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L'invention concerne un procédé pour la production de nouveaux produits synthétiques constitués par les esters phosphoriques de dextrane naturel ou partiellement décomposé ;les composés obtenus suivant la pré- sente invention correspondent à la formule générale
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dans laquelle R représente la molécule simple du dextrane, n = 1,2 ou 3 et n' > 1.
Ces composés peuvent être sous forme de sels et présenter divers degrés d'estérification (de 1 à 3 hydroxyles estérifiés pour chaque molécu- le simple). Les composés partiellement décomposés ont un poids moléculaire compris entre 50.000 et 60.000. (Par exemple, en se référant à la formule ci-dessus, pour n =¯3, n'est d'environ 9 pour un poids moléculaire de 5000 et d'environ 11 pour un poids moléculaire de 60.000).
Les composés conformes à la présente invention (et ceux , par exemple les esters phosphoriques du lactose, obtenus conformément au brevet français déposé le 1er février 1956 par la demanderesse pour ' Procédé d'obtention d'esters phosphoriques du lactose") sont les premiers produits synthétiques qui puissent être utilisés en thérapeutique en vue d'une action antilipémique (ce qui n'exclut pas d'autres actions plus importantes).
On connaît déjà les esters sulfuriques de polysaccharides, ayant une action thérapeutique :par exemple, les pro- duits connus sous les dénominations de "Treburon" et '"Trombostop" (esters sulfuriques de l'acide polygalacturonique) ; le "Paritol" (ester sulfurique de l'acide polymannurônique) etc... ainsi.que le sulfate de dextrane, qui est toxique, sauf pour certaines dimensions de la molécule.Cependant, de tels esters, déjà connus, ont, à côté d'une action antilipémique (c'est-à- dire une action qui abaisse la teneur en graisse, ou qui émulsifie les grais- ses du plasma sanguin) une action, par-dessus tout, angicoagulante.
L'impor- tance des composés obtenus par le procédé faisant l'objet de la présente invention est due au fait que, bien qu'ils montrent une action antilipémique importante, ils ne sont ni toxiques, ni anticoagulants, de sorte qu'ils conviennent à la thérapie de l'artériosclérose où il est justement très im- portant qu'il n'y ait pas de risque, en raison de l'absence d'action anti- coagulante (c'est-à-dire, absence d'une influence pratique quelconque sur le temps de coagulation), alors 'que les anticoagulants ne peuvent, en raison du danger qu'ils représentent, être employés en thérapeutique comme agents antilipémiques, même s'ils présentent par eux-mêmes une action antilipémique.
On note, en particulier, deux actions physioligiques des produits obtenus par le procédé de la présente invention. L'une se manifeste par une augmentation du taux de migration des lipoprotéines supérieures (c'est-à-dire de celles ayant un poids moléculaire supérieur) ; on a contrôlé cette action par élec- trophorèse sur papier. L'autre se manifeste par une clarification du plas- ma lipémique. On représente un exemple d'une telle clarification dans le diagramme du dessin annexé où l'on donne des courbes de clarification, obte- nues sur le plasma d'un chien auquel on a administré les produits obtenus par le procédé de l'invention, 3 heures après un repas de 'graisse, par injec- tion intraveineuse (courbe 1) et par injection intramusculaire (courbe2).
On indique, en ordonnées les pourcentages de transmission, lus à # = 700m au spectrophotomètre de Beckman, et en abscisses les temps en minutes à par- tir de l'injection desdits produits.Ce diagramme est traduit par le tableau suivant (la colonne de gauche donne pour chaque courbe les valeurs, rappor- tées à un échantillon d'eau auquel on attribue un coefficient de transmis- sion T de 100 pour un rayon de lumière monochromatique).
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On peut résumer comme suit le procédé faisant l'objet de la présente invention :
On purifie d'abord le dextrane à l'alcool et l'acétone et on le rend plus réactif par traitement à la pyridine anhydre, ou on le traite par de l'ammoniaque et du potassium.
Après séchage, on le met en suspension dans de la pyridine anhydre et on traite à basse température (entre-22 et -15 C) par'de l'oxychlorure de phosphore, en quantité de 20 à 40 % supérieure à la quantité stoechiométrique. Il est indispensable d'ajouter le réactif lente- ment et d'agiter vigoureusement la suspension de dextrane dans de la pyridi- ne, car il est important (pour la formation de liaisons intérieures particu- lières d'estérification) qu'une petite quantité de réactif soit en contact avec une grande quantité de la matière à estérifier. On agite alors la sus- pension chaude (à 38 C) pendant 20 heures, puis on la refroidit de nouveau (, -40 C) et on forme le sel de sodium de l'ester par traitement à la soude tout en maintenant la température entre-15 et -5 C.
On sépare la couche la plus épaisse et on la pulvérise, s'il y a lieu, au désintégrateur, puis on précipite le sel de sodium de l'ester phosphorique de dextrane par l'alcool éthylique. On redissout le précipité dans de l'eau, on le purifie par dia- lyse, on le concentre, on le reprécipite à l'alcool éthylique, et on le sè- che. Il est important de maintenir la température entre -22 et -15 C pendant l'addition de POCl., ainsi que de maintenir le bain exactement à 38 C pen- dant les 20 heures pendant lesquelles se fait l'estérification. Il est aus- si indispensable de maintenir la température entre -15 et -5 C pendant l'ad- dition de NaOH ayant pour but d'amener à un pH neutre.
