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PREPARATION D'INSULINE INJECTABLE A EFFET PROLONGE ET SON PROCEDE
DE PRODUCTION.
L'importance de la présence de zinc dans diverses préparations d'insuline pour injection sous-cutanée et intramusculaire a fait l'objet d'un certain nombre de tests chimiques, biologiques et cliniques
Ainsi, il est connu que l'effet thérapeutique prolongé peut s'obtenir par injection sous-cutanée dans les lapins d'insuline dissoute, lorsque la solution d'insuline contient de grandes quantités de zinc.
Ainsi,. en vue d'obtenir un effet prolongé important, il est nécessaire d'utiliser des quantités de zinc si importantes (environ 10-200 gamma par unité d'in- suline, correspondant approximativement a 40-800 milligrammes de zinc par 100 cm3 avec-40 unités -internationales d'insuline par cm3) que. par injection dans les êtres humains il y a apparition d'irritation aiguës à l'emplace- ment de l'injection; il est en même temps douteux que des quantités aussi fortes de zinc plissent être administrées quotidiennement sans danger à l'or- ganisme humaine Les préparations d'insuline qui consistent en insuline dis- soute avec addition de zinc n'ont par conséquent pas trouvé d'application clinique pratique quelconque.
Il est également connu.que les préparations d'insuline prota- mine en mélange avec du zinc ont un effet prolongé considérablement plus grand que celui de ces mêmes préparations non mélangées à du zinc. Cette observation s'est avérée de grande importance, et les préparations d'insu- line protamine avec addition de zinc ont trouvé un emploi clinique pratique étendu.
-En outre, il est connu qu'un-certain nombre de métaux ont la propriété de précipiter les protéinesPar exemple, l'hydroxyde de zinc précipité peut servir à la .précipitation- des protéines.'
On a ainsi précipité quantitativement de l'insuline-par addi- tion d'un précipité d'hydroxyde de zinc, obtenu à partir de sulfate de zinc
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avec de la soude caustique, à une solution d'insuline acide. Le précipité d'insuline et de sel de zinc basique a été injecté dans des animaux à titre expérimental, avec pour résultat un effet d'insuline prolongé plus intense que celui obtenu avec de l'insuline ordinaire. Avec de plus grandes quanti- tés de zinc le métal semble toutefois neutraliser l'effet d'insuline.
Ce- pendant on n'a pas'expérimenté l'effet clinique 'de ces précipités et on n'a pas produit de préparations se prêtant à l'usage clinique sur la base des testa biologiques effectués.
Finalement, on a exécuté des tests chimiques sur' l'aptitude de l'insuline précipitée amorphe à retenir le zinc en vue de-la proportion du @ zinc par rapport à l'insuline dans les glandes du pancréas. On a utilisé com- me matière de départ pour ces tests en partie de l'insuline exempte de zinc, et en partie de l'insuline cristallisée.
L'insuline exemple de zinc a été obtenue à partir d'insuline technique ordinaire par un certain nombre de processus de dissolution et de précipitation successifs avec emploi notamment d'hydroxyde d'ammonium et d'acétate d'ammonium comme tampon dans les phases de précipitation, de même que l'acide lactique entre autres dans les phases de dissolution. On a alors déterminé dans quelle mesure une partie d'insuline exempte de zinc est pré- cipitée à diverses valeurs de pH en présence de 9,5 gamma de zinc par unité d'insuline, et dans quelle mesure une partie d'insuline exempte de zinc est précipitée au PH 7,0 en présence de quantités variables de zinc.
On a trou- vé.qu'au PH 7 il faut jusqu'à 10 gamma environ de zinc par unité d'insuline pour obtenir une précipitation totale de l'insuline, et que, même avec cette teneur en zinc, on trouve environ 5-15 % de l'insuline en solution aux va- leurs de PH en-dessous de 7et-allant jusqu' à 4,5.
Dans les tests exécutés avec de l'insuline cristallisée, on dis- sout l'insuline cristallisée dans de l'acide chlorhydrique avec addition de chlorure de zinc en quantités variables, et on ajuste alors.le pH à 6,5 avec de la soude caustique, après quoi on détermine la teneur en zinc du précipi- té résultant. Les essais ont montré que l'insuline amorphe précipitée par réglage au PH 6,5 contient des quantités croissantes de zinc pour une con- centration croissante en zinc'. Aucune de ces suspensions d'insuline amorphe contenant du zinc, formées au cours des essais chimiques mentionnés, n'ont été expérimentées biologiquement ou cliniquement, et aucune de ces suspen- sions ne conviennent pour l'emploi clinique pratique.
