ES2343252T3 - Evento de maiz pv-zmgt32 (nk603) y composiciones y procedimientos para deteccion del mismo. - Google Patents
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Abstract
Un constructo de ADN que comprende: un primer y un segundo casete de expresión, en la que dicho primer casete de expresión en conexión operativa comprende (i) un promotor de actina 1 de arroz, (ii) un intrón de actina 1 de arroz, (iii) una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto, (iv) una molécula de ADN que codifica un EPSPS tolerante a glifosato y (v) una molécula de ADN terminador transcripcional; y dicho segundo casete de expresión comprende en conexión operativa (a) un promotor del CaMV 35S, (b) un intrón Hsp70, (c) una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto, (d) una molécula de ADN que codifica un EPSPS tolerante a glifosato y (e) una molécula de ADN terminador transcripcional.
Description
Evento de maíz PV-ZMGT32 (nk603)
y composiciones y procedimientos para detección del mismo.
La presente invención se refiere a un constructo
de ADN que confiere a las plantas tolerancia al glifosato, a su uso
para preparar una planta de maíz que tolere la aplicación de
herbicida glifosato y a una planta de maíz transgénica tolerante al
glifosato y a semillas de la misma que comprenden el constructo.
El maíz es un cultivo importante y es una fuente
de alimento principal en muchas zonas del mundo. Se han aplicado al
maíz los procedimientos de biotecnología para mejorar los rasgos
agronómicos y la calidad del producto. Un rasgo agronómico
semejante es la tolerancia a herbicidas, en particular tolerancia al
herbicida glifosato. Este rasgo en maíz se ha conferido mediante la
expresión de un transgén en las plantas de maíz (patente de los
Estados Unidos Nº.: 6.040.497).
La expresión de genes extraños en plantas se
conoce por estar influida por su posición cromosómica, debido
quizás a la estructura de cromatina (por ejemplo heterocromatina) o
la proximidad de elementos reguladores transcripcionales (por
ejemplo, potenciadores) cerca del sitio de integración (Weising y
col., Ann. Rev. Genet. 22: 421-427, 1988).
Por esta razón, a menudo es necesario someter a una revisión un gran
número de eventos con el fin de identificar un evento caracterizado
por la expresión óptima de un gen introducido de interés. Por
ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede
haber una amplia variación en niveles de expresión de genes
introducidos entre eventos. Puede haber también diferencias entre
patrones espaciales o temporales de expresión, por ejemplo,
diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos
tejidos vegetales, que puede no corresponder a los patrones
esperados de elementos reguladores presentes en el constructo
génico introducido. Por esta razón, es común producir cientos o
miles de eventos diferentes y someter a una revisión aquellos
eventos para un evento simple que tiene niveles y patrones de
expresión transgénica deseados para propósitos comerciales. Un
evento que tiene niveles y patrones de expresión transgénica
deseados es útil para introducir el transgén dentro de otros
antecedentes genéticos mediante cruzamiento sexual usando
procedimientos de reproducción convencionales. La progenie de tales
cruces mantiene las características de expresión transgénica del
transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar una
expresión génica fiable en un número de variedades que están bien
adaptadas a las condiciones de crecimiento locales.
Sería ventajoso poder detectar la presencia de
un evento en particular con el fin de determinar si la progenie de
un cruzamiento sexual contiene un transgén de interés. Además, un
procedimiento para detectar un evento en particular sería útil para
cumplir con las regulaciones que requieren la aprobación anterior a
la comercialización y etiquetado de alimentos derivados de plantas
de cultivo recombinantes, por ejemplo. Es posible detectar la
presencia de un transgén mediante cualquier procedimiento de
detección de ácidos nucleicos bien conocido tal como la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación de ADN usando sondas
de ácido nucleico. Estos procedimientos de detección generalmente
se centran en elementos genéticos usados frecuentemente, tales como
promotores, terminadores, genes marcadores, etc. Como resultado,
tales procedimientos pueden no ser útiles para discriminar entre
diferentes elementos, particularmente los producidos usando el mismo
constructo de ADN, a menos que se conozca la secuencia de ADN del
ADN cromosómico adyacente al ADN insertado ("ADN flanqueante").
Un ensayo de PCR específico de evento se discute, por ejemplo, por
Windels y col. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:
459-462, 1999), quienes identificaron el evento
40-3-2 de soja tolerante a glifosato
mediante PCR usando un grupo de cebadores que abarcan el empalme
entre el inserto y el ADN flanqueante, específicamente un cebador
que incluye una secuencia del inserto y un segundo cebador que
incluye una secuencia del ADN flanqueante.
La patente de Estados Unidos 5,948,956 menciona
un vector específico pMON25496 y su uso para transformar plantas;
las secuencias funcionales de dicho vector no se desvelan
completamente en dicho documento.
De acuerdo con un aspecto de la invención, se
proporciona un constructo de ADN que cuando se expresa en células
vegetales y plantas confiere tolerancia a herbicida de glifosato. La
presente invención se refiere preferiblemente a los procedimientos
para producir y seleccionar una planta de cultivo monocotiledónea
tolerante a glifosato. El constructo de ADN está constituido por
dos casetes de expresión transgénicos. El primer casete de expresión
comprende una molécula de ADN de un promotor de actina 1 de arroz
(Oryza sativa) y un intrón de actina 1 de arroz unido
operativamente a una molécula de ADN que codifica una secuencia de
péptido de tránsito de cloroplasto, conectada operativamente a una
molécula de ADN que codifica una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) resistente a glifosato, conectada operativamente a
una molécula de ADN que comprende un terminador transcripcional 3'.
El segundo casete de expresión transgénica del constructo de ADN
comprende una molécula de ADN del promotor del virus del mosaico de
la coliflor (CaMV) 35S, conectada operativamente a una molécula de
ADN que comprende un intrón Hsp70, conectada operativamente a una
molécula de ADN que codifica una secuencia peptídica de transito de
cloroplasto, unida operativamente a una molécula de ADN que codifica
una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) resistente a glifosato, conectada operativamente a
una molécula de ADN que comprende un terminador transcripcional
3'.
De modo más específico, se proporciona un
constructo de ADN que cuando se expresa en células vegetales y en
plantas confiere tolerancia al herbicida glifosato. Esta invención
se refiere preferentemente a los procedimientos para producir y
seleccionar una planta de maíz tolerante a glifosato. El constructo
de ADN está constituido por dos casetes de expresión transgénica.
El primer casete de expresión está constituido por una molécula de
ADN de un promotor de actina 1 de arroz (Oryza sativa) y un
intrón de actina 1 de arroz unido operativamente a una molécula de
ADN que codifica una secuencia peptídica de tránsito de cloroplasto
de EPSPS de Arabidopsis, conectada operativamente a una
molécula de ADN que codifica una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) resistente a glifosato aislada de Agrobacterium
tumefasciens sp., cepa CP4, conectada operativamente a una
molécula de ADN que consta de un terminador transcripcional de
nopalina sintasa. El segundo casete de expresión consta de una
molécula de ADN del promotor del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV) 35S que contiene una duplicación en tándem de la región
potenciadora, conectada operativamente a una molécula de ADN que
codifica una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) resistente a glifosato aislada de Agrobacterium
tumefasciens sp., cepa CP4, conectada operativamente a una
molécula de ADN que está constituida por un terminador
transcripcional de nopalina sintasa.
