ES2261330T3 - Composiciones y procedimientos para la deteccion de trnsformante de maiz pv-zmgt32 (nk603). - Google Patents

Composiciones y procedimientos para la deteccion de trnsformante de maiz pv-zmgt32 (nk603).

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ES2261330T3 ES01202314T ES01202314T ES2261330T3 ES 2261330 T3 ES2261330 T3 ES 2261330T3 ES 01202314 T ES01202314 T ES 01202314T ES 01202314 T ES01202314 T ES 01202314T ES 2261330 T3 ES2261330 T3 ES 2261330T3
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Abstract

Una molécula de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8.

Description

Composiciones y procedimientos para la detección de transformación de maíz PV-ZMGT32 (nk603).
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biología molecular de plantas, específicamente la invención se refiere a una molécula de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos diagnosticada para tolerancia a glifosato en una planta. La invención se refiere más específicamente a selección de un rasgo de tolerancia a glifosato en plantas de maíz y a ensayos para detectar la presencia de DNA de PV-ZMGT32 (nk603) de planta de maíz en una muestra.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere a la selección de un rasgo de tolerancia a herbicida glifosato en plantas de maíz (Zea mays) y a la detección de la región de inserción transgénica/genómica en maíz PV-ZMGT32 (nk603) y la progenie del mismo.
El maíz es un cultivo importante y es una fuente de comida principal en muchas áreas del mundo. Los procedimientos de la biotecnología se han aplicado al maíz para mejora de los rasgos agronómicos y la calidad del producto. Un rasgo agronómico tal es tolerancia a herbicidas, en particular tolerancia al herbicida glifosato. Este rasgo en maíz se ha conferido mediante la expresión de un transgén en las plantas de maíz (patente de los Estados Unidos Nº.: 6.040.497). La tolerancia a glifosato se ha conferido también a otras plantas monocotiledóneas mediante transformación con un gen quimérico CP4, por ejemplo a césped (documento US 5.048.956).
La expresión de genes extraños en plantas se conoce por estar influida por su posición cromosómica, debida quizás a la estructura de cromatina (por ejemplo heterocromatina) o la proximidad de elementos reguladores transcripcionales (por ejemplo, potenciadores) cerca del sitio de integración (Weising y col., Ann. Rev. Genet. 22: 421-427, 1988). Por esta razón, a menudo es necesario someter a una revisión un gran número de casos con el fin de identificar un caso caracterizado por la expresión óptima de un gen introducido de interés. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación en niveles de expresión de genes introducidos entre casos. Puede haber también diferencias entre patrones espaciales o temporales de expresión, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgén en diversos tejidos vegetales, que puede no corresponder a los patrones esperados de elementos reguladores presentes en la construcción génica introducida. Por esta razón, es común producir cientos o miles de casos diferentes y someter a una revisión aquellos casos para un caso simple que tiene niveles y patrones de expresión transgénica deseados para propósitos comerciales. Un caso que tiene niveles y patrones de expresión transgénica deseados es útil para introducir en la dotación genética mediante retrocruzamiento de híbridos el transgén dentro de otros antecedentes genéticos mediante cruzamiento sexual entre diferentes cepas usando procedimientos de reproducción convencionales. La progenie de tales cruces mantiene las características de expresión transgénica del transformante original. Esta estrategia se usa para asegurar expresión génica fiable en un número de variedades que están bien adaptadas a las condiciones de crecimiento locales.
Sería ventajoso poder detectar la presencia de un caso en particular con el fin de determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgén de interés. Además, un procedimiento para detectar un caso en particular sería útil para cumplir con las regulaciones que requieren la aprobación anterior a la comercialización y etiquetado de alimentos derivados de plantas de cultivo recombinantes, por ejemplo. Es posible detectar la presencia de un transgén mediante cualquier procedimiento de detección de ácidos nucleicos bien conocido tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación de DNA usando sondas de ácido nucleico. Estos procedimientos de detección generalmente se centran en elementos genéticos usados frecuentemente, tales como promotores, terminadores, genes marcadores, etc. Como un resultado, tales procedimientos no pueden ser útiles para discriminar entre diferentes elementos, particularmente aquellos producidos usando la misma construcción de DNA a menos que se conozca la secuencia de DNA del DNA cromosómico adyacente al DNA insertado ("DNA flanqueante"). Un ensayo de PCR específico de caso se discute, por ejemplo, por Windels y col. (Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b: 459-462, 1999), quienes identificaron el caso 40-3-2 de soja tolerante a glifosato mediante PCR usando un grupo de cebadores que abarcan el empalme entre el inserto y el DNA flanqueante, específicamente un cebador que incluye secuencia del inserto y un segundo cebador que incluye secuencia del DNA flanqueante.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona:
(1) una molécula de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8;
(2) un par de moléculas de DNA que comprende: una primera molécula de DNA y una segunda molécula de DNA, en el que las moléculas de DNA son de suficiente longitud de nucleótidos contiguos de SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8 o sus complementos para funcionar como cebadores de DNA o sondas diagnósticas para DNA extraído de planta de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o la progenie del mismo;
(3) un procedimiento para detectar la molécula de DNA de (1);
(4) un procedimiento para seleccionar un rasgo de tolerancia a glifosato en plantas de maíz;
(5) un kit de detección de DNA que comprende: al menos una molécula de DNA de suficiente longitud de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8 para funcionar como un cebador de DNA o sonda específica para caso de maíz PV-ZMGT32 (nk603) y/o su progenie.
Esta invención se refiere preferiblemente a los procedimientos para seleccionar una planta de cultivo monocotiledónea tolerante a glifosato, en plantas de cultivo particulares transformadas con construcciones de DNA que constan de dos cartuchos de expresión transgénicos. El primer cartucho de expresión comprende:
una molécula de DNA de un promotor de actina 1 de arroz (Oryza sativa) y un intrón de actina 1 de arroz unido operativamente a una molécula de DNA que codifica una secuencia de péptido de tránsito de cloroplasto, conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) resistente a glifosato, conectada operativamente a una molécula de DNA que comprende un terminador transcripcional 3'. El segundo cartucho de expresión transgénica de la construcción de DNA comprende una molécula de DNA del promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, conectado operativamente a una molécula de DNA que comprende un intrón Hsp70, conectado operativamente a una molécula de DNA que codifica una secuencia peptídica de transito de cloroplasto, unida operativamente a una molécula de DNA que codifica una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) resistente a glifosato, conectada operativamente a una molécula de DNA que comprende un terminador transcripcional 3'.
Tal construcción de DNA cuando se expresa en células vegetales y en plantas confiere tolerancia a herbicida de glifosato. Esta invención se refiere preferiblemente a los procedimientos para seleccionar una planta de maíz tolerante a glifosato. Como se expuso anteriormente, la construcción de DNA consta de dos cartuchos de expresión transgénica. El primer cartucho de expresión consta de una molécula de DNA de un promotor de actina 1 de arroz (Oryza sativa) e intrón de actina 1 de arroz unido operativamente a una molécula de DNA que codifica una secuencia peptídica de tránsito de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis, conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) resistente a glifosato aislada de Agrobacterium tumefasciens sp., cepa CP4, conectada operativamente a una molécula de DNA que consta de un terminador transcripcional de nopalina sintasa. El segundo cartucho de expresión consta de una molécula de DNA del promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S que contiene una duplicación en tándem de la región potenciadora, conectada operativamente a una molécula de DNA que codifica una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) resistente a glifosato aislada de Agrobacterium tumefasciens sp., cepa CP4, conectada operativamente a una molécula de DNA que consta de un terminador transcripcional de nopalina sintasa.