La présente invention se rapporte à la production de prépara- tions d'insuline injectables agissant avec effet prolongé, basée sur de l'insuline 'précipitée amorphe. L'invention repose sur les observations chi- miques suivantes:
1) L'insuline précipitée amorphe est non seulement apte à s'unir au zinc,mais aussi à d'autres métaux. Ainsi, si le zinc est remplacé par du cobalt, du nickel, du cadmium, du cuivre, du manganèse ou du fer, on consta- te que ces métaux sont-retenus par l'insuline amorphe d'une manière corres- pondante au zinp, avec pour résultat des-changements correspondants dans la solubilité de l'insuline et dans l'effet biologique modifié obtenu.
2) En ajustant une solution acide d'insuline amorphe ou cristal- lisée à un PH approximatif de 7, il est possible d'obtenir de l'insuline pré- cipitée de manière pratiquement quantitative à l'état amorphe en présence de beaucoup moins de zinc que dans les tests biologiques mentionnés plus haut et dans les tests chimiques dans lesquels on utilise de l'insuline exempte de zinc comme matière première. Suivant l'invention on a donc trouvé que la pré- cipitation quantitative peut déjà être atteinte lorsqu'il y a plus de 0,6 gam- ma environ de zinc par unité d'insuline: On peut encore obtenir des précipita- tions correspondantes par l'emploi des métaux mentionnés plus haut en quanti- té du même ordre que celui de la quantité de zinc spécifiée.
En d'autres mots, il est possible en fait par le réglage du PH aux environs de 7 d'obtenir l'in
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suline précipitée presque quantitativement à l'état amorphe lorsque un ou plusieurs des métaux mentionnés sont présents en quantité telle que la-suspen- sion résultante d'insuline amorphe contienne plus de 2xAxl0-5 milli-équiva- lents environ des métaux mentionnés par cm3 de suspension,, "A" représentant le nombre d'unités internationales d'insuline par cm3 de suspension.
3) De plus, les essais chimiques ont révélés d'une manière sur- prenante qu'il n'est pas possible de produire une suspension insuline zinc suivant l'invention par les procédés connus ordinaires, pour obtenir des pré- parations d'insuline neutres à effet prolongéo Des préparations expérimenta- les, contenant du zinc et de l'insuline, et produites de plus suivant les procédés connus (addition d'un agent isotonique, d'un agent tampon et d'un agent de conservation dans des conditions aseptiques) ont presque le même ef- fet que l'insuline ordinaire et sont en outre instables.
D'autres expérien- ces ont révélé que la cause de ceci doit être attribuée aux tampons ordinai- res au sujet desquels on a constaté qu'ils gênent le processus chimique en- tre le métal et 1-'insuline. Vu qu'il est requis pour l'effet biologique pro- longé que l'insuline soit difficilement soluble à réaction neutre du sang, il est donc nécessaire de connaître les facteurs possibles exerçant une in- fluence sur la formation d'insuline amorphe difficilement soluble ou pouvant neutraliser complètement cette formation.
Le tampon le plus commun, le phosphate, est ainsi inutilisable sauf dans les préparations basées sur le nickel. Les tampons au citrate sont inutilisables en même temps qu'un quelconque des métaux. On mentionnera plus loin des tempons convenables.
Le processus chimique entre insuline et métal, causant l'effet biologique prolongé, est en d'autres mots très sensible envers même de peti- tes additions d'autres substances.
Lors du choix des substances d'addition telles que les substan- ces tampons, les substances isotoniques et les agents de conservation, on doit par conséquent s'assurer que les substances en question aux concentra- tions désirées ne montrent pas une plus grande affinité pour le métal emplo- yé que celle de l'insuline, en sorte que la liaison entre insuline et ion métallique, qui constitue une condition nécessaire préalable pour l'effet biologique diffèré, serait empêchéeo
4) Suivant l'invention on a en outre constaté que les précipi- tés d'insuline amorphe en présence des métaux mentionnés sont seulement stables dans un intervalle de PH bien défini et sont fonction de la quanti- té d'insuline présente à l'état dissous.
