Procédé de préparation du sel sodique de pénicilline cristallisé. La présente invention a pour objet. un procédé de préparation du sel sodique de pénicilline cristallisé.
lie processus d'isolement de la pénicilline (lu bouillon de fermentation comprend habi tuellement l'extraction du bouillon, acidifié et filtré, par un solvant organique, ordinaire ment de l'acétate d'amyle, le traitement au carbone du liquide d'extraction, la purifica tion de ce liquide, par exemple par extraction répétée avec de l'eau ou des solvants organi ques, par adsorption chromatographique ou par d'autres moyens, et l'évaporation à basse température de la, solution aqueuse finalement obtenue du sel sodique de pénicilline, pour obtenir ce sel sous forme amorphe. Ce sel amorphe obtenu par dessiccation à basse tem pérature présente l'inconvénient d'être hygros- copique et relativement instable.
Le sel sodique de pénicilline cristallisé est, par contre, relativement stable et non hygroscopique. De nombreuses méthodes ont été proposées récemment pour obtenir le sel sodique de pénicilline cristallisé. Une de ces méthodes consiste à dissoudre le sel sodique (le pénicilline amorphe dans un alcool ali phatique inférieur et à produire la cristalli sation du sel par addition d'un liquide misci ble avec l'alcool mais ne constituant pas un solvant pour le sel sodique de pénicilline.
Un procédé proposé par la suite consiste à produire la. cristallisation d'une .préparation partiellement purifiée ayant une teneur rela- tivement élevée en pénicilline, en présence d'un sel neutre soluble dans l'eau, à séparer les cristaux obtenus et à les recristalliser dans un solvant organique. Un autre procédé en core consiste à ajouter un agent favorisant la précipitation à une solution aqueuse de pénicilline ou de sels de pénicilline, à extraire les sels de pénicilline du mélange résultant avec un solvant organique non miscible, et à produire la cristallisation d'un sel pur de pénicilline à partir du liquide d'extraction.
Ces procédés de préparation du sel sodi que de pénicilline cristallisé ont l'inconvénient de donner un rendement global peu élevé en substance cristalline, et cette susbtance est rarement à la fois pure et pratiquement in colore. La présente invention permet d'obtenir le sel sodique de pénicilline cristallisé, pur et blanc, avec de bons rendements.
On a. trouvé qu'une cristallisation efficace du sel sodique de pénicilline, avec production de cristaux pratiquement purs et blancs, peut être obtenue seulement par la combinaison de certaines opérations dont l'importance n'a pas été comprise jusqu'ici, soit qu'on les envisage seules, soit qu'on envisage leurs combinaisons, et que l'inclusion de ces opérations dans le processus de purification est d'une importance capitale pour obtenir de bons rendements.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on extrait la pénicilline d'un bouil lon de fermentation acidifié contenant de la pénicilline, par un solvant organique, en ce qu'on transforme la pénicilline contenue dans l'extrait en le sel sodique de pénicilline amor phe par adjonction d'un composé alcalin du sodium, en ce qu'on prépare une solution de ce sel sodique amorphe dans un mélange d'eau et de butanol normal, le sel ap'ant une acti vité d'au moins 800 unités internationales de pénicilline par mg,
en ce qu'on traite cette solution avec du charbon activé en quantité au plus égale à 10 % du poids de la. solution, en ce qu'on sépare ensuite le charbon de la solution, en ce qu'on ajuste le pH de la solu tion â une valeur comprise entre 5,0 et 7,5, en ce qu'on évapore la solution ainsi obtenue en maintenant la teneur en eau de la.
solution à une valeur d'au moins 5 % en volume jus- qu'à ce que la concentration en sel sodique de pénicilline soit. au moins de 15 mg par eni-3, en ce qu'on poursuit ensuite l'évaporation de la solution sans adjonction d'eau jusqu'à ce que la cristallisation du sel sodique se pro duise et en ce qu'on recueille le sel sodique de pénicilline cristallisé.
