CH345976A - Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique - Google Patents
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Description
<Desc/Clms Page number 1>
Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique L'invention se rapporte à la préparation d'un nouveau composé chimique possédant de précieuses propriétés antibiotiques, et de ses sels. Ce nouvel antibiotique sera dénommé dans ce qui suit paroinomycine 5>.
La paromomycine est une substance blanche, amorphe et stable, très soluble dans l'eau, modérément soluble dans le méthanol et peu soluble dans l'éthanol absolu. Elle est optiquement active et a un pouvoir rotatoire [ ]D d'environ -;- 640 (à 1,% dans l'eau).
La paromomycine contient seulement les éléments carbone, hydrogène, azote et oxygène. Elle a la formule
EMI1.19
<Desc/Clms Page number 2>
La paromomycine donne un essai positif à la nin- hydrine, un essai positif Elson-Morgan pour un amino-sucre, un essai négatif pour le maltol après chauffage avec un alcali, et un essai Sakaguchi négatif pour les guanidines.
Le spectre d'absorption dans l'infrarouge de la paromomycine en employant un gâchis d'huile minérale formé de la substance pulvérisée et d'huile minérale, est caractérisé par des sommets d'absorption aux longueurs d'onde de 2,93 et 6,25 microns. La fig. 1 montre le spectre d'absorption de la paromomycine dans l'infrarouge. La paromomycine forme des sels d'addition avec les acides minéraux tels que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique et semblables.
La paromomycine donne un chlorhydrate ayant un pouvoir rotatoire [a]D d'environ -I- 56,5o ( à 1 % dans l'eau). Son pKa est égal à 6,3 et 8,35. Ce chlor- hydrate est plus soluble dans l'éthanol froid que dans l'éthanol chaud.
Le spectre d'absorption du chlorhydrate de paro- momycine dans l'infrarouge en employant un gâchis à l'huile minérale est caractérisé par des sommets d'absorption à des longueurs d'onde de 6,23, 6,61, 6,66, 8,72, 9,53 et 9,70 microns et une inflexion. à 2,95 microns. La fig. 2 montre le spectre d'absorption du chlorhydrate de paromomycine dans l'infrarouge.
La paromomycine forme un sulfate ayant un pou- voir rotatoire [a]D d'environ -I- 50,50 (à 1,5 % dans l'eau). Le spectre d'absorption du sulfate de paromo- mycine dans l'infrarouge en employant un gâchis à l'huile minérale est caractérisé par des sommets d'absorption prononcés à des longueurs d'onde de 6,17 et 6,55 microns, et une inflexion à 3,1 microns.
La fig. 3 montre le spectre d'absorption du sulfate de paro- momycine dans l'infrarouge.
La paromomycine est préparée, selon l'invention, en inoculant un milieu nutritif aqueux stérile ayant un pH entre 6 et 8,5, et contenant une source de carbone assimilable et une source d'azote et des substances minérales, avec du Streptomyces rimosus, forme paromomycinus, en soumettant à l'incubation le milieu inoculé à une température de 20 à 35o C en aérobie, en enlevant les matières solides présentes dans le milieu incubé et en isolant l'antibiotique produit de la solution ainsi obtenue, sous forme de base libre ou sous forme d'un sel d'addition d'acide.
Le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus est un microorganisme inconnu jusqu'ici, qui se rencontre dans les sols. Il a été isolé pour la première fois d'un échantillon de sol pris à Hacienda Tierra- dura, Miranda, Colombie, Amérique du Sud.
On peut obtenir des cultures de ce microorganisme en préparant une, suspension dans de l'eau stérile d'un échantillon du sol le contenant, en laissant les particules plus lourdes se déposer, en étendant la suspension surnageante résultante de ce sol en une série de dilutions sur des plaques d'agar nutritif, en soumettant ces plaques à l'incubation à 24 - 280 C pour produire le développement des microorganismes, et en transplantant des colonies individuelles choisies ressemblant au Streptomyces rimosus forme paromomycinus sur des plaques fraîches d'agar nutritif.
Après sélections répétées et transplantations de colonies non contaminées et caractéristiques sur des plaques frai- ches d'àgar nutritif, on obtient des thalles qui constituent des cultures pures du microorganisme cherché.
Le Streptomyces rimosus, forme paromomycimis a les caractères suivants : quand il s'est développé sur un milieu glycérine-asparagine-agar, le mycélium inférieur est jaune pâle à brun, et le mycélium aérien est blanc ; quand il a poussé sur un milieu amidon synthétique-agar, le mycélium inférieur est brun clair et le mycélium aérien est blanc ; sur un milieu malate de calcium-agar, le mycélium inférieur est jaune brun clair et le mycélium aérien est blanc; sur un milieu agar nutritif, le mycélium inférieur est jaune orange brun clair et il n'y a que peu ou pas de mycélium aérien ;
sur un milieu glucose-tryptone-agar, le mycélium inférieur est jaune clair à brun clair, le mycélium aérien est blanc, et une faible coloration brune apparait dans le milieu d'agar. Les colonies de surface sont élevées, unies, ridées ou plissées, et lézardées dans les aires de croissance épaisse ; souvent l'agar est aussi lézardé. Vus au microscope, les hyphes aériens sont irrégulièrement ramifiés ; les branches latérales sont courtes et incurvées en spirales. Les spirales sont nombreuses sur la plupart des milieux et se trouvent souvent en groupes denses. Les parties distales des hyphes aériens se subdivisent en chaînes de spores.
Le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus liquéfie la gélatine avec formation de peu ou pas de couleur dans le milieu et en général il ne peptonise pas le lait de tournesol. Dans le milieu synthétique d'agar (Pridham and Gottlieb, J.
