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Publication number: BE570237A
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Description


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   Il est connu de cristalliser de l'insuline dans un milieu   aqueux con-   tenant des ions,'appelés ci-après ions M, d'un ou plusieurs métaux activant la cristallisation (Zn, Cd, Co, Ni et Ou), de préférence le zinc, et ayant un degré pH compris entre 5,5 et 7.Pour la cristallisation, on emploie un produit tampon, d'habitude le phosphate de sodium, le citrate de .sodium, l'acétate ammonique ou l'acétate sodique, En ce qui concerne l'emploi du tampon au phosphate de sodium et le tampon à l'acétate ammonique, on se référera au brevet américain N  2143590 et, en ce qui concerne l'emploi du tampon au citrate de sodium, on se référera au brevet américain n  2626228. Parfois,on emploie également une addition de sol- vants pouvant empêcher la précipitation de l'insuline amorphe.

   Comme solvants de ce genre, il y a, par exemple, l'acétone, les alcools propylique, butylique et amylique. 



   Les cristaux d'insuline ainsi obtenus contiennent des ions M chimi- quement liés dans la structure cristalline elle-même; leur quantité varie suivant les conditions de cristallisation appliquées. Elle peut être exprimée par le nom- bre d'atomes métalliques par cellule unitaire,   c'est-à-dir e   que l'unité cristal- lographique contient 390 atomes d'azote protéinique ; elle peut être également ex- primée par la quantité, en pourcents, de métal dans les cristaux secs ou par la quantité de métal, en équivalents en gr., par   gr:   de cristaux secs. Par cristaux secs, on entend des cristaux dont la teneur en eau est telle que leur teneur en azote protéinique est d'environ 14,2 %. 



   Lorsqu'on emploie un tampon au citrate, les cristaux obtenus devront contenir 2 atomes métalliques par cellule unitaire, soit   0,34 %   de zinc. En ap- pliquant le procédé du brevet américain ? 2143590, suivant lequel on effectue la cristallisation en présence d'un tampon au phosphate de sodium et la recristalli- sation en présence d'un tampon à l'acétate ammonique, sans addition d'ions de zinc, les cristaux recristallisés contiendront 3 atomes de zinc par cellule uni- taire des cristaux, soit   0,52   de zinc. 



   Si l'on cristallise l'insuline dans une solution en absence de pro- duits précipitant le   zinc;'- comme   par exemple les ions de phosphate, ou des pro- duits formant des composés complexes de zinc, par exemple des ions de citrates, tout en employant, par exemple un tampon à l'acétate de sodium, les cristaux ob- tenus contiendront, si l'on emploie une teneur suffisamment élevée en ions M dans le milieu de cristallisation, jusqu'à 5 atomes métalliques par cellule unitaire, ce qui, pour autant qu'il s'agisse du zinc, correspond à une teneur en zinc d'en- viron   0,8     %.   



   Si le milieu de cristallisation possède une concentration élevée en ions M de telle sorte qu'un cristal d'insuline, qui s'y trouve en suspension, contienne plus d'environ 6 atomes métalliques par cellule unitaire, les cristaux d'insuline ne se formeront que très lentement ou pas du tout. 



   Les cristaux d'insuline obtenus de ces différentes manières ont une structure rhomboédrique et la forme de mâcles, d'"étoiles" ou de rhomboèdres dé- formés, lorsque l'insuline provient du pancréas du boeuf ou du veau. 



   Il est à noter qu'en employant de l'insuline provenant du pancréas du boeuf ou du veau, on peut obtenir des cristaux d'insuline ayant la forme de rhomboèdres à arêtes vives et à faces planes, si le milieu de cristallisation con- tient des ions d'halogène, par exemple sous forme d'addition de chlorure de so- dium, en une forte concentration appropriée   (cnfo   brevet ? 520.686). Les cris- taux de ce genre n'entrent pas en considération dans la présente description. 



   On a mis des cristaux d'insuline ayant une teneur en zinc de 0,52 %, en suspension dans de l'eau distillée et on les a injectés à des lapins, (voir,   JoPharm.   58, 93-104, 1936). On a trouvé que l'effet se distinguait très nettement de l'action brève et rapide d'une solution de cristaux. Si,'d'autre part, on ajou- te des ions M, en quantité appropriée, à la suspension cristalline, on obtiendra, de façon connue, un effet très prolongé, les cristaux en suspension se combinant 

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 en réaction neutre (pH du sang),avec les ions M, tout en formant un composé insu- line-métal légèrement soluble, se   résorbât   lentement et contenant au moins 5-6   @   atomes métalliques par cellule unitaire (voir p.ex.

   Science, Vol. 116, N    3015,   
394-398 (1952). ' 
A présent, on a montré, de façon surprenante, qu'il n'y a pas de con- dition pour obtenir un effet très prolongé des suspensions   cristallines' d'insuli-   ne et que cette   absorption   des métaux activant la cristallisation par les cris- taux d'insuline se produit à un pH 7 de la suspension. 



