BE438574A - - Google Patents

Description

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  Procédé de préparation d'une peptide de la   (3-alanine   ou   d'un   dérivé de la   (3-alanine.   



   La présente invention a pour objet un procédé de prépa- ration   'd'une   peptide   de.     la. (3 -alanine   ou d'un dérivé de la   -alanine,   et se rapporte à la production de substances con- sidérées comme nécessaires à l'alimentation convenable des animaux. Par suite de preuves existantes, on croit que des substances de cette nature existent d'une façon très générale dans les tissus d'êtres vivants. Une de ces substances hypo- thétiques a été nommée   t'acide   pantothénique", ce nom dérivant   @   

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 du grec et signifiant "provenant de partout".

   Cette substance fut découverte par l'inventeur en 1933 (voir Journal of The American Chemical Society, vol. 55, p. 2912, 1933) qui, seul ou conjointement avec ses collaborateurs, a publié divers articles se rapportant à cette substance, à savoir : 
R. J. Williams et D.H. Saunders. Biochemical
Journal, vol. 28, p. 1887, 1934 ;   R.J.   Williams et R. Maser. Journal American
Chemical Society, vol. 56, p. 169,   1934 ;   
E.   Rohrmann,   E. Burget et R.J. Williams. Proceed- ings Society of Expérimental Biology and Medicine, vol. 32, p.   473,   1934 ;   O.H.   Mc. Burney, W.B Bollon et R.J. Williams,
Proceedings National Academy of Science, vol. 21, p. 301, 1935 ; 
R.J.

   Williams et E.   Rohrman,   Plant Physiology, vol. 10, p. 559, 1935 et   R.J.   Williams, W.A.   Mosher,   et E.   Rohrman,   Bioche- mical Journal, vol. 30, p. 2036, 1936. 



   Ces substances physiologiquement importantes sont carac- térisées en ce qu'elles sont des produits peptidiques de con- 
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 densation de la -alanine (Ch'IVH3CH2COOH) avec des ce-hydro-   xy-acides   ou des Ó-ceto-acides capables de lactonisation ou avec des lactones correspondantes elles-mêmes. On désigne du nom de peptide tout composé contenant le groupe suivant   d'a-   tomes :HC-CO-NH-C. Les substances importantes du point de vue physiologique répondent à la formule générale suivante : 
 EMI2.2 
 dans laquelle R, dans une position quelconque, représente un atome d'hydrogène ou un radical alkylique. Les radicaux alkyliques peuvent être identiques ou différents. Dans cette formule, X représente soit un atome d'oxygène, soit un atome d'hydrogène et un radical hydroxyle.

   Si un des X est un atome d'oxygène, l'autre est un atome d'hydrogène et un radical hy- 

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 droxyle. Les deux X peuvent chacun être un atome d'hydrogène et un radical hydroxyle, mais ces deux X ne peuvent pas être un atome   d'oxygène.   Si l'un ou l'autre X est un atome   d'oxy-   gène, par déplacement   tautomérique   de l'hydrogène du radical hydroxyle, le composé peut affecter la forme cyclique : 
 EMI3.1 
 
Dans les formules- indiquées ci-dessus, n est un petit nombre entier dont la valeur n'est pas supérieure à 4 et, dans le produit naturel, il est probablement 2. 



   Les diverses substances possédant la structure indiquée ci-dessus n'ont pas la même efficacité physiologique. La demanderesse préfère les suivantes : 
 EMI3.2 
 

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 mais l'invention n'est pas limitée aux structures préférées indiquées. 



   L'acide pantothénique peut être obtenu à partir de sources naturelles par le procédé suivant :
On traite le produit de l'hydrolyse du foie de mouton par de la terre à foulon pour en éliminer les substances ba-   siques,   puis on l'amène à un PH de 3,5 environ et on adsorbe l'acide à action physiologique sur du charbon activé "Norite", On lixivie ce dernier par de l'ammoniac dilué avec du métha-   nol,   on neutralise et on évapore à sec en présence de la brucine à l'état d'alcaloïde en présence d'oxalate de brucine et de terre d'infusoires. La matière sèche est broyée et soumise à l'extraction par le chloroforme et on soumet le chloroforme à l'extraction par une petite proportion d'eau.

   Les sels de brucine résultants, qui renferment le sel de la brucine et de l'acide pantothénique, sont soumis à un travail complexe de fractionnement, qui implique la distribution entre les deux solvants immiscibles, eau et chloroforme. Pendant le travail de fractionnement, les fractions sont soumises à   des   essais en ce qui concerne leur activité physiologique. 