Il est nécessaire que le solvant organique utilisé pour dissoudre le sel sodique amorphe de pénicilline soit une solution aqueuse de butanol normal, et ensuite que le sel sodique de pénicilline amorphe sou mis à la cristallisation ait une activité d'au moins 800, et de préférence d'au moins 1000 unités internationales de pénicilline par milligramme. On a trouvé, d'une part, qu'avec des solvants organiques autres que le butanol normal, les rendements obtenus en cristaux de sel sodique de pénicilline sont. notablement ré duits, et, d'autre part, que si la pureté du sel amorphe soumis à la. cristallisation est infé rieure à celle indiquée ci-dessus, l'efficacité du procédé de cristallisation est diminuée et le produit obtenu est moins pur.
En outre, bien que le traitement au charbon n'ait pas une influence notable sur la pureté du sel so dique de pénicilline cristallisé finalement ob tenu, il permet d'éliminer des petites quan tités de certaines impuretés qui peuvent agir comme des inhibiteurs de cristallisation et dont. la présence doit être évitée pour avoir une cristallisation satisfaisante du sel.
De plus, la solution doit être pratiquement neutre, son pH étant compris entre 5,0 et 7,5 et de préférence entre 6,4 et 6,6, car il peut se pro duire une décomposition clé la pénicilline à des pH plus acides ou plus alcalins en pré sence de butanol normal. Enfin, la concentra tion en pénicilline dans la solution de butanol normal doit être d'au moins<B>15</B> mg par milli litre, et de préférence de \?5 à 70 mg par milli litre avant de laisser cristalliser le. sel sodique de pénicilline.
Le butanol normal humide est un solvant pour le sel sodique de péni cilline amorphe, tandis que le butanol normal anhydre ne dissout pratiquement pas ce sel. Il est évident par conséquent qu'en évapo rant une solution du sel sodique (le péni cilline amorphe dans du butanol normal hu mide, l'eau s'élimine sous forme d'un mélange azéotropique avec une partie chi butanol nor mal, ce qui entraîne la eristallisation ou la précipitation du sel sodique de pénicilline du butanol normal anhydre résultant.
Afin d'évi ter le plus possible la. destruction de la péni eilline pendant. le stade d'évaporation, il est avantageux d'effectuer cette évaporation par au moins deux passages dans un évaporateur à couche mince, en ajoutant de l'eau à la solution du sel sodique de pénicilline amorphe dans le butanol normal avant claque passage dans l'évaporateur, de manière due la teneur en eau de cette solution ne tombe pas au- dessous de 5% en volume,
jusqu'à ce que la solution ait été concentrée à la valeur indi quée avant la cristallisation. Il est avanta geux de recristalliser le sel sodique de péni cilline cristallisé obtenu en premier lieu.
Les pH de la solution sont déterminés en diluant un échantillon de la solution avec dix fois son volume d'eau distillée, et en mesurant le pH de la solution obtenue.
L'ajustage du plI de la solution peut. se faire en ajoutant un acide quand orr vent réduire la valeur du pll, ou un composé alca lin du sodium, tel que l'lrvdroxvde, le carbo nate out le bicarbonate de sodium, quand ort désire augmenter la, valeur du pH.
Le traitement au charbon de la solution peut se faire, par exemple, en brassant la solu tion avec 4 1/o en poids du produit marque Actibon C ou d'un autre charbon activé, en séparant le charbon par filtration et en le lavant sur le filtre avec du butanol normal, la première fraction de lavage étant ajoutée au filtrat, et les autres fractions étant utilisées pour le premier lavage et les lavages subsé quents d'une autre charge de charbon.
Il faut noter due toutes les opérations de distillation et. d'évaporation intervenant dans le présent procédé et portant sur des solutions contenant. de la pénicilline peuvent être effec- tnées à pression réduite, selon la pratique ordinaire, pour éviter une décomposition de la pénicilline. Une pression clé moins de 50 mm <B>11-</B> s'est montrée satisfaisante.
