BRPI0611492A2 - bifidobactéria probiótica felina - Google Patents

Abstract

De acordo com a presente invenção, é apresentada uma cepa de bactérias formadoras de ácido láctico, do gênero Bifidobacteria, obtenível mediante isolamento a partir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado, e apresentando uma atividade probiática em animais. São apresentados, também, métodos de uso e composições compreendendo as Bifidobacteria da presente invenção.

Description

"BIFIDOBACTÉRIA PROBIÓTICA FELINA"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo demicroorganismos probióticos, mais especificamente abactérias formadoras de ácido láctico probióticas felinas,bem como métodos para o uso das mesmas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os mecanismos de defesa para proteção do tratogastrointestinal (GI) de mamíferos contra a colonização porbactérias são altamente complexos. 0 trato GI da maioriados mamíferos é colonizado por microflora nativa e pormicroorganismos patogênicos invasivos. Em um estadosaudável, essas microfloras concorrentes encontram-se em umestado de equilíbrio. A modificação do equilíbrio damicroflora intestinal pode causar ou evitar diversostranstornos gastrointestinais, tanto em seres humanos comoem outras espécies de mamíferos, como animais de estimação,inclusive gatos, cães e coelhos. O bem-estar de animais deestimação está estreitamente relacionado à alimentação e àsaúde gastrointestinal, e a manutenção do equilíbrio damicroflora intestinal nesses animais pode resultar emanimais de estimação mais saudáveis.

O número e a composição da microflora intestinaltendem a ser estáveis, embora idade e dieta possam modificá-los. A acidez gástrica, a bílis, o peristaltismo intestinale a imunidade local são fatores considerados importantes naregulação da flora bacteriana presente no intestino delgadode seres humanos e diversos outros mamíferos.Freqüentemente, os transtornos gastrointestinais em animaisde estimação, inclusive aqueles encontrados em felinos,estão ligados ã proliferação bacteriana e ã produção deenterotoxinas por bactérias patogênicas. Esses fatoresperturbam o equilíbrio da microflora intestinal e podempromover inflamação e respostas imunológicas aberrantes.

Ao longo dos últimos anos, pesquisas começaram arevelar algumas valiosas cepas de bactérias, e seu usopotencial como agentes probióticos. Os probióticos sãoconsiderados preparações de bactérias, sejam estas viáveisou mortas, tendo constituintes como proteínas oucarboidratos, ou frações purificadas de fermentosbacterianos, que promovem a saúde dos mamíferos ao preservara microflora natural no trato GI, e ao reforçar os controlesnormais contra respostas imunológicas aberrantes.

Acreditase que as bactérias probióticas sejam mais eficazes quandoderivadas da espécie que se pretende tratar, ou de espéciescom parentesco próximo a esta. Portanto, existe umanecessidade por cepas probióticas derivadas de animais deestimação, para serem utilizadas para animais de estimação,que sejam diferentes daquelas derivadas de seres humanos.

O documento WO 01/90311 apresenta microorganismosprobióticos isolados a partir de amostras fecais obtidas apartir de gatos, as quais têm atividade probiótica. Noentanto, essas bactérias foram obtidas a partir de amostrasfecais, e podem não ser parte da microflora intestinalnatural presente na porção superior do tratogastrointestinal.

Conseqüentemente, existe uma necessidade pelaobtenção de cepas de bactérias, mediante isolamento apartir da microflora intestinal natural presente na porçãosuperior do trato gastrointestinal, que sejamparticularmente adaptadas para gatos, e que tenham sidoselecionadas por suas propriedades probióticas e capacidadepara sobreviver o processamento, incorporando essas cepas acomposições que são adequadas a seu uso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, sãoapresentadas cepas de bactérias formadoras de ácido lácticodo gênero Bifidobacteria, obtenível mediante isolamento apartir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado,e apresentando uma atividade probiótica em animais. As cepasde bactérias formadoras de ácido láctico são selecionadas,de preferência, dentre as espécies compreendendoBifidobacterium longum Bifidobacterium animalis,Bifidobacterium adoleseentis, Bifidobaeterium bifidum,Bifidobacterium infantis ou Bifidobacterium thermophilum.

Em uma modalidade preferencial, a cepa debactérias formadoras de ácido láctico é uma cepaselecionada do grupo consistindo em Bifidobaeterium longumcom uma seqüência de DNA da região do espaçador 16s-23stendo mais de 95% de homologia com SEQ. ID N0 1, ou mais de94% de homologia com SEQ. ID N0 2.Em uma outra modalidade preferencial, a cepa debactérias formadoras de ácido láctico é selecionada dogrupo consistindo em Bifidobacterium longum NCIMB 412 90(AHF5340) , Bifidobacterium longum NCIMB 41291 (AHF1231) emisturas dos mesmos.

Além disso, a presente invenção refere-se ao usodas bactérias formadoras de ácido láctico, obteníveismediante isolamento a partir de trato gastrointestinal felinoressecado e lavado, para a manutenção e melhoria da saúde doanimal de estimação, bem como composições compreendendo asditas bactérias formadoras de ácido láctico.

Estes e outros aspectos, bem como característicase vantagens da presente invenção, ficarão aparentes aosversados na técnica a partir da leitura da presentedescrição.

SEQÜÊNCIAS

SEQ. ID N0 1 - seqüência de nucleotídeo doespaçador intergênico 16s-23s de Bifidobacterium longumNCIMB 412 90 (AHF534 0).

SEQ. ID N0 2 seqüência de nucleotídeo doespaçador intergênico 16s-23s de Bifidobacterium longumNCIMB 41291 (AHF1231).

SEQ. ID N0 3 - seqüência iniciadora 16s-23s de PCRdo lado esquerdo, para análise de seqüência.

SEQ. ID N0 4 - seqüência iniciadora 16s-23s de PCRdo lado direito, para análise da seqüência.NÚMEROS DE DEPOSITO DAS BACTÉRIAS

A Tabela abaixo indica as espécies deBifidobacterium e seu número da cepa, para cepas que sãoexemplos da presente invenção. As cepas bacterianas estãodepositadas junto ao "National Collections of IndustrialFood and Marine Bactéria" (NCIMB), Aberdeen, Reino Unido.

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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Todos os pesos, medidas e concentrações napresente invenção são medidos a 250C na composição em suatotalidade, exceto onde indicado em contrário.

Exceto onde indicado em contrário, todas asporcentagens das composições aqui mencionadas sãoporcentagens em peso, e todas as razões são razões em peso.

Exceto onde indicado em contrário, todos os pesosmoleculares são pesos moleculares médios ponderais.

Exceto onde indicado em contrário, o conteúdo detodas as fontes de literatura mencionadas neste texto estãoaqui incorporadas em sua totalidade, por referência.

Exceto onde são apresentados exemplos específicosde valores reais medidos, os valores numéricos aquimencionados devem ser considerados como sendo qualificadospela expressão "cerca de".

No âmbito da descrição apresentada a seguir, aabreviação UFC ("unidade formadora de colônia") designa onúmero de células bacterianas revelado por contagensmicrobiológicas em placas de ágar, como é de entendimento comum na técnica.

Para uso na presente invenção, o termo "mutantesdos mesmos" inclui cepas bacterianas derivadas compreendendomutações de DNA em outras seqüências de DNA do genomabacteriano, excluindo-se a seqüência intergênica 16s-23s.

Para uso na presente invenção, o termo "mutaçõesde DNA" inclui mutações naturais ou induzidas compreendendoao menos alterações de base única, inclusive deleções,inserções, transversões e outras modificações de DNAconhecidas pelos versados na técnica, inclusive modificaçãogenética introduzida em um nucleotídeo ou seqüência deaminoácidos original (pai), mantendo-se ao menos 50% dehomologia com a seqüência-pai. De preferência, a seqüênciacompreendendo a mutação ou mutações de DNA tem ao menos60%, com mais preferência ao menos 75% e, com maispreferência ainda, 85% de homologia com a seqüência-pai.Para uso na presente invenção, a seqüência de "homologia"pode ser determinada mediante o uso de técnicas-padrãoconhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, ahomologia pode ser determinada mediante o uso do algoritmode homologia "BLAST" disponível publicamente online, emhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.

Para uso na presente invenção, o termo "modificaçãogenética" inclui a introdução de seqüências de DNA exógenase/ou endógenas no genoma de um organismo, seja por meio deinserção no genoma do dito organismo, seja por meio devetores, inclusive DNA de plasmídios ou bacteriófagos,conforme é de conhecimento do versado na técnica, sendo que adita seqüência de DNA tem um comprimento de ao menos duasbases de ácido desoxirribonucléico.

Para uso na presente invenção, o termo "animal deestimação" significa um animal doméstico. De preferência,"animal de estimação" significa animais domésticos comofelinos (gatos), caninos (cães), coelhos, furões, cavalos,vacas ou similares. Com mais preferência, "animal deestimação" significa um gato doméstico.