Si la valeur du PH n'est pas main- tenue dans un intervalle étroit bien défini,et si on ne prend pas de pré- cautions pour s'assurer qu'une très petite quantité d'insuline seulement soit présente à l'état dissous, l'insuline précipitée à l'état amorphe se transformera à l'entreposage en insuline cristalliséeo En vue d'éviter la transformation en insuline cristallisée, la valeur du PH doit se trouver entre 6-6,5 environ et 8,5 environ. Dans cet intervalle de PH en tout cas moins de 2% de l'insuline, présente se trouve -en. solution.
Lorsqu'on spécifie que la limite inférieure de PH est 6-6,5 environ, la raison en est que la limite inférieure est fonction de la quantité présente des métaux mentionnés, de sorte qu'une valeur plus basse de PH puisse être utilisée avec une quantité croissante de métal. Si par exemple, la teneur en zinc est de 5 gamma par unité d'insuline ou davan- tage, il est alors-possible de descendre jusqu'à 6 environ sans danger de cristallisation tandis qu'avec 2 gamma par unité d'insuline il est seule- ment possible de descendre jusqu'à 6,5 environ.
On peut employer des substances tampons pour assurer le main- tien de la valeur du PH dans l'intervalle mentionnéo Ceci doit être pris
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spécialement en-considération lorsqu'une valeur, de PH est utilisée aux envi- rons de la limite inférieure mentionnée plus haut qui est de 6-6,5 environ, cas où une légère diminution de PH entraine un, danger de cristallisation de l'insuline amorphe.
En conformité avec les observations précédentes}, le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'on produit une suspension d'insuline amorphe dans un milieu de suspension aqueux en présence de un ou plusieurs métaux tels que du zinc, du cobalt, du nickel, du cadmium, du cuivre, du man- ganèse et du fer en concentration telle que la suspension terminée contien- ne plus de 2xAxlo-5 environ de milliéquivalents des métaux mentionnés par cm3 de suspension, "A" représentant le nombre d'unités internationales d'in- suline par cm3 de suspension, et en ce qu'on donne à la suspension une valeur de PH de 6 environ, en évitant en même temps la présence de ces ions qui, à réaction neutre, ont une affinité plus grande pour les métaux mentionnés que celle de l'insuline,
de sorte que moins de 2 % de l'insuline présente dans la suspension se trouve à l'état dissous.
Des tests cliniques ont montré qu'il est possible de cette fa- çon d'arriver à des préparations d'insuline injectables, qui montrent un ef- fet prolongé de 24 heures et plus;, et qui dans la plus part des cas donnent une meilleure utilisation'de l'insuline injectée que ne le font les'prépara- tions d'insuline connues avec un degré de retardatement correspondant, ce qui représente une économie d'insuline.
L'effet clinique obtenu est absolument reproductible, même après que les préparations produites ont été entreposées pendant longtemps. La rai- son de ceci est due à la fois à la valeur du PH des préparations et à la fai- ble quantité d'insuline en solution, ce qui évite la conversion de l'insuline amorphe en insuline cristallisée à l'entreposage ; telle conversion de l'in- suline amorphe en insuline cristallisée aboutirait en fait à un changement considérable de l'effet prolongé des préparations.
Dans la thérapeutique courante du diabète il est de grande impor- tance de réaliser des préparations d'insuline ayant une action thérapeutique telle qu'une seule injection quotidienne suffise à la grande majorité des cas de diabète. Il s'est avéré que les préparations d'insuline produites suivant l'invention répondent à cette nécessité, ces préparations ayant une teneur en métal de 3 x A x 10-5 environ à 18 x A x 10-5environ milliéquivalents par cm3, correspondant dans le cas du zinc à une teneur d'environ 1 à environ 6 gamma par unité d'insuline.
En utilisant une injection par jour il est pos- sible avec des préparations de cette composition d'obtenir un apport d'insu- line convenable durant les heures de la matinée et de l'après-midi et de main- tenir en même temps une quantité suffisante d'insuline pour couvrir la consom- mation d'insuline au cours de la soirée et de la nuit.
En conformité avec ce qui est dit plus haut, le procédé suivant l'invention est caractérisé en outre en ce qu'on donne à la suspension aqueu- se d'insuline amorphe sur une teneur en un ou plusieurs des métaux mention- nés de 3 x A x 10-5 environ à 18 x A x 10-5 environ milliéquivalents par cm3, "A" représentant le nombre d'unités internationales d'insuline par cm3 de sus- pension.
