BG98332A - Полипептиди на вируса на хепатит с (нсv) - Google Patents

Abstract

Разкрити са епитопи на вируса на хепатит с /нсv/,приложими като имуногенни реагенти и съответните антитела, както и метод за тяхното използване. </P>

Description

ОьДАСТ М №«Ο

Яеобр&мжете ее отнася » материали и метеж аа ре< гужране разпространението на хепатит С вирусната инфекция /ЖГ/, По-специално,то се отнася ж пожпоптиж.прижжмк като инунолотни реагенти при откриването, прежтвратявашто и лечението на HCV mhHwou

НА ИЗОБРКГВИИЕГО

151·;*

мнж ж откриването на мйого ебвря и спеотфични пожиептиди^прило жиш като имунологични реагент». Шж и»пр. Мм^Айяй а£,®& публикация ^318216 I Ното^йп й а!., нуждалия >388832 , GJ»® й at, Solow· /1989/ Ж, t 359-362 » Ъо й at, Science /1989/ Ж · 362*364 ί *ЪиоЙ©п й at АртЦу /1991/ 141381388.- d <1

- 2 Тези пубжжции осигуряват екстензивно ниво ва чинията в областта на ^V_ta еака също и получаването и приложението на НС7 пожпептидаи имунолотагчни реагента.

Други прилагат наготово и допаетряват работата яа Чтаоптоп СЪШО и ет al., ЙК Рат. ошсание 2239245 / Т&е ^М1соме Гоипоат1оп М,/ ,Waro,EF$ публ. -442,394 /Knifed В1о^м11са? Inc./, ^ипо ет at.,8R) птбл. »- 445423 Abbott Хавог./, Hasli er al.,EP0 руйКикапия 451891 / Ago H₄VJ _t P©y. е от al.,PCT публ.·^ № 91/155516 / Сепе(ав Inc. /, er a! EH) публ. 468 657 /Топен Corp./ , и Квмаоа βτ аЧ.ЕРО цубл,$ 469348 Х$оя^1. £е1уаки &.К. /. ^<J %вствителда,спе1дн>чни нето.ж за скришнг и идентНикапия на носители на HCV и Ж7-контажшрана кръв иж кръвни прожкти са вашю постижение не медицината. Дост-треноФузионен хепатит / РТН / ее появява у приблизително 10$ от попиентите.на. които е предавано грмщнато HCV ее кстановява в близо 90$ от тези случаи, йай-голевдаят проблем в това заболяване е ^Тгсстот?тя на. прогросигоне до хронично чернодробно увреждане /25-55$ /.Грижата за пагиептите,като напр. предотвратяване на нрьвопрелета нетна замърсена с крадв и кръвни продукта или тесен контакт на персонаж изисква шдевдш диагностачж и прогностични средства,като HCV >_южпептиди, за откриване на антитела, свързани е НСТДажва полипептици са приложиш също и като ваксини и имунотерапевтихп® агенти за предотвратяване и/иж лепеше на забодяваното.

Дтлиото №№ © сравнително нов агент, съществува промълвя» ваща цуждо от определяне на допълнителни типологични реагенти, които аиха позволили по-нататъино изследване на кленепшят κνρο i на заболяването и ешлемиологията на ЖТ в популацията.

• з ·

ОПИСАНИЕ М ШВРШШв ое отнася до ж.реоерижрот на нови Ж ежтош^^ж^трижржто ж тш егмтояи житолива ждуижое tti№ 4MMt 1ММН№ШЙММММН* ЖММ> MMMI ММГЯМЙМКвН -г-.иж-тищ f-. Мь^.ль4МШЬи*4|^м· мам &шЛЛ> а -—

ЯВ ЖлипОНЖдфив пуОДуШИц ЖИТО рВиНфИТ ННуЖЖЖмЖ 9 amWtJKR* срещу BBf мАгж иродужрш деииДОГ антитела ш вино Леи поле* пишд и п>деити са пржяювг иго стандарт* иж паагонти »_ж4Bl пяийамкааямкмкитлая «Иккамкямнмямль шй «Жеа мяка ммьдь |^ш^£4МмньмлшммИ1ша* млим***мм Ιμ-*^μ*·μαμμ ^м**^** «КгиЮТЛпВжгда TwjwtrW· И>«ЛЯ1 ЖИТО pWwlPWWWIf Нж ВЖЖЖоЯ ♦ *Чте1ПРШ1||Ц ЯЯИВ⁴* «ш.

**“Н>ffHft ЪМЕЬ-ЖйМк ЯЙ№Ъ®ЛМ1ИИВ ИМАхИТЖ 'МИИМУ ЖЖШМ1Ь №к ММЬ ЖЖЖИЖк4ИМ1 ЖКМЙ1 НМаА**АСМ* ^ШЬЖММ*

МЯпжкж RMlZw «W'lWlMWroeWUWf Тодай М 1Ж|1ШЖяЮЖ1Жгт> Iw4iw”wt» С^ЖЯ^т tfLV «им|К eMML4HB^№^ttvUF ИшИк.<ММЛПМЬ ИМ НЬ мшм ИМм>ЯШШМШк^м ·**’ *яжгав,<лмжж*ж ое аътри в » ножжижжите жеждожтел*

Ww- · *' —

Жсш»о& cw apt»m^_tmispwp ,в швиостиояи тестове,като те· pemooKW «w,«a скржш· ж аитивирусж атеиж, и на ижж· ранете ж иволмраии/пречистени Ж\* жжжжиде иж настини,

Ь жгеш най-а®грок с^съл.жстоягщето ивейпетемие е жсонеж жъи ждапептиж» съдвржщи ношм>характера нирмми HBV впитопи,паз— крти тук, метода ж подаване и® такива пожпептиж /»ш* реюмйшажни и сижепшж метода /штоде еа ивжжшяо ш ням оодажжжда / жто даегноатш?ж,ваижжж® и теражжииж / и вшаства на ярояиждатж.съетвж иж Йорми_гвдажирвж за тажва V иевоожж / вата жжжжида,жжреяея1 wt тгунотюйе W» ·»твърда nmpmot, орежи иж ижеяжоиеи ^тадажгичен състав /, «»г «· - «·>>

Аналогиниз,антитела / 1юж«жжжв,мояокжжлж,ида «жш«тй

-“Ht-irttfr ΊΒΠ1Ι ι№Τ— Titltfl*Jt ЛЬИЬ»Л9 «ММЛЛк^МИ*М ιΜ ·ί*Τ*ϊΗ0* —Τι ι—lTWtH inmiltli Mt“’ А *<·ΜΜ»ί·Μ^^4·<·^.^·ΒΜΜ1· CRUMk 4ЙМК*ЯВ1Ш —Λ - — — - — jMTMfca i 1ИнЯЗ₽ ©Вя^ВВЯ^К фзрвЯЧЯ®.ИИ1 $ ^'HOTR^:T45w*4KB8iJwS^ft®ra 1^р®Чм0ЯИЯИ и др, / срещу ежтопите дааирт w»c® ew вш«*еж в ой* хвата m ттож|ото ижйретеяю,е таж ewo и иетож ва подача* ване на такива антитела.жтода ва използване на такива антитеж /в жатстишдацаансинита и терапията / » обожи на проивводстж, състав иж ферм&цоттша фортлдаптиреж им ташва идалошеш / кое ожтем,|»адйдаж гв« икуш^ойе ида дара жиъртст, орал* иж идаомшоне» фермадегитея състав Л . 4 .

Друтт аспекти на изобретението се отнасят де китове за анализ на проби с оглед присъствието не ЖТ антиген .вкжктащи «

горните антитела в подрюдящо съжрвиде. Други аспекти иа изобретението се отнасят де детове за анадез на проби за присъствие на антитела,насочени срещу ЖУ антиген,включващи пожпептиж както са описани де-горе в дедходящо съ.дьржито.

Освен тези, посочени де-горе,даги аспекти не настоящето иде* г» . , бретение са t метод за получаване на полипептид, оъдардещ новооткритите ЖУ епители, вкдечвад иннубиране на гостопрешждеде клетки,траисг5ормирани е експресионен вектор, съдьрощ госледеваталност, кодеряща деждептид, който притежава. ЖУ епитопа при усдедея,шзволявящи експресията на полипептида | и шжпеитид,съдъряящ таим ЖУ е гштоп, получен по посоченият метод*

Чцунологишдате изследвания са също включени в изобретението» Те предвиждат имунологично изследване де откривана на ЖУ антиген,включващо инку&фан® иа проба, да която се предполага че сздърда ЖУ антиген е антитяло,както е описано по-горе при условия,гозволяващи формирането на антиген-антитяло комплект | и

*... * откриване яа антиген-антитяло ко^птлекса, съдържащ антитялото Λслецване де установяване на анти-ЖУ антитела включва инкубиоане f— на проба, която вероятно съдьтжа анти-ЖУ ажитеж е полипептид, както е описано по-горе, при условия, позволяващи фордегранвте на антитяло-антиген комплекс| и отжмване па антитяло-аятгден томплекса,съдържащ полипептида.

Съгласно изобретението са предвидени и ваксини де лепеше на ЖУ шлялия, които включват нмудегензн пептид,съдържащ ЖУ елитеяа,описан по-горе.

Още едан аспект m изобретението е метод яа получаване на

- 5 %»<

антитела срещу HCV, включващ въвеждане у щаден индивид не. изолиран полипептид,който е имуногенен и съдърза HCV епитоп. описан тук,в количество достатъчно,за да предизвика имунен отговор.

Изброените по-горе аспекти на изобретението са осъществени чрез откриването на HCV епитопи от формулата ^: аа* — аа където аа означава амино киселина х и у са цяло число,така че у-х — б аа_х-аа^ означава част от амино киселинната последователност на ^гура 1.

и х е подбран от групата,състояща се от ^:

23-34, 36, 66-79, 81-94,

96-98, 101-103, 186-189, 191, 206, 223, 232, 256, 286, 297-299, 321, 347, 357, 413, 414, 432, 465-471, 480-484, 501, 502, 521, 540-549, 579, 594-599, 601613 , 641, 662-665 , 685 , 705, 706, 729, 782-789 , 801, 851-855 , 893 , 916, 928, 946, 952-954, 1026, 1072, 1109, 1112-1117, 1218, 1240, 1280-1285, 1322, 1338, 1371, 1384, 1410, 1411, 1454, 1492, 1493, 1532-1535, 1560, 1561, 1566-1568, 1571-1577, 1601-1607, 1615-1620, 1655, 1695, 1710-1712, 1728, 1729, 17581762, 1781, 1808, 1821, 1851, 1880, 1908-1913, 1925, 1940-1948, 1951, 19661969, 1999, 2001-2004, 2006-2014, 2024, 204S-2053, 2055-2057 , 2071, 20882093, 2108, 2122-2148, 2165, 2187, 222^2232, 2244-2249, 2267, 2281-2286, 2288, 2289, 2325-2327, 2346, 2347, 2349, 2382, 2401, 2417-2422, 2439-2444, 2446-2456, 2469, 2471-2476, 2495, 2533, 2534, 2573-2578, 2602-2604, 26062612, 2632-2638, 2660, 2676-2679, 2688-2693, 2707, 2721, 2757-2762, 2779, 2794, 2795, 2797-2799, 2801, 2802, 2817-2843, 2863-2867, 2878-2884, 28862895.

- 5д·

Горните обекти се постигат cw и е помощта ка HCV ат фадожта « аа * аа' където аа означава ашно шсажна х и у са цяло адсло,равл5пто « у - χ -в аа - аа означава чам от амино киселинната последователност съглесто Фогура !| х

х е подбрано от група,състояща се от 85 /котето у а по-малто от 45/, 80 /йогата у а по-малто от 90/,95 /тото у е гкншлто ат 110 /, 99 / котета у е по-малхо от 210/ 500 /когато у е по-малко ат 550 /,600 Лютото у е по-мално от 625 / 1260 f котето у е ю-мяо от 1280 / ,Ю /когато у е по-толто от 1981/, 1570 /котета у е пниахто от 1590/, 1694 /когато у е no-wi© м 1735/ , 1949 /тотата у © по-малко от 2124 / , 1950 когато у е то-малто от 19вб/ ,2000 Легато у е ив-толто от 2050/, 2005 /тотото у е па-шлто от 2228 / . 2250 / тотата у е гю-мелто от f₉ 2267 /когато у е яо-мелто от 2285/, 2290 /тото у е то-мвлто от 2310/ , 2345 /тотото у е то-тодао от 2375/, 2348 /тотото у е по-малто ат 2464/,2445 / тотата у е по-шлто от 2475/. 2470 /тотото у е по-малко ат 2490 /,2505 / тотата у а по-малто от 2620/,2780 /тотото у е по-малко от -830 / ,2796/feraro у е то-м малто от 2886 /дототозу , 2800 /котето у е по-мелто от 2850 / и 2885 /котето у а по-малто от 2905/.

Във всято от формужтв по-тере, м-у в ио-малто или ре»* но m 10,20,30,40 или 50 в неком изпълнения ив изобоатажето.

• 6 *

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРГЖГЕ $Иг. 1 погазва полипротеинв на ЖУ кротжиятя мш на ШУЬ <кг, 2 гюгазва съставната ©Ж последователност ва HCV_r

Шкг.З погазва куклестидната съгласувана посжпрветелвоет на човешки изолат последоватажюсти оа »

покамии ж под сотищскната линия. %«веани еа също а амино

-киселините, кодирша в съгласуваните последователности.

'’W- ж . wr.4 покаева иуклвотидната съгласувана последователност на човешки изолат 27, вариантните последователности оа ш* паваж под секванционната линия ДЬгаеани оа cw в aww киселяв съгласуваната последователност,

Й1Г.5 погазва подавнените последователности не чорояки иволати 23 и 27 и на ЖУ1.Л>молож>91те гюсжлователности еа обмити· еМ.йжмвжжжто последователности еа е малки

-Q човеот изолатн 23 и 27 и на ЖУ1 Ломожжните жеждматдаямтв са е мои буюм, ^кг.7 показва сратнна на поджвжната съставна нукхеотмдна последователност на изплатите ^иогп^Ж^^НСТч^д _w ЖУ1.

$ιγ· 8 показва сравнеше на нучдаетижште иоеждевателюетм на Ж10 и състава w HC¥i пмледматежост| посждоаетелността а на линията над пунктира» а ЖУ1 последователността е на линията под г^шктира.

ΦίΓ.9 показва сравнение иа амино киселинните шследмателности 117*308 /съответстващ нв Ш¥1/,1©дараж в % &* последователността на човешки иеолати ^M8_tJ®fe3_tW7_t*hre_t ®1 • 7 -.

НАЧИНИ ЗА ПРОВЩАЯЕ НА ИЗОБтаЕНИЕТО

Пьжшто цитиране ва публикациите, отряда се № този w дал *т да йьДО итраш в яа изобретението * и 8 *%бж~ 9Г^Цр№* е ι, дшшшда ’Хепатит € вирус* или W се отнася до известни вдеденш видове^ патогенни дамевс ст доите нртниват 1ШЯЙ ,дак?о ν де атежирани дамева ил» ,жфеятивжг иитерфериреда ЧЙвСПЩИ ₍ДОДУИШ· от тях,^еногно евдм да ее видят пу^ждатт^пвжре®* и раадеж ^В^во да иоо6ретежето*»Ж№ гедо» е обхванат от ^®^И»веетнв е, w ЖС съдардащите жтуси притежават относително тека степен не спонтанна мутшжя, дояло даяж са стойности от 10^ де 16^ ва йдарпорирен нутоти* ^-®1® ^;^йре /,&реде това, деветте

Х‘?терогея»ста и издаячдаостта да гедатипа ее онвеждава в вирусите, налице са множество дамзвеАтлт,имне могат яа бъдат вирулентни или ажрулентж,® рамките на KCV жжвт*Дзадожава· изто,идентиф!ЩиданвтО|Окриванвто и изолирането на вирусните НСТ ***>

щтве или мзолати е дебре девушжира» в литературата·Неда по* вече, разкритото тук ивяши получаване на жагностици и ваксини за вируеж !’тамеда/изолати,б така съда и състави и метода , дайте са цридожвда в сврииинтежте пдацедаш ас анти-вируени етеити ва фаршюлодачни «ужде, кайте и srewn, жито имхнЖрат репягиетита наО.

