BRPI0716088B1 - anticorpo isolado, composição, molécula de ácido nucléico isolada, vetor, método para produzir um anticorpo, hibridoma, e, kit - Google Patents

anticorpo isolado, composição, molécula de ácido nucléico isolada, vetor, método para produzir um anticorpo, hibridoma, e, kit Download PDF

Info

Publication number
BRPI0716088B1
BRPI0716088B1 BRPI0716088-7A BRPI0716088A BRPI0716088B1 BR PI0716088 B1 BRPI0716088 B1 BR PI0716088B1 BR PI0716088 A BRPI0716088 A BR PI0716088A BR PI0716088 B1 BRPI0716088 B1 BR PI0716088B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
antibody
hlight
seq
pta
nos
Prior art date
Application number
BRPI0716088-7A
Other languages
English (en)
Inventor
Steven W. Granger
Shinichiro Kato
Carl F. Ware
Original Assignee
La Jolla Institute For Allergy And Immunology
Kyowa Kirin Co., Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39126775&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BRPI0716088(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by La Jolla Institute For Allergy And Immunology, Kyowa Kirin Co., Ltd filed Critical La Jolla Institute For Allergy And Immunology
Publication of BRPI0716088A2 publication Critical patent/BRPI0716088A2/pt
Publication of BRPI0716088A8 publication Critical patent/BRPI0716088A8/pt
Publication of BRPI0716088B1 publication Critical patent/BRPI0716088B1/pt
Publication of BRPI0716088B8 publication Critical patent/BRPI0716088B8/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

ANTICORPO ISOLADO COMPOSIÇÃO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, HIBRIDOMA, USO DE UMA COMPOSIÇÃO, MÉTODOS PARA DIMINUIR OU INIBIR A LIGAÇÃO DE LIGHT A HVEM, LT(BETA)R, DCR3 OU QUALQUER COMBINAÇÃO DOS MESMOS E PARA DIMINUIR OU INIBIR A SECREÇÃO DE CCL20, IL-8, RANTES OU QUALQUER COMBINAÇÃO DOS MESMOS E, KIT. São aqui fornecidos anticorpos, tais como anticorpos totalmente humanos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLGHT. também são fornecidos ácidos nucléicos isolados que codificam anticorpos, tais como anticorpos totalmente humanos, que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT. Além disso são fornecidos vetores e células hospedeiras que compreendem ácidos nucléicos que codificam anticorpos, tais como anticorpos totalmente humanos, que se imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT. Também são fornecidos métodos de fabricar anticorpos, tais como anticorpos totalmente humanos, que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT. Também é aqui fornecido um método de tratar uma doença mediada por hLIGHT em um paciente que compreende administrar ao paciente um anticorpo, tal como um anticorpo totalmente humano, que imunoespecificamente se liga a um polpeptídeo hLIGHT. Em forma de realização preferidas, estes anticorpos anti-hLIGHT aqui fornecidos melhorado, neutralizado ou de outro (...).

Description

INTRODUÇÃO
[001] São aqui fornecidos anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo LIGHT humano (hLIGHT) (equivalente à linfotoxina, exibe expressão indutível e compete com a glicoproteína D do HSV quanto ao HVEM, um receptor expressado pelos linfócitos T), um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou outro epítopo de hLIGHT. Em algumas formas de realização os anticorpos são anticorpos totalmente humanos, preferivelmente anticorpos monoclonais totalmente humanos, que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou epítopo de hLIGHT. Também são fornecidos ácidos nucléicos isolados que codificam anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou epítopo de hLIGHT. A invenção fornece ainda vetores e células hospedeiras que compreendem ácidos nucléicos que codificam anticorpos que imuno- especificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou epítopo de hLIGHT, assim como métodos de fabricar anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou epítopo de hLIGHT. Também são fornecidos métodos de usar os anticorpos anti-hLIGHT aqui fornecidos para inibir a atividade biológica de hLIGHT in vivo e/ou para tratar ou de outro modo controlar uma doença mediada por hLIGHT em um paciente.
FUNDAMENTOS
[002] LIGHT, (equivalente à linfotoxina, exibe expressão indutível e compete com a glicoproteína D do HSV quanto ao HVEM, um receptor expressado pelos linfócitos T) é um alvo de citocina potencial que foi implicado nos processos de doenças autoimunes inflamatórias crônicas (Mauri et al. 1998 Immunity 8 21-30). Como um membro da superfamília de TNF (TNFSF) de ligandos, LIGHT é também conhecido como TNFSF14 ou CD258. LIGHT é expressado na superfície de células T na ativação em uma maneira firmemente regulada aparecendo dentro de 4 horas, chegando ao máximo em 12 a 24 horas e desaparecendo em 48 horas (Castellano et al. 2002 J Biol Chem 277 42841-51). Entretanto, LIGHT também está presente em níveis detectáveis constitutivamente na superfície de células dendríticas imaturas (Tamada et al. 2000 J Immunol 164 4105-10) e nas células T e células matadoras naturais (NK) no intestino (Cohavy et al. 2005 J Immunol 174 646-53). LIGHT medeia seus efeitos biológicos pela ligação a três receptores da superfamília de TNF incluindo o receptor β da linfotoxina (LTβR) (Crowe et al. 1994 Science 264 707-10, Browning et al. 1997 J Immunol 159 3288-98), o mediador da entrada do vírus do herpes (HVEM) (Montgomery et al. 1996 Cell 87(3) 427-36) e o receptor isca 3 (DcR3) (Yu et al. 1999 J Biol Chem 274 13733-6).
[003] Camundongos tratados com uma proteína de fusão de LTβR- Fc inibidora reduziram os sintomas inflamatórios no modelo de transferência de célula T CD4+CD45RBaltode colite, uma patologia mediada pela célula T CD4+ (Mackay et al. 1998 Gastroenterology 115 1464-75). A expressão específica de célula T transgênica constitutiva de LIGHT também foi mostrado levar à inflamação intestinal grave com patologia equivalente a autoimune que se parece com a doença do intestino inflamatório humana (IBD) (Wang et al. 2005 J Immunol 174 8173-82, Shaikh et al. 2001 J Immunol 167 6330-7, Wang et al. 2001 J Immunol 167 5099-105, Wang et al. 2004 J Clin Invest 113 826-35). Os linfócitos que expressam LIGHT podem induzir sintomas equivalentes à IBD (por exemplo, perfis de citocina da doença de Crohn humana, úlceras fissuradas, ileíte e aumentos no IFN-Y e TNF colônicos) quando as células de linfonodo mesentérico dos animais transgênicos em LIGHT são transferidas para RAG-/- (Wang et al. 2005 J Immunol 174 8173-82). Na doença humana, aumentos da expressão de LIGHT foram observados em pacientes com doença de Crohn ativa (Cohavy et al. 2005 J Immunol 174 646-53, Wang et al. 2005 J Immunol 174 8173-82, Wang et al. 2004 J Clin Invest 113 826-35, Cohavy et al. 2004 J Immunol 173 251-8). LIGHT também foi demonstrado ser elevado nas células T do intestino de pacientes IBD (Cohavy et al. 2004 J Immunol 173 251-8). Evidência genética também sustenta um papel para LIGHT na IBD (Granger et al. 2001 J Immunol 167 5122-8); (Rioux et al. 2000 Am J Hum Genet 66 1863-70; Low et al. 2004 Inflamm Bowel Dis 10 173-81; Bonen e Cho 2003 Gastroenterology 124 521-36).
[004] Além disso, a sinalização de CCL20-CCR6 foi mostrada estar envolvida na IBD e LIGHT induz a secreção de CCL20 a partir da linhagem de célula epitelial colônica humana HT29.14s. Em estudos humanos, as células epiteliais do cólon foram descobertas serem uma fonte maior de CCL20 em pacientes IBD e a expressão de CCL20 é aumentada em pacientes com IBD humanos (Kwon et al. 2002 Gut 51 818-26; (Kaser et al. 2004 J Clin Immunol 24 7485).
[005] hLIGHT também foi implicado na doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD). Por exemplo, LIGHT foi mostrado fornecer atividade co-estimuladora potente para as células T, realçando a proliferação e a produção de citocinas Thl independentes do caminho B7-CD28 (ver, por exemplo, Tamada et al. 2000 J. Immunol. 164 4105-4110). O bloqueio da co- estimulação de LIGHT-HVEM pelos anticorpos monoclonais anti-HVEM, HVEM-Ig ou proteína de fusão de LTβR inibe as respostas de célula T halogênicas (ver, por exemplo, Tamada et al. 2000 J. Immunol. 164 41054110., Harrop et al. 1998 J. Immunol. 161 1786). Além disso, a administração in vivo de LW-1g ou anticorpos anti-LIGHT de murino inibe as respostas de linfócito T citotóxico anti-hospedeiro (CTL) em um modelo de GVHD agudo de murino (Tamada et al. 2000 Nat. Med. 6 283-289).
[006] Embora observações tais como aquelas debatidas acima indiquem um papel para LIGHT em distúrbios inflamatórios, tais como IBD ou GVHD, até agora nenhum anticorpo humano anti-LIGHT humano foi produzido, nem qualquer anticorpo anti-hLIGHT humano ou anticorpos anti- hLIGHT monoclonais foram mostrados ser antagonísticos à atividade biológica de hLIGHT. Como tal, uma necessidade continua a existir quanto a identificação de terapias, tais como terapias anti-LIGHT, úteis para o tratamento de distúrbios inflamatórios em seres humanos. A citação ou debate de uma referência aqui não deve ser interpretada como uma admissão de que tal é técnica anterior para a presente invenção.
SUMÁRIO
[007] São aqui fornecidos anticorpos, tais como anticorpos totalmente humanos, que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Também são fornecidos ácidos nucléicos isolados que codificam anticorpos, tais como anticorpos totalmente humanos, que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Além disso, são fornecidos vetores e células hospedeiras que compreendem ácidos nucléicos que codificam anticorpos, tais como anticorpos totalmente humanos, que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Também são fornecidos métodos de fabricar anticorpos, tais como anticorpos totalmente humanos, que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Também é aqui fornecido um método de tratar uma doença mediada por hLIGHT que compreende administrar um anticorpo, tal como um anticorpo totalmente humano, que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Em formas de realização preferidas, os anticorpos anti-hLIGHT são aqui fornecidos anticorpos antagonistas que melhoram, neutralizam ou de outro modo inibem a atividade biológica de hLIGHT in vivo (por exemplo, a produção ou secreção mediadas por hLIGHT de CCL20, IL-8 ou RANTES a partir de células que expressam um ligando de hLIGHT, tal como um receptor de hLIGHT, (por exemplo, HVEM, LTβPR e/ou DcR3)). Um anticorpo da invenção pode ser um anticorpo de tamanho natural ou um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno. Os anticorpos da invenção também são úteis para detectar hLIGHT, assim como para melhorar, neutralizar ou de outro modo inibir a atividade de hLIGHT, por exemplo, em um paciente humano que sofre de um distúrbio em que a atividade de hLIGHT é prejudicial.
[008] Assim, em um aspecto, é aqui fornecido um anticorpo isolado que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Em algumas formas de realização, o anticorpo imunoespecificamente se liga a (a) um epítopo de hLIGHT trimérico (ou nativo), (b) um epítopo de hLIGHT monomérico (ou desnaturado), (c) tanto um epítopo de hLIGHT trimérico quanto um epítopo de hLIGHT monomérico, (d) um epítopo de hLIGHT trimérico mas não um epítopo de hLIGHT monomérico ou (e) um epítopo de hLIGHT monomérico mas não um epítopo de hLIGHT trimérico. Em formas de realização preferidas, o anticorpo imunoespecificamente liga um epítopo de hLIGHT trimérico mas não um epítopo de hLIGHT monomérico humano. Em formas de realização preferidas, o anticorpo é um anticorpo E1, anticorpo E13, anticorpo E63, anticorpo F19 ou anticorpo F23.
[009] Hibridomas que produzem cada um dos anticorpos E1, E13, E63, F19 e F23 foram depositados sob as disposições do Tratado de Budapest com a American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) em 12 de Julho de 2006 (Acesso ATCC Nos PTA-7729 (hibridoma 124 E1) e PTA-7728 (hibridoma 124 F23), respectivamente), 17 de agosto de 2006 (Acesso ATCC Nos PTA-7818 (hibridoma 124 E63) e PTA-7819 (hibridoma 124 F19) e 23 de agosto de 2006 (Acesso ATCC No PTA-7842 (hibridoma 124 E13) e são aqui incorporados por referência. Os anticorpos produzidos por cada um dos hibridomas 124 E1, 124 E13, 124 E63, 124 F19 e 124 F23 também podem ser aludidos aqui como E1, E13, E63, F19, F23, respectivamente e/ou pelos Números de Acesso ATCC. PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 e PTA-7728, respectivamente.
[0010] Estes anticorpos, hibridomas, métodos de fabricar estes anticorpos e métodos de usar estes anticorpos são todos incluídos na invenção.
[0011] Em formas de realização específicas, um anticorpo da invenção é um que é competitivamente bloqueado (por exemplo, em uma maneira dependente da dose) por um anticorpo E1, um anticorpo E13 e/ou um anticorpo E63 quanto a ligação a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), um fragmento de hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Em outras formas de realização, o anticorpo é competitivamente bloqueado (por exemplo, em um maneira dependente da dose) por um anticorpo F19 e/ou um anticorpo F23 quanto a ligação a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), um fragmento de hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Em formas de realização específicas, o anticorpo é competitivamente bloqueado (por exemplo, em um maneira dependente da dose) por um anticorpo E1, um anticorpo E13 e/ou um anticorpo E63, mas não é competitivamente bloqueado (por exemplo, em um maneira dependente da dose) por um anticorpo F19 e/ou um anticorpo F23, quanto a ligação a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), um fragmento de hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Em outras formas de realização, o anticorpo é competitivamente bloqueado (por exemplo, em um maneira dependente da dose) por um anticorpo F19 e/ou um anticorpo F23, mas não é competitivamente bloqueado (por exemplo, em um maneira dependente da dose) por um anticorpo E1, um anticorpo E13 e/ou um anticorpo E63, quanto a ligação a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), um fragmento de hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. os testes de bloqueio competitivo exemplares são aqui fornecidos nos Exemplos.
[0012] Também são aqui fornecidos anticorpos ou fragmentos de anticorpo de ligação de antígeno destes que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Em certas formas de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno compreende uma cadeia VH, cadeia VL, domínio VH, domínio VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de E1, E13, E63, F19 ou F23.
[0013] Em certas formas de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste compreende menos do que seis CDRs. Em algumas formas de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste compreende ou consiste de uma, duas, três, quatro ou cinco CDRs selecionadas do grupo que consiste de CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL. Em formas de realização específicas, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno deste compreende ou consiste de uma, duas, três, quatro ou cinco CDRs selecionadas do grupo que consiste de CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de E1, E13, E63, F19 ou F23.
[0014] Também são aqui fornecidas composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-hLIGHT da invenção, tal como E1, E13, E63, F19 ou F23.
[0015] Em formas de realização específicas, um anticorpo da invenção é um anticorpo totalmente humano, um anticorpo monoclonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo antagonista ou qualquer combinação dos mesmos. Em formas de realização particulares, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano ou fragmento de ligação de antígeno deste, que imunoespecificamente se liga a hLIGHT. Em formas de realização preferidas, o anticorpo é um anticorpo antagonista.
[0016] Em certas formas de realização, o anticorpo compete (por exemplo, em uma maneira dependente da dose) com HVEM, LTβR, DcR3 ou proteínas de fusão destes (por exemplo, Fc:HVEM, Fc:LTβR ou Fc:DcR3), quanto a ligação a um polipeptídeo hLIGHT, tal como um polipeptídeo hLIGHT expressado na superfície da célula ou polipeptídeo hLIGHT solúvel, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Os testes de bloqueio competitivo exemplares são fornecidos nos Exemplos aqui.
[0017] Em um segundo aspecto, são aqui fornecidos ácidos nucléicos isolados que codificam anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Em certas formas de realização, o ácido nucléico codifica uma cadeia VH, cadeia VL, domínio VH, domínio VL, CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de E1, E13, E63, F19 ou F23.
[0018] Em um terceiro aspecto, são aqui fornecidos vetores e células hospedeiras que compreendem ácidos nucléicos que codificam anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT.
[0019] Em um quarto aspecto, são aqui fornecidos métodos de fabricar anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Em certas formas de realização, o anticorpo imunoespecificamente se liga a uma variante de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) de um polipeptídeo hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L e/ou 214K-32L. Também são aqui fornecidos hibridomas que produzem anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT ou variante de SNP deste. Em formas de realização preferidas, o hibridoma é o hibridoma que produz E1, E13, E63, F19 ou F23.
[0020] Em um quinto aspecto, são aqui fornecidos métodos de tratar ou de outro modo aliviar um ou mais sintomas de uma doença mediada por hLIGHT em um paciente (por exemplo, um paciente humano), que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), em que a atividade de hLIGHT é inibida pelo anticorpo. Em certas formas de realização, a doença mediada por hLIGHT é uma IBD, tal como doença de Crohn ou colite ulcerativa. Em outras formas de realização, a doença mediada por hLIGHT é GVHD.
[0021] Em um sexto aspecto, são aqui fornecidos métodos para diminuir ou inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, LTβR e/ou DcR3 em um paciente (por exemplo, um paciente humano), que compreendem administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel).
[0022] Em um sétimo aspecto, são aqui fornecidos métodos para diminuir ou inibir uma atividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, em um paciente (por exemplo, um paciente humano), que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula), em que a atividade biológica de hLIGHT é diminuída ou inibida pelo anticorpo.
[0023] Em um oitavo aspecto, são aqui fornecidos métodos para diminuir ou inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, LTβR e/ou DcR3 em uma célula tendo hLIGHT expressado na superfície da célula, contactando a célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), tal como um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT.
[0024] Em um nono aspecto, são aqui fornecidos métodos para diminuir ou inibir uma atividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, em uma célula tendo um receptor de hLIGHT expressado na superfície da célula (tal como, HVEM, LTβR e/ou Dc3R), contactando a célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel ou variante de SNP deste), em que a atividade biológica de hLIGHT é diminuída ou inibida pelo anticorpo.
[0025] Em um décimo aspecto, é aqui fornecido um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende ainda um rótulo detectável. Em certas formas de realização, os anticorpos anti-hLIGHT que compreendem um rótulo detectável são usados em um método para a detecção de hLIGHT em uma amostra, o dito método compreendendo contactar a amostra com o anticorpo anti-hLIGHT. Em formas de realização específicas, a amostra compreende uma célula que expressa hLIGHT na superfície da célula.
[0026] Em um décimo primeiro aspecto, são aqui fornecidos kits que compreendem um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT.
TERMINOLOGIA
[0027] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como é habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica. Todas as patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações são incorporados por referência em sua totalidade. No evento e, que haja uma pluralidade de definições para um termo aqui, aqueles nesta seção prevalecerão a menos que de outro modo estabelecido.
[0028] O termo “cerca de” ou “aproximadamente” significa dentro de 20 %, preferivelmente dentro de 10 % e mais preferivelmente dentro de 5 % (ou 1 % ou menos) de um dado valor ou faixa.
[0029] Como aqui usado, “administrar” ou “administração” refere-se ao modo de injetar ou de outro modo liberar fisicamente uma substância como ela existe fora do corpo (por exemplo, um anticorpo anti-hLIGHT aqui fornecido) em um paciente, tal como pela liberação mucósica, intradérmica, intravenosa, intramuscular e/ou qualquer outro método de liberação física aqui descrito ou conhecido na técnica. Quando uma doença ou um sintoma desta, estão sendo tratados, a administração da substância tipicamente ocorre depois do início da doença ou sintomas desta. Quando uma doença ou sintomas desta, estão sendo prevenidos, a administração da substância tipicamente ocorre antes do início da doença ou sintomas desta.
[0030] No contexto de um polipeptídeo, o termo “análogo” como aqui usado refere-se a um polipeptídeo que possua uma função similar ou idêntica como um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo anti-hLIGHT mas não necessariamente compreendem uma sequência de aminoácido similar ou idêntica de um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo anti-hLIGHT ou possua uma estrutura similar ou idêntica de um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo anti-hLIGHT. Um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácido similar refere-se a um polipeptídeo que satisfaz pelo menos um dos seguintes: (a) um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido que seja pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 % e preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % ou o mais preferivelmente pelo menos 99 % idêntica à sequência de aminoácido de um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, SEQ ID NO: 52), um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo anti-hLIGHT aqui descritos; (b) um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeo que hibridize sob condições severas a uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo anti-hLIGHT (ou região VH ou VL deste) aqui descrito de pelo menos 5 resíduos de aminoácido, pelo menos 10 resíduos de aminoácido, pelo menos 15 resíduos de aminoácido, pelo menos 20 resíduos de aminoácido, pelo menos 25 resíduos de aminoácido, pelo menos 40 resíduos de aminoácido, pelo menos 50 resíduos de aminoácido, pelo menos 60 resíduos de aminoácido, pelo menos 70 resíduos de aminoácido, pelo menos 80 resíduos de aminoácido, pelo menos 90 resíduos de aminoácido, pelo menos 100 resíduos de aminoácido, pelo menos 125 resíduos de aminoácido ou pelo menos 150 resíduos de aminoácido (ver, por exemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY); e (c) um polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 % e preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % ou o mais preferivelmente pelo menos 99 % idêntica à sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo anti-hLIGHT (ou região VH ou VL deste) aqui descritos. Um polipeptídeo com estrutura similar a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo anti-hLIGHT aqui descrito refere-se a um polipeptídeo que tem uma estrutura secundária, terciária ou quaternária similar de um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um hLIGHT ou um anticorpo de hLIGHT aqui descrito. A estrutura de um polipeptídeo pode ser determinada pelos métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, incluindo mas não limitados a, cristalografia de raio X, ressonância magnética nuclear e microscopia eletrônica cristalográfica.
[0031] Para determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácido ou de duas sequências de ácido nucléico, as sequências são alinhadas com propósitos de comparação ótima (por exemplo, intervalos podem ser introduzidos na sequência de uma primeira sequência de aminoácido ou ácido nucléico para alinhamento ótimo com uma segunda sequência de aminoácido ou ácido nucléico). os resíduos de aminoácido ou nucleotídeo nas posições de aminoácido ou posições de nucleotídeo correspondentes são depois comparadas. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nesta posição. a identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade % = número de posições sobrepostas idênticas/número total de posições X 100 %). Em uma forma de realização, as duas sequências são do mesmo comprimento.
[0032] A determinação da identidade percentual entre duas sequências (por exemplo, sequências de aminoácido ou sequências de ácido nucléico) também pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplo preferido, não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2264 2268, modificado como em Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5873 5877. Um tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403. As pesquisas de nucleotídeo BLAST podem ser realizadas com os conjunto de parâmetros de programa NBLAST nucleotídeo, por exemplo, para a contagem = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeo homólogas a uma molécula de ácido nucléico da presente invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o conjunto de parâmetros de programa XBLAST, por exemplo, para a contagem de 50, comprimento de palavra = 3 para se obter sequências de aminoácido homólogas a uma molécula de proteína da presente invenção. Para se obter alinhamentos de intervalo com propósitos de comparação, O BLAST de intervalo pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389 3402. Alternativamente, PSI BLAST pode ser usado para realizar uma pesquisa repetida que detecta relações distantes entre as moléculas (Id.). Quando da utilização de BLAST, BLAST de intervalo e programas PSI Blast, os parâmetros de default dos respectivos programas (por exemplo, de XBLAST e NBLAST) podem ser usados (ver, por exemplo, National Center for Biotechnology Information (NCBI) na web mundial, ncbi.nlm.nih.gov). Um outro exemplo preferido, não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS 4: 11 17. Um tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que é parte do pacote de software de alinhamento de sequência GCG. Quando da utilização do programa ALIGN para comparar sequências de aminoácido, uma tabela de resíduo em peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4 pode ser usado.
[0033] A identidade percentual entre duas sequências pode ser determinada usando técnicas similares àquelas descritas acima, com ou sem deixar intervalos. No cálculo da identidade percentual, tipicamente apenas emparelhamentos exato são contados.
[0034] Como aqui usado, um “antagonista” ou “inibidor” de hLIGHT refere-se a uma molécula que é capaz de inibir ou de outro modo diminuir uma ou mais das atividades biológicas de hLIGHT, tal como em uma célula que expressa hLIGHT ou em uma célula que expressa um ligando de hLIGHT, tal como um receptor de hLIGHT. Por exemplo, em certas formas de realização, os anticorpos da invenção são anticorpos antagonistas que inibem ou de outro modo diminuem a secreção de CCL20, IL-8 e/ou RANTES a partir de uma célula tendo um receptor de hLIGHT expressado na superfície da célula (por exemplo, HVEM, LTβR e/ou DcR3) quando o dito anticorpo é contactado com a dita célula. Em algumas formas de realização, um antagonista de hLIGHT (por exemplo, um anticorpo antagonístico da invenção), por exemplo, pode atuar pela inibição ou de outro modo diminuir os caminhos de ativação e/ou sinalização de célula da célula que expressa um receptor de hLIGHT, por meio do qual a inibição de uma atividade biológica mediada por hLIGHT da célula em relação à atividade biológica mediada por hLIGHT na ausência de antagonista. Em certas formas de realização os anticorpos são aqui fornecidos anticorpos anti-hLIGHT totalmente humanos, antagonísticos, preferivelmente anticorpos anti-hLIGHT monoclonais, totalmente humanos, antagonísticos.