Ceci permet, sans l'emploi de substances étrangères à l'organis- me, d'arriver à des préparations d'insuline possédant un degré prolongé par- ticulièrement convenable, supérieur aux préparations d'insuline connues en ce qui concerne l'utilisation de la quantité d'insuline injectée, et par consé- quent en ce qui concernel'accommodementdu parient à la préparation.
Si l'insuline employée comme matière première contient seulement une petite quantité de métal, on utilise un milieu de suspension aqueux qui contient un ou plusieurs des métaux en question en une quantité combinée par cm3 de plus de 2 x A x 10- environ milliéquivalents
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Comme il est important que la valeur du PH des préparations pro- duites'soit maintenu encore entre'6'environ et 8,5 environ après qu'elles ont été-entreposées pendant un temps plus long, il est'avantageux d'utiliser une-ou plusi-eurs substances tampons pour maintenir la valeur du, % utilisée.
En choisissant le tampon on doit s'assurer que la substance tampon n'intro- duit pas des anions dans le milieu de suspension aqueux qui ont une plus grande affinité pour le métal ou les métaux présents dans la suspension que celle que l'insuline possèdeo Comme exemple de substances tampons utilisa- bles on peut mentionner le tampon acétate, le tampon borate, le tampon bar- biturate de diéthyle et le yampon maléate de même que le tampon phosphate qui, cependant, peut seulement s'employer lorsque le degré de retardement de la préparation est basé sur la présence de nickel.
Suivant la présente invention il est en outre avantageux que le milieu de suspension aqueux ait une valeur de PH de 7 ou qu'on lui commni- que cette valeur. Ceci confère aux préparations résultantes la même acidité que le sang et les fluides des tissus dans l'organisme humain. C'est cette valeur de PH que l'insuline amorphe est également la plus difficilement solu- ble, et par conséquent que les suspensions produites sont les plus stables.
Pour des raisons d'ordre clinique il est préférable d'employer des milieux de suspension isotoniqueo Des substances comme le glucose, le chlorure de sodium ou la glycérine peuvent servir pour rendre les milieux aqueux isotoniques. Cependant, ces substances doivent être seulement consi- dérées comme citées à titre d'exemple. D'autres exemples seront rendus ap- parents à la lecture de la littérature accessible se rapportant à ce domaineo
En ce qui concerne la stabilité des préparations d'insuline il est en outre avantageux d'ajouter un ou plusieurs des agents de conservation utilisés ordinairement pour les liquides d'injection. Le p-hydroxybenzoate de méthyle (nipagin) et le p-hydroxy-benzoate de propyle de même que le mer- curiacétate de phényle sont des exemples de tels agents de conservation.
Le procédé suivant l'invention peut être réalisé en mélangeant les matières premières employées (insuline amorphe, composé métallique, eau distillée et si on le désire la substance tampon, l'agent isotonique et l'a- gent de conservation) dans un ordre quelconque, et en ajustant si nécessaire, la valeur du PH de la composition produite entre 6 environ et 8,5 environ, en opérant d ans des conditions aseptiques si les matières premières sont à l'état stérilisé,par exemple sous forme de solutions stérilisées,tandis que l'on s'assure, au cas ou l'exécution du processus aboutirait à un mé- lange non stérilisé contenant de l'insuline, que l'insuline soit présente à l'état dissous puis on intercale une opération da stérilisation, par exem- ple une filtration des germes,
préalablement à là précipitation de l'insuline dans des conditions aseptiques, et on fait les additions successives, s'il y a lieu d'en faire, dans des conditions de stérilité.
Comme composé métallique on peut employer un sel minéral ou or- ganique tel qu'un chlorure, sulfate, nitrate, ou acétate, ou un hydroxyde, oxyde ou un composé métallique complexe qui, étant ajouté, est présent sous une forme telle que le métal puisse être fixé par l'insuline.
On peut employer de l'insuline cristallisée comme matière pre- mière au lieu d'insuline amorphe mais, dans ce cas, il est de nécessité ab- solue auparavant que l'insuline cristallisée soit mise en solution tandis que l'on effectue le processus.