La presente invención proporciona un
procedimiento para producir una planta de maíz tolerante al
herbicida glifosato que comprende transformar una célula de maíz
con un constructo de ADN definido anteriormente en el presente
documento (pMON25496), seleccionar la célula de maíz para tolerancia
al tratamiento con una dosis eficaz de glifosato y cultivar la
célula de maíz en una planta de maíz fértil. La planta de maíz
fértil puede autopolizarse o cruzarse con variedades de maíz
compatibles para producir progenie tolerante al glifosato.
La presente invención se refiere a las plantas y
semillas de maíz tolerante al glifosato que comprenden el
constructo de ADN tal como se ha definido anteriormente en el
presente documento, tales como una línea de maíz (Zea
mais).
Lo precedente y otros aspectos de la invención
llegarán a ser más patentes a partir de la siguiente descripción
detallada y dibujos acompañantes.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Mapa de plásmido de pMON25496.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes definiciones y procedimientos se
proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar
a los expertos en la técnica en la práctica de la presente
invención. A menos que se señale otra cosa, los términos son para
entenderse de acuerdo al uso convencional por los expertos en la
técnica relevante. Las definiciones de términos comunes en biología
molecular se pueden encontrar también en Rieger y col., Glossary
of Genetics: Classical and Molecular, 5ª edición,
Springer-Verlag: Nueva York, 1991; y Lewin, Genes
V, Oxford University Press: Nueva York, 1994. Se usa la
nomenclatura para bases de ADN como se expone en CFR 37 artículo
1,822.
Como se usa en el presente documento, el término
"maíz" significa Zea mais o maíz e incluye todas las
variedades de plantas que pueden cruzarse con maíz, incluidas
especies silvestres de maíz.
Como se usa en el presente documento, el término
"que comprende" significa "que incluye pero no limitado
a".
"Glifosato" se refiere a
N-fosfonometilglicina y sus sales. El glifosato es
el ingrediente activo del herbicida Roundup® (Monsanto Co.).
Tratamientos con "herbicida de glifosato" se refiere a
tratamientos con los herbicidas Roundup®, Roundup Ultra®, Roundup
UltraMax® o cualquier otra formulación herbicida que contenga
glifosato. La selección de las tasas de aplicación para una
formulación de glifosato que constituye una dosis biológicamente
eficaz está dentro del alcance del técnico agrícola normal.
Un constructo de ADN es un ensamblado de
moléculas de ADN unidas conjuntamente que proporcionan uno o más
casetes de expresión. El constructo de ADN es preferentemente un
plásmido que está habilitado para su autorreplicación en una célula
bacteriana y contiene diversos sitios de restricción de enzimas
endonucleasas que son útiles para introducir moléculas de ADN que
proporcionan elementos genéticos funcionales, es decir, promotores,
intrones, líderes, secuencias codificadoras, regiones de
terminación 3', entre otros. Los casetes de expresión contenidos en
un constructo de ADN comprenden los elementos genéticos necesarios
para proporcionar transcripción de un ARN mensajero. Los casetes de
expresión contenidos dentro de un constructo de ADN comprenden los
elementos genéticos necesarios para proporcionar transcripción de
un ARN mensajero. Los casetes de expresión se pueden diseñar para
expresarse en células procariotas o células eucariotas. Los casetes
de expresión de la presente invención se pueden diseñar para
expresarse más preferentemente en células vegetales. La combinación
de casetes de expresión en plantas transgénicas puede conducir a
fenotipos inesperados. En la presenta invención, la combinación del
casete promotor de actina 1 de arroz y el casete promotor de CaMV
35S proporcionado en un constructo de ADN (pMON25496) potenció la
tolerancia de la planta de maíz transgénico al herbicida glifosato
cuando se comparó con los casetes aislados solos y con el estándar
comercial llamado GA21 que contiene tres copias de un casete
promotor de actina 1 de
arroz.
arroz.
Un "evento" transgénico se produce mediante
transformación de células de plantas con un constructo de ADN
heterólogo que incluye un casete de expresión de ácidos nucleicos
que comprende un transgén de interés, la regeneración de una
población de plantas resultantes de la inserción del transgén dentro
del genoma de la planta, y la selección de una planta en particular
caracterizada por la inserción dentro de una localización genómica
en particular. El término "evento" se refiere al transformante
original y la progenie del transformante que incluye el ADN
heterólogo. El término "evento" se refiere también a la
progenie producida mediante un cruce sexual entre individuos de
diferentes cepas entre el transformante y otra variedad que incluya
el ADN heterólogo. Incluso después de retrocruzamientos repetidos
con un progenitor recurrente, el ADN insertado y el ADN flanqueante
a partir del progenitor transformado están presentes en la progenie
del cruce en la misma localización cromosómica. El término
"evento" también se refiere a ADN del transformante original
que comprende el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante
inmediatamente adyacente al ADN insertado que debería esperarse al
transferirse a una progenie que recibe ADN insertado que incluye el
transgén de interés como el resultado de un cruzamiento sexual de
una línea parental que incluye el ADN insertado (por ejemplo, el
transformante original y la progenie resultante de autofecundación)
y una línea parental que no contiene el ADN insertado. Una planta
de maíz tolerante a glifosato PV-ZMGT32 (nk603) se
puede multiplicar, primero cruzando sexualmente una primera planta
de maíz parental constituida por una planta de maíz crecida a partir
de la planta de maíz transgénico PV-ZMGT32 (nk603)
que tiene número de acceso de la ATCC PTA-2478 y
progenie de la misma derivada de transformación con casetes de
expresión de la presente invención adecuados que toleran la
aplicación del herbicida glifosato, y una segunda planta de maíz
parental que carece de la tolerancia a herbicida glifosato,
produciendo por lo tanto una pluralidad de plantas de primera
generación; y seleccionando después una planta de primera
generación que es tolerante a la aplicación del herbicida glifosato;
y autofecundando la planta de primera generación, produciendo por
lo tanto una pluralidad de plantas de segunda generación; y
seleccionando después a partir de las plantas de la segunda
generación una planta tolerante al herbicida glifosato. Estas
etapas pueden incluir adicionalmente el retrocruzamiento de la
primera planta de la progenie tolerante a glifosato o de la segunda
planta de la progenie tolerante a glifosato con la segunda planta de
maíz parental o una tercera planta de maíz parental, produciendo de
este modo una planta de maíz que tolera la aplicación de herbicida
glifosato.
Se entenderá también que diferentes plantas
transgénicas se pueden aparear también para producir prole que
contiene dos genes exógenos, añadidos segregados independientemente.
