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PROCEDE POUR'LA PREPARATION 'DE 'L'ESTER MONOPHOSPHORIQUE.DE LA
LACTOFLAVINE,
L'invention présente a trait à un nouveau procédé pour la pré- paration de l'ester monophosphorique de lactoflavine qui est un corps physio- logiquement actif. Ces ester, tout particulièrement sous forme d'un de ses sels, par exemple le sel sodique, possède la propriété désirable d'être beau- coup plus aisément soluble que la lactoflavine, ce qui le rend approprié à la préparetion de solutions de lactoflavine destinées à être injectées ou destinées à être additionnées à des denrées alimentaires. Vis-à-vis des esters de lactoflavine avec des acides organiques, l'ester phosphorique de l'invention a le grand avantage d'être très résistant à l'hydrolyse dans un large secteur de pH.
L'invention présente comprend aussi les produits in- termédiaires nouveaux de la préparation dudit ester.
Ro Kuhn et ses collaborateurs (Berichte des Deutschen Chemischen Gesellschaft, tome 69 [1936], pages 1543 et 1974; brevet américain No. 2'111' 491) ont donné un compte-rendu sur la préparation d'un ester phosphorique de la lactoflavine, sans toutefois indiquer le point de fusion ni le pouvoir ro- tatoire de leur produit.
Après avoir essayé,de reproduire les résultats de Kuhn et de ses collaborateurs, Po Karrer et ses collaborateurs (Helvetica Chimica Acta, tome 20 [1937], pages 79-83), communiquent, en page 81 du pé- riodique qui vient d'être nommé, ce qui suit : "Nous nous sommes efforcés, en des douzaines d'expériences, d'obtenir de manière synthétique l'ester phosphorique de lactoflavine pur, ce qui ne nous a pas'réussi jusqu'à ce jour; au contraire, la composition des préparations était toujours variable et ne correspondait pas à celle du sel calcique simple de l'ester monophosphorique de lactoflavine.
On peut supposer que les auteurs cités ont rencontré de sem- blables difficultés,car ils ne publient pour leur produit aucun résultat d'a- nalyse (tandis qu'ils le font pour les produits intermédiaires exempts de phos- phore). "
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Le procédé formant l'objet du brevet de Kuhn, mentionné plus haut, y est décrit comme une réaction entre la lactoflavine et l'oxychloru- re de phosphore. Cette réaction est dite avoir lieu en présence d'une base organique, tout particulièrement en présence de pyridineo Toutefois l'uti- lisation de l'oxyhalogénure de phosphore telle qu'elle est décrite dans ce brevet, ne s'est pas avérée appropriée, comme le démontrent les observations de Po Karrer et de ses collaborateurs, mentionnées plus haut.
Même en répé- rant le procédé selon Kuhn, en utilisant l'oxyhalogénure de phosphore spé- cialement indiqué dans le brevet, c'est-à-dire l'oxychlorure de phosphore, et en travaillant en présence de pyridine, il n'a pas été possible d'obtenir par synthèse l'ester monophosphorique de lactoflavine recherché.
Or, il a été établi suivant l'invention présente, qu'il est aisé d'obtenir l'ester monophosphorique de lactoflavine, avec un bon rendement, en faisant dissoudre la lactoflavine dans des acides chlorophosphoriques et en soumettant le produit réactionnel à une hydrolyseo
Il n'est pas possible de procéder de la sorte en utilisant de 1-'oxychlorure'de phosphore dans le procédé selon Kuhn, car la lactoflavine est pour ainsi dire insoluble dans l'oxychlorure de phosphore et, à la tem- pérature ambiante, elle n'est pas phosphorylée par l'oxychlorure de phospho- re, tandis qu'il y a décomposition quand on chauffe.
Un avantage tout par- ticulier de l'invention présente vis-à-vis du procédé selon Kuhn réside dans le fait qu'il n'y a besoin d'aucune base, telle que la pyridine, pour cataly- ser la phosphorylation et qu'il n'est pas nécessaire de maintenir des condi- tions sévèrement anhydres, comme on doit le faire quand on opère avec un mélange de phosphorylation composé d'oxychlorure de phosphore et de pyridineo Il est recommandable d'effectuer la réaction de phosphorylation avec un grand excès d'agent phosphorylant et pour une durée prolongée, afin d'être sûr que toute la lactoflavine soit phosphoryléeo
Les acides chlorophosphoriques utilisés comme substance de dé- part sont obtenus par traitement de l'oxychlorure de phosphore avec 1 ou 2 mol d'eau.