Bact. 56, 108 (1948)), cet organisme utilise de nombreuses sources de carbone, y compris l'adonite, la cellobiose, la dex- trine, le dextrose, le d-galactose, la glycérine, l'i-ino- site, le lactose, le lévulose, le maltose, la d-mannite, le d-mannose, le mélibiose, la sorbite, l'amidon et le tréhalose ; il utilise moins facilement le l-arabinose, le raffinose et le xylose ;
il n'utilise pas l'esculine, la dulcite, l'inuline, le mélécitose, le rhamnose, la sali- cine et le sucrose. Cet organisme utilise de nombreuses sources d'azote, parmi lesquelles la dl-alanine, la l-arginine, l'acide dl-aspartique, la l-cystine, la l-cys- téine, l'acide 1-glutamique, la glycyl-glycine, la l-his- tidine, la 1-leucine, la l-lysine, la l-phénylalanine, la L-proline, la dl-sérine, la dl-thréonine,
la dl-valine, le sulfate d'ammonium et le nitrate de sodium; il utilise moins facilement la l-hydroxyproline, la dl-isoleucine, la dl-méthionine, le l-tryptophane, la l-tyrosine, la dl- norleucine, l'urée, et le carbonate d'ammonium.
Morphologiquement, le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus ressemble étroitement au Streptomyces rimosus (décrit par Sobin et al, au brevet U.S. 2516080 et conservé sous la désignation
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EMI3.1
<tb> Table <SEP> 1
<tb> Comparaisons <SEP> de <SEP> colorations <SEP> du <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus, <SEP> forme <SEP> paromomycinus
<tb> et <SEP> du <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> NRRL <SEP> 2234,
<SEP> cultivés <SEP> sur <SEP> divers <SEP> milieux <SEP> à <SEP> agar
<tb> Milieu <SEP> Partie <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus
<tb> à <SEP> agir <SEP> caractéristique <SEP> forme <SEP> paromomycinus <SEP> NRRL <SEP> 2234
<tb> Glycérine- <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Jaune <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair <SEP> Jaune <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Asparagine <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> Blanc
<tb> Substratum <SEP> Aucune <SEP> Légèrement <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Amidon <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Brun <SEP> clair <SEP> Brun <SEP> clair
<tb> synthétique <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> (faiblement <SEP> aérien)
<SEP> Blanc
<tb> Substratum <SEP> Aucune <SEP> Aucune
<tb> Malate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Jaune <SEP> brun <SEP> Jaune <SEP> brun
<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> Blanc
<tb> Substratum <SEP> Aucune <SEP> Légèrement <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Milieu <SEP> nutritif <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Jaune <SEP> clair <SEP> - <SEP> brun <SEP> orangé <SEP> clair <SEP> Jaune <SEP> brun <SEP> clair
<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Pas <SEP> de <SEP> myc.
<SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> (faiblement <SEP> aérien)
<tb> Substratum <SEP> Aucune <SEP> Aucune
<tb> Glucose <SEP> Treptone <SEP> Mycélium <SEP> inférieur <SEP> Jaune <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> clair <SEP> Jaune <SEP> brun <SEP> à <SEP> brun <SEP> orangé
<tb> Mycélium <SEP> aérien <SEP> Blanc <SEP> Blanc
<tb> Substratum <SEP> Légèrement <SEP> brun <SEP> clair <SEP> Brun <SEP> clair
NRRL 2234 dans la collection de culture permanente de la Northern Utilization Research Branch à Peoria, Illinois). Ces deux microorganismes présentent des colorations semblables de leurs mycéliums inférieurs et aériens, comme cela est indiqué à la table 1.
Le S. rimosus est quelque peu plus, foncé et colore souvent l'agar plus que ne le fait le Strepto- myces rimosus, forme paromomycinus. Dans les essais d'utilisation du carbone, le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus et le S. rimosus utilisent les mêmes sources de carbone sauf le l-arabinose, que le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus n'utilise que faiblement tandis que le S. rimosus l'utilise bien (Table II).
En ce qui concerne l'utilisation de l'azote, les deux organismes sont semblables (Table III). Microscopiquement, le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus ressemble étroitement au S. rimostrs. Les deux organismes forment des groupes denses de spirales sur des milieux agar et glycérine- asparagine, amidon synthétique, malate de calcium et glucose-tryptone. Sur un milieu d'agar nutritif les deux organismes ne forment que peu de mycélium aérien, et au microscope, leurs filaments aériens sont pour la plupart courts et droits, avec seulement des spirales fortuites.
Avec les deux organismes, la croissance en surface et l'agar se fondent souvent aux endroits de développement épais sur divers milieux agar.
Du fait que le Streptomyces rimosus, forme paro- momycinus ressemble étroitement au S. rimosus, NRRL 2234, morphologiquement et à bien des égards physiologiquement, on conclut que le Strep- tomyces rimosus, forme paromomycinus représente une forme nouvelle et distincte du Streptomyces ri- mosus. Une culture de Streptomyces rimosus, forme paromomycinus est conservée dans la collection de culture permanente du Bureau de Culture de Parke, Davis & Co., Detroit, Michigan, sous No 04998,
et à la Culture Collection of the Fermentation Division (collection de cultures de la Division de Fermentation), Northern Utilization Research Branch, Département de l'Agriculture des U.S., Peoria, Illinois, sous No NRRL 2455.
Pour l'inoculation, on peut employer des spores ou conidies du Streptomyces rimosus, forme paromo- mycinus. Des suspensions aqueuses, de ceux-ci, cou- tenant une faible proportion de savon ou autre agent mouillant, peuvent aussi être utilisées. Pour des fermentations en grand, il est préférable d'employer des cultures vigoureuses et jeunes du microorganisme.
Comme source de carbone assimilable dans le milieu nutritif aqueux, on peut employer soit des hydrates de carbone purs, soit les mélanges d'hydrates de carbone disponibles dans le commerce. Comme exemples de ces substances qui conviennent pour ce but, on peut citer le glucose, le d-mannose, le d-ga- lactose, le sirop de maïs, l'amidon, l'amidon soluble, les liqueurs de malt, les mélasses, les amidons hydrolysés, la glycérine, etc.
La quantité d'hydrate de car- bone présente dans le milieu de culture n'est pas particulièrement critique ; elle peut varier de 0,5 1/o à 5 'o/o en poids du poids total dudit milieu.