[0035] Os termos “anticorpo” e “imunoglobulina” ou “Ig” podem ser usados aqui intercambiavelmente. Os termos “anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT,” “anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT,” “anticorpos anti- hLIGHT” e termos análogos também são aqui usados intercambiavelmente e referem-se aos anticorpos e fragmentos destes, que especificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, tal como um antígeno ou epítopo de hLIGHT. Um anticorpo ou um fragmento deste que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT pode ser reativo cruzado com antígenos relacionados. Preferivelmente, um anticorpo ou um fragmento deste que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT não reage cruzado com outros antígenos. Um anticorpo ou um fragmento deste que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT podem ser identificados, por exemplo, pelos imunoensaios, BIAcore ou outras técnicas conhecidas por aqueles de habilidade na técnica. Um anticorpo ou um fragmento deste ligam-se especificamente a um antígeno de hLIGHT quando este se liga a um antígeno de hLIGHT com afinidade mais alta do que a qualquer antígeno reativo cruzado como determinado usando técnicas experimentais, tais como radioimunoensaios (RIA) e ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISAs). Tipicamente uma reação específica ou seletiva será pelo menos duas vezes o sinal ou ruído de fundo e mais tipicamente mais do que 10 vezes o fundo. Ver, por exemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Segunda Edição, Raven Press, Nova Iorque nas páginas 332-336 para um debate com respeito à especificidade de anticorpo.
[0036] Os anticorpos da invenção incluem, mas não são limitados a, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos recombinantemente produzidos, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, Fvs de cadeia única (scFv) (por exemplo, incluindo monoespecíficos, biespecíficos, etc.), anticorpos camelizados, fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab’), Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), anticorpos anti- idiotípicos (anti-Id) e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos acima. Em particular, os anticorpos da presente invenção incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, domínios de ligação de antígeno ou moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT (por exemplo, uma ou mais regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) de um anticorpo anti-hLIGHT). Os anticorpos da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), qualquer classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou qualquer subclasse (por exemplo, IgG2a e IgG2b) da molécula de imunoglobulina. Em formas de realização preferidas, os anticorpos de hLIGHT são totalmente humanos, tais como anticorpos de hLIGHT monoclonais totalmente humanos. Em certas formas de realização, os anticorpos da invenção são anticorpos de IgG ou uma classe (por exemplo, IgG1 ou IgG4 humanos) ou subclasse destes.
[0037] O termo “domínio de ligação de antígeno,” “região de ligação de antígeno,” “fragmento de ligação de antígeno,” e termos similares referem- se àquela porção de um anticorpo que compreende os resíduos de aminoácido que interagem com um antígeno e conferem ao agente de ligação a sua especificidade e afinidade para o antígeno (por exemplo, as regiões determinadoras de complementaridade (CDR)). A região de ligação de antígeno pode ser derivada de qualquer espécie de animal, tais como roedores (por exemplo, coelho, rato ou hamster) e seres humanos. Preferivelmente, a região de ligação de antígeno será de origem humana.
[0038] Como aqui usado, o termo “composição” é intencionado a abranger um produto contendo os ingredientes especificados (por exemplo, um anticorpo da invenção), opcionalmente, nas quantidades especificadas, assim como qualquer produto que resulte, direta ou indiretamente, da combinação dos ingredientes especificados, opcionalmente, nas quantidades especificadas.
[0039] Os termos “região constante” ou “domínio constante” referem- se a uma porção de terminal carbóxi da cadeia leve e pesada que não está diretamente envolvida na ligação do anticorpo ao antígeno mas exibe várias funções efetoras, tais como interação com o receptor Fc. Os termos referem- se à porção de uma molécula de imunoglobulina tendo uma sequência de aminoácido mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, o domínio variável, que contém o sítio de ligação de antígeno. O domínio constante contém os domínios CH1, CH2 e CH3 da cadeia pesada e o domínio CHL da cadeia leve.
[0040] No contexto de um polipeptídeo, o termo “derivado” como aqui usado refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT que tenham sido alterados pela introdução de substituições, deleções ou adições de resíduo de aminoácido. O termo “derivado” como aqui usado também refere-se a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT que tenham sido quimicamente modificados, por exemplo, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao polipeptídeo. Por exemplo, mas não por via de limitação, um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo de hLIGHT podem ser quimicamente modificados, por exemplo, pela glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Os derivados são modificados em uma maneira que é diferente do peptídeo ou polipeptídeos que ocorrem naturalmente ou de partida, no tipo ou localização das moléculas ligadas. Os derivados incluem ainda a deleção de um ou mais grupos químicos que estão naturalmente presentes no peptídeo ou polipeptídeo. Um derivado de um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo de hLIGHT pode ser quimicamente modificado pelas modificações químicas usando técnicas conhecidas por aqueles de habilidade no ramo, incluindo, mas não limitados à clivagem química específica, acetilação, formulação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, um derivado de um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo de hLIGHT podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos. Um derivado de polipeptídeo possui uma função similar ou idêntica como um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo de hLIGHT aqui descrito.
[0041] O termo “quantidade eficaz” como aqui usado refere-se à quantidade de uma terapia (por exemplo, um anticorpo ou composição farmacêutica aqui fornecidos) que é suficiente para reduzir e/ou melhorar a gravidade e/ou duração de uma dada doença e/ou um sintoma com esta relacionado. Este termo também abrange uma quantidade necessária para a redução ou melhora do avanço ou progressão de uma dada doença, redução ou melhora da recorrência, desenvolvimento ou início de uma dada doença e/ou parra melhorar ou realçar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de uma outra terapia (por exemplo, uma terapia outra que não a de anticorpo anti-hLIGHT aqui fornecida). Em algumas formas de realização, a quantidade eficaz de um anticorpo da invenção é de cerca de 0,1 mg/kg (mg de cerca de por kg de peso do paciente) a cerca de 100 mg/kg. Em certas formas de realização, uma quantidade eficaz de um anticorpo fornecidos nesse sentido é de cerca de 0,1 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg, de cerca de 15 mg/kg, de cerca de 20 mg/kg, de cerca de 25 mg/kg, de cerca de 30 mg/kg, de cerca de 35 mg/kg, de cerca de 40 mg/kg, de cerca de 45 mg/kg, de cerca de 50 mg/kg, de cerca de 60 mg/kg, de cerca de 70 mg/kg, de cerca de 80 mg/kg cerca de 90 mg/kg ou cerca de 100 mg/kg (ou um faixa nesse sentido). Em algumas formas de realização, “quantidade eficaz” como aqui usado também refere-se à quantidade de um anticorpo da invenção para se obter um resultado especificado (por exemplo, inibição de uma atividade biológica de hLIGHT de uma célula, tal como a inibição da secreção de CCL20, IL-8 ou RANTES a partir da célula).
[0042] O termo “epítopo” como aqui usado refere-se a uma região localizada na superfície de um antígeno, tal como polipeptídeo hLIGHT ou fragmento de polipeptídeo hLIGHT, que é capaz de ser ligado a uma ou mais regiões de ligação de antígeno de um anticorpo e que tem atividade antigênica ou imunogênica em um animal, preferivelmente um mamífero e o mais preferivelmente em um ser humano, que é capaz de evocar uma resposta imune. Um epítopo tendo atividade imunogênica é uma porção de um polipeptídeo que evoca uma resposta de anticorpo em um animal. Um epítopo tendo atividade antigênica é uma porção de um polipeptídeo ao qual um anticorpo imunoespecificamente liga como determinado por qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, pelos imunoensaios aqui descritos. Os epítopos antigênicos não precisam ser necessariamente imunogênicos. Os epítopos usualmente consiste de agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm características estruturais tridimensionais específicas assim como características de carga específicas. Uma região de um polipeptídeo que contribui para um epítopo pode ser aminoácidos contíguos do polipeptídeo ou o epítopo pode vir junto de duas ou mais regiões não contíguas do polipeptídeo. O epítopo pode ser ou não um aspecto de superfície tridimensional do antígeno. Em certas formas de realização, um epítopo de hLIGHT é um aspecto de superfície tridimensional de um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, em uma forma trimérica de um polipeptídeo hLIGHT). Em outras formas de realização, um epítopo de hLIGHT é aspecto linear de um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, em uma forma trimérica ou monomérica do polipeptídeo hLIGHT). Os anticorpos aqui fornecidos podem imunoespecificamente ligar-se a um epítopo da forma monomérica (desnaturada) de hLIGHT, um epítopo da forma trimérica (nativa) de hLIGHT ou tanto a forma monomérica (desnaturada) quanto a forma trimérica (nativa) de hLIGHT. Em formas de realização específicas, os anticorpos aqui fornecidos imunoespecificamente se ligam a um epítopo da forma trimérica de hLIGHT mas não se liga imunoespecificamente à forma monomérica de hLIGHT.
[0043] O termo “excipientes” como aqui usado refere-se às substâncias inertes que são habitualmente usadas como um agente diluente, veículo, conservantes, aglutinantes ou estabilizantes para medicamentos e inclui, mas não limitados a, proteínas (por exemplo, albumina sérica, etc.), aminoácidos (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, lisina, arginina, glicina, histidina, etc.), ácidos graxos e fosfolipídeos (por exemplo, alquil sulfonatos, caprilato, etc.), tensoativos (por exemplo, SDS, polissorbato, tensoativo não iônico, etc.), sacarídeos (por exemplo, sacarose, maltose, trealose, etc.) e polióis (por exemplo, manitol, sorbitol, etc.). Ver, também, Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA, que é por meio deste incorporado por referência em sua totalidade.
[0044] No contexto de um peptídeo ou polipeptídeo, o termo “fragmento” como aqui usado refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo que compreende menos do que a sequência de aminoácido de tamanho natural. Um tal fragmento pode surgir, por exemplo, de uma truncagem no terminal amino, uma truncagem no terminal carbóxi e/ou um deleção interna de um resíduo(s) da sequência de aminoácido. Fragmentos, por exemplo, podem resultar da união de RNA alternativa ou da atividade de protease in vivo. Em certas formas de realização, fragmentos de hLIGHT incluem polipeptídeos que compreendem uma sequência de aminoácido de pelo menos 5 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 100 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácido contíguos, pelo menos 200 resíduos de aminoácido contíguos ou pelo menos 250 resíduos de aminoácido contíguos da sequência de aminoácido de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT. Em uma forma de realização específica, um fragmento de um polipeptídeo hLIGHT ou um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT retém pelo menos 1, pelo menos 2 ou pelo menos 3 funções do polipeptídeo ou anticorpo.
[0045] Os termos “anticorpo totalmente humano” ou “anticorpo humano” são aqui usados intercambiavelmente e referem-se a um anticorpo que compreende uma região variável humana e, o mais preferivelmente uma região constante humana. Em formas de realização específicas, os termos referem-se a um anticorpo que compreende uma região variável e região constante de origem humana. Anticorpos anti-hLIGHT “totalmente humanos”, em certas formas de realização, também podem abranger anticorpos que se ligam a polipeptídeos hLIGHT e são codificados pelas sequências de ácido nucléico que são variantes somáticas que ocorrem naturalmente de sequência de ácido nucléico da imunoglobulina da linha germinativa humana. Em uma forma de realização específica, os anticorpos anti-hLIGHT são aqui fornecidos anticorpos totalmente humanos. O termo “anticorpo totalmente humano” inclui anticorpos tendo regiões variáveis e constantes correspondentes às sequências da imunoglobulina da linha germinativa humana como descrito por Kabat et al. (Ver Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242). Os métodos exemplares de produzir anticorpos totalmente humanos são fornecidos, por exemplo, nos Exemplos aqui, mas qualquer método conhecido na técnica pode ser usado.
[0046] A frase “anticorpo humano recombinante” inclui anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressados usando um vetor de expressão recombinant transfectado em uma célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinatória, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo ou vaca) que sejam transgênicos e/ou transcromossômicos para os genes da imunoglobulina humana (ver por exemplo, Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) ou anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a união de sequências de gene da imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes podem ter regiões variáveis e constantes derivadas de sequências da imunoglobulina da linha germinativa humana (Ver Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 913242). Em certas formas de realização, entretanto, tais anticorpos humanos recombinantes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para as sequências de Ig humanas é usado, mutagênese somática in vivo) e assim as sequências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com as sequências VH e VL da linha germinativa humana, podem não existir naturalmente dentro do repertório da linha germinativa de anticorpo humano in vivo.
[0047] O termo “proteína de fusão” como aqui usado refere-se a um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácido de um anticorpo e uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo ou proteína heterólogos (isto é, um polipeptídeo ou proteína não normalmente uma parte do anticorpo (por exemplo, um anticorpo antigênico não anti-hLIGHT)). O termo “fusão” quando usado em relação a hLIGHT ou a um anticorpo anti-hLIGHT refere- se à união de um peptídeo ou polipeptídeo ou fragmento, variante e/ou derivado deste, com um peptídeo ou polipeptídeo heterólogos. Preferivelmente, a proteína de fusão retém a atividade biológica do hLIGHT ou anticorpo anti-hLIGHT. Em certas formas de realização, a proteína de fusão compreende um domínio VH, domínio VL, CDR de VH (um, duas ou três CDRs de VH) e/ou VL CDR (um, duas ou três CDRs de VL) do anticorpo de hLIGHT, em que a proteína de fusão imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT.
[0048] O termo “cadeia pesada” quando usado em referência a um anticorpo refere-se a cinco tipos distintos, chamado alfa (α), delta (δ), épsilon (ε), gama (y) e mu (μ), com base na sequência de aminoácido do domínio constante de cadeia pesada. Estes tipos distintos de cadeias pesadas são bem conhecidos e dão origem a cinco classes de anticorpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, incluindo quatro subclasses de IgG, a saber IgG1, IgG1, IgG3 e IgG4. Preferivelmente a cadeia pesada é uma cadeia pesada humana.
[0049] O termo “hospedeiro” como aqui usado refere-se a um animal, preferivelmente um mamífero e o mais preferivelmente um ser humano.
[0050] O termo “célula hospedeira” como aqui usado refere-se à célula objeto particular transfectada com uma molécula de ácido nucléico e a progênie ou progênie potencial de uma tal célula. A progênie de uma tal célula pode não ser idêntica à célula precursora transfectada com a molécula de ácido nucléico devido às mutações ou influências ambientais que possam ocorrer em gerações sucessivas ou integração da molécula de ácido nucléico no genoma da célula hospedeira.
[0051] O termo “agente imunomodulatório” e variações deste incluindo, mas não limitados a, agentes imunomodulatórios, como aqui usados referem-se a um agente que modula um sistema imune do hospedeiro. Em certas formas de realização, um agente imunomodulatório é um agente imunossupressor. Em certas outras formas de realização, um agente imunomodulatório é um agente imunoestimulatório. De acordo com a invenção, um agente imunomodulatório usado nas terapias de combinação da invenção não incluem um anticorpo anti-hLIGHT ou fragmento de ligação de antígeno. Agentes imunomodulatórios incluem, mas não são limitados a, moléculas pequenas, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, proteínas de fusão, anticorpos, moléculas inorgânicas, agentes miméticos e moléculas orgânicas.
[0052] Como aqui usado, o termo “em combinação” no contexto da administração de outras terapias refere-se ao uso de mais do que uma terapia. O uso do termo “em combinação” não restringe a ordem em que as terapias são administradas a um paciente com uma infecção. Uma primeira terapia pode ser administrada antes (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas), concorrentemente ou depois (por exemplo, 1 minuto, 45 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas) a administração de uma segunda terapia a um paciente que teve, tem ou é suscetível a uma doença mediada por hLIGHT. Qualquer terapia adicional pode ser administrada em qualquer ordem com as outras terapias adicionais. Em certas formas de realização, os anticorpos da invenção podem ser administrados em combinação com uma ou mais terapias (por exemplo, terapias que não sejam dos anticorpos da invenção que sejam correntemente administradas para prevenir, tratar, controlar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT. Os exemplos não limitantes de terapias que podem ser administradas em combinação com um anticorpo da invenção incluem agentes analgésicos, agentes anestésicos, antibióticos ou agentes imunomoduladores ou qualquer outro agente listado na U.S. Pharmacopoeia e/ou Physician’s Desk Reference.
[0053] O termo “sal inorgânico” como aqui usado refere-se a qualquer composto que não contenha nenhum carbono que resulte da substituição de parte ou todo do hidrogênio ácido ou um ácido por um metal ou um grupo que atue como um metal e seja frequentemente usado como um composto de ajuste de tonicidade em composições farmacêuticas e preparações de materiais biológicos. Os sais inorgânicos mais comuns são NaCl, KCl, NaH2PO4, etc.
[0054] Um anticorpo “isolado” ou “purificado” é substancialmente livre de material celular ou outras proteínas contaminantes a partir da fonte de célula ou tecido a partir da qual o anticorpo é derivado ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. A linguagem “substancialmente livre de material celular” inclui preparações de um anticorpo em que o anticorpo é separado de componentes celulares das células a partir das quais o mesmo é isolado ou recombinantemente produzido. Assim, um anticorpo que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de anticorpo tendo menos do que cerca de 30 %, 20 %, 10 % ou 5 % (em peso seco) de proteína heteróloga (também aqui aludida como uma “proteína contaminante”). Quando o anticorpo é recombinantemente produzido, eles também é de modo preferível substancialmente livre de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos do que cerca de 20 %, 10 % ou 5 % do volume da preparação de proteína. Quando o anticorpo é produzido pela síntese química, este é de modo preferível substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos, isto é, ele é separado de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. Consequentemente, tais preparações do anticorpo têm menos do que cerca de 30 %, 20 %, 10 %, 5 % (em peso seco) de precursores químicos ou compostos outros que não o anticorpo de interesse. Em uma forma de realização preferida, os anticorpos da invenção são isolados ou purificados.
[0055] Uma molécula de ácido nucléico “isolada” é uma que é separada de outras moléculas de ácido nucléico que estão presentes na fonte natural da molécula de ácido nucléico. Além disso, uma molécula de ácido nucléico “isolada”, tal como uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida pelas técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. Em uma forma de realização específica, uma molécula(s) de ácido nucléico que codifica(m) um anticorpo da invenção é/são isolada(s) ou purificada(s).
[0056] Os termos “LIGHT humano,” “hLIGHT” ou “polipeptídeo hLIGHT” e termos similares referem-se aos polipeptídeos (“polipeptídeos,” “peptídeos” e “proteínas” são aqui usados intercambiavelmente) que compreendem a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 52 e polipeptídeos relacionados, incluindo variantes SNP destes. Os polipeptídeos relacionados incluem variantes alélicas (por exemplo, variantes SNP); variantes de união; fragmentos; derivados; variantes de substituição, deleção e inserção; polipeptídeos de fusão; e homólogos interespécies, preferivelmente, que retêm a atividade de hLIGHT e/ou são suficientes para gerar uma resposta imune anti-hLIGHT. As variantes de SNP não sinônimas exemplares incluem, mas não são limitadas a, polipeptídeos hLIGHT que compreendem 214E-32S (um ácido glutâmico na posição 214 e serina na posição 32 de um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, o polipeptídeo hLIGHT representado na SEQ ID NO: 52)), 214K-32S, 214E-32L e 214E-32L. Também abrangidos são formas solúveis de hLIGHT que são suficientes para gerar uma resposta imunológica anti-hLIGHT (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54). Como aqueles habilitados na técnica avaliarão, um anticorpo anti-hLIGHT da invenção pode se ligar a um polipeptídeo hLIGHT, fragmento de polipeptídeo, antígeno e/ou epítopo, visto que um epítopo é parte do antígeno maior, que é parte do fragmento maior do polipeptídeo, que, por sua vez, é parte do polipeptídeo maior. hLIGHT pode existir em uma forma trimérica (nativa) ou monomérica (desnaturada).
[0057] Os termos “numeração de Kabat,” e termos equivalentes são reconhecidos na técnica e referem-se a um sistema de numeração de resíduos de aminoácido que são mais variáveis (isto é hipervariável) do que outros resíduos de aminoácido nas regiões variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo ou uma porção de ligação de antígeno deste (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 e, Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH No. 91-3242). Para a região variável de cadeia pesada, a hiperregião variável tipicamente varia das posições de aminoácido de 31 a 35 para CDR1, posições de aminoácido de 50 a 65 para a CDR2 e posições de aminoácido de 95 a 102 para a CDR3. Para a região variável de cadeia leve, a hiperregião variável tipicamente varia das posições de aminoácido de 24 a 34 para CDR1, posições de aminoácido de 50 a 56 para CDR2 e posições de aminoácido de 89 a 97 para CDR3.
[0058] O termo “cadeia leve” quando usado em referência a um anticorpo refere-se a dois tipos distintos, chamado capa (K) de lambda (X) com base na sequência de aminoácido dos domínios constantes. As sequências de aminoácido de cadeia leve são bem conhecidas na técnica. Em formas de realização preferidas, a cadeia leve é uma cadeia LIGHT humana.
[0059] Como aqui usado, os termos “controlar,” “controlando,” e “controle” refere-se aos efeitos benéficos que um paciente deriva de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico), que não resulta em uma cura da infecção. Em certas formas de realização, um paciente é administrado com uma ou mais terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos, tais como um anticorpo da invenção) para “controlar” uma doença mediada por hLIGHT (por exemplo, IBD ou GVHD), um ou mais sintomas deste, de modo a prevenir a progressão ou piora da doença.
[0060] O termo “anticorpo monoclonal” refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos homogêneos ou substancialmente homogêneos e cada anticorpo monoclonal tipicamente reconhecerá um único epítopo no antígeno. Em formas de realização preferidas, um “anticorpo monoclonal,” como aqui usado, é um anticorpo produzido por um único hibridoma ou outra célula, em que o anticorpo imunoespecificamente se liga apenas a um epítopo de hLIGHT como determinado, por exemplo, por ELISA ou outro ensaio de ligação de antígeno ou de ligação competitiva conhecido na técnica ou nos Exemplos aqui fornecidos. O termo “monoclonal” não é limitado a qualquer método para fabricar o anticorpo. Por exemplo, anticorpos monoclonais da invenção podem ser fabricados pelo método de hibridoma como descrito em Kohler et al.; Nature, 256: 495 (1975) ou podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago usando as técnicas como aqui descritas, por exemplo. Outros métodos para a preparação de linhagens de célula clonal e de anticorpos monoclonais por meio destas expressados são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, o Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5aEd., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Nova Iorque). Outros métodos exemplares de produzir outros anticorpos monoclonais são fornecidos nos Exemplos aqui.
[0061] Os termos “que ocorre naturalmente” ou “nativo” quando usados em conexão com materiais biológicos tais como moléculas de ácido nucléico, polipeptídeos, células hospedeiras e outros, referem-se àqueles que são encontrados na natureza e não manipulados por um ser humano.
[0062] O termo “farmaceuticamente aceitável” como aqui usado significa ser aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia, European Pharmacopeia ou outra farmacopéia no geral reconhecida para o uso em animais e mais particularmente em seres humanos.
[0063] “Anticorpos policlonais” como aqui usados refere-se a uma população de anticorpo gerada em uma resposta imunogênica a uma proteína tendo muitos epítopos e assim inclui uma variedade de anticorpos diferentes direcionados ao mesmo e a epítopos diferentes dentro da proteína. Métodos para produzir anticorpos policlonais são conhecidos na técnica (Ver, por exemplo, o Capítulo 11 em: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5a Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, Nova Iorque).
[0064] Como aqui usado, o termo “polinucleotídeo,” “nucleotídeo,” “ácido nucléico”, “molécula de ácido nucléico” e outros termos similares são usados intercambiavelmente e incluem DNA, RNA, mRNA e outros.
[0065] Como aqui usado, os termos “prevenir,” “prevenindo,” e “prevenção” referem-se à inibição total ou parcial do desenvolvimento, recorrência, início ou disseminação de uma doença mediada por hLIGHT e/ou sintoma com esta relacionado, resultando da administração de uma terapia ou combinação de terapias aqui fornecidas (por exemplo, uma combinação de agentes profilático ou terapêutico, tais como um anticorpo da invenção).
[0066] Como aqui usado, o termo “agente profilático” refere-se a qualquer agente que possa inibir total ou parcialmente o desenvolvimento, recorrência, início ou disseminação de uma doença mediada por hLIGHT e/ou sintoma com esta relacionado em um paciente. Em certas formas de realização, o termo “agente profilático” refere-se a um anticorpo da invenção. Em certas outras formas de realização, o termo “agente profilático” refere-se a um agente outro que não um anticorpo da invenção. Preferivelmente, um agente profilático é um agente que é conhecido ser útil a ou tenha sido ou esteja sendo correntemente usado para prevenir uma doença mediada por hLIGHT e/ou um sintoma com esta relacionado ou impede o início, desenvolvimento, progressão e/ou severidade de uma doença mediada por hLIGHT e/ou um sintoma com esta relacionado. Em formas de realização específicas, o agente profilático é um anticorpo anti-hLIGHT totalmente humano, tal como um anticorpo anti-hLIGHT monoclonal totalmente humano.
[0067] Em certas formas de realização da invenção, um “título sérico profilaticamente eficaz” é o título sérico em um paciente, preferivelmente um ser humano, que total ou parcialmente iniba o desenvolvimento, recorrência, início ou disseminação de uma doença mediada por hLIGHT e/ou sintoma com esta relacionado no dito paciente.