L'évaporateur à. couche mince utilisable pour l'évaporation de la solution aqueuse dans le biitanol normal. du sel sodique amorphe petit être un évaporateur à couche ascension nelle d'un type usuel, avant un débit suffi samment élevé pour réduire, sinon suppri mer, la destruction de la pénicilline due à de longues périodes clé contact. avec le butanol normal à, température élevée.
On poursuit l'évaporation de la solution jusqu'à atteindre une concentration en sel d'au moins 15 mg par millilitre (soit, par exemple, 25 000 uni tés par millilitre), et clé préférence comprise entre 4-0 et 60 mg, et pendant cette eoneen- tration on ajoute, si nécessaire, une quantité déterminée d'eau à la solution aqueuse de bntanol avant.
chaque passage dans l'évapora teur, (le manière que la teneur en eau de la solution ne tombe pas au-dessous de 5 % en volume, pour éviter qu'une cristallisation pré maturée du sel sodique de pénicilline ne se produise et pour réduire la décomposition du sel<B>(le</B> pénicilline qui est beaucoup plus lente en présence d'eau.
La concentration en eau peut être avantageusement. de 20 % en vo- lume avant chaque passage. Quand la concen tration du sel (le pénicilline dans la solution a atteint au moins<B>15</B> nig par millilitre pen dant le stade de concentration, la cristalli sation peut s'effectuer par un ou plusieurs passages supplémentaires de la solution dans l'évaporateur et sans addition d'eau.
Ces pas sages finals de la solution concentrée à tra- vers l'évaporateur peuvent être prévus, par réglage de la concentration de la solution, de la température et de la vitesse d'écoulement, clé manière que la cristallisation du sel sodi que de pénicilline se produise dans un organe collecteur et. non dans le tube d'évaporation. La liqueur-mère séparée peut être passée à nouveau dans l'évaporateur, afin d'augmenter le rendement en sel cristallisé.
Il faut. noter que la solution concentrée obtenue après plusieurs passages dans l'évapo rateur peut être évaporée plus avant par sim ple distillation ou évaporation sous pression réduite pour effectuer la cristallisation du sel sodique de pénicilline, au lieu de passer dans l'évaporateur.
Le sel sodique cristallin et la liqueur-mère peuvent être séparés par filtration, et la liqueur-mère, qui a ordinairement une faible teneur en pénicilline CT et une teneur relative ment haute en pénicilline F, peut être traitée pour récupérer ces pénicillines.
Le sel cris tallisé séparé peut, ensuite être recristallisé, par exemple par dissolution dans une solution aqueuse de butanol normal et par adjonction de butanol normal sec à la solution, de préfé rence en deux fractions au moins et à la tem pérature de 0 C environ, pour amener la concentration de l'alcool à 95-99 % en vo- lume environ, ce qui entraîne la cristallisa tion du sel.
On a constaté que si l'addition de butanol normal .sec se poursuit jusqu'à une concentration finale en butanol. normal de 97 % en volume, en veillant à ce que la cris- tallisation commence avec une teneur en eau aussi haute que possible et que les cristaux se séparent sous formes d'aiguilles, on obtient des cristaux blancs du sel sodique de péni cilline d'une pureté de 100% pratiquement,
avec un rendement. de 72 à 77 % dans ce der- nier stade de recristallisation. Un tel mode de faire donne normalement des aiguilles, mais il peut être nécessaire parfois d'amorcer la cristallisation.
Quand on poursuit l'addition de butanol normal sec jusqu'à une concentra- tion finale de 99 % en volume, le rendement en produit cristallisé peut être augmenté, mais le produit. est aussi plus coloré.
Comme la liqueur-mère séparée à ce stade peut être uti lisée à nouveau à un stade antérieur du pro cédé, par exemple en l'ajoutant à la solution traitée nu charbon, il n'y a pas d'avantage à continuer l'addition de butanol normal sec au- delà d'une concentration de 97 %.
Il faut noter aussi que, bien que la solu tion du sel sodique de pénicilline amorphe dans le butanol normal utilisée puisse être obtenue de différentes manières, il est avanta geux que cette solution provienne de l'extrac tion aqueuse d'une solution du sel sodique de pénicilline dans un solvant organique, telle qu'obtenue dans le procédé ordinaire de pré paration de la pénicilline, suivie d'une extrac tion de l'extrait aqueux par du butanol nor mal.