В текеда да идобретежото е предоставена и и^ормщги ва различни дашве/изолио яа №ϊ₍η no-enwam за дам ида изот СДСЛО1 /дадачан ода НВД/,Яя|оршншя за вдай дам иж няодат, като частична даномна или ажне киселинна последеватояност, е достатъчна,за да позволи ма специалиста ι областта, жвползвайтеи стандартна т&хннтя да изолира ножи ща мове/и золмии и да установи дада такива ®м адоюве/изодатк са ВДЛдаммзр,нягодао рвяжш щамв/яоота еа описвш са полупе?» ет «η·—пш сантм. швяшен тю отношение на ттшкакяежйюст и геоповйЬсжи произжщса изолирани c помощта на и»|ормавия от iwwwara пое* ледаваталност па Ш1» ^фрмадията, предоставена «уж,е показателна за wo, па ЯВ* о вероятно дзлочеи родетаяияж на 'фжммижрусито. Семейството ^%ва— виаирида съдарка много вируси,които са малив, капсулицани патовени за човека, ^орфоло жита и състава на ^гатавирусните ттястички еа известни и оа дасжууяраии в ΒγΙητοπ /19вб/.’^й-овдо,гю отне* шание на морфода»ята,^вивирусите еъ.т?ьт»т пентроен тгкжета»ежд» заобиколен е жтждаа даойна обвивна, трионите са сферичш и имат жаметър около 40-50 пм.Техните япра са около **5-30 пи в даамотър.Пз продатнио на въндаата повърхност от вируедата обвивка иш проетгаи, които са отого 5-10 ям .дълги е тер/итлии макьюалосж сдало ? ш в ж^етърЛв^ж зд светвате са^Ш*) |/'И| '4cOAv'(tu^ (хиД^гм^ив U<>4 ιΛί^,Τβ пш^ежават пожти· но-верми венож / 11000 нуклеотида /, шгто es далю годалтя ет тези на MCV и кодарат протеинов тзокурсор около 3W0 ашгно киселиниЛдешдуадаи вирус» ппс-теини са тезграждат е тож презпязден полипептид.

Геио^шата структура и цуниеотидота посжгонвтелност на HCV генттта PRK са рееултат на дадрждоиГетмвт се явява aw* . , · верюта ИК,съдържаща приблизително W 000 вукдаоткда.^еношт е иодативно-верицен и притежава. напремъснвта,транслапионна отворена четяща рамка / ОРГ /, която допир® поли протони от около 1 О00 ашю кисежнн . В 0?Т,стру1пгуршжт тфотеин/и/ :<вио са кодирани в първата четвъртина нв ΙΣ-крайната област, е преобладаването на подапротаин,отговорен за ме-структурйите протвиж· • 9 Ногато co прави сравнение с венчай известни поелеиоветелиости,се наблюдават ^ж»,но значиш ио-жнеарии жмоложности е не~струк~ туряйте протеини от семейството не. фжвивируснте »в така студа и на пестивирусите /които сега се счита,че съпто прдавжежат пи семейство ^ванивилиде/· % базата н® првдпол»г®е?дате амино киселини» шжпаж-В ярк* леотидните яюледеветелнвстж на HCV1 н други ада^тажтаа, вероятните протеинови области « тф дареният пожпротеия,1йюе в приблгатажиите граници, co еж дайте ^!

	......шшжш
С / нуилео№* пояден	1*191
протеин /
2 / вирусен капсуларен
протеин /	192 - ят
1X1 /капсула /	281-900
II 2 /неизвестна
Функции /	800 - 1050
II 3 /протеаза /	1050 - 1850
II 4 /неиввестнв
функция	1851 - 2100
II 5 /полимераза /	2100 - 2011 /итей/

?ези области са, обаче преда^телж, екс одри ^нталня ^тример, S1-II 2 границата е приблизително в 750-810 областта,» П $· XI 4 границата е около ЖСМСВО.Нажцв « cw доказателство,че 191 аа версията на 0 е преиурсор, нойто е получен по-нататаж / кьм прбдадагелнз 170 ае с .далият А а II'2,11'4 и П5 протеините ся получени всеки в два по-штатмвни зрели протеина.

• 10 *

Очаква са различните щамове, изолати иж субтипове да съдържат мриацин на амино киселивг и нуклекдеви кисштнм,г сравнеше с Ж1,Зе жго изожтн се очаква да давана» тю-голяма да* положа / лота о* сдало 40# а общата bwri киселинна поеледзвателдает,сравнена с ЯСТ1,Обаче,мож да намерена,че чма други да-далда дадалдаи изолатмЛе бкха дагли да бъдат оттпе пелени WS® Ж съгласно различни крттедаи,датп например, едаа ОРР с приблизително 9 000 жлдаеотида до црибжадтелда 12 000 илигоо* тида.дадараща типротоян, сдаден да .размер на тези ж Ж1 ударен дажр^отеин със сдаяиа хил^офобде и/мли антигени»* ч^рахтерив«нва на Ж1 и присъствието де но-данеарнв аантидяи даслсдавателввсти*които са съ>гранеде с В даткжеяие,гедеш dir бил поян* тивио-вернжна Η3ζ

Ж шдира поне едан егогтов, който е имунологично идентифицируем с еден епитон ь Ж1 шж протеина. Актова е уникален ва а Ж дагато се сравнява с известните от по-рано ^лавивируеи.^миваиюстта на «питона жше да бъде детармгнирама праз неговата жцр нелогична реактивност е анти-Ж антитела и отсъствие ма ичудаде* лична рдекжвноот о антитела ердау иввостни от ^давивируса

Л ^етоде да определяне де м>^нож>игптта реактигдест са ипг-остде в сблесттв»нап1жмер,адто редеоимунодашчно изштване,изпитвеме да Ш?А _t дашгдутинациа и различни придерг ва даддаддаде кзедандаим*. осигурени чрез изобретението»

Обратно*сравняването hr яоследаветелността де Ж опитата е дозьнти от да-реде даедадаватедаости на «ленове от семейството $ » Фдавивириде може да бъде използвано за оценка де ^униналдестта»

Ь допълнение към посоченото по-горе,елвдаашит® параметри да нуклеиново киселинната дамодежност и амино киселинната хомодацдаст са приложими както самостоятелно,така и в комбинация, да идентифициран· на щама/мзолата като Ж. Ънолкото щамовете Ж и идалатите се еволюционно свързани,очаква ее,че жмологмята тю пелия геном на нуклеотида» ниво може да е около 10* или повече, дато вероятно е около 40* или повече,дори вероятно 60* ида повеи® и най-вероятно- около 80* ида повече, и в попълнение,ще иш BopecnoHwnew непрекъснати последователности по продължение на гоно около 13 нуклеотида. Следва да се отбележи.че са налице и вариантни и хипервариантни ебжсти в рамките иа HCV генома| поради доза хоуолопията в тези области се очаква ла бъда значимо по-жлю? от тави по поодъяженио на далия геном.Съответствието между предполагаемата ν гегомна последователност на HCV и.наппичер, СДО/HCV-t сЖН последователността, може ч» *ьде определена като се но доловят известни техники.Например,те метат да бъ.пат определени чрез дадачт· но сравняване на сеивенционната информация зя голичтелдотеда от пре,цголагае*ч^я HCV в HCV еДНК последователностите, описада тук. Например,още,те могет до бъдат определени чпее хибридизация па полинуклеотидите при условия, които армират стафида дуплекси между домодомните облеете /като ияпо. онези, които биха били използвани преда ра вгражда него/, до слепвано от незгражия^е с епгожерижна

специфична нуклеаза/и/,сле.л което се отдодолч размеов на оазгрядвндае хйдажтх фрагмент.

Ъряда еводациентате взаимоотношения нв щамовете или изолатите на HCV_t плдодтолагаемнте № щатве иж наолатм -могат да бъдат идентифицирани на бвяета на тяхната. юемодождавт на подапам· тидао ниво .Най-общо,^ домовете или изолатите се очаква па ^ъ.пат now 10* домохожни,повече от 40* х»мододо»,.вероятда ловене от около 70* домело таи и дори го-вероятно повече от дошложж.дато

някоя дари дож да са повече о* 90* домолодаи да голипептегне ниво.

Техниките ва определяне ажяо киселинната сетесяпионяа комвдежноет са известш в областта. Наппичер,амино киселинната последователност може да бъда определена директно и сравнена е последователностите, предоставел в описанието на настоящето идобретение.Обратдо.нуклеотидната последователност на генсмш материал от пведполагаемия Ш може да бъде определен /обикновено чрез посредничеството на сДО/, амино киселинната последователност, която е кодарана може да бъде определена и съответстващите области -сравнени·

Каят© ее употребява тук,полииуклеотид подучен от * определена последователност,се отнася до полинукгоотидна последовател·» ноот, която е обхваната от последователност е приблизително поне около 6 нуклеотиде.за предпочитане около 8 нуклеотиде.още по-добро от поне 10*12 нуклеотида и дери най-добро от поне около 15-20 нуклеотмдде съответстващи на областта от определената нуклеотидна последователност.Съответстващи означава хоможжност е или комплементарност спрямо определена последователност* % предпочитане, последователностите от областта,от която е получен полинуклеотида, даса хомолояаш или компяементарни на последователността, доято е уникална на НС7 генома.&де е или не е уникална за ЯС№ гонома, можа де се опрецаде посредством известни в областта техники.Например, последователността доже де бвде сравнена с тази от базата денС ни /както за приоритетна дата /,напр. Сепевапк,за де ое определи дали тя присъства в неинфектирен гостоприемник иде в други оргедезмиЛследователността освен това моме де бъде сравнена с известде / де приоритетната дата / последователности от други вирусни а агенти, вкдечително онези, доите индуцират хепатит ,нагтр. HAV_tHBV _я ад _{и е} членовете от семейство ^дедевириде.Съответствието иде несъо тветствието на подучената последователност спрямо други такива може също де бъде определено чрез дебридаоирене при подходящи костта на нуклеиново киселинните последователности са известни за спсциадестите в областта.Йш, напр. НмййВ е4 а{.АЙ2/.

В допълват, несъвпаденията на дуплексните тжнуклеотида. Формирани чрез хибридизация може да бъда определен» тю познати техни* ки,вкжчмтелно например, ре «града не е цуклеааи като 1, която специфично разгражда едноварижните области в дуплексните полииухло— отида. Области, от деитс могат де бъдат де лучеж типични ДОК пое— ледователностн включват, но не са ограничени да, напр. областите, кодиращи специфични е пито пи, като ие-транокрибираии и/иж не-трамслирани области,

Ц)лучешят делинуклеотид е незадължително получен по физичен начин от иукжютидна последователност, която е ложата, но моно да бъде про дуциран по различен начин, например -химичен синтез или ДНК репжкация или обратна транскрвгбция иж тредекрибция.В Д01Т1УБ1в19(в^жО1вХХп1ОШ|аК О* 9мЛ№&<11 СяОляИМсСаВЙм^Н НИ Оsipe^KHBlUITB последователности могат да бъдат модифицирани да начини, които са в познати в областта с оглед предполагаемото пгиложение.

Аналогично,полипептид иж амино киселинна последователност, пвидачжв от определена амино киселина мж нуклеинова дееелтяв се отнася да пожпотшд с идентична амино киселина ва тож дож* пептид, който е «одарен в последователността, иж на негова чает»к като таж част ое състои от най-малде З-В амино киселини, и за предпочитане поне 8*10 амино киселини, и дери де-преддечитано —io амино киселини, иж поите мкгат да съдет идентмчжцярани по имунологичен начин с дождептида, надарен в последователността. Тави терданологяя вкжчва съцо дедадептид,екс дресиран от опреде* лоната нуклео

последователност.

Р<мюмбинаятиви1 иж получен полипептид не е задължително транслиран от определената последователност на пиво«EKSKfWK ММВВ ДВ (ЗжДда вjXSдухф* jJbR ПВ ЯВЯНРв И Дв 9 НКЧвИ^ ЯиЯВЧМПМ1ЯНв1 например химичен синтеа иж експресия на рекомбинантна експгесионн

- 14 на система, или изолиране от HCV, включително мутапия на HCV.Peкомбинантния или получен полипептид може да вкжчва един или повече анадази на амино жселини или не срещани в природата /синтетични/ амино киселини в тяхната последователност.Метода з® инсертиране на аналози на амино киселини в последователностите са познати за специалистите в областта.Те могат да включват ада или повече маркирания,които също се познати нв спеша листите.

Терминът реяомбинантен пожнуклеотид* както се използва тук предалата полицукдеотид от геноша.сЖК, синтетична, или със синтетичен произход, постигнат благодарение на своя произход или манипулиране t 1/ не е асоцииран с всички или част от пзлинуклеотида с които не с® асоциира в птродата ,2/ присъединен е към полинуклеотид,различен от този, към който ее приеъежнява в природата, или 3/ не е© среда в природата.

Терминът ^И1юлинуклеотид*както се употребява тук, се отнася до полимерна форма на нуклеотид с каквато и да е дължиа, независимо рибонуклеотид или дезоксирибонуклеотид.Този термин се отнася само до първичната струк^гра на м>лекулата.Твка,този термин включва дк двойно- или едао-верижна ДНК или РНК.ТЬй включва също типове на мо,дафикада,нагцжмер,белязания,известни за специалистите,метижрания,*капеулирвиия^в, заместване на един или повече от природа срещаните нуклеотида с даден аналог,интернуклеотидай модафикапии, като например незаредаж свързвания / като метил фосфонати,фосфотриестери,фосфора>дадати,карбамати и др./ и със заредени връзки / напр. фосфоротиоати, фосфор© датиоаж и др./,онези,съпъртада допълнитено пртсъедидени части, като напр.протеини /включително нук4 «...

леази,токсини,антитела,сигнални пвптида,тюли-1-лизин и др./, онези с интерналаяврк / напр. акжжн,псорален и др./,онези,съдържаш хелатори / като втали,радиоактивни етаж, бор, окислявани детали / онеш, съдържащи алкилатоги,онези е можТмциряни връзки /като алфа аномерни нуклеинови киселини и .др. /,нскто и неждафипирани форда на пожнуклеотида.

Прелистен * пожпептид като термин се отнася до полипептида, който е в състояние,показващо че е свободен от други полипептиди,т.е. в одеимикИо съдържа минимум от около 50^ тегл. /желан пожпептид/обцо количество пожпептид в състава Λ за пред·

Г почитане около 70^ и дох» около 90# от желаният пожпептид,без оглед № не про таено дете мятешали в състава. Х“*нмките за пречистване ва вирусните пожпептида ся известни за специалистите в областта. Очистените антитела се дефинирани ечалогично.

* РекомС&нантни гостоприемникода клетви**, клетки гостоприлинии”, клетъчни култура” и други поде дебни термини обозначаващи микроорганизтж иж пруде еудапиотични клетъчни линии, култи ви рани като едно клетъчни ,се отнася де клетки, които могат да са, били са или ще бъдат използвани като ^ципиенти на редембинантен вектор иж друг трансфер на ДНК, _и включват потомство на оригиналната клетка, която е била тоянсфектирана.Зняе се,че /може да се разбере,че/ потомството на отделна дарентажа клетка може да не ЙЯдеж задължително идентична в ’ морфологично геномно иж ДНИ отношение като оригиналната родителска клетка, благодареше на природде, случайни иж преднамерени мутапии.

Ввпжкация” е генетичен еле ент ,τ.β. пдазмид, хромо sow, вирус,дезмид и др.,които се отдасят като автономни единици на по ли нуклеотидна репжкация в рамките на клетката | т.е. те са спо собни на репжкация под свой собствен контрол.

Вектор” е репликон,в който други пожнуклеотидни сегменти са присъединеш,тада че да допринесе да репжкапията и/или експресията иа присъединения сегмент.

** ^Ънтролна последователност” се отнася де пожнуклеотидеи поеледедателности,които да необходими, за да въздействат на екс просията на кодиращите после .го ветелности, към гоито те са свъг®аш.Яриродата на такива контролни последователности се различава в зМрисигост от гостоприемниковия организъм} в продашотите_лодебни контролни последователности включват предамо промотор® ри* бозомен сайт ва свързване и терминатери! ® еукарнотите контролни* те последователности включват промотори»терминатори и в някои елу иди, тн-усилватели. Терминът контролна последователност* включва като ’«нимум всички компоненти, «ието присъствие еиеобходимо за експресия, и може също да включва допълнителни компоненти,пие* то присъствие е преимуществено,например,ждарни постегователности Оперативно свързан* се използва за да обозначи съпоставяне, при което така описаните компоненти са във взаимоотношения, позволяващи им да функционират по очаквания начин. Контролмшоследователност оперативно свързана* към копираща послелователностсе лигатирана по такъв начин, че експресията на кодиртеата последователност се постига при условия, конкурентни с контролната последователност.

Отворена четяща рамка* /ОНР/ е област от полинуклеотикгната послеповптелгост, която кодира пожпептид} тази област може да представи паст от кодаращата последователност или пялата копираща после пователност.

* Кздераща последователност* е полинуклеотидана послепователност,която се тронскрмбире в м?НК и/или се транслира в полипептиддато се поставя под контрола на подходящи регулаторни последователности. Граничите нв кодиращата последователност са определени посредством транслационен стартерен кодон при 5 - края и транслационен стоп кодои при 3 - края.Кодиращата последователност може да включва, ж не е ограничена до мРНК,_сда _м рекомбинантяи гожнувлеотидни последователности.