En outre, il est des plus avantageux que l'insuline soit utili- sée sous forme d'une solution acide d'insuline amorphe ou cristallisée, pour que la précipitation d'insuline amorphe se produise au cours de la prépara- tion elle-mêmeOn obtient ainsi les propriétés physiques les,,plus favora- bles du précipité.
Dans une forme préférée du procédé on mélange une solution aci- de d'insuline avec une solution des autres matières de départ, hormis les sub-
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stances tampons, après quoi on effectue une filtration des germes, et on ajoute ensuite dans des conditions aseptiques une solution stérilisée de sub- stances tampons et, si on le désire, des substances de réglage de PH' en vue d'obtenir une valeur de PH comprise entre 6 environ et 8,5 environ.
Comme indiqué précédemment l'insuline amorphe est capable de fi- xer des quantités variables des métaux mentionnés. Par conséquent., dans le procédé suivant l'invention le processus peut consister aussi à utiliser de l'insuline amorphe avec une teneur telle en métaux intéressés que la teneur en métal de la suspension terminée provienne complètement ou partiellement de l'insuline amorphe utilisée.
Dans ce cas l'insuline amorphe possède avan- tageusement une teneur en métal plus grande que 0,4 milliéquivalents environ par grammeo
Au lieu d'insuline amorphe avec une teneur en métal telle que la teneur en métal de la suspension terminée provienne complètement ou partiel- lement de l'insuline amorphe utilisée,, on peut employer de l'insuline cristal- lisée avec une teneur correspondante en métal, mais dans ce cas l'insuline cristallisée doit se trouver à l'état dissous ou être mise en solution au cours de la préparation pour la précipitation subséquente à l'état amorpheo
Pour expliquer davantage le procédé suivant l'invention, on se rapporte aux exemples mentionnés ci-après qui montrent divers aspects de l'invention sans que cette dernière se limite à ces exemples.
Lorsqu'on emploie les solutions des diverses matières de départ dans l'exécution du procédé de l'invention,il est également possible d'opérer en produisant un certain nombre de stock-solutions stériles quisont utilisées comme base pour la production de diverses préparations par addition de la so- lution de base dans des conditions d'aseptieo
On peut produire par exemple la solution de base suivante: Stock-solution I On dissout 2,18 g d'insuline recristallisée dans 25 cm3 d'acide chlorhydrique 0,1 N; on ajoute de l'eau distillée jusqu'à un volume de 125 cm3.
Stock-solution II : On ajoute à 20 cm3 d'une solution aqueuse de chlorure de zinc contenant 1 % de zinc de l'eau distillée jusqu'à un volume de 125 cm3.
Stock-solution III : On ajoute à 10 cm3 d'une solution aqueuse de chlorure cuivrique contenant 1 % de cuivre de l'eau distillée jusqu'à un volume de 100 cm3.
Stock-solution IV On ajoute à 10 cm3 d'une solution aqueuse de chlorure de nickel contenant 1 % de nickel de l'eau distillée jus- qu'à un volume de 100 cm3.
Stock-solution V : On dissout 1,36 g d'acétate de sodium, renfermant 3 moles d'eau de cristallisation., dans de l'eau distillée jusqu'à un volume de 100 cm3.
Stock-solution VI : On dissout 1,16 g d'acide maléique dans de l'eau distil- lée jusqu'à un volume de 100 cm3.
Stock-solution VII : On dissout 2,06 g de diéthylbarbiturate de sodium dans de l'eau distillée jusqu'à un volume de 100 cm3.
Stock-solution VIII: On dissout 0,95 g de borax dans de l'eau distillée jus- qu'à un volume de 100 cm3.
Stock-solution IX On dissout 3,58 g de phosphate disodique, renfermant 12 moles d'eau de cristallisation, dans de l'eau distillée jusqu'à un volume de 100 cm3.
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EXEMPLE I.
On mélange 1,3 cm3 de glycérine avec 0,5 cm3 d'une solution dé - nipagin à 25 % dans l'éthanol, et on ajoute 50 cm3 d'eau distillée. Au mélan- ge produit on ajoute, après filtration stérile;, 10 cm3 de la stock-solution I, 2,5 cm3 de la stock-solution IX et 10 cm3 de la stock-solution V, après quoi on ajoute 3,0 cm3 de soude caustique stérilisée 0,1 N, et on complète le mélange à un volume de 100 cm3 avec de l'eau distillée stérilisée.