CEPAS DE BIFIDOBACTERIA FORMADORAS DE ÁCIDO LÁCTICO

O primeiro aspecto da presente invenção compreendeuma cepa de bactérias formadoras de ácido láctico do gêneroBifidobacterial obtenivel mediante isolamento a partir detrato gastrointestinal felino ressecado e lavado, eapresentando uma atividade probiótica em animais. Osprobióticos consistem em microorganismos viáveis ou mortos,composições processadas de microorganismos, seusconstituintes como proteínas ou carboidratos, ou fraçõespurificadas de fermentos bacterianos, que afetam de modobenéfico um hospedeiro. 0 uso geral de bactérias probióticasse dá sob a forma de células viáveis. No entanto, isso podeser estendido a células não-viáveis, como culturas mortas oucomposições contendo fatores benéficos expressos pelasbactérias probióticas. Isso pode incluir microorganismosmortos por meios térmicos, por exposição a um pH alterado,ou submetidos a pressão. Para o propósito da presenteinvenção, o termo "probióticos" destina-se a incluir, ainda,os metabólitos gerados pelos microorganismos da presenteinvenção durante a fermentação, caso estes não sejamseparadamente indicados. Esses metabólitos podem serliberado no meio de fermentação, ou podem ser armazenados nointerior do microorganismo. Para uso na presente invenção, otermo "probiótico" inclui, também, bactérias, homogenatosbacterianos, proteínas bacterianas, extratos bacterianos,sobrenadantes de fermento bacteriano e misturas dessesitens, os quais exercem funções benéficas ao animalhospedeiro, quando administrados em uma dose terapêutica.

Descobriu-se que as bactérias formadoras de ácidoláctico do gênero Bifidobacteria, obteníveis medianteisolamento direto a partir de trato gastrointestinalressecado e lavado de mamíferos, são aderentes ao trato GI emseguida à alimentação com células bacterianas viáveis, eapresentam, também, uma ação imunomodulatória significativaquando fornecidas aos animais sob suas formas viáveis, não-viáveis ou fracionadas. Sem se ater à teoria, acredita-se queas Bifidobacteria obteníveis mediante isolamento a partir detrato gastrointestinal ressecado e lavado mantenham estreitaassociação com os tecidos mucosos intestinais. Sem se ater àteoria, acredita-se que isso resulte na geração, pelasBifidobacteria probióticas da presente invenção, de respostasalternativas no hospedeiro, as quais resultam em sua açãoprobiótica. Descobriu-se que as bactérias probióticasobteníveis mediante isolamento a partir de tratogastrointestinal ressecado e lavado podem modular o sistemaimune do hospedeiro por meio de interação direta com oepitélio mucoso e com as células imunes do hospedeiro. Essaimunomodulação, em conjunto com o mecanismo tradicional deação associado às bactérias probióticas, isto é, a prevençãoda aderência de patógenos aos intestinos, mediante oclusão ecompetição por nutrientes, faz dos Bifidobacteria da presenteinvenção organismos probióticos altamente eficazes.

As Bifidobacteria da presente invenção, obteníveismediante isolamento a partir de trato GI felino ressecado elavado, apresentam atividade microbicida in vitro contradiversas cepas/espécies bacterianas patogênicas. Sem se aterà teoria, acredita-se que essa atividade microbicida invitro indique o potencial de atividade probiótica in vivo emanimais, de preferência animais de estimação, como gatos. Asbactérias formadoras de ácido láctico da presente invençãoapresentam, de preferência, atividade microbicida in vitrocontra Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes,Listeria innocua ou Eschericia coli, com mais preferênciauma combinação dessas cepas e, com mais preferência ainda, todas essas cepas.

Sem se ater à teoria, acredita-se que a atividademicrobicida das bactérias formadoras de ácido láctico dapresente invenção pode ser o resultado de várias açõesdiferentes realizadas pelas ditas bactérias. Foi sugeridoanteriormente, na técnica, que diversas cepas de bactériasisoladas a partir de amostras fecais exercem seu efeitoprobiótico no trato gastrointestinal, após seu consumo oralao impedir, mediante oclusão, a fixação de organismospatogênicos à mucosa intestinal. Isto exige o consumo oral decélulas bacterianas "vivas" ou viáveis, para que uma colôniade bactérias se estabeleça nos intestinos. No entanto,acredita-se que the as Bifidobacteria da presente invenção,obteníveis mediante isolamento a partir de trato GI felinoressecado e lavado, embora exerçam algum efeito probióticomediante oclusão se fornecidos sob uma forma viável, possamoferecer um efeito probiótico substancial em suas formastanto viáveis como não-viáveis devido à produção, durante afermentação in vitro, de uma ou mais substâncias que ou matamos microorganismos patogênicos ou inibem sua proliferação,e/ou que alteram a imunocompetência do animal hospedeiro.

Essa forma de atividade probiótica é desejável, já que asbactérias da presente invenção podem ser fornecidas sob aforma de culturas viáveis ou não-viáveis, ou como produtos defermentação purificados e, ainda assim, proporcionar umefeito terapêutico benéfico ao animal hospedeiro.

De preferência, as bactérias formadoras de ácidoláctico da presente invenção são capazes de manter suaviabilidade após trânsito pelo trato GI. Isso é desejável,para que as culturas de bactérias vivas possam seradministradas por via oral, e para que ocorra a colonizaçãodos após o trânsito através do esôfago e do estômago. Acolonização dos intestinos pelas bactérias formadoras deácido láctico da presente invenção é desejável paraproporcionar ao hospedeiro benefícios probióticos de longoprazo. A dosagem oral de células não-viáveis ou isoladospurificados das mesmas induz benefícios temporários mas,como as bactérias não são viáveis, não são capazes de seproliferar e proporcionar, de maneira contínua, um efeitoprobiótico in si tu. Como resultado, isto pode exigir que ohospedeiro receba doses regularmente, de modo a manter osbenefícios de saúde. Em contraste, as células viáveiscapazes de sobreviver ao trânsito gástrico em sua formaviável e, subseqüentemente, colonizar os intestinosmediante adesão à mucosa intestinal e proliferação sobre amesma, são capazes de proporcionar de maneira contínua osefeitos probióticos in situ.

Portanto, é preferencial que as bactériasformadoras de ácido láctico da presente invenção mantenhamsua viabilidade após a suspensão em um meio com pH 2,5durante 1 hora. Para uso na presente invenção, o termo"manter a viabilidade" significa que ao menos 25% dasbactérias inicialmente em suspensão no meio de teste sãoviáveis, usando-se o método de contagem em placas conhecidopelos versados na técnica. De preferência, o termo "mantera viabilidade" significa que ao menos 50% das bactériasinicialmente em suspensão são viáveis. É desejável que asbactérias formadoras de ácido láctico da presente invençãomantenham sua viabilidade após a exposição a um baixo pH,já que isso imita a exposição aos sucos gástricos noestômago e no intestino superior in vivo, após a consumooral por animais.

Além disso, é preferencial que as bactériasformadoras de ácido láctico da presente invenção apresentemuma proliferação de ao menos 66% quando na presença de aomenos 0,3% de sais biliares de porco. A prolif eração, parauso na presente invenção, é descrita com mais detalhes noExemplo 3. Com mais preferência, as bactérias da presenteinvenção apresentam uma proliferação de ao menos 66% quandona presença de ao menos 1% de sais biliares de felino. Semse ater à teoria, acredita-se que as bactérias formadorasde ácido láctico da presente invenção que sejam capazes demanter a viabilidade na presença de ao menos 0,3% de saisbiliares de porco, sejam capazes de sobreviver às condiçõespresentes nos intestinos. Acredita-se que isso seja umresultado da adição de bílis de porco ao meio de cultura,reproduzindo as condições do intestino.

Além disso, é preferencial que as bactériasformadoras de ácido láctico da presente invenção apresentemadesão significativa a células epiteliais de intestino invitro. Para uso na presente invenção, o termo "adesãosignificativa" significa que ao menos 1% do número total debactérias formadoras de ácido láctico co-incubadas com ascélulas epiteliais in vitro aderem às ditas células. Commais preferência, ao menos 1,5% das células bacterianas co-incubadas aderem às células in vitro. Sem se ater à teoria,acredita-se que a aderência a células epiteliais deintestino in vitro seja uma indicação da capacidade dasbactérias formadoras de ácido láctico para colonizar otrato GI de um animal in vivo.

De preferência, a cepa de bactérias formadoras deácido láctico de acordo com a presente invenção é de umaespécie selecionada do grupo consistindo em Bifidobacteriumlongum, Bifidobacterium animalis, Bifidobacteriumadolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacteriuminfantis ou Bifidobacterium thermophilum, de preferênciaBifidobacterium longum.

A seqüência de polinucleotídeo intergênico 16s-23sé conhecida pelos versados na técnica como a seqüência deDNA, no genoma bacteriano, que pode ser usada paraidentificar diferentes espécies e cepas de bactérias. Essaseqüência de polinucleotídeo intergênico pode serdeterminada pelo método detalhado abaixo, no exemplo 4.