De acuerdo con la invención, las composiciones y procedimientos se proporcionan para detectar la presencia de la región de inserción transgénica/genómica a partir de una planta de maíz nueva denominada PV-ZMGT32 (nk603). Se proporcionan moléculas de DNA que comprenden al menos una secuencia de empalme de PV-ZMGT32 (nk603) seleccionada del grupo que consta de 5' TGTAGCGGCCCACGCGTGG 3' (SEQ ID Nº.: 9), 5' TACCACGCGACA
CACTTC 3' (SEQ ID Nº.: 10), y 5' TGCTGTTCTGCTGACTTT 3' (SEQ ID Nº.: 11) y complementos de las mismas; en las que una secuencia de empalme abarca el empalme entre los DNA heterólogos insertados dentro del genoma y el DNA de la célula de maíz flanqueante del sitio de inserción y es diagnóstica para el caso. La selección de las plantas y semillas de maíz que comprenden estas moléculas es un aspecto de la invención.
Una molécula de DNA novedosa 5' ACCAAGCTTTTATAATAG 3' (SEQ ID Nº.: 12) y el complemento de la misma, en la que esta molécula de DNA es novedosa en PV-ZMGT32 (nk603) y su progenie, la selección de plantas y semillas de maíz que comprenden está molécula son otros aspectos de esta invención.
Las moléculas de DNA que comprenden la región de inserción transgénica/genómica novedosa, SEQ ID Nº.: 7 y SEQ ID Nº.: 8 y son homólogas o complementarias con SEQ ID Nº.: 7 y SEQ ID Nº.: 8 son también un aspecto de esta invención.
Las moléculas de DNA que comprenden una longitud suficiente de una parte transgénica de la secuencia de DNA de SEQ ID Nº.: 7 y una longitud suficiente similar de una secuencia de DNA de maíz flanqueante 5' de SEQ ID Nº.: 7; o una longitud suficiente similar de una parte transgénica de la secuencia de DNA de SEQ ID Nº.: 8 y una longitud suficiente similar de una secuencia de DNA 3' que flanquea el transgén, en la que estas moléculas de DNA son útiles como cebadores de DNA en los procedimientos de amplificación de DNA tal como para proporcionar un producto amplicón de DNA producido específicamente a partir de DNA de PV-ZMGT32 (nk603) y su progenie son otro aspecto de la invención. Los cebadores de DNA homólogos de o complementarios a una longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID Nº.: 7 y SEQ ID Nº.: 8 para funcionar como cebadores o sondas de DNA diagnósticos para DNA extraído de planta de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o la progenie de los mismos son también un aspecto de esta invención.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan procedimientos de detectar la presencia de DNA correspondientes al caso de maíz PV-ZMGT32 (nk603) incluso en una muestra. Tales procedimientos comprenden: (a) extraer una muestra de DNA a partir de una planta de maíz; (b) poner en contacto la muestra de DNA con un par cebador de DNA que comprende moléculas cebadoras de DNA de suficiente longitud de nucleótidos contiguos de SEQ ID Nº.: 7 o su complemento, o SEQ ID Nº.: 8 o su complemento para funcionar como cebadores o sondas diagnósticas para DNA extraídos a partir de planta de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o progenie de la misma; (c) proporcionar una condición de reacción de amplificación de ácido nucleico; (d) llevar a cabo dicha reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo de este modo una molécula de amplicón de DNA; y (e) detectar la molécula de amplicón de DNA.
Se proporciona un par de moléculas de DNA que comprenden un grupo de cebadores de DNA que son homólogos a o complementarios con SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8 que funciona en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para producir un diagnóstico molecular de DNA de amplicón para PV-ZMGT32 (nk603). Más específicamente, se proporciona un par de moléculas de DNA que comprende un grupo de cebadores de DNA, en el que las moléculas de DNA se identificaron como SEQ ID Nº.: 13 o complementos de la misma y SEQ ID Nº.: 14 o comple-
mentos de la misma; SEQ ID Nº.: 15 o complementos de la misma y SEQ ID Nº.: 16 o complementos de la misma.
El amplicón producido mediante el procedimiento descrito anteriormente se puede hibridar bajo condiciones restrictivas a SEQ ID Nº.: 9, SEQ ID Nº.: 10, SEQ ID Nº.: 11, o SEQ ID Nº.: 12.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, procedimientos de detectar la presencia de una molécula de DNA corresponden al caso de PV-ZMGT32 (nk603) en una muestra, tales procedimientos constan de (a) poner en contacto la muestra que comprende DNA extraído a partir de una planta de maíz con una molécula de sonda de DNA que consta de SEQ ID Nº.: 9, SEQ ID Nº.: 10, SEQ ID Nº.: 11, o SEQ ID Nº.: 12, en la que dicha molécula de sonda de DNA hibrida bajo condiciones restrictivas con DNA genómico de un PV-ZMGT32 de caso de maíz y no hibrida bajo condiciones restrictivas con una planta de maíz control; (b) someter la muestra y sonda a condiciones de hibridación restrictiva; y (c) detectar hibridación de la sonda del DNA.
Procedimientos de producir una planta de maíz que tolera aplicación de glifosato comprenden las etapas de (a) cruzar sexualmente una primera línea de maíz parental que comprende los cartuchos de expresión de la presente invención, los cuales confieren tolerancia a aplicación de glifosato, y una segunda línea de maíz parental que carece de tolerancia a glifosato, produciendo de este modo una pluralidad de plantas de la progenie; y (b) seleccionar una planta de la progenie que tolera aplicación de glifosato. Tales procedimientos pueden comprender opcionalmente la etapa adicional de retrocruzar la planta de progenie con la segunda línea de maíz parental para producir una planta de maíz de un linaje verdadero que tolera la aplicación de glifosato.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para seleccionar plantas de maíz tolerantes a glifosato de la presente invención y progenie de las mismos comprendiendo extraer DNA a partir de una muestra de planta, poniendo en contacto un DNA con una molécula de ácido nucleico marcadora seleccionada del grupo que consta de SEQ ID Nº.: 9, SEQ ID Nº.: 10, SEQ ID Nº.: 11, o SEQ ID Nº.: 12, o complementos de las mismas, detectar la hibridación de dicha molécula de ácido nucleico marcadora al DNA, y llevar a cabo un análisis de reproducción asistida de marcador para el vínculo genético del rasgo de tolerancia a glifosato para la molécula de ácido nucleico marcadora.
La invención se refiere adicionalmente a un kit de detección de DNA que comprende al menos una molécula de DNA de longitud suficiente de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8 para funcionar como un cebador de DNA o sonda específica para PV-ZMGT32 (nk603) de caso de maíz y/o su progenie.
Lo precedente y otros aspectos de la invención llegarán a ser más patentes a partir de la siguiente descripción detallada y dibujos acompañantes.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Mapa de plásmido de pMON25496.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Las siguientes definiciones y procedimientos se proporcionaron para definir mejor la presente invención y para guiar a aquellos de habilidad ordinaria en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se señale otra cosa, los términos son para entenderse de acuerdo al uso convencional por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica relevante. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar también en Rieger y col., Glossary of Genetics: Classical and Molecular, 5ª edición, Springer-Verlag: Nueva York, 1991; y Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nueva York, 1994. Se usa la nomenclatura para bases de DNA como se expone en 37 CFR \NAK 1,822.
Como se usa en el presente documento, el término "comprendiendo" significa "incluyendo pero no limitado a".