La autofecundación de la generación adecuada puede producir plantas
que son homocigóticas para ambos genes exógenos, añadidos. Se
consideran también el retrocruzamiento con una planta parental y el
cruzamiento sexual entre diferentes cepas con una planta no
transgénica, y su propagación vegetativa. Las descripciones de otros
procedimientos de reproducción que se usan comúnmente para
diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de varias
referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar
Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy,
Madison WI (1987).
Una "sonda" es un ácido nucleico aislado el
cual está unido a una etiqueta detectable convencional o molécula
notificadora, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente
quimioluminiscente, o enzima. Una sonda semejante es complementaria
a una hebra de ácido nucleico diana, en el evento de la presente
invención, a una hebra de ADN genómico a partir del evento de maíz
transgénico PV-ZMGT32 (nk603) de una planta de maíz
o de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas incluyen no
sólo ácidos desoxirribonucleico o ribonucleico sino también
poliamidas y otros materiales de sonda que unen específicamente a
una secuencia de ADN diana y se pueden usar para detectar la
presencia de esa secuencia de ADN diana.
Los "cebadores" son ácidos nucleicos
aislados que están alineados con una hebra de ADN diana
complementaria mediante hibridación de ácidos nucleicos formando un
híbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana, prolongándose
después a lo largo de la hebra de ADN diana mediante una polimerasa,
por ejemplo, una polimerasa de ADN. Los pares de cebadores se
refieren a su uso para la amplificación de una secuencia de ácido
nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácidos
nucleicos convencionales.
Sondas y cebadores son de suficiente longitud
nucleotídica para unir la secuencia de ADN diana específicamente en
las condiciones de hibridación o condiciones de reacción
determinadas por el operador. Esta longitud puede ser de cualquier
longitud que sea de suficiente longitud para ser útil en el
procedimiento de detección de elección. Generalmente, se usan
longitudes de 11 nucleótidos o más, preferentemente de 18
nucleótidos o más, más preferentemente de 24 nucleótidos o más, y
del modo más preferente de 30 nucleótidos o más. Tales sondas y
cebadores hibridan específicamente con una secuencia diana bajo
condiciones de hibridación de alta restrictividad. Preferiblemente,
las sondas y cebadores tienen similaridad de secuencia de ADN
completa de nucleótidos contiguos con la secuencia diana, aunque
las sondas que difieren de la secuencia de ADN diana y que retienen
la capacidad para hibridar con secuencias de ADN diana se pueden
diseñar por procedimientos convencionales.
Los procedimientos para preparar y usar sondas y
cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, vol. 1-3, ed.
Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, 1989 (en adelante en este documento, "Sambrook y col.,
1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed.
Ausubel y col., Greene Publishing y
Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con
actualizaciones periódicas) (en adelante en este documento,
"Ausubel y col., 1992"); e Innis y col., PCR protocols: A
Guide to Methods and Applications, Academic Press; San Diego,
1990. Los pares de cebadores de PCR se pueden derivar de una
secuencia conocida, por ejemplo, usando programas de ordenador para
ese propósito tal como Primer (Versión 0,5, © 1991, Whiteland
Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Cebadores y sondas basados en las secuencias de
ADN flanqueante y de inserto descritas en el presente documento se
pueden usar para confirmar (y, si es necesario, para corregir) las
secuencias descritas mediante procedimientos convencionales, por
ejemplo, reclonando y secuenciando tales secuencias.
Las sondas y cebadores de ácidos nucleicos de la
presente invención hibridan en condiciones restrictivas con una
secuencia de ADN diana. Cualquier procedimiento de hibridación o
amplificación de ácido nucleico convencional se puede usar para
identificar la presencia de ADN a partir de un evento transgénico en
una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o fragmentos de las
mismas son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas
de ácido nucleico en determinadas circunstancias. Como se usan en
el presente documento, se dice que dos moléculas de ácido nucleico
son capaces de hibridar específicamente la una a la otra si las dos
moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de
cadena doble, antiparalela. Se dice que una molécula de ácido
nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico
si presentan complementariedad completa. Como se usa en el presente
documento, se dice que unas moléculas presentan "complementariedad
completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es
complementario a un nucleótido de la otra. Se dice de dos moléculas
que son "mínimamente complementarias" si pueden hibridar una
con la otra con suficiente estabilidad para permitirlas permanecer
alineada la una con la otra en al menos condiciones convencionales
de "baja restrictividad". De forma similar, se dice que las
moléculas son "complementarias" si se pueden hibridar una con
la otra con suficiente estabilidad para permitirlas permanecer
alineadas una con la otra en condiciones convencionales de "alta
restrictividad". Las condiciones de restrictividad
convencionales se describen por Sambrook y col., 1989, y por Hames y
col., en: Nucleic Acid Hybridation, A Practical Approach,
IRL Press, Washington, DC (1985). Son permisibles por lo tanto
desviaciones de la complementariedad completa, en tanto en cuanto
tales desviaciones no descarten completamente la capacidad de las
moléculas para formar una estructura de cadena doble. Para que una
molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda sólo necesita
ser suficientemente complementaria en secuencia para ser capaz de
formar una estructura de doble cadena estable en el disolvente y en
sales de concentraciones empleadas en particular.
Tal como se usa en el presente documento, una
secuencia sustancialmente homóloga es una molécula de ácido
nucleico que se hibridará específicamente al complemento de la
molécula de ácido nucleico a la cual se está comparando en
condiciones de alta restrictividad. Las condiciones de
restrictividad apropiada las cuales promueven la hibridación de
ADN, por ejemplo, cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) a
aproximadamente 45ºC, seguido por un lavado de SSC 2X a 50ºC, se
conocen por aquellos expertos en la técnica o se pueden encontrar en
Current Protocols in Molecular Biology, John Willey &
Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la
concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar de
una restrictividad baja de aproximadamente SSC 2X a 50ºC a una
restrictividad alta de aproximadamente SSC 0,2X a 50ºC. Además, la
temperatura en la etapa de lavado se puede incrementar a partir de
condiciones de baja restrictividad a temperatura ambiente,
aproximadamente 22ºC, en condiciones de alta restrictividad a
aproximadamente 65ºC. Tanto temperatura como sal se pueden variar,
o, bien la temperatura o bien la concentración de sal pueden
mantenerse constantes mientras la otra variable se cambia. En una
realización preferida, un ácido nucleico de la presente invención
hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácido
nucleico expuestas en las SEQ ID Nº.: 9, 10, 11, y 12, o
complementos de las mismas o fragmentos de cualquiera bajo
condiciones moderadamente restrictivas, por ejemplo a
aproximadamente 2,0 x SSC y aproximadamente 65ºC. En una
realización particularmente preferida, un ácido nucleico de la
presente invención hibridará específicamente con una o más de las
moléculas de ácido nucleico expuestas en de la SEQ ID Nº.: 9 a la
SEQ ID Nº.: 12 o complementos o fragmentos de cualquiera bajo
condiciones de alta restrictividad. Un marcador preferido de
molécula de ácido nucleico de la presente invención tiene la
secuencia de ácidos nucleicos expuesta de la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ
ID Nº.: 12 o complementos de las mismas.
