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La présente invention concerne des procédés métaboliques perfectionnés en particulier des procédés métaboliques appliqués à la production d'acide gibbérellique.
L'acide gibbérellique est un stimulant delà croissance des plantes pouvant être extrait des filtrats;de culture de certaine souches actives de la moi s issure Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme). Il est connu de préparer l'acide gibbérellique par la culture d'une souche active de Gibberella fujikuroi dans un milieu nutritif approprié, agité et aéré, contenant une source de carbone,, par exemple du glucose, une source d'azote, par exemple du nitrate d'ammonium, certains sels métalliques, par exemple du sulfate de
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magnésium et du phosphate monpotassique, et des traces de métaux tels que du fer, du cuivre, du zinc, du manganèse et du môlybdène.
Une caractéristique de ce procédé métabolique consiste en ce que l'acide est produit en majeure partie quand la synthèse propre' de la protéine ou la croissance active de la mois issure: est arrêtée.
Cet arrêt de la croissance active peut être le résultat de l'épuise- ment de l'un des constituants essentiels de la solution nutritive, par exemple l'azote ou le carbone.
Si on arrête la croissance active de la mois issure par épuisement d'un constituant essentiel du milieu, il est préférable que ce constituant essentiel ne soit pas la source de carbone.
Il est préférable, en effet, que du carbone demeure disponible pour satisfaire aux besoins de la moi s issure au cours du stade de production de l'acide gibbérellique. Dans certaines limites, plus il existe de carbone disponible pendant le stade-de production de l'acide, plus la production d'acide gibbérellique tend à augmenter Toutefois, une concentration élevée en carbone, en particulier quand elle existe sous forme de sucre, dans le stade initial du procédé métabolique, a tendance à diminuer le taux de croissance de la moi s issure, et a par conséquent un effet nuisible sur l'efficacité totale du procédé.
Suivant la présente invention, dans un procédé métabolique de préparation d'acide gibbérellique par la culture d'une souche active de Gibberella fujikuroi et-l'arrêt de la croissance active pour promouvoir la production d'acide gibbérellique, on maintient la quantité de carbone disponible au cours du stade de production d'acide gibbérellique, en ajoutant au milieu une source de carbone.
On peut ajouter la source de carbone de façon continue ou par charges espacées et une source de carbone appropriée peut être un sucre, par exemple du sucrose ou du glucose, un alcool polyhydri- que, par exemple de la glycérine ou ses esters, ou une huile végétale
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La source d'azote utilisée dans le milieu, peut être un se d'ammonium, un nitrate., de la liqueur de macération de mais ou une décoction de protéine, telle que la peptone, ou d'autres sources contenant de l' a.zote assimilable*
La présente invention permet d'amorcer une croissance hautement active de la moi.s issure tout en satisfaisant ses besoins en carbone au cours du stade de production d'acide gibbérellique.
L'invention est illustrée par 1.'exemple suivant.
On utilise deux fermentateurs A et B, chacun de 30 litres d'un milieu contenant:
EMI3.1
<tb> Fermentateur <SEP> A <SEP> Fermentateur <SEP> B
<tb> , <SEP> Poids <SEP> par <SEP> volume <SEP> poids <SEP> par <SEP> volume
<tb> Monohydrate <SEP> de <SEP> glucose <SEP> 10% <SEP> 10 <SEP>
<tb>
<tb> Nitrate <SEP> d'ammonium <SEP> 0,48% <SEP> 0,24%
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> 0,5% <SEP> 0,5%
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,1% <SEP> 0,1%
<tb>
<tb> Concentré <SEP> d'éléments <SEP> mineurs <SEP> 0,2% <SEP> vol/vol <SEP> 0,2% <SEP> vol/vo
<tb>
La composition du concentré d'éléments mineurs étant la suivante :
EMI3.2
<tb> Sulfate <SEP> ferreux <SEP> heptahydraté <SEP> 0,1 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> cuivre <SEP> pentahydraté <SEP> 0,015 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> zinc <SEP> heptahydraté <SEP> 0,1 <SEP> g
<tb>
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> manganèse <SEP> heptahydraté <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb>
<tb> Molybdate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> K2Mo04 <SEP> 0,01.g
<tb>
<tb> Eau <SEP> 100 <SEP> ml
<tb>
On inocule les milieux par une souche active de Gibberella fujikuroi dont des échantillons sont déposés dans les collections de culture du "Commonwealth Mycological Institute", à Kew, .du ''Central Bureau vo@ Schimmelcultures" à Baarn et de la "Northern Utilisation Research and Development Division of the United States Department of Agricul- ture", à Peoria, Illinois, U.S.A.;
on maintient ces milieux à 26,2 C, et on y insuffle de l'air à raison de 15 litres/minute. Après 118 heures de fermentation, après lesquelles la croissance active est pratiquement arrêtée, par ]--'épuisement de 1'azote'contenu dans les
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milieux, on ajoute du monohydrate de glucose sous forme'aseptique par portions de 15 g, pour maintenir la concentration en sucre des milieux au delà de 2-la en poids par volume.