Les réactions auxquelles cela donne lieu peuvent être représen- tées comme suit :
EMI2.1
POC13 + H20 -'-4 HOPOC12 + EC1 POC'3 + 2 H20 #- (HO)2POC1 + 2HCl
Le produit immédiat de la réaction de la lactoflavine avec les acides chlorophosphoriques peut être isoléo A cet effet, le mélange obtenu est additionné de plusieurs fois son.volume d'éther anhydre, ce qui provoque la précipitation du produit intermédiaire sous forme d'une substance solide, que l'on filtre, lave avec de l'éther et que l'on sèche. Ces produits intermédiaires contiennent au moins 2 atomes de phosphore et 1 atome de chlore.
Leur degré de phosphorylation dépend de la durée de l'action des acides chlorophosphoriques sur la lactoflavineo Les produits intermédiaires mentionnés comprennent les sels mondchlorophosphoriques et les sels dichlorophosphoriques des monoesters phosphoriques ou polyphosphoriques de la lactoflavine, la portion phosphorique ou polyphosphorique de ces esters pouvant contenir du chlore
L'hydrolyse de ces produits intermédiaires donne lieu à une scission de la portion monochlorophosphorique ou dichlorophosphorique, formative de sel,et à la formation de l'ester monophosphorique de la lactoflavine.
A côté du produit principal, c'est-à-dire du (5') -ester, il peut se former une petite quantité de l'ester (2')-, (3')- ou (4')-monophosphorique de la lactoflavine
Il n'est pas nécessaire d'isoler ces produits intermédiaires mais, au contraire, il est avantageux d'additionner le mélange réactionnel de plusieurs volumes d'eau froide ou de glace et de laisser reposer pendant quelques heures. Les acides chlorophosphoriques n'ayant pas réagi sont hydrolysés
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complètement en acide phosphorique et en acide chlorhydrique, et les éther- sels intermédiairement formés sont transformés en l'ester monqphosphorique de lactoflavine stableo Ce dernier peut être ensuite aisément isolé de la solution par cristallisation.
L'ester monophosphorique de la lactoflavine peut être transfor- mé en ses sels; de ceux-ci le sel monosodique et le sel monodiéthanolaminé méritent le plus grand intérêt. Ces sels sont très aisément solubles dans l'eau, et sont tout particulièrement appropriés pour la préparation de solu- tions injectables et d'autres compositions contenant de la lactoflavine.
Exemple 1
On additionne lentement, en remuant avec soin et en refroidis- sant, 7,2 g (0,4 mol.) d'eau à la température ambiante à 61,3 g (0,4 molo) d'oxychlorure de phosphorea Le mélange est remué jusqu'à ce que le dévelop- pement de chlorure d'hydrogène soit pratiquement terminé, puis on laisse repo- ser jusqu'au lendemain. Ensuite, le mélange d'acides chlorophosphoriques est refroidi à 5 C et, en agitant, additionné de 3,76 g de lactoflavine. La lac- toflavine se dissout rapidement, en donnant lieu à la formation de chlorure d'hydrogène. La solution est conservée pendant 11/2 heure à 5 C, puis pendant 31/2 heure à la température ambiante.
Elle est versée, lentement et en agitant, dans 500 cm3 d'éthyléther anhydreo Il se forme un précipité jaune qui est filtré, lavé soigneusement avec de l'éther, puis séché dans le video Rendement : 5,5 go L'analyse révèle une teneur de 2,4 atomes de phosphore par molécule. Ce produit intermédiaire est hygroscopique et a une odeur de chlorure d'hydrogèneo Il se décompose à environ 150 C.
Le produit intermédiaire ainsi obtenu est hydrolysé par l'adjonc- tion de 100 cm3 d'eau. Il se forme alors une solution limpide, de.couleur am- brée, dans laquelle l'ester monophosphorique de lactoflavine cristallise en plaques hexagonales. Pour permettre à la cristallisation de s'achever, on laisse reposerle mélange jusqu'au lendemain. Les cristaux sont séparés par filtration, lavés avec de l'alcool et de l'éther, puis sèches. Ces cristaux de couleur jaune fondent à 195 C et, d'après l'analyse, ils correspondent à l'ester monophosphorique de lactoflavine de la formule C17H19N4O5PO3H2. Le pouvoir rotatoire d'une solution à 2 % dans de lacide chlorhydrique concentré est de [[alpha]]28 /D= + 44,5 .