- 17 ”ймунологично идентиажцируем* сАзто се отнася да присъствието на епитопи и пожпептиди,които също присъстват в каления полипептид/и/,обикновено HCV жоптеитада протеини.Жтюлостшна иден личност може да бъде определена през свързване е антитяло и/или конкуренция при свързввнето|тези техники са известни зя спеттиалис тате в областта.

Както е употребено тук. епитоп* се отнася да антигенна детерминанта на пожпептида. Цдан е пито п може да обхване 3 или повеи аминокиселини,които определят сайта на свързване на пареното антитяло. Най-общо,един епитоп се състои от поне 5 амино киселини и понякога от по 8 a who киселини. Атолите за картиране на епитопите са известни в областта.

Здан дажпептад е ” имунологично реактивенс дадено антитяло, когато то се свързва е това антитяло благодарение на разпознаването на антитялото от специфичен епитоп, съдържал се в полипеп тида.^унологичната реактивност мо-зе па *ъпе оптедедана чрез свър зването на антитялото,и по-спепиално чрез кинетмката. на свързването на антитялото, и/или чрез конкурентното свързване с помощта на познати пожпептада като конкурента, които съдържат епитоп срещу който е насочено антитялото.Техниките за определяне дали дадено антитяло е р^унологично реактивно или не,са познати в областта

Както е употребено тук,терминът антитяло се използва за полипептид или група от пожпептида, които са обхваната от поне едагн антитяло комбинираш сайт.Антитяло комбинираш сайт иж свързваща област се Формира от гънката на дазжчж области на молекулата /е/ на антитялото,за да се обпазува три-жменсио на лна свързващо пространство с вътрешна повърхност, формата и заряда на която са разпределеад комплементарно на това в едан епитоп на даден антиген и който дава възможност за имунологична реакция е антигена.^дан антитяло комбиниращ сайт може да бъда формиран от тежко и леко верижна област /У_н и VjZ съответно/, които *оржрет хипервариабилна бримка,способстваща на ангигенното свързвана. Тершньташитяяо* вкжята, те пример, янтетяла от организми от разред вертебрата,жбрилни антитела, жмерни антитела, едно валентни антитела, изменени антитела, Гав протеините и антитела е ежнипна абласт.

Както тук е употреба», антитяло е аданична област /о/Ав/ е антитяло, което е обхванато от VH област,реагираща самостоятелно имунолошчно с определен антиген. оАв не съдържа V- област,но

-за която се знае *г ад» да съдържа .друга антиген свързваща област,жхшкххж съществува в антителата,например,кяпа и ламбда областите. *%тодите за получаване на cUe са известни в областта.$<ж, напр. Ward. ei аЛ/1989/ Антителата могат също така ж бъдат обхванати от ^V _H и области,«адао и други познати свързвани облеете. Цжмери за тези типове антитела и методи за тяхното получаване са известни в об ластта / виж, напр. ПС&тент 816 467 ,който е вритеен в пшложе ната литературна справка /, и включва следното ^:

^.пример ‘вертебрвта антителата са такива антитела,които оа тетрамеги шй®ЗДйгате,в:

ащи лени и тежки верига,обикновено агрегирали в *У* конфигурация и които може да са или да не са ко валентно свързани .4жно киселините в тези адаител® ва хомоложш с амигокиселинните последователности,намерени в антитяло,продуцирано от жмфоцити,явява ин /;Ьо /например в хибридами/фВертебрата антителата отекдавено включват природи? антитела, например пречистени пожклонални антитела и тоноклотлж такива.

Пример за получавана на такива антитела са отесаш по-горе*

Хибридни антитела са антителата,в които ежа двойка от тежките или леки вериги е хомоложна н® онази от първото антитяло, докато друга. Двойка от тежката или лека верига е хомоложна на двойка от различно втора антитяло.Типично е,че всяка от те» две двойки свързва различни ештош, по-специално от гозлтпа* антигени. Това води до свойството ^мбивалнетност,т.е. способността да свързва два антигена едновременно.Подобни хибриж могат да бодат форшраж с помощта на дамерни вериги, канта е посолено та-чнно.

* Химерни антитела са антитела,® лойта тежката и Аж ле» —’ к& вериги са слети протеини, ^икговего постоянната обгяст от веригите е от един специален вид и/иж клас .дата гшзда«ните обла© ти са от рвзличвиеяид и/или клас. 1ъч тази група се w\wma и което и да е антитяло,в което всяка или и даете вериги -тежката или леката,са съставени от комбинация на последоватедаости.иштираща секвещиите на антитела от различни изто^чици, независимо .дали тези източници са от различни класовЙ^зжтни чипове по произход, и дали или не точката на сливане е на различни/постоянни гранични честа Дака, възможно е да се гтподадарат антитела,в таита нита постоянната, нита различната област ж имитират известна антитяло после лова тежест. След това става въятода»,чвпгимер, да се конструират антитела,чиито вариабилен дагион притежава. по-висок сне цифичен афинитет за спетшалния антиген, ида пият© постоянна област може да покаже аовитеиа фиксация на кожлемента, или па ияиужг създаде .друга подобрения в свойствата,постигнати с честитено постоянната област.

Друг пример е “изменени антитела, който се отнася по антитела, в които природно срещаната ямита киселинна последователност па вертебрата авнтитялото варира.С помощта да тдаюмбинантни ДНК техники,антитялото таже иа бъде реконструидано за получаване на желаната жсядашшш даряктеристида.Ььзможнит® варианти са много, и граничат от издадени® на една иж поведе ад® киселини да пълното реконструиране на дадена област, например, константна ой· ляст.Измененията в постоянната обтаст,дай-обдо,да полчдадеде на

- 20 желана клет^нв характеристика, гато гапр. изпеят®?© па компл©- ... « ментарната <*1коация,взаи?дадействия с мембраните, и други Функции. Изменешята в различните области могат да *ъдат направени с оглед изменение на антигеннит© характеристиии.йдгитялото мож© пв бъда реконструирано така ч© да се постигне с.петтифи¹ ното ргзлежне иа моленула или вещество при cneiw<Wn?o клетъпда или тъканно жсто. кланото изменение може да бъде остществехо през познати техники в ш)лекулярната биология,като рекомбинзнтня техники, сей» насочена да/тагенеза и др.

Фце е дан пример е едаовалентното авдатяло*, което е агрегат, обхванат от тежво/леяо верижен дамер.Тож тип антитяло избягай антигенните ^?т>дулатдаи .Виж,напр. С1еюйе е? аЪ/1982/.

В определението жа антителата. са включени също и *Лю* фрагментите на антителата.*Гад* областите се отнасят до онези пасти на тежко и леко верижните антитела,които са грубо еквивалентни, или аналози,на последователностите,които обхващат га склонението на тежите или леките вериги, и които както се знае, са имунологич но свързани към специфичен антиген, но които не притежават е^екторяата ίο част. Гав* вкдапва яфякж агрегати от едаа тежка и о^г’ една лека верига/ойдаизвестна като Гад/ така както тетремери.съчърдащ» 2Й и 21 вериги /отнесени към Г/авЛ, /, които с® стюсобт на селективна реакция с определен антиген или антигеяно семейство. *Гав* антителата може да бъдат разделена ва субедамгии, подобно на тези описани по-горе,напр. ’вертебрата Гав*,хибрида? Гав,химерни Г_ав и из ленени ^вЛетода за получаване на Гав Фрагменти на антителата са известни за специалистите в областта, и вкжгват,например,протеолизис.и синтез чрез рекомданантни техники.

В термина *анн?тела* са включени също и ецно-верипни, антиген

- - 4 свързани / СА/ протаиж, като типа,описан в статията на сп1ом, I. в изданието от 15.юви,1Ж , Cancer ?е ©агоп /дакто статията,пмтиоа

.. HI _

Наето се употребява в текста, терминът * имтногенен полипептид е полипептид, който проявява целуларен и/иж худапален имунен отговор, независимо деж е самостоятелен иж е шжсъежтен към «осител в присъствието иж отсъствието на адеувант.

Терминътполипептид” ое отнася да пожмер от а мида киселини и не се отнася де специфична .дължиш на пподуята| тана.пептиде, олигопептиди и протеини са включени в рамките да дефинижята ва пожпептид.Този термин съда така несе отнася де иж изключва пост©кепресиоижте модафткатжи иа пожпептиде, като гжкожлатши.атштилираие,ФосФорилация и др.В дефишшията са включени owe,например, пожпепшда,съдартада един иж повече аналози да екна aw киселина /вкжтително яаггр. непжподда swho киселина Лпожпептиж със зямесетин свътлданшра така съда и други моливи капии, познати в областта,както природно,така и не -шжродао спещащи се.

”Тпансформшд!я’’,к8кто се употребява тук, се отнася да инсерция на екзогенен полинуклеотид в гостоприемникова клетка, независимо от метода,който е използван да инеерция.дапр. деректно поглъща* не, тртнс душния,/ -кръстосване или електропотжпия.йгзогеншят пожнуклеотид даже да ^ъде съхраняван като не-интогриран вектор» да πρ. пжзш'Д,или обратно,да» да ^къде интегриран в гостиприемнико» геном.

•Лечение”, както се употребява тук, оз напева пробилатота и/иж терапия.

Мндавид,както се употребява тук, се отнася де вертеп по-специално де пленове от вид» бозайници,и включва,но не се огрени паве де животни като кучета,детки,овпе,свине» плъхове, мишки,мороки свинчета,рогати животни и др. / но и примати,включително маймуни, шмшюнзета,бабуини и хора.

_o 99 _w

Както с© употребява в текста, смисловата верига на нуклеинова киселина съдържа. последователността,ноято притежава секван* ционна дешлогия е тази на мРШ.Анти-сшсж>вата верига” съдете послетоватслтост,която е иомплетонтарна на тави от ^мстословат® верига”,

Както се употребява тук, позитивно верижен геном на по лен вирус е този, който ,независимо пали е ЖК или ДНК* @ е^то-гепижен и който кодира вирусен шжпептид/и/.Примери за позитивно верижните £ПКзи1 вируси включвай > Ioto’ztW *С^-^.,_a <-. w.*₽j_co.>.,n т >b?_F Cai Дук се причисляват също и Г^·’'<.'··*-· ,които фор* .5 , ' -- ’ майно се отнасят към %;><^:' ‘ Ь? / Ейж -Йе(о\. < И<г?рв Ада/ /.

Както се употребява тук, антитяло, съдешато телесен компонент се отнася де компонент от тялото на индевиде, който е източник на интересуващите ш а>1тетела.Дт?тяде,съдържЕщо телесни компоненти еа известни в областа ад тохшката и вклютоят.то не с$ огтошгтони до,депример, плазма,серум,спинална течност, лимона течтост.външните отдели не респираторния тракт, чревния и генитален *^iw,c*^,c.w! ка,мляко,бели кръвни телца и миеломи.

ΐ^βκτο се употребява тук, биологична тооба се стопен то пгоба, от тъкан иж течност»изолирани от падея иждевид^ключито.жю,^© но ограничено де,например, плазма, серум,грВбнтоно тозътм· тотоост.нк лимфа» външни отдели яа кожата, ресжрртония тор кг, итегтинуто и гедеталиите, сълзи, слюнка ,?дляко,кп1В1да клетки, тто-с-ш,олтони и тока също и пробк от > . 'Г«··.·γ> клетъгяи култури /вягияттелно.но че огрени чадещо се де постоянна среда, полутона културалмата клетъпде среда»

II» ОПЙСА№ НА ИЗОШ^ЗЖЕЮ

Съгласно настоящето ято Летете се изподеват, тотолгото не ее указани други, донвенпиотолни техни»» от толеголярто-де ^хиология,

- 23 микробиология, рекомбинантна ЖК, и имунология,които са известни за специалистите.дози техники са обяснени напълно в литературата.

See e.g., Maniatis, Fitsch & Sambrook, ’Molecular Cloning; A Laboratory Manual (1982); *DNA Cloning, Volumes I and П (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed, 1984); Nucleic (B.D. Hames & S J. Higgins eds. 1984);

Transcription and Translation’ XB.p^Hames & SJ. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.);

Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth Enzvmol Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively), Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Veriag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986). All patents, patent applications, and publications mentioned herein, both supra and infra, are hereby incorporated herein by reference.

И. K Скъсени HCV по.тгипепти^ .центилициравзпгеи описани по-долу нови HCV

БОЛЯЕс.т конструирането на. полипепткзм, съдъргвпи скъсени /по-точно срязани / НС\- последовете—ости, които могат да ^ъдат използвани като 1сунологични реагенти.

Скъсените HCV £?я’’:о птоелинни тоследователности, кодиращи поне един вирусен епитоп са полезни имунологични геагенти,Нрпри'’ет, потомке: липи ек гк -c.mmkbc опъсето: псслетовгтелности могат а бъдат използвани като геагенти в де де но имунологично изследване, дози голи лепти.ги сг оът.о андидгт субетоммтоши иа антигените в състав за тотолмгвам-ме нг ам-мтммсерум или ваксини,/-околното тези скъсени после* 24 * дователносте могет да бъдат получен» чрев реалхчнм познати мгдожш, .включително трешр&ш на нативен вирусен протеин, предпотета ее да ее получават по синтетичен хи или реиомбинаитен ттътАждаптида.съдакащи теан скъсени BCV последователности могат да бъдат тдучеш да пълната HCV последователност /едан или повече етштогж,жт иепрекъснати,така и прекъснати / или № последователно е сти и хетеродолш последователности на сляти протеини.Ц>лесните хетеродожни досладоватежости включват такива,които обезпечават секретирането от рекомбинантен досто1джемник, постигат имунология ната реактивност на НС7 ©гжтопа/те/, или улеснява удвояваното на полипептида & имунологична повърхност или вансинален носителки • — - *·’ * ,,л

ЕЮ ггубл. W 116 201 ,П патент $ 4 722 840 ,SR> яубл. ® 259 149 , Н.--. патент ^4 629 783 , включени в литературната справка»

Размера, тш пожпептидете.обхващада скъсените HCV последователности може да варира широко, пате шнидалният размер е последователност е размер дастетъчен да подсигури епитоп,.подато македмалният размер не е ограничен.Зв удобство,максималният размер обикновено е не по-голям от онзи, който се изисква за обезпечаване на желаните HCV епитопи и функции на хстероложшта последователност, ако има такава. Обикновено ечъеенота последователност е в обхвата на от около 5 / или 8/ до около 100 адано киселини в далжда.Дз-тидачно е,обаче,НС7 последователността да бъда максимум от около 50 ж /или 40 / амино киселини в дължина, и понякога даксимуи от около 20,25 или 30 адано киселини.Обикновен е желателно да се подберат последователности от поне около 8,10,12 или 15 амино киселини.

Примери за скъсени амино киселинни пое ледовете лноств /октамери /.които са приложими така,кекто е описано тук,са дадени ио-далу dh· гфимерште изпълнения.до се разбере,че

- 25 тези нептиде не винаги точно картират даден епитоп.^й»т©геяш части от дееяедевателността могат да бъдат определени с помощта де мнвеедюделде техники и след това да. *ьдат дедетираде от нея 1Ъ-детатък,може де бъде идентифиитоана друда следваща скъсена HCV ашно десежна де начина, дейто вече е описан.

Нодадедеидеи продетаг,съдеряйде| овъеедете HGV дееедая де деояедедетелдеоде дегет де бъдат изготвени дато дескретде пея тида иде да са инкорйориреде в ш-дедег дедепетад, и може де намерят приложение както бе описано вече.В предаочитажят начин на придадеше* е късаните последоветеж-ости от Ж и/иде обдасти« те намират приложеше като ваксини иде терапевдечж продукти. Акато в човечето случаи всяка от областите може да има дедедео диагностична прклодемост,С,Н 3,И 4 и II 5 са специално предпочитани в комбинажяЧ 0 епитопи е епитоде от еден или повече от Н 3, II 4 иде И 5,

ШЕ

ЧАВАНЕ НА ТЮЖШПВДй

Наличността на ЖК деследедететети , тожради адеде жеаденде последователности позволява конструирането на експресионж вектори, кодаращж адеигенно активни области ст подедептида / напр, Φίϊ·, 2,/ Дези антигенно активни области мре гат да бъдат получени от покриващи иде жаисулде антипеде иде &т антигени от вътрешността, които не са отру1Н^рде,икл»ч«и,депдемер деде1^гклдетид свързващи протеини,полинуклеотмд пожмнраде и други вирусни протеини,необходими за репждедаят® и/иде стека* вяното на вирусната частица, ^рагченти.гождада» желаните подаден· тиде ее w лучават, например от вирусна еЖК клонове с пошадтз на коквенциошлнн начини зс рест^кцденде разграждане или чрез син• 26 * тетичш метода, и са включени във вектори,които могат,нвптяптр да съдържат части от фузионжте сеивендаи «ато ^! -додадашдава или суперокеид дасмутаза / /,с предпочитание ти. Летоде и вектори,които са приложими за получаване на ито съдържат фузионни лодадоватедада иа са одаеаж в публикация * 0195056, цубл. на 1 .οκτομβι», 1986. Антори, дож рда Фузионни полипепткди на ОД и HCV гожпептида, дато ПАП^7^ , IXAHBjgl и С100-3,които са кодирани в структурата яа XV ©ДНК , са опнсада в Издалите П»Вл ,IVJM и TV.ВЛ,съответно.Ьеяка част /па желани·/ ва XV ©ДНИ, съдържаща отворена четяща рамка /иж нейна синтетична версия /,може да бъда използвана за да етепревира режшбинантен полипептид, като зрежя иж фужонеи протеин.