Además, una molécula de ácido nucleico marcadora
preferente de la presente invención comparte entre el 80% y el 100%
o el 90% y el 100% de identidad de secuencia con una secuencia
explicada en de la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12 o complementos
de las mismas o fragmentos de las mismas. Finalmente, una molécula
de ácido nucleico marcadora preferida de la presente invención
comparte entre el 95% y el 100% de una identidad de secuencia con
una secuencia explicada en de la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12 o
complementos de las mismas o fragmentos de las mismas. De la SEQ ID
Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12 se pueden usar como marcadores en
procedimientos de reproducción vegetal para identificar la progenie
de cruces genéticos de forma similar a los procedimientos descritos
para análisis de marcador de ADN de repetición de secuencia simple,
en "ADN markers: Protocols, applications, and
overviews": (1997) 173-185, Cregan, y col.,
eds., Wiley-Liss NY.
La hibridación de la sonda de la secuencia de la
molécula de ADN diana se puede detectar mediante cualquier número
de procedimientos conocido por los expertos en la técnica, éstos
pueden incluir marcas fluorescentes, marcas radiactivas, marcas
basadas en anticuerpos y marcas quimioluminiscentes.
Respecto a la amplificación de una secuencia de
ácidos nucleicos diana (por ejemplo, mediante PCR) usando un par de
cebadores de amplificación en particular, "condiciones
restrictivas" son condiciones que permiten al par cebador
hibridar sólo con la secuencia diana de ácido nucleico a la cual se
uniría un cebador que tenga la secuencia de tipo salvaje
correspondiente (o su complemento) y que preferiblemente permiten
producir un único producto de amplificación, el amplicón, en una
reacción de amplificación térmica de ADN.
El término "específico para (una secuencia
diana)" indica que una sonda o cebador hibrida en condiciones de
hibridación restrictivas sólo con la secuencia diana en una muestra
que comprende la secuencia diana.
Tal como se usa en el presente documento, "ADN
amplificado" o "amplicón" se refiere al producto de
amplificación de ácidos nucleicos de una secuencia de aminoácidos
diana que es parte de una plantilla de ácido nucleico. Por ejemplo,
para determinar si la planta de maíz que resulta de un cruce sexual
contiene ADN genómico de evento transgénico a partir de la planta
de maíz de la presente invención, el ADN extraído de una muestra de
tejido de planta de maíz se puede someter a un procedimiento de
amplificación de ácidos nucleicos usando un par cebador de ADN que
incluye un primer cebador derivado de la secuencia flanqueante en el
genoma de la planta adyacente al sitio de inserción del ADN
heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del ADN
heterólogo insertado para producir un amplicón que es diagnóstico
para la presencia del ADN del evento. El amplicón es de una
longitud y tiene una secuencia que también es diagnóstica para el
evento. El amplicón puede variar en longitud desde la longitud
combinada del primer par más un par de bases nucleotídicas,
preferentemente más aproximadamente cincuenta pares de bases
nucleotídicas, más preferentemente más aproximadamente doscientos
cincuenta pares de bases nucleotídicas, e incluso más
preferentemente más aproximadamente cuatrocientos cincuenta pares
de bases nucleotídicas. Alternativamente, un par cebador se puede
derivar de una secuencia flanqueante en ambos lados del ADN
insertado tal como para producir un amplicón que incluya la
secuencia nucleotídica del inserto entera (por ejemplo, el
fragmento de ADN Mlu1 del constructo de expresión pMON25496, figura
1, aproximadamente 6706 pares de bases nucleotídicas). Un miembro
de un primer par derivado de la secuencia genómica de plantas se
puede localizar a distancia de la secuencia de ADN insertado, esta
distancia puede variar de un par de bases hasta los límites de la
reacción de amplificación, o aproximadamente veinte mil pares de
bases nucleotídicas. El uso del término "amplicón" excluye
específicamente dímeros de cebador que se pueden formar en la
reacción de amplificación térmica de
ADN.
ADN.
La amplificación de ácidos nucleicos se puede
llevar a cabo mediante algunos de los diversos procedimientos de
amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica,
incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se conoce
en la técnica una diversidad de procedimientos de amplificación y se
describe, entre otras cosas, en las patentes de los Estados Unidos
Nº.: 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide to Methods
and Applications, ed. Innis y col., Academic Press, San Diego,
1990. Los procedimientos de amplificación se han desarrollado para
amplificar hasta 22 kb de ADN genómico y hasta 42 kb de ADN de
bacteriófago (Cheng y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
5695-5699, 1994). Estos procedimientos así como
otros procedimientos conocidos en la técnica de amplificación de
ADN se pueden usar en la práctica de la presente invención. La
secuencia de inserto de ADN heterólogo o secuencia de ADN
flanqueante a partir del evento de maíz PV-ZMGT32
(nk603) se puede verificar (y corregir si es necesario) amplificando
tales secuencias a partir de ADN extraído a partir de la semilla o
plantas de Nº. de acceso de depósito de ATCC
PTA-2478 usando cebadores de ADN a partir de las
secuencias proporcionadas en el presente documento seguidas por
secuenciación de ADN estándar del amplicón de PCR o del ADN
clonado.
El amplicón producido mediante estos
procedimientos se puede detectar mediante una pluralidad de
técnicas. Uno de tales procedimientos es Análisis de Bits Genéticos
(Nikiforov, y col. Nucleic Acid Res. 22:
4167-4175, 1994) donde se diseña un oligonucleótido
de ADN el cual se solapa tanto con la secuencia de ADN genómico
adyacente flanqueante como con la secuencia de ADN insertada. El
oligonucleótido se inmoviliza en pocillos de una placa de
micropocillos. Tras someter a PCR a la región de interés (usando un
cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica
flanqueante adyacente), un producto de PCR de cadena simple se puede
hibridar con el oligonucleótido inmovilizado y servir como
plantilla para una reacción de extensión de base única usando una
ADN polimerasa y ddNTP señalados específicos para la siguiente base
esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una
señal indica presencia de la secuencia del inserto/secuencia
flanqueante debida a la amplificación, hibridación, y extensión de
base única exitosa.
Otro procedimiento es la técnica de
pirosecuenciación como se describe por Winge (Innov. Pharma
Tech. 00: 18-24, 2000). En este procedimiento
se diseña un oligonucleótido que se solapa con el ADN genómico
adyacente y el empalme de ADN del inserto. El oligonucleótido se
hibrida a producto de PCR de cadena simple a partir de la región de
interés (un cebador insertado en la secuencia y uno en la secuencia
genómica flanqueante) e incubado en presencia de una ADN
polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5'
fosfosulfato y luciferina. Se añaden individualmente dNTP y la
incorporación resulta en una señal ligera la cual se mide. Una
señal ligera indica la presencia de la secuencia del inserto del
transgén/secuencia flanqueante debida a amplificación, hibridación,
y extensión de base única o multibase exitosas.
