2項に記載の方法に従って測定 した。
その結果、 第 6図に示したように、 4種類の抗 CCR4キメラ抗体は、 いずれも同 等の CCR4に対する結合活性を示し、 還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が《結合していない糖鎖の割合は、 抗体の抗原結合活性に影響 を与えないことが明らかとなった。
3. ヒ ト CCR4細胞株に対する ADCC活性の評価
本実施例 1 項で調製した抗 CCR4 キメラ抗体 （27%)、 抗 CCR4 キメラ抗体 (39%)およぴ抗 CCR4 キメラ抗体 （46%)ならびに抗 CCR4 キメラ抗体 （8%)の ADCC活性を CCR4の発現量の異なる細胞株を標的細胞として測定し、 抗原数と還 元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖 鎖の割合の関係について調べた。 標的細胞としては実施例 1 の 1項で調製した 8 種類の CCR4の発現量の異なる細胞株のうち、 KC1067 (CCR4分子発現量は 4650個 /細胞）、 KC1063 (CCR4分子発現量は 15300個/細胞）、 KC1062 (CCR4分子発現量は 54200個/細胞） の 3種類を用いた。 還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位が "結合していない糖鎖の割合の異なる 4種類の抗 CCR4キメラ抗 体の ADCC活性は実施例 1の 2項に記載の方法に従つて測定した。 エフヱクタ一細 胞は 3名の健常人ドナー A、 B、 Cの末梢血より採取し、 ADCC活性測定時の抗体濃 度は最終濃度 l / g/mLとした。
第 7図には、 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が a 結合していない糖鎖の割合の異なる抗 CCR4キメラ抗体の ADCC活性を 3名の健常 人ドナー （A、 B、 C) のエフェクター細胞を用いて測定した結果をそれぞれ示した。 第 7図に示したように、 抗 CCR4キメラ抗体の ADCC活性は抗原数、 および還元末 端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合に相関して 上昇する傾向を示した。
第 7 図に示した各ド^ "一の抗 CCR4 キメラ抗体 （27%)、 抗 CCR4 キメラ抗体 (39%) , 抗 CCR4キメラ抗体 （46%)のプロットを、 KC1067 (CCR4分子発現量 4650 個/細胞） と KC1063 (CCR は 15300個/細胞） に対する ADCC活性の 2点を通る一 次式で近似した。 近似式 （3) は下式で記述される。
Y = A X Ln (X) - B (3) 式 （3) において、 Xは抗原数、 Yは Xに対応する ADCC活性、 A、 Bは係数であ る。 表計算ソフト Excel (Microsoft社製） を用いてそれぞれのプロットにおける A、 B の値を算出した。 それぞれのプロットにおける A、 B の値と、 その時の近似 式の Yに抗 CCR4キメラ抗体 （8%)の KC1062 (CCR4は 54200個/細胞） に対する ADCC活性の値を代入して得られる Xの値、 および X+54200の値を第 3表に示す。 このとき得られた Xの値は、 抗 CCR4キメラ抗体 （8%)の抗原数 54200個/細胞の 標的細胞に対する ADCC活性と等しい ADCC活性を抗 CCR4キメラ抗体 （27%)、 抗 CCR4 キメラ抗体 （39%)、 抗 CCR4 キメラ抗体 （46%)を用いて得るために必要な 抗原数を表す。 また X+54200の値は、 抗 CCR4キメラ抗体 （27%)、 抗 CCR4キメ ラ抗体 （39%)、 抗 CCR4キメラ抗体 （46%)がそれぞれ抗 CCR4キメラ抗体 （8%) に対し同じ ADCC活性を示すことができる抗原数の比率を表す。 第 3表
ドナー •A A B X X÷ 54200 a 1, 6- -フコ -スを含まない糖鎖の割合
27% 34. 3 283 5610 1/9. 66
39% 36. 0 294 5190 1/10. 4
46% 34. 2 272 4290 1/12. 6 ドナー -B A B X X÷ 54200 a 1, 6- -フコ -スを含まない糖鎖の割合
27% 40. 7 335 5280 1/10. 3
39% 43. 9 357 4650 1/11. 6
46% 40. 1 321 4190 1/12. 9 ドナー -C A B X X÷ 54200 1, 6- -フコ -スを含まない糖鎖の割合
27% 30. 2 225 6300 1/8. 61
39% 34. 0 251 4980 1/10. 9
46% 27. 3 193 4760 1/11. 4 第 3表に示したように、 いずれのドナーにおいても Xの値は還元末端の N-ァセ チルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖の割合が増加 するにつれて減少し、 Χ+54200の値も減少したが、 抗 CCR4キメラ抗体 （27%)、 抗 CCR4キメラ抗体 （39%)、 抗 CCR4キメラ抗体 （46%)のいずれも 10分の 1程度 の抗原数で抗 CCR4キメラ抗体 （8%)と同等の ADCC活性を示すことが明らかとな つた。 この結果は抗体組成物の Fc領域に結合する還元末端の N-ァセチルダルコ サミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖の割合が 20%以上の抗体 組成物は、 Fc領域に結合する N-グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端の N-ァセ チルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖の割合が 20% 未満の抗体組成物よりも 10分の 1の抗原数で同等の ADCC活性が得られることを 示している。 このことは、 還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α 結合していない糖鎖の割合が 20%未満の抗体組成物が ADCC活性を発揮すること のできない抗原発現量の低い標的細胞に対しても、 還元末端の N-ァセチルダルコ サミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖の割合の 20%以上の抗体 糸且成物 ADCC活性を発揮することができることを示している。
またこの結果は、 患者の標的細胞を用いて本発明の抗体医薬が特に有効な、 抗 原発現量の低い標的細胞を有する患者を選抜することができることを示している。 実施例 3. レクチン耐性 CH0/DG44細胞で生産された抗 CCR4抗体の ADCC活性
1. レクチン If性 CH0/DG44株の取得
CH0/DG44 細胞を、 IMDM- FBS (IO) - HT (1)培地 [FBS を 10 %、 HT supplement (GIBCO BRL社製） を 1倍濃度含む IMDM培地] にて接着培養用フラスコ 75cm2 (グ ライナー社製） 中で培養し、 コンフルェント直前まで増殖させた。 5mLの PBS (ィ ンビトロジヱン社製） にて細胞を洗浄後、 PBS で希釈した 0. 05%トリプシン （ィ ンビトロジヱン社製） を 1. 5mL添加して 37°Cにて 5分間放置し、 細胞を培養器底 面から剥離させた。 剥離させた細胞を通常の細胞培養で行われる遠心操作により 回収し、 1 X 105細胞/ mL の密度になるように IMDM- FBS (10)-HT (1)培地を添カロして 懸濁後、 未添加または 0. l i g/mL のアルキル化剤である N- methyl- N' -nitro-N - nitrosoguanidin (以下、 MNNG と表記、 Sigma社製） を添加した。 C02インキュべ ータ （TABAI製） 内で 37°Cにて 3 日間放置後、 培養上清を除き、 再び上述した操 作と同様の操作で細胞を洗浄、 剥離、 回収し、 IMDM- FBS (10) - HT (1)培地に懸濁後、 接着培養用 96 ゥヱルプレート （岩城硝子社製） に I X 103細胞/ゥエルの密度で播 種した。 各ゥエルには培地中終濃度で lmg/mL のレンズマメ凝集素 （Lens culinaris agglutinin；以下、 LCA と表記、 Vector社製）、 あるいは lmg/mL のヒ イロチヤワンタケ凝集素 (Aleuria aurantia Lectin；以下、 ML と表記、 Vector 社製）、 あるいは lmg/mL のィンゲンマメ凝集素 （Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin；以下、 L- PHA と表記、 Vector社製） を添加した。 C02インキュ ベータ内で 37°Cにて 2週間培養後、 出現したコロニーをレクチン耐性 CH0/DG44 株として取得した。 取得したそれぞれのレクチン耐性 CH0/DG44株については、 LCA耐性株を CHO- LCA株、 AAL耐性株を CH0 - AAL株、 L-PHA耐性株を CHO- PHA株と 名付けた。 取得したこれら株の各種レクチンに対する耐性を調べたところ、 CH0 - LCA株は AALに対しても耐性であり、 CHO- AAL株は LCAに対しても耐性であること が分かった。 さらに、 CH0 - LCA株および CH0 - AAL株は、 LCAや AALが認識する糖鎖 構造と同じ糖鎖構造を認識するレクチン、 すなわち、 N-グリコシド結合糖鎖還元 末端の N-ァセチルダルコサミン残基の 1位とフコースの 6位が α結合で付加され た糖鎖構造を認識するレクチンに対しても耐性を示した。 具体的には、 終濃度 lmg/mL のェンドウマメ凝集素 （Pisum sativum Agglutinin；以下、 PSA と表記、 Vector社製） が添加された培地でも CH0-LCA株およぴ CHO- AAL株は耐性を示し生 存することが分かった。 また、 アルキル化剤画 NG無添加の場合でも、 上述の処理 を施す細胞数を増やすことでレクチン耐性株を取得することが可能であった。 以 後、 これら株を以下の実施例に用いた。
2. 抗 CCR4キメラ抗体生産細胞の作製