Обратно, полипептид, съдьрякц XV епитож мо»® да &ьт получен чрез химичен синтез е помощта на стандартни техники да базата на амино киселинната последователност от фигурите и припетите.

- г···

ДНК, кодираща желаният толипептмд, независимо даж е в слята или не формати даж сшш или не сигнална послежвателдает за да дззвож секретиране, mow да бъда лигатирада в екстгоесионни век тори, подходящи за всеки подходящ гостоприемдажАхто етнегиотичните.твка и прокариотичдате гоетоприемникови системи по-рано оа използваш! за форирда иа редомбинантни полипептида и клетъпдат® линии са посечени в публ. 318 216.Ц)жпептида е изолиран от жзирали клетки иж от културелната среда и са пречистен» *

до степен,необходима за приложени еж им.Пречистването оже да е с технида,познати в областта, например,различни екепракиии.Фракциониране със сол, хроматография върху йонообданна дала, афинитетна хродатографйл, центрофугирана и др. подобни Аж, напр. ‘4тпдо: 1п Ьц/умоХооу за различните метода за пречистване не гдотеидаг.

Такива пожпепткда могат да еьдат използвани като диабетици, или онези,които допринасят за неутрализирането на антитела w да бъдат формираш във ваксини, Антитеда, действащи срещу тези пожпептида може съда да бъдат използвани като диагностици, иж ва пасивна имунотерапия.3 допълнение,дакто е даокутирано т*горе, антитшшта срещу теак полипептиди са придадеш например за изолиране и идентифициране на HCV частици.

полипептидате могат също да бъдат изолирани от вириош и да бъдат ерязаш/аж© още не саЛШриожте могат да *ьдат култивирани в KCV инфектираш клетки в тъдашя култури иж в инфектиран гостоприемно.

пХ шшв на жиганяи жжютади и тетлщя с шсиш

Андагенна област на пождаптид е обикновена сравнително м i

малка - 8 до 10 амино киселини или по-мвлио в дьлжна.^агме™ толкова жлшцволкото В ажно киселини могат да хврметеридерат даден антигенен регионЛези сегменти могат да кореспондират ж С ЙС7 деодеи антигена. Съответно с това, използвайки сДО на като база,ДВК кодиращи къси сегменти на HCV пожпоптиж могат да бъдат «депресирани рекож&нантио както като фужонж протеини,тека и като изолираш пожпептиди. В допълнение, къси ажно кисежнш последователности могат удобно да бъдат получени чрез химичен еинтеа.В случаите, когато синтезираният пожпеютд е е праделна ю^фгурахдая.така че да обезпечи прежлшя опито»,но е твърде малък аа да е ищуногенен, полипептида може да бъде присъеданен * към подаодащ носител.

%ого техники,които да са приложи® аа получаване на подебде свързвания биха могли да бъдат използвани и те са познати за спе* мштте в областта Дова са формирането на дасул^идаи госдаве е помощта на 11-сукщттжжл-3-/2-шридалтио/про1Жодет / И Р / и сукдадададал 4-/ ХЬ^жлеимида-жтилЛтклохввсян *1*карбогои* лат / ЯЗС / полумен от Pieroe йм₽. Роск/ого Д11!по1 ,/акс в пентида липсва сулфждтмяна група, тя може да бъда доставена с добавяне на цйстсинов остатък/, Тези реагенти създават дасулФидни мосотве помежду си и пепдадаите шстеинови остатъда m е дам про* теин и амидаата връзка чрез опоияоя*амдао с лизина, или друга свободна амино група в другия, Жвестш са ре з лични такива дисулфидао/ежд -формиращи агенти. 1иж,напр. Хмммп Fey /1082/ 921Ш Други бПуштаоналий удвояващи агенти формират тиоетер вместо да* сулфида» свързвано ,.W?oro от тези тио-етер-фоширещи агенти са тър говеда шдаодавда и вкжчват реактивни естери на в-мамттдажапро* дава киселина,2-бромдапетиа киселина,2-йодоопетна киселина , 4* / ХЬчделожда-мвтнл/шгфохедааи * 1 * карбоксилна киселина и други подабни. ^арбодаилните групи могат дв бвдат активирани про» ком^нирането им със сукцинимид ида 1-хидрадаил»2 штро-4-<тфда ва киселина,натриева сол. Допълнителни «тода ва удвояване ив антигени с помощта на ротавирус/ свързваща самюшл* е описана в _ ..... - I

ЯК) публикация 299 149 , която е втаотова s литераеурида» епрмт» Изброените no-горе метода не ся изчерпателно дадени,могат па бъдат използвани и друго варианти и модафмкдаии на посочените съ вдадения.

row да /Нде използван дакъвто и .та е носител, който сам по себе си не иидуцира проданитшто на вредни за гостоприемния» ан титела. Даддадящито носители са обикновено големи, бавно датаболизи' ·* . . ·— . «·** раж дащродалощули,дато протеините | поливажрида,агаро»а,падало»», целулозни четки и др. подрбш| полимерни амино киселини,тато пожгдутаишова киселина, по ли лизин и др., амино жеевч® даголижрк и • 29 инаитижрани жрусж частици,виж иапг. ^едал И, Д. Особено не· леят протеинови субстрата cs. серумните олбт»,«ини,хе»епиаг!»ч, иц^гиоглобудатови шлекуж ,тирогж>будахлвалбумин,н да протет®, добре позната на спвциажстат® в областта» идятджм жмж имшм ,¾¾¾¾¾

аа..„«м

I*“

^ногенността на епитодате на H0V даже да бъде постигшта aW чрез получаването им в дрождани кж бозайжкош систеш. шито са слята с или комбинирани с форжрещи частички протетю.тото например онеж,асоцииращи се с хвпатжт В повърхностен антиген. Виж напр» 1Ь пат. 4 722 840. Стрударите.жждато епитопа е свързан директно вън протеин, формиращ частички,кодирейки тежтоватежоота,прод5п®рат хибрида, които са тутгешк що се касае да HCV епитошА попълнение,волт: от векторите, тоито са получени, включват е!штож,сп®цкфич1ж за « притежават различна степан на имунсгеннтот, като напр. пре·- пептида.Тата чаетат. тонстру-иреж от частици формирмда протеин, който включва НСТ последоватежовти. са туногенни що се касае да HCV % HBV, ^епататния поаър/аюстен антиген / ИВ Д© / крито се знае, е формиран и включен в частици на .cere ^{; ; (} f ^Ла1егЛ®1з й а!» /1984/ /. -ЗЬршрането на такива -астада постара ияупогон»встта на моноедрна субежницв.Структурата w ожо да шжпва wvroIBUIHIBSS епитоп на ИВ 4>,вкжгпвайда 55 -те агано ижежж на · · пред-повържюетнвя/пре * / регион. Поигай й. ®1./ΐ984Λ Структурата на пре- · - НВ.Лр частица»вширеси^еяа в дрожди е ряздатж в ®0 дубл. ГМ 444.публ. ^рт !9,1986| жбр?де,вкжжващи хетеро ложни вирусни цоследавателнесш за дрождава експресията раввда «и в ®0 175 261,пу6л. Март,26,1966Леда структури могат да бъдат експрасирани в клетки ж бозайници, като напр. овариални клстж ш дпоною! хдедер /CW е помощта на ШО*диж.жроф©лат ре^гктазвн вектор / Rlemlis ©т.а!. /1984? /.

В депьлн©ние,частиДО· протеина.формиращ частички,ж>йто кодера последователност» дояе ж бъде преместен с кодони.доциращи еж· топ. В това претстваио, областите, които не е еадължтелнг да меда· ирет агрегапията на единият® за ДОрчираие на имуногенни настадг, в дрозда или бозайжци,*югат да бъдат дахетидани, кето ό тори ничии зе ежжнкрет допълнителшт® HBV антигени» сайтове от конкуренС да с епитопа.

II, Е, ШЛЯАВШ ЯЛ мжжж кси ни мстет да бъдат получени от ©ден или повече ижу· ногвжи делипептида, получени от своя страна от НСК ?ези газжпептида догат да бъдат ©депресирани в различни гостоприжнтв1г клетки / нагт. беятерии, лрожда.ижекж иж бозайнидени клетки /, иж обратно,може да бъдат мзожраж от вирусни препарати иж да са синтетично създадени. %ю~или мулти-валентните ваксини срещу ** HOf могат да бъдат обхванати от еден иж повече епитож ид ©жн или повече структурни протеини, и /иж ежи иж повече одетож от ©дан кж повече ^структурни протеини Деви ваксини могат да обхващат напр. ревомбинажж Ю гтолипептида и /или пожпептида» изолирани от вирнеш. В частност,ваксините вклт^ват един или по· вече от сле .дните протеини, или еубедажци не антигони, шлучеж от тях I Ж,^,С,11‘'2,И^с>3,11/'4 и -ΧΪ5.Специално предочитани са ваксини вкжугтащи Ж и Ада В\ иж техни субежжци.

В допълнени© горното, възможно е да ое създадо и жва ввкеигв от стешмрани микроорганизми,,които експресират ©ден иж повече рекомбинантни Ж7 полипептида. Подходящи атеяюирани микро·

- 31 организми са известни за специалистите б областта и включват, например вируси / като ваксинални вируси ,виж. Вголп ет al., 1986 / ,а така също и бактерии.

Получаването на ваксини, които съдържат имуногенен полипептид като Ш^ИШВ^НИК ,е известно за специалистите в областта. Обикновено такива ваксини се изготвят за иижекпиоит приложение,както като течни разтвор?,така и суспенсии j твърди форш,й0Дз©др{К за разтваряне или суспендеране в течност преде инжектирането също могат .да бъдат изготвени. Препаратите адгат Q да бъдат емулгирани или протеина .до бъде кепсулиран в жпозечи.

Активните имуногении инградеенти често се смесват с ексвипиенти които са фармакологично подходени и конкулиращи е активните инградаента.^деодещи ексципиенти са наприиер воде.солудекстроза, глицерол,етанол и други подобни и комбинации от тях.В допълнеше пс желание ваксината може да съдържа малки количества спомагателни вещества, като омекващи или ешлгиреши такива, буфери и/или с.доувснти иоито повишават ефективността на ваксината. Примери за — - » ’ адаувантите,които могат да бъдат ефективни са напр./без де сс ограничават до/ s елушшев хидроокис. К-Рпвтил-»чдоам?тл-Х~тпео** — ' * - ’ ^w шл-Г-ироглутемия / Thr -№Р /. Н-ацетел-до^тлемил-^-ялапил-1> -изоглуташи / ССР 11637 , отнасящ се като нор- №Р /₍ Н -агдетил^дфяшл -X -алзжл -D -изоглутаминил- лянин -? /1/ -г?’ -депалштоил п - глицеро -3-хидроксифосФоделокси /-етилямин / ССР 19835Λ _tотнасяш са като М?Р - РЕ / и , които съдържат три швфонента,екстрахирани от бактерии,’.юнофосфорил ж* шд А,трехалоза дгштюлат и скелет на клетъчни стени / MPL ♦ ® *

ТЬМ ♦ CWS f В ?* сквален /Т/ееп 30 е^лст.^ективносття ш адщуванта може де бъде· определена през измерване на количеството антитела, насочено срещу имуногенеи полипептид,съдържащ HCV _£-нти32 генна посдадевателноет,получеда в резултат от въвеждането на тези пожпептид във ваксини, които са вклтени съда в различни адауванти.

Ваксините ее въвеждат конвенционално * по парентадан им», инжекционно,напр. субяутанно иж и»р®даскулатж.А>пъждателни

- , ж форми, дайте са подаодавда за други начини ча въвеждане предани» дат еупозитории, и в някои случаи, орал» форми За супоедториуми, традедаенмюе свързв&да и носещи вещества могат да вядатват, например, пожалкилен гликож иж триглицерида | такива суттозиторни могат да бъдат фордарани от смеси, съдържащи активни ингредаенти в интервала от 0,5$ да 10$, за предпочитане 1$-^Л$. Орвжжте форми включват такива обикновени екешпиенти,едто напр· фармацевтични по качества мажтел,жктоза,нитесте,маг!шзиев сто* • · араунатриев дадари,ц,целу®за,?«гнежев карбонат и до. подобни. Тези състави еа във ферма на разтвори,еуеяансмя,таблетки, прахове, капсуж, преносими освобождаващи Форми иж прахове и съдържат 10$ « • 95$ от активния инградиент, за предпочита не 25$ - 70$, Протеиште могат да бъдат гключеш във ваксината като ивутралед или солеж форми^рмапевтечно подхожда сож са тези, включвавда допълнително дажчостпо киселия» соли /формиращи тпи амино групи от пептида / и които се Формират в явори? ничии кисели» като, например, ждоохлорна иж фосФордаа киселина,или такива органични киселини като оцетна,оксалова, т?лентова, тартарова и до Сож,форшрани със свободате едрбоисижи групи могат па бъдат получени скр ирнк от неоргешг-ед основи,като например .натпивра, калий,амоний, калций иж железен хидрокси д, както и те едва органични основи 1®те изопрошлтжн,ттжметиламин,2*етила.?®но етанол, хиетидак, проведа» и до. подобж.

• 33 и, ₽, даиаж и вадрв м ваксините

Ваксините се въвеждат по начин, съобразен е дозата във фор?«те, и в такива количества,де па е профилактично и/иж терапевтично ефективна Лжчството за въвеждане, което обикновено е от 5 ш де 250 мо антиген за доза, зависи от субекта иа лечеше, капацитет® на имунната ’у система или смнтезитжте антитела и степента на желаната заадта/^обходаште количества активен ин· градеент за въвеждане зависи от съображенията де тдадеикувашия и еа различни за всеки субект.

Ваксината даже да. ~ъде дадена в аданидеа доза по схеде или в повече дози също посхема. Схе?®та за мултипледе приложение поел вижда начален курс 4Л0- единични дож, последван от други този, давани в следващи интервали от вреда,необходимо да съхдени и подсили имунният отговор, депр. 1*4 месеца де втората доза, и яко е необдодида,после,идещи дози след няколко десена, ^жиде на позите ще бъде,поне отчасти, детерминиран от необходимостта на индивиде и би зависил ст съображенията на шдактиктватая·

В Допълнение,ваксината съдържаща и-ушденните антидеде може да бъда въведена в комбинация с .крути и»дуновегулзторни агента, например, тауно глобулини.

II, С, ПОЛУЧАВАНЕ НА АНГИГЕйА СРЩУ Η 0 V ШИТОЖ йудогешжте полипептиди, описани в текста де настоящето изобретение се използват за получаваш на антитела,вкжадмтелно моноклонални и поликдоналда.Ако се цели получаване на дожилоделни антитела / като жда,гошви,кози, конеки и др. /.подбраните жи34 вотни ее имунизирет е инуногонен полипептид. носещ епитоп/и/. Серума от имунизирайте жвотж се събира и третира съобразно известни процедури.йо серума съдържащ поликлонадай антитела срещу HCV епитоп съдържа антитела за друга антагеш.пожклоналнитв антитела могат да бъдат преплетени посредством ит.тюабинитетиа хроштоирафия.^ехниките за ппода^ране и обработване на пожняонален антисерум са известни в областта,виж напр. Mayer и ^а¹кег/|98?/. Обратно,пожклонвлните антитела могат па бъдат изожрани от бозайници,които преда това са ^ли инфектирани е ^нопяоналните антитела,насочени срещу HCV спитопи ^гет да бъдат получени от спетжажст® в обгастта. Основната 'т?да колония за получаване на моноклонажв? антитела »ф©з хибриден» е дебяе известна.Двжж антитяде-продупиращи клетъчни лиши дагят ла ^дат създадеш чрез фузия ие клетки, в съда и мр©_я друга техники като деректна трансформация яа В лимФоиити е онкогенна ДНК, или транс февция е вируса нв &р те!п-Шгг. До·, напр. М. cnreler er.el. /i960/,НашегИпо ет al.,/1981/ , Кеппвт ет а1.,/¹980Л виж също П патент * 4 341 761 , 4 .399 121 , 4 427 783 , 4 444 887, 4 466 917 , 4 47^<? 500 , 4 491 632 , и 4 493 890.^;%тклочя.гште антитела,продуцираш срещу епителите може да бьдатскринирани за гжзжчж свойства, като напр. изотип.ештопен афинитет и др.