Le tableau ci-après donne la quantité totale de sucre consommée par la moi sissure et la concentration en acide gibbérel- lique dans les deux milieux à mesure que la culture progresse.
EMI4.1
<tb>
Acide <SEP> gibbéréllioue <SEP> mg/1 <SEP> Sucre <SEP> utilisé <SEP> g/1
<tb>
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<tb> Durée <SEP> (heures <SEP> Fermenta- <SEP> Fermenta- <SEP> Fermenta- <SEP> 'Fermenta-*
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<tb>
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<tb>
<tb>
<tb> 573 <SEP> 324 <SEP> 409 <SEP> 355 <SEP> 237
<tb>
Le milieu utilisé dans le fermentateur A est pratiquement équilibré quant au carbône et à l'azote,
c'est-à-dire qu'il contient ces deux-'éléments nutritifs dans les proportions approximatives dans
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lesquelles ils sont absorbés par la moi s issure pendant sa croissance active. Par conséquent, le carbone serait épuisé-sensiblement au mê- me moment que l'azote, et en l'absence d'additions d'éléments nutri- tifs, on ne peut pas s'attendre à ce que la quantité d'acide gibbérellique produit dans la suite, dépasse 120 ml/litre.
'Toutefois, le tableau montre que si on effectue des additions d'une source de carbone., glucose monohydraté, après arrêt de la croissance active, on peut maintenir la production d'acide gibbérellique au moins jusqu'à ce que sa concentration s'élève à 324 mg/litre.
Dans le cas du fermentateur B, le milieu contient au début un excès de carbone qui demeure encore disponible quand l'azote contenu est épuisé, et on peut.s'attendre à ce que la production normale diacide gibbérellique .atteigne jusque 240 mg/litre.
Toutefois d.es additions de sucre visan.tà conserver du carbone disponible., a.boutissent à une concentration en acide qui s'élève jusqu'à 409 mg/litre.
Le milieu utilisé pendant le stade de croissance active de la moi s issure, est un milieu dit équilibré, dans lequel la concentration en azote peut être comprise dans la gamme de 0,017 à 0,26% en poids/volume, par exemple sous forme de 0,05 à 0,75% en poids/volume de nitrate d'ammonium et de préférence dans la gamme de 0,07 à 017% en poids par volume d'azote, par exemple scias forme de 0,2 à 0,5% en poids/volume de nitrate d'ammonium.
On choisit alors la concentration en carbone, par exemple sous, . forme de sucrose, glucose ou glycérine, de manière à procurer un milieu dans lequel le l'apport du carbone à l'azote est de pré- férence compris entre les valeurs de 10:1 et de 25:1. Un milieu équilibré type., convenant à la croissance active, peut par exemple contenir 0,24% en poids/volume de nitrate d'ammonium et 3,18% en poids/volume de glycose monohydraté, c'est-à-dire avoir un rapport de C : N de 14 : 1 ou bien il peut contenir 0,48% en poids/volume de nitrate d'ammonium et 10% en poids/volume de glucose
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monohydraté, c'est-à-dire avoir un rapport C :N de 21:5.
Quand la croissance active est pratiquement arrêtée par épuisement de l'azote dans un milieu équilibré, il ne reste que peu ou pas d'excès de carbone dans le milieu, et il n'existe ainsi que peu ou pas de carbone à l'aide duquel la moisissure peut produire de l'acide gibbérellique. C'est à ce stade qu' on ajoute au milieu une source additionnelle de carbone dans le but d' entretenir la production d'acide gibbérellique.