本実施例 1項で得られた 3種類のレクチン耐性株に、 参考例 1の 1項に記載し た方法で、 抗 CCR4キメラ抗体発現プラスミド pKANTEX2160を導入し、 薬剤 MTXに よる遺伝子増幅を行い、 抗 CCR4キメラ抗体生産株を作製した。 抗体発現量の測定 は参考例 1 の 2項に記載した ELISA法を用いて行い、 CHO- LCA株、 CH0-ML株、 CH0-PHA株、 それぞれから抗体を発現した形質転換株を取得した。 取得したそれ ぞれの形質転換株については、 CHO- LCA株由来の形質転換株を CH0/CCR4-LCA株、 CH0-AAL株由来の形質転換株を CH0/CCR4- AAL株、 CHO- PHA株由来の形質転換株を CH0/CCR4- PHA株と名付けた。 なお CH0/CCR4- LCA株は Nega- 13の株名で、 平成 13 年 9月 26 日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （茨 城県つくば市東 1丁目 1番地 中央第 6) に FERM BP- 7756として寄託されている。 3. レクチン耐性 CH0細胞による高 ADCC活性抗体の生産
本実施例 2項で得られた 3種類の形質転換株を用い、 参考例 1の 3項に記載し た方法で精製抗体を取得した。 精製した抗 CCR4キメラ抗体の抗原結合活性は参考 例 1の 2項に記載した ELISA法を用いて評価した。 いずれの形質転換株が生産す る抗体も、 参考例 1で作製した通常の CH0/DG44細胞を宿主とした生産株 5-03株 が生産する抗体と同等の抗原結合活性を示した。 それら精製抗体を用い、 実施例 1の 2項に記載した方法に従って各抗 CCR4キメラ抗体の ADCC活性を評価した。 その結果を第 8図に示した。 5- 03株が生産した抗体と比較して、 CH0/CCR4-LCA株 および CH0/CCR4- AAL株が生産した抗体では、 約 100倍程度の ADCC活性の上昇が 観察された。 一方、 CH0/CCR4 - PHA株が生産した抗体では有意な ADCC活性の上昇 は観察されなかった。 また、 CH0/CCR4 - LCA株と YB2/0細胞由来の生産株が生産し た抗体の ADCC活性を実施例 1の 2項に記載した方法に従って比較したところ、 CH0/CCR4-LCA株が生産した抗体は参考例 1で作製した YB2/0細胞由来生産株が生 産した抗体 KM2760-1 と同様の高い ADCC活性を示すことが明らかとなった （第 9 図)。
4. レクチン耐性 CH0細胞が生産する抗体の糖鎖分析
本実施例 3項で精製した抗 CCR4キメラ抗体の糖鎖分析を実施例 1の 3項に記載 の方法に従って行った。
第 4表には、 各種レクチン耐性株が生産した抗 CCR4キメラ抗体の糖鎖分析の結 果得られた還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合 していない糖鎖の割合 （％) を示す。 第 4表
抗体生産細胞 ひ 1, 6-フコースを持たない糖鎖の割合 （％)
5 - 03株 9
CH0/CCR4 - LCA株 48
CH0/CCR4-AAL株 27
CH0/CCR4-PHA株 8 5-03株が生産した抗体と比較して、 CH0/CCR4- LCA株が生産した抗体では、 還元 末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖 の割合が、 9%から 48%まで上昇していた。 CH0/CCR4- AAL株が生産した抗体では、 a l， 6-フコースを持たない糖鎖の割合が、 9%から 27%まで上昇していた。 一方、 CH0/CCR4-PHA株では 5-03株と比較して、 糠鎖パターンおよび α 1， 6-フコースを 持たない糖鎖の割合に殆ど変化は認められなかった。
実施例 2の結果によると、 還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコー スの 1位が α結合していない糖鎖の割合の 20%以上の抗体組成物は、 実験に用い たすベての抗原発現量の異なる標的細胞に対しても還元末端の Ν-ァセチルダルコ サミンの 6位にフコースの 1位がひ結合していない糖鎖の割合の低い抗体組成物 よりも高い細胞障害活性を発揮することを示している。 特に、 還元末端の Ν-ァセ チルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が Q;結合していない糖鎖の割合が 20% 未満の抗体組成物が ADCC活性を発揮することのできない抗原発現量の低い標的細 胞に対しても ADCC活性を発揮することができることを示している。 したがって、 本実施例にあるレクチン耐性 CH0細胞である CH0/CCR4- LCA株または CH0/CCR4 - AAL株から生産された抗体組成物は、 親株細胞である CH0/DG44細胞 5-03株が生 産した抗体組成物では ADCC活性を発揮することのできない抗原発現量の低い標的 細胞に対しても ADCC活性を発揮することができる。 実施例 4. 抗 CD20キメラ抗体組成物の ADCC活性による抗原発現量依存的な標的 細胞障害活性
1. CD20の発現量の異なるトランスフエクタント細胞の作製
(1) ヒト CD20遺伝子のクローニング
ヒト CD20 (以下 CD20 と表記する） のアミノ酸配列をコードする領域を含む遺 伝子のクローニングを、 以下の手順にて行った。
まず、 CD20 の塩基配列情報 [ジャーナル ·ォプ ·ェクスペリメンタル 'メディ スン （J. Exp. Med. ) , 167, 1975 (1988) ] を基に、 翻訳開始コドンを含む特異的 なフォワードプライマー （配列番号 2 に示す） および翻訳終止コドンを含む特異 的なリバースプライマー （配列番号 3に示す） を設計した。
次に DNA ポリメラーゼ KOD DNA polymerase (東洋紡績社製） を用いて、 Human Leukocyte 5， -STRETCH PLUS cDNA Library (Clontech社製） μ Ι を铸型として 含む 20 Lの反応液 [KOD DNA polymerase Ι μ Ι, 1倍濃度の KOD buffer (東洋紡 績社製）、 0. 2mraol/L dNTPs, mol/L上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 2 および 3、 合成はジヱンセット社に委託）] を調製し、 PCR を行った。 PCR は、 94°Cで 40秒間、 55°Cで 40秒間、 74°Cで 75秒間からなる反応を 1サイクルとして、 45 サイクル行った。 PCR後、 反応液を 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 特 異的増幅断片約 950bpを約 70 の滅菌水で回収した。 回収した特異的増幅断片 を鎳型に用いて、 さらに PCR で DNA断片の増幅を行った。 DNA ポリメラーゼ Advantage cDNA PCR Kit (Clontech社製） を用いて、 上記の回収した特異的増幅 断片 0. 7 ;u Lを錶型として含む 50 の反応液 [Advantage polymerase mix 1 レ 1倍濃度の Advantage cDNA PCR Kit 添付バッファー、 0. 04匪 ol/L dNTPs、 0. 6 mol/L上記遺伝子特異的プライマー （配列番号 2および 3) ] を調製し、 PCRを行 つた。 PCRは、 94°Cで 30秒間、 72°Cで 3分間からなる反応を 1サイクルとして、 35サイクル行った。 PCR後、 反応液を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN 社製） を用いて精製し、 滅菌水 20 L に溶解した。 制限酵素 l (宝酒造社製） および ^ SHI (宝酒造社製） で消化後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 特 異的増幅断片約 950bpを回収した。
一方、 プラスミド pBluescriptll SK (-) 2. 5 / g (Stratagene社製） を制限酵素 Pstl (宝酒造社製） および (宝酒造社製） で消化後、 0. 8%ァガロースゲル 電気泳動に供し、 約 2. 9kbpの断片を回収した。
上記で得た CD20の cDNA由来増幅断片とプラスミド pBluescriptll SK (-) 由来 の断片を、 DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 (宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を形質転換し、 得られたアン ピシリン耐性コロニーより公知の方法に従つて各々プラスミド DNAを単離した。 各プラスミ ドに揷入された cDNA の塩基配列は、 DNA シークェンサ一 377 (Parkin Elmer 社製) お ぴ BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer社製） を添付マニュアルに従い使用して決定した。 本法により配列決定した全ての揷入 cDNAが、 hFc RHIaの cDNAの ORF全長配列 をコードすることを確認した。 このうち PCR に伴う塩基の読み誤りを該配列内に 全く含まないプラスミド DNAを選択した。 以下、 本プラスミドを pBSCD20 と称す。 取得した CD20の cDNA中のアミノ酸コード領域の塩基配列を配列番号 4、 それ に対応するアミノ酸配列を配列番号 5に示す。
(2) CD20発現ベクターの構築
CD20の発現ベクターは、 以下のようにして構築した。
本項（1)で得られたプラスミ ド PBSCD20 3. 0 μ Ε を制限酵素 WI (東洋紡績社 製） および Ι ΪΗΙ (宝酒造社製） で消化後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 920bpの断片を回収した。