La source d'azote dans le milieu nutritif peut être de nature organique, inorganique ou organique- inorganique en mélange. Comme exemples des diverses substances azotées pouvant être employées dans le milieu nutritif, on peut citer les aminoacides, les peptones, les protéines hydrolysées ou non hydrolysées, la farine de poissons, la farine de soya, la liqueur de macération de maïs, des extraits de viande,
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<tb> Table <SEP> II
<tb> Comparaison <SEP> de <SEP> l'utilisation <SEP> du <SEP> carbone <SEP> par <SEP> le <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus, <SEP> forme <SEP> paromomycinus,
<tb> et <SEP> le <SEP> S.
<SEP> rimosus <SEP> NRRL <SEP> 2234
<tb> Sources <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus <SEP> Streptomyces <SEP> rimosus
<tb> de <SEP> carbone <SEP> forme <SEP> paromomycinus <SEP> NRRL2234
<tb> Monosaccharides
<tb> Pentoses
<tb> L-Arabinose <SEP> 0 <SEP> à <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Rhamnose <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> D-Xylose <SEP> 0 <SEP> à <SEP> + <SEP> 0 <SEP> à <SEP> -I-Hexoses
<tb> Dextrose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Galactose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lévulose <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> D-Mannose <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Disaccharides
<tb> Cellobiose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> ++ <SEP> à <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Maltose <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Mélibiose <SEP> +++ <SEP> ++ <SEP> à <SEP> ++++
<tb> Sucrose <SEP> 0
<SEP> 0
<tb> Tréhalose <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Trisaccharides
<tb> Mélécitose <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Raffinose <SEP> . <SEP> + <SEP> à <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> à <SEP> + <SEP> +
<tb> Polysaccharides
<tb> Dextrine <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Inuline <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Amidon <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Alcools <SEP> polyhydroxyliques
<tb> Adonite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Dulcite <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Glycérine <SEP> +++ <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> i-Inosite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D-Mannite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> ++++
<tb> D-Sorbite <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> Divers
<tb> Aesculine <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Salicine <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 0 <SEP> = <SEP> pas <SEP> de <SEP> croissance
<tb> + <SEP> = <SEP>
croissance <SEP> faible
<tb> + <SEP> + <SEP> = <SEP> croissance <SEP> assez <SEP> bonne
<tb> + <SEP> + <SEP> -I- <SEP> = <SEP> bonne <SEP> croissance
<tb> + <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> = <SEP> très <SEP> bonne <SEP> croissance.
<tb> Chaque <SEP> source <SEP> de <SEP> carbone <SEP> a <SEP> été <SEP> essayée <SEP> à <SEP> une <SEP> concentration <SEP> de <SEP> 0,1 <SEP> /a <SEP> en <SEP> poids, <SEP> dans <SEP> le <SEP> milieu <SEP> synthétique <SEP> à <SEP> agar <SEP> décrit
<tb> par <SEP> Pridham <SEP> et <SEP> Gottlieb, <SEP> J. <SEP> Bact., <SEP> 56, <SEP> 108, <SEP> 1948.
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Table l11 Comparaison de l'utilisation de l'azote par le Streptomyces rimosus, forme paromomycinus, et le S.
rimosus, NRRL 2234 Streptomyces rimosus Streptomyces rimosus Sources d'azote* forme paromomycinus NRRL 2234 Inorganiques Nitrate de sodium + + + + + + + + Sulfate d'ammonium + + + + + + + + Ammonium + + + + Organiques Dl-Alanine + + + + + + + + L-Arginine + + + + + + + + Acide dl-aspartique + + + + + + + + L-Cystine + + + + + + + L-Cystéine + + + + + + + + Acide 1-glutamique + + + + + + + + Glycyl-glycine + + + + + + + + L-Histidine + + + + + + + L-Hydroxyproline + + Dl-Isoleucine + + + + L-Leucine + + + + + + + L-Lysine ++++ +++ Dl-Méthionine + + + L-Phénylalanine + + + + + + + + L-Proline ++++ ++++ Dl-Sérine + + + + + + + Dl-Thréonine + + + + + + + + L-Tryptophane + + L-Tyrosine + + Dl-Norleucine + + + + + DL-Valine + + + + + + + + Urée + + + + @ 'k Chaque source d'azote a été essayée à une concentration 0,
01 M d'équivalent d'azote dans le milieu synthétique à agar décrit par Pridham et Gottlieb, J. Bact. 56, 108, 1948, modifié par omission du sulfate d'ammonium et adjonction de 1,0 /o en poids de dextrose. la farine d'arachide, les nitrates inorganiques, l'urée, les sels d'ammonium, etc. Vu la nature brute de la plupart des substances azotées facilement disponibles, la quantité qu'il faut en ajouter au milieu nutritif varie quelque peu selon leur degré de pureté. On peut dire cependant qu'en pratique les substances azotées ne doivent pas excéder 6 % en poids du poids total du milieu de fermentation.
II est nécessaire qu'il y ait une certaine quantité de sels minéraux pour obtenir les meilleurs rendements en paromomycine. En général, beaucoup des matières brutes telles que la liqueur de macération de maïs, les résidus de la fermentation butanol-acétone, les préparations de levures, la farine de soya avec l'huile, etc., contiennent des quantités suffisantes de sels minéraux. Cependant, pour assurer la présence de quantités adéquates des composants minéraux du milieu, il est en général avantageux d'ajouter de faibles quantités de sels inorganiques tels que le chlorure de sodium, le bicarbonate de sodium, le carbonate de calcium, l'acétate de sodium, etc.
La con- centration préférée en sels minéraux est de 0,1 à 1 % du milieu nutritif. La culture du Streptomyces rimosus, forme paro- momycinus dans le milieu nutritif aqueux peut être effectuée de diverses manières. Par exemple, le microorganisme peut être cultivé en aérobie à la surface du milieu, ou bien il peut être cultivé au-dessous de la surface du milieu, c'est-à-dire à l'état submergé, à condition de fournir simultanément de l'oxygène.