"Glifosato" se refiere a N-fosfonometilglicina y sus sales. El glifosato es el ingrediente activo del herbicida Roundup® (Monsanto Co.). Tratamientos con "herbicida de glifosato" se refiere a tratamientos con los herbicidas Roundup®, Roundup Ultra®, Roundup UltraMax® o cualquier otra formulación herbicida que contenga glifosato. La selección de las velocidades de aplicación para una formulación de glifosato que constituye una dosis biológicamente efectiva esta dentro del alcance del técnico agrícola normal.
Una construcción de DNA es un ensamblado de moléculas de DNA unidas conjuntamente que proporcionan uno o más cartuchos de expresión. La construcción de DNA es preferiblemente un plásmido que se deja para su autorreplicación en una célula bacteriana y contiene diversos sitios de restricción de enzimas endonucleasas que son útiles para introducir moléculas de DNA que proporcionan elementos genéticos funcionales, es decir, secuencias promotoras, intrones, líderes, codificadoras, regiones de terminación 3', entre otras. Los cartuchos de expresión contenidos en una construcción de DNA comprenden los elementos genéticos necesarios para proporcionar transcripción de un RNA mensajero. Los cartuchos de expresión contenidos dentro de una construcción de DNA comprenden los elementos genéticos necesarios para proporcionar transcripción de un RNA mensajero. Los cartuchos de expresión se pueden diseñar para expresarse en células procariotas o células eucariotas. Los cartuchos de expresión se pueden diseñar para expresarse más preferiblemente en células de plantas La combinación de cartuchos de expresión en plantas transgénicas puede conducir a fenotipos inesperados. La combinación de cartuchos de expresión en plantas transgénicas puede conducir a fenotipos inesperados. La combinación del cartucho promotor de actina 1 de arroz y el cartucho promotor de CaMV 35S proporcionado en una construcción de DNA (pMON25496) potenció la tolerancia de la planta de maíz transgénico a herbicida de glifosato cuando se comparó con los cartuchos aislados solos y al estándar comercial llamado GA21 que contiene tres copias de un cartucho promotor de actina 1 de
arroz.
Un "caso" transgénico se produce mediante transformación de células de plantas con una construcción de DNA heterólogo, que incluye un cartucho de expresión de ácidos nucleicos que comprende un transgén de interés, la regeneración de una población de plantas resultantes de la inserción del transgén dentro del genoma de la planta, y selección de una planta en particular caracterizada por la inserción dentro de una localización genómica en particular. El término "caso" se refiere al transformante original y la progenie del transformante que incluye el DNA heterólogo. El término "caso" se refiere también a la progenie producida mediante un cruce sexual entre individuos de diferentes cepas entre el transformante y otra variedad que incluya el DNA heterólogo. Incluso después de retrocruzamientos repetidos con un padre recurrente, el DNA insertado y el DNA flanqueante a partir del padre transformado están presentes en la progenie del cruce en la misma localización cromosómica. El término "caso" también se refiere a DNA del transformante original que comprende el DNA insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al DNA insertado que debería esperarse al transferirse a una progenie que recibe DNA insertado incluyendo el transgén de interés como el resultado de un cruzamiento sexual de una línea parental que incluye el DNA insertado (por ejemplo, el transformante original y la progenie resultante de autofecundación) y una línea parental que no contiene el DNA insertado. Una planta de maíz tolerante a glifosato PV-ZMGT32 (nk603) se puede multiplicar primero cruzando sexualmente una primera planta de maíz parental constituida por una planta de maíz crecida a partir de la planta de maíz transgénico PV-ZMGT32 (nk603) que tiene número de acceso de la ATCC PTA-2478 y progenie de la misma derivada de transformación con cartuchos de expresión adecuados que toleran aplicación de herbicida glifosato, y una segunda planta de maíz parental que carece de la tolerancia a herbicida glifosato; y autofecundando la planta de primera generación, produciendo por lo tanto una pluralidad de plantas de segunda generación; y seleccionando después a partir de las plantas de la segunda generación una planta tolerante al herbicida glifosato. Estas etapas pueden incluir adicionalmente el retrocruzamiento de la primera planta de la progenie tolerante a glifosato con la segunda planta de maíz parental o una tercera planta de maíz parental, produciendo de este modo una planta de maíz que tolera la aplicación de herbicida glifosato.
Se entenderá también que diferentes plantas transgénicas se pueden aparear también para producir prole que contiene dos genes exógenos, añadidos segregados independientemente. La autofecundación de la generación adecuada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos, añadidos. Se consideran también el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento sexual entre diferentes cepas con una planta no transgénica, y su propagación vegetativa. Las descripciones de otros procedimientos de reproducción que se usan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de varias referencias, por ejemplo, Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987).
Una "sonda" es un ácido nucleico aislado el cual se une a una etiqueta detectable convencional o molécula notificadora, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima. Una sonda tal es complementaria a una hebra de ácido nucleico diana, en el caso de la presente invención, a una hebra de DNA genómico a partir de caso de maíz transgénico PV-ZMGT32 (nk603) de una planta de maíz o de una muestra que incluye DNA del caso. Las sondas incluyen no sólo ácidos desoxirribonucleico o ribonucleico sino también poliamidas y otros materiales de sonda que unen específicamente a una secuencia de DNA diana y se pueden usar para detectarla presencia de esa secuencia de DNA diana.
Los "cebadores" son ácidos nucleicos aislados que se fusionan a una hebra de DNA diana complementaria mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de DNA diana, después se prolongan a lo largo de la hebra de DNA diana mediante una polimerasa, por ejemplo, una polimerasa de DNA. Los pares de cebadores se refieren a su uso para amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos convencionales.
Sondas y cebadores son de suficiente longitud nucleotídica para unir la secuencia de DNA diana específicamente en las condiciones de hibridación o condiciones de reacción determinadas por el operador. Esta longitud puede ser de cualquier longitud que sea de suficiente longitud para ser útil en el procedimiento de detección de elección. Generalmente, se usan 11 nucleótidos o más en longitud, preferiblemente 18 nucleótidos o más, más preferiblemente 24 nucleótidos o más, y lo más preferible 30 nucleótidos o más. Tales sondas y cebadores hibridan específicamente con una secuencia diana bajo condiciones de hibridación de alta restrictividad. Preferiblemente, las sondas y cebadores tienen similaridad de secuencia de DNA completa de nucleótidos contiguos con la secuencia diana, aunque las sondas que difieren de la secuencia de DNA diana y que retienen la capacidad para hibridar con secuencias de DNA diana se pueden diseñar por procedimientos convencionales.
Los procedimientos para preparar y usar sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, vol. 1-3, ed. Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en adelante en este documento, "Sambrook y col., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel y col., Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (en adelante en este documento, "Ausubel y col., 1992"); e Innis y col., PCR protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; San Diego, 1990. Los pares de cebadores de PCR se pueden derivar de una secuencia conocida, por ejemplo, usando programas de ordenador para ese propósito tal como Cebador (Versión 0,5, © 1991, Whiteland Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Cebadores y sondas basados en las secuencias flanqueantes y de inserto de DNA descritas en el presente documento se pueden usar para confirmar (y, si es necesario, para corregir) las secuencias descritas mediante procedimientos convencionales, por ejemplo, reclonando y secuenciando tales secuencias.