Em uma modalidade preferencial da presenteinvenção, a cepa de bactérias formadoras de ácido láctico éselecionada do grupo consistindo em Bifidobacteria com umaseqüência de polinucleotídeo intergênico 16s-23s que tem maisde 95% de homologia com SEQ. ID N0 1, ou mais de 94% dehomologia com SEQ. ID N0 2. Com mais preferência, a cepa debactérias formadoras de ácido láctico é selecionada do grupoconsistindo em Lactobacilli com uma seqüência depolinucleotídeo 16s-23s tendo mais de 95%, com maispreferência ainda mais de 97% de homologia com SEQ. ID N0 1ou SEQ. ID N0 2. Com mais preferência, a cepa de bactériasformadoras de ácido láctico de acordo com a presente invençãoé selecionada do grupo consistindo em Bifidobaeteria tendouma seqüência de polinucleotídeo 16s-23s de acordo com SEQ.ID N0 1 ou SEQ. ID N0 2. Com mais preferência ainda, a cepade bactérias formadoras de ácido láctico de acordo com apresente invenção é selecionada de Bifidobaeterium longumNCIMB 41290 (AHF5340) , Bifidobaeterium longum NCIMB 41291(AHF1231) ou uma mutação das mesmas.A cepa de bactérias formadoras de ácido láctico dogênero Bifidobacterial obtenível mediante isolamento apartir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado,pode ser usado para proporcionar benefícios probióticos emseguida ao consumo via oral em animais, de preferênciaanimais de estimação ou seres humanos. Esses benefíciosprobióticos geralmente mantêm ou melhoram a saúde geral doanimal. Os elementos não-limitadores de saúde e fisiologiaanimal que são beneficiados, seja terapeuticamente peloalívio de sintomas, ou profilaticamente pela prevenção dedoenças, incluem transtornos inflamatórios,imunodeficiência, doença inflamatória intestinal, síndromedo intestino irritável, câncer (particularmente aqueles dossistemas gastrointestinal e imune), doença diarréica,diarréia associada ao uso de antibióticos, apendicite,transtornos autoimunes, esclerose múltipla, mal deAlzheimer, amiloidose, artrite reumatóide, artrite,mobilidade das articulações, diabetes mellitus, resistênciaâ insulina, infecções bacterianas, infecções virais,infecções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital,trauma associado a cirurgia, doença metastática induzida porcirurgia, sepse, perda de peso, ganho de peso, acúmuloexcessivo de tecido adiposo, anorexia, controle de febre,caquexia, cura de ferimentos, úlceras, infecção da barreiraintestinal, alergia, asma, transtornos respiratórios,transtornos circulatórios, doença cardíaca coronariana,anemia, transtornos do sistema de coagulação sangüínea,doença renal, transtornos do sistema nervoso central, doençahepática, isquemia, transtornos nutricionais, osteoporose,transtornos endócrinos e transtornos da epiderme. Sãopreferenciais o tratamento do trato gastrointestinal,inclusive tratamento ou prevenção de diarréia, a regulaçãodo sistema imune, de preferência tratamento ou prevenção dedoença autoimune e inflamação, a manutenção ou melhoria dasaúde da pele e/ou da pelagem, de preferência tratamento ouprevenção de doença atópica da pele, a melhoria ou reduçãodos efeitos do envelhecimento, inclusive consciência mentale níveis de atividade, a prevenção de transtornos associadosao eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal, e a melhoria dasaúde das articulações, de modo a otimizar a mobilidade.

O tratamento dos transtornos apresentados acimapode ser medido mediante o uso de técnicas conhecidas pelosversados na técnica. Por exemplo, transtornos inflamatórios,inclusive doença autoimune e inflamação, podem serdetectados e monitorados utilizando-se testes de funçãoimune in vivo, como blastogênese de linfócitos, atividade decélulas "Natural Killer", resposta de anticorpos a vacinas,hipersensibilidade de tipo retardado e combinações dessesitens. Esses métodos são brevemente descritos na presenteinvenção, mas bem conhecidos pelos versados na técnica.

1. Blastogênese de linfócitos: Este ensaio mede aresposta proliferativa in vitro de linfócitos isoladosa partir de sangue integral fresco obtido de animaisde teste e de controle para diversos mitogênios, e éuma medida da função geral das células T e B. Emresumo, as células mononucleares do sangue periférico(PBMC, ou "peripheral blood mononucleocytes") sãoisolados a partir de sangue integral por meio demétodos Ficoll-Hypaque de centrifugação por densidade,conhecidos pelos versados na técnica. As PBMCsisoladas são lavadas duas vezes em meio celular RPMI1640 suplementado com HEPES, L-glutamina epenicilina/estreptomicina. As células lavadas sãoressuspensas em RPMI 1640 e contadas, e a densidade decélulas é adequadamente ajustada. As 2xl05 células sãoexpostas a uma gama de concentrações (de 0,1 ^g/mL a100 μg/mL) de diversos mitogênios, exemplos dos quaisincluem mitogênio de caruru-de-cacho (Gibco),fitoemaglutinina (Gibco) e concanavalina A (Sigma), emtriplicata, durante 72 horas a 37°C e 5% de CO2 com10% de soro fetal bovino (Sigma) . A 54 horas, ascélulas são pulsadas com 1 μCi 3H-timidina ecoletadas, e as contagens de cintilação são lidas emum TopCount NXT a 72 horas.

Atividade de células "Natural Killer": Conforme descritoem US 6.310.090, este ensaio mede a atividade efetorain vitro de células "natural killer" (NK) isoladas apartir de sangue integral fresco de animais de teste ede controle. As células "natural killer" (NK) são umcomponente da função imune inata de um mamífero. Ascélulas de adenocarcinoma de tiróide felino são usadascomo células-alvo na avaliação da atividade citotóxicade células NK. Foi anteriormente demonstrado que essalinhagem de células é suscetível à morte por células NKfelinas. As células-alvo foram cultivadas em um frascoT75 com 20 mL de meio mínimo essencial (MEM; SigmaChem. Co., St. Louis7 MO, EUA.), suplementado com 10%de soro fetal de bezerro (FCS) , 100 U/mL de penicilinae 100 μg/mL de estreptomicina. Quando confluentes, ascélulas-alvo foram tripsinizadas, lavadas 3 vezes eressuspensas a 5xl05 células/mL em meio completo (RPMI-1640 + 10% FCS + 100 U/mL de penicilina + 100 μο/ιη]!, deestreptomicina). Triplicatas de alíquotas de 100 μΐ, dascélulas-alvo foram pipetadas em placas com 96 cavidadesde fundo em U (Costar, Cambridge, Massachussets, EUA) eincubadas durante 8 horas para permitir a aderência dascélulas. Os linfócitos (células efetoras, 100 /xL)isolados por meio de separação Ficoll-Hypaque (conformedescrito acima) foram, então, adicionados às células-alvo para se obter uma razão entre células efetoras ecélulas alvo (E:A) de 10:1. Após 10 horas de incubaçãoa 37°C, foram adicionados 2 0 ^L de um substratocontendo 5 μg de brometo de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT). A mistura foiincubada durante 4 horas a 37°C, após os quais o MTTnão-metabolizado foi removido por aspiração. Oscristais de formazan foram dissolvidos mediante aadição de 2 00 μΙ* de etanol a 95%. A densidade óptica(DO) foi medida em 570 nm, utilizando-se um leitor demicroplacas. A porcentagem de morte celular específicapara célula NK foi calculada conforme exposto a seguir:Citotoxicidade específica (%) = 100 χ {l - [(DO de células-alvo e células efetoras

- DO de células efetoras)/(DO de células-alvo)]}

3. Resposta de anticorpos a vacinas: Os indivíduos deteste receberam um conjunto (até 5) de vacinas após aomenos 12 semanas de alimentação probiótica ou decontrole. As vacinas podem ser uma mistura de vacinasnovas e redundantes. Alguns exemplos não-limitadores deconjuntos de vacina que podem ser usado incluemmisturas de vacinas preparadas por Fort Dodge AnimalHealth. Alguns exemplos não-limitadores de vacinasadequadas ao uso na presente invenção incluem cinomosefelina, adenovírus, coronavírus, parainfluenza, eparvovírus. A história de vacinação do indivíduodeterminará as vacinas a serem utilizadas. Asquantidades, no sangue, de anticorpos específicos paraas vacinas administradas são medidas durante 3 semanas,sendo comparadas a duração e a intensidade da respostanos grupos com alimentação de controle e probiótica.

4. Hipersensibilidade de tipo retardado: Um método invivo não-invasivo para avaliação do estado do sistemaimune. Este teste compreende uma injeção intradérmicado mitogênio policlonal fitoemaglutinina (PHA) emcombinação com eritrócitos de ovelha, uma vacinamultivalente, histamina (100 μ1> de fosfato dehistamina a 0,0275 g/L, Greer, Lenoir, NC), ou PBS(100 μΐι de solução salina tamponada com fosfato a8,5 g/L, Sigma). A resposta imunológica ao antígeno éregistrada como espessura da dobra de pele, usandocalibres, em intervalos de tempo de 0, 24, 48 e 72horas após a injeção. Um aumento na espessura da dobrade pele indica uma maior resposta dehipersensibilidade, que deve diminuir mediante otratamento com as bactérias da presente invenção.

Métodos adicionais para a determinação do efeitodas bactérias Bifidobacteria da presente invenção sãodescritos em US 6.133.323 e US 6.310.090.