一方、 W097/10354 に記載のヒ ト型抗体の動物細胞安定発現用プラスミ ド PKANTEX93 2. 0 μ gを制限酵素 WI (東洋紡績社製） および g§aHI (宝酒造社製） で消化後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 9. 2kbpの断片を回収した。 上記で得た shFc RHIa cDNAを含む DNA断片とプラスミド pKANTEX93由来の断 片を、 DNA Ligation Kit Ver. 2. 0 (宝酒造社製）を用いて連結反応を行った。 該反 応液を用いて大腸菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を形質転換し、 得られたアンピシ リン耐性コロニーより公知の方法に従って各々プラスミド DNAを単離した。
各プラスミ ドに揷入された cDNA の塩基配列は、 DNA シークェンサ一 377 (Parkin Elmer 社製) および BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer社製） を添付マニュアルに従い使用して決定した。 本法により配列決定した全てのプラスミドが、 目的の CD20の cDNAを含むことを 確認した。 得られた発現ベクターを以下、 pKANTEXCD20 と称す。 なお、 本項に記 載した pKANTEXCD20の構築法は第 10図に示した。 (3) CD20の発現量の異なるクローンの選択
本項 (2)で作製した、 CD20遺伝子の動物細胞安定発現べクタ一 pKANTEXCD20をェ レクトロポレーシヨン法でマウス胸腺腫細胞株 EL- 4細胞 （ATCC TIB- 39) に導入 した。 まず EL- 4細胞を PBS (-) (GIBC0 BRL社製) にて 1 X 107個/ 500 z Lに懸濁し、 PKANTEXCD20を 10 g加えて氷中で 10分間放置した後、 専用キュべット（バイオ ラッド社製）に入れ、 260V、 500 μ ¥ϋで遺伝子導入を行った。 さらに 10分間氷中 にて放置した後、 RPMI1640- FBS (IO)培地 200mLに懸濁し、 96 ゥヱル細胞培養用プ レートに 100 L/ゥエルづっ分注した。 24時間後に培養上清を 100 17ゥエル除 去し、 lmg/mLの G418を含む 10%FCS- RPMI培地を 100 ^ L/ゥエルづっ分注し、 最 終濃度 0. 5mg/mLとした。 2週間後、 数十株のシングルクローンを選択して拡大培 ^しし。
一部のクローンに関しては、 CD20発現量の増加を目的として、 dhfr遺伝子増幅 系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 G418 を 0. 5mg/mL、 DHFR の阻害剤 である MTX (SIGMA社製） を 50nmol/L含む RPMI1640- FBS (IO)培地に 1〜2 X 105細 胞 /mLになるように懸濁し、 24 ゥヱルプレート （Greiner社製） に 2mLずつ分注 した。 5%C02インキュベーター内で 37。Cで 1〜2週間培養して、 50nmol/L MTX耐 性を示す形質転換株を誘導した。 さらに MTX濃度を 200nmol/レ 1000nmol/L と順 次上昇させ、 最終的に G418を 0. 5mg/mL、 MTXを 200nmol/Lあるいは 1000nmol/L の濃度で含む RPMI1640-SFM- FBS (IO)培地で増殖可能な形質転換株を複数得た。 得 られた形質転換株に対して、 2回の限界希釈法によるクローン化を行った。
(4) CD20の発現量の異なる細胞株の選択
本項 (3)で得られた各細胞株に発現している CD20分子の数を、 フローサイトメ 一ターを用いて定量した。 各細胞株 lxlO6個を、 マウス抗ヒト CD20モノクローナ ル抗体 （Coulter社製） を 40 μ §/ιΛ、 およぴ非特異的染色を防ぐために正常マウ ス血清 （CEDERLANE社製） を 5%で加えた FACS用緩衝液 100 i Lに懸濁し、 96ゥ エル U字プレートに分注し、 氷中で 60分間反応させた。 陰性対象としてはマウス 抗ヒト CD20モノクローナル抗体の代わりにマウス IgG2a (DAK0社製） を添カ卩した。 緩衝液にて 200 μ ΐ7ゥェルで 2回洗浄後、 FACS用緩衝液で 20倍に希釈した FITC 標識抗マゥス IgG (DAK0社製） を 100 L/ゥエルで加えた。 遮光し氷中で 60分間 反応後、 200 i L/ゥヱルで 3回洗浄し、 最終的に 500 ^ Lの PBS (-)に懸濁して、 フ ローサイトメーター EPICS XL-MCL (COULTER社製） で蛍光強度を測定した。 様々 な蛍光強度の株を合計 7種類選択し、 発現量の低い順に KC1156、 KC1157、 KC1158、 KC1160、 KC1162、 KC1163、 KC1164 と名づけた。 KC1160、 KC1163は MTX200nM耐性 株由来、 KC1164は MTXIOOOnM耐性株由来のクローンである。 各細胞株および親株 の EL-4細胞の蛍光強度のヒストグラムを第 11図に示す。
(5) CD20の発現量の異なる細胞株に発現する CD20分子数の定量
本項 (4)で選抜した各細胞株に発現している CD20分子の数を、 フローサイト メーターを用いて定量した。 CD20分子数の定量用の標準試料として、 既知数の マウス IgG がコートされた標準ビーズ （DAK0 QIFIKIT, DAK0社製） を用い、 FITC標識抗マウス IgGを本項 (4)記載の条件で反応させ、 洗浄後フローサイトメ 一ターで蛍光強度を測定した。 標準ビーズの添付説明書に従い蛍光強度とビー ズに吸着したマウス IgG分子数の相関式を算出し、 本項 (4)で得られた各細胞株 の蛍光強度を代入することにより各細胞株の CD20数を算出した。 またパックグ ラウンドとしてマウス IgG2aを反応させた場合の CD20数も算出し、 マウス抗ヒ ト CD20 モノクローナル抗体を反応させた場合の CD20数より差し引いて最終的 に各細胞株に発現している CD20数とした。 測定の結果得られた、 各細胞株に発 現する CD20分子の数を第 5表に記す。
4503 第 5表
細胞名 CD20数
EL-4細胞 6.11X102 KC1156 1.18X104 KC1157 1.45X104 KC1158 2.50X104 KC1160 4.12X104 KC1162 6.69X104 KC1163 2.05X105 KC1164 5.75X105
2. CD20の発現量の異なる細胞株を標的細胞に用いた ADCC活性の測定
参考例 2で得られた各抗 CD20キメラ抗体 KM3065、 抗 CD20キメラ抗体 （44%) および Rituxan™の 3種類 (Fc領域に結合する還元末端の N-ァセチルダルコサミ ンの 6位にフコースの 1位がひ結合していない糖鎖の割合はそれぞれ 96%、 44%、 6%) の ADCC活性と抗原数との関係を、 本実施例 1項で得られた CD20の発現量の 異なる細胞株を標的細胞に用いて以下のようにして測定した。
(1) 標的細胞溶液の調製
RPMI1640-FBS (10) 培地に 500 μ g/mlの濃度で G418硫酸塩 （ナカライテスタ製） を添カ卩した培地で培養した CD20 の発現量の異なる細胞株の IX 106細胞を調製し、 放射性物質である Na2 51Cr04を 3.7MBq当量加えて 37°Cで 60分間反応させ、 細胞を 放射線標識した。 反応後、 RPMI1640- FBS(IO) 培地で懸濁および遠心分離操作によ り 3回洗浄し、 培地に再懸濁し、 4°Cで 30分間氷中に放置して放射性物質を自然 解離させた。 遠心分離後、 RPMI1640- FBS(IO) 培地を 5ml加え、 2X105細胞/ mlに 調製し、 標的細胞溶液とした。
(2) エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血 50mlを採取し、 へパリンナトリウム （武田薬品社製） 0.5mlを加 え穏やかに混ぜた。 これを Lymphoprep (Nycomed Pharma AS |± ) を用いて使用 説明書に従い、 遠心分離して単核球層を分離した。 RPMI1640- FBS(10) 培地で 3回 遠心分離して洗浄後、 培地を用いて 2 X 106細胞/ ral の濃度で再懸濁し、 エフエタ ター細胞溶液とした。
(3) ADCC活性の測定
96ゥエル U字底プレート （Falcon社製） の各ゥエルに本項（1) で調製した標的 細胞溶液の 50 μ ΐ (1 X 104細胞/ゥ ル） を分注した。 次いで本項（2) で調製した エフェクター細胞溶液を 100 / l (2 X 105細胞/ゥエル、 エフヱクタ一細胞と標的 細胞の比は 20: 1 となる） 添加した。 更に、 参考例 2で得られた 3種の抗 CD20キ メラ抗体、 Rituxan™、 抗 CD20キメラ抗体 (44%)および KM3065を最終濃度 5ng/ml となるように加え、 37°Cで 4時間反応させた。 反応後、 プレートを遠心分離し、 上清の 51Cr量を τ/ -カウンタ一にて測定した。 自然解離 51Cr量は、 エフェクター 細胞溶液、 抗体溶液の代わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、 上清 の 51 Cr量を測定することにより求めた。 全解離51 Cr量は、 抗体溶液の代わりに培 地のみを、 エフェクター細胞溶液の代わりに 1 規定塩酸を添加し、 上記と同様の 操作を行い、 上清の 51 Cr量を測定することにより求めた。 ADCC活性は上記式 （1) により求めた。
得られた ADCC活性と、 本実施例 1項で得られた各標的細胞に発現する CD20分 子数との関係を第 12図に示す。 3種の抗 CD20キメラ抗体は、 ともに抗原数依存 的な ADCC活性を示したが、 KM3065、 抗 CD20キメラ抗体 (44%)の ADCC活性はほぼ 同等であり、 いずれも Rituxan™の ADCC活性を大幅に上回った。 KM3065のプロッ トはデータ解析ソフトウェア KaleidaGraph™ (SYNERGY SOFTWARE社製） を用いた 結果、 下式 （4) で近似された。 y= (-67. 81/ (1+ (x/28942) L 58) ) +68. 19 (4) 式 （4) において、 Xは CD20数、 yは細胞障害活性を表す。
また同様に、 抗 CD20キメラ抗体 (44%)のプロットは下式 （5) で近似された。 y= (-67. 98/ (1+ (x/3360l) L 55) ) +67. 59 (5)