Las sondas y cebadores de ácidos nucleicos de la presente invención hibridan bajo condiciones restrictivas con una secuencia de DNA diana. Cualquier procedimiento de hibridación o amplificación de ácido nucleico convencional se puede usar para identificar la presencia de DNA a partir de un caso transgénico en una muestra. Moléculas de ácido nucleico o fragmentos de las mismas son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido nucleico bajo ciertas circunstancias. Como se usan en el presente documento, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente la una a la otra si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico de cadena doble, antiparalela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si ellas presentan complementariedad completa. Como se usa en el presente documento, se dice que moléculas presentan "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario con un nucleótido de la otra. Se dice de dos moléculas que son "mínimamente complementarias" si pueden hibridar una con la otra con suficiente estabilidad para permitirlas permanecer fusionadas la una a la otra bajo al menos condiciones convencionales de "baja restrictividad". De forma similar, se dice que las moléculas son "complementarias" si se pueden hibridar una con la otra con suficiente estabilidad para permitirlas permanecer fusionadas una a la otra bajo condiciones convencionales de "alta restrictividad". Las condiciones de restrictividad convencionales se describen por Sambrook y col., 1989, y por Hames y col., en: Nucleic Acid Hybridation, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Son permisibles por lo tanto desviaciones de la complementariedad completa, en tanto en cuanto tales desviaciones no descartan completamente la capacidad de las moléculas para formar una estructura de cadena doble. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como un cebador o sonda necesita sólo ser suficientemente complementaria en secuencia para ser capaz de formar una estructura de doble cadena estable bajo el disolvente y sales de concentraciones empleadas en particular.
Como se usa en el presente documento, una secuencia sustancialmente homóloga es una molécula de ácido nucleico que se hibridará específicamente al complemento de la molécula de ácido nucleico a la cual se está comparando bajo condiciones de alta restrictividad. Las condiciones de restrictividad apropiada las cuales promueven la hibridación de DNA, por ejemplo, cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por un lavado de SSC 2X a 50ºC, se conocen por aquellos expertos en la técnica o se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar de una restrictividad baja de aproximadamente SSC 2X a 50ºC a una restrictividad alta de aproximadamente SSC 0,2X a 50ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado se puede incrementar a partir de condiciones de baja restrictividad a temperatura ambiente, aproximadamente 22ºC, en condiciones de alta restrictividad a aproximadamente 65ºC. Tanto temperatura como sal se pueden variar, o, bien la temperatura o bien la concentración de sal pueden mantenerse constantes mientras la otra variable se cambia. En una realización preferida, un ácido nucleico de la presente invención hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácido nucleico expuestas en SEQ ID Nº.: 9, 10, 11, y 12, o complementos de las mismas o fragmentos de cualquiera bajo condiciones moderadamente restrictivas, por ejemplo a aproximadamente 2,0 x SSC y aproximadamente 65ºC. En una realización particularmente preferida, un ácido nucleico de la presente invención hibridará específicamente con una o más de las moléculas de ácido nucleico expuestas en de la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12 o complementos o fragmentos de cualquiera bajo condiciones de lata restrictividad. En un aspecto de la presente invención, un marcador preferido de molécula de ácido nucleico de la presente invención tiene la secuencia de ácidos nucleicos expuesta de la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12 o complementos de las mismas.
En un aspecto adicional de la presente invención, una molécula de ácido nucleico marcadora preferida de la presente invención comparte una identidad de secuencia del 100% con una secuencia explicada en de la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12 o complementos de las mismas. De la SEQ ID Nº.: 9 a la SEQ ID Nº.: 12 se pueden usar como marcadores en procedimientos de reproducción vegetal para identificar la progenie de cruces genéticos de forma similar a los procedimientos descritos para análisis de marcador de DNA de repetición de secuencia simple, en "DNA markers: Protocols, applications, and overviews": (1997) 173-185, Cregan, y col., eds., Wiley-Liss
NY.
La hibridación de la sonda de la secuencia de la molécula de ácido nucleico diana se puede detectar mediante cualquier número de procedimientos conocido por aquellos expertos en la técnica, estos pueden incluir, pero no se limitan a, marcas fluorescentes, marcas radiactivas, marcas basadas en antibióticos, y marcas quimioluminiscentes.
Respecto a la amplificación (por ejemplo, mediante PCR) usando un par de cebadores de amplificación en particular, "condiciones restrictivas" son condiciones que permiten al par cebador hibridar sólo con la secuencia diana de ácido nucleico a la cual se uniría un cebador que tenga la secuencia de tipo salvaje correspondiente (o su complemento) y que preferiblemente permiten producir un único producto de amplificación, el amplicón, en una reacción de amplificación térmica de DNA.
El término "específico para (una secuencia diana)" indica que una sonda o cebador hibrida bajo condiciones de hibridación restrictivas sólo con la secuencia diana en una muestra que comprende la secuencia diana.
Como se usa en el presente documento, "DNA amplificado" o "amplicón" se refiere al producto de amplificación de ácidos nucleicos de una secuencia de aminoácidos diana que es parte de una plantilla de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de maíz que resulta de un cruce sexual contiene DNA genómico de caso transgénico a partir de la planta de maíz de la presente invención, el DNA extraído de una muestra de tejido de planta de maíz se puede someter a un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos usando un par cebador de DNA que incluye un primer cebador derivado de la secuencia flanqueante en el genoma de la planta adyacente al sitio de inserción del DNA heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del DNA heterólogo insertado para producir un amplicón que es diagnóstico para la presencia del DNA del caso. El amplicón es de una longitud y tiene una secuencia que también es diagnóstica para el caso. El amplicón puede variar en longitud desde la longitud combinada del primer par más un par de bases nucleotídicas, preferiblemente más aproximadamente cincuenta pares de bases nucleotídicas, más preferiblemente más aproximadamente doscientos cincuenta pares de bases nucleotídicas, e incluso más preferiblemente más aproximadamente cuatrocientos cincuenta pares de bases nucleotídicas. Alternativamente, un par cebador se puede derivar de secuencia flanqueante en ambos lados del DNA insertado tal como para producir un amplicón que incluye la secuencia nucleotídica del inserto entera (por ejemplo, el fragmento de DNA Mlu1 de la construcción de expresión pMON25496, figura 1, aproximadamente 6706 pares de bases nucleotídicas). Un miembro de un primer par derivado de la secuencia genómica de plantas se puede localizar a distancia de la secuencia de DNA insertado, esta distancia puede variar de un par de bases hasta los límites de la reacción de amplificación, o aproximadamente veintemil pares de bases nucleotídicas. El uso del término "amplicón" excluye específicamente dímeros de cebador que se pueden formar en la reacción de amplificación térmica de
DNA.
La amplificación de ácidos nucleicos se puede llevar a cabo mediante algunos de los diversos procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se conoce en la técnica una diversidad de procedimientos de amplificación y se describe, entre otras cosas, en las patentes de los Estados Unidos Nº^{s}.: 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis y col., Academic Press, San Diego, 1990. Los procedimientos de amplificación se han desarrollado para amplificar hasta 22 kb de DNA genómico y hasta 42 kb de DNA de bacteriófago (Cheng y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5695-5699, 1994). Estos procedimientos así como otros procedimientos conocidos en la técnica de amplificación de DNA se pueden usar en la práctica de la presente invención. La secuencia de inserto de DNA heterólogo o secuencia de DNA flanqueante a partir de caso de maíz PV-ZMGT32 (nk603) se puede verificar (y corregir si es necesario) amplificando tales secuencias a partir de DNA extraído a partir de la semilla o plantas de Nº. de acceso de depósito de ATCC PTA-2478 usando cebadores de DNA a partir de las secuencias proporcionadas en el presente documento seguidas por secuenciación de DNA estándar del amplicón de PCR o del DNA clo-
nado.