Além disso, a melhoria quanto aos efeitos doenvelhecimento pode ser determinada mediante o uso deabsorptometria de dupla emissão de raios X ou tomografiacomputadorizada para medir a composição corporal, inclusivemassa corporal gorda, massa corporal magra e conteúdomineral ósseo. De modo similar, esse método pode ser usadopara determinar alterações de anatomia como perda de peso oudensidade óssea em indivíduos, após infecção.

As Bifidobacteria da presente invenção também podemser usadas em um método para redução dos níveis de estresseem animais de estimação. As concentrações sangüíneas dehormônios de estresse, inclusive epinefrina, norepinefrina,dopamina, cortisol e proteína C-reativa e outras proteínas defase aguda podem ser medidas para determinar os níveis deestresse e sua redução ou manutenção. Esses hormônios sãoreconhecidos biomarcadores de estresse, e podem serprontamente medidos mediante o uso de técnicas conhecidaspelos versados na técnica. Adicionalmente, a medição diretado tamanho adrenal como um marcador in vivo da atividade doeixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal pode ser feita por meiode imagens de tomografia computadorizada.

Além disso, a manutenção ou a melhoria da saúdeda pele e/ou da pelagem de animais de estimação, inclusivede doença atópica da pele, pode ser medida mediante o usode avaliações de pele e pelagem conduzidas por doisindivíduos treinados. Exemplos de critérios examinadosdurante essas avaliações incluem:

a) índice de queda de pêlos: Um índice de queda de pêlos éatribuído a cada indivíduo de teste mediante a coletade pêlos produzidos durante uma sessão de escovaçãopadronizada. Os pêlos são retidos e pesados, e osindivíduos de controle e de teste são comparados.

b) Avaliações subjetivas de pele/pelagem: Examinadorestreinados avaliam subjetivamente as condições de pele epelagem, mediante a determinação de queda de pêlos,caspa, brilho, uniformidade, maciez e densidade.

c) Avaliação funcional da pele: A função de barreira dapele pode ser avaliada mediante a esfregação dasuperfície da pele com uma gaze encharcada em acetona.

Essa técnica perturba, de maneira eficaz, a função debarreira da pele ao remover da camada córnea camadascelulares individuais, juntamente com as frações delipídio a estas associadas. A perturbação da barreira équantificada por meio da medição do aumento na perdatransepidérmica de água (PTEA) e do grau de vermelhidãodo local ofendido, mediante o uso de métodos conhecidospelos versados na técnica. As pontuações paravermelhidão (eritema) são obtidas mediante o uso dosistema de câmera e iluminação anteriormente descrito.

Os registros de PTEA e as pontuações de vermelhidão sãoobtidos imediatamente antes e depois da perturbação,bem como nos pontos finais âs cinco e às 24 horas, paraavaliar as propriedades de proteção e cura da pele.

0 tratamento ou prevenção de diarréia em animaisde estimação pode ser medido utilizando-se um método depontuação das fezes. A pontuação das fezes pode serregistrada diariamente, de acordo com as seguintesdiretrizes, sendo os grupos de controle e de testecomparados antes e depois da alimentação com as bactérias,de acordo com a presente invenção.

Pontuação: 5 Extremamente seca

Estas fezes são duras e não aderem a superfícies.Estas fezes rolam quando empurradas. Não são produzidasindentações quando estas fezes são apanhadas. Estas fezessão freqüentemente defecadas em grupos de unidadesindividuais, em vez de uma unidade completa. Estas fezesmantêm seu formato original após a coleta.

Pontuação: 4 Firme (fezes ideais)

Estas fezes são firmes, bem formadas ecilíndricas. Estas fezes não se rompem facilmente quandoapanhadas. Estas fezes podem deixar resíduos sobresuperfícies e luvas. Estas fezes são freqüentementedefecadas como uma só unidade. Estas fezes mantêm seuformato original após a coleta.Pontuação: 3 Mole, com formato

Estas fezes são moles, no entanto têm formatosdefinidos. Estas fezes se rompem facilmente e,definitivamente, deixam resíduos sobre superfícies e luvas.

Estas fezes freqüentemente perdem seu formato original apósa coleta. Estas fezes freqüentemente se apresentam emconjunto com outra pontuação, mas podem compreender atotalidade da amostra.

Pontuação: 2 Mole, sem formato

Estas fezes são moles e não apresentam formatocilíndrico. 0 formato freqüentemente associado a um "tipo 2"é aquele conhecido como "excremento de vaca". Estas fezesperdem o formato original quando coletadas, edefinitivamente deixam resíduos sobre superfícies e luvas.

Estas fezes freqüentemente se apresentam em conjunto comoutra pontuação, mas podem compreender a totalidade daamostra. Estas amostras podem se espalhar por uma área devários centímetros.

Pontuação: 1 Líquida

As fezes com esta pontuação sempre parecerãolíquidas, e pode ou não haver a presença de matériaparticulada. Estas fezes são freqüentemente defecadas emgrupos de montes, em vez de uma unidade completa. Muco estáfreqüentemente presente nas amostras deste tipo. As amostrasdeste tipo de fezes são de coleta muito difícil, e sempredeixa resíduos em superfícies e luvas. Estas amostras podemse espalhar por uma área de vários centímetros.Além disso, são registradas outras observações,inclusive: presença de sangue, de objetos estranhos ou demuco nas fezes.

Além disso, o tratamento de infecçãogastrointestinal em animais de estimação pode compreender aotimização da ecologia microbiana dos mesmos. A otimizaçãoda ecologia microbiana em animais de estimação compreende,de preferência, a redução dos teores de bactériaspatogênicas nas fezes dos mesmos.

Os teores de bactérias patogênicas presentes nas fezes de animais de estimaçãopodem ser enumerados mediante o uso do método padrão decontagem em placa, conhecido pelos versados na técnica. Commais preferência, as bactérias patogênicas são selecionadasa partir do grupo consistindo em Clostridia, Escherichia,Salmonella, bacteroides e combinações das mesmas. Algunsexemplos não-limitadores de cepas de bactérias patogênicasadequadas incluem C. perfringens, C. difficile, Eschericiacoli, Salmonella typhimurium e combinações destas.

0 método de uso das bactérias da presenteinvenção pode incluir, também, o tratamento profilático outerapêutico do trato urinário de mamíferos, de preferênciaanimais de estimação. Alguns exemplos não-limitadores detratamentos do trato urinário incluem tratamento ouprevenção de infecções do trato urinário, tratamento ouprevenção de doenças renais, inclusive pedras no tratourinário, tratamento ou prevenção de infecções na bexiga, esimilares. Sem se ater à teoria, acredita-se que asbactérias Bifidobacteria da presente invenção sejam úteisna prevenção dessas doenças como resultado de suacapacidade para degradar o ácido oxálico, conformedemonstrado in vitro. 0 ácido oxálico é um subproduto dometabolismo urinário que pode formar precipitadosinsolúveis, os quais resultam em infecções nos rins, nabexiga e em outras partes do trato urinário. Ao degradar oácido oxálico e, portanto, potencialmente evitar suaprecipitação e acúmulo no trato urinário, as bactérias dapresente invenção podem tratar e prevenir infecções eoutras doenças do trato urinário. A degradação do ácidooxálico pode ser medida in vitro mediante o uso do kit paratestes de ácido oxálico cat # 755699, disponívelcomercialmente junto à Boehringer Mannheim/R-Biopharm.

As Bifidobacteria da presente invenção podem serusadas em um método para a melhoria ou manutenção da saúde deanimais de estimação, compreendendo a melhoria da digestão defibras. A melhoria da digestão de fibras é desejável, poispromove a proliferação das ditas bactérias probióticas, bemcomo da microflora endõgena benéfica, o que auxilia nasupressão de algumas bactérias potencialmente patogênicas.

Além disso, uma diminuição na quantidade de metabólitostóxicos e enzimas nocivas que resultam da fermentaçãocolônica foi documentada em seres humanos (Tomomatsu, H."Health effects of oligosaccharides", (1994) Food Technol, 48,61-65). A digestão de fibras pode ser determinada mediante ouso do método descrito em Vickers et al. (2001), "Comparisonof fermentation of selected fructooligosaccharides and otherfiber substrates by feline colonic microflora", Am. J. Vet.Res. 61 (4), 609-615, exceto pelò fato de que em vez deinocular usando amostras fecais diluídas, cada experimentoutilizou culturas puras das cepas bacterianas em questão.

As cepas probióticas felinas da presente invençãopodem ser usadas para reduzir o odor das fezes e da urina e,concomitantemente, na caixa de areia, mediante a redução daprodução de compostos, nas fezes e na urina, que causam odor.

Alguns exemplos não-limitadores de compostos causadores deodor incluem amônia, indóis, fenóis, aminas, ácidos graxos decadeia ramificada e compostos voláteis contendo enxofre. Semse ater à teoria, acredita-se que a redução dos teores dessescompostos nas fezes ou na urina de um animal de estimaçãoreduz o odor associado às mesmas. Além disso, para animais deestimação que usem caixa de areia, há uma diminuiçãoconcomitante no odor da caixa de areia.