Rituxan™は KC1163 (CD20数： 205000個/細胞） に対して 41. 8%の細胞障害活 性を示した。 この値を式 （4)、 (5) に代入し、 KM3065 あるいは抗 CD20 キメラ抗 体 （44%) が KC1163 に対する Rituxan™の細胞障害活性と同等の細胞障害活性を 示すのに必要な CD20数を算出すると、 それぞれ 38500個/細胞、 46100個/細胞で ある。 すなわち、 KM3065あるいは抗 CD20キメラ抗体 （44%) は Rituxan™の約 5 分の 1の CD20数で同等の ADCC活性を示すことが明らかとなった。 また CD20数が 高い条件でも Rituxan™の細胞障害活性は KM3065 あるいは抗 CD20 キメラ抗体 (44%) の細胞障害活性に到達せず、 低レ、活性値で飽和してしまうことも明らかに なった。
この結果は、 還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位がひ 結合していない糖鎖の割合の高い抗体組成物は、 実験で用いたすべての抗原発現 量の異なる標的細胞に対しても還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合していない糖鎖の割合の低い抗体組成物よりも高い細胞障害 活性を発揮することを示しているが、 特に、 還元末端の Ν-ァセチルダルコサミン の 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖の割合の低い抗体組成物が ADCC 活性を発揮することのできない抗原発現量の低い標的細胞に対しても ADCC活性を 発揮することができることを示している。
すなわち、 1， 6-フコース Zレクチン耐性細胞から生産された抗体組成物は、 a l， 6-フコースノレクチン不耐性細胞から生産された抗体組成物が ADCC活性を発 揮することのできない抗原発現量の低い標的細胞に対して、 ADCC活性を発揮する ことができることを示している。 参考例 1. 抗 CCR4キメラ抗体の作製
1. 抗 CCR4キメラ抗体の安定生産細胞の作製
W001/64754記載の抗 CCR4キメラ抗体のタンデム型発現べクター pKANTEX2160を 用いて抗 CCR4キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。 (1) ラットミエローマ YB2/0細胞を用いた生産細胞の作製
lO ^u gの抗 CCR4キメラ抗体発現ベクター pKANTEX2160 (W001/64754) を 4 X 106 細胞のラットミエローマ YB2/0細胞 （ATCC CRL1662) へエレク トロポレーシヨン 法 [サイ トテクノロジー （Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] により導入後、 40mL の Hybridoma- SFM- FBS (5) [FBS (PAA ラボラ トリーズ社製） を 5 %含む Hybridoma-SFM培地 （ィンビトロジェン社製） ] に懸濁し、 96ゥエル培養用プレー ト (住友べ一クライトネ土製) に 200 μ ΐ7ゥヱルずつ分注した。 5%C02インキュべ 一ター内で 37°C、 24時間培養した後、 G418を lmg/mLになるように添加して 1〜2 週間培養した。 G418 耐性を示す形質転換株のコロエーが出現し、 増殖の認められ たゥヱルより培養上清を回収し、 上清中の抗 CCR4キメラ抗体の抗原結合活性を本 実施例 2項記載の ELISA法により測定した。
培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥエルの形質転換株につい ては、 DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 G418 を lmg/mL、 DHFR の阻害剤である MTX (SIGMA社製） を δΟηΜ含む Hybridoma- SFM - FBS (5) 培地に 1〜2 X 105細胞/ ml になるように懸濁し、 24 ゥエルプレート (Greiner社製） に 1mlずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°Cで 1〜2 週間培養して、 50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 形質転換株の増殖が 認められたゥエルの培養上清中の抗 CCR4キメラ抗体の抗原結合活性を本実施例 2 項記載の ELISA法により測定した。
培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥエルの形質転換株につい ては、 上記と同様の方法により、 ΜΤΧ濃度を上昇させ、 最終的に ΜΤΧを 200ηΜの 濃度で含む Hybridoma-SFM- FBS (5) 培地で増殖可能かつ、 抗 CCR4キメラ抗体を高 生産する形質転換株を得た。 得られた形質転換株について、 2 回の限界希釈法に よる単一細胞化 （クローン化） を行い、 得られたクローン化株を KM2760_1#58- 35-16 と名付けた。 尚、 W000/61739の実施例 8に示された a l， 6 -フコシルトラン スフエラーゼの遺伝子の転写物の定量法を用い、 該転写物の量が比較的低い株を 優良株として選択し用いた。 選択された株はレクチン耐性株であった。 (2) CH0/DG44細胞を用いた生産細胞の作製
抗 CCR4 キメラ抗体発現ベクター pKANTEX2160 の 4 μ g を 1. 6 X 106細胞の CH0/DG44 細胞へエレク ト 口ポレーシヨ ン法 [サイ トテク ノ ロ ジー (Cytotechnology) , 3， 133 (1990) ] により導入後、 10mlの IMDM_dFBS (10) - HT (1) [dFBS (ィンビトロジェン社製） を 10%、 HT supplement (ィンビトロジェン社 製） を 1倍濃度で含む IMDM培地 （ィンビトロジェン社製) ] に懸濁し、 96ゥエル 培養用プレート （岩城硝子社製） に ΙΟΟ μ Ι/ゥエルずつ分注した。 5%C02インキ ュベータ一内で 37で、 24時間培養した後、 IMDM-dFBS (lO) (透析 FBSを 10%で含 む IMDM培地） に培地交換し、 1〜2週間培養した。 HT非依存的な増殖を示す形質 転換株のコロニーが出現したため、 増殖の認められたゥエルより培養上清を回収 し、 上清中の抗 CCR4キメラ抗体の発現量を本実施例 2項記載の ELISA法により測 定した。
培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥヱルの形質転換株につい ては、 DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 MTXを 50nM 含む IMDM- dFBS (10) 培地に 1〜2 X 105細胞/ ml になるように懸濁し、 24 ゥエルプ レート （岩城硝子社製） に 0. 5ml ずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°Cで 1〜2週間培養して、 50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 増殖が 認められたゥヱルの形質転換株については、 上記と同様の方法により、 MTX濃度 を 200nMに上昇させ、 最終的に MTXを 200nMの濃度で含む IMDM- dFBS (10) 培地で 増殖可能かつ、 抗 CCR4キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。 得られた形質 転換株を 5 - 03株と名付けた。
2. CCR4部分ペプチドに対する結合活性 （ELISA法）
抗 CCR4キメラ抗体が反応し得るヒト CCR4細胞外領域ぺプチドとして化合物 1 (配列番号 1) を選択した。 ELISA法による活性測定に用いるため、 以下の方法で BSA (Bovine Serum Albumin) (ナカライテスタ社製） とのコンジユゲートを作製 し、 抗原として用いた。 すなわち、 10 mg の BSA を含む PBS溶液 900 mL に、 100ml の 25mg/raL SMCC [4- (N-マレイミドメチル） シク口へキサン-卜カルボキシ リックァシッド N-ヒドロキシサクシンィミドエステル] (シグマ社製) - DMS0溶液 を撹拌しながら滴下し、 30分間ゆつくりと攪拌した。 25 mL PBS で平衡化した NAP- 10カラムなどのゲルろ過カラムに反応液 ImLをアプライし、 1. 5mLの PBSで 溶出させた溶出液を BSA-SMCC溶液とした （A28。測定から BSA濃度を算出)。 次に、 0. 5 mgの化合物 1に 250mL PBSを加え、 次いで 250mL DMFを加えて完全に溶解さ せた後、 前述の BSA- SMCC溶液 （BSA換算 1. 25mg) を撹拌下で添加して 3時間ゆつ くり攪拌した。 反応液を PBSに対して 4°C、 一晩透析し、 最終濃度 0. 05%となる ようにアジ化ナトリゥムを添加して、 0. 22 mm フィルターでろ過した後 BSA-化合 物 1溶液を調製した。
96穴の EIA用プレート （グライ "一社製） に、 上述のように調製した BSA-ィ匕合 物 1溶液を 0. 05 U g/mL、 50 1/ゥエルで分注し、 4°Cで一晚放置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 1%BSA - PBSを 100 μ L/ゥヱルでカロえ、 室温で 1時間反応させて残 存する活性基をブロックした。 各ゥエルを 0. 05%Tween20 を含む PBS (以下、 Tween-PBS と表記する） で洗浄後、 形質転換株の培養上清を 50 / L/ゥヱルでカロえ、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 各ゥヱルを Tween- PBSで洗浄後、 1%BSA- PBS で 6000 倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ャギ抗ヒ ト IgG ( y ) 抗体溶液 (American Qualex社製） を二次抗体溶液として、 それぞれ 50 L/ゥヱルで加え、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 Tween-PBSで洗浄後、 ABTS基質液を 50 / L/ゥ エルで加えて発色させ、 20分後に 5%SDS溶液を 50 し/ゥェル加えて反応を停止 した。 その後 0D415を測定した。 本参考例 1項で得られた抗 CCR4キメラ抗体は、 CCR4に対する結合活性を示した。