La Polarización de Fluorescencia como se
describe por Chen y col., (Genome Res. 9: 492-498,
1999) es un procedimiento que se puede usar para detectar el
amplicón. Usando este procedimiento se diseña un oligonucleótido que
se solapa con el ADN genómico flanqueante y el empalme de ADN
insertado. El oligonucleótido se hibrida a producto de PCR de
cadena simple a partir de la región de interés (un cebador en el ADN
insertado y uno en la secuencia de ADN genómica flanqueante) y se
incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP señalado
fluorescentemente. La extensión de base individual da como
resultado la incorporación de los ddNTP. La incorporación se puede
medir como un cambio en polarización usando un fluorómetro. Un
cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia de
inserto/secuencia flanqueante debida a la amplificación, hibridación
y extensión de base individual
exitosas.
exitosas.
Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)
se describe como un procedimiento para detectar y cuantificar la
presencia de una secuencia de ADN y se entiende totalmente en las
instrucciones proporcionadas por el fabricante. Brevemente, se
diseña una sonda oligonucleotídica FRET la cual se solapa con la
región flanqueante y con el empalme de ADN del inserto. La sonda
FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN
insertado y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en
presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de
la sonda FRET da como resultado escisión y liberación del resto
fluorescente desde el resto desactivador de la sonda FRET. Una
señal fluorescente indica la presencia de la secuencia
flanqueante/secuencia del inserto del transgén debido a la
amplificación e hibridación exitosas.
Se han descrito Balizas Moleculares para usar en
detección de secuencia en Tyangi, y col. (Nature Biotech. 14:
303-308, 1996). Brevemente, se diseña una sonda
oligonucleotídica FRET que se solapa con el empalme de ADN de
inserto y la región flanqueante genómica. La estructura única de la
sonda FRET da como resultado que contiene la estructura secundaria
que mantiene los restos fluorescente y desactivador en proximidad
cercana. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la
secuencia de inserto de ADN y uno en la secuencia genómica
flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y
dNTP. Tras la amplificación de PCR exitosa, la hibridación de la
sonda FRET a la secuencia diana da como resultado la eliminación de
la estructura de sonda secundaria y la separación espacial de los
restos fluorescentes y desactivadores. Da como resultado una señal
fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la
secuencia de inserto del transgen/secuencia flanqueante debido a la
amplificación e hibridación exitosas.
Los siguientes ejemplos se incluyen para
demostrar ejemplos de ciertas realizaciones preferentes de la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El evento de maíz transgénico
PV-ZMGT32 (denominado a continuación nk603) se
generó mediante bombardeo con microproyectiles de embriones de maíz
(Songstad y col., In Vitro Cell Plant 32:
179-183, 1996) usando un fragmento de ADN de MLu I
lineal derivado de pMON25496 (figura 1). Este fragmento de ADN
contiene dos casetes de expresión transgénica que confieren
colectivamente tolerancia a glifosato a la planta de maíz. El primer
casete se compone del promotor de la actina 1 del arroz e intrón
(P-Os.Act1 y I-Os.Act1, patente de
los Estados Unidos Nº.: 5.641.876), conectado operativamente a un
péptido de transito de cloroplasto EPSPS de Arabidopsis
(TS-At.EPSPS:CTP2, Klee y col., Mol. Gen.
Genet. 210: 47-442, 1987), conectado
operativamente con una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato de cepa CP4 de
Agrobacterium sp. (AGRTU.aroA:CP4, patente de los
Estados Unidos Nº.: 5.633.435) y conectado operativamente con un
terminador transcripcional de nopalina sintasa
(T-AGRTU.nos, Fraley y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80: 4803-4807, 1983). El segundo
casete de expresión de transgén está constituido por el promotor del
virus del mosaico de la coliflor 35S que contiene una duplicación
en tándem de la región potenciadora (P-CaMV.35S, Kay
y col., Science 236: 1299-1302, 1987;
patente de los Estados Unidos Nº.: 5.164.316), conectado
operativamente a un intrón de Hsp 70v de Zea mays
(I-Zm.Hsp 70, patente de los Estados Unidos Nº.:
5.362.865) conectado operativamente a un péptido de tránsito de
cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis
(TS-At.EPSPS:CTP2, Klee y col., Mol. Gen.
Genet. 210: 47-442, 1987), conectado
operativamente a una
5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato de cepa CP4 de
Agrobacterium sp. (AGRTU.aroA:CP4, patente de los
Estados Unidos Nº.: 5.633.435) y conectado operativamente con un
terminador transcripcional de nopalina sintasa
(T-AGRTU.nos, Fraley y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80: 4803-4807, 1983). Tras el
bombardeo, los callos transgénicos tolerantes a glifosato se
seleccionaron en medios que contenían glifosato 3 mM y las plantas
se regeneraron subsecuentemente. Se produjeron trescientas cuatro
plantas a partir de 91 eventos transgénicos independientes, se
seleccionó el nk603 a partir de esta población sobre la base de una
combinación suprema de características, incluidas tolerancia a
glifosato, realización agronómica e inserción transgénica única.
Las evaluaciones de invernadero y de campo del evento nk603 y su
progenie derivada indicó que esta inserción transgénica confiere
tolerancia que excede especificaciones comerciales para tolerancia
vegetativa y reproductiva total a 340 g de glifosato/acre (840 g de
glifosato/hectárea; 32 onzas de Roundup Ultra/acre) cuando se
aplican a los estados foliares V4 y V8.
\vskip1.000000\baselineskip
El evento de maíz nk603 tolerante a glifosato se
comparó con el estándar comercial actual, GA21 (patente de los
Estados Unidos Nº.: 6.040.497), para la tolerancia al daño
vegetativo con glifosato y el efecto sobre la producción. GA21
contiene al menos 3 casetes de expresión de transgén dispuestos en
tándem en el genoma de maíz del evento GA21
(SCP/GMO/232-Final, Dirección General de la Comisión
Europea de Salud y Protección al Consumidor). El casete de transgén
de GA21 consta de un promotor de actina 1 de arroz e intrón unido a
un péptido de tránsito de cloroplasto de ribulosa
1,5-bifosfato carboxilasa unido a una EPSPS
resistente a glifosato de maíz modificado y una región de
terminación de transcripción de nopalina sintetasa 3'. Se plantaron
plantas de nk603 y GA21 en hileras en terrenos de campo duplicados.