La quantité de source de carbone ajoutée au milieu à la fin du stade de croissance active est réglée dans le but d'éviter l'inhibition de la moisissure pour la production d'acide gibbérel- lique. Un grand excès de source de carbone est désavantageux au sta- de de production de l'acide, et un excès raisonnable peut par exempl exister sous la forme de 0,1 à 10% en poids/volume de glucose, et plus particulièrement sous la forme de 1 à 4% en poids/volume de glucose .
On peut appliquer le procédé de l'invention en combinaison avec un procédé à stades multiples pour la production d'acide , gibberelliqüe, tel que décrit dans le brevet de même date de la
Demanderesse intitulé "Perfectionnements apartés aux procédés métaboliques".
Ainsi, la culture de la souche active de Cibberela fujikuroi peut s'effectuer en deux ou plusieurs stades, dont le permier stade est un stade de croissance active de ia moisissure dans un milieu approximativement équilibré, 'c'est-à-dire dans lequel le rapport C:N est compris entre 10 :1 25:1 le second stade étant un stade autours duquel la croissance active -se poursuite dans un milieu ayant un rapport C :N élevé, par exemple compris entre environ 30 :1 environ 55:
1, et la croissance active est arrêtée par épuisement de l'azote, en conservant un excès de la source de carbone, et le troisième stade étant un stade au cours duquel on introduit dans le milieu des quantités additionnelles de la source de carbone, en maintenant une concentration approximativement constante delà source de carbone dans le milieu, jusqu'à cessation
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de la production d'acide gibbérellique.
Ainsi., par exemple, on peut exécuter le premier stade dans un milieu qui contient 3,18% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,24% en poids/volume de nitratedammonium, c'est-à-dire ayant un rapport C:N d'environ 14:1, et on peut alors exécuter le second stade dans un milieu non équilibre ayant un rapport C:N plus élevé, par exemple un milieu qui contient respectivement 16% en poids/volu- me ou 10% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,4% en poids/ volume de nitrate d'ummonium, c'est-à-dire ayant respectivement un rapport C:N de 41:1 ou 26:1. La croissance de la moisissure se poursuit jusqu'à ce que la source d'azote soit complètement épuisées il reste alors un excès de la source de carbone et la production d'acide gibbérellique commence.
Au cours de cette production décide gibbérellique, l'excès de la source de carbone s'épuise de façon continue, et quand cett source atteint une concentration d'environ 0,5 à 10% en poids/volume du milieu, on commence à ajouter de nouvelles quantités d'une source de carbone, qui peut être ou ne pas !être la même que celle utilisée dans les stades précédents, dans le but de maintenir une concentration constante en carbone dans le milieu et maintenir ainsi la production continue d'acide gibbérellique avec des rendements qui n'ont pas encore été atteints jusqu'à présent.
La source préférée de carbone est un sucre, par exemple du sucrose ou du glucose, et la concentration constante préférée de ce sucre au cours de la production continue d'acide gibbérellique est comprise dans la gamme d'environ 1% à environ 4% en poids/volume du.milieu. La concentration constante préférée peut être atteinte en ajoutant par intervalles des quantités de sucre au milieu pendant le stade final de production d'acide gibbérellique, par exemple à des intervalles de 12 à 24 heures. De cette façon, on obtient un milieu de culture qui contient jusqu'environ 1.000 mg d'acide gibbérellique par litre de milieu, et on peut séparer cet acide du milieu par des moyens connus.
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L'invention est illustrée davantage par les exemples suivants: EXEMPLE 1
EMI8.1
Prénaration de l'inoculum.
On inocule 5 litres d'un mélange nutritif contenant 8% en poids/volume de glucose monohydraté, 0,4% de nitrate d'ammonium (en poids/volume)., 0,5% en poids/volume de phosphate monopotassique, 0,1% en poids/volume de sulfate de magnésium heptahydraté, et 0,2% en volume/volume d'un concentré d'élément mineur, dont la composi- tion est décrite plus haut, à un pH de 3,47, à l'aide d'une culture
EMI8.2
sur agar de Gibberella fujikuroi. On maintient la milieu à bzz et on le remue et on l'aère à raison de 2,5 litres d'air par minute.
Fermentation de production.