O método de uso das bactérias formadoras de ácidoláctico da presente invenção tipicamente envolve o consumooral pelo animal. 0 consumo oral pode ocorrer como parte daingestão dietária normal, ou sob a forma de um suplemento àmesma. 0 consumo oral tipicamente ocorre ao menos uma vez pormês, de preferência ao menos uma vez por semana e, com maispreferência, ao menos uma vez por dia. As bactériasformadoras de ácido láctico da presente invenção podem seradministradas ao animal de estimação em uma quantidadeterapeuticamente eficaz para manter ou melhorar a saúde doanimal, de preferência um animal de estimação. Para uso napresente invenção, o termo "quantidade terapeuticamenteeficaz", no que se refere às bactérias formadoras de ácidoláctico, significa aquela quantidade de bactérias que ésuficiente para proporcionar o efeito ou benefício desejado aum animal hospedeiro precisando de tratamento, porém baixa osuficiente para evitar efeitos adversos como toxicidade,irritação ou resposta alérgica, proporcionalmente a umarelação risco/benefício razoável quando usada do modoindicado na presente invenção. A "quantidade terapeuticamenteeficaz" específica irá variar conforme fatores como acondição específica sendo tratada, as condições físicas dousuário, a duração do tratamento, a natureza da terapiasimultânea (caso haja), a forma de dosagem específica a serutilizada, o veículo empregado, a solubilidade da forma dedosagem, e o regime de dosagem específico.

De preferência, as bactérias formadoras de ácidoláctico são fornecidas ao animal de estimação em uma dosena faixa de l,0E+04 a 1,0E+14 UFC por dia e, com maispreferência, na faixa de l,0E+06 a 1,0E+12 UFC por dia. Acomposição pode conter, de preferência, ao menos 0,001% debactérias formadoras de ácido láctico do gêneroBifidobacteria, na faixa de l,0E+04 a 1,0E+12 ufc/g,obteníveis mediante isolamento a partir de trato GI felinoressecado e lavado. As bactérias formadoras de ácidoláctico podem ser administradas ao animal em sua formaviável, sob a forma de células mortas, ou como destilados,isolados ou outras frações dos produtos de fermentação dasbactérias formadoras de ácido láctico da presente invenção,ou qualquer mistura desses materiais.De preferência, as bactérias formadoras de ácidoláctico, ou uma fração purificada ou isolada das mesmas,são usadas para preparar uma composição destinada a manterou melhorar a saúde de um animal. Conforme indicado acima,a composição pode ser parte da ingestão dietária normal, oupode ser um suplemento. Nos casos em que a composição fazparte da ingestão dietária normal, esta pode estar sob aforma de um alimento seco para animais, como biscoitos ouração, um alimento à base de grãos processados, um alimentoúmido para animais, iogurtes, molhos, itens mascáveis,petiscos e similares.

Essas composições podem compreender outroscomponentes. Outros componentes são benéficos para inclusãonas composições usadas na presente invenção, mas sãoopcionais para os propósitos da invenção. Por exemplo, ascomposições alimentícias são, de preferência,nutricionalmente balanceadas. Em uma modalidade, ascomposições alimentícias podem compreender, com base namatéria seca, de cerca de 20% a cerca de 50% e, depreferência, de cerca de 22% a cerca de 40% de proteínabruta, em peso da composição alimentícia. 0 material deproteína bruta pode compreender qualquer material tendo umteor de proteínas de ao menos cerca de 15% em peso, sendoque alguns exemplos não-limitadores destes incluemproteínas vegetais como feijão soja, caroço de algodão eamendoim, e proteínas animais como caseína, albumina etecido cárneo. Alguns exemplos não-limitadores de tecidocárneo útil à presente invenção incluem carne fresca efarinhas secas ou processadas, como farinha de peixe,farinha de aves, farinha de carne, farinha de ossos esimilares. Outros tipos de fontes adequadas de proteínabruta incluem glúten de trigo ou de milho, e proteínasextraídas de fontes microbianas, como levedura.

Além disso, as composições alimentícias podemcompreender, com base na matéria seca, de cerca de 5% a cercade 35% e, de preferência, de cerca de 10% a cerca de 30% degordura, em peso da composição alimentícia. Além disso, ascomposições alimentícias compreendendo as bactériasformadoras de ácido láctico da presente invenção podem,também, compreender de cerca de 4% a cerca de 25% de fibradietária total. As composições podem, também, compreendermúltiplas fontes de amido, conforme descrito em W099/51108.

As composições da presente invenção podem conter,ainda, uma fonte de carboidrato. São fontes ilustrativas osgrãos ou cereais como arroz, milho, milo, sorgo, cevada,alfafa, trigo e similares. Além disso, as composiçõestambém podem conter outros materiais, como soro de leiteseco e outros subprodutos lácteos.

As composições compreendendo as bactérias dapresente invenção podem, também, compreender um prebiótico.

O termo "prebiótico" inclui substâncias ou compostos que sãofermentados pela flora intestinal do animal de estimação e,conseqüentemente, promovem a proliferação ou odesenvolvimento de bactérias formadoras de ácido láctico notrato gastrointestinal do dito animal, em detrimento debactérias patogênicas. O resultado dessa fermentação é umaliberação de ácidos graxos, em particular ácidos graxos decadeia curta, no cólon. Isto tem o feito de reduzir o valorde pH no cólon. Alguns exemplos não-limitadores deprebióticos adequados incluem oligossacarídeos, como inulinae seus produtos de hidrólise conhecidos comofrutooligosacarídeos, galactooligosacarídeos,xilooligossacarídeos, ou oligoderivados de amido. Osprebióticos podem ser fornecidos sob qualquer formaadequada. Por exemplo, o prebiótico pode ser fornecido sob aforma de material de origem vegetal contendo essas fibras.

Os materiais de origem vegetal adequados incluem aspargo,alcachofras, cebolas, trigo ou chicória, bem como resíduosdesses materiais de origem vegetal. Alternativamente, afibra prebiótica pode ser fornecida sob a forma de umextrato de inulina, sendo adequados, por exemplo, osextratos de chicória. Os extratos de inulina adequados podemser obtidos junto à Orafti SA de Tirlemont 3300, Bélgica,sob a marca registrada "Raftiline". Por exemplo, a inulinapode ser fornecida sob a forma de Raftiline (g) ST, que é umpó branco fino que contém de cerca de 90% a cerca de 94%, empeso, de inulina, até cerca de 4%, em peso, de glicose efrutose, e de cerca de 4% a 9%, em peso, de sacarose.

Alternativamente, a fibra pode estar sob a forma de umfrutooligossacarídeo como aquele obtido junto à Orafti SA deTirlemont 33 00, Bélgica, sob a marca registrada "Raftilose".Por exemplo, a inulina pode ser fornecida sob a forma deRaftilose (g) P95. De outro modo, os frutooligosacarídeospodem ser obtidos pela hidrólise da inulina por meio demétodos enzimáticos, ou mediante o uso de microorganismos.

Para .alimentos secos para animal de estimação, umprocesso adequado é a cocção com extrusão, embora assamentoe outros processos adequados possam ser usados. Quandocozido com extrusão, o alimento seco para animais deestimação é geralmente fornecido sob a forma de uma ração.

Se for usado um prebiótico, este pode ser misturado, antesdo processamento, aos demais ingredientes do alimento secopara animais de estimação. Um processo adequado é descritono Pedido de Patente Européia N0 0850569. Se for usado ummicroorganismo probiótico, é melhor que este seja aplicadocomo um revestimento ou um recheio no alimento seco paraanimais de estimação. Um processo adequado é descrito napublicação de patente européia número EP 0 862 863.

Para alimentos úmidos, os processos descritos naspatentes U.S. N0 4.781.939 e 5.132.137 podem ser usadospara produzir produtos cárneos simulados. Outrosprocedimentos para a produção de produtos em pedaços tambémpodem ser usados como, por exemplo, cozimento em um forno avapor. Alternativamente, produtos em filão podem serproduzidos mediante a emulsificação de um material cárneoadequado para produzir uma emulsão de carne, adicionando-seum agente gelificante adequado e aquecendo-se a ditaemulsão de carne, antes de acondicionar a mesma em latas ououtros recipientes. As composições alimentícias úmidastípicas podem compreender de cerca de 5% a cerca de 15% deproteína, de cerca de 1% a cerca de 10% de gordura, e decerca de 1% a cerca de 7% de fibras. Exemplos não-limitadores de ingredientes que podem ser usados emcomposições alimentícias úmidas incluem frango, peru, carnebovina, pescado branco, caldo de frango, caldo de peru,caldo de carne bovina, fígado de frango, quirela de arroz,grits de milho, farinha de peixe, ovos, polpa de beterraba,cloreto, farelo de linhaça, cordeiro, subprodutos de carnebovina, subprodutos de frango e misturas desses itens.

Em outra modalidade, as composições de suplementocomo biscoitos, itens mascáveis e outros petiscos podemcompreender, com base na matéria seca, de cerca de 20% acerca de 60% de proteína, ou de cerca de 22% a cerca de 40%de proteína, em peso da composição de suplemento. Comooutro exemplo, as composições de suplemento podemcompreender, com base na matéria seca, de cerca de 5% acerca de 3 5% de gordura, ou de cerca de 10% a cerca de 3 0%de gordura, em peso da composição de suplemento. Ascomposições alimentícias e de suplemento destinadas ao usopor felinos são de conhecimento comum na técnica.