[0068] O termo “antígeno de hLIGHT” refere-se àquela porção de um polipeptídeo hLIGHT ao qual um anticorpo imunoespecificamente se liga. Um antígeno de hLIGHT também refere-se a um análogo ou derivado de um polipeptídeo hLIGHT ou fragmento deste ao qual um anticorpo imunoespecificamente se liga. Em algumas formas de realização, um antígeno de hLIGHT é um antígeno de hLIGHT monomérico ou um antígeno de hLIGHT trimérico. Uma região de um polipeptídeo hLIGHT que contribui para um epítopo pode ser aminoácidos contíguos do polipeptídeo ou o epítopo pode vir junto de duas ou mais regiões não contíguas do polipeptídeo. O epítopo pode ser ou não um aspecto de superfície tridimensional do antígeno. Uma região localizada na superfície de um antígeno de hLIGHT que é capaz de evocar uma resposta imune é um epítopo de hLIGHT. O epítopo pode ser ou não um aspecto de superfície tridimensional do antígeno.
[0069] Uma “doença mediada por hLIGHT” e “distúrbio mediado por hLIGHT” são usados intercambiavelmente e referem-se a qualquer doença que seja completa ou parcialmente causada por ou é o resultado de hLIGHT. Em certas formas de realização, hLIGHT é aberrantemente (por exemplo, altamente) expressado na superfície de uma célula. Em algumas formas de realização, hLIGHT pode ser aberrantemente super regulada em um tipo de célula particular. Em outras formas de realização, a sinalização de célula normal, aberrante ou excessiva é causada pela ligação de hLIGHT a um ligando de hLIGHT. Em certas formas de realização, o ligando de hLIGHT é um receptor de hLIGHT (por exemplo, HVEM, LTβR ou DCR3), por exemplo, que é expressado na superfície de uma célula, tal como uma célula epitelial colônica. Em certas formas de realização, a doença mediada por hLIGHT é uma doença do intestino inflamatório (IBD), tal como a doença de Crohn (CD) ou colite ulcerativa (UC). Em outras formas de realização, a doença mediada por hLIGHT é a doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD).
[0070] Um “ligando de hLIGHT” refere-se a uma molécula que se liga ou de outro modo interage com hLIGHT. Em formas de realização preferidas, o ligando de hLIGHT é um receptor de hLIGHT.
[0071] Os termos “receptor de hLIGHT” ou “receptor de ligação de hLIGHT” são aqui usados intercambiavelmente e referem-se a um polipeptídeo receptor que se liga a hLIGHT. Em formas de realização específicas, o receptor de hLIGHT é HVEM, FOR ou DcR3. Em algumas formas de realização, o receptor de hLIGHT é expressado na superfície de uma célula, tal como uma célula epitelial colônica.
[0072] O termo “sacarídeo” como aqui usado refere-se a uma classe de moléculas que são derivados de álcoois poliídricos. Sacarídeos são habitualmente aludidos como carboidratos e podem conter quantidades diferentes de unidades de açúcar (sacarídeo), por exemplo, monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos.
[0073] O termo “título sérico” como aqui usado refere-se a um título sérico médio em uma população de no mínimo 10, preferivelmente pelo menos 20 e o mais preferivelmente pelo menos 40 pacientes até cerca de 100, 1000 ou mais.
[0074] Como aqui usado, a expressão “efeitos colaterais” abrange efeitos não desejados e adversos de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico). Os efeitos indesejados não são necessariamente adversos. Um efeito adverso de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico) pode ser nocivo ou desconfortável ou perigosa. Os exemplos de efeitos colaterais incluem, diarréia, tosse, gastroenterite, respiração ofegante, náusea, vômito, anorexia, cólicas abdominais, febre, dor, perda de peso corporal, desidratação, alopecia, dispnéia, insônia, tontura, mucosidade, efeitos nervosos e musculares, fadiga, boca seca e perda de apetite, exantemas ou inchaços no local de administração, sintomas equivalentes à gripe tais como febre, calafrios e fadiga, problemas do trato digestivo e reações alérgicas. Os efeitos indesejados adicionais experimentados pelos pacientes são numerosos e conhecidos na técnica. Muitos são descritos no Physician’s Desk Reference(60aed., 2006).
[0075] O termo “molécula pequena” e termos análogos incluem, mas não são limitados a, peptídeos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácido, polinucleotídeos, análogos de polinucleotídeo, nucleotídeos, análogos de nucleotídeo, compostos orgânicos ou inorgânicos (isto é, incluindo compostos heterorgânicos e/ou organometálicos) tendo um peso molecular menor do que cerca de 10.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor do que cerca de 5,000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor do que cerca de 1.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular menor do que cerca de 500 gramas por mol e sais, ésteres e outras formas farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos.
[0076] Os termos “estabilidade” e “estável” como aqui usados no contexto de uma formulação líquida que compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT refere-se à resistência do anticorpo na formulação ao desdobramento térmico e químico, agregação, degradação ou fragmentação sob as dadas condições de fabricação, preparação, transporte e armazenagem. As formulações “estáveis” da invenção retêm a atividade biológica igual a ou maior do que 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % ou 99,5 % sob as dadas condições de fabricação, preparação, transporte e armazenagem. A estabilidade do anticorpo pode ser avaliada pelos graus de agregação, degradação ou fragmentação pelos métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica, incluindo mas não limitados à Eletroforese em Gel Capilar (rCGE), Eletroforese em Gel de Poliacrilamida Dodecil Sulfato de Sódio (SDS-PAGE) e HPSEC reduzidas, comparadas a um anticorpo referência. A estabilidade global de uma formulação que compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT pode ser avaliado por vários ensaios imunológicos incluindo, por exemplo, ELISA e radioimunoensaios usando o epítopo específico de hLIGHT.
[0077] Como aqui usado, os termos “indivíduo” e “paciente” são usados intercambiavelmente. Como aqui usado, um indivíduo é preferivelmente um mamífero tal como um não primata (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, gatos, cães, ratos, etc.) ou um primata (por exemplo, macacos e seres humanos), o mais preferivelmente um ser humano. Em uma forma de realização, o indivíduo é um mamífero, preferivelmente um ser humano, tendo uma doença mediada por hLIGHT. Em uma outra forma de realização, o indivíduo é um mamífero, preferivelmente um ser humano, em risco de desenvolver uma doença mediada por hLIGHT.
[0078] Como aqui usado “substancialmente todo” refere-se a pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 % ou cerca de 100 %.
[0079] O termo “substancialmente livre de tensoativo” como aqui usado refere-se a uma formulação de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT, a dita formulação contendo menos do que 0,0005 %, menos do que 0,0003 % ou menos do que 0,0001 % de tensoativos e/ou menos do que 0,0005 %, menos do que 0,0003 % ou menos do que 0,0001 % de tensoativos.
[0080] A expressão “substancialmente livre de sal” como aqui usada refere-se a uma formulação de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT, a dita formulação contendo menos do que 0,0005 %, menos do que 0,0003 % ou menos do que 0,0001 % de sais inorgânicos.
[0081] O termo “tensoativo” como aqui usado refere-se a substâncias orgânicas tendo estruturas anfipáticas; a saber, eles são compostos de grupos de tendências de solubilidade opostas, tipicamente uma cadeia de hidrocarboneto solúvel em óleo e um grupo iônico solúvel em água. Os tensoativos podem ser classificados, dependendo da carga da porção ativa na superfície, em tensoativos aniônicos, catiônicos e não iônicos. Os tensoativos são frequentemente usados como agentes umectantes, emulsificantes, solubilizantes e dispersantes para várias composições farmacêuticas e preparações de materiais biológicos.
[0082] Como aqui usado, o termo “rótulo” refere-se a qualquer tipo de porção que seja ligado, por exemplo, a um polipeptídeo e/ou um polinucleotídeo que codifica um hLIGHT ou anticorpo de hLIGHT ou fragmento de ligação de antígeno deste. Por exemplo, um polinucleotídeo que codifica um hLIGHT, anticorpo de hLIGHT ou fragmento de ligação de antígeno deste pode conter uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam rótulo adicionais que codificam, por exemplo, uma porção detectável ou uma porção que ajude na purificação por afinidade. Quando traduzido, o rótulo e o anticorpo podem estar na forma de uma proteína de fusão. Os termos “detectável” ou “detecção” com referência a um rótulo refere-se a qualquer rótulo que é capaz de ser visualizado ou em que a presença do rótulo é de outro modo capaz de ser determinada e/ou medida (por exemplo, pela quantificação). Um exemplo não limitante de um rótulo detectável é um rótulo fluorescente.
[0083] Como aqui usado, o termo “agente terapêutico” refere-se a qualquer agente que pode ser usado no tratamento, controle ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT e/ou um sintoma com esta relacionado. Em certas formas de realização, o termo “agente terapêutico” refere-se a um anticorpo da invenção. Em certas outras formas de realização, o termo “agente terapêutico” refere-se a um agente outro que não um anticorpo da invenção. Preferivelmente, um agente terapêutico é um agente que é conhecido ser útil para ou tem sido ou está sendo correntemente usado para o tratamento, controle ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT ou um ou mais sintomas com esta relacionados. Em formas de realização específicas, o agente terapêutico é um anticorpo anti-hLIGHT totalmente humano, tal como um anticorpo anti-hLIGHT monoclonal totalmente humano.
[0084] A combinação de terapias (por exemplo, uso de agentes profiláticos ou terapêuticos) que é mais eficaz do que os efeitos aditivos de qualquer duas ou mais terapias isoladas. Por exemplo, um efeito sinergístico de uma combinação de agentes profiláticos e/ou terapêuticos permite o uso de dosagens mais baixas de um ou mais dos agentes e/ou administração menos frequente dos ditos agentes a um paciente com uma doença mediada por hLIGHT. A capacidade para utilizar dosagens mais baixas de terapias profiláticas ou terapêuticas e/ou para administrar as ditas terapias menos frequentemente reduz a toxicidade associada com a administração das ditas terapias a um paciente sem reduzir a eficácia das ditas terapias na prevenção, controle, tratamento ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT. Além disso, um efeito sinergístico pode resultar em eficácia melhorada de terapias na prevenção ou no controle, tratamento ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT. Finalmente, efeito sinergístico de uma combinação de terapias (por exemplo, agentes profiláticos ou terapêuticos) pode evitar ou reduzir efeitos colaterais adversos ou não desejados associados com o uso de qualquer terapia isolada.
[0085] Em certas formas de realização da invenção, um “título sérico terapeuticamente eficaz” é o título sérico em um paciente, preferivelmente um ser humano, que reduz a gravidade, a duração e/ou os sintomas associados com uma doença mediada por hLIGHT no dito paciente.
[0086] Como aqui usado, o termo “terapia” refere-se a qualquer protocolo, método e/ou agente que pode ser usado na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT (por exemplo, IBD ou GVHD). Em certas formas de realização, os termos “terapias” e “terapia” referem-se a uma terapia biológica, terapia sustentadora e/ou outras terapias úteis na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT conhecida a uma pessoa de habilidade na técnica tal como pessoal médico.
[0087] Como aqui usados, os termos “tratar,” “tratamento” e “tratando” referem-se à redução ou melhora da progressão, severidade e/ou duração de uma doença mediada por hLIGHT (por exemplo, IBD ou GVHD) resultando da administração de uma ou mais terapias (incluindo, mas não limitados à administração de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos, tal como um anticorpo da invenção). Em formas de realização específicas, tais termos referem-se à redução ou inibição da ligação de hLIGHT a HVEM, a redução ou inibição da ligação de hLIGHT a LTβR, a redução ou inibição da ligação de hLIGHT a DcR3, a redução ou inibição da produção ou secreção de CCL20 a partir de uma célula que expressa um receptor de hLIGHT de um paciente, a redução ou inibição da produção ou secreção de IL-8 a partir de uma célula que expressa um receptor de hLIGHT de um paciente, a redução ou inibição da produção ou secreção de RANTES a partir de uma célula que expressa um receptor de hLIGHT de um paciente e/ou a inibição ou redução de um ou mais sintomas associadas com uma doença mediada por hLIGHT, tal como um IBD ou GVHD. Em formas de realização específicas, um agente profilático é um anticorpo anti-hLIGHT totalmente humano, tal como um anticorpo anti-hLIGHT monoclonal totalmente humano.
[0088] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se a uma porção das cadeias leve e pesada, tipicamente cerca de 120 a 130 aminoácidos do terminal amino na cadeia pesada e cerca de 100 a 110 aminoácidos na cadeia leve, que diferem extensivamente na sequência entre anticorpos e são usados na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para o seu antígeno particular. A variabilidade na sequência é concentrada nestas regiões chamadas de regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) enquanto que as regiões mais altamente conservadas no domínio variável são chamadas regiões de matriz (FR). As CDRs das cadeias leves e pesadas são primariamente responsáveis para a interação do anticorpo com antígeno. A numeração de posições de aminoácido aqui usada está de acordo com o EU Index, como em Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D.C.) 5aed. (“Kabat et al.”). Em formas de realização preferidas, a região variável é uma região variável humana.
[0089] O termo “variante” quando usado em relação a hLIGHT ou a um anticorpo de hLIGHT refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo que compreende um ou mais (tal como, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 25, de cerca de 1 a cerca de 20 e preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 15, mais preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 10 e o mais preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 5) substituições, deleções e/ou adições de sequência de aminoácido quando comparada a uma sequência nativa ou não modificada. Por exemplo, uma variante de hLIGHT pode resultar de um ou mais (tal como, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 25, de cerca de 1 a cerca de 20 e preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 15, mais preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 10 e o mais preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 5) mudanças a uma sequência de aminoácido de hLIGHT nativa. Também por via de exemplo, uma variante de um anticorpo anti-hLIGHT pode resultar de um ou mais (tal como, por exemplo, de cerca de 1 a cerca de 25, de cerca de 1 a cerca de 20 e preferivelmente cerca de 1 a cerca de 15, mais preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 10 e o mais preferivelmente de cerca de 1 a cerca de 5) mudanças a uma sequência de aminoácido de um anticorpo anti-hLIGHT nativo ou anteriormente não modificado. Variantes podem ser de ocorrência natural, tal como variantes alélicas ou de união ou podem ser artificialmente construídas. As variantes de polipeptídeo podem ser preparadas a partir das moléculas de ácido nucléico correspondentes que codificam as ditas variantes. Em formas de realização preferidas, a variante de hLIGHT ou variantes de anticorpo de hLIGHT retêm atividade funcional de hLIGHT ou anticorpo de hLIGHT, respectivamente. Em formas de realização específicas, uma variante de anticorpo de hLIGHT imunoespecificamente liga hLIGHT e/ou é antagonístico para a atividade de hLIGHT. Em certas formas de realização, a variante é codificada por uma variante de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) de hLIGHT. Uma variante de SNP exemplar de hLIGHT codifica um ácido glutâmico (E) ou uma lisina (K) na posição de aminoácido 214. Uma outra variante de SNP exemplar de hLIGHT codifica uma serina (S) ou uma leucina (L) na posição de aminoácido 32.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
[0090] A FIG. 1A-1B representa uma análise citométrica de hLIGHT endogenamente expressada com anticorpo anti-hLIGHT humano. (A) A linha de célula T humana I123.D7 foi ativada com PMA e inonomicina durante a noite e tingido para o marcador de ativação CD69 em combinação com vários anticorpos anti-hLIGHT. As células positivas em CD69 foram fornecidas e analisadas quanto ao tingimento de hLIGHT (linha em negrito) comparada ao IgG1 anti-influenza humana de controle (linha pontilhada) ou tingimento de células I123.D7 não ativadas com anticorpos anti-hLIGHT (linha cinza). A ligação foi detectada com anticorpo secundário de IgG-APC anti-humano de cabra. (B) O tingimento da linhagem de célula T humana ativada II-23.D7 com anticorpos humanos anti-hLIGHT é saturável. As células II-23.D7 ativadas foram rotuladas com anticorpos humanos anti-hLIGHT em várias concentrações e detectadas com IgG-APC anti-humano. As plotagens da média geométrica de dados de intensidade de fluorescência são mostrados junto com a regressão não linear.
[0091] As FIG. 2A-2B representam o tingimento de hLIGHT recombinante na linhagem de célula T EL4-hLIGH com anticorpo anti- hLIGHT humano. Em (A) e (B), quantidades classificadas de anticorpos anti- hLIGHT foram usadas para tingir células EL4-hLIGHT, detectadas com IgG- APC anti-humana e analisada pela citometria de fluxo. A intensidade de fluorescência média geométrica (MFI) foi determinada e a análise de regressão não linear aplicada. Em todos os experimentos a proteína M2 antiinfluenza humana foi usada como um controle negativo. Os dados obtidos desta análise são representados na FIG. 3.
[0092] A FIG. 3 representa características de anticorpos anti-hLIGHT humanos monoclonais.
[0093] A FIG. 4 representa bloqueio cruzado de anticorpo pelo ELISA. esta análise define dois grupos com base na competição quanto a ligação a hLIGHT pelo ELISA. Os anticorpos individuais foram revestidos nos reservatórios de uma placa de 96 reservatórios. FLAG-hLIGHT solúvel foi pré-incubado com anticorpos anti-hLIGHT solúveis e depois adicionados aos reservatórios revestidos. A ligação de FLAG-hLIGHT ao anticorpo revestido foi detectada com IgG-HRP anti-FLAG. A inibição percentual foi determinada usando a OD de cada amostra na seguinte fórmula: % de inibição = (max - amostra/max) x 100.
[0094] As FIGs. 5A e 5B representam o bloqueio da ligação de HVEM humano:Fc ao hLIGHT nativo na superfície da célula pelos anticorpos anti-hLIGHT humanos monoclonais. Em (A) e (B), quantidades classificadas de anticorpos foram incubadas com células EL4-hLIGHT, HVEM humano biotinilado:Fc foi adicionado a uma concentração de sub-saturação e detectadas com SAAPC. Como mostrado em (A), o anticorpo M2 antiinfluenza humano foi usado como um controle.
[0095] As FIGs. 6A e 6B representam o bloqueio da ligação de LTβR humano:Fc ao hLIGHT nativo na superfície da célula pelos anticorpos anti- hLIGHT humanos monoclonais. Em (A)-(B), quantidades classificadas de anticorpos foram incubados com células EL4-hLIGHT, LTβR humano alvejado com poliHis:Fc foi adicionado em uma concentração de sub- saturação e detectado com anti-His-APC. Como mostrado em (A), o anticorpo M2 anti-influenza humano foi usado como um controle.
[0096] A FIG. 7 representa a secreção de CCL20 mediada por hLIGHT a partir de células epiteliais colônicas humanas. hLIGHT solúvel recombinante foi adicionado ao meio de cultivo de células HT29.14s em concentrações crescentes. O meio de cultivo foi colhido no dia 3 após o tratamento e níveis de CCL20 foram determinados pelo ELISA. As barras de erro indicam dois tratamentos independentes.
[0097] A FIG. 8 representa a secreção de IL-8 e RANTES mediada por hLIGHT a partir de células epiteliais colônicas humanas. hLIGHT solúvel recombinante, TNF, LTα1β2 e FLAG-BAP (como um controle negativo) foram adicionados ao meio de cultivo de células HT29.14s. O meio de cultivo foi colhido de reservatórios diferentes nos dias 1, 2 e 3 pós-tratamento. Os níveis de IL-8 e RANTES foram determinados pelo ELISA. A fosfatase alcalina bacteriana rotulada com FLAG (FLAG-BAP) foi usada como um controle negativo de proteína irrelevante alvejada.
[0098] As FIGs. 9A e 9B mostram que o anticorpo anti-hLIGHT humano inibe a secreção de CCL20 mediada por hLIGHT a partir de células epiteliais colônicas humanas. (A) hLIGHT solúvel recombinante (1 μg/ml) foi pré-incubada com anticorpos anti-hLIGHT e adicionado ao meio de cultivo de células HT29.14s. O meio de cultivo foi colhido de dois reservatórios de cada tratamento no dia 3. Os níveis de CCL20 foram determinados pelo ELISA. Os meios sozinhos, hLIGHT solúvel sozinho, hLIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 anti-influenza e cada anticorpo anti-hLIGHT sozinho foram incluídos como controles. (B) A análise de regressão não linear de dados representados no painel A.
[0099] As FIGs. 10A e 10B mostram anticorpo anti-hLIGHT humano inibem a secreção de RANTES mediada por hLIGHT expressado na superfície da célula a partir de células epiteliais colônicas humanas. (A) células EL4-hLIGHT fixas foram pré-incubadas com anticorpos anti-hLIGHT e adicionadas ao meio de cultivo de células HT29.14s. O meio de cultivo foi colhido de dois reservatórios para cada tratamento no dia 3. Os níveis de RANTES foram determinados pelo ELISA. Os meios sozinhos, as células EL4-hLIGHT sozinhas, hLIGHT solúvel sozinho e cada anticorpo anti- hLIGHT sozinho foram incluídos como controles. (B) A plotagem dos dados representados em (A).
[00100] A FIG. 11 representa os resultados de um experimento de bloqueio competitivo quanto a ligação a hLIGHT.
[00101] A FIG. 12 representa a atividade de bloqueio de anticorpos para a ligação de HVEM:Fc às células 293 hLIGHT. Anticorpos anti-hLIGHT humanos monoclonais E1, E13 F19, o mAb R&D e os anticorpos policlonais anti-hLIGHT de cabra comercialmente disponíveis (R&D Systems) e anticorpos policlonais anti-hLIGHT de coelho (eBioscience) foram testados quanto a sua capacidade para bloquear a ligação de HVEM:Fc às células 293 que expressa hLIGHT.
[00102] A FIG. 13 representa a atividade de bloqueio de anticorpos para a ligação de LTβR:Fc à células 293 hLIGHT. Os anticorpos anti- hLIGHT humanos monoclonais E1 e E13, o mAb R&D e anticorpos policlonais anti-hLIGHT de cabra comercialmente disponíveis (R&D Systems) e anticorpos policlonais anti-hLIGHT de coelho (eBioscience) foram testados quanto a sua capacidade para bloquear a ligação de LTβR:Fc às células 293 que expressam hLIGHT.
[00103] A FIG. 14 representa a atividade de bloqueio de anticorpos para (A) LTβR:Fc e (B) ligação de HVEM:Fc às células 293 hLIGHT e é uma representação gráfica dos dados mostrados nas FIGS. 12 e 13.
[00104] As FIGs. 15A e 15B representam a ligação de vários anticorpos anti-hLIGHT ao hLIGHT solúvel nativo ou desnaturado. Cinco microgramas de LIGHT humano solúvel foi fervido em tampão de amostra 2 x SDS (desnaturado) ou não tratado (nativo) e depois ambos foram diluídos em série em incrementos de 6x. 5 ml de cada diluição de hLIGHT foram manchados simultaneamente sobre membranas de 0,2 pri PVDF hidratado (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando uma pipeta de 8 canais múltiplos. As manchas foram deixadas secar ao ar depois re-hidratadas, bloqueadas (1 x TBST (solução salina tamponada com Tris Tween-20) +2,5 % de leite desnatado + 0,02 % de azida de sódio). Cada mancha foi sondada com 5 μg/ml de cada anticorpo primário. As manchas foram lavadas 3x e 1x TBST seguido pelo Abs secundário biotinilado (Biotina-Cabra αHumano (Vector Labs, Burlingame, CA), Biotina-Cabra α camundongo (Jackson labs, Bar Harbor, ME), Biotina-Camundongo α cabra (Sigma-Aldrich corp., St. Louis, MO)) a 5 μg/ml. As manchas foram lavadas 3x em 1x TBST seguido pelo super SA-HRP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A quimioluminescência foi usada para a detecção usando o kit de detecção ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e o sinal foi visualizado pela exposição à película de formação de imagem X-OMAT AR (Kodak, Rochester, Nova Iorque). (A) Os resultados de Dot Blot usando os mAbs anti- hLIGHT humanos E1, E13, E63, F19, F23 ou dois anticorpos anti-hLIGHT monoclonais de murino comercialmente disponíveis da R&D Systems (“mAb de camundongo da R&D”) e Abnova (“mAb de camundongo da Abnova”). Um anticorpo anti-M2 (antígeno irrelevante) foi usado como um controle negativo. (B) Os resultados de Dot Blot usando uma preparação de anticorpo policlonal anti-hLIGHT de cabra comercial (R&D Systems “pAb de cabra da R&D”) ou duas preparações de anticorpo policlonal anti-hLIGHT de coelho comerciais (eBioscience (“pAb de coelho da eBioscience”) e Peprotech (“pAb de coelho da Peprotech”)).
[00105] A FIG. 16 representa a ligação de vários anticorpos anti- hLIGHT ao hLIGHT solúvel nativo ou desnaturado e resume os dados apresentados na FIG. 15 na forma de tabela.
[00106] A FIG. 17 mostra que os anticorpos anti-LIGHT humanos da invenção inibem a secreção de CCL20 mediada por LIGHT a partir de células epiteliais colônicas humanas, ao passo que os anticorpos anti-hLIGHT de camundongo comercialmente disponíveis não. LIGHT humano solúvel recombinante (1 μg/m1) foi pré-incubada com anticorpos anti-LIGHT e adicionado ao meio de cultivo de células HT29.14s. O meio de cultivo foi colhido de dois reservatórios de cada tratamento no dia 3. Os níveis de CCL20 foram determinados pelo ELISA. O meio sozinho, LIGHT solúvel sozinho, LIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 anti-influenza, Ab anti-LIGHT não bloqueador B 12 e cada anticorpo anti-LIGHT sozinho foram incluídos como controles. E1 e F19 são representativos de cada grupo de epítopo de bloqueio cruzado.