Антитела, както депонлонолни, така и поликлонадаи,които е» насочени срещу HCV спитопи са сподавяло чридаи»® в жагдеетииатв,а онези които са неуттжзнрещи са щилида в пасивната мчг· нотераотя.^ноклонвлни епитела догат да бъдат използвани и за повишаване анти-идаотипичнвт· антитела.

йяи-и.даотипните антитела са и’«тдегдебулиш,деито носят ^Н”вътрешен шжда на антигена от инфедшонния агент спещу който е делена задата.Дш напр. П1 опо//,А.,ет.е1. /1981 / _и Дг®е мап

Я5 ет al.,/1985/.Техниките за получаване на анти-идаетипни антитела са известни в областта.Виж,напр.Су/усп /19^5/,ШеПамага ет al. /1984/ * Vyroenaao ет al. /1935/. Тези анти-идаотипни антитела могат също така да бъдат използвани за лечение, ваксинирано и/или даагностива не ИАПШ ,както^иза изясняване на имуногетпште облас ти на θ’ антигените.

il_a Н. ИЖОЖОЖаНЕ и деО®1 КИТОВЕ

Цалииеятидато и антителата от настоящето изобретение са прижгжж да откриване на присъствието на HCV антитела,или при· съствието на вируса иж HCV пожпептида /или епитопи/, в например биологични <о^. /дазайна ж ичунопробите е обект та множества вариации, дато са познати шюго форми за. спепиежстите.^лудапробата използва поне едан вирусен епитоп, получен от HCV.B _@дао изпълнеиие,имунопробата ма сдарта доЛнация от вирусни епитопи, получеш от ОТ. Тези епитоии тогат да бъдат получени от различни вирусни пожпептиди, и могат да са в различни рекомбинантна или природа но>шетжда,иж заедно в съдате рекомбинантни пожпептида.^да имунопроба може да използва,например,моноклонаяно антитяло, насочено срещу вирусни ештода,комбинация от допоклонални антитела,насочена срещу епитопите на един вирусен антиген, тонокло нални антитела,насочени срещу епителите от адаи вирусен антиген^ моноклонада антитела насечеш срещу ежтопите от различни вирусни антигени, пожклонални антитела да сочени срещу рвзхични вирусни антигеж.датодаката даа» да се базира, да пример, на конкурентни или жжкзмк F нвоочеад реакдаи, или сапдаичев тип изелепрания, йетодаште могат също ж пример да използват твърда повърхности или да бъдат ищудопрт^ипитирани. Швечето от изслепважятг ияполеват белязани антитеда или полипептида! маркерите догат па 'ъ.пат например, ензимвтични,флуоресце*УГ1Ш, хедалуминисдантни, ое деоантивни или оцветявада молекули. Изслздважч, които w амшяфдарет синим» те от сондата сяр се познати | примери зв жито са изследвания, използващи Лготин и авиден и ензим-белядаж и далият?» имунопробк, като Ш А /описани по-рено /,

Осиновено едео изследван© за снти-BCV аммтеж вклтдаа подбор и изготвяне на тестови проби,за които се смита ме съдардат антителата, като напр. биологична проба, след това се инкубират с антигенен / т.е. ега?топ-съпьрдащ f пожпепдед при усдажя,позволяващи формирането на натиген-ентитяло иомтшекси, и елек това 0 откриване формираните комплекси.^тдащите условия ”а инкубация са добре известни на спет»алистите.^4у?юизслепването мода да *вде без огрежчеят.в хетерогенна или хомогенна Форма, и от стандартен иж конкурентен тип.

В хетерогенната си Форма,яолипептида е обикновено свързан е твърде повърхност за да улесни ревуеляието на пробата от полипептида след инкубяжята.Примери за твърде понъпдаости,конто «гат па бъдат използвани са нитроцелулоза / напр. в мембранна или михроти· търш кладениета /.поливинил хлорид ! дато листи или микргмдетърни кждежота / .пожстиренов жтеис / като напр, «οροί иж мидроти· търпи панички/.поливинил Флуорид / известен дато 1|ййоп Лде~ азотирвна хартия,найлонова гт^бррт.отяяиррж «дани и пдатеипови А иа9аи%пример,^гпвтесп bwton \ или Camion' 2 »дадеотитъпчи пани^яи иж 0,25 инчови пожстиренови миии f *оп «

Ball / могат да ^пат иягодавени да хетегогодната Фотма.Тяъодате повърхности.съдьрдащи атиге^даят -ожиептид обиинодапо се промива след репетирането от тестовите проби и пн#>ж опдадаждада да свързаните антитела.Кзкто стандартните,така и конкурентните Форми се известни за спедеалистите.

В хомогенната форма, тест торбите се иииубнрот в атеиген в разтвор. Например» това тото да стане при условия, деито де .наведат де предапнтирая» иа всеки антиген-антитяло детелекс,дебто се Ъммк ра. Както стандартште,тлча и дентс-рентят форш е® известни за специалистите в областта.

В стандартната ?*>орма, количеството ш антителата,Фод*1давдаг антитяж-антигеииия жожлекс тото то се наблюдава ждактноДо ида да даде съпм?стввио от определяне даж белязаните анти-ксеногенни антитела ще ее свъряа» благодарение на образуваното ^?« номплеиж.В конкурентната фор?4»,иожчеетвото на HCV антителата в пробата се определя дадантивно чрез наблюдаване еФект» те конкуренция при свързваното не познато водачество от беяиввпото антитяло /иж лруги даниузиращи лигянда / в детелекса.

^м<ш©ксите,в които теи о бленуваното и’·» е водено тоти-HCV антитяло / или,в случаите на конкурентно изпитване,те делидеството от конкурентно антитяло / се определят по който в .те е от тознатите техниж ,в зависимост от Формота.^теимер,тебедагдени HCV антитела в комплекса могат да бъдат открити с помощта ш детегат на аняшеяогенен 1© свързан в демпдеве е черкез / чето. ензимен маркер /.

В имунологичните изпитания, където SCV чолипетеиди са подложел на анализ,тест пробата,обикновено ^голоютжа птоба.ее нтеу*»ра с анти-HCV антитела при условия, които де тозвожт Фотдапнното н· на антиген*ажитяло яомплевси ,Ц>гот де бъдат изполтеаш деяжтеи форт.Например, *©анлвимеда проба”»където антитяло, пдатоепено към твърда повърхност се инкубИра о тест тообята| промива се,иноШда се с второ·,белязано антитяло за анализ п повъодеостта се тежиш оттвс.Анажжраното вещество се открива чрез определяне дели вто тото антитяло е свързано е понър:<ностте. В конкурентната Форма,която тоте да 'Чле както хетерогенна,така и гошгенна,тест пробвта обикновено се ит^бида с вжтя» и се дершра,денюлдатдатт антиген също ее иннубира дегто пое ле довя тежа, така и е.пиоврт/еяде Лози и други Форш са добре познати на специалистите в областта.

Цйктивж системи яа откшване на HCV инфекции се тези, които включват употребата на шстиж от епитопи.кекто е ожеано по-горе, ^шопите в пластината могат да. бъдат конструираш г един или муоти пептида. Опитването за вариращите епитопи може да е последователно ида едновременно.

Яшим-свързаното имуносорбентш изпитване / Ш А / моте да бъда използва»® аа измерване кзнтдантрецията както те матигеиа, така и на антитялото, ‘йзи тетод е в зависимост от понтдапията на даден ензим о антиген или антитяло, и използва свътеяната ензимнв активност като количествен» терда.З? измерване те антитялото, познатият антиген се фиксира към твъсда фаза / ч»то текгопянитеи или плссшсова дема /.инкгбите се с тест серуию говтождене, промива се, инку&ге се е авти-имтглобчлин, белязан е ензим « оттево се пуошде.яздете,полдедащи за м»дедане ся известни да спели» алистите и включват,например пегоксидеда от хрян. Озичгнв?» активност се измерва чрез добавяне те стецифиччи о^бетвети и ее спре* деля -'Т«р’«гашя продукт или асимижражят субстрат по телотжтетвичен начин. йепента на активност е даректна функция на толт^еството на антитялото.

За да, е® измери антиген,известно специфично антитяло се фиксира към твърда яящши фе за, добавя се теотуваният тетешал,съдьрввщ антиген,след инкубация твърдете фаза се промива и се добавя второ ензимно-маукирвно антитяло.Слец прошнене.се го бавя субстрат, ензижата активност ее едежва калоритетри^но и се свързва е концентрацията на антигена, Ъдхопяпдате за юдано диагностика китове, • .39 стодявда подаоддЕдате белязани реагенти ее конструирани през опаковане в подходаци материали, вкж^гително пожиептида от изобрет®жето,съдаржвда №7 опитопи кж антитела,. срещу ештож в пода.да^и донтейнери.даегго с постоянните реагенти и данериалв, необхожж за. остттн® да изпитването, дакто и инструх* ции за пговежлане на изпитването.

ш. оснош w

Основните датода,използвани в практиката да настоящето изобретение могат да бъдат дамереш.наптжмер .в телесната ж* теретурна спреваа, по-спедаялно в ЙО публикации 318 216 и 388 23%.

П, ПЙШ

По-долу са описани ’.тчдарк от дастопдато чда^дадание, жита са дадаж са’О е илюстративна роя и «е одарщдапат обхвата ж ипобпедашето.В светли дата че излодатто.да <”тепиажсте в областта &ха били одежда '«юдаство п?дадагш изпълнения в рашяите и® предявените патента даетеннии.

V. %ртиране на ет-ттопите от HCV генома

Следва^доте придали са дазчлтат от датирането на епитопите в експеришнт.птоведви е H&V} пожпротеиновв пое ледовете··· ността, показана на Й?гЛ.Квкто е подавано на ^г. -3-11, налице е кетерогешост сред Ю изолатите,показвате,че тези замествания на ашно кксежжте жда да бъдат осъществени в октамера, описан по-далу. ^то доггьлдани® кът за?«естванията с аито киселини от съответстващи яоналисадаи в ярутя изолати,дадаств®ния със синтетични аналози на спепифични ажно жеежни или съхранени замествания на базата па заряда /по-спетеалто ногата замества· него да гозпчшва го / , ег в обдаещ да идабготйдаото.

п_г лл, си®© а иизюжаж? се 1®тадк дажетиленои? р с гоп-рв Ох**' f Qo \ ©ιβο Лдеторе , Лстог!®,^р?ге1⁴е » ,ее приготвя? ϊ-го© гостевяпето иу в Шня / 20^ νΛ тегорижя в >тшШж«и / JW / за 30 ;жн чг <г0ие те е аг^л^· гогт ’rrir^-ero-л*да игли се Ο'ΡΟτηβϊΤΈΡτ,ΠΓΟ^ΗΌτ се е MF за 5 се « ^?ш·

НОЯ ν€Τ5Γ'»Π·0ΤΗΟ / о Г!'/*-» Г /₉*с:'г:·'- ГО Ю РГОЪГО®?

гои© 10 етз,сл@‘^т го-го ее nrorow? '-r ro-^%row? о Л 1--%тфот^едаотг1?азол / ,^67 мг f

И® BWW'X® 3S път в АлГ / 5 ее разтваря в ,»-Г / 3) уд / пс игоогогояе в -w да

Гшс-ж;жоште sw t fwe· I-Wа-ОЕ/р, Д»ос * ..

/Т>^/ -ОР/р, -1Ьо©-Ь.АОр/0»4%/-0^р₄ <мое*-Е*С^/0-т%/-0Е^р, i^OC-M^e-OP^p „ А»с-^?у*0Р/р, •Ibso-l-Hi \/го_еЛ0Р/р _t <Wo<U*»xfe-0P/p , Ялос-Ь-Ху^/Ц&©/-О^р , Дтс-Ь.Ь»и-01Ур _t Дзд ^^•0P^p_tfyoe*iwAV!|U)P/p ,^w~^W*9P/p, ,

-Гиоо-1*Аг©Л4г/*0^/р _t ^»©-Ι·^ογ/4-^/ *$A4 , Дтс-Ь*%^т* й/-&квт , -iwa-X-Va^rOiyp Дгос-Л-хуг-З^р.

^ятените ®жно o e и иглигогите жсежяк ее гоготвнт в шлготиш® падам

».'-. гого_rw «· ужгогогожго.етго гоего ее ^П3®С ря »'е5,ьп'.....’»’= eg '’•'ww е дан / ν crown е <0^Р / тп / за почистваш и -т _; TW ж’^жлт,^;^вв.дуоставя? ж· реагират н® .цлГ /р -<^ц/ _f^e0H /4 х сс.

се повтаря за всят .гот^^вте-⁵© го ягода я*ееλμηη,ροοτο се далуче? встпу

Свободните Н-краища след това се ацетижрат за да ее компенсират свободният е ми,ц, тъй като човечето е пито пи не се откриват при М-края и поради това не притежават позитивен заряд.Ацетижранете се съпровожда със запълване яа кладентотата от микротитърната паничка е ДОУоцетен анхидад/триетиламин / 5*2*1 ///А^г което позволяея на игличките да реагират в кладечтотято за 90 минути при 20®$.След това те се промиват е ЖГ Амин/ и МеОН /4x2 мин /,изсушават се яа въз,духа, за поне 10 мин.

Защитните жкжвоят групи от страничните вериги се отстраняват чрез третиране с флуор© оцетна кисежна /фенол/питиоетан / 95*2,5 * 2,5 /уА/ в пожпропиленови торби за 4 часа при стайна температура. След това иглиптгите се промиват в дихло рометан /2x2 мин /, 5$ да-изопрошлетилажн/дахлорометан /2 х 5 мин / ,дихлорометан /5 мин / и се изсушават на въздуха за 10 мин.След това игличките се промиват с вода А мин / ,Мй /18 часа /, изсушават се под вакуум и се оставят на съхранеше в пластмасови торби върху силиха гел.

IV. ИЗПИТВАНЕ НА ПЕПТИДД

Носещите ектамери иглички,изготвени както е описано догоре, най-напред се третират е ултразвук за 30 тн в бк*>ер за разрушаване / 1$ натриев додецил сулфат, 0,1$ 2-меркаптоетанол, 0,1 М ИаН^РО^/ на бО^.След това игличките се потапят във вода /6О®С/ последвано от варене в ^СН А мин / и се оставят да се изсушат на въз,духа. Игличките след това се покриват отново за час при 25°С в микротитърни кладеш'е та съдържащи 200 J«I* блокиращ буфер / 1$ овалбумин ,1$ B^f А ,0,1$ 7®ин и 0,05$ в

РВъ/ при разклащане. След това игличките се потапят в микротитърни кладенчета съдържащи 175 м! антисерум, подучен от хора,диаг ностицирани като носители на HCV и ©е оставят да се инкубират — 42 — на. 4°C за ©да' нощ.Слеч товй игжчките се изпитват яя срещу антисерум от три различни пациенте. Проба -ί РАА 3668 / *А* / проявяваща силна, реактивност към № V©cjern aioi-i ,XV донкурентна Ж^^А , XV Ш2А кът клон 0100-2 / при 1*1000 разреждаш / и ИВА отговори от 4 ♦ до C1Q0 ,5-1-1 , и Сзз© / С 22 не се дева /. /Адагечните клонове се както са дадени в ЕРО публ. 318 216 у 388 232. ч^кто онези,owrw в литературата₅отнасяща се де XV иьгуно итдатадая да рездедежедае от θτη» Жа^по^Ис Лдо./. %плйгепештв плазма ое 'дазрежде

5'500 в блокираш буфер. %юбя ^РАА 33028 / *В* /.проявяваща силна реактивност ори V® тегл в1отт , XV юняювйр*я Ш^А, HCV .ЕИД за клон Ci 00-3 / при 1*500 /азреждеи» / и ₽1®А отвори от 4 ♦ де С100 , 5-1-1 , СЗЗС и Срр. Ъликденажя анти* серум се пречиства на части чрез пропускане през протеин А »· лона и се използва явят тш разреждане от 15200 в бгокирад буфер. %ебз m 32931 / ^WC« / проявяла ударена ^г’епктпвност кш XV V®\4ei*n eioAA fe* / ₄ XV датпппадг-ттни SUSA _# HCV EXI SA там клон Cl 00-3 / при чгзрежп^но ! 564 / и PIBA отговор? от 3* • и 4* де 0100 и 5-1-1-, реепекти^ш / Соя© и Сч*> надени/.

Поликдодален антисерум се пречиетдо^асти чрез пгопусдаиепров протеин А додада , и се използва те тзреждене 15500 п бдодаращ буфер.