Dans la titration potentiométrique avec de l'hydro- xyde de sodium, la courbe de titration démontre, après l'addition d'exacte- ment un équivàlent d'alcali, une inflexion bien définie à pH 4,5. Après l'ad- dition d'un deuxième équivalent, on obtient une deuxième inflexion à pH 8,50 Le produit a le même aspect que la lactoflavine, il est biologiquement actif, mais il se distingue de la lactoflavine par sa grande solubilité dans l'eau, par le fait qu'il est tant soit,peu gélifié par l'addition d'eau, et par la formation de sels très solubles dans l'eau avec les hydroxydes d'alcalis, 1' ammoniaquela diéthanolamine et autres bases semblableso
Exemple 2
Comme il a été décrit dans l'exemple 1, on ajoute 14,4 g (0,8 molo) d'eau à 61,3 g (0,4 molo)
d'oxychlorure de phosphore et on laisse reposer le mélange jusqu'au lendemain. On ajoute 3,76 g de lactoflavine, en agitant, au mélange des acides chilorophosphoriques obtenus. La lactoflavine se dissout ra- pidement, en donnant lieu à la formation de chlorure d'hydrogène. On laisse reposer la solution pendant 65 heures à la température ambiante, puis on la verse lentement dans 500 en? d'éther anhydre. Le précipité rouge-brun est fil- tré, lavé avec de l'éther et séché dans le video Ce produit intermédiaire pè- se 6, 2 g, ce qui indique une polyphosphorylation plus forte que pour le produit intermédiaire de l'exemple 1. Le produit est ajouté à 62 cm de dioxan,e, contenant 6 cm3 d'eau.
On observe d'abord dissolution, puis l'ester monophos- phorique de lactoflavine cristalliseo Le lendemain, on sépare les cristaux par filtration, on les lave avec de la dioxanne et de l'éther, et on les sèche.
Ses propriétés sont identiques à celles du produit final de l'exemple 1.
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Exemples
Comme il est décrit à l'exemple 1, on traite 61,3 parties d'oxychlo- rure de phosphore avec 7,2 g d'eau pour obtenir les acides chlorophosphoriques.
On dissout ensuiite dans ce mélange 3.76 g de lactoflavine. Après avoiir laiissé reposer pendant heure à 5 C, puis pendant ac heures à la température ambiante, on verse la solution dans un mélange de 200 g de glace et 200 g d'eau, et on laisse reposer jusqu'au lendement. L'ester monophosphorique de la lacto- flavine cristallise. Il est séparé par filtration, lavé avec de l'acide chlor- hydrique 3N, de l'alcool et de l'éther, puis il est séchéo Ce produit est iden- tique à celui que l'on obtient suivant l'exemple 1.
Le sel monosodique de l'ester monophosphorique de la lactoflavine est obtenu de la manière suivante : 4,56 g d'ester monophosphorique de lacto- flavine sont maintenus en suspension dans environ 100 cm3 d'eau. Cette suspen- sion est ajustée à pH 4,5 par l'addition d'une solution d'hydroxyde de sodium 1N ou 2N. On provoque la dissolution complète de l'ester en agitant sans in- terruption et en écrasant les parties gélifiées. Une opalescence, éventuelle- ment existante, peut être éliminée par filtration de la solution à travers un filtre de verre fritté fin. On peut aussi provoquer la clarification en ajou- tant à la solution une petite quantité d'amide nicotinique ou d'éthanolamide gentisique, ou en ajustant le pH d'abord à 9, par l'addition d'hydroxyde de sodium, puis à 4,5 par l'addition d'acide acétique.
Au moment où la solution est limpide à pH 4,5 on y ajoute 5 fois son volume d'éthanol; le sel mono- sodique de l'ester monophosphorique de lactoflavine se précipitée Il est sépa- ré par filtration, lavé avec de l'éthanol et de l'éther et séché à 500,C dans le vide. Le produit, pesant environ 4 g, est une poudre de couleur jaune. A une concentration de 25 mg par cm3, il forme une solution aqueuse limpide.