3. 抗 CCR4キメラ抗体の精製
(1) ΥΒ2/0細胞由来の生産細胞の培養おょぴ抗体の精製
本参考例 1 項で得られた抗 CCR4 キメラ抗体を発現する形質転換細胞クローン ΚΜ2760- 1#58- 35- 16を 200nM MTX、 Daigo' s GF21 (和光純薬製） を 5%の濃度で含 む Hybridoma- SFM (インビトロジヱン社製） 培地に 2 X 105細胞/ ml となる様に懸 3 濁し、 スピナ一ボトル （岩城硝子社製） を用いて 37°Cの恒温室内で Fed-Batch攪 拌培養した。 8-10 日間培養して回収した培養上清より、 Prosep- A (ミリポア社 製） カラムおよびゲルろ過法を用いて、 抗 CCR4キメラ抗体を精製した。 精製した 抗 CCR4キメラ抗体を KM2760-1と名付けた。
(2) CH0/DG4 細胞由来の生産細胞の培養およぴ抗体の精製
本参考例 1項で得られた抗 CCR4キメラ抗体を生産する形質転換細胞株 5-03株 を IMDM- dFBS (10) 培地中で、 182cm2フラスコ （Greiner社製） にて 5°/。C02インキ ュベータ一内で 37°Cにて培養した。 数日後、 細胞密度がコンフルェントに達した 時点で培養上清を除去し、 25ml の PBSバッファ一にて細胞を洗浄後、 EXCELL301 培地 （JRH社製） を 35ml注入した。 5%C02インキュベーター内で 37°Cにて 7日間 培養後、 培養上清を回収した。 培養上清より Prosep- A (ミリポア社製） カラムを 用いて、 添付の説明書に従い、 抗 CCR4 キメラ抗体を精製した。 精製した抗 CCR4 キメラ抗体を KM3060と名付けた。
KM2760-1および KM3060の CCR4に対する結合活性を ELISAにより測定した結果、 同等の結合活性を示した。
4. 精製した抗 CCR4キメラ抗体の解析
本参考例 1項で得られた 2種類の抗 CCR4キメラ抗体の各 4μ §を公知の方法 [ネイチヤー （Nature) , 227, 680, 1970] に従って SDS- PAGE により、 分子量およ び精製度を解析した。 精製した各抗 CCR4キメラ抗体は、 いずれも非還元条件下で は分子量が約 150Kdの単一のバンドが、 還元条件下では約 50Kdと約 25Kdの 2本 のバンドが認められた。 これらの分子量は、 抗体の H鎖および L鎖の cDNAの塩基 配列から推定される分子量 （H鎖：約 49Kd、 L鎖：約 23Kd、 分子全体：約 144Kd) とほぼ一致し、 更に、 IgG型の抗体は、 非還元条件下では分子量は約 150Kdであ り、 還元条件下では分子内の S - S結合が切断され、 約 50Kdの分子量を持つ H鎖と 約 25Kd の分子量を持つ L鎖に分解されるという報告 [アンティボディズ， Chapter 14、 モノクローナル 'アンティポディズ] と一致し、 抗 CCR4 キメラ抗体 が正しい構造の抗体分子として発現され、 かつ精製されたことが確認された。 参考例 2. 抗 CD20ヒト型キメラ抗体の作製
1. 抗 CD20ヒト型キメラ抗体発現ベクターの作製
(1) 抗 CD20マウスモノクローナル抗体の VLをコードする cDNAの構築
W094/11026に記載されている抗 CD20マウスモノクローナル抗体 2Βδの VLの ァミノ酸配列をコードする cDNA (配列番号 6に記載）を PCR法を用いて以下の様 にして構築した。
まず、 W094/11026記載の VLの塩基配列の 5'末端と 3'末端に PCR時の増幅用 プライマーの結合塩基配列 （ヒト化抗体発現用ベクターへクローユングするた めの制限酵素認識配列も含む） を付加した。 設計した塩基配列を 5'末端側から 約 100塩基ずつ計 6本の塩基配列に分け （隣り合う塩基配列は、 その末端に約 20塩基の重複配列を有する様にする）、 それらをセンス鎖、 アンチセンス鎖の交 互の順で、 実際には、 配列番号 7、 8、 9、 10、 11、 および 12の 6本の合成 DNA を作製 (GENSET社製へ委託）した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が 0. 1 となる様に、 50 // L の反応液 [K0D DNA Polymerase添付 PCR Buffer #1 (東洋紡績社製）、 0. 2niM dNTPs、 lmM塩化マ グネシゥム、 0. 5 M M13 primer M4 (宝酒造社製）、 0. 5 ^ Μ Ml 3 primer RV (宝 酒造社製）]に添加し、 DNA サーマルサイクラ一 GeneArap PCR System 9600 (Perkin Elmer社製） を用いて、 94°Cにて 3分間加熱した後、 2. 5単位の K0D DNA Polymerase (東洋紡績社製） を添加し、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒 間、 74°Cにて 1分間のサイクルを 25サイクル行ない、 更に 72°Cにて 10分間反 応させた。 該反応液 25 し をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 約 0. 44kbの VLの PCR産物を回収し た。
次に、 プラスミド pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製） を制限酵素 Smal (宝酒造社製） して得られた DNAO. l ^u g と、 上記で得られた PCR産物約 O. l ^i g を滅菌水に加えて 7. 5 しとし、 TAKARA ligation kit ver. 2の solution I (宝 酒造社製） 7. 5 /i L、 制限酵素 1 (宝酒造社製） 0. 3 ^ Lを加えて 22°Cで 2時 間反応させた。 この様にして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸 菌 DH5 a株 （東洋紡績社製） を形質転換した。 形質転換株のクローンより各ブラ スミ ド DNA を調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosystems社製） を用いて添付の説明書に従って反応後、 同社の DNAシーケンサ ABI PRISM 377 により塩基配列を解析した。 こうして目 的の塩基配列を有する第 13図に示したプラスミド pBS- 2B8Lを得た。
(2) 抗 CD20マウスモノクローナル抗体の H鎖 V領域をコードする cDNAの構築
W094/11026に記載されている抗 CD20マウスモノクローナル抗体 2B8の H鎖 V 領域 (以下 VH と表記する）のアミノ酸配列をコードする cDNA (配列番号 13に記 載） を PCR法を用いて以下の様にして構築した。 2B8は市販の抗 CD20キメラ抗 体 Rituxan™の元となる、 Rituxan™と同一の V領域を有するモノクローナル抗体 である。
まず、 W094/11026記載の VHの塩基配列の 5'末端と 3'末端に PCR時の増幅用 プライマーの結合塩基配列 （ヒト化抗体発現用ベクターへクローエングするた めの制限酵素認識配列も含む） を付加した。 設計した塩基配列を 5'末端側から 約 100塩基ずつ計 6本の塩基配列に分け （隣り合う塩基配列は、 その末端に約 20塩基の重複配列を有する様にする）、 それらをセンス鎖、 アンチセンス鎖の交 互の順で、—実際には、 配列番号 14、 15、 16、 17、 18、 および 19の 6本の合成 DNAを作製 （GENSET社製へ委託） した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が Ο. Ι μ Μ となる様に、 50 /i Lの反応液 [K0D DNA Polymerase添付 PCR Buffer #1 (東洋紡績社製）、 0. 2mM dNTPs、 ImM塩化マ グネシゥム、 0. 5 μ Μ M13 primer M4 (宝酒造社製）、 0. 5 Μ M13 primer RV (宝 酒造社製）]に添加し、 DNA サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer社製） を用いて、 94°Cにて 3分間加熱した後、 2. 5単位の K0D DNA Polymerase (東洋紡績社製） を添加し、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒 4503 間、 74°Cにて 1分間のサイクルを 25サイクル行い、 更に 72°Cにて 10分間反応 させた。 該反応液 25 μ ί をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 約 0. 49 k bの VHの PCR産物を回収 した。
次に、 プラスミド pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製） を制限酵素 Smal (宝酒造社製） して得られた DNAO. l ^ g と、 上記で得られた PCR産物約 O. l ^u g を滅菌水に加えて 7. 5 Lとし、 TAKARA ligation kit ver. 2の solution I (宝 酒造社製） 7. 5 レ 制限酵素 § I (宝酒造社製） 0. 3 Lを加えて 22°Cで一晩 反応させた。
この様にして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a株 （東 洋紡績社製） を形質転換した。 形質転換株のクローンより各プラスミド DNA を 調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosysteras社製） を用いて添付の説明書に従って反応後、 同社の DNA シーケンサ ABI PRISM 377 により塩基配列を解析した。 こうして目的の塩基配 列を有する第 14図に示したプラスミド pBS_2B8Hを得た。