Los tratamientos eran 1) no pulverizados, 2) pulverizados a
velocidad de 4,48 10^{-4} kg/m^{2} (4,48 kg/hectárea (64
onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V4 y de nuevo con
velocidad de 4,48 10^{-4} kg/m^{2} (4,48 kg/hectárea (64
onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V8, 3) pulverizados
a 6,72 10^{-4} kg/m^{2} (6,72 kg/hectárea (96 onzas/acre)) de
Roundup Ultra® en estado foliar V4 y de nuevo con velocidad de 6,72
10^{-4} kg/m^{2} (6,72 kg/hectárea (96 onzas/acre)) de Roundup
Ultra® en estado foliar V8. La tolerancia vegetativa se midió como
porcentaje de daño vegetativo determinado mediante la cantidad de
malformación foliar observada 10 días después del tratamiento con
herbicida en el estado foliar V8. El rendimiento de cada terreno se
midió en toneladas/hectárea (celemines/acre) y el porcentaje de
reducción en rendimiento se determinó por cada tratamiento de
herbicida relativo al tratamiento no pulverizado. El resultado
mostrado en la Tabla 1 ilustra que nk603 muestra un porcentaje menor
de nivel de daño vegetativo que las plantas GA21 y la reducción de
rendimiento en porcentaje observada es también menor para el evento
nk603. Se observó una incidencia baja de daño vegetativo en los
terrenos no pulverizados, esta observación es atribuible a diversos
factores ambientales distintos de la exposición a herbicida de
glifosato. El doble casete de expresión de pMON25496 en nk603 se
comparó en daño vegetativo y valoración de fertilidad de tres
eventos de maíz independientes obtenidos sólo a partir de la
expresión que dirige el promotor CaMV.35S del gen de tolerancia a
glifosato (AGRU.aroA:CP4). Se observó que el doble casete de
expresión confirió un nivel mayor de tolerancia vegetativa y
tolerancia reproductiva que tres eventos de maíz independientes (ev
1, ev 2 y ev 3) conteniendo sólo el casete de expresión donde la
expresión del gen de tolerancia al glifosato se dirigió mediante el
promotor de CaMV.35S. Un nivel más alto de tolerancia vegetativa al
daño por herbicida glifosato se observó para nk603 más 3 eventos de
maíz adicionales derivados de pMON25496 cuando se comparó al daño
promedio de 6 eventos de maíz derivados de un constructo donde la
expresión del gen de tolerancia a glifosato se dirigió sólo
mediante el promotor e intrón de actina de arroz
(P-OS.Act1/I-Os.Act1). Las plantas
transformadas con el casete de doble expresión poseían un nivel más
alto de tolerancia al glifosato para daño vegetativo de fertilidad
que plantas derivadas de la transformación con los casetes de
expresión aislados. Esto dio como resultado resistencia
incrementada a pérdida de rendimiento debida a la aplicación del
herbicida glifosato. El constructo de pMON25496 proporcionó dos
casetes de expresión de plantas en una única localización en nk603
que confiere un nivel más alto de tolerancia a glifosato que la
inserción en tándem triple que tiene lugar en el estándar
comercial, GA21.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La molécula de ADN flanqueante correspondiente
de nk603 se clonó usando adaptadores ligados y PCR adecuada como se
describe en el kit Genome Walker^{TM} (catálogo Nº.
K1807-1, CloneTech Laboratories, Inc., Palo Alto,
CA). Primero, el ADN genómico a partir del evento nk603 se purificó
mediante el procedimiento de purificación de CTAB (Rogers y col.,
Plant Mol. Biol. 5: 69-76, 1985). Las
bibliotecas de ADN genómico para amplificación se prepararon de
acuerdo con las instrucciones del fabricante (Genome Walker^{TM},
CloneTech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). En reacciones
separadas, el ADN genómico se digirió durante toda una noche a 37ºC
con las siguientes endonucleasas de restricción de extremos romos:
EcoRV, ScaI, DraI, PvuII, y StuI
(CloneTech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Las mezclas de
reacción se extrajeron con fenol:cloroformo, el ADN se precipitó
mediante la adición de etanol a la fase acuosa, se sedimentó
mediante centrifugación, después se resuspendió en tampón
Tris-EDTA (10 mM de Tris-HCl, pH
8,0, EDTA 1 mM). Los fragmentos de ADN genómicos de extremos romos
purificados se ligaron a los adaptadores de Genome Walker^{TM} de
acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la ligazón,
cada reacción se trató con calor (70ºC durante 5 minutos) para
terminar la reacción y se diluyó 10 veces en tampón
Tris-EDTA. Un \mul de cada ligazón respectiva se
amplificó después en 50 \mul de reacción que incluían 1 \mul de
biblioteca de adaptadores ligados respectiva, 1 \mul de cebador
AP1 adaptador de Genome Walker^{TM} (5' GTATATCGACTCACTATAGGGC
3', SEQ. ID. Nº.: 1) 10 \muM, 1 \mul de oligonucleótido
específico de transgén nk603. (5'
TGACGTATCAAAGTACCGACAAAAA
CATCC 3', SEQ. ID. Nº.: 2) 10 \muM, 1 \mul de desoxirribonucleótidos 10 mM, 2,5 \mul de sulfóxido de dimetilo, 5 \mul de tampón de PCR 10X que contiene MgCl_{2}, 0,5 \mul (2,5 unidades) de ADN polimerasa termostable Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) y H_{2}O a 50 \mul. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador usando control de temperatura calculado y las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo de 95ºC durante 9 minutos, 7 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 70ºC durante 3 minutos; 36 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 65ºC durante 3 minutos, 1 ciclo de 65ºC durante 4 minutos. Un \mul de cada reacción primaria se diluyó 50 veces con agua y se amplificó en una reacción secundaria (1 \mul de reacción primaria diluida respectiva, 1 \mul de cebador adaptador AP2 adecuado de Genome Walker^{TM} (5' ACTATAGGGCACGCGTGGT 3', SEQ. ID. Nº.: 3, proporcionado por el fabricante) 10 \muM, 1 \mul de oligonucleótido adecuado específico de transgén k603. (5' CTTTGTTTTATTTTGGACTATCCCGACTC 3', SEQ. ID. Nº.: 4) 10 \muM, 1 \mul de desoxirribonucleótidos 10 mM, 2,5 \mul de sulfóxido de dimetilo, 5 \mul de tampón de PCR 10X que contiene MgCl_{2}, 0,5 \mul (2,5 unidades) de ADN polimerasa termostable Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) y H_{2}O a 50 \mul usando las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo de 95ºC durante 9 minutos; 5 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 70ºC durante 3 minutos; 24 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 65ºC durante 3 minutos, 1 ciclo de 65ºC durante 4 minutos.
CATCC 3', SEQ. ID. Nº.: 2) 10 \muM, 1 \mul de desoxirribonucleótidos 10 mM, 2,5 \mul de sulfóxido de dimetilo, 5 \mul de tampón de PCR 10X que contiene MgCl_{2}, 0,5 \mul (2,5 unidades) de ADN polimerasa termostable Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) y H_{2}O a 50 \mul. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador usando control de temperatura calculado y las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo de 95ºC durante 9 minutos, 7 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 70ºC durante 3 minutos; 36 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 65ºC durante 3 minutos, 1 ciclo de 65ºC durante 4 minutos. Un \mul de cada reacción primaria se diluyó 50 veces con agua y se amplificó en una reacción secundaria (1 \mul de reacción primaria diluida respectiva, 1 \mul de cebador adaptador AP2 adecuado de Genome Walker^{TM} (5' ACTATAGGGCACGCGTGGT 3', SEQ. ID. Nº.: 3, proporcionado por el fabricante) 10 \muM, 1 \mul de oligonucleótido adecuado específico de transgén k603. (5' CTTTGTTTTATTTTGGACTATCCCGACTC 3', SEQ. ID. Nº.: 4) 10 \muM, 1 \mul de desoxirribonucleótidos 10 mM, 2,5 \mul de sulfóxido de dimetilo, 5 \mul de tampón de PCR 10X que contiene MgCl_{2}, 0,5 \mul (2,5 unidades) de ADN polimerasa termostable Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) y H_{2}O a 50 \mul usando las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo de 95ºC durante 9 minutos; 5 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 70ºC durante 3 minutos; 24 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 65ºC durante 3 minutos, 1 ciclo de 65ºC durante 4 minutos.