Le mode de faire préféré pour produire la paro- momycine sur une large échelle comprend l'emploi de cultures submergées, ou en profondeur du Strep- tomyces rimosus, forme paromomycinus. Dans cette manière de mettre en oeuvre l'invention, on inocule un milieu nutritif aqueux stérile avec du Streptomyces rimosus, forme paromomycinus et soumet le milieu à l'incubation avec agitation et aération à une température entre 20 et 351, C,
de préférence dans le voisinage de 23 - 300 C jusqu'à ce qu'il se soit produit une concentration maximum de la paromomycine dans le liquide de culture. Le temps requis pour cette production maximum de paromomycine varie avec les dimensions et le genre de l'appareil employé. Par exemple, pour une fermentation industrielle sur une
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large échelle, telle qu'on l'effectue dans les appareils de fermentation du type à réservoir, la production maximum de paromomycine est atteinte en environ trois à six jours.
On peut limiter la période d'incubation à des temps plus courts, mais les rendements sont en général inférieurs. Des périodes d'incubation plus longues ne paraissent pas diminuer la quantité de paromomycine présente dans le liquide de culture. Lorsqu'on emploie, pour l'incubation, des ballons se- coueurs, le temps pour la production maximum peut être un peu plus long que celui requis avec les cuves de fermentation en grand.
Dans des conditions de culture submergée, le microorganisme se développe sous forme de particules plus ou moins séparées, dispersées dans tout le milieu nutritif, contrastant avec la pellicule plus ou moins continue qui se forme à la surface du milieu dans la méthode de culture en surface. Grâce à cette distribution de l'organisme dans la masse du milieu, on peut cultiver de grands volumes du milieu nutritif inoculé en une seule fois dans les grands réservoirs ou cuves ordinairement employés dans l'industrie de la fermentation.
Les, appareils de fermentation à réservoir stationnaire, munis de dispositifs convenables d'agitation et d'aération, de même que les appareils de fermentation à tambour rotatif, se sont trouvés particulièrement adaptés à ces fins. Cependant, pour la préparation de plus petites quantités de l'antibiotique ou de cultures du microorganisme, la méthode à culture submergée peut être exécutée dans de petits ballons ou vases qui peuvent être secoués ou agités par des moyens mécaniques convenables.
L'agitation et l'aération du mélange de culture peuvent être réalisées de différentes manières. L'agitation peut être obtenue par des turbines, des palettes, des propulseurs ou tout autre dispositif mécanique d'agitation, par renversement ou secouage du récipient de fermentation lui-même, par des dispositifs de pompage, ou encore par le passage d'air à travers le milieu.
L'aération peut être effectuée en injectant de l'air dans le milieu de fermentation par des tuyaux ouverts, à travers des tuyaux perforés ou des moyens de diffusion poreux tels que des pièces de charbon, du carborundum, du verre aggloméré, etc. ; elle peut aussi être réalisée en pulvérisant, giclant ou versant le mélange dans ou à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
La production de paromomycine par culture en surface comprend l'inoculation d'une couche peu profonde, en général de moins de 2 cm, d'un milieu nutritif aqueux stérile avec du Streptomyces rimosus, forme paromomycinus et en soumettant le mélange à une incubation en aérobie à une température de 20 à 350 C. Il est en général nécessaire que la période d'incubation soit plus longue que dans l'incubation en profondeur pour obtenir la production maximum de paromomycine. En général, cette ,période d'incubation est de dix à quinze jours.
Lorsque la phase d'incubation est terminée, le mycélium est enlevé du liquide, lequel contient la paromomycine cherchée, et le produit est isolé du liquide de culture par les méthodes décrites ci-après.
Après achèvement de la phase de fermentation du procédé, la matière solide présente dans le mélange de culture est enlevée de toute manière convenable, par exemple par filtration, centrifugation, etc., et la paromomycine est isolée du liquide de culture restant. L'isolement peut se faire de façon commode par les méthodes d'échange d'ions, de préférence par adsorption et élution de la paromomycine en employant un échangeur de cations sous sa forme de sel.
La paro- momycine contenue dans l'éluat peut être isolée par concentration à siccité, ou, si on le désire, elle peut être encore purifiée, avant de l'isoler, par des adsorptions et élutions répétées.
Selon l'une des méthodes préférées pour isoler la paromomycine du mélange de culture, on soumet le milieu de culture résiduaire à l'adsorption et l'élu- tion à l'aide d'une résine d'échange de cations sous sa forme de sel, on concentre l'éluat, on fait adsorber l'éluat concentré sur du charbon activé, on extrait la paromomycine du charbon et récupère de l'extrait la paromomycine à l'état libre ou sous forme d'un sel d'addition avec un acide minéral.
Selon cette méthode, le liquide de culture obtenu en enlevant la matière solide du mélange de culture de fermentation, est ajusté à un pH d'approximativement 6,8 à 7,5, puis on le fait passer à travers une colonne d'adsorption contenant une résine à acide carboxylique sous forme de sel, tel que le sel de sodium, de potassium ou d'ammonium. La résine contenant la paromomy- cine adsorbée est lavée avec de l'eau puis est éluée avec un acide minéral aqueux dilué tel que l'acide chlorhydrique, ou une base telle que l'hydroxyde d'ammonium.
On concentre l'éluat, on y mélange du charbon activé, et le charbon contenant la paroma- mycine ou son sel adsorbé est retiré du mélange ; la paromomycine ou le sel de paromomycine est ensuite élué de ce charbon avec un solvant organique convenable, tel qu'un alcool aliphatique inférieur aqueux ou anhydre, ou une cétone. La paromomy- cine ou son sel peut être isolée de cet éluat en éliminant le solvant dans le vide ou par précipitation.
Dans certains cas, après élution de la paromomy- cine de l'échangeur de cations, il est désirable, surtout si des quantités notables de sels minéraux sont présents, d'élever le pH de l'éluat par addition d'une base avant l'adsorption sur du charbon activé. Dans ces cas, on ajuste l'éluat à un pH d'environ 9 à 9,7, on mélange du charbon activé avec cet éluat, retire du mélange le charbon contenant la paromomycine adsorbée et le lave avec de l'eau, puis la paromomy- cine en est éluée avec un acide minéral dilué.
La paromomycine contenue dans l'éluat résultant est isolée de façon commode en faisant passer l'éluat à travers un échangeur contenant une résine à échange d'anions sous forme hydroxyle, en recueillant et neutralisant le percolat, et en traitant ce percolat neutre par échange avec une résine d'échange de cations, en
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éluant avec de l'hydroxyde d'ammonium et en lyophilisant l'éluat.