El amplicón producido mediante estos procedimientos se puede detectar mediante una pluralidad de técnicas. Uno de tales procedimientos es Análisis de Bits Genéticos (Nikiforov, y col. Nucleic Acid Res. 22: 4167-4175, 1994) donde se diseña un oligonucleótido de DNA el cual se solapa tanto con la secuencia de DNA genómico adyacente flanqueante como con la secuencia de DNA insertada. El oligonucleótido se inmoviliza en pocillos de una placa de micropocillos. Tras someter a PCR a la región de interés (usando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), un producto de PCR de cadena simple se puede hibridar con el oligonucleótido inmovilizado y servir como una plantilla para una reacción de extensión de base única usando una DNA polimerasa y ddNTP señalados específicos para la siguiente base esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. Una señal indica presencia de la secuencia del inserto/secuencia flanqueante debida a la amplificación, hibridación, y extensión de base única exitosa.
Otro procedimiento es la técnica de pirosecuenciación como se describe por Winge (Innov. Pharma Tech. 00: 18-24, 2000). En este procedimiento se diseña un oligonucleótido que se solapa con el DNA genómico adyacente y el empalme de DNA del inserto. El oligonucleótido se hibrida a producto de PCR de cadena simple a partir de la región de interés (un cebador insertado en la secuencia y uno en la secuencia genómica flanqueante) e incubado en presencia de una DNA polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Se añaden individualmente dNTP y la incorporación resulta en una señal ligera la cual se mide. Una señal ligera indica la presencia de la secuencia del inserto del transgén/secuencia flanqueante debida a amplificación, hibridación, y extensión de base única o multibase exitosas.
La Polarización de Fluorescencia como se describe por Chen y col., (Genome Res. 9: 492-498, 1999) es un procedimiento el cual se puede usar para detectar el amplicón de la presente invención. Usando este procedimiento se diseña un oligonucleótido el cual se solapa con el DNA genómico flanqueante y el empalme de DNA insertado. El oligonucleótido se hibrida a producto de PCR de cadena simple a partir de la región de interés (un cebador en el DNA insertado y uno en la secuencia de DNA genómica flanqueante) e incubado en presencia de una DNA polimerasa y un ddNTP señalado fluorescentemente. La extensión de base individual da como resultado incorporación de los ddNTP. La incorporación se puede medir como un cambio en polarización usando un fluorómetro. Un cambio en polarización indica la presencia de la secuencia de inserto/secuencia flanqueante debida a la amplificación, hibridación, y extensión de base individual exitosas.
Taqman® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) se describe como un procedimiento de detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de DNA y se entiende totalmente en las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Brevemente, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET la cual se solapa con la región flanqueante y con el empalme de DNA del inserto. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un primer en la secuencia de DNA insertado y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de la sonda FRET da como resultado escisión y liberación del resto fluorescente desde el resto desactivador de la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/secuencia del inserto del transgén debido a amplificación e hibridación exitosas.
Se han descrito Balizas Moleculares para usar en detección de secuencia en Tyangi, y col. (Nature Biotech. 14: 303-308, 1996). Brevemente, se diseña una sonda oligonucleotídica FRET que se solapa con el empalme de DNA de inserto y la región flanqueante genómica. La estructura única de la sonda FRET dio como resultado contener estructura secundaria que mantiene los restos fluorescente y desactivador en proximidad cercana. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de inserto de DNA y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Tras amplificación de PCR exitosa, la hibridación de la sonda FRET a la secuencia diana da como resultado la eliminación de la estructura de sonda secundaria y la separación espacial de los restos fluorescentes y desactivadores. Da como resultado una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia de inserto del transgen/secuencia flanqueante debido a la amplificación e hibridación exitosas.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de ciertas realizaciones preferidas de la invención. Se debería apreciar por aquellos de habilidad en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan aproximaciones que los inventores han encontrado que funcionan bien en la práctica de la invención, y así se puede considerar para constituir ejemplos de modos preferidos para esta práctica.
Ejemplos
Ejemplo 1
El caso de maíz transgénico PV-ZMGT32 (nk603) se generó mediante bombardeo con microproyectiles de embriones de maíz (Songstad y col., In Vitro Cell Plant 32: 179-183, 1996) usando un fragmento de DNA de MLu I lineal derivado de pMON25496 (figura 1). Este fragmento de DNA contiene dos cartuchos de expresión transgénica que confieren colectivamente tolerancia a glifosato de la planta de maíz. El primer cartucho se compone del promotor de la actina 1 del arroz e intrón (P-Os.Act1 y I-Os.Act1, patente de los Estados Unidos Nº.: 5.641.876), conectado operativamente a un péptido de transito de cloroplasto EPSPS de Arabidopsis (TS-At.EPSPS:CTP2, Klee y col., Mol. Gen. Genet. 210: 47-442, 1987), conectado operativamente con una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato de cepa CP4 de Agrobacterium sp. (AGRTU.aroA:CP4, patente de los Estados Unidos Nº.: 5.633.435) y conectado operativamente con un terminador transcripcional de nopalina sintasa (T-AGRTU.nos, Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-4807, 1983). El segundo cartucho de expresión de transgén consta del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S que contiene una duplicación en tándem de la región potenciadora (P-CaMV.35S, Kay y col., Science 236: 1299-1302, 1987; patente de los Estados Unidos Nº.: 5.164.316), conectado operativamente a un intrón de Hsp 70v de Zea mays (I-Zm.Hsp 70, patente de los Estados Unidos Nº.: 5.362.865) conectado operativamente a un péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis (TS-At.EPSPS:CTP2, Klee y col., Mol. Gen. Genet. 210: 47-442, 1987), conectado operativamente a una 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) tolerante a glifosato de cepa CP4 de Agrobacterium sp. (AGRTU.aroA:CP4, patente de los Estados Unidos Nº.: 5.633.435) y conectado operativamente con un terminador transcripcional de nopalina sintasa (T-AGRTU.nos, Fraley y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4803-4807, 1983). Tras el bombardeo, los callos transgénicos tolerantes a glifosato se seleccionaron a partir de esta población en base a una combinación superior de características, incluyendo tolerancia a glifosato, realización agronómica, e inserción transgénica única. Las evaluaciones de invernadero y de campo del caso nk603 y su progenie derivada indicó que esta inserción transgénica confiere tolerancia que excede especificaciones comerciales para tolerancia vegetativa y reproductiva total a 0,084 g glifosato/m^{2} (840 g de glifosato/hectárea (340 g de glifosato/acre)); 2,24\cdot10^{-4} kg de Roundup Ultra/m^{2} (2,24 kg de Roundup Ultra/ha (35 onzas de Roundup Ultra/acre)) cuando se aplican a los estados foliares V4 y
V8.