Il est possible d'utiliser, au lieu d'oxychlorure de phosphore, des quantités correspondantes de P2O et d'acide phosphorique..Dans ce cas, le dextrane purifié et activé est mis en aispension dans de la pyridine anhy- dre contenant en solution du P2O5, puis on ajoute, goutte à goutte, de l'aci- de phosphorique, à environ 0 C, on maintient la masse d'abord à température ambiante pendant environ une heure et ensuite au chaud (à environ 40 C pen- dant environ 45 heures. Après refroidissement à 0 C, on amène le pH à 7-7,5 par NaOH, et on sépare le produit comme dans le premier cas.
Le traitement de déshydratation des esters dans un désintégra- teur (désintégrateur mécanique) est nouveau, et, du point de vue technique, il permet de réduire à 1/4 le temps nécessaire pour obtenir le produit pul- vérisé, et à 50 % la consommation d'alcool.
Finalement, il est à noter que les esters libres du type décrit ci-dessus ne sont pas stables, de sorte qu'on les prépare sous forme de leurs sels, en particulier de leurs sels de sodium, comme décrit ci-dessus et dans les exemples suivants. Tous les produits obtenus conformément au procé- dé de la présente invention sont des produits nouveaux. On donne ci-après quelques exemples de préparation des esters phosphoriques de dextrane, exem- ples qui illustrent l'invention et ne sont nullement limitatifs. Dans ces exemples, les rendements sont égaux à 60 % des rendements théoriques. Les poids moléculaires des produits respectifs sont d'environ 60.000, sauf spécifica-
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tion particulière.
EXEMPLE 1.
On met en suspension 40 g de dextrane dans 50 cm3 d'alcool éthy- lique à 99?9 %. On ajoute d'un coup 200 cm3 d'eau, et on agite mécanique- ment le mélange. Lorsque le dextrane s'est gélifié, on ajoute 500 on? d'acé- tone, et on continue l'agitation pendant 20 minuteso Après repos de 30 minu- tes, on sépare le dextrane par filtration, on le traite par 600 cm3 de pyri- dine anhydre, et on agite le mélange pendant 30 minutes. Après avoir lais- sé reposer toute la nuit, on filtre le mélange. On recommence encore deux fois le traitement, d'abord avec 400 cm , puis avec 200 cm3 de pyridine.
Ensuite on sèche le dextrane sous vide à 40 C.
Dans un flacon d'un litre, muni d'un agitateur étanche, d'un en- tonnoir permettant de verser goutte à goutte, et d'un tube rempli de CaCl2, on introduit 30 g de dextrane prétraité comme décrit ci-dessus et 300 cm3 de pyridine anhydre ; on refroidit le mélange avec de la glace sèche à une température de -22 C, et on verse lentement 40 cm de POCl3, par l'entonnoir, en un temps de 55 minutes, tout en maintenant la température entre-22 et -15 C. Lorsque l'addition est terminée, on élève la température de la solu- tion à +4 C en 10 minutes, puis ensuite à +23 C en environ 30 minutes.
On met alors le flacon dans un bain à 38 C et il atteint cette température en 15 minutes.On maintient la suspension à cette température pendant 20 heures tout en l'agitant continuellement.On enlève le bain, on refroidit de nou- veau la solution avec de la glace sèche et, toujours en agitant, on ajoute goutte à goutte une solution de NaOH à 40 % refroidie, tout en réglant cet- te addition de manière à maintenir à maintenir la température de la solu- tion entre -15 et -5 C. Après addition de 40 cm3 de NaOH, on ajoute 300 cm3 d'eau, par petites quantités, pour élever la température à 0 C. On ajoute encore delà soude jusqu'à ce que l'on ait atteint un pH de 7-7,5. On continue à agiter la masse à température ambiante pendant 60 minutes, puis on chauffe à 30-32 C, pendant 10 minutes.
Ensuite on filtre et on introduit la masse dans un entonnoir à séparation ; après enlèvement de la couche supé- rieure, on traite la couche inférieure par de l'éthanol à 99 %. Il se forme d'abord une huile, qui se transforme en une pâte ; on enlève les liqueurs- mères par décantation, et on traite de nouveau la pâte par de l'éthanol à 99 % et on l'introduit dans un désintégrateur ;elle se transforme ainsi en une poudre que l'on sépare par filtration, redissout dans une petite quan- tité d'eau et reprécipité par l'éthanolo Le précipité est redissous dans l'eau et dialysé pendant 120 heures dans de l'eau courante. On concentre alors la solution jusqu'à un faible volume, sous vide, à 40 C, et on préci- pite par l'alcool éthylique.