Après 80 heures., on inocule 5 litres de la culture di- dessus dans un appareil fermentateur de 100 litres, contenant un milieu de nutrition préparé comme suit:
EMI8.3
<tb> Glucose <SEP> monohydraté <SEP> 8% <SEP> en <SEP> poids/volume
<tb>
EMI8.4
Nitratedëmmonium bzz "
EMI8.5
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> heptahydraté <SEP> 0,1% <SEP> "
<tb>
<tb> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> 0,5% <SEP> "
<tb>
<tb> Concentré <SEP> d'élément <SEP> mineur <SEP> 0,2% <SEP> en <SEP> volume/volume
<tb>
Eau pour parfaire à 75 litres.
La composition du concentré d'éléments mineurs est celle donnée plus haut. On stérilise le milieu, puis on le refroidit et on 1-lino- cule au moyen de 5 litres de l'inoculum décrit ci-dessus. On agite le milieu, on le maintient à une température de 26 C, et on l'aère par uncourant d'air de 0,5 volume d'air par volume de milieu de culture et par minute.
Quand la croissance active de la moisissure a cessée c'est-à-dire quand la source d'azote est complètement épuisée, commence la production d'acide gibbérellique, et la concentration de la source de carbone restante (glucose) décroît rapidement . 39 heures après.le début de la formation d'acide gibbé-
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rellique pendant le stade production de l'acide, la concentration en glucose est d'environ 0,9% en poids/volume et on ajoute alors des quantités additionnelles du sucre au milieu nutritif de.12 en 12 heures, afin de maintenir une concentration d'environ 2% de glucose en poids/volume dans le milieu nutritif, pendant bout le reste du stade de formation diacide au cours de la fermentation Le tableau suivant donne la concentration 'en acide gibbérellique dans le milieu.,
en fonction de la consommation de glucose, à mesure que la fermentation progresse.
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<tb>
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<tb> 359 <SEP> 618 <SEP> 17,1
<tb>
On filtre ensuite les contenus des fermentateurs, et on extrait un échantillon de 58 litres du filtrat par l'acétate d'éthyle pour- séparer lacide gibbérellique, qu'on obtient ensuite par des moyens connus. On obtient ainsi 33,48 g d'acide gibbérellique sous forme de poudre cristalline incolore qui fond à 233-235 C en se décomposant.
On peut obtenir une seconde portion d'acide gibbérellique à partir du filtrat de cristallisation.
EXEMPLE 2
On répète le procédé décrit dans l'exemple 1, excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydrat é et 0,24% en poids/volume de nitrate .d'ammonium dans le milieu nutritif utilisé dans le stade de production d'acide gibbérellique de la fermentation, par 20% en poids/volume de glucose monohydraté e't 0,4% en poids/volume de nitrate d'ammonium.
Au coars du stade de production diacide gibbérellique, le glucose en excès existant
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dans le milieu nutritif est rapidement consomme., et on ajoute des quantités additionnelles de glucose monohydraté à des intervalles de 12 heures, après environ 74 heures, afin de mainte une concentration d'environ 4% en poids/volume de glucose dans le milieu nutritif pendant le restant du stade de production d'acide gibbérellique de la fermentation. Le tableau ci-après donne la concentration en acide gibbérellique dans le milieu en fonction du glucose consommé, à mesure que la fermentation progresse.
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Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Sucre <SEP> utilisé
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4
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<tb> 508 <SEP> 826 <SEP> 35,0
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EXEMPLE
On répète le procédé décrit dans l'exemple 1 excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydraté et les 0,24% en poids/volume.de nitrate d'ammonium dans le milieu nutritif utilisé dans la fermentation productive, par 20% en poids/volume
EMI11.1
<té glucose monohydraté et 0% en poids/volume de nitrate .d'rmmon.im Au cours du stade de production d'acide gibbérellique, l'excès de glucose existant dans le milieu nutritif, est rapidement épuisé et on ajoute de 12 en 12 heures des quantités additionnelles de glucose monohydraté après environ 26 heures,
-afin de maintenir une concentration d'environ 10% en poids/volume de glucose pendant tout le restant du stade de production de 1,1 acide gibbérellique de la fermentation Le tableau ci-après donne la concentration en, acide gibbérellique du :milieu, en fonction du glucose consommé à mesure que la fermentation progresse.
EMI11.2
.Age (heures après -Acide gi'bbéri11ique Sucre consomme 1 -9 ino c.,tLia-t mg±y±re ' Lep- :Q01d:YIQ
EMI11.3
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6
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<Desc/Clms Page number 12>
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.