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Ejemplo 2
El caso de maíz nk603 tolerante a glifosato se comparó con el estándar comercial actual, GA21 (patente de los Estados Unidos Nº.: 6.040.497), para tolerancia a daño vegetativo con glifosato y efecto sobre producción. GA21 contiene al menos 3 cartuchos de expresión de transgén dispuestos en tándem en el genoma de maíz del caso GA21 (SCP/GMO/232-Final, Dirección General de la Comisión Europea de Salud y Protección al Consumidor). El cartucho de transgén de GA21 consta de un promotor de actina 1 de arroz e intrón unido a un péptido de tránsito de cloroplasto de ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa unido a una EPSPS resistente a glifosato de maíz modificado y una región de terminación de transcripción de nopalina sintetasa 3'. Plantas de nk603 y GA21 se plantaron en hileras en terrenos de campo duplicados. Los tratamientos eran 1) no pulverizados, 2) pulverizados a velocidad de 4,48\cdot10^{-4} kg/m^{2} (4,48 kg/hectárea (64 onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V4 y de nuevo con velocidad de 4,48\cdot10^{-4} kg/m^{2} (4,48 kg/hectárea (64 onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V8, 3) pulverizados a 6,72\cdot10^{-4} kg/m^{2} (6,72 kg/hectárea (96 onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V4 y de nuevo con velocidad de 6,72\cdot10^{-4} kg/m^{2} (6,72 kg/hectárea (96 onzas/acre)) de Roundup Ultra® en estado foliar V8. La tolerancia vegetativa se midió como porcentaje de daño vegetativo determinado mediante la cantidad de malformación foliar observada 10 días después del tratamiento con herbicida en el estado foliar V8. El rendimiento de cada terreno se midió en toneladas/hectárea (celemines/acre) y el porcentaje de reducción en rendimiento se determinó por cada tratamiento de herbicida relativo al tratamiento no pulverizado. El resultado mostrado en la Tabla 1 ilustra que nk603 muestra un porcentaje menor de nivel de daño vegetativo que las plantas GA21 y la reducción de rendimiento en porcentaje observada es también menor para el caso nk603. Se observó una incidencia baja de daño vegetativo en los terrenos no pulverizados, esta observación es atribuible a diversos factores ambientales distintos de la exposición a herbicida de glifosato. El doble cartucho de expresión de pMON25496 en nk603 se comparó en daño vegetativo y valoración de fertilidad de tres casos de maíz independientes obtenidos sólo a partir de la expresión que dirige el promotor CaMV.35S del gen de tolerancia a glifosato (AGRU.aroA:CP4). Se observó que el doble cartucho de expresión confirió un nivel mayor de tolerancia vegetativa y tolerancia reproductiva que tres casos de maíz independientes (ev 1, ev 2 y ev 3) conteniendo sólo el cartucho de expresión donde la expresión del gen de tolerancia a glifosato se dirigió mediante el promotor de CaMV.35S. Un nivel más alto de tolerancia vegetativa a daño con herbicida glifosato se observó para nk603 más 3 casos de maíz adicionales derivados de pMON25496 cuando se comparó al daño promedio de 6 casos de maíz derivados de una construcción donde la expresión del gen de tolerancia a glifosato se dirigió sólo mediante el promotor e intrón de actina de arroz (P-OS.Act1/I-Os.Act1). Las plantas transformadas con el cartucho de doble expresión poseían un nivel más alto de tolerancia a glifosato para daño vegetativo de fertilidad que plantas derivadas de transformación con los cartuchos de expresión aislados. Esto dio como resultado resistencia incrementada a pérdida de rendimiento debida a aplicación de herbicida glifosato. La construcción de pMON25496 proporcionó dos cartuchos de expresión de plantas en una única localización en nk603 que confiere un nivel más alto de tolerancia a glifosato que la inserción en tándem triple que tiene lugar en el estándar comercial, GA21.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 1 Tolerancia a Glifosato de nk603 - Daño vegetativo, Rendimiento, y Valoración de Fertilidad
1
2
* {}\hskip0,25cm \begin{minipage}[t]{150mm} El daño vegetativo se observó 10 días después de tratamiento de V8, es una medida tomada para valorar daño vegetativo en respuesta a tratamiento glifosato. \end{minipage}
** {}\hskip0,1cm \begin{minipage}[t]{150mm} Tasa de fertilidad masculina: 4-5 = totalmente fértil; 3 = emisión de polen significativamente reducida; 0-2 = completamente estéril-altamente estéril, no adecuado para uso comercial. \end{minipage}
*** 64 onzas = 1,81 kg; 2,721552 kg = 96 onzas; 128 onzas = 3,63 kg 
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Ejemplo 3
La molécula de DNA flanqueante correspondiente de nk603 se clonó usando adaptadores ligados y PCR adecuada como se describe en el kit Genome Walker™ (catálogo # K1807-1, CloneTech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Primero, el DNA genómico a partir del caso nk603 se purificó mediante el procedimiento de purificación de CTAB (Rogers y col., Plant Mol. Biol. 5: 69-76, 1985). Las bibliotecas de DNA genómico para amplificación se prepararon de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Genome Walker™, CloneTech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). En reacciones separadas, el DNA genómico se digirió durante toda una noche a 37ºC con las siguientes endonucleasas de restricción de extremos romos: EcoRV, ScaI, DraI, PvuII, y StuI (CloneTech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Las mezclas de reacción se extrajeron con fenol:cloroformo, el DNA se precipitó mediante la adición de etanol a la fase acuosa, se sedimentó mediante centrifugación, después se resuspendió en tampón Tris-EDTA (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM). Los fragmentos de DNA genómicos de extremos romos purificados se ligaron a los adaptadores de Genome Walker™ de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de la ligazón, cada reacción se trató con calor (70ºC durante 5 minutos) para terminar la reacción y se diluyó 10 veces en tampón Tris-EDTA. Un \mul de cada ligazón primaria se amplificó después en 50 \mul de reacción que incluían 1 \mul de biblioteca de adaptadores ligados respectiva, 1 \mul de cebador AP1 adaptador de Genome Walker™ (5' GTATATCGACTCACTATAGGGC 3', SEQ. ID. Nº.: 1) 10 \muM, 1 \mul de oligonucleótido específico de transgén nk603 (5' TGACGTATCAAAGTACCGACAAAAACATCC 3', SEQ. ID. Nº.: 2) 10 \muM, 1 \mul de desoxirribonucleótidos 10 mM, 2,5 \mul de dimetilsulfóxido, 5 \mul de tampón de PCR 10X que contiene MgCl_{2}, 0,5 \mul (2,5 unidades) de DNA polimerasa termostable Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) y H_{2}O a 50 \mul. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador usando control de temperatura calculado y las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo de 95ºC durante 9 minutos, 7 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 70ºC durante 3 minutos; 36 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 65ºC durante 3 minutos, 1 ciclo de 65ºC durante 4 minutos. Un \mul de cada reacción primaria se diluyó 50 veces con agua y se amplificó en una reacción secundaria (1 \mul de reacción primaria diluida respectiva, 1 \mul de cebador adaptador AP2 adecuado de Genome Walker™ (5' ACTATAGGGCACGCGTGGT 3', SEQ. ID. Nº.: 3, proporcionado por el fabricante), 1 \mul de oligonucleótido adecuado específico de transgén k603 (5' CTTTGTTTTATTTTGGACTATCCCGACTC 3', SEQ. ID. Nº.: 4) 10 \muM, 1 \mul de desoxirribonucleótidos 10 mM, 2,5 \mul de dimetilsulfóxido, 5 \mul de tampón de PCR 10X que contiene MgCl_{2}, 0,5 \mul (2,5 unidades) de DNA polimerasa termostable Amplitaq (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) y H_{2}O a 50 \mul usando las siguientes condiciones de ciclación: 1 ciclo de 95ºC durante 9 minutos; 5 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 70ºC durante 3 minutos; 24 ciclos de 94ºC durante 2 segundos, 65ºC durante 3 minutos, 1 ciclo de 65ºC durante 4 minutos.
Los productos de PCR, que representan regiones 5' que abarcan el empalme entre la inserción transgénica nk603 y el DNA de maíz flanqueante vecino se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa seguida por purificación a partir de la matriz de agarosa usando el Kit de Extracción de Gel QIAquick (catálogo # 28704, Qiagen Inc., Valencia, CA) y clonación directa dentro del vector pGEM-T Easy (catalog. # A1360, Promega, Madison, WI). La identidad de los productos de PCR clonados y la relación con el fragmento Mlu I de pMON25496 se confirmó mediante análisis de secuencia de DNA (ABI Prism™ 377, PE Biosystems, Foster City, CA y software de análisis de secuencia DNASTAR, DNASTAR Inc., Madison, WI).