Ces extractions peuvent se faire avanta geusement en continu à contre-courant dans une tour ou dans un élément à plusieurs étages, la proportion du solvant à l'eau dans chaque extraction étant choisie de manière à assurer une extraction optimum de la péni cilline, tout en évitant une dilution inutile de la solution de pénicilline ainsi traitée.
On a observé que le traitement de la solu tion du sel sodique de pénicilline amorphe dans le butanol normal avec un charbon activé chimiquement, entraîne l'acidification de cette solution et nécessite par conséquent l'ajuste ment du pH à une valeur comprise entre 5,0 et 7,5 et de préférence entre 6,4 et 6,6 avant cle concentrer la solution. Cet ajustement se fait de préférence en ajoutant. à la solution une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium, avant de commencer l'évaporation.
Si, cepen dant, la solution butylique est déjà saturée d'eau, il est impossible de neutraliser la solu tion par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium, et il est. nécessaire, dans ce cas, d'ajouter de l'hydroxyde de so dium aqueux après que la solution a été par tiellement concentrée et déshydratée par un seul passage dans l'évaporateur.
L'exemple suivant expose une mise en oeuvre du procédé selon l'invention. L'activité de la pénicilline est donnée en unités inter nationales, et les pourcentages sont en poids, sauf indication contraire. Exemple: On agite une solution de sel sodique de pénicilline amorphe dans du butanol normal., obtenue comme indiqué plus haut à partir d'un bouillon acidifié, en présence d' Aeti- bon C (charbon activé acide), à raison de 4 parties en poids de charbon pour 100 par ties en volume de la.
solution, on sépare le charbon par filtration et on lave le charbon sur le filtre avec 25 % du volume de la, solu- tion originale de butanol normal.
Le sel sodi que de pénicilline récupéré dans le filtrat et dans la première fraction de lavage représente les 94,7 % du sel original, et la décoloration obtenue dans ce stade est. de 82 0/0.
La solution traitée au charbon est ensuite évaporée par plusieurs passages dans un évaporateur à cou che mince ascensionnelle comprenant un tube d'évaporation en métal 11-1 onel de 61 em de longueur et de 6 mm de diamètre intérieur, et un système de condensation comportant une chemise d'eau en métal 1tlonel de 12,5 mm de diamètre intérieur.
Après le premier passage dans l'évapora teur, on neutralise la solution à un pH de 6,5 au moyen d'une solution d'hydroxyde de so dium. La teneur en eau de la solution est ajustée à une valeur d'environ 20% en vo lume avant chaque passage. Le débit du liquide à travers l'évaporateur est d'environ 6,8 litres/heure. Quand la solution a été con centrée jusqu'à une valeur de 54,3 mg de sel sodique de pénicilline par millilitre, le sel est. cristallisé par trois nouveaux passages de la solution dans l'évaporateur. La substance cris talline est alors séparée par filtration de la liqueur-mère, et consiste en sel sodique de pénicilline d'une pureté de 97 0/0, le rendement étant de 80%.
La liqueur-mère contient. 12,3 mg de sel sodique de pénicilline par milli litre et ainsi le rendement. global en sel sodi que de pénicilline à partir de la solution trai tée au charbon est de 99 0/0.
La substance cristalline séparée est. dissoute dans deux fois son poids d'une solution aqueuse de butanol normal à 88 % en volume environ, et le sel sodique de pénicilline est recristallisé dans cette solution par addition (le butanol normal sec, à 0 C, jusqu'à une eorieentration finale de 97% en volume. La substance cristalline obtenue consiste en sel sodique de pénicilline blanc d'une pureté de 100%,
le rendement étant de 77%. Si l'on tient compte du sel sodique de pénicilline dans la liqueur-mère, qui rentre dans le cycle du procédé où on l'ajoute à la solution traitée au charbon,
on obtient un rendement de 99 % en substance cristalline dans ce stade de reeristal- lisation.