Selon une autre méthode préférée pour isoler la paromomycine, le liquide de culture de fermentation est adsorbé et élué de la façon ci-dessus décrite en employant une résine échangeuse de cations, le pH de l'éluat résultant est ajusté, si nécessaire, à environ 4,5 - 7, et l'on fait passer l'éluat à travers une colonne contenant un mélange en quantités à peu près égales de charbon activé et de terres de diatomées. Le sel de paromomycine qui est retenu par la colonne, est élué par lavage avec de l'eau.
Des quantités supplémentaires de paromomycine restant dans la colonne après lavage avec de l'eau peuvent être récupérées par un nouveau lavage avec des solvants organiques aqueux dilués ou avec un acide minéral aqueux dilué. Le sel d'acide minéral de la paromomy- cine peut être retiré de ces liquides de lavage en éliminant le solvant dans le vide, ou par précipitation.
La paromomycine peut être dégradée par hydrolyse avec un acide minéral tel que l'acide chlorhydrique en donnant un sel cristallin contenant, à l'ana- lyse élémentaire, 32 - 33 '% de carbone, 7'% d'hy- drogène,
9 - 10 % d'azote et 23 - 24 % de chlore. Les produits d'une telle hydrolyse par acide miné- ral sont sans activité antibactérielle appréciable.
La paromomycine est fortement active bactério- statiquement contre une grande variété d'organismes pathogènes. En particulier, elle est pleinement active in vitro contre les espèces de staphylocoques qui résistent à l'oxytétracycline, l'érythromycine ou la car- bomycine. La table IV montre le spectre antibactériel de la paromomycine employée comme sulfate, in vitro.
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Table !v Spectre antibactériel du sulfate de paromomycine l\ Concentration inhibitrice minimum du sulfate de paromomycine Culture en #tg/ml Clostridium. perfringens . . . . . . . . . . . 100.0 Coryn.ebacterium diphtheriae . . . . . . . .
0.39 Diplococcus pneumoniae . . . . . . . . . . 100.0 Micrococcus pyogenes var. aureus . . . . . . 0.78 Streptococcus pyogenes . . . . . . . . . . . 25.0 Streptococcus salivarius . . . . . . . . . . . 50.0 Aerobacter aerogenes . . . . . . . . . . . . 6.25 Brucella suis . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.13 Escherichia coli . . . . . . . . . . . . . . . 12.5 Klebsiella pneumoniae . . . . . . . . . . . . 1.56 Neisseria catarrhalis . . . . . . . . . . . . . 0.78 Pasteurella multocida . . . . . . . . . . . . 6.25 Proteus vulgaris . . . . . . . . . . . . . . . 3.13 Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . - 50.0 Salmonella paratyphi . . . . . . . . . . . . 1.56 Salmonella schottmuelleri . . . . . . . . . . 12.5 Salmonella typhosa . . . . . . . . . . . . . 6.25 Shigella dysenteriae . . . . . . . . . . . . . 12.5 Shigella paradysenteriae . . . . . . . . . . . 12.5 Shigella sonnei . . .
. . . . . , . . . . . . . 12.5 Vibrio comma . . . . . . . . . . . . . . . . 25.0 Mycobacterium phlei . . . . . . . . . . . . 0.19 Mycobacterium tuberculosis var. hominis. . 0.19 Déterminée par des essais faits deux fois sur des séries de dilutions de bouillon. Pureté estimée à 60-70 /a. La paromomycine est un agent utile pour la prévention d'une infection possible par des microorganismes pathogènes.
La paromomycine possède d'importantes propriétés antiparasites et est particulièrement utile pour combattre l'Endomoeba histolytica, agent produisant l'ameliasis. Elle est aussi utile pour le traitement d'infections locales en surface, causées par divers microbes pathogènes ; elle est particulièrement applicable au traitement d'infections, causées par des espèces de staphylococcus qui résistent aux divers antibiotiques ordinairement employés, soit l'oxytétracycline, l'érythromycine, la carbomycinë, etc.
Pour ces applications, la paromomycine peut être employée sous forme de base libre ou de sel par addition d'acide minéral tel que le chlorhydrate, le sulfate, etc. Elle peut être appliquée sous diverses formes qui conviennent, par exemple comme poudre en mélange avec un diluant inerte tel que le talc, l'amidon, etc., ou comme onguent, contenant une base inerte pour pommade et une faible proportion de
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paromomycine, ou encore en solution aqueuse diluée contenant, si on le désire, un agent tension-actif compatible.
Sous ces formes, la paromomycine peut être avantageusement employée à une concentration d'environ 5 mg par centimètre cube, pour les solutions, et d'environ 5 mg par gramme, pour les poudres et les onguents. La paromomycine a l'avantage d'être relativement non toxique et d'être stable dans des conditions variables d'usage. Employée comme bactériostat, la paromomycine est appliquée directement au lieu d'infection, et d'autres applications peuvent être faites périodiquement, si cela est nécessaire. Si on le désire, la paromomycine peut être employée en combinaison avec d'autres agents bactériostatiques.
Les exemples suivants servent à illustrer l'invention.
Exemple 1: Douze litres d'un milieu nutritif ayant la composition suivante
EMI8.13
<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ...... <SEP> 0,5
<tb> Glycérine <SEP> .... <SEP> . <SEP> .................... <SEP> 0,5
<tb> Caséine, <SEP> hydrolysée <SEP> à <SEP> l'acide <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,3
<tb> Peptone............................ <SEP> 0,25
<tb> Levure <SEP> de <SEP> brasserie <SEP> ... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> Substances <SEP> solides <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> 0,25
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,25
<tb> Résidu <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> acétone-butanol <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,25
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> ...... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb> Eau, <SEP> ce <SEP> qu'il <SEP> faut <SEP> pour <SEP> faire <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 100,0
sont mis dans un récipient de fermentation de 30 litres, muni d'un appareillage en acier inoxydable comprenant un diffuseur, un propulseur, des chicanes et des tuyaux de prise d'échantillons, et le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant deux heures.