De forma similar, la secuencia de DNA de maíz flanqueante 3' de nk603 se amplificó y clonó usando cebadores específicos de gen adecuados, tales como, SEQ ID Nº.: 5 (5' AGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGC 3') y SEQ ID Nº.: 6 (5' GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG 3') que se fusiona al terminador transcripcional T-AGRTU.nos. Dos terminadores transcripcionales T-AGRTU.nos están presentes en la inserción transgénica/genómica nk603, uno interno en la construcción y uno en el extremo 3' de la construcción adyacente al DNA genómico de maíz. Los productos de PCR producidos en esta reacción se secuenciaron y la secuencia de DNA que abarca el empalme entre el transgén y la secuencia flanqueante se distinguió de los productos del T-AGRTU.nos interno por comparación con las secuencias de elementos genéticos conocidas de la construcción pMON25496 como se describe previamente.
La secuencia de DNA de maíz que flanquea ambos lados de la inserción transgénica se determinó para nk603 secuenciando los productos de amplificación derivados de Genome Walker™ y el alineamiento para secuencia transgénica conocida. En el extremo 5' de la inserción transgénica, se determinó la secuencia de un segmento de 498 pares de bases alrededor del empalme de inserción (SEQ. ID. Nº.: 7). Esto consistió en 304 pares de bases (pb) de la secuencia de DNA genómico de maíz flanqueante (nucleótidos 1-304 de SEQ. ID. Nº.: 7), 45 pares de bases de secuencia de DNA de construcción pMON25496 (nucleótidos 305-349 de SEQ. ID. Nº.: 7) y 149 pares de bases de secuencia de DNA a partir del extremo 5' de P-Os.Act 1 (nucleótidos 350-498 de SEQ. ID. Nº.: 7).
La secuencia de DNA se determinó para un segmento de 1183 pares de bases alrededor del empalme de inserción 3' (SEQ. ID. Nº.: 8), que comienza con 164 pares de bases del terminador transcripcional T-AGRTU.nos (nucleótidos 1-164 de SEQ. ID. Nº.: 8), 217 pb de secuencia de DNA de construcción pMON25496 (nucleótidos 165-381 de SEQ. ID. Nº.: 8), 305 pb de genes plastídicos del maíz, rps11 y rpoA (segmentos parciales de cada gen correspondientes a las bases 63-363 del acceso al Banco de Genes X07810, correspondientes a las bases 382-686 de la SEQ. ID. Nº.: 8), y la secuencia de DNA restante constituido por secuencia de DNA de maíz genómico que flanquea el sitio de integración (correspondiente a las bases 687-1183 de SEQ. ID. Nº.: 8).
Las moléculas de DNA de empalme, SEQ. ID. Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10, SEQ. ID. Nº.: 11, y SEQ. ID. Nº.: 12 son moléculas de DNA novedosas en nk603 y son diagnósticas para planta de maíz nk603 y su progenie. Las moléculas de empalme en SEQ. ID. Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10 y SEQ. ID. Nº.: 11 representan aproximadamente 9 nucleótidos en cada lado de un sitio de inserción de un fragmento de DNA de transgén y fragmento de DNA de maíz. La SEQ. ID. Nº.: 9 se encuentra en las posiciones nucleotídicas 296-314 de SEQ. ID. Nº.: 7. Las secuencias de empalme SEQ. ID. Nº.: 10 y 1 están situadas en las posiciones nucleotídicas 373-390 y 678-695 respectivamente, de SEQ. ID. Nº.: 8, representando una molécula de DNA de empalme de secuencia de DNA de construcción con secuencia de DNA de plastos de maíz (SEQ. ID. Nº.: 10) y secuencia de construcción con secuencia de DNA genómico de maíz (SEQ. ID. Nº.: 11). SEQ. ID. Nº.: 12 se sitúa en posición nucleotídica 156-173 de SEQ. ID. Nº.: 8 y representa una molécula de DNA novedosa en nk603 debido a que es una fusión entre la secuencia del terminador T-AGRTU.nos con un fragmento invertido de la secuencia de DNA promotora de actina de arroz,
Ejemplo 4
Los pares cebadores del caso de DNA se usan para producir un amplicón diagnóstico para nk603. Estos pares cebadores de caso incluyen pero no se limitan a SEQ ID Nº.: 13 y SEQ ID Nº.: 14 para la molécula de DNA de amplicón 5' y SEQ ID Nº.: 15 y SEQ ID Nº.: 16 para la molécula de DNA de amplicón 3'. Además de estos pares cebadores, cualquier par cebador derivado de SEQ. ID. Nº.: 7 y SEQ. ID. Nº.: 8 que cuando se use en una reacción de amplificación de DNA produzca un diagnóstico de amplicón de DNA para nk603 es un aspecto de la presente invención. Las condiciones de amplificación para este análisis se ilustran en la tabla 2 y en la tabla 3 para la región de empalme inserto de transgén/genómica. El mismo procedimiento se aplica para amplificación del DNA del amplicón 3' usando moléculas de DNA cebadoras SEQ ID Nº.: 15 y SEQ ID Nº.: 16, sin embargo, cualquier modificación de estos procedimientos que usa moléculas de DNA o complementos de las mismas para producir una molécula diagnóstica de DNA de amplicón para nk603 está dentro de la habilidad ordinaria en la técnica. Además, un par cebador control (SEQ. ID. Nº.: 17 y 18) para amplificación de un gen de maíz endógeno se incluye como un estándar interno para las condiciones de reacción. El análisis de muestra de extracto de DNA de tejido de planta nK603 incluye un control de extracto de DNA de tejido positivo de nk603, un control de extracto de DNA negativo de una planta de maíz que no es nk603, y un control negativo que no contiene ningún extracto de DNA de maíz plantilla. Las moléculas de cebador de DNA adicionales de longitud suficiente se pueden seleccionar de SEQ. ID. Nº.: 7 y SEQ. ID. Nº.: 8 por aquellos expertos en la técnica de procedimientos de amplificación de DNA, y condiciones optimizadas para la producción de un amplicón pueden diferir de los procedimientos mostrados en tabla 2 y tabla 3 pero dan como resultado un diagnóstico de amplicón para nk603. El uso de estas secuencias cebadoras de DNA con modificaciones a los procedimientos de tabla 2 y 3 está dentro del alcance de la invención.
El ensayo del amplicón de nk603 se puede llevar a cabo usando un Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient como se muestra en la tabla 3, o mediante procedimientos y aparatos conocidos por aquellos expertos en la técnica.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 2 Procedimiento y mezcla de reacción de PCR para la confirmación de la región de empalme inserto de transgén/genómica 5' nk603
4
5
TABLA 3 Parámetros de PCR sugeridos para diferentes termodicladores
\begin{minipage}[t]{155mm} Mezclar suavemente, si es necesario (no es peligroso encima del termociclador), añadir 1-2 gotas de aceite mineral encima de cada reacción. Continuar con PCR en un Stratagene Robocycler, MJ Engine, Perkin-Elmer 9700, o termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient usando los siguientes parámetros de ciclación. \end{minipage}
\begin{minipage}[t]{155mm} Nota: el Motor MJ del termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient se pondría en funcionamiento en el modo calculado:. Poner en funcionamiento el termociclador con la escala de velocidad fija al máximo. \end{minipage}
Nº de ciclo Ajustes: Stratagene Robocycler
1 94ºC 3 minutos
38 94ºC 1 minuto
60ºC 1 minuto
72ºC 1 minuto y 30 segundos
1 72ºC 10 minutos 
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Nº de ciclo Ajustes: Motor MJ o Perkin-Elmer 9700
1 94ºC 3 minutos
38 94ºC 10 segundos
60ºC 30 segundos
72ºC 1 minuto
1 72ºC 10 minutos
TABLA 3 (continuación)
Nº de ciclo Ajustes: Eppendorf Mastercycler Gradient
1 94ºC 3 minutos
38 94ºC 15 segundos
60ºC 15 segundos
72ºC 1 minuto
1 72ºC 10 minutos
Un depósito de la Monsanto Company, semilla de maíz del caso PV-ZMGT32 (nk603) descrito anteriormente se ha fabricado bajo el Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110. El número de acceso de ATCC es PTA-2478. El depósito se mantendrá en el archivo durante un periodo de 30 años, 5 años tras la última solicitud, o durante la vida efectiva de la patente, en el caso de que sea mayor, y se reemplazará según sea necesario durante ese periodo.