[00107] A FIG. 18 mostra que os anticorpos anti-LIGHT humanos da invenção inibem a secreção de RANTES mediada por LIGHT a partir de células epiteliais colônicas humanas, ao passo que anticorpos anti-hLIGHT de camundongo comercialmente disponíveis não. LIGHT humano solúvel recombinante (1 μg/ml) foi pré-incubado com anticorpos anti-LIGHT e adicionados ao meio de cultivo de células HT29.14s. O meio de cultivo foi colhido de dois reservatórios de cada tratamento no dia 3. Os níveis de RANTES foram determinados pelo ELISA. O meio sozinho, LIGHT solúvel sozinho, LIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 anti-influenza, Ab antiLIGHT não bloqueador B 12 e cada anticorpo anti-LIGHT sozinho foram incluídos como controles. E1 e F19 são representativos de cada grupo de epítopo de bloqueio cruzado.
[00108] As FIGS. 19A a 19B representam uma análise citométrica da ligação de hLIGHT expressado na superfície da célula pelo E1 humano (A) ou (B) anticorpos F19 anti-hLIGHT em comparação com suas contrapartes de anticorpo de cadeia capa única recombinante. hLIGHT estável que expressa células 293 foram incubados com quantidades crescentes de anticorpos antiLIGHT indicados na legenda. A ligação foi detectada com anticorpo secundário de IgG-APC anti-humano de cabra. Os anticorpos foram purificados de culturas de hibridoma ou células 293F transitoriamente transfectadas com vetores de expressão de mamífero que codificam os diferentes cDNAs da cadeia capa emparelhada com o gene da cadeia pesada. As plotagens da média geométrica dos dados de intensidade de fluorescência são mostradas junto com a regressão não linear.
[00109] A FIG. 20 representa o bloqueio cruzado do anticorpo pelo ELISA comparando anticorpos da cadeia capa únicos com as suas contrapartes precursoras. Esta análise define dois grupos com base na competição quanto a ligação a hLIGHT pelo ELISA. os anticorpos individuais foram revestidos nos reservatórios de uma placa de 96 reservatórios. FLAG-hLIGHT solúvel foi pré-incubada com anticorpos anti- hLIGHT solúvel e depois adicionados aos reservatórios revestidos. A ligação de FLAG-hLIGHT ao anticorpo revestido foi detectado com anti-FLAG IgG- HRP. A inibição percentual foi determinada usando a OD de cada amostra na seguinte fórmula: % de inibição = (max - amostra/max) x 100.
[00110] As FIGS. 21A-21B representam o bloqueio das ligações (A) HVEM humano:Fc ou (B) LTβR humano:Fc ao hLIGHT nativo na superfície da célula pelos anticorpos anti-hLIGHT humanos monoclonais e as suas contrapartes recombinantes de cadeia capa única. Quantidades classificadas de anticorpos foram incubadas com células EL4-hLIGHT, HVEM humano biotinilado:Fc ou LTβR humano rotulado com poliHis:Fc adicionado a uma concentração de sub-saturação e depois detectado com SA-APC ou anti-His- APC. Os anticorpos foram purificados a partir de culturas de hibridoma ou células 293F transitoriamente transfectadas com vetores de expressão de mamífero que codificam os diferentes cDNAs da cadeia capa emparelhados com o gene da cadeia pesada.
[00111] A FIG. 22 representa a inibição da secreção de CCL20 mediada por hLIGHT a partir de células epiteliais colônicas humanas pelos anticorpos anti-LIGHT humanos da cadeia capa únicos recombinantes comparados com os anticorpos produzidos pelo hibridoma precursor. LIGHT humano solúvel recombinante (1 μg/ml) foi pré-incubado com anticorpos anti-LIGHT e adicionados ao meio de cultivo de células HT29.14s. O meio de cultivo foi colhido de dois reservatórios de cada tratamento no dia 3. Os níveis de CCL20 foram determinados pelo ELISA. O meio sozinho, LIGHT solúvel sozinho (SHL), LIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 anti- influenza ou cada anticorpo na ausência de LIGHT solúvel foram incluídos como controles. Os anticorpos aludidos como “E1 k2” compreendem E1capa(B) e “F19k2” compreendem F19capa(B).
[00112] A FIG. 23 mostra que os anticorpos anti-LIGHT humanos da invenção inibem a secreção de CCL20 mediada por LIGHT a partir de células epiteliais colônicas humanas, ao passo que os anticorpos anti-hLIGHT de camundongo comercialmente disponíveis não inibem (Abnova) ou inibem apenas em concentrações excessivamente altas (100 μg/ml) (R&D). LIGHT humano solúvel recombinante (1 μg/ml) foi pré-incubado com anticorpos anti-LIGHT e adicionados ao meio de cultivo de células HT29.14s. O meio de cultivo foi colhido de dois reservatórios de cada tratamento no dia 3. Os níveis de CCL20 foram determinados pelo ELISA. O meio sozinho, LIGHT solúvel sozinho (SHL), LIGHT solúvel incubado com anticorpo M2 antiinfluenza irrelevante, albumina sérica anti ser humano ou cada anticorpo na ausência de solúvel LIGHT foram incluídos como controles. E1 e F19 são representativos de cada grupo de epítopo de bloqueio cruzado.
[00113] As FIGS. 24A-24B representam a freqüência alélica de certos hLIGHT variantes de polimorfismos de nucleotídeo único não sinônimos (SNP) (a) que codificam um ácido glutâmico (E) ou lisina (K) na posição de aminoácido 214; ou (B) que codificam uma leucina (L) ou serina (S) na posição de aminoácido 32) através de várias populações étnicas.
[00114] FIG. 25A-25D. As FIGS. 25A a 25C representam uma titulação de dose do tingimento de linhagens de célula que expressam variantes SNP não sinônimas de LIGHT humano com os anticorpos anti- hLIGHT humanos 124F23 e 124E1capa((B). Quantidades classificadas de anticorpos anti-hLIGHT foram usadas para tingir células EL4-hLIGHT que expressam a variante SNP (A) 214E-32S (B) 214K-32S ou (C) 214E-32L, detectada com IgG-APC anti-humano e analisada pela citometria de fluxo. (D) representa uma titulação de dose do bloqueio mediado pelo anticorpo anti-LIGHT humano da ligação HVEM human:Fc (quadrados) ou LTβR:Fc (triângulos) à superfície de célula expressada 214K-32S LIGHT variante SNP realizada como na FIG. 5. Para (A)-(D) a intensidade de fluorescência média geométrica (MFI) foi determinada e a análise de regressão não linear aplicada.
[00115] As FIGS. 26A e 26B representam uma análise citométrica de fluxo de linhagens de célula que expressam variantes de SNP não sinônimas com anticorpo anti-hLIGHT humano. (A) a linhagem de célula EL4-LIGHT SNP 214E e (B) a linhagem de célula EL4 SNP 214K foi tingida com uma concentração (10 μg/ml) de cada anticorpo anti-hLIGHT. A ligação foi detectada com anticorpo secundário IgG-APC anti-humano de cabra. IgG humano de controle de isótipo foi usado como um controle negativo.
[00116] A FIG. 27 representa a inibição pelo anticorpo humano anti- hLIGHT de hLIGHT expressado na superfície da célula da secreção de RANTES mediada pela variante SNP a partir de células epiteliais colônicas humanas. hLIGHT solúvel recombinante (SHL) (1 μg/ml) ou 5 x 105de células de variante SNP de EL4-hLIGHT 214K ou 214E foram pré incubadas com anticorpos anti-hLIGHT e adicionado ao meio de cultivo de células HT29.14s. O meio de cultivo foi colhido de dois reservatórios de cada tratamento no dia 3. Os níveis de RANTES foram determinados pelo ELISA. Meio sozinho, células EL4-hLIGHT sozinhas, hLIGHT solúvel sozinho e cada anticorpo anti-hLIGHT sozinho foram incluídos como controles.
[00117] A FIG. 28 representa uma representação esquemática do modelo GVHD xenogênico agudo. Camundongos SCID são injetados com um anticorpo IL2RI3 (TM-131) no dia -2 para esgotar as células NK. No dia - 1, os camundongos recebem 2,5 Gy de irradiação subletal. No dia 0, os camundongos recebem 10 milhões de PBMC humana pela injeção intraperitoneal seguido imediatamente pela injeção intravenosa de um antiLIGHT humano ou anticorpo de controle negativo. Os camundongos são pesados em intervalos de 3 a 4 dias e no dia 12, os camundongos são sacrificados e avaliados quanto a patologia principal. Os baços são removidos para a análise citométrica de fluxo, os cecos são removidos para histologia e o soro é coletado quanto a citocina e análise de anticorpo.
[00118] A FIG. 29 representa as contagens de patologia principal observadas no modelo de doença GVHD xenogênica aguda de murino. As contagens de patologia para injeção sem anticorpo monoclonal (círculos), injeção de anticorpo anti-hLIGHT monoclonal 124F23 (triângulos) e anticorpo monoclonal IgG1 humana de controle (quadrados) são representados. Contagem de 0, 1, 2 ou 3 (nenhum, brando, moderado ou severo, respectivamente) são designado para cada uma das três categorias: diarréia, inflamação peritoneal/ascite e inflamação intestinal (contagem total máxima de 9).
[00119] A FIG. 30 representa as contagens de histopatologia observadas no modelo de doença GVHD xenogênica aguda de murino. As contagens de patologia para injeção sem MAb (círculos), injeção de MAb anti-hLIGHT 124F23 (triângulos) e MAb hIgG1 de controle (quadrados) são representados. As contagens de 0, 1, 2 ou 3 (nenhum, brando, moderado ou severo, respectivamente) são designados para cada um das quatro categorias: severidade de inflamação, grau de inflamação, dano/atrofia de vilosidade e envolvimento percentual (contagem máxima total de 12).
[00120] As FIGS. 31A a 31B representam seções tingidas com hematoxilina e eosina (H&E) histológicas representativas do ceco de camundongo no estudo de GVHD. (A) Seção de ceco de camundongo tratada com MAb anti-LIGHT e (B) camundongo tratado com IgG humana de controle. A involução da sub-mucosa indica ascite, as setas tracejadas indicam regiões de sangue e as setas sólidas indicam uma região de infiltrado de linfócito.
[00121] A FIG. 32 representa números de célula T total no baço de camundongos no estudo de GVHD xenogênico. Os asteriscos indicam valores do teste t de student de menos do que 0,05 para as comparações entre animais tratados com MAb anti-LIGHT e controles.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00122] São aqui fornecidos anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Também são fornecidos ácidos nucléicos isolados que codificam anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Além disso, são fornecidos vetores e células hospedeiras que compreendem ácidos nucléicos que codificam anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Também são fornecidos métodos de fabricar anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Também é aqui fornecido um método de tratar ou controlar uma doença mediada por hLIGHT que compreende administrar um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT.
ANTICORPOS
[00123] Os anticorpos da invenção incluem, mas não são limitados a, anticorpos sintéticos, anticorpos monoclonais, anticorpos recombinantemente produzidos, anticorpos multiespecíficos (incluindo anticorpos biespecíficos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, intracorpos, Fvs de cadeia única (scFv) (por exemplo, incluindo monoespecíficos, biespecíficos, etc.), anticorpos camelizados, fragmentos de Fab, fragmentos de F(ab’), Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), anticorpos anti- idiotípicos (anti-Id) e fragmentos de ligação de epítopo de qualquer um dos acima.
[00124] Em particular, os anticorpos aqui fornecidos incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT. As moléculas de imunoglobulina aqui fornecidas podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. Em uma forma de realização específica, um anticorpo é aqui fornecido um anticorpo de IgG, preferivelmente um IgG1 ou IgG4.
[00125] Variantes e derivados de anticorpos incluem fragmentos de anticorpo que retêm a capacidade para se ligar especificamente a um epítopo. Os fragmentos preferidos incluem fragmentos de Fab (um fragmento de anticorpo que contém o domínio de ligação de antígeno e compreende uma cadeia leve e parte de um cadeia pesada ligada em ponte por uma ligação de dissulfeto); Fab’ (um fragmento de anticorpo contendo um domínio de anti- ligação única que compreende um Fab e uma porção da cadeia pesada adicional através da região de dobradiça); F(ab’)2 (duas moléculas Fab’ unidas pelas ligações de dissulfeto intercadeia nas regiões de dobradiça das cadeias pesadas; as moléculas Fab’ podem ser direcionadas contra os mesmos ou epítopos diferentes); um Fab biespecífico (uma molécula Fab tendo dois domínios de ligação de antígeno, cada um dos quais pode ser direcionado a um epítopo diferente); uma cadeia Fab de cadeia única que compreende uma região variável, também conhecida como, um sFv (a região variável, determinativa de ligação de antígeno de uma cadeia leve e pesada única de um anticorpo ligados juntos por uma cadeia de 10 a 25 aminoácidos); um Fv ou dsFv ligados a dissulfeto (a região determinativa variável, de ligação de antígeno de uma cadeia leve e pesada única de um anticorpo ligados entre si por uma ligação de dissulfeto); um VH camelizado (a região variável, determinativa de ligação de antígeno de uma cadeia pesada única de um anticorpo em que alguns aminoácidos na interface VH são aqueles encontrados na cadeia pesada de anticorpos de camelo que ocorrem naturalmente); um sFv biespecífico (uma molécula de sFv ou um dsFv tendo dois domínios de ligação de antígeno, cada um dos quais podem ser direcionados a um epítopo diferente); um diacorpo (um sFv dimerizado formado quando o domínio VH de um primeiro sFv se parece com o domínio VL de um segundo sFv e o domínio VL do primeiro sFv se parece com o domínio VH do segundo sFv; as duas regiões de ligação de antígeno do diacorpo podem ser direcionadas para os mesmos ou epítopos diferentes); e um triacorpo (um sFv trimerizado, formado em uma maneira similar a um diacorpo, mas em que três domínios de ligação de antígeno são criados em um complexo único; os três domínios de ligação de antígeno podem ser direcionados para o mesmo ou epítopos diferentes). Os derivados de anticorpos também incluem uma ou mais sequências de CDR de um sítio que combina anticorpo. As sequências de CDR podem ser ligadas entre si em um esqueleto quando duas ou mais sequências de CDR estão presentes. Em certas formas de realização, o anticorpo a ser usado com a invenção compreende uma Fv de cadeia única (“scFv”). scFvs são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios VH e VL de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma cadeia de polipeptídeo única. No geral, o polipeptídeo de scFv compreende ainda um ligador de polipeptídeo entre os domínios de VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de scFvs ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonals Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, pp. 269-315 (1994).
[00126] Os anticorpos da invenção podem ser de qualquer origem animal incluindo pássaros e mamíferos (por exemplo, ser humano, murino, burro, ovelha, coelho, cabra, porquinho da Índia, camelo, cavalo ou galinha). Em certas formas de realização, os anticorpos da invenção são anticorpos humanos ou humanizados monoclonais. Como aqui usado, anticorpos “humanos” incluem anticorpos tendo a sequência de aminoácido de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulina humana ou de camundongos que expressam anticorpos de genes humanos.
[00127] Em formas de realização preferidas, os anticorpos da invenção são anticorpos totalmente humanos, tais como anticorpos totalmente humanos que imunoespecificamente ligam um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Tais anticorpos totalmente humanos seriam vantajosos em relação aos totalmente de camundongo (ou outros anticorpos totais ou parciais de espécies não humanas), anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos para minimizar o desenvolvimento de efeitos colaterais não desejados ou não necessários, tais como respostas imunes direcionadas para anticorpos não totalmente humanos (por exemplo, anticorpos anti-hLIGHT derivados de outras espécies) quando administrados ao paciente.
[00128] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos ou de multiespecificidades maiores. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de um polipeptídeo hLIGHT ou pode ser específico tanto para um polipeptídeo hLIGHT assim como para um epítopo heterólogo, tais como um polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido. Em formas de realização preferidas, os anticorpos são aqui fornecidos monoespecíficos para um dado epítopo de um polipeptídeo hLIGHT e não se ligam imunoespecificamente a outros epítopos.
[00129] Em formas de realização preferidas, os anticorpos das composições que compreendem os anticorpos e métodos de usar os anticorpos da presente invenção incluem um anticorpo E1, E13, E63, F19 ou F23 (Acesso ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728, respectivamente). Também são aqui fornecidos hibridomas que produzem anticorpos E1, E13, E63, F19 ou F23 (Acesso ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728, respectivamente) e/ou outros anticorpos anti-hLIGHT monoclonais aqui descritos.
[00130] Em certas formas de realização, um anticorpo isolado é aqui fornecido que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada (por exemplo, em uma maneira dependente da dose) por: (a) um anticorpo E1, anticorpo E13 ou anticorpo E63 ou (b) um anticorpo F19 ou anticorpo F23; com a condição de que a ligação ao epítopo de hLIGHT não seja bloqueada por ambos de: (a) o anticorpo E1 e o anticorpo F19, (b) o anticorpo E1 e o anticorpo F23, (c) o anticorpo E13 e o anticorpo F19, (d) o anticorpo E13 e o anticorpo F23, (e) o anticorpo E63 e o anticorpo F19 ou (f) o anticorpo E63 e o anticorpo F23. O anticorpo pode ser ou não um anticorpo totalmente humano. Em formas de realização preferidas, o anticorpo é um anticorpo anti-hLIGHT monoclonal totalmente humano e ainda mais preferivelmente um anticorpo anti-hLIGHT monoclonal, antagonista totalmente humano. Os testes de bloqueio competitivos exemplares que podem ser usados são fornecidos nos Exemplos aqui.
[00131] Em outras formas de realização, um anticorpo isolado, preferivelmente um anticorpo totalmente humano, é aqui fornecido que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada (por exemplo, em uma maneira dependente da dose) por: (a) um anticorpo E1, anticorpo E13 ou anticorpo E63 ou (b) um anticorpo F19 ou anticorpo F23. O anticorpo pode ser ou não um anticorpo totalmente humano. Em formas de realização preferidas, o anticorpo é um anticorpo anti-hLIGHT monoclonal totalmente humano e ainda mais preferivelmente um anticorpo anti-hLIGHT monoclonal, antagonista totalmente humano. Os testes de bloqueio competitivo exemplares que podem ser usados são fornecidos nos Exemplos aqui.
[00132] Em algumas formas de realização, os anticorpos aqui fornecidos competem (por exemplo, em uma maneira dependente da dose) com HVEM, LTβR e/ou DcR3 (ou proteína(s) de fusão destes) quanto a ligação a hLIGHT expressado na superfície da célula. Em outras formas de realização, os anticorpos aqui fornecidos competem (por exemplo, em uma maneira dependente da dose) com HVEM, LTβR e/ou DcR3 (ou proteína(s) de fusão destes) quanto a ligação a hLIGHT solúvel. Os ensaios de ligação competitiva exemplares que podem ser usados são fornecidos nos Exemplos aqui. Em uma forma de realização, o anticorpo parcial ou completamente inibe a ligação de HVEM, LTβR e/ou DcR3 a hLIGHT expressado na superfície da célula, tal como hLIGHT. Em uma outra forma de realização, o anticorpo parcial ou completamente inibe a ligação de HVEM, LTβR e/ou DcR3 a hLIGHT solúvel. Em algumas formas de realização, os anticorpos aqui fornecidos parcial ou completamente inibem a secreção de CCL20, IL-8 e/ou RANTES a partir de uma célula tendo ligando de hLIGHT expressado na superfície da célula, tal como um receptor de hLIGHT (por exemplo, HVEM, LTβR e/ou DcR3). Em certas formas de realização, a célula que expressa o receptor de hLIGHT é uma célula epitelial colônica.
[00133] Os anticorpos da presente invenção incluem aqueles anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno dos seguintes anticorpos: um anticorpo E1 (Acesso ATCC No PTA-7729), anticorpo E13 (Acesso ATCC No PTA- 7842) ou anticorpo E63 (Acesso ATCC No PTA-7818), um anticorpo F19 (Acesso ATCC No PTA-7819) ou anticorpo F23 (Acesso ATCC No PTA- 7728), na Seção de Exemplos e em outro lugar no pedido. Em uma forma de realização específica, um anticorpo da presente invenção é anticorpo E1, E13, E63, F19 ou F23. Em uma outra forma de realização, um anticorpo da invenção compreende um fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, um fragmento Fab) de E1 e 13, E63, F19 ou F23.
[00134] Preferivelmente, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais, totalmente humanos tais como anticorpos monoclonais antagonistas totalmente humanos, que imunoespecificamente se ligam a hLIGHT.
[00135] Em algumas formas de realização, os anticorpos aqui fornecidos se ligam a um epítopo de hLIGHT que é um aspecto de superfície tridimensional de um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, em uma forma trimérica de um polipeptídeo hLIGHT). Uma região de um polipeptídeo hLIGHT que contribui para um epítopo pode ser aminoácidos contíguos do polipeptídeo ou o epítopo pode vir junto de duas ou mais regiões não contíguas do polipeptídeo. Um epítopo de hLIGHT pode estar presente em (a) a forma trimérica (“um epítopo de hLIGHT trimérico”) de hLIGHT, (b) a forma monomérica (“um epítopo de hLIGHT monomérico”) de hLIGHT, (c) tanto a forma trimérica quanto a monomérica de hLIGHT, (d) a forma trimérica, mas não a forma monomérica de hLIGHT ou (e) a forma monomérica, mas não a forma trimérica de hLIGHT.
[00136] Por exemplo, em algumas formas de realização, o epítopo está apenas presente ou disponível para a ligação na forma trimérica (nativa), mas não está presente ou disponível para a ligação na forma monomérica (desnaturada) por um anticorpo anti-hLIGHT. Em outras formas de realização, o epítopo de hLIGHT é aspecto linear do polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, em uma forma trimérica ou forma monomérica do polipeptídeo hLIGHT). Anticorpos aqui fornecidos podem imunoespecificamente se ligar a (a) um epítopo da forma monomérica de hLIGHT, (b) um epítopo da forma trimérica de hLIGHT, (c) um epítopo da forma monomérica mas não a forma trimérica de hLIGHT, (d) um epítopo da forma trimérica mas não a forma monomérica de hLIGHT ou (e) tanto a forma monomérica quanto a forma trimérica de hLIGHT. Em formas de realização preferidas, os anticorpos aqui fornecidos imunoespecificamente se ligam a um epítopo da forma trimérica de hLIGHT mas não se ligam imunoespecificamente a um epítopo da forma monomérica de hLIGHT.
[00137] Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece um ou mais anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo uma cadeia VH e/ou cadeia VL tendo a sequência de aminoácido de uma cadeia VH e/ou cadeia VL de um anticorpo E1, E13, E63, F19 e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA- 7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728.
[00138] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece um ou mais anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo um domínio VH e/ou VL tendo a sequência de aminoácido de um domínio VH e/ou domínio VL de anticorpo E1, E13, E63, F19 e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728.
[00139] Em uma outra forma de realização, a presente invenção fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo uma, duas, três ou mais CDRs tendo a sequência de aminoácido de uma, duas, três ou mais CDRs de anticorpo E1, E13, E63, F19 e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728.
[00140] Em uma forma de realização, a presente invenção fornece um ou mais anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo uma combinação de CDRs de VH e/ou CDRs de VL tendo a sequência de aminoácido das CDRs de VH e/ou CDRs de VL de E1, E13, E63, F19 e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA- 7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728.
[00141] A presente invenção fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo uma cadeia VH e/ou cadeia VL tendo uma sequência de aminoácido de uma cadeia VH e/ou cadeia VL, respectivamente, de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada em um maneira dependente da dose por: (a) um anticorpo E1, E13 ou E63 ou (b) um anticorpo F19 ou F23; com a condição de que a ligação ao epítopo de hLIGHT não seja bloqueada por ambos de: (a) o anticorpo E1 e o F19, (b) o anticorpo E1 e o F23, (c) o anticorpo E13 e o F19, (d) o anticorpo E13 e o F23, (e) o anticorpo E63 e o F19 ou (f) o anticorpo E63 e o F23.
[00142] A presente invenção também fornece anticorpos totalmente humanos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo uma cadeia VH e/ou cadeia VL tendo uma sequência de aminoácido de uma cadeia VH e/ou cadeia VL, respectivamente, de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada em uma maneira dependente da dose por: (a) um anticorpo E1, anticorpo E13 ou anticorpo E63 ou (b) um anticorpo F19 ou anticorpo F23. Preferivelmente, o anticorpo totalmente humano é um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00143] A presente invenção fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo um domínio VH e/ou domínio VL tendo uma sequência de aminoácido de um domínio VH e/ou domínio VL, respectivamente, de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada em uma maneira dependente da dose por: (a) um anticorpo E1, E13 ou E63 ou (b) um anticorpo F19 ou F23; com a condição de que a ligação ao epítopo de hLIGHT não seja bloqueada por ambos de: (a) o anticorpo E1 e o F19, (b) o anticorpo E1 e o F23, (c) o anticorpo E13 e o F19, (d) o anticorpo E13 e o F23, (e) o anticorpo E63 e o F19 ou (f) o anticorpo E63 e o F23.