L'insuline précipite à l'état amorphe lors de l'addition de la soude caustique, et la suspension produite acquiert une valeur de pH = 7.
Elle contient environ 1 gamma de zinc par unité d'insuline.
EXEMPLE II.
Le processus opératoire est le même que dans l'exemple I, en utilisant toutefois une quantité double de stock-solution II avec pour résul- tat que la suspension d'insuline amorphe ainsi obtenue contient environ 2 gam- ma de zinc par unité d'insuline.
EXEMPLE III.
Le processus opératoire est le même que dans l'exemple I, en utilisant toutefois 10 cm3 de stock-solution II et 3,4 cm3 de soude causti- que stérilisée 0,1 N. La suspension d'insuline amorphe ainsi produite a éga- lement 7 comme valeur de pH, mais elle contient environ 4 gamma de zinc par unité d'insulineo EXEMPLE IV
Le processus opératoire est le même que dans l'exemple III, en utilisant toutefois une addition de 2,7 cm3 de soude caustique stérili- sée 0,1 N, avec comme résultat que la suspension d'insuline amorphe obtenue a une valeur de PH égale à 6.
EXEMPLE V.
On mélange 1,3 cm3 de glycérine avec 0,5 cm3 d'une solution de nipagin à 25 % dans l'éthanol, et on ajoute 50 cm3 d'eau distilléeo Au mélan- ge obtenu on ajoute, après filtration stérile 10 cm3 de stock-solution I, 5 cm3 de stock-solution II et 10 cm3 de stock-solution VI, après quoi on ajoute 21,4 cm3 de soude caustique stérilisée 0,1 N puis on dilue le mélange avec de l'eau distillée stérilisée jusqu'à un volume de 100 cm3. La suspen- sion formée cE'insuline amorphe a une valeur de pH égale à 7 et contient en- viron 2 gamma de zinc par unité d'insuline.
EXEMPLE VI.
Le processus opératoire est le même que dans l'exemple V, en utilisant toutefois 10 cm3 de la stock-solution VII, au lieu des 10 cm3 de la stock-solution VI, de même que 4,5 cm3 d'acide chlorhydrique stérilisé 0,1 N au lieu des 21,4 cm3 de soude caustique.
La suspension d'insuline amorphe obtenue a une valeur de PH égale à 7 contient environ 2 gamma de zinc par unité d'insuline.
EXEMPLE VII.
Le processus opératoire est le même que dans l'exemple V, en utilisant toutefois 10 cm3 de stock-solution VIII au lieu des 10 cm3 de . stock-solution VI, et 0,9 cm3 d'acide chlorhydrique stérilisé 0,1 N au lieu des 21,4 cm3 de soude caustique.
La suspension d'insuline amorphe ainsi obtenue a une valeur de PH égale à 7 et une teneur en zinc d'environ 2 gamma par unité d'insuline.
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EXEMPLE VIII
On mélange 1,3 cm3 de glycérine avec 0,5 cm3 d'une solution de nipagin à 25 % dans l'éthanol, et on ajoute 60 cm3 d'eau distillée..
On ajoute au mélange produit, après filtration stérile, 10 cm3 de stock-solution I, 10 cm3 de stock-solution III et 10 cm3 de stock-solu- tion VII, après quoi on ajoute 3,4 cm3 d'acide chlorhydrique stérilisé 0,1 N et dilue le mélange avec de l'eau distillée stérilisée jusqu'à un volume de 100 cm3 .
La suspension d'insuline amorphe ainsi obtenue a une valeur de pH égale à 7 et contient environ 2,5 gamma de cuivre par unité d'insuline.
EXEMPLE IX
On mélange 1,3 cm3 de glycérine avec 0,5 cm3 d'une solution de nipagin à 25 % dans l'éthanol, et on ajoute 50 cm3 d'eau distillée. On ajoute 10 cm3 de stock-solution I, 10 cm3 de stock-solution IV et 10 cm3 de stock-solution IX au mélange produit après autoclavage, après quoi on ajoute 0,5 cm3 d'acide chlorhydrique stérilisé 0,1 N, puis dilue le mélange avec de l'eau distillée stérilisée jusqu'à un volume de 100 cm3.
La suspension d'insuline amorphe ainsi produite a une valeur de PH égale à 7 et contient environ 2,5 gamma de nickel par unité d'insuline.
EXEMPLE X.