йгжчште се продават в /Г^ееп °0 /4 х 10 ш / ж стайна температура, слад което се шгдабиря в мипротитъпни хладен чета,еъдьрвети перотссидаза от хрян -белязан кози я.яти-швевяи I© антисерум / 176 м! , 1*2000 разреждане в бдонирад буфер без за. еден нае mw 25©С с р‘жл^яте,Амдат$еечдая зятиеорум е стцифичен зв ловешки Jq-тюви леда и техда тепиги, и реагира с igC и -нжасове.Игдочит отново се промиват в /Шй 20 /4 х 10 мин / в? стайна температура, ^тбетратен раз-

- 43 .

ьубстпбтя! раорворене ее приготвя чрез разреждане на 1^Р0₄ / 1М,200 мХ / и лимонена киселина / U’,160 м! / до 2 I с дастидарана вода, довеждайки оН до 4,0, Аеидо-З-етил^ензтиааодавеулфонат / АВТ ,50 мг / и хидроген пероксид / 0,3 мХ/мХ / се добавя към 100 ?Д буфер неяосредствеяо преда използването за ς^ο пълзене на субстратният разтвор. С^бстретният разтвор /150 мХ / след това се прибавя към всяко кладенче от ?жкротвтъриата панишса, и игжчките се потапят в кладенчетата и се ищу^рет жхяркдагаию1 при 25°С на тъадоДдад появяване на оцветяванетореакцията се прекратява чрез отстраняване на игжчките и абсорб цвята на разтворите възлиза до 405 пм.

Неброените по-доду о ктитори са r whoреактивни с антиHCV антисерум. йптидате,реагир®да е всичките три аятнсеруж са изброени като епитопи, докато иетдате.реапдоатп само е едан иж даа антисеуума се посолени като лея» епитопи /означени е * /. Оидакте епитопи ся хтотждоени с букви вжто е номера /напр. %>АА /, ^vw

AM	C-etleAVy. c, Sequence	de AM Seaucnce-
23	KEPGGGQA	87	GNEGCGWA
24	EPGGGQAV	Ep2
25	PGGGQAVG	88	NEGCGWAG
26	GGGQAVGG	89	EGCGWAGW
27	GGQAVGGV	90	GCGWAGWL
28	GQAVGGVY-^-	91	CGWAGWLL
29	QAVGGVYL -	92	GWAGWLLS
30	AVGGVYLL	93	WAGWLLSP
31	VGGVYLLP	94	AGWLLSPR
32	GGVYLLPR	95	GWLLSPRG
33	GVYLLPRR	96	WLLSPRGS
34	VYLLPRRG	97	LLSPRGSR
35	YLLPRRGP	98	LSPRGSRP
36	LLPRRGPR	99	SPRGSRPS
66	PKARRPEGEpl	100	PRGSRPSW Ep3
67	KARRPEGR	101	RGSRPSWG
68	ARRPEGRT	102	GSRPSWGP
69	RRPEGRTW	103	SRPSWGPT
70	RPEGRTWA
71	PEGRTWAQ	186	TVPASAYQ Ep4
72	EGRTWAQP	187	VPASAYQV
73	GRTWAQPG EpA	188	PASAYQVR
74	RTWAQPGY	189	ASAYQVRN
75	TWAQPGYP	190	SAYQVRNS
76	WAQPGYPW	191	AYQVRNST
77	AQPGYPWP
78	QPGYPWPL	206	DCPNSSIV -
79	PGYPWPLG
80	GYPWPLYG	223	TPGCVPCV ~
81	YPWPLYGN
82	PWPLYGNE	232	EGNASRCW Ep5
83	WPLYGNEG
84	PLYGNEGC	256	TQLRRHID ~
85	LYGNEGCG
86	YGNEGCGW	286	LVGQLFTF ~
		297	RHWTTQGC Ep6
		298	HWTTQGCN
		299	WTTQGCNC
		321	MMMNWSPI -
		347	DMIAGAHW Ep7
		357	LAGIAYFS Ep8

413	I1NTNGSW EpB	594	YSRCGSGP Fa
	414	INTNGSWH		595	SRCGSGPW
				596	RCGSGPWL
	432	SLNTGWLA -		597	CGSGPWLT
5				598	GSGPWLTP
	465	FDQGWGPI EpC		599	SGPWLTPR
	466	DQGWGPIS		600	GPWLTPRC
	467	QGWGPISY		601	PWLTPRCL
	468	GWGPISYA		602	WLTPRCLV
10	469	WGPISYAN		603	LTPRCLVD EpF
	470	GPISYANG		604	TPRCLVDY
	471	PISYANGS		605	PRCLVDYP
				606	RCLVDYPY
	480	PDQRPYCW EpD		607	CLVDYPYR
15	481	DQRPYCWH		608	LVDYPYRL
	482	QRPYCWHY		609	VDYPYRLW
	483	RPYCWHYP		610	DYPYRLWH
	484	PYCWHYPP		611	YPYRLWHYFB
				612	PYRLWHYP
20	500	KSVCGPVY Ep9		613	YRLWHYPC
	501	SVCGPVYC
	502	VCGPVYCE		641	EAACNWTR
			Epl2
	521	RSGAPTYS ^>10
25				662	LSPLLLn EpI3
	540	NNTRPPLGEpE		663	SPLLUn
	541	NTRPPLGN		664	PLLLUIQ
	542	TRPPLGNW		665	LUJnQW
	543	RPPLGNWF
30	544	PPLGNWFG		685	LSTGUHL -
	545	PLGNWFGC
	546	LGNWFGCT		705	VGSSIASW ~
	547	GNWFGCTW		706	GSSIASWA
	548	NWFGCTWM
35	549	WFGCTWMN		729	ARVCSCIW Epl4
	579	LHCPTDCF -		782	WVPGAVYT
			EpG
				783	VPGAVYIT
40				784	PGAVYTFY
				785	GAVYTFYG
				786	AVYTFYGM
				787	VYTFYGMW
				788	YTFYGMWP
45				789	TFYGMWPL

801 LALPQRAY ~

851	RVEAQLHV ΕρΗ	1384	VIKGGRHL Ep20
	852	VEAQLHVW
	853	EAQLHVWI		1410	LGINAVAY Ep21
	854	AQLHVWIP		1411	GINAVAYY
5	855	QLHVWTPP
				1454	CNTCVIQT -
	893	LAVFGPLW -
				1492	GRGKPGIY Ep22
	916	QGLLRFCA -		1493	RGKPGIYR
10
	928	MIGGHYVQ Ερ15		1532	PAETTVRL Ep23
				1533	AETTVRLR
	946	TGTYVYNH ΕρΙ		1534	ETTVRLRA
				1535	TTVRLRAY
15	952	NHLTPLRDEpJ
	953	HLTPLRDW		1560	GVFIGLJH Ep24
:W	954	LTPLRDWA		1561	VFIGLIHI
	1026	LAPITAYA -		1581	ENLPYLVA
20			Ep25
	1072	TCINGVCW EpK		1567	NLPYLVAY
				1568	LPYLVAYQ
	1109	LVGWPAPQ Epl6		1569	PYLVAYQA
				1570	YLVAYQAT
25	1171	CPAGHAVG Epl7		1571	LVAYQATV
	1113	PAGHAVGI		1572	VAYQATVC
	1114	AGHAVGIF		1573	AYQATVCA
	1115	GHAVGIFR		1574	YQATVCAR
	1116	HAVGIFRA		1575	QATVCARQ
30	1117	AVGIFRAA		1576	ATVCARQA
				1577	TVCARQAP
	1218	WPQSEQV EpL
				1601	PPSWDQMW
	1240	VPAAYAAQ -	Ep26
Γ 35				1602	PSWDQMWK
	1260	ATLGFGAY ~		1603	SWDQMWKC
				1604	WDQMWKCL
	1280	GVRITTGS Epl 8		1605	DQMWKCLI
	1281	VRITTGSP		1606	QMWKCLIR
40	1282	RITTGSPI		1607	MWKCLJRL
	1283	nTGSPIT
	1284	TTGSPTTY		1615	KPTLHGPI Ep27
	1285	TGSPITYG		1616	PTLHGPIP
				1617	TLHGPIPL
45	1322	DATSILGI -		1618	LHGPIPLL
				1619	HGPIPLLY
	1338	TAGARLW - .		1620	GPIPLLYR
	1371	GEIPFYGK Epl9		1655	WTSTWVL -

1694	UPDREVLEpM	1966	SECTIPCS EpS
	1695	IPDREVLY		1967	ECTIPCSG
				1968	CIIPCSGS
	1710	ECSQHLPY EpN		1969	TIPCSGSW
5	1711	CSQHLPYI
	1712	SQHLPYIE		1999	LMPQLPGI EpT
				2000	MPQLPGIP
	1728	EKQKALGL EpO		2001	PQLPGIPE
	1729	KQKALGLL		2002	QLPGIPEV
10				2003	LPGIPEVS
	1758	EEEWAKLM EpP		2004	PGIPEVSC ------
	1759	IEWAKLMW		2005	GIPEVSCQ
	1760	EWAKLMWN		2006	IPEVSCQR
	1761	WAKLMWNE		2007	PEVSCQRG
15	1762	AKLMWNEI		2008	EVSCQRGY
				2009	VSCQRGYK
	1781	LPGNPAIA -		2010	SCQRGYKG
				2011	CQRGYKGV
	1808	LFNILGGW Ep28		2012	QRGYKGVW
20				2013	RGYKGVWR
	1821	AAPGAATA -		2014	GYKGVWRG
	1851	HAGYGAG Ep29		2024	IMHTRCHC
			Ep31
25	1880	VNLLPAIL -
				2048	VGPRICRN EpU
	1908	PGEGAVQW EpG		2049	GPRICRNY
	1909	GEGAVQWM		2050	PRICRNYW
	1910	EGAVQWMN		2051	RICRNYWS
30	1911	GAVQWMNR		2052	ICRNYWSG
	1912	AVQWMNRL		2053	CRNYWSGT
	1913	VQWMNRU		2054	RNYWSGIE
				2055	NYWSGTEP
	1925	RGNHVSPI BpR		2056	YWSGTEPI
35				2057	WSGTEPIN
	1940	AAARVTAI Ep30
	1941	AARVTAIL		2071	TPLPAPNY Ep32
	1942	ARVTAILS
	1943	RVTAILSS		2088	EEYVLRQV EpV
40	1944	VTAILSSL		2089	EYVIRQVG
	1945	TAILSSLV		2090	YVIRQVGD
	1946	AILSSLVT		2091	VIRQVGDF
	1947	ILSSLVTQ		2092	IRQVGDFH
	1948	LSSLVTQL		2093	RQVGDFHY
45	1949	SSLVTQLL
	1950	SLVTQLLR		2108	DNLKCPCQ -
	1951	LVTQLLRR

i I i ) I !

i

2122	EEELDGVR EpW
	2123	IELDGVRL
	2124	ELDGVRLH
	2125	LDGVRLHR
5	2126	DGVRLHRF
	2127	GVRLHRFA
	2128	VRLHRFAP
	2129	RLHRFAPP
	2130	LHRFAPPC
10	2131	HRFAPPCK
	2132	RFAPPCKP
	2133	FAPPCKPL
	2134	APPCKPLL
	2135	PPCKPLLR
15	2136	PCKPLLRE
	2137	CKPLLREE
	2138	KPLLREEV
li	2139	PLLREEVS
	2140	LLREEVSF EpX
20	2141	LREEVSFR
	2142	REEVSFRV
	2143	EEVSFRVG
	2144	EVSFRVGL
	2145	VSFRVGLH
25	2146	SFRVGLHE
	2147	FRVGLHEY
	2148	RVGLHEYP
	2165	EPEPDVAV ~
30
	2187	GRRLARGS -
	2226	LIEANLLW EpY
	2227	IEANLLWR
35	2228	EANLLWRQ
	2229	ANLLWRQE
	2230	NLLWRQEM
	2231	LLWRQEMG
	2232	LWRQEMGG
40
	2244	VESENKW Ep33
	2245	ESENKWI
	2246	SENKWIL
	2247	ENKWILD
45	2248	NKWILDS
	2249	KWILDSF
	2250	WELDSFD

2267 EISVPAEI Ep34

2280 REAQALPV EpZ

2281 EAQALPVW

2282 AQALPVWA

2283 QALPVWAR

2284 ALPVWARP

2285 LPVWARPD

2286 PVWARPDY

2287 VWARPDYN

2288 WARPDYNP

2289 ARPDYNPP

2290 RPDYNPPL. .

2325 PPPRKKRT Ep35

2326 PPRKKRTV

2327 PRKKRTW

2345 AELASRSE Ep36

2346 ELASRSEG

2347 LASRSEGS

2348 ASRSEGSS

2349 SRSEGSSS

	2382	AESYSSMP Ep37
	2401	SDGSWSTV
Ep38
	2417	WCCSMSY
EpAA
	2418	VCCSMSYW
	2419	CCSMSYWI
	2420	CSMSYWIG
	2421	SMSYWIGA
	2422	MSYWIGAL

- 4Q -

2439	QKLPINAL EpBB	2602	LPLAVMGS
		2440	KLPINALS	EpDD
		2441	LPINALSN		2603	PLAVMGSS
		2442	PINALSNS		2604	LAVMGSSY
	5	2443	INALSNSL		2605	AVMGSSYG
		2444	NALSNSLL		2606	VMGSSYGE
		2445	ALSNSLLR		2607	MGSSYGEQ
		2446	LSNSLLRH		2608	GSSYGEQR
		2447	SNSLLRHH		2609	SSYGEQRV
	10	2448	NSLLRHHN		2610	SYGEQRVE
		2449	SLLRHHNL		2611	YGEQRVEE
		2450	LLRHHNLV		2612	GEQRVEEL-----—----------
		2451	LRHHNLVY
		2452	RHHNLVYS		2632	KTPMGFSY
	15	2453	HHNLVYST	Ep41
		2454	HNLVYSTI		2633	TPMGFSYD
		2455	NLVYSTIS		2634	PMGFSYDT
		2456	LVYSTISR		2635	MGFSYDTR
W					2636	GFSYDTRC
	20	2469	QKKVTFDR Ep39		2637	FSYDTRCE -
		2470	KKVTFDRL		2638	SYDTRCED
		2471	KVTFDRLQ
		2472	VTFDRLQV		2660	YQCCDLDP -
		2473	TFDRLQVL
	25	2474	FDRLQVLD		2676	LTERLYVG
		2475	DRLQVLDS	EpEE
		2476	RLQVLDSH		2677	TERLYVGG
					2678	ERLYVGGP
		2495	ASKVKANL -		2679	RLYVGGPL
	30
		2533	RKAVTEHN EpCC		2688	NSRGENCG
		2534	KAVTHINS	EpFF
					2689	SRGENCGY
		2573	GRKPARLI Ep40		2690	RGENCGYR
	35	2574	RKPARLTV		2691	GENCGYRR
		2575	KPARUVF		2692	ENCGYRRC
:iw		2576	PARUVFP		2693	NCGYRRCR
		2577	ARLTVFPD
		2578	RUVFPDL		2707	TSCGNTLI Ep42
	40
					2721	AACRAAGL -
					2757	AFTEAMTR
				Ep43
	45				2758	FEEAMTRY
					2759	TEAMTRYS '
					2760	EAMTRYSA
					2761	AMTRYSAP
					2762	MTRYSAPP

2779	DLELHSC Ер44	2878	DLPPIIQR Ep47
		2780	LELIISCS	2879	LPPHQRL
				2880	PPHQRLH
		2794	HDGAGKRV	2881	PHQRLHG
5	Ер45			2882	HQRLHGL
		2795	DGAGKRVY	2883	IQRLHGLS
		2796	GAGKRVYY	2884	QRLHGLSA
		2797	AGKRVYYL	2885	RLHGLSAF
		2798	GKRVYYLT	2886	LHGLSAFS
10		2799	KRVYYLTR	2887	HGLSAFSL
		2800	RVYYLTRD	2888	GLSAFSLH
		2801	VYYLTRDP	2889	LSAFSLHS
		2802	YYLTRDPT	2890	SAFSLHSY
				2891	AFSLHSYS
15		2817	WETARHTP	2892	FSLHSYSP
	EpGG			2893	SLHSYSPG
		2818	ETARHTPV	2894	LHSYSPGE
		2819	TARHTPVN	2895	HSYSPGEI
		2820	ARHTPVNS
20		2821	RHTPVNSW
		2822	HTPVNSWL
		2823	TPVNSWLG
		2824	PVNSWLGN
		2825	VNSWLGNI
25		2826	NSWLGNU
		2827	SWLGNUM
		2828	WLGNHME
		2829	LGNUMEA
		2830	GNUMEAP
30		2831	NUMEAPT
		2832	DMEAPTL
		2833	IMEAPTLW
		2834	MEAPTLWA
		2835	EAPTLWAR
35		2836	APTLWARM
		2837	PTLWARMI
		2838	TLWARMIL
		2839	LWARMILM
		2840	WARNCLMT
40		2841	ARMELMTH
		2842	RMILMTHF
		2843	NEELMTHFE
		2863	LDCEIYGA Ep46
45		2864	DCEIYGAC
		2865	CETYGACY
		2866	ETYGACYS
		2867	IYGACYSI

т

- 51 ·

2912	хотрт	%«8
2913	CVPPIPAV
2914	VPPIPAV Р
2938	шест
2939	АХССКУТЕ
2940	ХССКУ1Ш
2966	И CW1
2961	V НАЖТ

п_г в_г дааздшо

№№е антигени могат дв бодат открити и използвани аа диагиос« тююено иа ЯВ¥ инфекпията много по-бъвзо.