次に、 14番目のアミノ酸残基を Alaから Pro へ置換するために、 配列番号 20 で示した合成 DNA を設計し、 LA PCR in vitro Mutagenesis Primer Set for pBluescriptll (宝酒造社製） を用いた PCR法により、 以下の様に塩基の置換を 行った。 上記のプラスミド pBS- 2B8Hを lng含む 50 の反応液 [LA PCR Buffer II (宝酒造社製）、 2. 5 単位の TaKaRa LA Taq、 0. 4mM dNTPs、 2. 5mM塩化マグネ シゥム、 50nM T3 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製）、 50nM上記の変異 導入用プライマー （配列番号 20、 GENSET社製) ] を調製し、 DNAサーマルサイク ラー GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer社製） を用いて、 94°Cにて 30秒 間、 55°Cにて 2分間、 72°Cにて 1分 30秒間のサイクルを 25サイクル行なった。 該反応液 30 JU L をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 約 0. 44kbの PCR産物を回収し、 30 ^ Lの水溶液 とした。 また、 同様に、 上記のプラスミド pBS- 2B8Hを lng含む 50 しの反応液 [LA PCR Buffer II (宝酒造社製）、 2. 5 単位の TaKaRa LA Taq、 0. 4mM dNTPs、 4503
2. 5raM塩化マグネシウム、 50nM T7 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製）、 50nM MUT Bl primer (宝酒造社製）]の PCRを行った。 該反応液 30 をァガロー スゲ/レ電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製） を用いて、 約 0. 63kbの PCR産物を回収し、 30 の水溶液とした。 続いて、 上記で得られ た 0. 44kbの PCR産物と 0. 63kbの PCR産物を 0. 5 Lずつ 47. 5 z Lの反応液 [LA PCR Buffer II (宝酒造社製）、 0. 4mM dNTPs、 2. 5mM塩化マグネシウム] に添加し、 DNAサーマノレサイクラ一 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer社製） を用レヽ て、 90°Cにて 10分間加熱した後、 60分間かけて 37°Cまで冷却した後、 37°Cで 15分間保持することによって DNAをァニーリングさせた。 2. 5単位の TaKaRa LA Taq (宝酒造社製） を添加して 72°Cにて 3分間反応させた後、 lOpmolずつの T3 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製） と T7 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製） を添加して反応液を 50 / L とし、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 2 分間、 72°Cにて 1分 30秒間のサイクルを 10サイクル行った。 該反応液 25 L を QIA quick PCR purification kit (QIAGEN社製） にて精製した後、 半量を 10 単位の制限酵素 fei (宝酒造社製） と 10 単位の制限酵素 (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分 画し、 約 0. 59kbの Kpnl-Sacl断片を回収した。
次に、 pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製） 1 ^ g を 10 単位の制限酵素 ΚβηΙ (宝酒造社製） と 10単位の §^1 (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反 応させた後、 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 2. 9kbの ί^Ι- Sacl断片を回収した。
上記で得られた PCR産物由来の Kpnl-Sacl 断片とプラスミド pBluescriptll SK (-)由来の Kpnl-Sacl 断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得られた組 換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 " 株 （東洋紡績社製） を形質転換 し、 形質転換株のクローンより各プラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosystems社製) を用 いて添付の説明書に従って反応後、 同社の DNAシーケンサ ABI PRISM 377 によ り塩基配列を解析した。
こうして目的の塩基配列を有する第 14図に示したプラスミド PBS- 2B8Hmを得 た。
(3) 抗 CD20ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ヒ ト化抗体発現用ベクター PKANTEX93 (Mol. Immunol. , 37, 1035, 2000) と 本参考例の 1項 （1) および （2) で得られたプラスミド pBS- 2B8Lおよび pBS - 2B8Hmを用いて抗 CD20ヒ ト型キメラ抗体 (以下、 抗 CD20キメラ抗体と表記する） の発現ベクター PKANTEX2B8Pを以下の様にして構築した。
本参考例の 1項 （1) で得られたプラスミド pBS- 2B8Lの 2 を 10単位の制 限酵素 BsiWI (New England Biolabs社製） を用いて 55°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位の制限酵素 (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 41kbの BsiWI- EcoRI断片 を回収した。
次に、 ヒト化抗体発現用ベクター PKANTEX93 の 2 /i g を 10 単位の制限酵素 BsiWI (New England Biolabs社製） を用いて 55°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位の制限酵素 1 (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該 反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 12. 75kb の BsiWI-EcoRI断片 を回収した。
次に、 上記で得られたプラスミド pBS- 2B8L由来 BsiWI- EcoRI断片とプラスミ ド pKANTEX93由来の BsiWI- EcoRI断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製） の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得られた 組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5ひ 株 （東洋紡績社製） を形質転 換し、 第 15図に示したプラスミド PKA TEX2B8- Lを得た。
次に、 本参考例 1項 （2) で得られたプラスミド pBS- 2B8Hmの 2 ii gを 10単位 の制限酵素 (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1 時間反応させた後、 更に 10 単位の制限酵素 Notl (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応 液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 45kbの Apal-Notl断片を回収し た。
次に、 上記で得られたプラスミド pKANTEX2B8_Lの 3 μ §を 10単位の制限酵素
A I (宝酒造社製） を用いて 37°cで 1時間反応させた後、 更に 10単位の制限酵 素 l (宝酒造社製） を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロー スゲル電気泳動にて分画し、 約 13. 16kbの Apal-Notl断片を回収した。
次に、 上記で得られたプラスミド pBS- 2B8Hm由来の Apal-Notl 断片とプラス ミド PKANTEX2B8- L由来の l断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社 製） の Solution I を用いて、 添付の説明書に従って連結した。 この様にして得 られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a 株 （東洋紡績社製） を 形質転換し、 形質転 のクローンより各プラスミド DNAを調製した。
得られたプラスミ ドを用い、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosystems社製） を同社の DNA シークェンサ一 377を用いて塩基配列の解析を行った結果、 目的の DNAがクローユングされてい る第 15図に示したプラスミド pKANTEX2B8Pが得られたことを確認した。
2. 抗 CD20キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
(1) ラットミエローマ YB/0細胞を用いた生産細胞の作製
本参考例 1項 （3) で得られた抗 CD20キメラ抗体発現ベクター pKANTEX2B8P を用いて抗 CD20キメラ抗体の動物細胞での発現を以下の様にして行った。