On sèche le précipité sous vide, à °0 Ce On obtient ainsi le sel de sodium de l'ester phosphorique de dextrane. C'est une poudre blanche inodore et insipide, qui, par chauffage, se décompose sans fondre. Par hydrolyse suivant des procédés connus, elle donne des molé- cules simples de glycose liées avec des liaisons a 1,6 et a 1,4. L'analyse donne s C= 13,5 ; H = 1,3 % ; Na = 25,9 ; P = 17,4 %, ce qui correspond à 3 groupes hydroxyle estérifiés pour chaque molécule simple.
Au lieu de purifier la matière de départ (dextrane) et la rendre plus réactive par traitement par la pyridine, comme décrit ci-dessus, on peut opérer comme suit, avec l'ammoniaque et le potassium
On dissout 38 g de dextrane dans de l'ammoniaque liquide à une température de -50 C. On ajoute, par petites quantités, 6,2 g de potassium métallique, tout en agitant la solution et en attendant, avant de faire une nouvelle addition, que la couleur bleue qui apparaît après chaque addition de potassium ait disparu. L'ammoniaque est évaporée progressivement et les dernières fractions en sont enlevées dans une étuve sous vide à 45 C9 On ef-
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fectue alors l'estérification comme décrit ci-dessus.
EXEMPLE 2.
Dans un flacon d'un litre, muni d'un agitateur étanche et d'un tube de CaCl2, on introduit 10 g de dextrane prétraité par la pyridine comme dans l'exemple 1, et on ajoute 200 cm de pyridine anhydre dans laquelle on a fait dissoudre 6,3 g de P2O5. On met le flacon dans un bain de glace et on ajoute goutte à goutte 1,9 cm.d'acide phosphorique de poids spécifique 1,59, en 20 minutes. On enlève alors le bain de glace et on laisse le flacon à température ambiante pendant 60 minutes.On met ensuite le flacon dans un bain chauffé à 40 C et on l'y laisse pendant 45 heures. Après refroidis- sement à 0 C, on règle le pH à 7-7,5 par de la soude, et on enlève la couche plus dense (inférieure) qu'on traite dans un désintégrateur par de l'alcool éthylique à 99 %.
On sépare par filtration la poudre obtenue, on la redis- sout dans une petite quantité d'eau, on dialyse dans l'eau courante pendant 60 heures et on reprécipite par l'alcool éthylique. On filtre le précipité et on le sèche sous vide à 600C. Ce produit a les mêmes propriétés chimiques que le produit obtenu comme décrit dans l'exemple 1.
EXEMPLE 3.
Dans un;flacon de.1000 cm3 muni d'un condenseur à reflux, on introduit 5 g de dextrane, 200 cm3 d'eau et 40 cm3 d'HCl N. Le mélange est passé au re- flux pendant 8 heures. Après refroidissement on amène la solution au pH 7 avec NaOH N et on la traite par 200 cm3 d'acétone. On centrifuge le résidu et on concentre le liquide séparé sous vide jusqu'à 75 cm3, puis on précipi- te par l'alcool éthylique ; on obtient une fraction a, dont le poids molécu- laire est entre 1000 et 20.000.
On dissout 5 g du solide séparé par centrifugation dans 100 cm3 d'eau, dans un flacon de 500 cm3 muni d'un réfrigérant à reflux, on traite par 10 on? de HC1 N et on passe au reflux pendant 12 heures. Après refroi- dissement, on amène la solution aupH 7 avec NaOH N et on traite par 100 cm d'acétone. On centrifuge le précipité, on le redissout dans une petite quantité d'eau, on reprécipite par l'alcool éthylique et on sèche sous vide on a une fraction b dont le poids moléculaire est supérieur à 60.000.
On concentre le liquide séparé par centrifugation, sous vide, jusqu'à 75 cm3 et on précipite par l'éthanol ; on obtient une fraction c, dont le poids moléculaire est entre 20. 000 et 60.000. On obtient ainsi des fractions de dextrane de poids moléculaires différents. Ceci est important, pour autant que l'actionantilipémique, la toxicité, etc.. varient avec la grandeur de la molécule. Pour des produits obtenus par le procédé de la pré- sente invention, on a trouvé que le poids moléculaire optimum est en général d'environ 20. 000.
EXEMPLE 4.
La fraction ¯a de dextrane, décomposée comme dans l'exemple 3, est soit soumise au prétraitement et à l'estérification comme décrit dans l'exemple 1, soit traitée suivant la technique de l'exemple 2. Le produit ob- tenu a les mêmes propriétés chimiques que celui de l'exemple 1. Le poids mo- léculaire est compris dans les limites indiquées pour la fraction a de l'exemple 3.
EXEMPLE 5.
La fraction b de dextrane, décomposée comme dans l'exemple 3, est traitée suivant la technique de l'exemple 4. Le produit obtenu a les mêmes propriétés chimiques que celui de l'exemple 1. Le poids moléculaire est compris danx les limites indiquées pour la fraction b de l'exemple 3.
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EXEMPLE 6.
La fraction de dextrane, décomposée comme dans l'exemple 3, est traitée suivant la technique de l'exemple 4. Le produit obtenu a les mêmes propriétés chimiques que celui de l'exemple 1. Le poids moléculaire est compris dans les limites indiquées pour la fraction c de l'exemple 3.