Los productos de PCR, que representan regiones
5' que abarcan el empalme entre la inserción transgénica nk603 y el
ADN de maíz flanqueante vecino se purificaron mediante
electroforesis en gel de agarosa seguida por purificación a partir
de la matriz de agarosa usando el Kit de Extracción de Gel QIAquick
(catálogo Nº. 28704, Qiagen Inc., Valencia, CA) y clonación directa
dentro del vector pGEM-T Easy (catalog. Nº. A1360,
Promega, Madison, WI). La identidad de los productos de PCR
clonados y la relación con el fragmento Mlu I de pMON25496 se
confirmó mediante análisis de secuencia de ADN (ABI Prism^{TM}
377, PE Biosystems, Foster City, CA y software de análisis de
secuencia ADNSTAR, ADNSTAR Inc., Madison, WI).
De forma similar, la secuencia de ADN de maíz
flanqueante 3' de nk603 se amplificó y clonó usando cebadores
específicos de gen adecuados, tales como, SEQ ID Nº.: 5 (5'
AGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGC 3') y SEQ ID Nº.: 6 (5'
GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG 3') que se fusiona al terminador
transcripcional
T-AGRTU.nos. Dos terminadores transcripcionales T-AGRTU.nos están presentes en la inserción transgénica/genómi-
ca nk603, uno interno en el constructo y uno en el extremo 3' del constructo adyacente al ADN genómico de maíz. Los productos de PCR producidos en esta reacción se secuenciaron y la secuencia de ADN que abarca el empalme entre el transgén y la secuencia flanqueante se distinguió de los productos del T-AGRTU.nos interno por comparación con las secuencias de elementos genéticos conocidas del constructo pMON25496 como se describe previamente.
T-AGRTU.nos. Dos terminadores transcripcionales T-AGRTU.nos están presentes en la inserción transgénica/genómi-
ca nk603, uno interno en el constructo y uno en el extremo 3' del constructo adyacente al ADN genómico de maíz. Los productos de PCR producidos en esta reacción se secuenciaron y la secuencia de ADN que abarca el empalme entre el transgén y la secuencia flanqueante se distinguió de los productos del T-AGRTU.nos interno por comparación con las secuencias de elementos genéticos conocidas del constructo pMON25496 como se describe previamente.
La secuencia de ADN de maíz que flanquea ambos
lados de la inserción transgénica se determinó para nk603
secuenciando los productos de amplificación derivados de Genome
Walker^{TM} y el alineamiento para secuencia transgénica
conocida. En el extremo 5' de la inserción transgénica, se determinó
la secuencia de un segmento de 498 pares de bases alrededor del
empalme de inserción (SEQ. ID. Nº.: 7). Esto consistió en 304 pares
de bases (pb) de la secuencia de ADN genómico de maíz flanqueante
(nucleótidos 1-304 de SEQ. ID. Nº.: 7), 45 pares de
bases de secuencia de ADN del constructo pMON25496 (nucleótidos
305-349 de SEQ. ID. Nº.: 7) y 149 pares de bases de
secuencia de ADN a partir del extremo 5' de P-Os.Act
1 (nucleótidos 350-498 de SEQ. ID. Nº.: 7).
La secuencia de ADN se determinó para un
segmento de 1183 pares de bases alrededor del empalme de inserción
3' (SEQ. ID. Nº.: 8), que comienza con 164 pares de bases del
terminador transcripcional T-AGRTU.nos (nucleótidos
1-164 de SEQ. ID. Nº.: 8), 217 pb de secuencia de
ADN del constructo pMON25496 (nucleótidos 165-381 de
SEQ. ID. Nº.: 8), 305 pb de genes plastídicos del maíz,
rps11 y rpoA (segmentos parciales de cada gen
correspondientes a las bases 63-363 del acceso al
Banco de Genes X07810, correspondientes a las bases
382-686 de la SEQ. ID. Nº.: 8), y la secuencia de
ADN restante constituido por secuencia de ADN de maíz genómico que
flanquea el sitio de integración (correspondiente a las bases
687-1183 de SEQ. ID. Nº.: 8).
Las moléculas de ADN de empalme, SEQ. ID. Nº.:
9, SEQ. ID. Nº.: 10, SEQ. ID. Nº.: 11, y SEQ. ID. Nº.: 12 son
moléculas de ADN novedosas en nk603 y son diagnósticas para planta
de maíz nk603 y su progenie. Las moléculas de empalme en SEQ. ID.
Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10 y SEQ. ID. Nº.: 11 representan
aproximadamente 9 nucleótidos en cada lado de un sitio de inserción
de un fragmento de ADN de transgén y fragmento de ADN de maíz. La
SEQ. ID. Nº.: 9 se encuentra en las posiciones nucleotídicas
296-314 de SEQ. ID. Nº.: 7. Las secuencias de
empalme SEQ. ID. Nº.: 10 y 1 están situadas en las posiciones
nucleotídicas 373-390 y 678-695
respectivamente, de SEQ. ID. Nº.: 8, representando una molécula de
ADN de empalme de secuencia de ADN del constructo con secuencia de
ADN de plastos de maíz (SEQ. ID. Nº.: 10) y secuencia del constructo
con secuencia de ADN genómico de maíz (SEQ. ID. Nº.: 11). SEQ. ID.
Nº.: 12 se sitúa en posición nucleotídica 156-173 de
SEQ. ID. Nº.: 8 y representa una molécula de ADN novedosa en nk603
debido a que es una fusión entre la secuencia del terminador
T-AGRTU.nos con un fragmento invertido de la
secuencia de ADN promotora de actina de arroz.
\vskip1.000000\baselineskip
Los pares cebadores del evento de ADN se usan
para producir un amplicón diagnóstico para nk603. Estos pares
cebadores de evento incluyen pero no se limitan a SEQ ID Nº.: 13 y
SEQ ID Nº.: 14 para la molécula de ADN de amplicón 5' y SEQ ID Nº.:
15 y SEQ ID Nº.: 16 para la molécula de ADN de amplicón 3'. Además
de estos pares cebadores, cualquier par cebador derivado de SEQ.