[00144] A presente invenção também fornece anticorpos totalmente humanos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo um domínio VH e/ou domínio VL tendo uma sequência de aminoácido de um domínio VH e/ou domínio VL, respectivamente, de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada em um maneira dependente da dose por: (a) um anticorpo E1, anticorpo E13 ou anticorpo E63 ou (b) um anticorpo F19 ou anticorpo F23. Preferivelmente, o anticorpo totalmente humano é um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00145] A presente invenção fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo um, duas ou três CDRs de VH (isto é, CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH) tendo uma sequência de aminoácido uma, duas ou três CDRs de VH, respectivamente, de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada em um maneira dependente da dose por: (a) um anticorpo E1, E13 ou E63 ou (b) um anticorpo F19 ou F23; com a condição de que a ligação ao epítopo de hLIGHT não seja bloqueada por ambos de: (a) o anticorpo E1 e o F19, (b) o anticorpo E1 e o F23, (c) o anticorpo E13 e o F19, (d) o anticorpo E13 e o F23, (e) o anticorpo E63 e o F19 ou (f) o anticorpo E63 e o F23.
[00146] A presente invenção também fornece anticorpos totalmente humanos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, o dito compreendendo uma, duas ou três CDRs de VH (isto é, CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH) tendo uma sequência de aminoácido uma, duas ou três CDRs de VH, respectivamente, de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada em um maneira dependente da dose por: (a) um anticorpo E1, anticorpo E13 ou anticorpo E63 ou (b) um anticorpo F19 ou anticorpo F23. Preferivelmente, o anticorpo totalmente humano é um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00147] A presente invenção fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo uma, duas ou três CDRs de VL (isto é, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL) tendo uma sequência de aminoácido uma, duas ou três CDRs de VL, respectivamente, de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada em um maneira dependente da dose por: (a) um anticorpo E1, E13 ou E63 ou (b) um anticorpo F19 ou F23; com a condição de que a ligação ao epítopo de hLIGHT não seja bloqueada por ambos de: (a) o anticorpo E1 e o F19, (b) o anticorpo E1 e o F23, (c) o anticorpo E13 e o F19, (d) o anticorpo E13 e o F23, (e) o anticorpo E63 e o F19 ou (f) o anticorpo E63 e o F23.
[00148] A presente invenção também fornece anticorpos totalmente humanos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, o dito compreendendo uma, duas ou três CDRs de VL (isto é, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL) tendo uma sequência de aminoácido uma, duas ou três CDRs de VL, respectivamente, de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que a ligação ao epítopo de hLIGHT pelo anticorpo é competitivamente bloqueada em um maneira dependente da dose por: (a) um anticorpo E1, anticorpo E13 ou anticorpo E63 ou (b) um anticorpo F19 ou anticorpo F23. Preferivelmente, o anticorpo totalmente humano é um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00149] A presente invenção também fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo uma ou mais CDRs de VH (isto é, CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH) tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDRs de VH (isto é, CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH) de E1, E13, E63, F19 e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728; ou qualquer combinação dos mesmos.
[00150] Em uma forma de realização, os anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT compreendem um domínio VH tendo a sequência de aminoácido do domínio VH representado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5 e/ou um domínio VL tendo a sequência de aminoácido do domínio VL representado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91 ou 10.
[00151] Em certas formas de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende (a) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 1 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 82, 6 ou 83; (b) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 2 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 7; (c) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 3 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 8; (d) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 4 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 90, 9, 91 ou 92; ou (e) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 5 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 10. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00152] Em uma outra forma de realização, os anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT compreendem um domínio VH tendo a sequência de aminoácido do domínio VH de um anticorpo tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente) e/ou um domínio VL tendo a sequência de aminoácido do domínio VL de um anticorpo tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente).
[00153] Em certas formas de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende (a) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7729 (E1) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7729 (E1); (b) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7842 (E13) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7842 (E13); (c) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7818 (E63) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7818 (E63); (d) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7819 (F19) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7819 (F19); ou (e) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7728 (F23) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7728 (F23). Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00154] Em algumas formas de realização, os anticorpos da invenção compreendem uma CDR1 de VH tendo a sequência de aminoácido da CDR1 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em uma outra forma de realização, os anticorpos da invenção compreendem uma CDR2 de VH tendo a sequência de aminoácido da CDR2 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em uma outra forma de realização, os anticorpos da invenção compreendem uma CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido da CDR3 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em certas formas de realização, os anticorpos da invenção compreendem uma CDR1 de VH e/ou uma CDR2 de VH e/ou uma CDR3 de VH independentemente selecionadas de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH como representadas em qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5.
[00155] A presente invenção também fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo uma ou mais CDRs de VL (isto é, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL) tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDRs de VL (isto é, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL) de E1, E13, E63, F19 e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente); ou qualquer combinação dos mesmos.
[00156] Em certas formas de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende (1) um domínio VH tendo (a) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 11, 12 e/ou 13, respectivamente, (b) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 14, 15 e/ou 16, respectivamente, (c) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 17, 18 e/ou 19, respectivamente, (d) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 20, 21 e/ou 22, respectivamente ou (e) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 23, 24 e/ou 24, respectivamente e/ou (2) um domínio VL tendo (a) uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 84, 26 ou 85; uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 86, 27 ou 87; e/ou uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 88, 28 ou 89, (b) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 29, 30 e/ou 31, respectivamente, (c) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 32, 33 e/ou 34, respectivamente, (d) uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 93, 35, 94 ou 95; uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 36, 97 ou 98; e/ou uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 36, 97 ou 98 ou (e) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 38, 39 e/ou 40, respectivamente. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00157] Em algumas formas de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende (1) um domínio VH tendo (a) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7729 (E1), (b) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7842 (E13), (c) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7818 (E63), (d) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7819 (F19) ou (e) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7728 (F23) e/ou (2) um domínio VL tendo (a) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7729 (E1), (b) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7842 (E13), (c) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7818 (E63), (d) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7819 (F19) ou (e) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7728 (F23). Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00158] Em certas formas de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende (1) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 11, 12 e/ou 13, respectivamente e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 84, 26 ou 85; uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 86, 27 ou 87; e/ou uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 88, 28 ou 89; (2) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 14, 15 e/ou 16, respectivamente e (b) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 29, 30 e/ou 31, respectivamente; (3) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 17, 18 e/ou 19, respectivamente e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 32, 33 e/ou 34, respectivamente; (4) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 20, 21 e/ou 22, respectivamente e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 93, 35, 94 ou 95; uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 36, 97 ou 98; e/ou uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 36, 97 ou 98; ou (5) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 23, 24 e/ou 24, respectivamente e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 38, 39 e/ou 40, respectivamente. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00159] Em algumas formas de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende (1) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7729 (E1) e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7729 (E1); (2) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7842 (E13) e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7842 (E13); (3) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7818 (E63) e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7818 (E63); (4) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7819 (F19) e uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7819 (F19); ou (5) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo Acesso ATCC No. PTA-7728 (F23) e (b) um domínio VL tendo uma CDR de VLI, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo Acesso ATCC No PTA-7728 (F23). Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00160] Em algumas formas de realização, os anticorpos da invenção compreendem uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido da CDR1 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente). Em uma outra forma de realização, os anticorpos da invenção compreendem uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido da CDR2 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente). Em uma outra forma de realização, os anticorpos da invenção compreendem uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido da CDR3 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente). Em certas formas de realização, os anticorpos da invenção compreendem uma CDR1 de VL e/ou uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VL independentemente selecionadas das CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL como representadas em qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC No PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente).
[00161] Em algumas formas de realização, os anticorpos da invenção compreendem um (1) domínio VH ou cadeia tendo um ou mais de (a) uma CDR1 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente), (b) uma CDR2 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR2 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA- 7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente) ou (c) uma CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR3 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente); e/ou (2) um domínio VL ou cadeia tendo um de mais de (a) uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido da CDR1 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA- 7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente), (b) uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR2 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente) e/ou (c) uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR3 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC N— PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente). Tabela 1: Sequências de regiões CDR de anticorpos E1, E13, E63, F19 e F23 (SEQ ID NOS).
Figure img0001
* Preferido sequências CDR1 de VL e VL-3 de E1 e F19.
[00162] A presente invenção também fornece anticorpos que compreendem uma ou mais CDRs de VH e uma ou mais CDRs de VL listadas na Tabela I. Em particular, a invenção fornece um anticorpo que compreende uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); um VH1 CDR1, uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 17, 21 ou 24) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98, ou 39); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38), uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38), uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38), uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); ou qualquer combinação destas das CDRs de VH (SEQ ID NOS: 11 a 25) e CDRs de VL (SEQ ID NOS: 26 a 40) listadas na Tabela I. As CDRs de VH e CDRs de VL correspondentes dos Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23), também podem ser usadas em qualquer uma das combinações listadas acima. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00163] A presente invenção também fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT, os anticorpos que compreendem derivados dos domínios VHs, CDRs de VH, domínios VLs e CDRs de VL aqui descritos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT. A presente invenção também fornece anticorpos que compreendem derivados de E1, E13, E63, F19 e/ou F23, em que os ditos anticorpos imunoespecificamente se ligam a um epítopo de hLIGHT. As técnicas padrão conhecidas por aqueles de habilidade na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula da invenção, incluindo, por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada pela PCR que resulta em substituições de aminoácido. Preferivelmente, os derivados incluem menos do que 25 substituições de aminoácido, menos do que 20 substituições de aminoácido, menos do que 15 substituições de aminoácido, menos do que 10 substituições de aminoácido, menos do que 5 substituições de aminoácido, menos do que 4 substituições de aminoácido, menos do que 3 substituições de aminoácido ou menos do que 2 substituições de aminoácido em relação à molécula original. Em uma forma de realização preferida, os derivados que têm substituições de aminoácido conservativas são fabricadas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais prognosticados. Uma “substituição de aminoácido conservativa” é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral com uma carga similar. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais ramificadas em beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte das sequências codificadoras, tais como pela mutagênese de saturação e os mutantes resultantes podem ser triados quanto a atividade biológica para identificar mutantes que retêm a atividade. A seguir da mutagênese, a proteína codificada pode ser expressada e a atividade da proteína pode ser determinada.
[00164] Em uma outra forma de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % idêntica à sequência de aminoácido de E1, E13, E63, F19 e/ou F23 ou um fragmento de ligação de antígeno deste, tal como um domínio VH, domínio VL, cadeia VH ou cadeia VL. Em uma forma de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % idêntica a uma sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em uma outra forma de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % idêntica a uma sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10. Já em uma outra forma de realização, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT compreende uma sequência de aminoácido de uma CDR de VH e/ou uma CDR de VL que é pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou pelo menos 99 % idêntica a uma sequência de aminoácido da CDR de VH representada nas SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 (CDRs de VH) e/ou uma sequência de aminoácido da CDR de VL representada nas SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 86, 27, 87, 88, 28, 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97, 98, 99, 37, 100, 101, 38, 39 ou 40.
[00165] Em formas de realização específicas, o anticorpo é um anticorpo anti-ser humano totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano. Anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica. Os métodos exemplares incluem a imunização com um antígeno de hLIGHT (qualquer polipeptídeo hLIGHT capaz de evocar uma resposta imune e opcionalmente conjugado a um carregador) de animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena; ver, por exemplo, Jakobovits et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 2551; Jakobovits et al., (1993) Nature, 362: 255 258 (1993); Bruggermann et al., (1993) Year in Immunol., 7: 33. Outros métodos de produzir totalmente anticorpo anti-hLIGHT humano pode ser encontrado nos Exemplos aqui fornecidos.
[00166] Alternativamente, anticorpos totalmente humanos podem ser gerados através da triagem in vitro de bibliotecas de anticorpo de demonstração de fago; ver por exemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991), aqui incorporados por referência. Várias bibliotecas de demonstração de fago contendo anticorpo foram descritas e podem ser facilmente preparadas por uma pessoa habilitada na técnica. as bibliotecas podem conter uma diversidade de sequências de anticorpo humano, tais como fragmentos de Fab, Fv e scFv humanos, que podem ser triados contra um alvo apropriado.
[00167] Em formas de realização preferidas, os anticorpos usados de acordo com os métodos da invenção têm uma alta afinidade quanto a um polipeptídeo hLIGHT ou fragmento de polipeptídeo ou epítopo deste. Em uma forma de realização, os anticorpos usados de acordo com os métodos da invenção têm uma afinidade mais alta para um anticorpo de hLIGHT do que para os anticorpos conhecidos (por exemplo, anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis debatidos aqui em outro lugar). Em uma forma de realização específica, os anticorpos usados de acordo com os métodos da invenção têm uma afinidade de 2 a 10 vezes (ou mais) mais alta para um antígeno de hLIGHT do que um anticorpo anti-hLIGHT conhecido como avaliado pelas técnicas aqui descritas ou conhecidas para uma pessoa de habilidade na técnica (por exemplo, um ensaio BIAcore). De acordo com estas formas de realização, a afinidade dos anticorpos são, em uma forma de realização, avaliadas por um ensaio de BIAcore.
[00168] Em uma forma de realização específica, um anticorpo que imunoespecificamente liga um antígeno de hLIGHT compreende uma sequência de aminoácido de um domínio VH e/ou uma sequência de aminoácido de um domínio VL codificado por uma sequência de nucleotídeo que hibridiza a (1) o complemento de uma sequência de nucleotídeo que codifica qualquer um dos domínios VH e/ou VL representados nas SEQ ID NOS: 41, 42, 43, 44 ou 45 (VH) e/ou SEQ ID NOS: 102, 46, 103, 47, 48, 104, 49, 105, 106 ou 50 (VL) ou (2) o complemento de uma sequência de nucleotídeo que codifica qualquer um dos domínios VH ou VL de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) sob condições severas (por exemplo, hibridização a DNA ligado ao filtro em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C seguida por uma ou mais lavagens em 0,2 x SSC/0,1 % de SDS a cerca de 50 a 65°C) sob condições altamente severas (por exemplo, hibridização ao ácido nucléico ligado ao filtro em 6 x SSC a cerca de 45°C seguido por uma ou mais lavagens em 0,1 x SSC/0,2 % de SDS a cerca de 68°C) ou sob outras condições de hibridização severas que são conhecidas por aqueles de habilidade na técnica (ver, por exemplo, Ausubel, F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque nas páginas 6.3.1 a 6.3.6 e 2.10.3).
[00169] Em uma outra forma de realização, um anticorpo que imunoespecificamente liga um antígeno de hLIGHT compreende uma sequência de aminoácido de uma CDR de VH ou uma sequência de aminoácido de uma CDR de VL codificada por uma sequência de nucleotídeo que hibridiza ao complemento de uma sequência de nucleotídeo que codifica qualquer uma das CDRs de VH e/ou CDRs de VL representadas nas SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 (CDRs de VH) e/ou SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 86, 27, 87, 88, 28, 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97, 98, 99, 37, 100, 101, 38, 39 ou 40 (CDRs de VL) ou (b) o complemento de uma sequência de ácido nucléico que codificam qualquer uma das CDRs de VH e/ou CDRs de VL de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA- 7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) sob condições severas (por exemplo, hibridização ao DNA ligado ao filtro em 6X SSC a cerca de 45°C seguido por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC/0,1 % de SDS a cerca de 50 a 65°C), sob condições altamente severas (por exemplo, hibridização ao ácido nucléico ligado ao filtro em 6X SSC a cerca de 45°C seguido por uma ou mais lavagens em 0,1X SSC/0,2 % de SDS a cerca de 68°C) ou sob outras condições de hibridização severas que são conhecidas por aqueles de habilidade na técnica (ver, por exemplo, Ausubel, F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque nas páginas 6.3.1 a 6.3.6 e 2.10.3)
[00170] Os anticorpos da invenção incluem anticorpos que são quimicamente modificados, isto é, pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo. Por exemplo, mas não por via de limitação, os derivados de anticorpo incluem anticorpos que foram quimicamente modificados, por exemplo, pela glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização pelos grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Qualquer uma de numerosas modificações químicas pode ser realizada pelas técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas à clivagem química específica, acetilação, formulação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Adicionalmente, o anticorpo pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.
[00171] A presente invenção também fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT que compreendem uma região de matriz conhecida por aqueles de habilidade na técnica (por exemplo, um fragmento humano ou não humano). A região de matriz, por exemplo, pode ser de ocorrência natural ou regiões de matriz de consenso. O mais preferivelmente, a região de matriz de um anticorpo da invenção é humana (ver, por exemplo, Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479 para uma listagem de regiões de matriz humanas, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade). Ver também Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (U.S. Department of Health and Human Services, Washington, D. C.) 5aed.
[00172] Em uma forma de realização específica, a presente invenção fornece anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo a sequência de aminoácido de uma ou mais da CDRs de E1, E13, E63, F19 e/ou F23 (isto é, SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 (CDRs de VH) ou SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 86, 27, 87, 88, 28, 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97, 98, 99, 37, 100, 101, 38, 39 ou 40 (CDRs de VL) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 e regiões de matriz humanas com uma ou mais substituições de aminoácido em um, dois, três ou mais dos seguintes resíduos: (a) resíduos de matriz raros que diferem entre a matriz de anticorpo de murino (isto é, matriz de anticorpo doador) e a matriz de anticorpo humano (isto é, a matriz de anticorpo aceitadora); (b) resíduos da zona de Venier quando diferir entre matriz de anticorpo doadora e a matriz de anticorpo aceitadora; (c) resíduos de empacotamento intercadeia na interface VH/VL que diferem entre a matriz de anticorpo doadora e a matriz de anticorpo aceitadora; (d) resíduos canônicos que diferem entre as sequências de matriz de anticorpo doadora e a matriz de anticorpo aceitadora, particularmente as regiões de matriz cruciais para a definição da classe canônica das alças de CDR de anticorpo de murino; (e) resíduos que são adjacentes a uma CDR; (g) resíduos capazes de interagir com o antígeno; (h) resíduos capazes de interagir com a CDR; e (i) contactar resíduos entre o domínio VH e o domínio VL. Em certas formas de realização, os anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT que compreendem as regiões de matriz humanas com uma ou mais substituições de aminoácido em um, dois, três ou mais dos resíduos identificados acima são anticorpos de hLIGHT antagonísticos.
[00173] A presente invenção abrange anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo a sequência de aminoácido do domínio VH e/ou domínio VL ou um fragmento de ligação de antígeno deste de um anticorpo produzido pelo hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA- 7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728) ou de um anticorpo E1, E13, E63, F19 e/ou F23, tendo mutações (por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido) nas regiões de matriz. Em certas formas de realização, os anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT compreendem a sequência de aminoácido do domínio VH e/ou domínio VL ou um fragmento de ligação de antígeno deste de E1, E13, E63, F19 e/ou F23 com um ou mais resíduo de substituições de aminoácido nas regiões de matriz dos domínios VH e/ou VL.
[00174] A presente invenção também abrange anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT, os ditos anticorpos compreendendo a sequência de aminoácido do domínio VH e/ou domínio VL de um anticorpo produzido pelo hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 ou de um anticorpo E1, E13, E63, F19 e/ou F23, tendo mutações (por exemplo, um ou mais resíduo de substituições de aminoácido) nas regiões hipervariáveis e de matriz. Preferivelmente, as substituições de aminoácido nas regiões hipervariáveis e de matriz melhoram a ligação do anticorpo a um antígeno de hLIGHT.
[00175] Em algumas formas de realização, os anticorpos aqui fornecidos diminuem ou inibem a ligação de hLIGHT ao HVEM, LTβR e/ou DcR3 e/ou diminuem ou inibem uma atividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, no paciente (por exemplo, um paciente humano). Em certas formas de realização, os anticorpos aqui fornecidos, tais como um anticorpo anti-hLIGHT monoclonal humano, diminui ou inibe a ligação de um hLIGHT solúvel ou expressado na superfície da célula ao HVEM ou LTβR e/ou diminui ou inibe a secreção de CCL20 e/ou RANTES depois do contato com um hLIGHT solúvel ou expressado na superfície da célula, em um paciente. Em algumas formas de realização, o hLIGHT é uma variante SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L. O bloqueio da atividade de ligação de um anticorpo aqui fornecido de hLIGHT ao HVEM, LTβR e/ou DCR3 pode ser detectado usando um ensaio como descrito em qualquer um dos Exemplos de 1 a 4. A inibição da atividade biológica de células que expressam um receptor de hLIGHT por um anticorpo de hLIGHT aqui fornecido pode ser detectado usando um ensaio como descrito em qualquer um dos Exemplos de 1 a 4.
[00176] Em outras formas de realização, os anticorpos aqui fornecidos diminuem ou inibem a ligação de hLIGHT ao HVEM, LTβR e/ou DcR3 e/ou diminuem ou inibem uma atividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, em uma célula tendo um receptor de hLIGHT expressado na superfície da célula (tal como, HVEM, LTβR e/ou Dc3R). Em certas formas de realização, os anticorpos aqui fornecidos, tais como um anticorpo humano monoclonal anti-hLIGHT, diminui ou inibe a ligação de um hLIGHT solúvel ou expressado na superfície da célula ao HVEM ou LTβR e/ou diminui ou inibe a secreção de CCL20 e/ou RANTES, em uma célula tendo um receptor de hLIGHT expressado na superfície da célula depois de contactar com um hLIGHT solúvel ou expressado na superfície da célula. Em algumas formas de realização, o hLIGHT é uma variante SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L. O bloqueio da atividade de ligação de um anticorpo aqui fornecido de hLIGHT ao HVEM, LTβR e/ou DCR3 pode ser detectado usando um ensaio como descrito em qualquer um dos Exemplos de 1 a 4. A inibição da atividade biológica de células que expressam um receptor de hLIGHT por um anticorpo de hLIGHT aqui fornecido pode ser detectada usando um ensaio como descrito em qualquer um dos Exemplos de 1 a 4.
[00177] A presente invenção também fornece proteínas de fusão que compreendem um anticorpo aqui fornecido que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT e um polipeptídeo heterólogo. Em algumas formas de realização, o polipeptídeo heterólogo ao qual o anticorpo é fundido é útil para alvejar o anticorpo às células tendo hLIGHT expressado na superfície da célula.
[00178] A presente invenção também fornece painéis de anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT. Em formas de realização específicas, a invenção fornece painéis de anticorpos tendo constantes de taxa de associação diferentes, afinidades quanto ao antígeno de hLIGHT diferentes e/ou especificidades diferentes quanto a um antígeno de hLIGHT. A invenção fornece painéis de cerca de 10, preferivelmente de cerca de 25, de cerca de 50, de cerca de 75, de cerca de 100, de cerca de 125, de cerca de 150, de cerca de 175, de cerca de 200, de cerca de 250, de cerca de 300, de cerca de 350, de cerca de 400, de cerca de 450, de cerca de 500, de cerca de 550, de cerca de 600, de cerca de 650, de cerca de 700, de cerca de 750, de cerca de 800, de cerca de 850, de cerca de 900, de cerca de 950 ou de cerca de 1000 anticorpos ou mais. Os painéis de anticorpos podem ser usados, por exemplo, em placas de 96 reservatórios ou 384 reservatórios, tais como para os ensaios tais como ELISAs.
CONJUGADOS DE ANTICORPO E PROTEÍNAS DE FUSÃO
[00179] Em algumas formas de realização, os anticorpos da invenção são conjugados ou recombinantemente fundidos a um agente de diagnóstico, detectável ou terapêutico ou qualquer outra molécula. Os anticorpos conjugados ou recombinantemente fundidos podem ser úteis, por exemplo, para monitorar ou prognosticar o início, desenvolvimento, progressão e/ou severidade de uma doença mediada por hLIGHT como parte de um procedimento de teste clínico, tal como a determinação da eficácia de uma terapia particular.
[00180] Tais diagnóstico e detecção podem ser realizados, por exemplo, ligando-se o anticorpo às substâncias detectáveis incluindo, mas não limitados a, várias enzimas, tais como, mas não limitados a, rábano peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos protéticos, tais como, mas não limitados a, estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como, mas não limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tais como, mas não limitados a, luminol; materiais bioluminescentes, tais como mas não limitados a, luciferase, luciferina e aequorina; materiais radioativos, tais como, mas não limitados a, iodo (131I, 125 123 121 14 35 3 115 113 112 I I e I), carbono ( C), enxofre ( S), trítio ( H), índio ( In, In, In 111 99 201 68 67 103 e In,), tecnécio ( Tc), tálio ( Ti), gálio ( Ga, Ga), paládio ( Pd), 99 133 18 153 177 159 149 molibdênio ( Mo), xenônio ( Xe), flúor ( F), Sm, Lu, Gd, Pm, 140 175 166 90 47 186 188 142 105 97 68 57 65 La, Yb, Ho, Y, Sc, Re, Re, Pr, Rh, Ru, Ge, Co, Zn, 85 32 153 169 51 97 54 75 113 117 Sr, P, Gd, Yb, Cr, Ru, Mn, Se, Sn e Sn; e metais emissores de positron usando várias tomografias de emissão de positron e íons metálicos paramagnéticos não radioativos.