プラスミド PKANTEX2B8P の 10 μ g を 4 X 106細胞のラットミエロ一マ細胞株 YB2/0細胞 （ATCC CRL1662) へエレク トロポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ]により導入後、 40mlの H-SFM (GIBC0 - BRL社 製） 培地 （牛胎児血清 （FCS) を 5%添加） に懸濁し、 96 ウェルマイクロタイタ 一プレート （住友ベークライト社製） に 200 μ ΐ7ゥエルずつ分注した。 5%C02ィ ンキュベータ一内で 37°C、 24時間培養した後、 G418を lmg/mlになる様に添カロ して 1〜2週間培養した。 G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、 コン フルェントになったゥヱルより培養上清を回収し、 培養上清中のヒト IgG抗体 の産生量を本参考例 2項 （2) に示す ELISA法により測定した。
培養上清中にヒト IgG抗体の発現が認められたゥエルの形質転換株について は、 dhfr 遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、 G418 を lmg/mL, dhfr遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 DHFR と表記する） の 阻害剤であるメソトレキセ一ト （以下、 MTX と表記する： SIGMA社製） を 50nM 含む H- SFM培地に 1〜2 X 105細胞/ ml になる様に懸濁し、 24 ゥェルプレート (Greiner社製） に lmLずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°Cで 1〜2 週間培養して、 50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 形質転換株がゥェ ルにコンフルェントになった時点で培養上清中のヒト IgG抗体の産生量を本参 考例 2項 （2) に示す ELISA法により測定した。 培養上清中にヒ ト IgG抗体の発 現が認められたゥエルの形質転換株については、 上記と同様の方法により、 MTX 濃度を 100nM、 200nM と順次上昇させ、 最終的に G418を lmg/mL、 MTXを 200nM の濃度で含む H-SFM培地で増殖可能かつ、 抗 CD20キメラ抗体を高発現する形質 転換株を得た。 得られた形質転換株については、 限界希釈法による単一細胞化 (クローン化） を行い、 抗 CD20キメラ抗体を発現するクローン KM3065を取得し た。 尚、 W000/61739 の実施例 8 に示す α 1, 6 -フコシルトランスフヱラーゼの遺 伝子の転写物の定量法を用い、 該転写物の量が比較的低い株を優良株として選 択し、 用いた。 選択された株はレクチン耐性株であった。
このようにして得られた抗 CD20 キメラ抗体を生産する形質転換クローン ΚΜ3065は平成 13年 12月 21 曰付で、 独立行政法人産業技術総合研究所特許生 物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6) に FERM BP - 7834として寄託されている。
(2) 培養上清中のヒト IgG抗体濃度の測定 （ELISA法）
ャギ抗ヒ ト IgG (H&L)抗体 （American Qualex社製） を Phosphate Buffered Saline (以下、 PBS と表記する） で希釈して 1 μ g/mL とし、 96穴の ELISA用プ レート （グライナ一社製） に、 50 L/ゥヱルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着 させた。 P B Sで洗浄後、 1%牛血清アルブミン （以下、 BSA と表記する； AMPC 社製） を含む PBS (以下、 1%BSA_PBSと表記する） を 100 ^ L/ゥヱルでカ卩え、 室 温で 1 時間反応させて残存する活性基をプロックした。 1%BSA-PBS を捨て、 形 質転換株の培養上清、 精製したヒト型キメラ抗体の各種希釈溶液を 50 L/ゥェ ルで加え、 室温で 2時間反応させた。 反応後、 各ゥエルを 0. 05%TWeen20 を含 む PBS (以下、 Tween- PBS と表記する） で洗浄後、 1%BSA - PBSで 3000倍に希釈 したペルォキシダーゼ標識ャギ抗ヒト IgG (H&L)抗体溶液 （American Qualex社 製） を二次抗体溶液として、 それぞれ 50 μ !7ゥヱルで加え、 室温で 1時間反応 させた。 反応後、 Tween - PBS で洗浄後、 ABTS基質液 [2， 2' _アジノ-ビス（3-ェチ ノレべンゾチアゾリン- 6-スノレホン酸）アンモニゥムの 0. 55gを 1Lの 0. 1Mクェン 酸緩衝液 (pH4. 2)に溶解し、 使用直前に過酸化水素を l /i L/ml で添加した溶液] を 50 μ ΐ7ゥエルで加えて発色させ、 415nmの吸光度 （以下、 0D415 と表記する） を測定した。
3. 抗 CD20キメラ抗体の培養上清からの精製
本参考例の 2項 （1) で得られた抗 CD20 キメラ抗体を発現する形質転換細胞 クローン KM3065を MTXを 200nM、 Daigo' s GF21 (和光純薬製） を 5%の濃度で 含む H - SFM (GIBC0 - BRL社製） に 1 X 105細胞/ ml となる様に懸濁し、 182cm2フラ スコ （Greiner社製） に 50ml分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°Cで 7 日間培養し、 コンフルェントになった時点で培養上清を回収した。 培養上清よ り Prosep- A (ミリポア社製） カラムを用いて、 添付の説明書に従い、 抗 CD20キ メラ抗体 KM3065を精製した。 得られた抗 CD20キメラ抗体 KM3065の約 3 μ gを、 公知の方法 [ネイチヤー（Nature) , 227, 680 (1970) ]に従って電気泳動し、 分子 量および精製度を調べた。 その結果、 精製した抗 CD20 キメラ抗体 KM3065 は、 非還元条件下は約 150 キロダルトン （以下、 Kd と表記する） であり、 還元条件 下では約 50Kd と約 25Kdの 2本のパンドが認められた。 これらの蛋白質の大き さは、 IgG型の抗体は、 非還元条件下では分子量は約 150Kdであり、 還元条件下 では分子内のジスルフィ ド結合 (以下、 S - S結合と表記する) が切断され、 約 50Kdの分子量を持つ H鎖と約 25Kdの分子量を持つ L鎖に分解されるという報告 (アンティボディズ、 モノクローナル 'アンティボディズ） と一致し、 市販の抗 CD20 キメラ抗体 Rituxan™ Rituxan™の泳動パターンともほぼ一致することから、 抗 CD20 キメラ抗体 KM3065 が正しい構造の抗体分子として発現されていること が確認された。
4. 抗 CD20キメラ抗体の糖鎖解析
本参考例 3項で精製した抗 CD20キメラ抗体の糖鎖解析を、 実施例 1の 3項の 方法に従い行った。 その結果、 CH0/DG44細胞で生産された市販の抗 CD20キメラ 抗体 Rituxan™ (ジヱネンテック社より購入） の a 1， 6-フコースが結合しない糖 鎖含量は 6%、 α 1, 6-フコース結合糖鎖含量は 94%であった。 ΚΜ3065 の a l，6 - フコースが結合しない糖鎖含量は 96%、 a l， 6-フコース結合糖鎖含量は 4%で あった。 以上の結果から、 ΚΜ3065 は c¾ l, 6-フコースが結合しない糖鎖含量の割 合が Rituxan™と比較して多いことがわかった。
5. 還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合してい ない糖鎖の割合が 44%である抗 CD20キメラ抗体の調製
ΚΜ3065 と Rituxan™を用い、 KM3065 : Rituxan™=l： 1 の割合で混合した試料を 実施例 1 の 3 項 の方法にしたがって糖鎖分析を行なった。 その結果、 還元末端 の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が (¾結合していない糖鎖の割 合は 44%であった。 この試料を抗 CD20キメラ抗体 （44%)と名づけた。
6. 抗 CD20キメラ抗体の CD20発現細胞に対する結合活性 （蛍光抗体法）
本参考例 3項で得られた 3種の精製 CD20キメラ抗体 KM3065、 抗 CD20キメラ 抗体 （44%)および Rituxan™の抗原結合活性をフ口一サイ トメ トリーを用いた 蛍光抗体法によって評価した。 CD20陽性細胞であるヒトリンパ腫細胞株 Raji細 胞（JCRB9012)を 2 X 105個ずつ、 96ゥエル U字プレート (Falcon社製）に分注した。 抗 CD20キメラ抗体を FACS用緩衝液 （1%BSA - PBS、 0. 02%EDTA、 0. 05%NaN3) に て希釈した抗体溶液（濃度 0. 039〜40 i g/mL)を 50 L/ゥヱルとして加え、 氷 中で 30分間反応させた。 FACS用緩衝液にて 200 μ ί/ゥエルで 2回洗浄後、 ΡΕ 標識抗ヒト IgG抗体 （コールター社製） を FACS用緩衝液を用いて 100倍希釈し たものを 50 i L/ゥエル加えた。 遮光し氷中で 30分間反応させた後、 200 し/ ゥエルで 3回洗浄し、 最終的に 500 に懸濁して、 フローサイトメーターで蛍 光強度を測定した。 測定結果を第 16図に示す。 3種類の抗 CD20キメラ抗体は、 いずれも同等の CCR4に対する結合活性を示し、 還元末端の N-ァセチルダルコサ ミンの 6位にフコースの 1位が α結合していない糖鎖の割合は、 抗体の抗原結 合活性に影響を与えないことが明らかとなった。 産業上の利用可能性
本発明によって、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサ ミンの 6位とフコースの 1位が α;結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を 有さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬では治療 できない患者または疾患に適応する医薬、 およぴ該医薬を用いた該患者のスクリ 一二ング方法を提供することができる。