On met en suspension 174 mg d'insuline cristallisée dans 2,5 cm3 d'une solution de chlorure de zinc contenant 0,16 % de Zn++, et dissout par une addition au mélange de 10 cm3 d'acide chlorhydrique 0,02 No On ajoute alors 1,3 cm3 de glycérine comme isotonique et 0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin comme agent de conservation, après quoi on effectue une dilution avec de l'eau jusqu'à un volume de 87 cm3 et filtre stérilement la solution.. On ajoute alors 10 cm3 d'un tamon autoclavé, contenant 1,36 % d'a- cétate sodique, 3H2O, après quoi on ajuste le PH a 7 avec 3 cm3 de soude caustique stérilisée 0,1 N.
Le produit obtenu est une suspension d'insuline amorphe de même composition que celle de l'exemple Io EXEMPLE XI
On dissout 174 mg d'insuline cristallisée dans 10 cm3 de HC1 0,02 No On ajoute ensuite la solution suivantes
1,3 cm3 de glycérol 0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin
8 mg de Zn (à l'état de chlorure) de l'eau distillée pour complèter à 80 cm3.
Le mélange est filtré stérilement, après quoi on ajoute un mé- lange autoclavé consistant en 3, 0 cm3 de NaOH 0,1 N
1,36 mg d'acétate de sodium, 3 H2O de l'eau pour complèter à 10 cm3.
La suspension d'insuline amorphe ainsi produite a la même composition que la suspension de l'exemple II.
EXEMPLE XII,.
On dissout 174 mg d'insuline cristallisée dans 10 cm3 de HC1 0,02N contenant 16 mg de Zn à l'état de chlorure, puis on filtre stérilement la solution. On prépare alors une solution contenant
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136 mg d'acétate de sodium, 3 H2O 1,3 cm3 de glycérol
0,5cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin
3,4 cm3 de NaOH 0,1N de l'eau pour compléter à 90 cm3
Cette solution est ensuite filtrée stérilement, après quoi on mélange les deux solutions filtrées stérilement dans des conditions asepti- queso La préparation ainsi produite a la même composition que celle de l'exemple III.
EXEMPLE XIII
On met en suspension 4000 unités internationales d'insuline amorphe dans 10 cm3 d'une solution de chlorure de zinc contenant 0,16 % de Zn++. On dissout le tout ensuite par addition de 10 cm3 de HC1 O,lNo On ajou- te 1,3 cm3 de glycérol comme isotonique et 0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin comme agent de conservation., On effectue ensuite une dilu- tion jusqu'à 90 cm3 avec de l'eau et on effectue une filtration stérile, après quoi on ajoute 10 cm3 de NaOH 0,1 N autoclavé-e contenant 136 mg d'acétate de sodium, 3H2O. Finalement on ajuste le pH à 6 avec-0,07 cm3 de NaOH stérilisée 1n.
Par ce procédé on obtient une préparation de même composition que celle de l'exemple IV.
EXEMPLE ni[
On met en suspension 4000 unités internationales d'insuline amor- phe dans 5cm3 d'une solution de chlorure de zinc contenant 0,16 % de zinc, puis dissout avec 3 cm3 de HCI 0,02N et 10 cm3 d'une solution d'acide maléi- que à 1,16 %. On ajoute alors 1,3 cm3 de glycérol, 0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin de même que de l'eau pour compléter à 80 cm3. On filtre stérilement la solution, après quoi on ajuste le pH à 7 avec 20 cm3 de NaOH stérilisé 0,1N.
La préparation ainsi produite a la même composition que celle de l'exemple V.
EXEMPLE XV.
On met en suspension 4000 unités internationales d'insuline amor- phe stérilisée dans le milieu de suspension filtré stérilement ci-dessous.
8 mg de zinc (à l'état de chlorure)
206 mg de diéthylbarbiturate de sodium
1,3 cm3 de glycérol 0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin
6,5 cm3 de HCl 0,1 N de l'eau pour compléter à 100 cm3.
La suspension d'insuline amorphe ainsi produite a une valeur de PH égale à 7 et contient environ 2 gamma de zinc par unité d'insuline.
EXEMPLE XVI.
On met en suspension 4000 unités internationales d'insuline amorphe stérilisée dans le milieu de suspension filtré stérilement ci-des- sous:
8 mg de zinc ( à l'état de chlorure)
95 mg de borax
1,3 cm3 de glycérol
0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin
2,9 cm3 de HC1 0,1N de l'eau pour compléter à 100 cm3.