Os alimentos para animal de estimação podemconter outros agentes ativos, como ácidos graxos de cadeialonga e zinco. Os ácidos graxos de cadeia longa adequadosincluem ácido alfa-linoléico, ácido gama-linolênico, ácidolinoléico, ácido eicosapentanóico e ácido docosaexanóico.

Os óleos de peixe são uma fonte adequada de ácidoseicosapentanóicos e ácido docosaexanóico.

0 óleo de borragem, o óleo de semente de groselhanegra e o óleo de prímula são fontes adequadas de ácidogama-linolênico. Os óleos de cártamo, os óleos de girassol,os óleos de milho e os óleos de soja são fontes adequadasde ácido linoléico. Esses óleos também podem ser usados nossubstratos para revestimento mencionados acima. O zincopode ser fornecido de diversas formas adequadas, porexemplo como sulfato de zinco ou oxido de zinco. Alémdisso, muitos ingredientes comumente usados em alimentospara animal de estimação são fontes de ácidos graxos e dezinco. Tem sido observado que a combinação de chicória,como uma fonte de prebiótico, com um óleo rico em ácidolinoléico, como o óleo de soja, proporciona benefíciosinesperados, que sugerem um efeito sinérgico.

Nos casos em que a composição está sob a forma deum molho, esta compreende, de preferência, ao menos 10% deum caldo, sendo que alguns exemplos não-limitadores destesincluem caldos de vegetais, de carne bovina, de frango oude presunto. As composições de molho típicas podemcompreender de cerca de 0,5% a cerca de 5% de proteínabruta, de cerca de 2% a cerca de 5% de gordura bruta, e decerca de 1% a cerca de 5% de fibras.

Alguns outros exemplos não-limitadores desuplementos adequados ao uso na presente invenção incluempós, suspensões de óleo, suspensões à base de leite equeijos, e composições à base de manteiga de cacau bem comopílulas ou cápsulas. Nos casos em que a composição está soba forma de uma pílula, agentes de ligação adequados sãonecessários para manter a pílula sob uma forma sólida ecomprimida. Alguns exemplos não-limitadores de agentes deligação adequados incluem as gomas naturais como gomaxantana, pectinas, lecitinas, alginatos e outras conhecidaspelos versados na técnica. Nos casos em que a composiçãoestá sob a forma de uma cápsula, esta é de preferênciaencapsulada mediante o uso de tecnologias conhecidas pelosversados na técnica. Alguns exemplos não-limitadores demateriais de encapsulação adequados incluem álcoolpolivinílico (PVA), polivinil pirrolidona (PVP), alginatos egelatina. As composições à base de iogurte podem compreenderde cerca de 1% a cerca de 5% de proteína, de cerca de 10% acerca de 20% de carboidrato, de cerca de 1% a cerca de 5% defibra, de cerca de 1% a cerca de 5% de gordura e de cerca de50% a cerca de 90% de um veículo líquido, como leite.

Exemplos

Esses exemplos são fornecidos para ilustrar ainvenção, e não se destinam a limitar, em nenhum aspecto, oescopo da mesma.

Exemplo 1: isolamento de bactérias formadoras deácido láctico a partir de trato gastrointestinalfelino

Amostras de intestinos de felino foram obtidas apartir de gatos saudáveis apresentados a veterinárioslocais para eutanásia iniciada e aprovada pelos donos dosanimais. Todos os animais estavam saudáveis e isentos dedoenças. Foram dissecados o cólon, o cólon médio, o ceco eo íleo de cada gato, de maneira a expor a mucosa.

Os sobrenadantes foram removidos após agitação dotecido mucoso (em vórtice durante 1 minuto) e homogeneizaçãomecânica do tecido. Cada sobrenadante foi colocado em umaplaca de ágar do tipo de Man Rogosa Sharpe (MRS) agar. Estasforam incubadas anaerobicamente, mediante o uso de umsistema Anerocult GasPak, durante 4 8 horas a 37°C. Ascolônias isoladas a partir das placas foram reaplicadas poresfregaço em MRS, e novamente cultivadas anaerobicamente sobas mesmas condições. As colônias isoladas foram reaplicadaspor esfregaço mais 4 vezes, com a finalidade de purificaruma cepa única. Foram avaliadas a morfologia e a aparênciamicroscópica da colônia. Os isolados adequados foramtestados quanto a reação de Gram e atividade de catalase. Aidentificação de bastonetes Gram-positivos, catalase-negativos, foi realizada mediante teste de API (API 50CHL,BioMerieux). As células colhidas foram lavadas duas vezescom 0,05M de tampão de fosfato (pH 6,5) e cisteina HCl(500 mg/L), sendo a lavagem seguida de sonicação. Osfragmentos celulares foram removidos por centrifugação. Ossobrenadantes foram incubados com NaF (6 mg/mL) e Naiodoacetato (10 mg/mL) durante 3 0 minutos a 37°C. A reaçãofoi interrompida mediante incubação com hidroxilamina HCl(pH 6,5) durante 10 minutos à temperatura ambiente. 0desenvolvimento de cor foi monitorado em seguida à adição deHCl (4M) , FeCl3.6H20 (5% (p/v) em 0, IM HCl) e frutose-6-fosfato (sal de Na) . A formação de acetil fosfato a partirde frutose-6-fosfato foi evidenciada pela cor avermelhadaformada pelo quelato férrico de seu hidroximato.Exemplo 2: triagem quanto à atividade microbicidaCada uma das cepas de bactérias formadoras deácido láctico foi incubada anaerobicamente em caldo MRS.2 μΐ. de cada cultura foram aplicados em pontos sobre placasde ágar MRS, as quais foram incubadas anaerobicamente de umdia para outro. Salmonella typhimurium e B. Colienteropatogênica (ExPEC) foram pré-cultivadas de um dia paraoutro, e 100 μΐ foram inoculados em agar fundido (1% v/v) .

Essa cultura indicadora foi vertida sobre a superfície dasplacas de MRS inoculadas. Após incubação de um dia paraoutro, as zonas de inibição em redor da colônia probióticaforam medidas. Todos os experimentos foram realizados emduplicata, em três ocasiões separadas. Além disso, aincorporação do tampão de 2% de betaglicerofosfato ao ágarpossibilitou determinar a contribuição da produção de ácidoà inibição in vitro de patógenos que foi observada.

Os dados apresentados na Tabela 2 demonstramclaramente que as cepas de bactérias formadoras de ácidoláctico da presente invenção, obteníveis medianteisolamento a partir de trato GI felino ressecado e lavado,têm significativa atividade microbicida In vitro,indicadora de uma potencial atividade probiótica.

Tabela 2

<table>table see original document page 36</column></row><table>Exemplo 3: medições in vitro de sobrevivência ecolonização

Tolerância a pH

As células bacterianas foram colhidas de culturasincubadas de um dia para outro, lavadas duas vezes em tampãode fosfato (pH 6,5) e ressuspensas em caldo de MRS/TPYajustado com IM HCl até pH 2,5. As células foram incubadasanaerobicamente a 37°C, e sua sobrevivência foi medida aintervalos de 0, 30, 60, 120, 240 e 360 minutos, mediante ouso do método de contagem em placas conhecido pelos versadosna técnica. A Tabela 3 sumariza esses dados por cepa.

Tabela 3

Sobrevivência de cepas em um ambiente de baixo pH (pH 2,5).

Os dados são contagens de Iog UFC.

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Resistência à bílis

As cepas bacterianas foram aplicadas poresfregaço sobre ágar MRS suplementado com bílis de porco(Sigma) a 0,5%, 1% e 5% (p/v). As placas foram incubadas a370C sob condições anaeróbicas, e a proliferação foiregistrada após 48 horas. A proliferação foi comparada complacas de controle por um observador experiente, e aproliferação das colônias foi descrita como:

Negativa (0) - nenhuma proliferação,+ (1) - proliferação translúcida nebulosa (<33%em placas de controle com 0% de bílis),

++ (2) - proliferação definida, porém não tão boacomo nas placas de controle (>33%, mas <66%);

+++ (3) - proliferação equivalente à das placas decontrole (>66%).

Uma vez que a proliferação das colônias na presençade sais biliares é comparada às placas de controle, osdescritores de proliferação recebem valores numéricos de 0,I7 2 ou 3 (-, +, ++ou +++, respectivamente) e são, então,expressos como uma porcentagem, em que 3 representa 100%.

A Tabela 4 demonstra que a Bifidobacterium dapresente invenção claramente apresenta uma resistência asais biliares, sendo capazes de proliferar e formarcolônias em níveis de ao menos 66%, na maioria dos casos,quando expostos a 0,5% de sais biliares de porco.