<110> Monsanto Co
\hskip1cm
Behr, Carl 
\hskip1cm
Hironaka, Catherine 
\hskip1cm
Heck, Gregory 
\hskip1cm
You, Jinaong 
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<120> Caso de maíz PV-ZMGT32 (nk603) y Composición y Procedimientos para Detección del Mismo
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<130> 38-21 (52258)B
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<150> 60/213.567
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<151> 22-06-2000
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<150> 60/241.215
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 13-10-2000
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<150> 60/240.014
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<151> 13-10-2000
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<160> 16
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<170> PatentIn en versión 3.0
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<210> 1
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(22)
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<223> totalmente sintetizado
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
gtatatcgac tcactatagg gc 
\hfill
22 
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<210> 2
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<211> 30
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(30)
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<223> totalmente sintetizada
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
tgacgtatca aagtaccgac aaaaacatcc 
\hfill
30 
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<210> 3
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<211> 19
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(19)
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<223> totalmente sintetizada
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
actatagggc acgcgtggt 
\hfill
19 
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<210> 4
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<211> 29
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(29)
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<223> totalmente sintetizada
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctttgtttta ttttggacta tcccgactc 
\hfill
29 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 26
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(26)
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<223> totalmente sintetizada
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
agattgaatc ctgttgccgg tcttgc 
\hfill
26 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 28
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(28)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizada
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcggtgtcat ctatgttact agatcggg 
\hfill
28 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 498
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(498)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1-304 DNA genómico de maíz Zea 
\hskip1cm
305-349 DNA de vector de construcción 
\hskip1cm
350-498 DNA de promotor actina 1 de arroz 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
6 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
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<211> 1183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1883)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1-64 Terminador 3' de Agrobacterium tumefasciens nos
\hskip1cm
165-381 DNA de vector de construcción 
\hskip1cm
382-686 Genes plastídicos de maíz Zea, rps11 y rpoA 
\hskip1cm
687-1183 DBA genómico de maíz Zea 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
7 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(19)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA genómico de maíz Zea y de vector
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtagcggcc cacgcgtgg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA plastídico de maíz Zea y DNA de vector
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskip
taccacgcga cacacttc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> DNA genómico de maíz Zea y DNA de vector
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<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgctgttctg ctgacttt 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(18)
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<223> DNA de terminador 3' de Agrobacterium tumefasciens nos y promotor de actina de arroz
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accaagcttt tataatag 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 13
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<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizado
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatcgatcca aaatcgcgac tg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 14
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(22)
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<223> totalmente sintetizado
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<400> 14
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcactttgg gccacctttt at 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 15
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
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<221> fuente
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<222> (1)..(22)
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<223> totalmente sintetizado
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<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gacgttattt atgagatggg tt 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<200> 16
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<211> 22
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<212> DNA
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<213> artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> fuente
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<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> totalmente sintetizado
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<400> 16
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\hskip-.1em\dddseqskip
catcatctcg cgccttcctt tc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (8)

1. Una molécula de DNA que comprende una secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8.
2. Un par de moléculas de DNA que comprenden: una primera molécula de DNA y una segunda molécula de DNA, en la que las moléculas de DNA son de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID Nº.: 7 o su complemento para funcionar como cebadores de DNA o sondas diagnósticas para DNA extraídas a partir de planta de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o progenie de la misma.
3. Un par de moléculas de DNA que comprenden: una primera molécula de DNA y una segunda molécula de DNA, en la que las moléculas de DNA son de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID Nº.: 8 o su complemento para funcionar como cebadores de DNA o sondas diagnósticas para DNA extraídas a partir de planta de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o progenie de la misma.
4. Un procedimiento de detectar la presencia de una molécula de DNA seleccionada del grupo constituido por de SEQ. ID. Nº.: 7 y SEQ. ID. Nº.: 8 en una muestra de DNA, comprendiendo el procedimiento:
(a) extraer una muestra de DNA de una planta de maíz;
(b) poner en contacto la muestra de DNA con un par cebador de DNA que comprende moléculas cebadoras de DNA de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID Nº.: 7 o su complemento, o SEQ ID Nº.: 8 o su complemento para funcionar como cebadores de DNA o sondas diagnósticas para DNA extraídas de planta de maíz PV-ZMGT32 (nk603) o progenie de la misma;
(c) proporcionar una condición de reacción de amplificación de ácidos nucleicos;
(d) llevar a cabo dicha reacción de amplificación, produciendo de este modo una molécula amplicón de DNA; y
(e) detectar la molécula amplicón de DNA.
5. Un procedimiento de detectar la presencia de una molécula de DNA seleccionada del grupo que consta de SEQ. ID. Nº.: 7 y SEQ. ID. Nº.: 8 en una muestra de DNA, comprendiendo el procedimiento:
(a) extraer una muestra de DNA de una planta de maíz;
(b) poner en contacto la muestra de DNA con una molécula de DNA identificada como SEQ. ID. Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10, SEQ. ID. Nº.: 11, y SEQ. ID. Nº.: 12, en la que dicha molécula de DNA es una sonda de DNA que hibrida bajo condiciones de hibridación restrictivas con la molécula de DNA seleccionada del grupo constituido por SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8, y no hibrida bajo las condiciones de hibridación restrictivas con una muestra de DNA que no contien la molécula de DNA identificada como SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8;
(c) someter la muestra y sonda a condiciones de hibridación restrictiva; y detectar hibridación de la sonda al DNA.
6. Una molécula de DNA seleccionada del grupo que consta de SEQ. ID. Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10, SEQ. ID. Nº.: 11, y SEQ. ID. Nº.: 12, y complementos de la misma.
7. Un procedimiento de seleccionar un rasgo de tolerancia a glifosato dentro de plantas de maíz que comprende
a) extraer una muestra de DNA a partir de progenie de plantas de maíz;
b) poner en contacto la muestra de DNA con una molécula de ácido nucleico marcador seleccionada a partir del grupo que consta de SEQ. ID. Nº.: 9, SEQ. ID. Nº.: 10, SEQ. ID. Nº.: 11, y SEQ. ID. Nº.: 12, o complementos de la misma;
c) llevar a cabo un procedimiento de reproducción asistida por un marcador del rasgo de tolerancia a glifosato, en el que el rasgo de tolerancia a glifosato está ligado genéticamente a un complemento de la molécula de ácido nucleico marcadora.
8. Un kit de detección de DNA que comprende: al menos una molécula de DNA de suficiente longitud de nucleótidos contiguos homólogos o complementarios a SEQ ID Nº.: 7 o SEQ ID Nº.: 8 para funcionar como un cebador o sonda de DNA específico para el caso de maíz PV-ZMGT32 (nk603) y/o su progenie.
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