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La préparation ainsi produite a la même composition que celle de 1-'exemple VII.
EXEMPLE XVII.
On dissout 4000 unités internationales d'insuline amorphe dans une solution comportant
10 mg de cuivre ( à l'état de chlorure)
5,4 cm3 de HCl 0,1 N
1,3 cm3 de glycérol
0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin -de l'eau pour compléter à 90 cm3 On filtre la solution stérilement, après quoi on ajoute 10 cm3 de diéthylbar- biturate de sodium stérilisé à 2,06 %.
La suspension d'insuline amorphe produite a la même composition que celle de l'exemple VIII .
EXEMPLE XVIII.
On met en suspenion 174 mg d'insuline cristallisée dans 10 cm3 d'une solution de chlorure de nickel contenant 0,1 % de nickel, puis on dis- sout avec 2,5 cm3 de HC1 0,1 No On ajoute alors 1,3 cm3 de glycérol et 0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin puis dilue,avec de l'eau jusqu'à 95 cm3.
On filtre stérilement la solution, après quoi on ajoute 5 cm3 de tampon auto-
EMI10.1
clavé contenant 358 >g de NaHP 4' 12 HzOa
La préparation ainsi produite a la même composition que celle de l'exemple IX.
EXEMPLE XIX.
On mélange 200 mg d'insuline amorphe (20 unités internationales par mg) contenant 2,3 % de zinc, avec:
2,5 mg d'une solution de ZnC12 contenant 0,16 % de zinc.
3 cm3 de HC1 0, 02 N
1,3 cm3 de glycérol
0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin
10 cm3 d'acide maléique à 1,16 % de l'eau pour compléter à 80 cm3.
On filtre la solution stérilement, après quoi on ajuste le p à 7 avec 20 cm3 de NaOH stérilisée 0,1N. H
La préparation a la même composition que dans les exemples 14 et 5.
EXEMPLE XX.
On mélange 200 mg d'insuline amorphe (20 unités internationales par mg) contenant 5 % de eu.++, avec :
5,4 cm3 de HCl 0,1N
1,3 cm3 de glycérol
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D9 5 . em3 de -oipagin jdans -1? esprit de vin de l'eau pour compléter à 90 cm3.
On filtre stérilement la solution d'insuline produite, après quoi on ajuste le PH à 7 avec 10 cm3 d'une solution à 2,06 % de diéthylbarbiturate de sodium stérilisée, ce qui provoque la précipitation de l'insuline à l'état amorphe.
La préparation a la même composition que dans les exemples 17 et 8.
EXEMPLE XXI.
On met en solution 174 mg d'insuline cristallisée contenant 2,7% de Zn, dans :
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10 cm3 diacide maléique à 1,16 %
1,3 cm3 de glycérol
0,5 cm3 de nipagin à 25 % dans l'esprit de vin
0,8 cm3 de HCl 0,1N de l'eau pour compléter à 80 cm3.
On filtre stérilement la solution, après quoi on élève le PH à 7 avec 20cm3 de NaOH stérilisée 0,lN, ce qui provoque la précipitation de l'insuline à l'état-amorphe. La suspension d'insuline produite a une valeur de PH égale à 7 et contient environ .1 .gamma-de zinc par unité d'insuline.
REVENDICATIONS. la Procédé de 'production de préparations d'insuline injecta- bles à effet prolongé, caractérisé en ce qu'on produit une suspension d'in- suline amorphe dans un milieu de suspension aqueux en présence de un ou plu- sieurs métaux tels que du zinc, du cobalt, du nickel, du cadmium, du cuivre, du manganèse et du fer, en concentration telle que la suspension terminée contienne plus de 2 x A x 10-5 milliéquivalènts environ des métaux mentionnés par centimètre cube de suspension, "A" représentant le nombre d'unités inter- nationales d'insuline par centimètre cube de suspension et en ce qu'on donne à la suspension une valeur de PH allant de 6 environ à 8,5 environ, en évi- tant en même temps la présence de ces ions qui, à réaction neutre,
ont une affinité plus grande pour les métaux mentionnés que celle de l'insuline, avec comme résultat que moins de 2 % de l'insuline présente dans la suspension se trouve à l'état dissous.