ID. Nº.: 7 y SEQ. ID. Nº.: 8 que cuando se use en una reacción de
amplificación de ADN produzca un diagnóstico de amplicón de ADN para
nk603 es un aspecto de la presente invención. Las condiciones de
amplificación para este análisis se ilustran en la tabla 2 y en la
tabla 3 para la región de empalme inserto de transgén/genómica. El
mismo procedimiento se aplica para amplificación del ADN del
amplicón 3' usando moléculas de ADN cebadoras SEQ ID Nº.: 15 y SEQ
ID Nº.: 16, sin embargo, cualquier modificación de estos
procedimientos que usa moléculas de ADN o complementos de las mismas
para producir una molécula diagnóstica de ADN de amplicón para
nk603 está dentro de la habilidad ordinaria en la técnica. Además,
un par cebador control (SEQ. ID. Nº.: 17 y 18) para amplificación de
un gen de maíz endógeno se incluye como un estándar interno para
las condiciones de reacción. El análisis de muestra de extracto de
ADN de tejido de planta nK603 incluye un control de extracto de ADN
de tejido positivo de nk603, un control de extracto de ADN negativo
de una planta de maíz que no es nk603, y un control negativo que no
contiene ningún extracto de ADN de maíz plantilla. Las moléculas de
cebador de ADN adicionales de longitud suficiente se pueden
seleccionar de SEQ. ID. Nº.: 7 y SEQ. ID. Nº.: 8 por los expertos
en la técnica de procedimientos de amplificación de ADN, y
condiciones optimizadas para la producción de un amplicón pueden
diferir de los procedimientos mostrados en tabla 2 y tabla 3 pero
dan como resultado un diagnóstico de amplicón para nk603. El
amplicón en el que al menos una molécula de cebador de ADN de
longitud suficiente derivada de SEQ. ID Nº.:7 y SEQ. ID Nº.:8 que
es diagnóstico para nk603. El amplicón en el que al menos un cebador
de ADN de longitud suficiente derivado de cualquiera de los
elementos genéticos de pMON25496 que es diagnóstico para nk603 es un
aspecto de la invención. El ensayo del amplicón de nk603 se puede
llevar a cabo usando un Stratagene Robocycler, MJ Engine,
Perkin-Elmer 9700, o termociclador Eppendorf
Mastercycler Gradient como se muestra en la tabla 3, o mediante
procedimientos y aparatos conocidos por los expertos en la
técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Mezclar suavemente, si es necesario
(termociclador sin tapa caliente), añadir 1-2 gotas
de aceite mineral encima de cada reacción. Continuar con PCR en un
Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700,
o termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient usando los
siguientes parámetros de ciclación.
Un depósito de la Monsanto Company, semilla de
maíz del evento PV-ZMGT32 (nk603) desvelado
anteriormente se ha realizado a tenor del Tratado de Budapest con
la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University
Boulevard, Manassas, Va. 20110. El número de acceso de ATCC es
PTA-2478. El depósito se mantendrá en el depósito
durante un periodo de 30 años, 5 años tras la última solicitud, o
durante la vida efectiva de la patente, cualquiera que sea mayor, y
se reemplazará en caso necesario durante ese periodo.
<110> Monsanto Technology LLC
\hskip1cm Heck, Gregory
\hskip1cm You, Jinaong
\vskip0.400000\baselineskip
<120> EVENTO DE MAÍZ
PV-ZMGT32 (nk603) Y COMPOSICIONES Y
PROCEDIMIENTOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 38-21
(52258)D
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 10/919,423
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
16-08-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn en versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(29)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(498)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN quimérico de ADN genómico de
Zea mays y ADN promotor de Act 1 de Oryzae sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1883)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN quimérico de la región de
terminación de Agrobacterium tumefasciens nos y ADN
plastídico de zea mays y ADN genómico de zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN quimérico de ADN genómico de
Zea mais y de ADN de inserto transgénico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN quimérico de ADN de inserto
transgénico y ADN plastídico de Zea mais
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN quimérico de ADN plastídico de
Zea mais y ADN de inserto transgénico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN quimérico de ADN de la región de
terminación de Agrobacterium tumefasciens nos y ADN promotor
de Act1 de Oryzae sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm22
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm23
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm24
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<110> Monsanto Technology LLC
\hskip1cm Heck, Gregory
\hskip1cm You, Jinaong
\vskip0.400000\baselineskip
<120> EVENTO DE MAÍZ
PV-ZMGT32 (nk603) Y COMPOSICIONES Y
PROCEDIMIENTOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 38-21
(52258)D
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<140> 10/919,423
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<141>
16-08-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn en versión 3.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
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<223> ADN totalmente sintético
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<212> ADN
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<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(30)
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<223> ADN totalmente sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(19)
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<223> ADN totalmente sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(29)
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<223> ADN totalmente sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(26)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
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<400> 5
\hskip1cm31
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<222> (1)..(498)
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<223> ADN quimérico de ADN genómico de
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<211> 1183
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<212> ADN
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<222> (1)..(1883)
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<223> ADN quimérico de la región de
terminación de Agrobacterium tumefasciens nos y ADN
plastídico de zea mays y ADN genómico de zea mays
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<223> ADN quimérico de ADN genómico de
Zea mais y de ADN de inserto transgénico
\newpage
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(18)
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<223> ADN quimérico de ADN de inserto
transgénico y ADN plastídico de Zea mais
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<400> 10
\hskip1cm36
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<210> 11
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN quimérico de ADN plastídico de
Zea mais y ADN de inserto transgénico
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
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<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN quimérico de ADN de la región de
terminación de Agrobacterium tumefasciens nos y ADN promotor
de Act1 de Oryzae sativa
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<400> 12
\hskip1cm38
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 13
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm39
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 14
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(22)
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<223> ADN totalmente sintético
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<400> 14
\hskip1cm40
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<200> 15
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(22)
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<223> ADN totalmente sintético
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<400> 15
\hskip1cm41
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<200> 16
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ADN totalmente sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm42
Claims (4)
1. Un constructo de ADN que comprende: un primer
y un segundo casete de expresión, en la que dicho primer casete de
expresión en conexión operativa comprende (i) un promotor de actina
1 de arroz, (ii) un intrón de actina 1 de arroz, (iii) una molécula
de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto, (iv) una
molécula de ADN que codifica un EPSPS tolerante a glifosato y (v)
una molécula de ADN terminador transcripcional; y
dicho segundo casete de expresión comprende en
conexión operativa (a) un promotor del CaMV 35S, (b) un intrón
Hsp70, (c) una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito
de cloroplasto, (d) una molécula de ADN que codifica un EPSPS
tolerante a glifosato y (e) una molécula de ADN terminador
transcripcional.
2. El constructo de ADN de la reivindicación 1,
en la que la molécula de ADN que codifica un EPSPS tolerante a
glifosato consta de una molécula de ADN de
AGRTU.aroA:CP4.
3. Un procedimiento para producir una planta de
maíz que tolera la aplicación de herbicida glifosato que
comprende:
(a) transformar una célula de maíz con el
constructo de ADN de la reivindicación 1;
(b) seleccionar dicha célula de maíz para
tolerancia a la aplicación de glifosato;
(c) cultivar dicha célula de maíz en una planta
de maíz fértil.
4. Una planta de maíz transgénica tolerante a
glifosato y semillas de la misma que comprenden el constructo de
ADN de la reivindicación 1.
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