4» ЧРЯЧМВН* ЯгРРФР/Яг ,99 99999^999^99, Ά ЧЯ ф ЧЛ 99, v ЯПяР-ЯЯР^е ЯР

Имаш. вжаш^Ч. *ш<ма*·«* «ммвчль ЛЕ** лл.а» ttatJt, ичам^***· .жьамь *амЧ.ааьиа а» няколко кръвни проои са получени от хор® с повишени стои пости не А1Т,не негативни за анти-6100-3 янтитяда.Цмр крадни прой!,получени преди пълната сероденвереия /0100-3 позитивно/ ♦

се използват за изследване при разреждане 1*2000Аел®жането * · * се провежда както е описано в Раздел IV. А» пв-гореЛспорежю с това,се провежда инку^ране на дубликат от игличаи с перокси дазно-балязан кожи анти-човошкя ЪМ специфичен аятиоердгм.^жто люто,ицуизреаитнк © -а® антитела оа ранни опитани.·

Резултатите показват,че най-ренните опитани оа wwepewi в областта, отстояща от око» амино киселина 480 де анино киселина 85О.Че©тично силни опито пи оа намерени между в&вше киселини номера 506,510,523,553,562,580 и обласра от 590 де 620, като за тях е установено,че оа 1©^м отмери.Изследвания,които • 52 * използват антигени* носещи опитопи от таяв ебяает иоаволм ьат диагностицирам· иа HSV инфекция на ежи ранен та в счевнеиио с Я8следвжй№к,и8долзваор| други анпкгени·

Детм^жимте С8 И&СХеШВ&НИ ОЯШК &9 яямямллш ПВОбЙ.ВМти от ж ш^тк,стр&жр от пост-трансфузионен НШВ »ПАТИТ. КОИТО «асдатгиймия (М ггоовежввт яж 3-12 гож».Яимн·

Цшвите живи от исъвни ппоби са ио-шлде

от веднъж седмично, ^сяк» проба се тестува ва %€ и %М посредством SU срещу ежи същински антиген /@Й2/ * два говърхнос таи /шшфюфяи f жгть / Ж и 38 / и три антиген» от но· структурни област / СЗЗс,С100/и II 5 /.Установи се, че 1о^м отговора hr Ш2 и Шс предаовствува W отговора за тези антигош. II «5 също иидуцира М отговор, но този отговор но • вм... предаевства ХоС отговора оа този антигенЛака,можв да се приготви пвоба. способна дв определи » много ценен етап от ин* чЯ^ЯЖ^Яв Λ<Яя£4ЧЖ 9^9^v 4* ТИв ЧИЧ1Ж яЖ—<^Я>№ 99 991 рр/Лг —ч^ЯЖ ^9 99 ^^9,Я9Ж9Л 49 WW 99 —®··*— февдята посредством използване на впитоде.получени от 022 и СЗЗс области и изпитване за 1фй свързваш.Аиштсла срещу ®38о областта се съхраняват зе много хъш¹ период от време, гоето предполага,че деаггостични проби,насочени срещу СвЗс биде Ж· як най-надеждни.

Ж €* Секвеиционни варианти в изолати от различни инжвиж.

Иводати ст Нагоите съдърввт последователности,отклоняващи ос от СДЗ/HCVl ,еа идентифицира» у хвра,нягож от които са оережпгано позитивни за анти-С100*3 антитела / ®*10 е мжмшжмк »:мь4м*«шм«ь4мямг > ИЯ4вкядемшнК»«м»яшъ»мк8Мйъ еамм лллвл сямядеме » дела

KMMwJwD «WJtwIrJIJiVM * е**ДжстТМц|ШT.ptyolUlyw НЖ Тво» СТО БИ ИжФдеКТС ww съпътства от кложрано и съгласевано на сегменти от гонома » п, * ииа — nlliMMitti^j· м^п> β·μι «шлушмаммаш УЯ.1лЯ яжльямйммИМША шадеждмйкмямнкЖ кмь яовто са ашиифицирини посредством *w техни» с помощта иа

СДС/НС1 последователности. Метода използва праЯмори и дойде основани на HCV _сда десдадоветелностите, описани тух.Пармп» еш в метода е синтезата на сЖК аа вееш от HCV генома, пят жрошя междинен оепдакатоо.с помощта на обратна ттжнсишб· тава.Слвд синтезата на HCV еДЖ и преде амплифииапията,^ в пробата до раогражда по познати иашш.Явзграданият сегмент от № _сда след това до ампхифицира яре· използването на подходящи праймери · Аипдафицираиите дедевмдек последователности до хлонират и кдондоета,оъдедеквде| ашошфн1Д|раните паоледвватол** _;а»^г . *· . . · ^w дести се откриват със сонда, която е домдотнтарва иа деследеммммшаеяим, «мними* между ппаймепите.нс която иа до пптпо впива 4· ЯМЯ***ЯЛ|МЯМ W ярЯиМ^В ®ЯМ W*4M^ —^ЯМ —™ЯМ—“ ·“ Я'ЯЯМ ЯМ ЯМ <кв^й<МЛ ·ΜΜ ·Μ^ΜΚ··Μ··

с тях.

- 54 чиства чрез екстракция с хлороформ-фенол.

HCV FHK от препеватз не РНК се трансдаибипа обратно в сДНК.След като се синтезират двете вериги на сД^А получената еДНК се амплифицира по PCR метода. HCV _сДНК-_{те в Т}ри клона, получени от всеки HCV изолат,се подлага на секвенияонен анализ. Анализът се провежда главно чрез метода,описан от Cfien и 9ееЬиг^ /1985/.

Съгласуваните последователности от клона,получени от HCV в пробите 23 и 27 са показани на ^гг. 3 и ^иг. 4,съответно Различните последователности са също показани на тези фигури, до.колкото са амино киселини,кодирани в съгласуваните последователности.

^тгури 5 и 6' показват сравнение на позитивно верижните нуклеотидни. последователности / Йтг.5/ и предполагаемите амино киселинни последователности / ^г.б / от пробите 23,27 и HCV1, Амино киселинните последователности от HCV1 на ^г.б представят амино-киселинните номера 129-467 от HCV полипротеина,кодиран от голямата ОРР в HCV геномната FHK. И_зслед_Ване на ^гг.5 и Фйг.б показва,че това са варианти в последователностите на трите изолирани клона.Секвенционните вариации на нуклеотидно ниво и на амино киселинно ниво са сумирани на таблицата,която следва непосредствено по-долу. В таблицата,амино киселините означени като: и HS1 представят амино киселинните номера 130’ до 380 и 380 до 470,съответно,като тези области са познати . Номерацията е от предполагаемия иницииращ метионин.Определянето катоди Ц£1 се основава на позиционирането на последователностите, кодиращи полипептидите,с помощта на модела на ^лавивирусите. На_КТо бе дискутирано по-рано,обаче,последните доказателства показват,че няма пълна корелация между HCV _и ^лавивирусите по отношение на вирусните полипептидни области,

- 5δ по-специално в предполагаемите OtSl области. Наистина, HCV полипептидате в техните дедаращи области могат де поиазват » ошдевяишии от1деммн91я от ^b®BJoeip^isnnin модел» TABMIAi

Хомолошюст не тследоветелностито •4 иавеяида . Η 1 и»«с«тд» « Hi * * 4 4 **

Hcvi/Hcvas и % я яг яет

BCT1/W? 89 93 М 99 9682

ВСТ23/ИЛЙ7 № 93 86 90 9384

Иввамкяпюч» ва налице вариации в явввиавлирамн* HCV

П(имюдодетея1ям^ю>мяониреш№о последователности от проби 23 и 27 / наречени ЖШ и Ж7 / ашш съдържа 1019 нуялеотиде

ГЮВВЗВ8ЙИЙ ΒΦβΒβΥΜΝΙ ИВ· ^ВИВ¥йр8НВ В ПВТЛЯИИЧ^ЯЯЖ муФЖМЯ! в • ♦ мяЯьянйМ) яз Лбямяъязлшь яя 4К*. явйС4мМкМ1ММНь41ь. яяя4ЯЬ.«Яйк,4МьЯЬ. ilr- —з яггч. «г- — —— — тит- — —1~— —· мш шзм SE йЗИ ОПЛВмТ В ПОДОрВпИТВ KflBlw^Be WC^®J0|BBerro^H®8^WV» ИВ *И»О

произход· ·

Интересно е де се знае,че секвенпионште вариации иолду *

в две от предполадееште области не са еддет^дедеватол* ио<демм1 в преддолагаемият регион очеяидао е отнсеителмо постоянна и по нй кога разхильряяиа по този региои»9братно, предполагаемата П 1 област има по-висоде стопен на вариа^яяост от

- 56 са шие&теш в едан дадервариабйлои деоб от около 28 ашно ясадени, шт оа додадезирани около 70 амино игоелини надолу ек мршш? &*«pot от предполагаемия полипротенн.

йза че мода до се спор че откритите вариации еа въведеш по време на амплифидеиионння процес»като че но всич-

оа от тош характер. Установено е,че Тао подемера-

аате въвецде грешни в последователността при приблизително 1 база аа Ю иилобази от Ж матрицата за одая пииъл / аШ ет al., 1988 ЛНв основата на тази отиде, могат да бъдат въведени до 7 !рам по време на ампдафижционшяк POP процес в 1019 ор Ж фрагмент.Назедесимо от това, трите оубкдош да. JCT-йЗ и H0V-27 водат до 29 и 14 базови веркапии,съответно.'Говя пред« поляга,че тези вериапим са природно срещащи ее.Около 6С0 от измененията в базите са тихи /сдасй/мутедш, деито не променят ашш киселинната последователност, Вариапии, въведени от ?ао подемераза по време на ампдафижадята 8и слепвало де ее очшпмьче се проявява само понякода| обаче резултатите показват,че вариантните последодетежюетн ое струпват дои поде ежи специфичен регион.

П.с*2. Н G V ИЗОЛАТИ ОТ ХОРА В ИТАЛИЯ й САЩ

Сегменти от ЯС7 РНК доедотавеш в узжни изолати,се амплифидарат посредством ®V/ePCP методаДези сегменти обхващат област от 0,6 Jfe до 1,6 та,долу от ’датионинеуяожрде »

щият старт йоден от предполагаемият ИС? пождоотшн. ^изоля«гте оа от биологични пробЬ, подучени от ЯС7 инфегараш индивида. Ло-спещално, изолат НСТ 668 е от невеста пдозма от индивид от САЩ , Ш1 и 8С10 еа от чернодробна биопсия на пациент от Италия, и Щд е от и>яоиуклеоцитна фракция на периферна кръв от 4юриж8нсяи деидат.Срадеми сегменти rbJCV РНК изолирани от жшинзв.

ИК ео изолира от пробй подаде падат» де фенол*(2Ю1₃1 идеадел алкохолна екстракция. М & *яя 0,01 плазма оо разрежда до ираШа обем1,0 «I , е ТМВ/вдадедеде

К/ ротор /0,05 > Трис~ЙС1 ,рН 8,0 , 0,001 И WA , 0,1. м ОА, 1де/м1 протеиназа К _и 0,5^ / ,съдарда 10 де 40 мо/м! детдандева дееежнв и ое янцубира ва 37®С _3S 60 мин.

След това протеина»» разгражда·, подучената в резултат плавна ва фраадияг ое депротеидедера посредством екстрахирай· с TS / 50 мМ ^шо*НС1 ,рЙ 8,0 , 1 нМ ВДА / наситен фенол ,ϊ® 6,5. Отделната фаде се отделя чрез центрофугиране и се рдастрдара с ΪΒΠΒ съдарда 0,1* . Ълучените в резултат вода Фази от всяка аистрежция ое отливат и ее екстражрет двукратно о еднакъв обем фенол/хдероформ/идеамидев атдел /1*1 /99*1// и след това двукратно е еднакъв обем от смее 99*1 от хлороформ /ждеамидев отдел. След фазово ревдедеде чрез центрофугиране , водната фаза ое довежда де крайна концентрация от 0,2 й Ца· ацетат и цувадедевкте киселини ее преципитирет чрез добавян· и·»· на даа обема етанол. Предедеткрадето нуклеинови киселини ее възстановяват чрез ултрацентрсфугиране в V 41 ротор при 30К, де 60 мин при 4°С или в епруветка де 10 ши при

К , 4°С.

ИЖ, екстрахирана от чернодробна биопсжя бе одетурт от дрДА«1я^,<> potato ^olow ol ' · ?1о^аде1 та ,1ог1 де, йтада. %ноцуклеоцитнета фракция е получена чрез дедавнтация на еднвкви количества кръв от дере чреа heott - ?аеде / Чдермм1а Corp. / е помощта на инструкциите не произдедйтоЛ1 Обдето количество ЯЖ се екстрахира от фракцията е дедата де — . » · гуаждан-тиоцианйтната процедура,описана от йюо ет.а!., 1989.

- 58 Синтезата на. W сДЯК пробите се осъ-ествява посред* ствол участието на обратна «рйнскрибтязя.Слеп феноямо преси®»* тиреие,прешпитирйнвта ™ ида Фдешжя ® нуклеинова киселина ее изсушава и се рееуепендара в третидена е ДОС жетижрана вода. Етеричните структури в нуклеиновите киселини се теружват чрез нагряване при 65⁰С зя 10 _{WK| и} пребито се охлаждат нтбевяе върху лед. оЖ се синтезира използдайж 1 ло 3 ш от ойдота Ж от черен дроб, или от нуклеинова жеедана 4ж РНК / екстрахирана от 10 до 100 иХ пжзма.Пда деятезата се иа* ползва обратна трансифбтаза и се щовеада в 25 мХ роашюнна смае» кат» е уввзаякето яа произдоштеж,ВР1 . Всички реада· оюя смеси за сЖ синтсзата съддаат 23 еданиш от М-asa ~ иизхбтр» Bm ln , ·/ Й йег /^¥омеоа /» След сЖ^К синтевата.» респсциснните с’«вси се разреждат с по да, варят се 10 мен и бързо се складат върху лед.

Всеки набор от преда ее поддаде на два питала ЖамшН»' кадая. Таймерите за а^лификация са подбрани тапа ле да iw« фшират обжсж,оздаеш като I* и Р\ Пьжм обхваща ^гклеошж 669-1243 и предаде гаеште амино шеежни 117 по 3001 втората област * обхваща нуклеотида 1215*1679 и дедара предаолагвеште ашно киселини от 300 до 408 /дадададееште адао киселини са номерирани започвайки от предалагаемия ме* тионин шндтр&д даден./.

iCP реакциите се провеждат предимно спорел инструкшите на дожюводатам /Сети. -Д»яг!п - St маг/, е изшючжие иа добавянето на 1 но Ж»аза А. Реакциите се давадат п мжеи обем 100 мХ. РС^ се осъществява да 30 цикъла, при режи от 94° С /1 шн/ » 37°С /? ши/ и 72*0 Λ мин / , <пю 7 минутна еистензия дож 72®С за последният цикъл. След тен® пробите ое owe* • 59 трехират е fewojrlC^Ctg, двукратна етянолда дапипитедо.реоуе· пендерт·® ® Ю ^рио ЯС1_#р8 8_t0 и конценгритон» е помощта на Кентрияон-ЗО / Ажяон/ филтрати. Цда те да преде ДУра уопеи· и© ее отстраняват ожгонуклтотмда,то-маляи от 30 нуилеотяда по размер| по този начин се отстраняват примерите от пърния кръг на Жшшпфиввжята·

Концентрирайте с Цонтритон-ЗО пуобй се тецдегат на вт©· рк нръг И^ампйифишяя» ^я се повтаря 35 ф?стля при режм 94°С /1 мин/, 6О*С / 1 т/ и 72°С / 2 шн / сте 7-минутяа ^w едетонзия при 72°С за последния цисти. След то» пгобит® ее евстражрат е фенол! (ОД₃,пр®1ааи«нраг се двукратно и се рее· гравдит о Щ»?!» реакционните продукти се анализират чре® електрофоретично разделяне на продуктите върху 6$ полиактжлашдам голово. ЖС е приблизителен размер дато този на очакваният Н2? продукт ее пода» на елеитроедуация от головете н се субклонире иж в gSBM плазмиден вектор иж в r oill.&mm· ният размер на продут за %Д и Ей ₽ елец първият кръг на ампжфикация е 615 вр и 683 вр съответно! след вторият кръг на шдадафижцта, очакваният размер да продукта зн ^к.Д и % £ е 414 вр и 575 вр, съответно. ^1д8здадате,съдьрдаж амшйтраните е© гоотоприамниюви клетки! рС&М пдазшда се използва за трепе формиране на ДЙ5-влфе , и :'Й11 се използва за трансформиране на СбОО .делта -НПч, Клоновете ш тр®и®ферчире.ните клетия, кои» то се хибрилизират към подходящи № сонда иж пък които ишт инсерти е прави жн размер, ее not подбират.След това инеерти* т® ее клоиират в ШЗ и се съгласуват. Сондите зо всички НС7/ ©HJP продукти ее състоят от ТОлязаш еетоори от HCV еДНК «

получени посредством РБ^мтлификадая.