   Le sel concentré de brucine est converti en sels calciques, par agitation avec de l'eau de chaux, et la brucine est éliminée par extraction à l'aide du chloroforme. On poursuit le fractionnement des sels de calcium suivant le degré de pureté désiré, en employant le chlorure de mercure, pour éliminer les impuretés, et divers solvants, en vue de la précipitation fractionnée. Des détails plus complets au sujet de ce procédé complexe sont donnés dans les publications suivantes : 

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On trouve des études relatives au constituant physiolo- giquement actif dans L'article suivant :   R.J.   Williams, H.H.   Weinstock Jr. ,   E. Rohrman,
J.H. Truesdail, Herschel K. Mitchell et C.E. Mayer,
Journal American Chemical Society= vol. 61, p. 454
1939. 



     On   poursuit la purification du produit par acétylation, au moyen de l'anhydride acétique dans la pyridine, suivie d'une méthylation à l'aide du diazo-méthane, d'une extraction par l'éther et d'une distillation dans un appareil distilla- toire moléculaire à 110 , Dans l'état de pureté la plus gran- de qu'on a pu atteindre jusqu'à présent, il est efficace pour stimuler la croissance du Streptococcus lactis lorsqu'on n'emploie pas plus de 4 millionièmes de micromilligrammes par centimètre cube du milieu. 



   Le procédé qui vient d'être décrit est très laborieux et coûteux, les rendements sont extrêmement faibles, et la subs. tance obtenue n'est pas entièrement pure. Un des buts de l'invention est de produire à l'état pur et d'une manière moins coûteuse et plus efficace l'acide pantothénique et d'autres substances possédant les mêmes propriétés physiolo- giques. 



   A cet effet, la demanderesse procède par voie synthéti- que. Les produits résultants sont capables de stimuler la croissance de diverses levures, de certaines moisissures, de semences d'alfalfa, de certains extraits du foie, des bacté- ries lactiques, et.celle de jeunes poussins, et on suppose qu'ils ont une signification physiologique plus étendue, qui ne pourra être complètement révélée que par de futures expé- riences. 



   Après cette description de la présente invention en ter- mes généraux, on donnera dans ce qui.suit des indications pour la mise en oeuvre de l'invention, par des exemples con- 

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 crets. 



   Exemple 1. On permet à   100   milligrammes d'Ó-hydroxy- Ó-n-valérolactone normale de réagir pendant 24 heures à 30  avec 1 gramme d'ester /3-alanine-éthylique. On hydrolyse le produit de la réaction en lui permettant de réagir pendant une heure à 30  avec une solution 0,3 normale de carbonate de sodium. Il s'ensuit que l'ester éthylique de la peptide Ó-Ó-dihydroxy-valéro-ss-alanidique formé d'abord est converti en l'acide libre correspondant suivant la réaction suivante . 
 EMI6.1 
 



   Le produit manifeste la propriété de stipuler la croissance. Cela peut être démontré par un essai du produit, en ajoutant 0,1 milligramme à 12 cm3 de milieu basal de Snell, Strong et Peterson, Biochemical Journal 31, 1789 (1937) pour les bactéries de l'acide lactique (ce milieu renferme de la peptone traitée par alcali). La croissance des bactéries est stimulée ainsi considérablement.. 



   Exemple   2.   On permet à 100 milligrammes d' Ó-hydroxy-ss méthyle-Ó-n-butyrolactone normale de réagir pendant 1 1/2 heure à 30  avec 500 milligrammes d'ester Ó-almine éthlique.   On   hydrolyse le produit et on l'essaie de la même façon qu'à l'exemple 1. Le produit final contient   dans   des proportions physiologiquement intéressantes la substance : 
 EMI6.2 
 qui manifeste une activité physiologique comparable à celle du produit   de -l'exemple   1. 

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   Exemple 3. Suivant cette synthèse, on condense l'ester µ-alanine-éthylique avec la lactone obtenue par la dissociation de l'acide du sel de calcium concentré auquel il est fait allusion plus haut. A cet effet, il n'est pas nécessaire de purifier complètement le sel de calcium concentré. On hydrolyse le sel de calcium brut en le dissolvant dans l'acide chlorhydrique normal et en chauffant la solution pendant 1 1/2 heure à 100 c On évapore à sec à 50  la solution résultante et on permet au résidu, contenant la lactone brute, de réagir pendant 18 heures à 5  avec un excès d'ester ss-alanine éthylique. Après hydrolyse, comme dans les exemples précédents, le produit résultant manifeste un pouvoir très élevé de stimulation de la croissance de la levure ou du   Strep-'   tococcus lactis. 



   La substance employée dans cet exemple pour la condensation avec un ester ou avec un sel de la   /3-alanine   est une lactone car, bien qu'elle soit neutre, elle se combine avec les alcalis, comme un acide et, lorsqu'on chauffe le sel alcalin avec un acide minéral dilué, la substance neutre originelle est régénérée.. Elle contient un radical Ó-hydroxyle car, lorsqu'on la chauffe pendant une heure à 140  environ avec de   l'acide   sulfurique concentré, elle donne approximativement une molécule d'oxyde de carbone pour un équivalent de substance employée. On a constaté que cela constituait un procédé de détermination quantitative   des o(     -hydroxyacides.   