   La présente invention, se rapportant à un procédé de préparation de suspensions cristallines d'insuline ayant un effet prolongé, est basée sur les découvertes suivantes : 
Si l'on met les cristaux d'insuline de boeuf ou de veau du type préci- té, en suspension dans un milieu aqueux ayant un pH de 5,5 et une composition tel- le que la teneur en ions M libres de la suspension obtenue soit faible, à tel point que, pour un pH 7 du milieu, les cristaux d'insuline contiennent moins de 
5-6 atomes métalliques par cellule unitaire, on constatera que cette suspension n'exerce pas un effet prolongé remarquable. Si, d'autre part, la suspension est réglée à un pH 7, on constatera, de façon surprenante, que l'action de la suspen- sion est fortement prolongée.

   Cette constatation est la plus surprenante pour les propriétés des cristaux d'insuline obtenus à partir du pancréas du porc. Si l'on prépare une suspension du type précité à partir d'insuline de porc et si on la règle à un pH de 5,5 cette suspension n'exercera pas un effet prolongé et il en se sera de même si   l'on   change le pH en le réglant à 7, les cristaux d'insuline de porc se dissolvant en procédant de la sorte. 



   De plus, on a trouvé que la durée d'action des suspensions aqueuses de cristaux d'insuline de boeuf ou de veau augmentera si ces suspensions sont stockées pendant une période prolongée à la température ambiante ou à des tempé- ratures plus élevées et si elles ont un pH sensiblement inférieur à 7 ; d'autre part, il n'y aura pas de changement important dans la durée d'action si les sus- pensions ont un pH d'environ 7 (6,5 à 7,5). Une préparation d'insuline doit être stable; des essais effectués ont montré que ces suspensions sont stables à un pH d'environ 7 (6,5 à 7,5) et uniquement dans cette gamme de pH. 



   D'après les constatations ci-dessus, le procédé de la présente inven- tion, suivant lequel on prépare une suspension de cristaux d'insuline dans un mi- lieu pouvant être injecté, est caractérisé en ce qu'on emploie des cristaux d'in- suline provenant du pancréas du boeuf ou du veau et ayant une structure rhomboé-   drique   et la forme de mâcles, d'"étoiles" ou de rhomboèdres;

   ce procédé est éga-   lement   caractérisé en ce qu'on emploie un milieu aqueux ayant ou auquel on a don- né un degré d'acidité tel que le pH de la suspension soit d'environ 7 (6,5 à 7,5), tout en se composant également d'ions de métaux activant la cristallisation de l'insuline et de produits, comme par exemple des produits tampons, liant ces ions, de telle sorte que les cristaux d'insuline en suspension, à un pH 7 du milieu, contiennent 5-6 atomes maximum de ces métaux par cellule unitaire, soit, au maxi- mum, 0,25 à 0,30 milli-équivalent de métal par gr. de cristaux secs. 



   On peut effectuer le procédé en mettant les cristaux d'insuline, pré- alablement préparés, en suspension dans un milieu aqueux pouvant être injecté, 
Dans ce cas, il est préférable d'employer des cristaux d'insuline n'ayant pas été préalablement soumis à l'un ou l'autre séchage, car on a constaté qu'un procédé de séchage diminuait la durée d'action des suspensions. 



   Toutefois, il convient mieux d'effectuer la cristallisation de ]insu- line dans des conditions stériles et de donner, au milieu de cristallisation, une composition telle qu'il puisse être injecté, de sorte que, suivant la présen- te invention, on utilise la liqueur mère des cristaux comme milieu de cristalli- sation, auquel on a ajouté l'un ou l'autre produit manquant, comme par exemple ;l'eau, les isotoniques et les agents de conservation. 

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   La durée d'action des   suspensions   obtenues dépend de la grosseur des; cristaux d'insuline en   suspensiong   la duxée d'action étant réduite si la grosseur des cristaux diminue. Suivant la présente invention, on emploie, de préférence, des cristaux d'insuline d'une grosseur prédéterminée et uniforme allant jusqu'à environ 40   #.   On peut régler la grosseur des cristaux, par exemple en appliquant les procédés faisant l'objet des brevets N    533.252   et 533.298. 



   Il est préférable d'utiliser un milieu aqueux ne contenant pas des produits liant des ions M libres, par exemple des produits tampons, la teneur to- tale en ions M de la suspension obtenue atteignant, dans ce cas, au maximum 13 x, A x 10-3 milli-équivalents par litre, A indiquant le nombre d'unités d'insuline par millilitre. 