Le milieu est alors refroidi et inoculé avec 20 ml d'une suspension dans une solution stérile à 0,1% d'heptadécyl-sulfate de sodium, de spores de Strepto- myces rimosus, forme paromomycinus provenant de deux cultures de sporulation selon Moyer sur agar en pente.
Le mélange de culture inoculé est soumis à l'incubation à 26() C pendant soixante heures, au cours desquelles le mélange est agité à 200 t.p.rn. et de l'air stérile est fait passer dans le milieu par le diffuseur à raison de 12 litres à la minute.
Une partie du milieu de culture incubé résultant est employée pour l'inoculation de 16 litres d'un milieu nutritif de la composition suivante
EMI8.42
<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> ...... <SEP> . <SEP> ..... <SEP> 1,0
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> . <SEP> . <SEP> .. <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ..... <SEP> 0,1
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ........ <SEP> .....
<SEP> 0,167
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> voulue <SEP> pour <SEP> faire <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100,0
Le pH de ce dernier milieu nutritif est ajusté à 7,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 10N, et le milieu est placé dans un récipient de fermentation de 30 litres, en verre, muni d'un diffuseur, d'un propulseur, de chicanes et d'un tuyau de prise d'échantillons. Le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant deux heures, laissé refroidir, puis inoculé avec 800 ml du milieu de culture obtenu comme décrit ci-dessus.
Le mélange de culture résultant est soumis à l'incubation à 26,1 C pendant nonante-quatre heures, pendant lesquelles le mélange est agité à 200 t.p.m. et que l'on fait passer de l'air stérile dans le milieu à l'aide du diffuseur, à raison de 16 litres par minute. Pendant l'incubation, on évite la formation de mousse par addition, selon besoin, d'axonge brute et d'huiles minérales contenant des mono- et di-glycérides.
A la fin de la période d'incubation, le milieu de culture de fermentation est ajusté à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique concentré, les substances solides présentes sont enlevées par filtration, et la masse sur le filtre est lavée avec de l'eau. Les eaux de lavage sont combinées avec le filtrat principal, le pH est ajusté à 7,0, et 15,5 litres de ce liquide de culture filtré sont introduits dans un échangeur en colonne (d. i. 38 mm), rempli de 380 ml d'une résine à acide carboxylique ayant été préalablement lavée successivement avec deux litres d'une solution aqueuse de 37,5 g d'hydroxyde de sodium puis avec deux litres d'eau.
La colonne contenant la paromo- mycine est lavée avec deux volumes d'eau, et est éluée avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N. Les premiers 19,4 litres du percolat contiennent peu ou pas de paromomycine, et leur pH varie de 6 à 7,3. Quand le pH de l'éluat commence à tomber au-dessous de 6,0, on en recueille 2 litres.
Cette portion de deux litres est neutralisée à un pH 6 avec une solution d'hydroxyde de sodium 10 N et est filtrée. Le filtrat est concentré par évaporation dans le vide à un volume d'environ un litre.
On prépare une colonne d'adsorption en versant un mélange aqueux boueux de 65 g de charbon activé lavé à l'acide (produit marque Darco G-60) et 50 g de terre de diatomées dans une colonne de 38 mm, et on y ajoute 300 ml du filtrat concentré. La colonne est lavée avec 400 ml d'eau et éluée successivement avec 325 ml d'eau, 425 ml d'acétone aqueux à 1:
% et 400 ml d'acétone aqueux à 10 0/0. Les éluats d'eau et d'acétone sont concentrés et lyophilisés pour obtenir le chlorhydrate de paromomy- cine sous forme d'une poudre. Le produit est purifié en reprenant la poudre dans du méthanol, ajoutant un grand excès d'acétone à la solution, et récupérant par filtration le précipité qui se forme.
Le produit, le chlorhydrate de paromomycine a un pouvoir ro- tatoire [CC] 25 = -I- 56,50 (à 1% dans l'eau).
A l'analyse le chlorhydrate de paromomycine donne 35,71 % de carbone, 6,95 % d'hydrogène, 8,42 % d'azote et 21,5% de chlore.
<Desc/Clms Page number 9>
Pour obtenir la paromomycine à l'état de base libre, le chlorhydrate -est dissous dans l'eau pour for- mer une solution à 3 % ;
celle-ci est versée dans une colonne d'adsorption contenant une résine d'échange d'anions (produit marque Amberlite IR-45), ou de préférence IRA 411 ou IRA 400 à la forme hydroxyle, et la colonne est lavée avec une faible quantité d'eau.
Le percolat aqueux est concentré à siccité par lyophilisation, et le produit solide obtenu est purifié en le reprenant avec de l'éthanol obsolu bouillant, en refroidissant, et récupérant la paromo- mycine solide ; [a]25 = -I- 640 (à 1 % dans l'eau).
Par analyse, elle contient 45,17 % de carbone, 7,44'% d'hydrogène et 10,35'% d'azote. Exemple 2 Pour préparer un inoculum frais pour la produo- tion de paromomycine sur une large échelle décrite ci-après, 76 1 d'un milieu nutritif ayant la composition suivante
EMI9.45
<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> .... <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> - <SEP> . <SEP> - <SEP> - <SEP> .
<SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ... <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> voulue <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 100,0
sont introduits dans un récipient de fermentation de l901. en acier inoxydable, et le pH est ajusté à 7,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 6 N. On stérilise le milieu par chauffage à 121 C pendant une heure.
Le milieu est alors refroidi et inoculé avec 40 ml d'une suspension de spores de Strepto- nzyces rimosus, forme paromomycinus dans une so- lution stérile d'heptadécylsulfate de sodium à 0,1 %, préparée de la manière décrite à l'exemple 1. Le milieu de culture est soumis à l'incubation à 260 C pendant soixante-quatre heures, durant lesquelles on lui fournit de l'air stérile à l'aide d'un diffuseur à raison de 9,8 pieds cubes par minute.
Pendant l'incubation, on ajoute un mélange stérilisé d'axongei brute et d'huiles minérales contenant des mono- et di-gly- cérides selon besoin pour éviter la formation de mousse.
La culture incubée ainsi obtenue est employée pour inoculer la culture principale, qui a été préparée de la manière suivante 435 1 d'un milieu ayant la composition suivante
EMI9.63
<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> ---- <SEP> l'o
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> ------ <SEP> l'o
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .......
<SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,5
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> voulue <SEP> pour <SEP> faire <SEP> 100,0
sont mis dans un récipient de fermentation de 7601 en acier inoxydable, et le pH est ajusté à 7,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 6 N. Le milieu est stérilisé par chauffage à 121o C pendant une heure, puis on le laisse refroidir.
Le milieu stérile est inoculé avec 381 de la culture préparée comme décrit ci-dessus et est soumis à l'incubation à 260 C pendant septante-deux heures, durant lesquelles on lui fournit de l'air stérile par un diffuseur à raison de 9411 par minute, et on l'agite avec un propulseur tournant à une vitesse de 230 t.p.m. Pour éviter une formation excessive de mousse pendant l'incubation, on ajoute selon besoin 8,1 litres d'un mélange stérile d'axonge brute et d'huiles minérales.
A la fin de la période d'incubation, le mélange de culture est amené à un pH de 2 avec de l'acide chlorhydrique concentré ; on le filtre et la masse sur le filtre est lavée avec de l'eau. Le filtrat et les eaux de lavage combinés 5641 sont neutralisés et ajoutés à une colonne d'adsorption (d. i. 152 mm), garnie avec 13 litres d'une résine à acide carboxylique ( Amberlite IRC-50) qui a été préalablement neutralisée par percolation avec une solution de 1,265 g d'hydroxyde de sodium dans 60 litres d'eau.
La colonne qui contient la paromomycine, est lavée avec environ 40 litres d'eau, puis éluée avec de l'acide chlorhydrique 0,5 N. Lorsque le pH du liquide sortant de la colonne tombe au-dessous de 6, on recueille 88,5 litres de l'éluat, on les neutralise avec une solution d'hydroxyde de sodium 6 N, puis on concentre par évaporation dans le vide jusqu'à environ un dixième du volume.
Un quart de litre de l'éluat concentré est ajouté à une colonne d'adsorption préparée en mettant une boue aqueuse de 80 g de charbon activé (produit marque Darco G-60) et 60 g de terre de diatomées dans un tuyau de 38 mm ayant une capacité d'environ 360 ml. Le chlorhydrate de paromomycine contenu dans la colonne est retiré par élution avec 11/2 litre d'eau. L'éluat est concentré, congelé, et séché à l'état congelé sous un vide très poussé.
Le produit solide obtenu, le chlorhydrate de paromomy- cine, représente un rendement de 64'% de l'activité de la paromomycine, présente initialement dans le mélange de culture à la fin de la fermentation.
Pour transformer le chlorhydrate de paromomy- cine en le sulfate correspondant, on dissout 1 g de ce chlorhydrate dans. 25 ml de méthanol et on ajoute à la solution 4,5 ml d'une solution aqueuse molaire d'acide sulfurique. Le précipité qui se forme est isolé par filtration, et la masse sur le filtre est lavée avec du méthanol et séchée. Le produit résultant, le sulfate de paromomycine sous une forme contenant un ion chlorure, est dissous dans de l'eau et le pH de la solution est ajusté à 6,0 par mélange avec une quantité suffisante d'une résine d'échange d'anions à la forme hydroxyle.
La résine est enlevée par filtration et le filtrat est concentré par lyophilisation. La gomme résiduaire est convertie en un solide blanc par trituration avec de l'acétone. Le produit solide est
<Desc/Clms Page number 10>
isolé par filtration, lavé avec de l'acétone et séché. Le produit, sulfate de paromomycine, a un pouvoir rotatoire [a]15 de + 50,50 (à 1 A/o dans de l'eau).
Exemple 3: Pour préparer un inoculant frais pour la production de paromomycine sur une large échelle, comme cela est décrit ci-après, 12 litres d'un milieu nutritif de la composition suivante
EMI10.9
<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ....... <SEP> 2,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ... <SEP> .......... <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> .... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> .............. <SEP> 0,5
<tb> Eau, <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour <SEP> faire <SEP> ...... <SEP> 100,0
sont placés dans un récipient de fermentation de 30 litres à agitateur, et le pH est ajusté à 7,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 6 N.
Le milieu est stérilisé par chauffage à 12l C pendant deux heures, puis on le laisse refroidir et on l'inocule avec 20 ml d'une suspension de spores de Streptomyces rimosus, forme paromomycinus, dans une solution stérile d'heptadécyl-sulfate de sodium à 0,1'% préparée comme décrit à l'exemple 1.
Le mélange de culture est soumis à l'incubation à 260 C pendant 71 heures, durant lesquelles de l'air stérile est fourni par un diffuseur à raison de 12 litres à la minute, et le mélange est agité au moyen d'un propulseur tournant à raison de 200 t.p.m.
La culture incubée ainsi obtenue est employée pour inoculer la culture principale, préparée de la manière suivante 38 1 d'un milieu ayant la composition
EMI10.27
<tb> pour <SEP> cent
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> ..... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 2,0
<tb> Farine <SEP> de <SEP> soya <SEP> avec <SEP> huile <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Résidu <SEP> d'estomac <SEP> de <SEP> porc <SEP> extrait <SEP> au <SEP> sel <SEP> 0,5
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ... <SEP> .......... <SEP> 0,167
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5
<tb> Eau <SEP> quantité <SEP> suffisante <SEP> pour <SEP> faire <SEP> ...... <SEP> 100,0
sont préparés dans un récipient de fermentation en acier inoxydable de 1141, et le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant une heure. On laisse le milieu refroidir et on l'inocule avec 100 ml de l'inoculant frais, préparé comme indiqué ci-dessus. Le milieu inoculé est soumis à l'incubation, à 26ç) C pendant vingt-quatre heures, durant lesquelles de l'air stérile lui est fourni par un diffuseur à raison de 1821 par minute.
l1361 d'un milieu nutritif ayant la même composition que décrit ci-dessus, sont préparés et placés dans un récipient de fermentation de 19001, en acier inoxydable, et le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant 1 heure. On laisse refroidir le milieu stérile et on l'inocule avec 381 du mélange de culture obtenu par la fermentation précédente.