[00181] A presente invenção abrange ainda usos dos anticorpos da invenção conjugados ou recombinantemente fundidos a uma porção terapêutica (ou um ou mais porções terapêuticas). O anticorpo pode ser conjugado ou recombinantemente fundido a uma porção terapêutica, tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um íon de metal radioativo, por exemplo, emissores alfa. Uma citotoxina ou agente citotóxico incluem qualquer agente que seja prejudicial às células. As porções terapêuticas incluem, mas não são limitadas a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracila descarbazina); agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalan, carmustina (BCNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cisdiclorodiamina platina (II) (DDP) e cisplatina); antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antigamente daunomicina) e doxorrubicina); antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)); Moléculas de Auristatina (por exemplo, auristatina PHE, briostatina 1 e solastatina 10; ver Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 46: 3802-8 (2002), Woyke et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45: 3580-4 (2001), Mohammad et al., Anticancer Drugs 12: 735-40 (2001), Wall et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266: 76-80 (1999), Mohammad et al., Int. J. Oncol. 15: 367-72 (1999), todos os quais são aqui incorporados por referência); hormônios (por exemplo, glicocorticóides, progestinas, androgênios e estrogênios), inibidores de enzima de reparo de DNA (por exemplo, etoposida ou topotecano), inibidores de cinase (por exemplo, composto ST1571, imatinib mesilato (Kantarjian et al., Clin Cancer Res. 8(7): 2167-76 (2002)); agentes citotóxicos (por exemplo, paclitaxel, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes e aqueles compostos divulgados nas Patentes U.S. Nos 6.245.759, 6.399.633, 6.383.790, 6.335.156, 6.271.242, 6.242.196, 6.218.410, 6.218.372, 6.057.300, 6.034.053, 5.985.877, 5.958.769, 5.925.376, 5.922.844, 5.911.995, 5.872.223, 5.863.904, 5.840.745, 5.728.868, 5.648.239, 5.587.459); inibidores da farnesil transferase (por exemplo, R115777, BMS- 214662 e aqueles divulgados, por exemplo, pelas Patentes U.S. Nos: 6.458.935, 6.451.812, 6.440.974, 6.436.960, 6.432.959, 6.420.387, 6.414.145, 6.410.541, 6.410.539, 6.403.581, 6.399.615, 6.387.905, 6.372.747, 6.369.034, 6.362.188, 6.342.765, 6.342.487, 6.300.501, 6.268.363, 6.265.422, 6.248.756, 6.239.140, 6.232.338, 6.228.865, 6.228.856, 6.225.322, 6.218.406, 6.211.193, 6.187.786, 6.169.096, 6.159.984, 6.143.766, 6.133.303, 6.127.366, 6.124.465, 6.124.295, 6.103.723, 6.093.737, 6.090.948, 6.080.870, 6.077.853, 6.071.935, 6.066.738, 6.063.930, 6.054.466, 6.051.582, 6.051.574 e 6.040.305); inibidores da topoisomerase (por exemplo, camptotecina; irinotecano; SN-38; topotecano; 9-aminocamptotecina; GG-211 (GI 147211); DX-8951f; IST-622; rubitecano; pirazoloacridina; XR-5000; saintopina; UCE6; UCE1022; TAN- 1518A; TAN 1518B; KT6006; KT6528; ED-110; NB-506; ED-110; NB-506; e rebecamicina); bulgareína; aglutinantes das ranhura menor do DNA tais como o corante Hoescht 33342 e corante Hoechst 33258; nitidina; fagaronina; epiberberina; coralina; beta-lapachona; BC-41; bisfosfonatos (por exemplo, alendronato, cimadronte, clodronato, tiludronato, etidronato, ibandronato, neridronato, olpandronato, risedronato, piridronato, pamidronato, zolendronato) inibidores da HMG-CoA redutase, (por exemplo, lovastatina, sinvastatina, atorvastatina, pravastatina, fluvastatina, estatina, cerivastatina, lescol, lupitor, rosuvastatina e atorvastatina); oligonucleotídeos de anti- sentido (por exemplo, aqueles divulgados nas Patentes U.S. Nos 6.277.832, 5.998.596, 5.885.834, 5.734.033 e 5.618.709); inibidores da adenosina deaminase (por exemplo, Fosfato de fludarabina e 2-Clorodesoxiadenosina); ibritumomab tiuxetan (Zevalin®); tositumomab (Bexxar®)) e sais, solvatos, clatratos farmaceuticamente aceitáveis e pró medicamentos destes.
[00182] Além disso, um anticorpo da invenção pode ser conjugado ou recombinantemente fundido a uma porção terapêutica ou porção medicamentosa que modifica uma dada resposta biológica. As porções terapêuticas ou porções medicamentosas não devem ser interpretadas como limitadas aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, a porção de medicamento pode ser uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo que possua uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina e pseudomonas, toxina da cólera ou toxina da difteria; uma proteína tal como o fator de necrose de tumor, Y-interferon, α-interferon, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta, ativador de plasminogênio de tecido, um agente apoptótico, por exemplo, TNF-Y, TNF-Y, AIM I (ver, Publicação Internacional No WO 97/33899), AIM II (ver, Publicação Internacional No WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567-1574) e VEGF (ver, Publicação Internacional No WO 99/23105), um agente anti-angiogênico, por exemplo, angiostatina, endostatina ou um componente do caminho da coagulação (por exemplo, fator de tecido); ou, um modificador de resposta biológica tal como, por exemplo, uma linfocina (por exemplo, interferon gama, interleucina-1 (“IL-1”), interleucina-2 (“IL-2”), interleucina- 5 (“IL-5”), interleucina-6 (“IL-6”), interleucina-7 (“IL-7”), interleucina 9 (“IL-9”), interleucina-10 (“IL-10”), interleucina-12 (“IL-12”), interleucina-15 (“IL-15”), interleucina-23 (“IL-23”), fator estimulador de colônia de granulócito macrófago (“GM-CSF”) e fator estimulador de colônia de granulócito (“G-CSF” )) ou um fator de crescimento (por exemplo, hormônio de crescimento (“GH”)) ou um agente de coagulação (por exemplo, cálcio, vitamina K, fatores de tecido, tais como mas não limitados a, fator de Hageman (fator XII), cininogênio high-molecular-weight cininogênio (HMWK), precalicreína (PK), proteínas de coagulação-fatores II (protrombina), fator V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, XIa, IX, IXa, X, fosfolipídeo e monômero de fibrina).
[00183] A presente invenção abrange anticorpos da invenção recombinantemente fundidos ou quimicamente conjugados (conjugações covalentes ou não-covalentes) a uma proteína heteróloga ou polipeptídeo (ou fragmento deste, preferivelmente a um polipeptídeo de cerca de 10, de cerca de 20, de cerca de 30, de cerca de 40, de cerca de 50, de cerca de 60, de cerca de 70, de cerca de 80, de cerca de 90 ou de cerca de 100 aminoácidos) para gerar proteínas de fusão. Em particular, a invenção fornece proteínas de fusão que compreendem um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo da invenção (por exemplo, um fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmento F(ab)2, um domínio VH, uma CDR de VH, um domínio VL ou uma CDR de VL) e uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogos. Em uma forma de realização, a proteína, polipeptídeo ou peptídeo heterólogos aos quais o anticorpo é fundido são úteis para alvejar o anticorpo a um tipo de célula particular, tal como uma célula que expresse hLIGHT ou um receptor de hLIGHT. Por exemplo, um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um receptor de superfície celular expressado por um tipo de célula particular (por exemplo, uma célula imune) pode ser fundida ou conjugada a um anticorpo modificado da invenção.
[00184] Uma proteína conjugada ou de fusão da invenção compreende qualquer anticorpo da invenção aqui descrito e um polipeptídeo heterólogo. Em uma forma de realização, uma proteína conjugada ou de fusão da invenção compreende os anticorpos E1, E13, E63, F19 ou F23 ou um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e um polipeptídeo heterólogo. Em uma outra forma de realização, uma proteína conjugada ou de fusão da invenção compreende um fragmento de ligação de antígeno de E1, E13, E63, F19 ou F23 ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA- 7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e um polipeptídeo heterólogo. Em uma outra forma de realização, uma proteína conjugada ou de fusão da invenção compreende um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de qualquer um dos domínios VHs representados nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e/ou um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de qualquer um dos domínios VLs representados nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10 ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e um polipeptídeo heterólogo. Em uma outra forma de realização, uma proteína conjugada ou de fusão da presente invenção compreende uma ou mais CDRs de VH tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das CDRs de VH representadas nas SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e um polipeptídeo heterólogo. Em uma outra forma de realização, uma proteína conjugada ou de fusão compreende uma ou mais CDRs de VL tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das CDRs de VL representadas nas SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 86, 27, 87, 88, 28, 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97, 98, 99, 37, 100, 101, 38, 39 ou 40 ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e um polipeptídeo heterólogo. Em uma outra forma de realização, uma proteína conjugada ou de fusão da invenção compreende pelo menos um domínio VH e pelo menos um domínio VL representado nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5 e SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA- 7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e um polipeptídeo heterólogo. Já em uma outra forma de realização, uma proteína conjugada ou de fusão da invenção compreende pelo menos uma CDR de VH e pelo menos uma CDR de VL representada nas SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 e SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 86, 27, 87, 88, 28, 89, 2, 30, 31, 32, 33, 34, 93, 35, 94, 95, 96, 36, 97, 98, 99, 37, 100, 101, 38, 39 ou 40, respectivamente ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e um polipeptídeo heterólogo.
[00185] Além disso, um anticorpo da invenção pode ser conjugado às porções terapêuticas tais como um íon de metal radioativo, tal como emissores alfa tais como 213Bi ou quelantes macrocíclicos úteis para a conjugação de íons radiometálicos, incluindo mas não limitados a, 131In, 131LU, 131Y, 131Ho, 131Sm, aos polipeptídeos. Em certas formas de realização, o quelante macrocíclico é o ácido 1,4,7,10-tetraazaciclo-dodecano- N,N’,N”,N”’-tetraacético (DOTA) que pode ser ligado ao anticorpo por intermédio de uma molécula ligadora. Tais moléculas ligadoras são habitualmente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4(10): 2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4): 553-7; e Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26(8): 943-50, cada uma incorporada por referência em suas totalidades.
[00186] Além disso, os anticorpos da invenção podem ser fundidos às sequências marcadoras, tais como um peptídeo para facilitar a purificação. Em formas de realização preferidas, a sequência de aminoácido marcadora é um peptídeo de hexa-histidina, tal como o rótulo fornecido em um vetor pQE (QIAGEN, Inc.), entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Como descrito em Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, por exemplo, hexa-histidina fornece a purificação conveniente da proteína de fusão. Outros rótulos de peptídeo úteis para a purificação incluem, mas não são limitados ao rótulo de hemaglutinina (“HA”), que corresponde a um epítopo derivado da proteína de hemaglutinina da influenza (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767) e o rótulo “FLAG”.
[00187] Os métodos para fundir ou conjugar porções terapêuticas (incluindo polipeptídeos) aos anticorpos são bem conhecidas, ver, por exemplo, Arnon et al., “Monoclonals Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, em Monoclonals Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, em Controlled Drug Delivery (2aEd.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, em Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, em Monoclonals Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119-58; Pat. U.S. Nos 5.336.603, 5.622.929, 5.359.046, 5.349.053, 5.447.851, 5.723.125, 5.783.181, 5.908.626, 5.844.095 e 5.112.946; EP 307.434; EP 367.166; EP 394.827; PCT publicações WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631 e WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331: 84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154: 5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 11337-11341, 1992, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades.
[00188] As proteínas de fusão podem ser geradas, por exemplo, através das técnicas de embaralhamento de gene, embaralhamentos de motivo, embaralhamento de exon e/ou embaralhamento de códon (coletivamente aludido como “embaralhamento de DNA”). O embaralhamento de DNA pode ser utilizado para alterar as atividades de anticorpos da invenção (por exemplo, anticorpos com afinidades mais altas e taxas de dissociação mais baixas). Ver, no geral, Patentes U.S. Nos 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.834.252 e 5.837.458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8: 72433; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287: 265-76; e Lorenzo e Blasco, 1998, Biotéchniques 24(2): 308- 313 (cada uma dessas patentes e publicações são por meio deste incorporadas por referência em sua totalidade). Os anticorpos ou os anticorpos codificados, podem ser alterados sendo submetidos à mutagênese aleatória pela PCR propensa a erro, inserção de nucleotídeo aleatória ou outros métodos antes da recombinação. Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção pode ser recombinado com um ou mais componentes, motivos, seções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas.
[00189] Um anticorpo da invenção também pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo como descrito na Patente U.S. No 4.676.980, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00190] A porção ou medicamento terapêuticos conjugados ou recombinantemente fundidos a um anticorpo da invenção que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT devem ser escolhidos para se obter o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) desejado(s). Em certas formas de realização, o anticorpo é um anticorpo modificado. Um médico ou outro corpo médico devem considerar o seguinte quando da decisão de qual porção ou medicamento terapêuticos conjugar ou recombinantemente fundir a um anticorpo da invenção: a natureza da doença, a gravidade da doença e a condição do paciente.
[00191] Os anticorpos da invenção também podem ser ligados a suportes sólidos, que são particularmente úteis para os imunoensaios ou purificação do antígeno alvo. Tais suportes sólidos incluem, mas não são limitados a, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinila ou polipropileno.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[00192] As formulações terapêuticas contendo um ou mais anticorpos da invenção aqui fornecidos podem ser preparadas para armazenagem misturando-se o anticorpo tendo o grau desejado de pureza com carregadores, excipientes ou estabilizadores fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os carregadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aos receptores nas dosagens e concentrações utilizadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabenos; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de peso molecular baixo (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons que formem sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos da proteína de Zn); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).
[00193] Os anticorpos da invenção aqui fornecidos também podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Lipossomas contendo a molécula de interesse são preparados pelos métodos conhecidos na técnica, tal como descrita em Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030; e Patentes U.S. Nos 4.485.045 e 4.544.545. Lipossomas com tempo de circulação realçada são divulgados na Patente U.S. No 5.013.556.
[00194] Imunolipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método da evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo contendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrusados através de through filtros de tamanho de poro definidos para produzir lipossomas com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab’ de um anticorpo aqui fornecido pode ser conjugado aos lipossomas como descrito em Martin et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 286-288 por intermédio de uma reação de troca de dissulfeto. Um agente quimioterapêutico (tal como Doxorrubicina) está opcionalmente contido dentro do lipossoma; Ver Gabizon et al., (1989) J. National Cancer Inst. 81(19): 1484.
[00195] As formulações, tais como aquelas aqui descritas, também podem conter mais do que um composto ativo como necessário para a indicação particular que é tratada. Em certas formas de realização, as formulações compreendem um anticorpo da invenção e um ou mais compostos ativos com atividades complementares que não afetam adversamente um ao outro. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser combinado com um ou mais outros agentes terapêuticos. Tal terapia combinada pode ser administrada ao paciente em série ou simultaneamente ou na sequência.
[00196] Um anticorpo da invenção também pode ser aprisionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, pelas técnicas de coacervação ou pela polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metacrilato de metila), respectivamente, em sistemas de liberação de medicamento coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano- partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
[00197] As formulações a serem usadas para a administração in vivo podem ser estéreis. Isto é facilmente realizado pela filtração, por exemplo, através de membranas de filtração estéreis.
[00198] Preparações de liberação prolongada também podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antagonista, matrizes estas que estão na forma de artigos formados, por exemplo, películas ou microcápsula. Os exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietila) ou polilactídeos de poli(álcool vinílico)), (Patente U.S. No 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de etila, etileno- acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis tais como o LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tais como etileno-acetato de vinila e ácido láctico-ácido glicólico permitem a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando anticorpos encapsulados permanecem no corpo por um tempo longo, eles podem desnaturar ou agregar-se como um resultado da exposição à umidade a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para a estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto ser a formação de ligação intermolecular S--S através da troca de tio-dissulfeto, a estabilização pode ser obtida pela modificação de resíduos de sulfidrila, liofilização de soluções ácidas, controle do teor de umidade, usando aditivos apropriados e desenvolvendo composições de matriz polimérica específicas.
[00199] As composições farmacêuticas aqui fornecidas contêm quantidades terapeuticamente eficazes de um ou mais dos anticorpos da invenção aqui fornecidos e opcionalmente um ou mais profiláticos adicionais de agentes terapêuticos, em um carregador farmaceuticamente aceitável. Tais composições farmacêuticas são úteis na prevenção, tratamento, controle ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT, tal como uma doença do intestino inflamatório ou um ou mais dos sintomas desta.
[00200] Os carregadores farmacêuticos adequados para a administração dos compostos aqui fornecidos incluem qualquer de tais carregadores conhecidos por aqueles habilitados na técnica como sendo adequados para o modo particular de administração.
[00201] Além disso, os anticorpos da invenção podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos (tais como um ou mais outros agentes profiláticos ou terapêuticos).
[00202] As composições podem conter um ou mais anticorpos da invenção. Em uma forma de realização, os anticorpos são formulados em preparações farmacêuticas adequadas, tais como soluções, suspensões, tabletes, tabletes dispersáveis, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação prolongada ou elixires, para a administração oral ou em soluções ou suspensões estéreis para a administração parenteral, assim como preparação de emplastros transdérmicos e inaladores de pós seco. Em uma forma de realização, os anticorpos descritos acima são formulados em composições farmacêuticas usando técnicas e procedimentos bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ansel (1985) Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4aEd., p. 126).
[00203] Nas composições, as concentrações eficazes de um ou mais anticorpos ou derivados destes são misturadas com um carregador farmacêutico adequado. As concentrações dos compostos nas composições são eficazes para a liberação de uma quantidade, na administração, que trata, previne ou melhora uma doença mediada por hLIGHT ou sintoma deste.
[00204] Em uma forma de realização, as composições são formuladas parac a administração de dosagem única. Para formular uma composição, a fração em peso de composto é dissolvida, colocada em suspensão, dispersada ou de outro modo misturada em um carregador selecionado em uma concentração eficaz tal que a condição tratada é aliviada, prevenida ou um ou mais sintomas são melhorados.
[00205] Um anticorpo da invenção é incluído no carregador farmaceuticamente aceitável em uma quantidade eficaz suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis nos pacientes tratados. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente testando-se os compostos em sistemas in vitro e in vivo usando métodos de rotina e depois extrapolados destes para as dosagens para seres humanos.
[00206] A concentração de anticorpo na composição farmacêutica dependerá, por exemplo, das características fisicoquímicas do anticorpo, do programa de dosagem e das quantidades administradas assim como de outros fatores conhecidos por aqueles de habilidade na técnica.
[00207] Em uma forma de realização, uma dosagem terapeuticamente eficaz produz uma concentração sérica de anticorpo de cerca de 0,1 ng/ml a cerca de 50 a 100 μg/ml. As composições farmacêuticas, em uma outra forma de realização, fornecem uma dosagem de cerca de 0,001 mg a cerca de 2000 mg de anticorpo por quilograma de peso corporal por dia. As formas unitárias de dosagem farmacêutica podem ser preparadas para fornecer de cerca de 0,01 mg, 0,1 mg ou 1 mg a cerca de 500 mg, 1000 mg ou 2000 mg e em uma forma de realização de cerca de 10 mg a cerca de 500 mg do anticorpo e/ou uma combinação de outros ingredientes essenciais opcionais por forma unitária de dosagem.
[00208] O anticorpo pode ser administrado de uma vez ou pode ser dividido em várias doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. É entendido que a dosagem e duração precisas de tratamento é uma função da doença que é tratada e pode ser determinada empiricamente usando protocolos de teste conhecidos ou pela extrapolação a partir de dados de teste in vivo ou in vitro. Deve ser mencionado que concentrações e valores de dosagem também podem variar com a gravidade da condição a ser aliviada. Deve ser entendido ainda que para qualquer paciente particular, os regimes de dosagem específicos podem ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições e que as faixas de concentração aqui apresentadas são apenas exemplares e não são intencionadas a limitar o escopo ou prática das composições reivindicadas.
[00209] Na mistura ou adição do anticorpo, a mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou coisa parecida. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo intencionado de administração e a solubilidade do composto no carregador ou veículo selecionados. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da doença, distúrbio ou condição tratados e pode ser empiricamente determinada.
[00210] As composições farmacêuticas são fornecidas para a administração aos seres humanos e animais em formas de dosagem unitárias, tais como tabletes, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções parenterais estéreis ou suspensões e soluções orais ou suspensões e emulsões de óleo em água contendo quantidades adequadas dos compostos ou derivados destes farmaceuticamente aceitáveis. O anticorpo é, em uma forma de realização, fórmulado e administrado em formas de dosagem unitárias ou formas de dosagem múltipla. As formas de dose unitária como aqui usado refere-se às unidades fisicamente separadas adequadas para os pacientes humanos e animal e empacotados individualmente como é conhecido na técnica. Cada dose unitária contém uma quantidade pré determinada do anticorpo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o carregador, veículo ou diluente farmacêuticos requeridos. Os exemplos de formas de dose unitária incluem ampolas e seringas e tabletes ou cápsulas individualmente empacotadas. As formas de dose unitária podem ser administradas em frações ou múltiplos destas. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem unitária idênticas embaladas em um único recipiente para ser administrada em forma de dose unitária segregada. Os exemplos de formas de dose múltipla incluem frascos, garrafas de tabletes ou cápsulas ou garrafas de pints (473 ml) ou galões (3,78 litros). Por este motivo, a forma de dose múltipla é um múltiplo de doses unitárias que não são separadas na embalagem.
[00211] Em formas de realização preferidas, um ou mais anticorpos anti-hLIGHT da invenção estão em uma formulação farmacêutica líquida. As as composições líquidas farmaceuticamente administráveis, por exemplo, podem ser preparadas dissolvendo-se, dispersando-se ou de outro modo misturando-se um composto ativo como definido acima e adjuvantes farmacêuticos opcionais em um carregador, tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, glicóis, etanol e outros, para formar deste modo uma solução ou suspensão. Se desejado, a composição farmacêutica a ser administrada também pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes de umectação, agentes emulsificadores, agentes solubilizadores, agentes tamponantes de pH e outros, por exemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitano, trietanolamina acetato de sódio, oleato de trietanolamina e outros de tais agentes.
[00212] Os métodos reais de preparar tais formas dosagem são conhecidos ou estarão evidentes, por aqueles habilitados nesta técnica; por exemplo, ver Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.
[00213] As formas de dosagem ou composições contendo anticorpo na faixa de 0,005 % a 100 % com o equilíbrio feito de carregador não tóxico podem ser preparadas. Os métodos para a preparação destas composições são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
[00214] As formas de dosagem farmacêutica oral são sólidas, gel ou líquidas. As formas de dosagem sólida são tabletes, cápsulas, grânulos e pós a granel. Os tipos de tabletes orais incluem comprimidos, pastilhas mastigáveis e tabletes que podem ser revestidos entéricos, revestidos com açúcar ou revestidos com película. As cápsulas podem ser cápsulas de gelatina duras ou moles, enquanto que os grânulos e pós podem ser fornecidos na forma não efervescente ou efervescente com a combinação de outros ingredientes conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
[00215] Em certas formas de realização, as formulações são formas de dosagem sólidas. Em certas formas de realização, as formulações são cápsulas ou tabletes. Os tabletes, pílulas, cápsulas, comprimidos e outros pode conter um ou mais dos seguintes ingredientes ou compostos de uma natureza similar: um aglutinante; um lubrificante; um diluente; um glidante; um agente desintegrante; um agente corante; um agente adoçante; um agente flavorizante; um agente umectante; um revestimento emético; e um revestimento de película. Os exemplos de aglutinantes incluem celulose microcristalina, goma de tragacanto, solução de glicose, mucilagem de acácia, solução de gelatina, melaços, polivinilpirrolidina, povidona, crospovidonas, sacarose e pasta de amido. Lubrificantes incluem talco, amido, estearato de magnésio ou cálcio, licopódio e ácido esteárico. Diluentes incluem, por exemplo, lactose, sacarose, amido, caulim, sal, manitol e fosfato de dicálcio. Glidantes incluem, mas não são limitados a, dióxido de silício coloidal. Os agentes desintegrantes incluem croscarmelose sódica, amido glicolato de sódio, ácido algínico, amido de milho, amido de batata, bentonita, metilcelulose, ágar e carboximetilcelulose. Os agentes corantes incluem, por exemplo, qualquer um dos corantes FD e C solúveis em água certificados aprovados, misturas destes; e corantes FD e C insolúveis em água colocados em suspensão em hidrato de alumina. Os agentes adoçantes incluem sacarose, lactose, manitol e agentes adoçantes artificiais tais como sacarina e qualquer número de aromas pulverizados a seco. Os agentes flavorizantes incluem aromas naturais extraídos de plantas tais como frutas e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensação agradável, tais como, mas não limitados a hortelã e salicilato de metila. Os agentes umectantes incluem monoestearato de propileno glicol, monooleato de sorbitano, monolaurato de dietileno glicol e éter laurílico de polioxietileno. Os revestimentos eméticos incluem ácidos graxos, gorduras, ceras, goma laca, goma laca amoniacal e acetato ftalatos de celulose. Os revestimentos de película incluem hydroxietilcelulose, carboximetilcelulose sódica, polietileno glicol 4000 e acetato ftalato de celulose.
[00216] Os anticorpos da invenção podem ser fornecidos em uma composição que os proteja do ambiente ácido do estômago. Por exemplo, a composição pode ser formuladas em um revestimento entérico que mantém a sua integridade no estômago e libera o composto ativo no intestino. A composição também pode ser formulada em combinação com um anti-ácido ou outro de tal ingrediente.
[00217] Quando a forma unitária de dosagem é uma cápsula, a mesma pode conter, além do material do tipo acima, um carregador líquido tal como um óleo graxo. Além disso, as formas unitárias de dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar e outros agentes entéricos. Os compostos também podem ser administrados como um componente de um elixir, suspensão, xarope, óstia, pulverização, goma de mascar ou coisa parecida. Um xarope pode conter, além dos compostos ativos, sacarose como um agente adoçante e certos conservantes, tinturas e corantes e sabores.
[00218] O anticorpo também pode ser misturado com outros materiais ativos que não comunicam a ação desejada ou com materiais que suplementam a ação desejada, tais como anti-ácidos, bloqueadores de H2 e diuréticos. O ingrediente ativo é um anticorpo ou derivado deste farmaceuticamente aceitável como aqui descrito. As concentrações mais altas, de até cerca de 98 % em peso do ingrediente ativo podem ser incluídas.