EXEMPLE 4
On répète le procédé décrit dans l'exemple 1, excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,24% en poids/volume de nitrate d'ammonium par 16,0% en poids/vo- lume de glucos,e monohydraté et 0,4% en poids/volume de nitrate d'ammonium. Au cours du stade de production d'acide gibbérellique de la fermentation, l'excès de glucose présent dans le milieu nutritif est épuisé-et on ajoute des quantités additionnelles de glucose monohydraté après 162 heures et ensuite à des intervalles de 12 à 24 heures, afin de maintenir une concentration d'environ 1 à 3% eh poids/volume de glucose dans le milieu nutritif pendant tout le restant du stade de production d'acide de la fermentation.
Le tableau ci-après donne la concentration en acide gibbérellique dans le milieu en fonction de la concentration en glucose à mesure que la fermentation progresse.
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<Desc/Clms Page number 13>
EMI13.1
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On sépare l'acide gibbérellique par des moyens connus., par filtration du mélange de fermentation et passage du filtrat (63 litres) à travers du carbone. On sépare l'acide gibbérellique absorbé par élutriation, puis on l'obtient et le purifie par cristallisation. On obtient ainsi 63,0 g d'acide glbbérellique,
<Desc/Clms Page number 14>
sous forme de produit cristallin incolore, qui fond à 233-235 C, en se décomposant.
EXEMPLE
On répète le procédé' décrit dans l'exemple 1 excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,24 % en poids/volume de nitrate .d'ammonium par 20% en poids/ volume de glucose monohydraté et 0,4% en poids/volume de nitrate d'ammonium. Au cours du stade de production d'acide gibbérellique , de la fermentation, l'excès de glucose existant dans le milieu nutritif est épuisé et on ajoute des quantités additionnelles de glucose monohydraté après 154 heures et ensuite, de 12 en 12 heures, .afin de maintenir une concentration d'environ 1 à 4% 'en poids/volume de glucose dans le milieu nutritif pendant tout le restant du stade de production d'acide de la fermentation.
Le tableau ci-après donne la concentration en acide gibbérellique dans le milieu en fonction de la concentration' en glucose à mesure que la fermentation progresse.
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Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> sucr<
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<Desc/Clms Page number 15>
EMI15.1
<tb> Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> suer'
<tb> 1/ <SEP> inoculation <SEP> mg.litre <SEP> % <SEP> en <SEP> poids/volume
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<Desc/Clms Page number 16>
EXEMPLE 6
On répète le procédé de l'exemple 1, excepté qu'on remplace les 8% en poids/volume de glucose monohydraté et les 0,24% en poids/ volume de nitrate d'ammonium par 10% en poids/volume de glucose monohydraté et 0,4% en poids/volume de nitrate d'ammonium.
Au cours du stade de production d'acide gibbérellique de la fermentation, l'excès de glucose existant dans le milieu nutritif est éprise et on ajoute des quantités additionnelles de glucose monohydraté après 60,5 heures, et ensuite à des intervalles de 12-24 heures, afin de maintenir une concentration d'environ 2-4% de glucose dans le milieu nutritif pendant tout le restant du stade de production d'acide de la fermentation. Le tableau ci-après donne la concentra- -tion en acide gibbérellique dans le milieu, en fonction de la concentration en glucose à mesure que la fermentation progresse.
EMI16.1
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Age <SEP> (heures <SEP> -après <SEP> .Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en <SEP> sucre
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<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
<tb> Age <SEP> (heures <SEP> après <SEP> Acide <SEP> gibbérellique <SEP> Concentration <SEP> en.
<SEP> sucre <SEP>
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<tb> l'inoculation <SEP> mg/litre <SEP> % <SEP> 'Poids/volume
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On sépare l'acide gibbérellique par des moyens connus par filtration du milieu de fermentation et passage du filtrat (60 litres)
à travers du carbone, On sépare l' acide gibbérellique adsorbé par élutriation, puis on le récupère et on le purifie par cristallisation. On obtient ainsi 63,6 g d'acide gibbérellique sous forme d'un solide cristallin incolore, qui fond à 233-235 C, en se décomposant .
REVENDICATIONS
EMI17.2
--------------------------- l.- Procédé métabolique de production d'acide gibbérellique par culture d'une souche active de Gibberella funjikuroi et arrêt de la croissance active pour promouvoir la production d'acide gib- bérellique, caractérisé en ce qu'on maintient la quantité de carbone disponible au cours du stade de production de l'acide gibbérellique en ajoutant au milieu une source de carbone.