Tabela 4

Sobrevivência de cepas em diversas concentrações de bílisde porco

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Além disso, para avaliar quaisquer diferenças nacapacidade das cepas para colonizar o trato GI de gatos, ascepas bacterianas foram aplicadas por esfregaço sobre ãgarMRS suplementado com bílis felina a 0,5%, 1% e 2%(peso/volume) . A bílis felina foi obtida a partir de gatossendo submetidos a endoscopia em um ambiente clínico duranteum procedimento não-terminal. As placas foram incubadas a37°C sob condições anaeróbicas, e a proliferação foiregistrada após 48 horas. A proliferação foi comparada complacas de controle por um observador experiente, e aproliferação das colônias foi descrita como:

Negativa (0) - nenhuma proliferação;

+ (1) - proliferação translúcida nebulosa (<33% emplacas de controle com 0% de bílis);

+ + (2) - proliferação definida, porém não tão boacomo nas placas de controle (>33%, mas <66%);

+++ (3) - proliferação equivalente à das placasde controle (>66%).

Uma vez que a proliferação das colônias na presençade sais biliares é comparada às placas de controle, osdescritores de proliferação recebem valores numéricos de 0,1, 2 ou 3 (-, +, ++ ou + + + , respectivamente) e são, então,expressos como uma porcentagem, em que 3 representa 100%.

A Tabela 5 demonstra que a Bifidobacterium dapresente invenção claramente apresenta uma resistência asais biliares de felino, sendo capazes de proliferar eformar colônias em níveis de ao menos 66%, na maioria doscasos, quando expostos a 1% de sais biliares de felino.

Tabela 5

Sobrevivência de cepas em diversas concentrações de bílisfelina

<table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>

Adesão a células epiteliais intestinais

A linhagem de células epiteliais humanas HT-29foi usada para avaliar as propriedades de adesão das cepasselecionadas. As células epiteliais foram cultivadas demodo rotineiro, sob a forma de camada única em frascos de75 cm2 para cultura de tecidos, a 37°C em uma atmosferaumidifiçada contendo 5% de CO2 em meio mínimo essencial deDulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal de bezerro(FCS) , penicilina/estreptomicina, glutamina e fungizona.

Para propósitos do experimento, as células epiteliais foramsemeadas a uma concentração de 5 χ IO5 células/mL (3 mL devolume total) por cavidade, em placas de cultura com 6cavidades (Sarstedt). Após incubação durante 7 dias, parapermitir diferenciação, as camadas únicas epiteliais foramlavadas com meio isento de antibióticos, contendo 10% deFCS. As suspensões bacterianas mais/em DMEM isento deantibióticos foram adicionadas a cada cavidade, e ascélulas foram incubadas durante 90 minutos a 37°C. Após aincubação, as camadas únicas foram lavadas três vezes comPBS. As células epiteliais foram lisadas em H20desionizada, e o número de bactérias aderentes foi obtidomediante o uso do método de contagem em placas conhecidopelos versados na técnica. A adesão foi expressa como umaporcentagem do número de bactérias inicialmente aplicadas àplaca. A Bifidobacteria longum AHF534D apresentou um nívelde adesão de 1,7%, enquanto a Bifidobacteria longum AHF1231apresentou um nível de adesão de 44,1%.

Exemplo 4: seqüenciamento de polinucleotídeointergênico 16s-23s

Os isolados de Bifidobacterium felina foramcentrifugados em tubos de estoque, e os peletes resultantesforam lisados em 100 de solução para extração e 25 ^L desolução para preparação de tecidos (Sigma, kit XNAT2) , eincubados durante 10 minutos à temperatura ambiente. Asamostras foram, então, incubadas durante 5 minutos a 95°C e,então, foram adicionados 100 ^L de solução paraneutralização (kit XNAT2) . A solução de DNA genômica foi,então, quantificada mediante o uso de um espectrofotômetroNanodrop, e armazenada a 4°C.

O PCR foi realizado mediante o uso de iniciadoresde espaçador intergênico (IGS), IGS L: 5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3' e IGS R: 5' -CTGGTGCCAAGGCATCCA-3'(Bridgidi et al. , 2000, System Appl. Microbiol., 23, 391-399(2000)) . As condições de ciclo foram de 94°C durante 3minutos (1 ciclo), 94°C durante 30 segundos, 53°C durante 30segundos, e 720C durante 3 0 segundos (28 ciclos). A reaçãode PCR continha 4 μL (50 ng) de DNA, mistura de PCR (kitXNAT2) , 0,4 μΜ de iniciador IGS LeR (MWG Biotech,Alemanha) . As reações de PCR foram realizadas em umtermociclo Eppendorf. Os produtos de PCR (10 /zL) forampassados, juntamente com um marcador para peso molecular(100 bp Ladder, Roche) por um gel a 2% de agarose manchadocom EtBr em TAE, para determinar seu perfil de IGS.Os produtos de PCR da Bifidobacterium (bandaúnica) foram purificados mediante o uso do kit depurificação Promega Wizard PCR.

Os produtos de PCR purificados foram seqüenciadosmediante o uso de seqüências iniciadoras (acima) para aregião de espaçador intergênico. Os dados de seqüênciaforam, então, pesquisados contra a base de dados denucleotídeos do NCBI, para determinar a identidade da cepapor homologia de nucleotídeos.

Após o seqüenciamento, as seqüências obtidas paraas quatro cepas depositadas foram comparadas à base de dadosde seqüências "BLAST", disponível online emhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ para verificação dehomologia com outras seqüências bacterianas 16s-23sdepositadas. As similaridades mais próximas paraBifidobacterium longum NCIMB 41290 (AHF5340) eBifidobacterium longum NCIMB 41291 (AHF1231) foi a cepaBifidobacterium longum NCC2705, tendo um grau de homologiapercentual de 95% e 94%, respectivamente.

Exemplo 5: exemplos de composição

Os Exemplos de 1 a 4 são exemplos de composiçõesde ração seca compreendendo a Bifidobacteria pseudolongumprobiótica da presente invenção.

<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>

Os Exemplos de 5 a 7 são exemplos de composiçõesúmidas de alimento para animais de estimação compreendendoas Bifidobacteria longum probióticas da presente invenção.

<table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table>

Os Exemplos de 8 a 10 são exemplos de composiçõesde suplemento à base de iogurte compreendendo asBifidobacteria longum probióticas da presente invenção.

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Todos os documentos citados na Descrição Detalhadada Invenção são, em sua parte relevante, aqui incorporadaspor referência, e a citação de qualquer documento não deveser interpretada como admissão de que este representetécnica anterior com respeito â presente invenção.

Embora modalidades específicas da presenteinvenção tenham sido ilustradas e descritas, deve ficaróbvio aos versados na técnica que várias outras alterações emodificações podem ser feitas sem que se desvie do caráter eâmbito da invenção. Portanto, pretende-se cobrir nasreivindicações anexas todas essas alterações e modificaçõesque se enquadram no escopo da presente invenção.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Alimentary HealthThe Iams CompanyBoiIeau, ThomasKiely, BarryMacSharry, JohnO1Mahony, LiamSunvold, Gregory

<120> Bifidobactéria probiótica felina

<130 > P171P2&

<140> Ainda não designada<141> 2005-06-21

<16Q> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 500

<212> DNA

<213> Bifidobacterium longum

<220 >

<221> miscelânea

<222> (3) . . (3)

<223> η is a, c, g, or t

<22 0 >

<221> miscelânea

<222> (6) . . (6)

<223> η is a, c, g, or t<220>

<221> miscelânea

<222> (475) . . (475)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 1 tcnggngtgc tgggatacct cctttctacg gagaatgcag gatgccgttc ggcgtccggtgcgaaccctc ccgcgcgatg gtcgcgtgtg gacgggttgc tggtgtggaa gatgtcgttggctttgcccc gccggtcgtg cggtgggtgc cggggtggtg cggatgcgct tttgggctcccggatcgcca ccccaggctt ttgcctggcg cgattcgatg cccgtcgtgc ctgcgggccggccgtgtgcc ggtctggtcg gcgtggcggt gcgtggtggc ttgagaactg gatagtggacgcgagcaaaa caagattttt tttgtgtctt tgttttgctg ttgatttcga atcgaactctattgttcgtt tcgatcgttt tgtgatcatt tttagtgtga tgatttgtcg tctgggaatt

60120180

cqgatcqcca ccccagqctt ttqcctggcq cgattcgatg cccgtcgtgc ctgcgggccg 240

300360420tgctagagga atcttgcggc gcatgcatgt tgcgtgtgtg ttgcttgcaa gggcntatgg 480tggatgcctt gccacccaga 500

<210> 2<211> 500<212> DNA

<213> Bifidobacterium Iongum

<220 >

<221> miscelânea

<222> (3) . . (3)

<223> η is a, c, g, or t

<220 >

<221> miscelânea

<222> (6)..(6)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (441) . . (441)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (452) . . (452)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222> (475)..(475)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> miscelânea

<222 > (485) . . (485)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 2

tcnggngtgc tggggatacc tcctttctac ggagaatgca ggatgctgtt cggcgtccgg 60

tgcgaaccct cccgcgcggt ggtcgcgtgt ggacgggttg ctggtgtgga agatgtcgtt 120

ggctttgccc cgccggtcgt gcggtgggtg ccggggtggt gcggatgcgc ttttgggctc 180

ccggatcgcc accccaggct tttgcctggc gcgattcgat gcccgtcgtg cctgcgggcc 240

ggccgtgtgc cggtctggtc ggcgtggcgg tgcgtggtgg cttgagaact ggatagtgga 3 00

cgcgagcaaa acaagggttt tttgtgtctt tgttttgctg ttgatttcga atcgaactct 360

attgttcgtt tcgatcgttt tgtgatcatt tttagtgtga tgatttgtcg tctgggaatt 420

tgctagagga atcttgcggc ncatgcatgt tncgtgtgtg ttgcttgcaa gggcntatgg 480tggangcctt gccacccaga

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213 > Artificial

<220 >

<223> Iniciador da PCR artificial

<400> 3

gctggatcac ctcctttc

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência da PCR artificial

<400> 4

ctggtgccaa ggcatcca

Claims (63)

1. Cepa de bactérias formadoras de ácido láctico,do gênero Bifidobacteria, obtenível mediante isolamento apartir de trato gastrointestinal felino ressecado e lavado,caracterizada pelo fato de ter atividade probiótica.