Секвенционнв информация за варианти да 8г Ь областта · получена от 3 клона от № «!8, ° клона от ΪΗ ,3 клош от МИ и от HOW клоновете. ^даштние да структурата на нуияоотидмт гюследоттеяноот от всеки изолат. получен от тези клонове е kf показано на Шр» 7. Ш фигурата всяка посдодоватедаст е поне· зана от 5 до 3 за смисловата везира ва % I областта и енквеи» циите са подредени. вертикалните жш® и плавните буш» показват секвенционната дододожиост^отсъствието » дожа и мндате * «·· букви показват жпса на додоложнвст^^следователносдавте^пошзада ш линиите са както следа I лт 1, Шгп | линия ?, МИ жния 3,Н0Т* 18 j мш 4 , ВДЬ йивенционната инфоршда да вариантите в йг Р областта е получена от да клона на МНО, и от HCVj кдояовете.Гтта МИ© клош ое отличават само по един нукяеотид. Сравнение на пуква отидните поеледоштедаости иа МИО /клон й / и състава н» HCW последователностите е дошзано на Зкг.8 | всята поеледоватед* ноет е показана от 5 до 3 края за смислодот» ввпига па -¾ Р областта и лвслодожкгедастите еа поданнени. ДмИният пянк* ч-^:/Х: *** тир у®»!^ пое леда вата жюстл те обозначава едивонционнете домололвв»

Црштшз на ашно «сеждато доследоттелности,годира* ни в %V1* /ашно кисели» ► 117*308 / и %··₽. областта /«satно вжсеяоя · 300-438 / за всеки от изожтите е потазада но ®кр_в$ и <ta,10 съответно.Ььв '^турите се включени последователносште за изолатито &&3 и IW^owcaw по-горе· ^вен това» означени оа последователностите оа Ядонвкият изолвт | тези последователности са предоставени от ДрЛ, 1Цдояга,^годоя, На фигурите, амино киселинните последователности зя областта еа да до» в тяхната пядост до MJV1 и нехешлоишгте амипв пиее* липи в разлшп-ште и.пожти са означени.

Hbikto се вижда и» Фю». 9, в областта й|Х>тов©оъле шв хомоложюст отж 93* меда HGV1 и датите идежти. Ю18, Тд и ВД имат оноло 97* жжжжнвст с ЯСУц 1Н?з _м ПЬу притежа· ват около 96* и около 95* датолом-шт, съответно, е HCVf. W. 10 показва,че жшжлште в ®п·, Ж област са значително по-жлжи от Φι X· обжстта | ш» повече ©ден субрегион ее явява хипервапиабияеи / т.е. от ашно киселини 383-4П5 Л Теии данни са сумигечи то Таблицата то^то слепва неподадавеяо ^ЙИЙЮпЖп&.уХ,, аблапттл

Процент хо?оло^юст е ЖУ1

Мззо - Ш38 АЙ383 . Ш05 по-долу.

ТАШ1ЩА I

Изожт

	afes / us/	83	57
	IH27 /н&/	Ш	39
	Японски	73	48
	едо/ита· /	84	48

П_л ^Ш&Шк ПРЙЖЖОСТ

Ьеитеиите,идат»ифицвраии туй тотет да 'Чдат изжязввнв аа получаваш н» полипепвида· продуяти, яаято е описано »горе за дажжеиия като сдашнте н® дав за ЯП инфежш,яяи« дана Ю даагноетика, подухваното на антитела и дадена wm. Други приложвдея са описани m-горе и оио нави ск очевижи за специалистите в областта.

Barr el al., Biotechnioues (1986) 4:428.

Bradley er al., Gastroenterology (1985) £2:773.

Botstein, Gene (1979) £:17.

M.A. Brinton, (1986) in The Viruses: The Togaviridae and Flaviviridae (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p.327-374.

Broach (1981) in: Molecular Biology of the Yeast - Saccharomyces, Vol. 1, p.445, Cold Spring Harbor Press.

Broach et al., Meth Enzymol (1983) 101:307.

Catty (1988), Antibodies, Volume 1: A Practical Approach (IRL Press). Chaney et al., Cell Mol Genet (1986) 12:237.

Chakrabaiti et al., Mol Cell Biol (1985) 5:3403.

Chang et al., Nature (1977) 198: 1056.

Chen and Seeburg, DNA (1985) 4:165.

Chiigwin et al., Biochemistry (1979) 18:5294.

Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem (1987) 162:156.

Choo et al., Science (1989) 244:359.

Clewell et al., Proc Natl Acad Sci USA (1969) £2:1159.

Clewell, J Bacterio! (1972) 111):667.

Cohen, Proc Natl Acad Sci USA (1972) £2:2110.

Cousens et al., Gene (1987) £1:265.

De Boer et al., Proc Natl Acad Sci USA (1983) 292:128.

Dreesman et al., J Infect Dis (1985) 151:761.

S.M. Feinstone and J.H. Hoofnagle, New Engl J Med (1984) 311:185.

Feigner et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) £4:7413.

Fields & Knipe (1986), Fundamental Virology (Raven Press, N.Y.).

Fiers et al., Nature (1978) 273:113.

R.J. Gerety et al., in Viral Hepatitis and Liver Disease (B.N. Vyas, J.L.

Dienstag, and J.H. Hoofnagle, eds)

Glennie et al., Nature (1982) 295:712.

Gluzman, Cell (1981) 22:175.

Goeddel et al., Nuc Acids Res (1980) £:4057.

* 63 *

Graham and Van der Eb, Virology (1978) 52:546.

Grunstein and Hogness, Proc Natl Acad Sci USA (1975) 71;3961.

Grych et al., Nature (1985) 316:74.

Gubler and Hoffman Gene (1983) 21:263.

Hahn, Virology (1988) 112:167.

Hammerling et al., (1981), Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas.

Han, Biochemistry (1987) 21:1617.

Helfman, Proc Natl Acad Sci USA (1983) £0:31.

Hess et al., J Adv Enzyme Reg (1968) 7:149.

Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci USA (1978) 75:1929.

Hitzeman et al., J Biol Chern (1980) 255:2073.

Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900.

Holland, J Biol Chem (1981) 256:1385.

Holland and Holland, J Biol Chem (1980) 255:2596.

Hoopes et al., Nuc Acids Res (1981) 2:5493.

Houghton et al., Nuc Acids Res (1981) 2:247

Τ. V. Hunyh et al., (1985) in DNA Cloning Techniques; A Practical Approach (D. Glover, Ed., IRL Press, Oxford, U.K.) pp. 49-78.

Immun Rev (1982) 62:185.

Ito et al., Agric Biol Chem (1984) 4g:341.

Iwarson, British Medical J (1987) 295:946.

Kennett et al. (1980) Monoclonal Antibodies.

Kniskem et al., Gene (1986) 4(5:135.

Kyte and Doolittle, J Mol Bio (1982) 157:105-132.

Laemmli, Nature (1970) 227:680.

Lee et al., Science (1988) 239:1288.

Luckow and Summers, Virol (1989) 17:31.

Mackett et al., J Virol (1984) 42:857.

T. Maniatis el al. (1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold

Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second

Edition (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Manning and Mocarski, Virol (1988) 167:477.

d.

Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London).

Maxam et al., Meth Enzvmol (1980) ¢5:499.

MacNamara et al., Science (1984) 226:1325.

Messing et al., Nuc Acids Res (1981) 2:309. Messing, Meth Enzvmol (1983) 101:20-37. Michelle et al., Int. Symposium on Viral Hepatitis. Monath (1986) in The Viruses: The Togaviradae And Flaviviridae (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum

Press), pp. 375-440.

Moss (1987) in Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, ^r eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.), p. 10.

Nagahuma et al., Anal Biochem (1984) 141:74.

Neurath et al., Science (1984) 224:392.

Nisonoff et al., Clin Immunol Immunopathol (1981) 2Г-397-406.

L.R. Overby, Curr Hepatol (1985) ¢:49.

L.R. Overby, Curr Hepatol (1986) ¢:65.

L.R. Overby, Curr Hepatol (1987) 7:35.

Paehl et al., J Virol (1987) ¢1:315.

Peleg, Nature (1969) 221:193.

Pfefferkom and Shapiro (1974), in Comprehensive Virology, Vol. 2 (FraenkelConrat & Wagner, eds., Plenum, N.Y.) pp. 171-230.

A.M. Prince, Ann Rev Microbiol (1983) 32:217.

' Rice et al., Science (1985) 229:726.

Rice et al. (1986) in The Viruses: The Togaviridae And Flaviviridae (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), p.279-328.

Roehrig (1986) in The Viruses: The Togaviridae And Flaviviridae (Series eds. Fraenkel-Conrat and Wagner, vol. eds. Schlesinger and Schlesinger, Plenum

Press)

Sadler et al., Gene (1980) £:279.

Saiki et al.. Nature (1986) 324:163.

Saiki er al., Science (1988) 239:487.

Sanger et al., Proc Natl Acad Sci USA (1977) 74:5463.

Setlow, ed. (1988), Genetic Engineering Vol. 10, pp. 195-219 (Plenum Publishing Co., N.Y.

Schlesinger et al., J Virol (1986) ¢0:1153.

M. Schreier et al., (1980) Hybridoma Techniques

Scopes (1984), 'Protein Purification, Principles and Practice, 2nd Ed., (SpringerVerlag, N.Y.).

Shimatake er al., Nature (1981) 292:128.

Singh et al., Nuc Acids Res (1983) 11:4049.

Sippel. Eur J Biochem (1973) 37:31.

Smith et al., Mol Cell Biol (1983) 3:2156-2165.

Steimer et al., J Virol (1986) 5£:9.

Stollar (1980), in The Togaviruses (R.W. Schlesinger, ed.), pp. 584-622.

Stuve et al., J Virol (1987) ¢1:326.

Sumiyoshi et al., Virol (1987) 161:497.

Taylor et al., Biochim Biophvs Acta (1976) 442:324.

Towbin et al., Proc Natl Acad Sci USA (1979) 76:4350.

Tsu and Herzenberg (1980), in Selected Methods In Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co.) pp. 373-391.

Vytdehaag et al., J Immunol (1985) 134:1225.

P. Valenzuela et al., Nature (1982) 298:344.

P. Valenzuela et al., (1984), in Hepatitis В (I. Millman et al., ed, Plenum * Press) pp. 225-236;

Warner, DNA (1984) 3:401.

Ward et al., Nature (1989) 341:544. '

Wu and Grossman, Meth Enzvmol (1987), 154 Recombinant DNA, Part E.

Wu, Meth Enzymol (1987), 155. Recombinant DNA, part F.

Zoller, Nuc Acids Res (1982) 1£:6487.

U.S. Patent No. 4,341,761

U.S. Patent No. 4,466,917

U.S. Patent No. 4,399,121

U.S. Patent No. 4,472,500

U.S. Patent No. 4,427,783

U.S. Patent No. 4,491,632

U.S. Patent No. 4,444,887

U.S. Patent No. 4,816,467

U.S. Patent No. 4,493,890

Claims (8)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1,. Цзлипептид,обхващащ скъсена HCV последователност.която съдържа ECV епитоп с формулата ^: където аа означава амино киселина * х и у са цяло число.така пе у-х - 6 · означава част от амино киселиината последователност на ^гура 1 и х е подбран от групата,състояща се от ^:

   23-34, 36, 66-79, 81-94, 96¹ _; 98, 101-103, 186-189, 191, 206, 223, 232, 256, 286, 297-299, 321, 347, 357,

   413, 414, 432, 465^71, 48^484, 501, 502, 521, 540-549, 579, 594-599, 601' 613, 641, 662-665, 685, 705, 706, 729, 782-789, 801, 851-855, 893, 916, 928, : >^! 946 , 952-954, 1026, 1072.1109, 1112-1117, 1218, 1240, 1280-1285, 1322, 1338, ί 1371, 1384, 1410, 1411, 1454, 1492, 1493, 1532-1535, 1560, 1561, 1566-1568.

   ^{: 1} 1571-1577, 1601-1607, 1615-1620/ 1655, 1695, 1710-1712, 1728, 1729, 17581762, 1781, 1808, 1821, 1851, 1880, 1908-1913, 1925, 1940-1948, 1951, 1966i 1969, 1999, 2001-2004. 2006-2014, 2024, 2048-2053, 2055-2057, 2071, 20882093, 2108, 2122-2148, 2165, 2187, 2226-2232, 2244-2249, 2267, 2281-2286, 2288, 2289, 2325-2327, 2346, 2347, 2349, 2382, 2401, 2417-2422, 2439-2444, ) 2446-2456, 2469, 2471-2476, 2495, 2533, 2534, 2573-2578, 2602-2604, 26062612, 2632-2638, 2660, 2676-2679, 2688-2693, 2707, 2721, 2757-2762, 2779, 2794, 2795, 2797-2799, 2801, 2802, 2817-2843, 2863-2867, 2878-2884, 28862895.

   67 ·
2. 2« претеадщж 1, «йто м»ж тляии»

   ОЮЛО 100 ШЖН0 ЯЙСО»® яж W-W!»·

   J
3. 3» Ц>жтптжд,е»»е« чтжтедаж 2, където у * ж * 50»
4. 4. ЦмвПМЯ«Д,ОМТт09В ПреТШЦШ 2,IIW у * ж · ⁹0, » *
5. 5» Ц*яттт»е«гяас*ю преттш З.яъдето у · ж * 10«
6. 6« Шжтажд,с«шено rroerewswr ^ямт ж е гюлбрвж

   ·.. .. - * от г^уот»еютснш ее- от 506,510,523,^3,582,580 ж Ш-620,
7. 7. Цматмяшд с дай» от ©но» 100 яли гамвж^обтщащ ежи ештоо а фошуяата nw аа оштяа аиш телиш I ж и у ое даде чяеде,тяде че у*х * 6 | аа* * аа^ оенмтаа чаот ое (акля^ш деелн даооедаоот о* ^trypa 1 | и ж е дечбдея от ччуча отстояща се от 35 / у е по-»» и <й / ,

   80 у е 1Ю*шлю е» 90/ , 95 Лшдеде у » де-шиде» от 110 /, 99 /дадето у е дендадао от 130 / , 100 /ждеде у • дмаш© от 180 /,190 Ля&дето у е дениажде от 910 /, 800 /където у е де-шяде от 550/ ,800/яъдето у е де—?ж*де от 625/, 136О/зад9ТО у е де*шда от 1980/ ,1589 / ww> у е

   W· W, аншпо от 1931/, 1570 /където у е ямдео от 1590/ ,1694 /дадето У ® пнт от 1735 / , 1949 /където у л де-шяг· от 2134/, 1950/дадет© у е де-да яде от *985/,W<^TkWO у · Я»*ШЛ8© от 2О5О/,9О05/къкото у 0 тишш е” /₉ ЖШ /дадето у е де-далж» от з**^/ ,9950 /яъдет© у « де-меж» от 3330/, 32^/където у а де-далде ст ^σ3^5 /, 2390/кадото У • ш*шуто от 2310/, 3345/жадт у е де-мш?да от *^Л^Я /,2348 /дадето у о де*шлде от 2466/, 9445/шдето У е де-малде от

   2475/, 2470/дъдето у е по-жлж от °49θΛ 2605/нъдето у е 1Ю-к®лно от 2820/,2780/тедето у е го-кзд» от w/, /rww у е по-жляо от 2886/, 2800/яъдето у е по*шляо от 2850/ и 2885/къдато у е по-шзлко от °905/.

   » » 8* Реагент за имунологично изпитване, отлтогащ полипептид съгласно яоято и да е от ппетежии 1-7.

   9. Реагент за «цупздогично изпитване съгласно претоплих 8, квдото у * х ** SO.

   10. Реагент за имунздогтпю изиитваж съгласно нретежрм
8. 8 . където х е подбран от групата състояща се от 506,510, 523,553,582,680 и 590 - 620.