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Claims

請 求 の 範 囲
1. N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 から生産された抗体組成物を有効成分として含有する、 N-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖 鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さなレ、細胞から生産された抗体組成物を有 効成分として含有する医薬では治療できない患者に適応することを特徴とする医
2. Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細 胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬では治療できない患 者が、 該患者の標的細胞における、 該抗体組成物が認識する抗原が、 該抗体組成 物が治療効果を発揮するには十分ではない量しか発現していない患者である、 請 求の範囲 1に記載の医薬。
3. 該抗体組成物が治療効果を発揮するには十分ではない量が、 該抗体組成物 が抗体依存性細胞障害活性を発揮するには十分ではない量である、 請求の範囲 2 に記載の医薬。
4. Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位 とフコースの 1位が 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 から生産された抗体組成物を有効成分として含有する、 Ν-グリコシド結合複合型 糖鎖還元末端の Ν -ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖 鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さな V、細胞から生産された抗体組成物を有 効成分として含有する医薬では治療できない疾患に適応することを特徴とする医
5. Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細 胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬では治療できない疾 患が、 該疾患に関わる標的細胞における、 該抗体組成物が認識する抗原が、 該抗 体組成物が治療効果を発揮するには十分ではない量しか発現していない疾患であ る、 請求の範囲 4に記載の医薬。
6. 該抗体組成物が治療効果を発揮するには十分ではない量が、 該抗体組成物 が抗体依存性細胞障害活性を発揮するには十分ではない量である、 請求の範囲 5 に記載の医薬。
7. レクチンに耐性を有する細胞が、 以下の （a)、 (b) および （c) からなる 群から選ばれる蛋白質の活性が低下または欠失した細胞である、 請求の範囲 1〜6 のいずれか 1項に記載の医薬。
(a) 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコースの合成に関与する酵素蛋白質；
(b) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質；
(c) 細胞内糖ヌクレオチド GDP-フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白 質。
8. レクチンが、 少なくとも、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群 から選ばれるレクチンである、 請求の範囲 1〜7のいずれか 1項に記載の医薬。
(a) レンズマメレクチン；
(b) ェンドウマメレクチン；
(c) ソラマメレクチン；
(d)ヒィロチャワンタケレクチン。
9. 細胞が、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞おょぴ植物細胞からなる群から選ばれ る細胞である、 請求の範囲 1〜8のいずれか 1項に記載の医薬。
10. 細胞が、 下記 （a)〜（j) からなる群から選ばれる細胞である、 請求の範 囲 1〜9のいずれか 1項に記載の医薬。
(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞；
(b) ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞；
(c) マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞；
(d) マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0- Agl4細胞； (e) シリアンハムスタ一腎臓組織由来 BHK細胞；
(f) 抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞；
(g) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
(h) 胚性幹細胞；
(i) 受精卵細胞；
(j) 植物細胞。
11. 抗体組成物が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ば れる抗体分子を有効成分として含有する抗体組成物である、 請求の範囲 1〜10 の いずれか 1項に記載の医薬。
(a) ヒ ト抗体；
(b) ヒト化抗体；
(c) (a) または （b) の Fc領域を含む抗体の断片；
(d) (a) または （b) の Fc領域を有する融合蛋白質。
12. 抗体分子のクラスが IgGである、 請求の範囲 11に記載の医薬。
13. N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞 から生産された抗体組成物が、 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチ ルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチ ンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障害 活性が高い抗体組成物である、 請求の範囲 1〜12のいずれか 1項に記載の医薬。
14. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結 合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない細胞から生産された抗体組 成物よりも高いことを特徴とする、 請求の範囲 13に記載の医薬。
15. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 14に記載の医薬。
16. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である、 請求の範囲 13〜15のいずれか 1項に記載の医薬。
17. 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が 20%以上である抗体組成物が、 CH0細胞が生産した抗体組成物である、 請求の範囲 16に記載の医薬。
18. 医薬が、 腫瘍を伴う疾患、 アレルギーを伴う疾患、 炎症を伴う疾患、 自 己免疫疾患、 循環器疾患、 ウィルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に 対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 請求の範囲 1〜： 17のいずれか 1項に 記載の医薬。
19. 請求の範囲 1〜17 のいずれか 1項に記載の医薬を製造するための、 N - グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコー スの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞から生 産された抗体組成物の使用。
20. (i) N_グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミン の 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有 さない細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬あるいは 請求の範囲 1〜17のいずれか 1項に記載の医薬と患者から取得したこれら医薬 の標的細胞とを接触させ、 （ii) 該標的細胞と反応した医薬の活性を測定し、 (iii) N -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さない 細胞から生産された抗体組成物を有効成分として含有する医薬が示した活性と 請求の範囲 1〜17 のいずれか 1項に記載の医薬が示した活性との測定値を比較 し、 （iv) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6 位とフコースの 1位が a結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有さな い細胞から生産された抗体組成物を含有する医薬が示した活性が低い患者を選 択することにより、 請求の範囲 1〜17 のいずれか 1項に記載の医薬が有効な患 者をスクリーニングする方法。 '
21. 標的細胞と反応した医薬の活性を測定する方法が、 以下の （a)、 （b)、 (c) および （d) からなる群から選ばれる活性を測定する方法である、 請求の範 囲 19に記載の方法。
(a) 抗体依存性細胞障害活性；
(b) Fc y受容体 Ha結合活性；
(c) 捕体依存性細胞障害活性；
(d) 増殖抑制活性。 ，
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