2. Cepa, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ter a capacidade de sobreviver ecolonizar o trato gastrointestinal de um animal deestimação.

3. Cepa, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de apresentar ao menos 66% deproliferação quando cultivada na presença de sais biliaresa 0,5%.

4. Cepa, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de ser capaz de manter suaviabilidade após 1 hora sob pH 2,5.

5. Cepa, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ser uma espécie selecionada dogrupo consistindo em Bifidobacterium longum, Bifidobacteriumanimalis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacteriumbifidum, Bifidobaeterium infantis, Bifidobaeteriumthermophilum e misturas das mesmas.

6. Cepa, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo fato de ser da espécie Bifidobaeterium1ongum.

7. Cepa, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo decepas tendo uma seqüência de polinucleotídeo intergênico-16s-23s com mais de 95% de homologia com SEQ. ID N0 1, oumais de 94% de homologia com SEQ. ID N0 2.

8. Cepa, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupoconsistindo em Bifidobacterium longum NCIMB 41290(AHF5340) , Bifidobacterium longum NCIMB 41291 (AHF1231) ,mutantes das mesmas e misturas das mesmas.

9. Cepa, de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a cepa mutante é uma mutaçãonatural, geneticamente modificada ou induzida.

10. Cepa, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que o animal de estimação é um gato.

11. Método para manter ou aprimorar a saúde de umanimal de estimação, caracterizado pelo fato de compreendera administração oral de bactérias formadoras de ácidoláctico do gênero Bifidobacteria, obteniveis medianteisolamento a partir de trato gastrointestinal felinoressecado e lavado.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a cepa é selecionada com baseem sua capacidade para sobreviver e colonizar o tratogastrointestinal de animais de estimação.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a cepa apresenta ao menos66% de proliferação quando cultivada na presença de saisbiliares a 0,5%.

14. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a cepa é capaz de manter suaviabilidade após 1 hora sob pH 2,5.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a cepa é selecionada do grupoconsistindo em Bifidobacterium longum, Bifidobacteriumanimalis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacteriumbifidum, Bifidobaeterium infantis ou Bifidobaeteriumthermophilum e misturas das mesmas.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que a cepa é da espécieBifidobaeterium longum.

17. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que a cepa é selecionada dogrupo de cepas tendo uma seqüência de polinucleotídeointergênico 16s-23s com ao menos 95% de homologia com SEQ.ID N0 1, ou ao menos 94% de homologia com SEQ. ID N0 2.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a dita cepa é selecionada deBifidobacterium longum NCIMB 41290 (AHF5340), Bifidobacteriumlongum NCIMB 41291 (AHF231) ou mutantes das mesmas.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a cepa mutante é uma mutaçãonatural, geneticamente modificada ou induzida.

20. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar à regulação ouaprimoramento do sistema imune de animais de estimação.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de se destinar ao tratamento ouprevenção de doença autoimune em animais de estimação.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de se destinar ap tratamento ouprevenção de inflamações em animais de estimação.

23. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar a manter ou aprimorara saúde da pele e/ou da pelagem de animais de estimação.

24. Método, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de se destinar ao tratamento ouprevenção de doença atópica da pele em animais de estimação.

25. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar à melhoria ou reduçãodos efeitos do envelhecimento em animais de estimação.

26. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar a evitar a perda depeso durante e após ocorrência de infecção em animais deestimação.

27. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar ao tratamento ouprevenção de infecção gastrointestinal em animais deestimação.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de se destinar à otimização daecologia microbiana de animais de estimação.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de compreender a redução dos teoresde bactérias patogênicas nas fezes de animais de estimação.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de as ditas bactérias patogênicassão selecionadas a partir do grupo consistindo emClostridia, Escherichia, Salmonella, e misturas das mesmas.

31. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar ao tratamento ouprevenção de doenças do trato urinário em animais deestimação.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a dita doença do tratourinário compreende infecção do trato urinário.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a dita doença do tratourinário compreende pedras no trato urinário.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a dita Bifidobacteriaprobiõtica aumenta a degradação de ácido oxálico in vitro.

35. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de aumentar a digestão de fibras emanimais de estimação.

36. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de reduzir os níveis de estresse emanimais de estimação.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36,caracterizada pelo fato de que os ditos níveis de estressesão medidos mediante a determinação dos teores de hormôniosde estresse selecionados do grupo consistindo em epinefrina,norepinefrina, dopamina, cortisol, proteína C-reativa ecombinações desses itens.

38. Método, de acordo com a reivindicação de 11,caracterizado pelo fato de a cepa ser fornecida comoalimento a um animal, em qualquer quantidade na faixa de-,0E+04 a 1,OE+12 UFC/animal por dia.

39. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de se destinar ao preparo de umacomposição destinada a manter ou aprimorar a saúde doanimal de estimação.

40. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que o animal de estimação é umgato.

41. Composição, caracterizada pelo fato decompreender uma cepa de bactérias formadoras de ácidoláctico do gênero Bifidobacterial obtenível medianteisolamento a partir de trato gastrointestinal felinoressecado e lavado, com atividade probiótica, e um veículo.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que a cepa é selecionada com baseem sua capacidade para sobreviver e colonizar o tratogastrointestinal de animais de estimação.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de que a cepa apresenta ao menos-66% de proliferação quando cultivada na presença de saisbiliares a 0,5%.

44. Composição, de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de a cepa ser capaz de manter suaviabilidade após 1 hora sob pH 2,5.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que a cepa é uma espécieselecionada do grupo consistindo em Bifidobacterium longum,Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium adolescentis,Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis,Bifidobaeterium thermophilum e misturas dos mesmos.

46. Composição, de acordo com a reivindicação 45,caracterizada pelo fato de que a cepa é da espécieBifidobaeterium longum.

47. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que a cepa é selecionada dogrupo de cepas tendo uma seqüência de polinucleotídeointergênico 16s-23s com ao menos 95% de homologia com SEQ.ID N0 1, ou ao menos 94% de homologia com SEQ. ID N0 2.

48. Composição, de acordo com a reivindicação 47,caracterizada pelo fato de que a dita cepa é selecionada dogrupo consistindo em Bifidobacterium longum NCIMB 41290(AHF5340) , Bifidobaeterium longum NCIMB 41291 (AHF]231) emutantes das mesmas.

49. Composição, de acordo com a reivindicação 48,caracterizada pelo fato de que a cepa mutante é uma mutaçãonatural, geneticamente modificada ou induzida.

50. Composição, de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de que o animal de estimação é umgato.

51. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de ser um alimento para animais deestimação.

52. Composição, de acordo com a reivindicação 51,caracterizada pelo fato de ser um alimento para gatos.

53. Composição, de acordo com a reivindicação 51,caracterizada pelo fato de ser um alimento úmido paraanimais ou um alimento seco para animais.

54. Composição, de acordo com a reivindicação 53,caracterizada pelo fato de estar sob uma forma selecionadaa partir do grupo consistindo em rações, itens mascáveis ebiscoitos.

55. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de ser um suplemento alimentar paraanimais de estimação.

56. Composição, de acordo com a reivindicação 55,caracterizada pelo fato de estar sob a forma de um molho.

57. Composição, de acordo com a reivindicação 55,caracterizada pelo fato de estar sob a forma de um iogurte,um queijo ou outro produto lácteo.

58. Composição, de acordo com a reivindicação 55,caracterizada pelo fato de estar sob uma forma selecionada apartir do grupo consistindo em cápsulas, tabletes e pílulas.

59. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de compreender ao menos 0,001% debactérias formadoras de ácido láctico na faixa de cerca de-1,0E+04 ufc/g a cerca de 1,0E+12 ufc/g.

60. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que as bactérias formadoras deácido láctico estão sob a forma de células viáveis.

61. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que as bactérias formadoras deácido láctico estão sob a forma de células não-viáveis, oude frações constituintes ativas das mesmas.

62. Método para redução do odor associado a fezesou urina de um animal de estimação, caracterizado pelo fatode compreender a administração oral de bactérias formadorasde ácido láctico do gênero Bifidobacteria, obteníveismediante isolamento a partir de trato gastrointestinalfelino ressecado e lavado.

63. Método para redução do odor associado a caixade areia de um animal de estimação, caracterizado pelo fatode compreender a administração oral de bactérias formadorasde ácido láctico do gênero Bifidobacteria, obteníveismediante isolamento a partir de trato gastrointestinalfelino ressecado e lavado.