[00219] Em todas as formas de realização, as formulações de tabletes e cápsulas podem ser revestidas como conhecido por aqueles de habilidade na técnica de modo a modificar ou prolongar a dissolução do ingrediente ativo. Assim, por exemplo, eles podem ser revestidos com um revestimento entericamente digerível convencional, tal como salicilato de fenila, ceras e acetato ftalato de celulose.
[00220] Em formas de realização preferidas, as formulações são formas de dosagem líquidas. As formas de dosagem oral líquidas incluem soluções aquosas, emulsões, suspensões, soluções e/ou suspensões reconstituídas a partir de grânulos não efervescentes e preparações efervescentes reconstituídas a partir de grânulos efervescentes. As soluções aquosas incluem, por exemplo, elixires e xaropes. Emulsões são óleo em água ou água em óleo.
[00221] Os elixires são preparações claras, adoçadas, hidroalcoólicas. Os carregadores farmaceuticamente aceitáveis usados em elixires incluem solventes. Os xaropes são soluções aquosas concentradas de um açúcar, por exemplo, sacarose e podem conter um conservante. Uma emulsão é um sistema de duas fases em que um líquido é dispersado na forma de glóbulos pequenos por todo um outro líquido. Os carregadores farmaceuticamente aceitáveis usados em emulsões são líquidos não aquosos, agentes emulsificantes e conservantes. As suspensões usam agentes de suspensão e conservantes farmaceuticamente aceitáveis. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos não efervescentes, a serem reconstituídos em uma forma de dosagem oral líquida, incluem diluentes, agentes adoçantes e umectantes. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos efervescentes, a serem reconstituídas em uma forma de dosagem oral líquida, incluem ácidos orgânicos e uma fonte de dióxido de carbono. Os agentes corantes e flavorizantes são usados em todas das formas de dosagem acima.
[00222] Os solventes incluem glicerina, sorbitol, álcool etílico e xarope. Os exemplos de conservantes incluem glicerina, metil e propil parabeno, ácido benzóico, benzoato de sódio e álcool. Os exemplos de líquidos não aquosos utilizados em emulsões incluem óleo mineral e óleo de semente de algodão. Os exemplos de agentes emulsificantes incluem gelatina, acácia, tragacanto, bentonita e tensoativos tais como monooleato de polioxietileno sorbitano. Os agentes de suspensão incluem carboximetilcelulose sódica, pectina, tragacanto, Veegum e acácia. Os agentes adoçantes incluem sacarose, xaropes, glicerina e agentes adoçantes artificiais tais como sacarina. Os agentes umectantes incluem monostearato de propileno glicol, monooleato de sorbitano, monolaurato de dietileno glicol e éter laurílico de polioxietileno. Os ácidos orgânicos incluem ácidos cítrico e tartárico. As fontes de dióxido de carbono incluem bicarbonato de sódio e carbonato de sódio. Os agentes corantes incluem qualquer um dos corantes FD e C solúveis em água certificados aprovados e misturas destes. Os agentes flavorizantes incluem aromas naturais extraídos de plantas tais como frutas e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensação de sabor agradável.
[00223] Para uma forma de dosagem sólida, a solução ou suspensão, por exemplo em carbonato de propileno, óleos vegetais ou triglicerídeos, em uma forma de realização, são encapsuladas em uma cápsula de gelatina. Tais soluções e a preparação e encapsulação destas, são divulgadas nas Patentes U.S. Nos 4.328.245, 4.409.239 e 4.410.545. Para uma forma de dosagem líquida, a solução, por exemplo, em um polietileno glicol, pode ser diluída com uma quantidade suficiente de um carregador líquido farmaceuticamente aceitável, por exemplo, água, para ser facilmente medida para a administração.
[00224] Alternativamente, as formulações orais líquidas ou semi- sólidas podem ser preparadas dissolvendo-se ou dispersando-se o composto ativo ou sal em óleo vegetais, glicóis, triglicerídeos, ésteres de propileno glicol (por exemplo, carbonato de propileno) e outros de tais carregadores e encapsular estas soluções ou suspensões em cascas de cápsula de gelatina duras ou moles. Outras formulações úteis incluem aquelas apresentadas nas Patentes U.S. Nos RE28.819 e 4.358.603. Em resumo, tais formulações incluem, mas não são limitadas àquelas contendo um composto aqui fornecido, um mono- ou poli-alquileno glicol dialquilado, incluindo, mas não limitado a, 1,2-dimetoximetano, diglima, triglima, tetraglima, polietileno glicol-350-éter dimetílico, polietileno glicol-550-éter dimetílico, polietileno glicol-750-éter dimetílico em que 350, 550 e 750 referem-se ao peso molecular médio aproximado do polietileno glicol e um ou mais antioxidantes, tais como hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisol butilado (BHA), galato de propila, vitamina E, hidroquinona, hidroxicoumarinas, etanolamina, lecitina, cefalina, ácido ascórbico, ácido málico, sorbitol, ácido fosfórico, ácido tiodipropiônico e seus ésteres e ditiocarbamatos.
[00225] Outras formulações incluem, mas não são limitados a, soluções alcoólicas incluindo um acetal farmaceuticamente aceitável. Os álcoois usados nestas formulações são quaisquer solventes miscíveis em água farmaceuticamente aceitáveis tendo um ou mais grupos hidroxila, incluindo, mas não limitados a, propileno glicol e etanol. Acetais incluem, mas não são limitados a, di(alquila inferior) acetais de alquil aldeídos inferiores tais como acetaldeído dietil acetal.
[00226] A administração parenteral, em uma forma de realização, é caracterizada pela injeção, subcutânea, intramuscular ou intravenosamente também é aqui considerada. Injetáveis podem ser preparados nas formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para a solução ou suspensão em líquido antes da injeção ou como emulsões. As soluções e emulsões injetáveis também contêm um ou mais excipientes. Os excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. Além disso, se desejado, as composições farmacêuticas a serem administradas também podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponizadores de pH, estabilizadores, realçadores de solubilidade e outros de tais agentes, tais como por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas.
[00227] A implantação de um sistema de liberação lenta ou liberação prolongada, tal que um nível constante de dosagem seja mantido (ver, por exemplo, a Patente U.S. No 3.710.795) também é aqui considerada. Em resumo, um composto é aqui fornecido disperso em uma matriz interna sólida, por exemplo, metacrilato de polimetila, metacrilato de polibutila, cloreto de polivinila plasticizado ou não plasticizado, náilon plasticizado, tereftalato de polietileno plasticizado, borracha natural, poliisopreno, poliisobutileno, polibutadieno, polietileno, copolímeros de etileno-acetato de vinila, borrachas de silicona, polidimetilsiloxanos, copolímeros de carbonato de silicona, polímeros hidrofílicos tais como hidrogéis de ésteres de ácido acrílico e metacrílico, colágeno, álcool polivinílico reticulado e acetato de polivinila parcialmente hidrolisado reticulado, que é circundado por uma membrana polimérica externa, por exemplo, polietileno, polipropileno, copolímeros de etileno/propileno, copolímeros de etileno/acrilato de etila, copolímeros de etileno/acetato de vinila, borrachas de silicona, polidimetil siloxanos, borracha de neopreno, polietileno clorado, cloreto de polivinila, copolímeros de cloreto de vinila com acetato de vinila, cloreto de vinilideno, etileno e propileno, tereftalato de polietileno ionomérico, borracha de butila, borrachas de epicloroidrina, copolímero de etileno/álcool vinílico, terpolímero de etileno/acetato de vinila/álcool vinílico e copolímero de etileno/viniloxietanol, que é insolúvel em fluidos corporais. O anticorpo difunde através da membrana polimérica externa em uma etapa que controla a taxa de liberação. A quantidade de anticorpo contida em tais composições parenterais é altamente dependente da natureza específica deste, assim como da atividade do composto e das necessidades do paciente.
[00228] As preparações para a administração parenteral incluem soluções estéreis prontas para injeção, produtos solúveis secos estéreis, tais como pós liofilizados, prontos para serem combinados com um solvente exatamente antes do uso, incluindo tabletes hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis secos estéreis a serem combinados com um veículo exatamente antes do uso e emulsões estéreis. As soluções podem ser aquosas ou não aquosas.
[00229] Se administrados intravenosamente, carregadores adequados incluem solução salina fisiológica ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) e soluções contendo agentes espessantes e solubilizantes, tais como glicose, polietileno glicol e polipropileno glicol e misturas destes.
[00230] Os carregadores farmaceuticamente aceitáveis usados nas preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersantes, agentes emulsificantes, agentes sequestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis.
[00231] Os exemplos de veículos aquosos incluem injeção de cloreto de sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose Isotônica, Injeção de Água Estéril, Injeção de Ringer com Dextrose e Lactatada. Os veículos parenterais não aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. Os agentes antimicrobianos em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas podem ser adicionados às preparações parenterais empacotadas em recipientes de dose múltipla que incluem fenóis ou cresóis, mercúricos, álcool benzílico, clorobutanol, ésteres metílicos e propílicos do ácido p-hidroxibenzóico, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Tampões incluem fosfato e citrato. Antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Os anestésicos locais incluem cloridreto de procaína. Os agentes de suspensão e dispersão incluem carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose e polivinilpirrolidona. Os agentes emulsificadores incluem Polissorbato 80 (TWEEN®80). Um agente sequestrante ou quelante de íons metálicos inclui EDTA. Carregadores farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis em água; e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido láctico para o ajuste do pH.
[00232] A concentração do composto farmaceuticamente ativo é ajustada de modo que uma injeção forneça uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico desejado. A dose exata depende da idade, peso e condição do paciente ou animal como é conhecido na técnica.
[00233] As preparações parenterais de dose unitária podem ser acondicionadas em uma ampola, um frasco ou uma seringa com uma agulha. Todas as preparações para a administração parenteral podem ser estéreis, como é conhecido e praticado na técnica.
[00234] Ilustrativamente, a infusão intravenosa ou intraarterial de uma solução aquosa estéril contendo um composto ativo é um modo eficaz de administração. Uma outra forma de realização é uma solução ou suspensão aquosa ou oleosa estéreis contendo um material ativo injetado como necessário para produzir o efeito farmacológico desejado.
[00235] Os injetáveis são planejados para a administração local e sistemaic. Em uma forma de realização, uma dosagem terapeuticamente eficaz é formulada para conter uma concentração de pelo menos cerca de 0,1 % p/p até cerca de 90 % p/p ou mais, em certas formas de realização mais do que 1 % p/p do composto ativo ao(s) tecido(s) tratado(s).
[00236] O anticorpo pode ser colocado em suspensão na forma micronizada ou outra forma adequada. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo pretendido de administração e da solubilidade do composto no carregador ou veículo selecionados. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da condição e pode ser empiricamente determinada.
[00237] Em outras formas de realização, as formulações farmacêuticas são pós liofilizados, que podem ser reconstituídos para a administração como soluções, emulsões e outras misturas. Elas também podem ser reconstituídas e formuladas como sólidos ou géis.
[00238] O pó liofilizado é preparado dissolvendo-se um anticorpo aqui fornecido ou um derivado deste farmaceuticamente aceitável, em um solvente adequado. Em algumas formas de realização, o pó liofilizado é estéril. O solvente pode conter um excipiente que melhore a estabilidade ou outro componente farmacológico do pó ou solução reconstituída, preparada do pó. Excipientes que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, dextrose, sorbital, frutose, xarope de milho, xilitol, glicerina, glicose, sacarose ou outros agentes adequados. O solvente também pode conter um tampão, tal como citrato, fosfato de sódio ou potássio ou outro de tal tampão conhecido por aqueles de habilidade na técnica, em uma forma de realização, em torno do pH neutro. A filtração da solução seguida pela liofilização sob condições padrão conhecidas por aqueles de habilidade na técnica fornece a formulação desejada. Em uma forma de realização, a solução resultante será distribuída em frascos para a liofilização. Cada frasco conterá uma dosagem única ou dosagens múltiplas do composto. O pó liofilizado pode ser armazenado sob condições apropriadas, tal como a cerca de 4°C até a temperatura ambiente.
[00239] A reconstitução deste pó liofilizado com água para injeção fornece uma formulação para o uso na administração parenteral. Para a reconstituição, o pó liofilizado é adicionado à água estéril ou outro carregador adequado. A quantidade exata depende do composto selecionado. Tal quantidade pode ser empiricamente determinada.
[00240] As misturas tópica são preparadas como descritas para a administração local e sistêmica. A mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsões ou coisa parecida e pode ser formulada como cremes, géis, unguentos, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, pulverizações, supositórios, bandagens, emplastros dérmicos ou qualquer outras formulações adequadas para a administração tópica.
[00241] Os anticorpos da invenção podem ser formulados como aerossóis para a aplicação tópica, tal como pela inalação (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 4.044.126, 4.414.209 e 4.364.923, que descrevem aerossóis para a liberação de um esteróide útil para o tratamento de doenças inflamatórias, particularmente asma). Estas formulações para a administração ao trato respiratório podem estar na forma de um aerossol ou solução para um nebulizador ou como um pó microfino para insuflações, sozinho ou em combinação com um carregador inerte tal como lactose. Em um tal caso, as partículas da formulação, em uma forma de realização, terão diâmetros de menos do que 50 mícrons, em uma forma de realização menos do que 10 mícrons.
[00242] Os compostos podem ser formulados para a aplicação local ou tópica, tal como para a aplicação tópica à pele e membranas mucósicas, tais como no olho, na forma de géis, cremes e loções e para a aplicação ao olho ou para a aplicação intracistérnica ou intraespinhal. A administração tópica é considerada para a liberação transdérmica e também para a administração aos olhos ou mucosa ou para terapias de inalação. As soluções nasais do composto ativo sozinho ou em combinação com outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis também podem ser administradas.
[00243] Estas soluções, particularmente aquelas intencionadas para o uso oftálmico, podem ser formuladas como soluções isotônicas de 0,01 % a 10 %, pH de cerca de 5 a 7, com sais apropriados.
[00244] Outras vias de administração, tais como emplastros transdérmicos, incluindo dispositivos iontoforéticos e eletroforéticos e administração retal, também são aqui considerados.
[00245] Os emplastros transdérmicos, incluindo dispositivos iotoforéticos e eletroforéticos, são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Por exemplo, tais emplastros são divulgados nas Patentes U.S. Nos 6.267.983, 6.261.595, 6.256.533, 6.167.301, 6.024.975, 6.010715, 5.985.317, 5.983.134, 5.948.433 e 5.860.957.
[00246] Por exemplo, as formas de dosagem farmacêutica para a administração retal são supositórios, cápsulas e tabletes retais para efeito sistêmico. Os supositórios retais que são aqui usados significam corpos sólidos para a inserção no reto que fundem ou amolecem na temperatura do corpo liberando um ou mais ingrediente farmacológica ou terapeuticamente ativos. As substâncias farmaceuticamente aceitáveis utilizadas em supositórios retais são bases ou veículos e agentes para elevar o ponto de fusão. Os exemplos de bases incluem manteiga de cacau (óleo de teobroma), glicerina-gelatina, carbocera (polioxietileno glicol) e misturas apropriadas de mono-, di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Combinações das várias bases podem ser usadas. Agentes para elevar o ponto de fusão de supositórios incluem espermacete e cera. Os supositórios retais podem ser preparados pelo método comprimido ou pela moldagem. O peso de um supositório retal, em uma forma de realização, é de cerca de 2 a 3 g.
[00247] Tabletes e cápsulas para a administração retal podem ser fabricados usando a mesma substância farmaceuticamente aceitável e peelos mesmos métodos como para as formulações para a administração oral.
[00248] Os anticorpos e outras composições aqui fornecidas também podem ser formuladas para serem alvejadas a um tecido particular, receptor ou outra área do corpo do paciente a ser tratado. Muitos de tais métodos de alvejamento são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Todos de tais métodos de alvejamento são considerados aqui para o uso nas composições presentes. Para exemplos não limitantes de métodos de alvejamento, ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 6.316.652, 6.274.552, 6.271.359, 6.253.872, 6.139.865, 6.131.570, 6.120.751, 6.071.495, 6.060.082, 6.048.736, 6.039.975, 6.004.534, 5.985.307, 5.972.366, 5.900.252, 5.840.674, 5.759.542 e 5.709.874. Em algumas formas de realização, os anticorpos anti- hLIGHT da invenção são alvejados (ou de outro modo administradas) ao cólon, tal como em um paciente tendo ou em risco de ter um IBD.
[00249] Em uma forma de realização, suspensões lipossômicas, incluindo lipossomas alvejados a tecido, tais como lipossomas alvejados a tumor, também podem ser adequados como carregadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, as formulações de lipossoma podem ser preparadas como descrito na Patente U.S. No 4.522.811. Em resumo, lipossomas tais como vesículas multilamelares (MLV’s) podem ser formadas secando-se a fosfatidil colina do ovo e fosfatidil serina cerebral (razão molar de 7:3) dentro de um frasco. Uma solução de um composto aqui fornecido em solução salina tamponada com fosfato que carece de cátions bivalentes (PBS) é adicionada e o frasco agitado até que a película de lipídeo seja dispersada. As vesículas resultantes são lavadas para remover composto não encapsulado, pelotizadas pela centrifugação e depois recolocadas em suspensão em PBS.
MÉTODOS DE ADMINISTRAÇÃO E DOSAGEM
[00250] A presente invenção fornece ainda composições que compreendem um ou mais anticorpos da invenção para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT (ou sintoma deste).
[00251] Em certas formas de realização, são aqui fornecidas composições que compreendem um ou mais anticorpos da invenção para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT, tal como IBD (por exemplo, colite ulcerativa ou doença de Crohn) ou um sintoma deste. Os sintomas de IBD podem variar de branda a severa e no geral dependem da parte do trato intestinal envolvido. Os sintomas exemplares de IBD incluem cólicas e dores abdominais, diarréia sanguinolenta, necessidade severa para ter um movimento do intestino, febre, perda de apetite, perda de peso, anemia, fadiga e/ou feridas nas pernas inferiores, tornozelos, panturrilha, coxas e braços. As complicações intestinais exemplares de IBD incluem sangramento profuso das úlceras, perfuração ou ruptura dos intestinos, estenoses e obstrução, fístulas (passagem anormal) e doença perianal, megacólon tóxico (por exemplo, dilatação não obstrutiva aguda do cólon) e/ou malignidades (por exemplo, câncer do cólon ou intestino delgado). Complicações extra-intestinais exemplares de IBD incluem artrite, condições de pele, inflamação dos olhos, distúrbios hepáticos e renais e/ou perda óssea. Qualquer combinação dos mesmos sintomas pode ser prevenida, controlada, tratada e/ou melhorada usando as composições e métodos aqui fornecidos.
[00252] Em certas formas de realização, são aqui fornecidas composições que compreendem um ou mais anticorpos da invenção para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT, tal como GVHD ou um sintoma deste. GVHD no geral ocorre a seguir de transplantes da medula óssea alogênicos ou não relacionados emparelhados (BMT).
[00253] Em algumas formas de realização, a GVHD é a GVHD aguda. Os sintomas de GVHD aguda podem acontecer rapidamente e podem ser brandos ou severos. Em certos casos, a GVHD aguda desenvolve dentro de cerca de três meses depois do transplante, tal como quando as contagens sanguíneas se recuperam depois do transplante. Em certos casos, a GVHD aguda afeta a pele, trato gastrointestinal (GI) e/ou fígado. Por exemplo, em alguns pacientes, a GVHD de pele aguda começa com uma erupção, por exemplo, nas palmas das mãos do paciente, solas dos pés ou ombros. Entretanto, a erupção pode tornar-se amplamente disseminada e pode ser pruriente e dolorosa e/ou pode empolar e descascar. A GVHD hepática aguda pode afetar as funções normais do fígado, tal como enzimas hepáticas e pode por sua vez, causar icterícia. A GVHD hepática aguda também pode fazer com que o abdômen do paciente fique inchado e doloroso se o fígado se torna ampliado. Finalmente, os sintomas de GVHD intestinal aguda (ou GVHD do sistema digestivo) podem incluir diarréia, muco ou sangue nas fezes, cólicas ou dor abdominal, indigestão, náusea e/ou perda de apetite. Outros sintomas gerais de GVHD aguda podem incluir anemia, febre de grau baixo e/ou ser mais propenso às infecções. Qualquer combinação dos mesmos sintomas de GVHD aguda pode ser prevenida, controlada, tratada e/ou melhorada usando as composições e métodos aqui fornecidos.
[00254] Em outras formas de realização, a GVHD é a GVHD crônica. A GVHD crônica pode ocorrer de cerca de três meses a cerca de um ano ou mais longo depois do transplante. A GVHD crônica pode ser branda ou severa e no geral inclui sintomas similares àqueles da GVHD aguda. A GVHD crônica pode afetar a pele e o sistema digestivo, incluindo o fígado mas também pode envolver outros órgãos e o sistema imune (por exemplo, tornar o paciente mais propenso às infecções) e/ou tecidos conectivos. Os sintomas de GVHD de pele crônica incluem uma erupção, pele seca, pele esticada, pele pruriente, escurecimento da cor da pele, espessamento da pele e/ou pode afetar o cabelo (por exemplo, perda de cabelo, virar cinza) ou unhas (por exemplo, unhas duras ou quebradiças). A GVHD intestinal crônica pode afetar o sistema digestivo, boca, esôfago, revestimento do estômago e/ou revestimento dos intestinos e os sintomas podem incluir diarréia, boca seca ou ferida, deglutição dolorosa, baixa absorção de nutriente pelo estômago, inchaço, cólicas estomacais. A GVHD hepática crônica pode causar dano e escoriação do fígado (cirrose). A GVHD crônica dos olhos pode afetar as glândulas que fabricam as lágrimas, fazendo com que os olhos se tornem secos, queimadura e dor ou dificuldade para tolerar luz brilhante. A GVHD pulmonar crônica pode causar encurtamento da respiração, respiração ofegante, tosse persistente e/ou ser mais propenso às infecções do tórax. A GVHD crônica afeta tendões (por exemplo, inflamação) que conectam o músculo ao osso causando dificuldade de estabilizar ou flexionar seus braços e pernas. Qualquer combinação dos mesmos sintomas da GVHD crônica pode ser prevenida, controlada, tratada e/ou melhorada usando as composições e métodos aqui fornecidos.
[00255] Em uma forma de realização específica, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo E1, E13, E63, F19 e/ou F23. Em uma forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização específica, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo E1, E13, E63, F19 e/ou F23. Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um fragmento de ligação de antígeno de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23).
[00256] Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem um ou mais domínios VHs tendo uma sequência de aminoácido de qualquer um dos domínios VHs representados nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR1s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR1s VH representadas nas SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23 (isto é, CDR1s VH das VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR2s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR2s VH representadas nas SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24 (isto é, CDR2s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma forma de realização preferida, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR3s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VH representadas nas SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25 (isto é, CDR3s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23).
[00257] Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem um ou mais domínios VLs tendo uma sequência de aminoácido de qualquer um dos domínios VLs representados nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10 ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR1s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR1s VL representadas nas SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 93, 35, 94, 95 ou 38 (isto é, CDR1s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA- 7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem um ou mais CDR2s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR2s VL representadas nas SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39 (isto é, CDR2s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente); ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma forma de realização preferida, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR3s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VL representadas nas SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40 (isto é, CDR3s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente), ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23).
[00258] Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem um ou mais domínios VHs tendo uma sequência de aminoácido de qualquer um dos domínios VHs representados nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5 ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e um ou mais domínios VLs tendo uma sequência de aminoácido de qualquer um dos domínios VLs representados nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10 ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23).
[00259] Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR1s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR1s VH representadas nas SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23 (isto é, CDR1s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e uma ou mais CDR1s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR1s VL representadas nas SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 93, 35, 94, 95 ou 38 (isto é, CDR1s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR1s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR1s VH representadas nas SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23 (isto é, CDR1s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e uma ou mais CDR2s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR2s VL representadas nas SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39 (isto é, CDR2s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR1s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR1s VH representadas nas SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23 (isto é, CDR1s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e uma ou mais CDR3s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VL representadas nas SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40 (isto é, CDR3s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23).
[00260] Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR2s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR2s VH representadas nas SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24 (isto é, CDR2s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e uma ou mais CDR1s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR1s VL representadas nas SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 93, 35, 94, 95 ou 38 (isto é, CDR1s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR2s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR2s VH representadas nas SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24 (isto é, CDR2s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e uma ou mais CDR2s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR2s VL representadas nas SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39 (isto é, CDR2s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR2s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR2s VH representadas nas SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24 (isto é, CDR2s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e uma ou mais CDR3s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VL representadas nas SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40 (isto é, CDR3s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23).
[00261] Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR3s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VH representadas nas SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25 (isto é, CDR3s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e uma ou mais CDR1s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR1s VL representadas nas SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 93, 35, 94, 95 ou 38 (isto é, CDR1s VL da VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR3s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VH representadas nas SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25 (isto é, CDR3s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e uma ou mais CDR2s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR2s VL representadas nas SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39 (isto é , CDR2s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um ou mais anticorpos que compreendem uma ou mais CDR3s VH tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VH representadas nas SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25 (isto é, CDR3s VH da VH representada nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23) e uma ou mais CDR3s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VL tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDR3s VL representado nas SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40 (isto é, CDR3s VL da VL representada nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10, respectivamente) ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23).