Le milieu inoculé est soumis à l'incubation à 26,1 C pendant vingt-trois heures, pendant lesquelles il est aéré par un diffuseur à raison de 12601 par minute, le mélange étant agité au moyen d'un propulseur tournant à raison de 84 t.p.m. Pendant cette incubation, pour éviter une formation excessive de mousse, on ajoute selon besoin 3,9 litres d'un mélange stérile d'axonge brute et d'huiles minérales contenant des mono- et di-glycérides.
On prépare 45401 d'un milieu de même composition que celui ci-dessus décrit, et présentant un pH de 7,5, et on les met dans un récipient de fermentation de 7600l, en acier inoxydable. Le milieu est stérilisé par chauffage à 1210 C pendant 1 heure, puis laissé refroidir. Le milieu stérile (pH 6,65) est inoculé avec 7571 du milieu de culture décrit immédiatement ci-dessus, et il est soumis à l'incubation à 26,1 C pendant quarante-neuf heures. Pendant l'incubation, de l'air est fourni à raison de 33601 à la minute et le milieu est agité à l'aide d'un propulseur tournant à raison de 125 t.p.m.
Le milieu de culture (7760l contenant la paro- momycine à une concentration d'environ 0,2 mg/ml) est filtré, la masse sur le filtre est lavée avec de l'eau, et le filtrat et eaux de lavage combinés (90801) sont amenés à un pH de 7,2 et sont ajoutés à une colonne d'adsorption préparée en garnissant une colonne de 457 mm avec 184 litres d'une résine à acide carboxylique ( Amberlite IRC-50) et neutralisant la résine par percolation avec 6481 d'hydroxyde de sodium 0,6 N.
La colonne est alors lavée avec environ 12301 d'eau, et éluée avec 21201 d'acide chlorhydrique 0,5 N et 7951 d'acide chlorhydrique 0,6 N, des lavages à l'eau étant faits après chaque élution à l'acide, de façon à obtenir un volume total d'éluat de 36901.
Des éluats combinés provenant de plusieurs opérations semblables (volume total 30701) sont amenés à un pH de 9,5 avec de l'hydroxyde de sodium 6 N. On ajoute alors du charbon activé ( Darco G-60) à raison de 1,5'% poids/volume, et de la terre d'infusoires à raison de 1,0'0/() p/v, et agite le mélange pendant 1/2 heure. Puis le mélange est filtré dans un filtre-presse que l'on lave avec 37651 d'eau. La paro- momycine est éluée avec 928l d'acide sulfurique 0,05 N et 12651 d'acide sulfurique 0,1 N.
Les éluats d'acide sulfurique sont combinés et on les fait passer sur 453 kg d'une résine échangeuse d'anions ( Amberlite IR-45) à la forme hydroxyle. On détermine périodiquement le pH de l'éluat, et quand il tombe au-dessous de 9, la résine est régénérée. Le percolat contient la paromomycine à l'état de base libre.
Une portion de 6461 du percolat concentré, contenant 1,3 - 1,5 g de paromomycine, est amené à un pH de 7,3 avec de l'acide sulfurique 1 N, et on la fait passer à travers 5 ml d'une résine à acide carboxylique, à la forme ammonium. La résine est ensuite lavée avec de l'eau, et l'eau de lavage, qui contient
<Desc/Clms Page number 11>
une faible quantité de matière active, est rejetée. La paromomycine est éluée avec de l'hydroxyde d'ammonium 1 N, et l'éluat est séché à froid. Le rendement en le produit cherché, la paromomycine, est de 1,125 g.
Claims (1)
- REVENDICATION Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique de nature basique ou d'un sel d'addition d'acide de celui-ci, caractérisé en ce que l'on inocule un milieu nutritif aqueux stérile ayant un pH entre 6 et 8,5 et contenant une source de carbone assimilable et une source d'azote et des substances minérales, avec du Streptomyces rimosus, forme paromomycinus, on soumet à l'incubation le milieu inoculé à une température de 20 à 35 C en aérobie, on enlève les matières solides présentes dans le milieu incubé et isole l'antibiotique produit de la solution ainsi obtenue, sous forme de base libre ou sous forme d'un sel d'addition d'acide. SOUS-REVENDICATIONS 1.Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'on agite le milieu nutritif et y introduit de l'air stérile pendant l'incubation. 2. Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'incubation. est effectuée à une température entre 23 et 30,, C pendant environ 3 à 6 jours. 3.Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que le milieu nutritif contient entre 0,1 et 1 % de sels minéraux et au moins l'une des substances sui- vantes: glucose, d-mannose, d-galactose, sirop de maïs, amidon, amidon soluble, liqueur de malt, mélasse, amidons hydrolysés et glycérine. 4.Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'antibiotique contenu dans le milieu incubé, après élimination des matières solides, est adsorbé sur une résine d'échange à acide carboxylique, et est élué de celle-ci, en ce que l'antibiotique contenu dans l'éluat résultant est adsorbé sur du charbon activé et élué de celui-ci, et en ce que l'antibiotique, ou sel d'addition d'acide de celui-ci, contenu dans l'éluat du charbon est isolé par élimination du solvant ou par précipitation sous forme d'un sel insoluble d'addition d'acide. 5.Procédé selon la revendication, caractérisé en ce que l'antibiotique contenu dans le milieu incubé après élimination des matières solides,, est adsorbé sur un échangeur de cations, et élué de celui-ci, le pH de l'éluat est amené à 9 - 9,7 l'antibiotique contenu dans celui-ci est adsorbé sur du charbon activé, qui est lavé avec de l'eau, l'antibiotique est élué avec un acide minéral dilué, l'antibiotique contenu dans l'éluat résultant est adsorbé par une résine d'échange d'anions à la forme hydroxyle et est élué de celle-ci,l'éluat résultant est neutralisé, l'antibiotique contenu dans cet éluat neutre est adsorbé sur une résine d'échange de cations et est élué avec de l'hydroxyde d'ammonium, et l'antibiotique est isolé par élimination du solvant.
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Family Applications (1)
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| CH (1) | CH345976A (fr) |
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1956
- 1956-05-04 CH CH345976D patent/CH345976A/fr unknown
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