   Les suspensions cr,istalline d'insuline obtenues suivant la présente invention possèdent un effet initial supérieur à celui obtenu avec les suspensions aqueuses cristallines connues d'insuline contenant, en outre, de l'insuline amor- phe en suspension et ayant une teneur supérieure en ions de zinc, de telle sorte que,les cristaux d'insuline en suspension, à un pH 7 du milieu de suspension, con- tiennent environ   2,3 %   de zinc. 



   Si l'on veut obtenir un effet initial plus élevé avec les suspensions cristallines d'insuline préparées suivant la présente invention, on peut employer une addition d'une solution   d'insuline   provenant du pancréas du pancréas du porc, cette solution ayant le même degré pH. La stabilité des suspensions n'en est pas influencée au cours du stockage. 



   L'exemple ci-après illustre le procédé suivant la présente invention. 



  Exemple. 



   On met 3,48 gr. de cristaux d'insuline de boeuf, contenant   0,78 %   de zinc, en suspension dans 100 millilitres d'eau et on les dissout en ajoutant 4 millilitres de HC1 1N. On filtre la solution dans des conditions stériles et on la dilue jusqu'à 150 millilitres avec de l'eau stérilisée. A cette solution, on ajoute 50 millilitres de 0,4 mole d'acétate de sodium contenant de l'hydroxyde de sodium en quantité telle que le mélange atteint un pH = 5,5. Après le mélange, l'insuline se cristallise tout en étant agitée lentement pendant environ 24 heu- res.

   Ensuite, on dilue la suspension en ajoutant 1800 millilitres d'une solution de benzoate p-hydroxy-méthylique contenant   0,11 %   de benzoate   p-hydroxy-méthyii-   que et 14 gr. de chlorure de sodium et du NaOH en quantité telle que le pH de la suspension finale sera de 7,3/7,4. 



   Au lieu d'employer un tampon d'acétate de sodium comme dans l'exemple ci-dessus, on peut employer un tampon de phosphate de sodium ou de citrate de so- dium. On peut également utiliser des cristaux d'insuline ayant une plus faible teneur en zinc ou des cristaux d'insuline contenant des métaux activant la cris- tallisation, autres que le zinc. 



   De plus, on peut également ajouter, au milieu de suspension   aqueux? .   des ions supplémentaires de métaux activant la cristallisation. 



   REVENDICATIONS.

Claims

1.- Procédé de préparation de suspensions cristallines d'insuline ayant un effet prolongé, et suivant lequel,on- prépare une suspension de cristaux d'insuline dans un milieu aqueux pouvant être injecté, caractérisé en ce qu'on emploie des cristaux d'insuline provenant du pancréas du boeuf ou du veau et pos- sédant une structure rhomboédrique et ayant la forme de macles, d'"étoiles" ou de rhomboèdres déformés, et en ce qu'on emploie un milieu aqueux ayant ou auquel on a donné un degré d'acidité tel que la valeur du pH de la suspension soit d'en- viron 7(6,8 à 6,5), tout en se composant d'ions de métaux activant la cristallisa- tion de l'insuline et de produits liant ces ions, par exemple des produits tampons, de telle sorte que les cristaux d'insuline en suspension, à un pH 7 du milieu, <Desc/Clms Page number 5> contiennent,

au maximum, 5-6 atomes de ces métaux par cellule unitaire, soit, au maximum, 0,25 à 0,30 milli-équivalent de métal par gramme de cristaux' secs.

2.- Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on uti- lise des cris faux d'insuline n'ayant pas été soumis préalablement à l'un ou l'autre procédé de séchage.

3.- Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on utilise, comme milieu de suspension pour les cristaux, la liqueur-mère des cris- taux, à laquelle on a ajouté l'un ou l'autre produit manquant, comme par exemple l'eau, des isotoniques et des agents de conservation.

4.- Procédé suivant les revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise des cristaux d'insuline d'une grosseur prédéterminée et uniforme.

5.- Procédé suivant les revendications 1 à 4, caractérisé en ce que, pour obtenir un effet initial, on ajoute une solution d'insuline provenant du pancréas du porc, cette solution ayant le même degré pH.

6.- Procédé de préparation de suspensions cristallines d'insuline ayant un effet prolongé;, principalement comme décrit ci-dessus en se référant par- ticulièrement à l'exemple.

7.- Préparation d'insuline ayant un effet prolongé et contenant une suspension de cristaux d'insuline provenant du pancréas du boeuf ou du veau, pos- sédant une structure rhomboédrique et ayant la forme de mâcles, d'"étoiles" ou de rhomboèdres déformés, dans un milieu aqueux pouvant être injecté et ayant un pH d'environ 7 (6,5 à 7,5), les cristaux d'insuline en suspension, à un pH 7 du mi- lieu, contenant, au maximum, 5-6 atomes de métaux activant la cristallisation de l'insuline par cellule unitaire, soit, au maximum, 0,25 à 0,30 milli-équivalents de métal par gramme de cristaux secs.