  C'est pourquoi cette substance tombe sous la définition donnée plus haut de composés convenant à la formation de pepti= des de   la 6 -alanine.   Son poids moléculaire'est de 120 environ. Ce fait, ainsi que l'existence de cette substance à l'état de lactone, est une preuve que l'exposant n de la formule indiquée plus haut est, dans le présent cas, un petit nombre entier, probablement 2.,, 

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La lactone précipitée se comporte comme une cétone en réagissant avec la dinitro 2.4 -phénylhydrazine pour former une hydrazone et en subissant l'hydrogénation. Après avoir réagi ainsi avec la dinitro 2.4-phénylhydrazine ou avec l'hydrogène, la substance ne réagit plus avec des esters de la   -alanine   pour constituer des produits   à pouvoir   physiologique élevé.

   Cela est une preuve que la structure de la substance qui réagit ainsi avec des esters de la ss-alanine est celle d'une céto-lactone répondant à la formule de structure suivante : 
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Le fait que cette substance n'a jamais été obtenue à l'état pur laisse quelque doute si un des atomes d'hydrogène de cette formule ne doit pas être remplacé par un radical méthyle. Le poids moléculaire de l'acide pantothénique dont elle est dérivée et l'équivalent- d'oxydation de l'acide pantothénique excluent toutefois la probabilité que la partie lactonique de la molécule   contienne   plus de six atomes de carbone. La lactone brute décrite plus haut peut être purifiée par distillation dans un appareil distillatoire moléculaire. 



  Lorsqu'elle est purifiée de cette façon, elle réagit avec la (3 -alanine   ct ses   dérivés pour former un produit qu'on ne peut pas distinguer de l'acide pantothénique en ce qui concerne son action physiologique. 



   D'autres lactones d'une nature analogue à celles décrites plus haut peuvent aussi être condensées, de la même fa- çon, avec les esters de la ss-alanine et hydrolysées pour produire des substances apparentées, actives physiologiquement. Parmi elles,, le produit de condensation de l'Ó-céto- 

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 d   -valêralactone   avec   la /$-alanine   est particulièrement important et précieux. 



   Il est évidemment entendu que, si on le désire, on peut employer d'autres esters de la   µ-alanine,   par exemple l'ester méthylique et d'autres sels de la   {3..alanine   au lieu de l'ester éthylique employé dans les procédés relatifs aux exemples particuliers décrits. 



   Les lactones décrites dans les exemples particuliers précédents et un certain nombre d'autres, qui peuvent être employées pour la mise en oeuvre de l'invention, n'ont pas été préparées avant la présente invention, et on indique dans ce qui suit le procédé de préparation de certaines de ces lactones. 



   On peut préparer l' d -hydroxy-Ó-  -n-valérolactone   de   1''exemple   1 de la façon suivante
On dissout 57 grammes d'aldol brut franchement produit (Mac Leod, Amer. Chem.   J.   37, 29) dans 50 cm3 d'éthanol à   95%   et on refroidit la solution aubain de glace. On ajoute 50 cm3 d'acide cyanhydrique anhydre et puis 2 cm3 d'hydroxyde d'ammonium à 28%, ce qui provoque une élévation de la température de la solution. Le mélange produit par la réaction est maintenu à 0  pendant une heure, puis on l'abandonne à la température ordinaire pendant trois heures.

   On ajoute alors le mélange produit par la réaction à une solution composée de 1 cm3   diacide,   sulfurique concentré dissous dans 250 cm3 d'eau, on chauffe le liquide au bain de vapeur pendant trois heures pour chasser l'excès d'acide cyanhydrique et on le fait bouillir pendant trois heures encore sous un condensateur à reflux. On ajoute alors 100 grammes d'hydroxyde de baryum, cristallisé et on chauffe le mélange produit par la. réaction, pendant dix heures, sous un condensateur à reflux. 



  Après refroidissement, on ajoute un excès d'acide sulfurique 

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 à 25%, on élimine le sulfate de baryum résultant, et on concentre la solution à Lui volume d'environ 100 cm3. On traite ensuite cette solution par la quantité de bicarbonate de sodium nécessaire pour neutraliser l'acide libre et on la soumet  d'une   façon continue, pendant quatorze heures, à l'extraction par l'éther,après quoi on chasse l'éther, ce qui laisse   Lui   liquide rougeâtre épais. On distille cette matière deux fois sous une pression de   0,025   mm. et à. une   températu-   re de 130 . Le produit de distillation, une huile rougeâtre, 
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 est 1' d -hydroxy- J -n-valérolactone normale. 



  On prépare de la façon suivante l' d,-hydroxy- (3-méthyl- Ó-n-butyrolactone normale employée dans le procédé décrit à l'exemple 2. 



   On refroidit au bain de glace un mélange de 250 grammes d'aldéhyde propionique dans 500 cm3 de méthanol, et on ajoute 130 grammes de para-formaldéhyde. On ajoute 10 grammes de carbonate de potassium dissous dans 10 cm3 d'eau, et on agite la solution pendant huit jours. Après cette période d'agitation, on ajoute 7 grammes d'acide tartrique, on filtre la solution et on chasse, à la trompe d'eau, à 60 , les matières volatiles, ce qui laisse un liquide épais, jaune verdâtre.On dissout ce liquide dans 200 cm3   d'éthanol   à 95% et on traite la solution par 107 cm3 d'acide cyanhydrique liquide.

   En procédant d'une façon analogue à celle décrite pour 
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 la préparation de l' d -hyd.roxy-.d -n-valéralactone normale, on obtient une huile visqueuse qui, après deux distillations à la température de 100 à 130 c sous une pression de 0,03 mm, donne une huile d'un jaune verdâtre. Ce produit est l' Ó-hy- 
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 droxy-  -méthyle- / -n-butyrolactone normale (calculée en ad-   me t tan t   c5),
D'autres lactones qui conviennent pour la condensation avec des esters ou des sels de la   /$-alanine   sont produites 

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 par des procédés similaires.

   Pour préparer les lactones des Ó-hydroxy-acides, on soumet des haldéhydes appropriées à la condensation du type   aldolique.   On convertit le radical aldéhyde du produit résultant en un radical cyanhydrine par   l'ac-   tion de   l'acide   cyanhydrique et on hydrolyse le radical nitrile de ce dernier pour le transformer en carboxyle. Les produits forment facilement des lactones par séparation d'eam
Un autre procédé utile dans certains cas consiste à réduire des cétones simples de structure correspondante (mais contenant un atome de carbone,de moins que le produit désiré) en leurs   hydroxy-aldéhydes,   à ajouter ensuite de l'acide cyanhydrique pour produire la cyanhydrine et à hydrolyser celle-ci par un acide minéral dilué.

   Les réactions suivantes sont exécutées en employant la butyrolacétone comme exemple de matière première. 
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   Pour préparer 1' Ó-céto-lactone, on   traite  une lactone simple, à structure correspondante et contenant un atome de carbone de moins que le produit désiré, par du pentachlorure de phosphore pour former le chlorure acide d'un acide chloro- substitué.   Celui-ci,   lorsqu'on le traite par du chlorure cuivreux, donne un nitrile d'un acide Ó-céto-chloro-substitué, Par traitement par un acide minéeral dilué, on hydrolyse celui ci en produisant l'acide carboxylique   chloro-substitué   correspondant qu'on transforme en lactone en le traitant par de 

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 l'oxyde Û'argent humide.

   C'est ainsi que la   bu.tyro-lactone,   par exemple, est amenée   à   subir les réactions suivantes : 
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Un autre procédé pour produire des Ó-céto-lactones consiste en ce qu'on condense les lactones simples, comme il est dit plus haut, avec l'oxalate de diéthyle et en décarbo-   xylant   le produit. La butyrolacétone, par exemple, donne le produit suivant : 
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Revendications. 



  1.- Le procédé de préparation d'une peptide de la ss-alanine ou d'un dérivé de   la /$-alanine,   caractérisé en ce qu'on fait réagir   la /5   -alanine ou un de ses dérivés, tels que des es- ters et ses sels, avec un acide capable de lactonisation ou avec la lactone correspondante.

Claims (1)

1. 2.- Le procadé suivant la revendication 1, caractérisé par l'em- ploi d'acides organiques. <Desc/Clms Page number 13>

   3.- Le procédé suivant la revendication 1, caractérisé par l'en- ploi d' Ó-céto-acides et d' d-hydroxy-acides.

   4.- Le¯procédé suivant les revendications 1 à 3, caractérisé par l'emploi d'une lactone obtenue par dissociation d'un sel du produit physiologiquement actif dérivant d'une source natu- relle, telle que le foie de mouton.

   5.- Le procédé suivant les revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on hydrolyse le produit de réaction pour le transfor- mer en l'acide libre.

   6.- Le procédé suivant les revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on amène l'aldéhyde correspondante à subir une conden- sation du type aldolique, qu'on traite le produit par de l'a- cide cyanhydrique et qu'on hydrolyse le radical nitrile du produit résultant pour le transformer en radical carboxyle.

   7.- Le procédé de préparation d'une peptide de la (3-alanine ou d'un de ses dérivés, en substance comme on l'a décrit dans le présent mémoire.

   8.- Une peptide de la ss-alanine ou d'un dérivé de la /%-alanine préparée par le procédé objet de l'invention.