[00262] Em uma forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um domínio VH tendo a sequência de aminoácido do domínio VH representado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5 e/ou um domínio VL tendo a sequência de aminoácido do domínio VL representado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91 ou 10.
[00263] Em certas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende (a) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 1 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 82, 6 ou 83; (b) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 2 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 7; (c) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 3 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 8; (d) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 4 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 90, 9, 91 ou 92; ou (e) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 5 e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 10. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00264] Em algumas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende um domínio VH tendo a sequência de aminoácido do domínio VH de um anticorpo tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente) e/ou um domínio VL tendo a sequência de aminoácido do domínio VL de um anticorpo tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente).
[00265] Em certas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende (a) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7729 (E1) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7729 (E1); (b) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7842 (E13) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7842 (E13); (c) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7818 (E63) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7818 (E63); (d) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7819 (F19) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7819 (F19); ou (e) um domínio VH tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7728 (F23) e um domínio VL tendo a sequência de aminoácido de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7728 (F23). Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00266] Em algumas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma CDR1 de VH tendo a sequência de aminoácido da CDR1 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma CDR2 de VH tendo a sequência de aminoácido da CDR2 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido da CDR3 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5. Em certas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma CDR1 de VH e/ou uma CDR2 de VH e/ou uma CDR3 de VH independentemente selecionadas de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH como representadas em qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5.
[00267] A presente invenção também fornece uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT que compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma ou mais CDRs de VL (isto é, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL) tendo uma sequência de aminoácido de qualquer uma das CDRs de VL (isto é, CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL) de E1, E13, E63, F19 e/ou F23; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente); ou qualquer combinação dos mesmos.
[00268] Em certas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende (1) um domínio VH tendo (a) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 11, 12 e/ou 13, respectivamente, (b) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 14, 15 e/ou 16, respectivamente, (c) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 17, 18 e/ou 19, respectivamente, (d) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 20, 21 e/ou 22, respectivamente ou (e) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 23, 24 e/ou 24, respectivamente e/ou (2) um domínio VL tendo (a) uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 84, 26 ou 85; uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 86, 27 ou 87; e/ou uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 88, 28 ou 89, (b) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 29, 30 e/ou 31, respectivamente, (c) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 32, 33 e/ou 34, respectivamente, (d) uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 93, 35, 94 ou 95; uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 36, 97 ou 98; e/ou uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 36, 97 ou 98 ou (e) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 38, 39 e/ou 40, respectivamente. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00269] Em algumas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende (1) um domínio VH tendo (a) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7729 (E1), (b) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7842 (E13), (c) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7818 (E63), (d) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7819 (F19) ou (e) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7728 (F23) e/ou (2) um domínio VL tendo (a) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7729 (E1), (b) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7842 (E13), (c) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7818 (E63), (d) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7819 (F19) ou (e) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7728 (F23). Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00270] Em certas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende (1) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 11, 12 e/ou 13, respectivamente e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 84, 26 ou 85; uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 86, 27 ou 87; e/ou uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 88, 28 ou 89; (2) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 14, 15 e/ou 16, respectivamente e (b) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 29, 30 e/ou 31, respectivamente; (3) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 17, 18 e/ou 19, respectivamente e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 32, 33 e/ou 34, respectivamente; (4) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 20, 21 e/ou 22, respectivamente e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 93, 35, 94 ou 95; uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 36, 97 ou 98; e/ou uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 96, 36, 97 ou 98; ou (5) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 23, 24 e/ou 24, respectivamente e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido representada nas SEQ ID NOS: 38, 39 e/ou 40, respectivamente. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00271] Em algumas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende (1) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7729 (E1) e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7729 (E1); (2) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7842 (E13) e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7842 (E13); (3) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7818 (E63) e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7818 (E63); (4) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7819 (F19) e uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7819 (F19); ou (5) (a) um domínio VH tendo uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e/ou CDR3 de VH de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7728 (F23) e (b) um domínio VL tendo uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e/ou CDR3 de VL de um anticorpo tendo o Acesso ATCC No PTA-7728 (F23). Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00272] Em algumas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido da CDR1 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido da CDR2 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA- 7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente). Em uma outra forma de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido da CDR3 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente). Em certas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma CDR1 de VL e/ou uma CDR2 de VL e/ou uma CDR3 de VL independentemente selecionadas da CDR1 de VL, CDR2 de VL, CDR3 de VL como representado em qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA- 7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente).
[00273] Em algumas formas de realização, uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende um (1) domínio VH ou cadeia tendo um ou mais de (a) uma CDR1 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR1 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA- 7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente), (b) uma CDR2 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR2 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente) ou (c) uma CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de uma CDR3 de VH de qualquer uma das regiões VH representadas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4 ou 5; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA- 7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente); e/ou (2) um domínio VL ou cadeia tendo um ou mais de (a) uma CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido da CDR1 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA- 7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente), (b) uma CDR2 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR2 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente) e/ou (c) uma CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de uma CDR3 de VL de qualquer uma das regiões VL representadas nas SEQ ID NOS: 82, 6, 83, 7, 8, 90, 9, 91, 92 ou 10; ou de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo os Acessos ATCC Nos PTA- 7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23, respectivamente).
[00274] A presente invenção também fornece uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma ou mais CDRs de VH e uma ou mais CDRs de VL listadas na Tabela I. Em particular, a invenção fornece uma composição para o uso na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT que compreende um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o dito anticorpo compreende uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); um VH1 CDR1, uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), um CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e um CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 27, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38), uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR1 de VH (SEQ ID NOS: 11, 14, 17, 20 ou 23), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38), uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); uma CDR2 de VH (SEQ ID NOS: 12, 15, 18, 21 ou 24), uma CDR3 de VH (SEQ ID NOS: 13, 16, 19, 22 ou 25), uma CDR1 de VL (SEQ ID NOS: 84, 26, 85, 29, 32, 35 ou 38), uma CDR2 de VL (SEQ ID NOS: 86, 27, 87, 30, 33, 96, 36, 97, 98 ou 39) e uma CDR3 de VL (SEQ ID NOS: 88, 28, 89, 31, 34, 99, 37, 100, 101 ou 40); ou qualquer combinação destas CDRs de VH (SEQ ID NOS: 11 a 25) e CDRs de VL (SEQ ID NOS: 26 a 40) listadas na Tabela I. As CDRs de VH e CDRs de VL correspondentes dos Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23), também podem ser usadas em qualquer uma das combinações listadas acima. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano e/ou um anticorpo de hLIGHT antagonista.
[00275] Como debatido em mais detalhes aqui em outro lugar, uma composição da invenção pode ser usada sozinha ou em combinação com outros compostos ou composições. Além disso, os anticorpos podem ser ainda recombinantemente fundidos a um polipeptídeo heterólogo no terminal N ou C ou quimicamente conjugado (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) aos polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, anticorpos da presente invenção podem ser recombinantemente fundidos ou conjugados às moléculas úteis como rótulos em ensaios de detecção e moléculas efetoras tais como polipeptídeos heterólogos, medicamentos, radionucleotídeos ou toxinas. Ver, por exemplo, as publicações PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; Patente U.S. No 5.314.995; e EP 396.387.
[00276] Em algumas formas de realização, aqui fornecidas são métodos para diminuir ou inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, LTβR e/ou DcR3 em um paciente (por exemplo, um paciente humano), que compreendem administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel). Em uma forma de realização, o hLIGHT é uma variante SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L. Em algumas formas de realização, uma atividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, também é diminuída ou inibida no paciente.
[00277] Em certas formas de realização, são aqui fornecidos métodos para diminuir ou inibir uma atividade biológica de hLIGHT, tal como secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, em um paciente (por exemplo, um paciente humano), que compreende administrar ao paciente uma quantidade eficaz de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula), em que a atividade biológica de hLIGHT é diminuída ou inibida pelo anticorpo. Em algumas formas de realização, o hLIGHT é uma variante de SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L.
[00278] Em outras formas de realização, são aqui fornecidos métodos para diminuir ou inibir a ligação de hLIGHT a HVEM, LTβR e/ou DcR3 em uma célula tendo hLIGHT expressado na superfície da célula, contactando a célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel), tal como um polipeptídeo hLIGHT, um fragmento de polipeptídeo hLIGHT ou um epítopo de hLIGHT. Em certas formas de realização, o hLIGHT é uma variante de SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L. Em algumas formas de realização, uma atividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, também é diminuída ou inibida na célula.
[00279] Em certas formas de realização, são aqui fornecidos métodos para diminuir ou inibir uma atividade biológica de hLIGHT, tal como a secreção de CCL20, IL8 e/ou RANTES, em uma célula tendo um receptor de hLIGHT expressado na superfície da célula (tal como, HVEM, LTβR e/ou Dc3R), contactando a célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo que imunoespecificamente se liga a um polipeptídeo hLIGHT (por exemplo, um hLIGHT expressado na superfície da célula ou solúvel) em que a atividade biológica de hLIGHT é diminuída ou inibida pelo anticorpo. Em algumas formas de realização, o hLIGHT é uma variante de SNP de hLIGHT, tal como 214E-32S, 214K-32S, 214E-32L ou 214K-32L.
[00280] Os anticorpos da presente invenção podem ser usados, por exemplo, para purificar, detectar e alvejar antígenos de hLIGHT, em métodos de diagnóstico e terapêuticos tanto in vitro quanto in vivo. Por exemplo, os anticorpos modificados têm uso em imunoensaios para medir qualitativa e quantitativamente níveis de hLIGHT em amostras biológicas. Ver, por exemplo, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2aed. 1988) (aqui incorporados por referência em sua totalidade).
[00281] A invenção também fornece métodos de prevenir, controlar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT pela administração a um paciente de uma quantidade eficaz de um anticorpo ou composição farmacêutica que compreenda um anticorpo da invenção. Em um aspecto, um anticorpo é substancialmente purificado (isto é, substancialmente livre de substâncias que limitem seu efeito ou produzam efeitos colaterais indesejados). Em formas de realização preferidas, o anticorpo é um anticorpo monoclonal totalmente humano, tal como um anticorpo monoclonal totalmente humano antagonista. O paciente administrado com uma terapia é preferivelmente um mamífero tal como não primata (por exemplo, vacas, porcos, cavalos, gatos, cães, ratos etc.) ou um primata (por exemplo, um macaco, tal como um macaco cinomolgo ou um ser humano). Em uma forma de realização preferida, o paciente é um ser humano. Em uma outra forma de realização preferida, o paciente é uma criança humana ou uma criança humana nascida prematuramente. Em uma outra forma de realização, o paciente é um ser humano com uma doença mediada por hLIGHT.
[00282] Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem ser usados para administrar um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da invenção), incluindo, mas não limitados a, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar a endocitose mediada por receptor de anticorpo (ver, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), construção de um ácido nucléico como parte de um retroviral ou outro vetor, etc. Métodos de administrar um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da invenção) ou composição farmacêutica incluem, mas não são limitados à administração parenteral (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea), epidural e mucósica (por exemplo, vias intranasal e oral). Em uma forma de realização específica, um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da presente invenção) ou uma composição farmacêutica são administrados intranasal, intramuscular, intravenosa ou subcutaneamente. Os agentes profiláticos ou terapêuticos ou composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolo, pela absorção através dos revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, mucosa intranasal, mucosas retal e intestinal, etc.) e podem ser administrados juntos com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, a administração pulmonar também pode ser utilizada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador e formulação com um agente aerossolizador. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 e 4.880.078; e Publicações PCT Nos WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 e WO 99/66903, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00283] Em uma forma de realização específica, pode ser desejável administrar um agente profilático ou terapêutico ou uma composição farmacêutica da invenção localmente à área em necessidade de tratamento. Isto pode ser obtido, por exemplo e não por via de limitação, pela infusão local, pela administração tópica (por exemplo, pela pulverização intranasal), por injeção ou por meio de um implante, o dito implante sendo de um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tais como membranas sialástico ou fibras. Preferivelmente, quando da administração de um anticorpo da invenção, cuidado deve ser tomado para usar materiais aos quais o anticorpo não absorva.
[00284] Em uma outra forma de realização, um agente profilático ou terapêutico ou uma composição da invenção podem ser liberadas em uma vesícula, em particular um lipossoma (ver Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., em Lipossomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova Iorque, pp. 353365(1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; ver no geral ibid.).
[00285] Em uma outra forma de realização, um agente profilático ou terapêutico ou uma composição da invenção podem ser liberados em um sistema de liberação controlada ou liberação prolongada. Em uma forma de realização, uma bomba pode ser usada para se obter a liberação controlada ou prolongada (ver Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). Em uma outra forma de realização, materiais poliméricos podem ser usados para se obter a liberação controlada ou prolongada de um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da invenção) ou uma composição da invenção (ver por exemplo, Medical Application of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Flórida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova Iorque (1984); Ranger e Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; ver também Levy et al., 1985, Science 228: 190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1: 105); Patente U.S. No 5.679.377; Patente U.S. No 5.916.597; Patente U.S. No 5.912.015; Patente U.S. No 5.989.463; Patente U.S. No 5.128.326; Publicação PCT No WO 99/15154; e Publicação PCT No WO 99/20253. Os exemplos de polímeros usados em formulações de liberação prolongada incluem, mas não são limitados a, poli(metacrilato de 2-hidróxi etila), poli(metacrilato de metila), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinila), poli(ácido metacrílico), poliglicolídeos (PLG), polianidridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(álcool vinílico), poliacrilamida, poli(etileno glicol), polilactídeos (PLA), poli(lactídeo-co-glicolídeos) (PLGA) e poliortoésteres. Em uma forma de realização preferida, o polímero usado em uma formulação de liberação prolongada é inerte, livre de impurezas lixiviáveis, estável na armazenagem, estéril e biodegradável. Já em uma outra forma de realização, um sistema de liberação controlada ou prolongada pode ser colocado em proximidade do alvo terapêutico, isto é, nas passagens nasais ou pulmonares, requerendo assim apenas uma fração da dose sistêmica (ver, por exemplo, Goodson, em Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Os sistemas de liberação controlada são debatidos na revisão por Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Qualquer técnica conhecida a uma pessoa de habilidade na técnica pode ser usada para produzir formulações de liberação prolongada que compreendem um ou mais anticorpos da invenção. Ver, por exemplo, Patente U.S. No 4.526.938, publicação PCT WO 91/05548, publicação PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, “Intratumoral Radioimunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained- Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39: 179-189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polimeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854 e Lam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00286] Em uma forma de realização específica, onde a composição da invenção é um ácido nucléico que codifica um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da invenção), o ácido nucléico pode ser administrado in vivo para promover a expressão do seu agente profilático ou terapêutico codificado, construindo-o como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e administrá-lo de modo que o mesmo se torne intracelular, por exemplo, pelo uso de um vetor retroviral (ver a Patente U.S. No 4.980.286) ou pela injeção direta ou pelo uso de bombardeamento de micropartícula (por exemplo, uma pistola de gene; Biolistic, Dupont) ou revestimento com lipídeos ou receptores de superfície celular ou agentes de transfecção ou administrando-o em ligação a um peptídeo equivalente a homeobox que é conhecido entrar no núcleo (ver, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868), etc. Alternativamente, um ácido nucléico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do DNA da célula hospedeira para a expressão pela recombinação homóloga.
[00287] Em uma forma de realização específica, uma composição da invenção compreende um, dois ou mais anticorpos da invenção. Em uma outra forma de realização, uma composição da invenção compreende um, dois ou mais anticorpos da invenção e um agente profilático ou terapêutico outro que não um anticorpo da invenção. Preferivelmente, os agentes são conhecidos como sendo úteis para ou foram ou são correntemente usados para a prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT. Além dos agentes profiláticos ou terapêuticos, as composições da invenção também podem compreender um carregador.
[00288] As composições da invenção incluem composições de medicamento volumosos úteis na fabricação de composições farmacêuticas (por exemplo, composições que são adequados para a administração a um sujeito ou paciente) que podem ser usadas na preparação de formas de dosagem unitárias. Em uma forma de realização preferida, uma composição da invenção é uma composição farmacêutica. Tais composições compreendem uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz de um ou mais agentes profiláticos ou terapêuticos (por exemplo, um anticorpo da invenção ou outro agente profilático ou terapêutico) e um carregador farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, as composições farmacêuticas são formuladas como sendo adequadas para a via de administração a um paciente.
[00289] Em uma forma de realização específica, o termo “carregador” refere-se a um diluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund (completo e incompleto)), excipiente ou veículo com que o produto terapêutico é administrado. Tais carregadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem do petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e outros. Água é um carregador preferido quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. As soluções salinas e dextrose aquosa e soluções de glicerol também podem ser utilizadas como carregadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha de trigo, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pó desnatado, glicerol, propileno glicol, água, etanol e outros. A composição, se desejada, também pode conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificantes ou agentes tamponizadores de pH. Estas composições pode tomar a forma de soluções, suspensões, emulsão, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação prolongada e outros. A formulação oral pode incluir carregadores padrão tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Os exemplos de carregadores farmacêuticos adequados são descritos em Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA. Tais composições conterão uma quantidade profilática ou terapeuticamente eficaz do anticorpo, preferivelmente na forma purificada, junto com uma quantidade adequada de carregador de modo a fornecer a forma para a administração apropriada ao paciente. A formulação deve se adequar ao modo de administração.
[00290] Em uma forma de realização preferida, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para a administração intravenosa aos seres humanos. Tipicamente, composições para a administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local tal como lignocaína para aliviar a dor no local da injeção. Tais composições, entretanto, podem ser administradas por uma via outra que não a intravenosa.
[00291] No geral, os ingredientes de composições da invenção são fornecidas separadamente ou misturadas juntas na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água em um recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Onde a composição deva ser administrada pela infusão, a mesma pode ser dispensada com uma garrafa de infusão contendo água grau farmacêutico estéril ou solução salina. Onde a composição é administrada pela injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida de modo que os ingredientes podem ser misturados antes da administração.
[00292] A invenção também fornece que um anticorpo da invenção é embalado em um recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de anticorpo. Em uma forma de realização, o anticorpo é fornecido como um pó liofilizado esterilizado seco ou concentrado isento de água em um recipiente hermeticamente selado e pode ser reconstituído, por exemplo, com água ou solução salina na concentração apropriada para a administração a um paciente. Preferivelmente, o anticorpo é fornecido como um pó liofilizado estéril seco em um recipiente hermeticamente selado em uma dosagem unitária de pelo menos 0,1 mg, pelo menos 0,5 mg, pelo menos 1 mg, pelo menos 2 mg ou pelo menos 3 mg e mais preferivelmente pelo menos 5 mg, pelo menos 10 mg, pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 30 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 60 mg, pelo menos 75 mg, pelo menos 80 mg, pelo menos 85 mg, pelo menos 90 mg, pelo menos 95 mg ou pelo menos 100 mg. O anticorpo liofilizado pode ser armazenado entre 2 e 8°C no seu recipiente original e o anticorpo pode ser administrado dentro de 12 horas, preferivelmente dentro de 6 horas, dentro de 5 horas, dentro de 3 horas ou dentro de 1 hora depois de ser reconstituído. Em uma forma de realização alternativa, um anticorpo é fornecido na forma líquida em um recipiente hermeticamente selado indicando a quantidade e concentração do anticorpo. Preferivelmente, a forma líquida do anticorpo é fornecida em um recipiente hermeticamente selado de pelo menos 0,1 mg/ml, de pelo menos 0,5 mg/ml ou de pelo menos 1 mg/ml e mais preferivelmente de pelo menos 5 mg/ml, de pelo menos 10 mg/ml, de pelo menos 15 mg/ml, de pelo menos 25 mg/ml, de pelo menos 30 mg/ml, de pelo menos 40 mg/ml, de pelo menos 50 mg/ml, de pelo menos 60 mg/ml, de pelo menos 70 mg/ml, de pelo menos 80 mg/ml, de pelo menos 90 mg/ml ou de pelo menos 100 mg/ml.
[00293] As composições da invenção podem ser formuladas como formas neutras ou salinas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com ânions tais como aqueles derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. e aqueles formados com cátions tais como aqueles derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
[00294] A quantidade de um agente profilático ou terapêutico (por exemplo, um anticorpo da invenção) ou uma composição da invenção que será eficaz na prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT pode ser determinada pelas técnicas clínicas padrão.
[00295] Consequentemente, uma dosagem de um anticorpo ou uma composição que resulte em um título sérico de cerca de 0,1 μg/ml a cerca de 450 μg/ml e em algumas formas de realização pelo menos 0,1 μg/ml, pelo menos 0,2 μg/ml, pelo menos 0,4 μg/ml, pelo menos 0,5 μg/ml, pelo menos 0,6 μg/ml, pelo menos 0,8 μg/ml, pelo menos 1 μg/ml, pelo menos 1,5 μg/ml e preferivelmente pelo menos 2 μg/ml, pelo menos 5 μg/ml, pelo menos 10 μg/ml, pelo menos 15 μg/ml, pelo menos 20 μg/ml, pelo menos 25 μg/ml, pelo menos 30 μg/ml, pelo menos 35 μg/ml, pelo menos 40 μg/ml, pelo menos 50 μg/ml, pelo menos 75 μg/ml, pelo menos 100 μg/ml, pelo menos 125 μg/ml, pelo menos 150 μg/ml, pelo menos 200 μg/ml, pelo menos 250 μg/ml, pelo menos 300 μg/ml, pelo menos 350 μg/ml, pelo menos 400 μg/ml ou pelo menos 450 μg/ml podem ser administrados a um ser humano para a prevenção, controle, tratamento e/ou melhora de uma doença mediada por hLIGHT. Além disso, ensaios in vitro podem ser opcionalmente utilizados para ajudar a identificar faixas de dosagem ótimas. A dose exata a ser utilizada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade de uma doença mediada por hLIGHT e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e cada circunstância do paciente.
[00296] As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir das curvas de resposta de dose derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo de animal.
[00297] Para os anticorpos da invenção, a dosagem administrada a um paciente é tipicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg do peso corporal do paciente. Em algumas formas de realização, a dosagem administrada ao paciente é de cerca de 1 mg/kg a cerca de 75 mg/kg do peso corporal do paciente. Preferivelmente, a dosagem administrada a um paciente está entre 1 mg/kg e 20 mg/kg do peso corporal do paciente, mais preferivelmente de 1 mg/kg a 5 mg/kg do peso corporal do paciente. No geral, os anticorpos humanos têm uma meia vida mais longa dentro do corpo humano do que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imune aos polipeptídeos estranhos. Assim, as dosagens mais baixas de anticorpos humanos e a administração menos frequente é muitas vezes possível. Além disso, a dosagem e a frequência de administração dos anticorpos da invenção podem ser reduzidas realçando-se a captação e penetração de tecido dos anticorpos pelas modificações tais como, por exemplo, lipidação.
[00298] Em uma forma de realização, aproximadamente 100 mg/kg ou menos, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos ou aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos de um anticorpo a invenção são administrados 5 vezes, 4 vezes, 3 vezes, 2 vezes ou, preferivelmente, 1 vez para controlar uma doença mediada por hLIGHT. Em algumas formas de realização, um anticorpo da invenção é administrado cerca de 1 a 12 vezes, em que as doses podem ser administradas como necessárias, por exemplo, semanal, bissemanal, mensal, bimestral, trimestral, etc., como determinado por um médico. Em algumas formas de realização, uma dose mais baixa (por exemplo, 1 a 15 mg/kg) pode ser administrada mais frequentemente (por exemplo, 3 a 6 vezes). Em outras formas de realização, uma dose mais alta (por exemplo, 25 a 100 mg/kg) pode ser administrada menos frequentemente (por exemplo, 1 a 3 vezes). Entretanto, como estará evidente àqueles na técnica, outras quantidades e programas de dosagem são facilmente determináveis e dentro do escopo da invenção.
[00299] Em uma forma de realização específica, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos de um anticorpo da invenção em uma formulação de liberação prolongada são administrados a um paciente, preferivelmente um ser humano, para prevenir, controlar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT. Em uma outra forma de realização específica, um bolo de aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos ou aproximadamente 0,1 mg/kg ou menos de um anticorpo da invenção não em uma formulação de liberação prolongada são administrados a um paciente, preferivelmente um ser humano, para prevenir, controlar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT e depois de um certo período de tempo, aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg ou menos, aproximadamente 50 mg/kg ou menos, aproximadamente 25 mg/kg ou menos, aproximadamente 10 mg/kg ou menos, aproximadamente 5 mg/kg ou menos, aproximadamente 1 mg/kg ou menos, aproximadamente 0,5 mg/kg ou menos ou aproximadamente 5 mg/kg ou menos de um anticorpo da invenção em uma liberação prolongada são administrados ao dito paciente (por exemplo, intranasal ou intramuscularmente) duas, três ou quatro vezes (preferivelmente uma vez). De acordo com esta forma de realização, um certo período de tempo pode ser de 1 a 5 dias, uma semana, duas semanas ou um mês.
[00300] Em algumas formas de realização, uma dose única de um anticorpo da invenção é administrada a um paciente para prevenir, controlar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze vezes, treze, catorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte, vinte um, vinte e dois, vinte e três, vinte e quatro, vinte e cinco ou vinte e seis em intervalos bi-semanais (por exemplo, de cerca de 14 dias) durante o curso de um ano, em que a dose é selecionada do grupo que consiste de cerca de 0,1 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg, de cerca de 15 mg/kg, de cerca de 20 mg/kg, de cerca de 25 mg/kg, de cerca de 30 mg/kg, de cerca de 35 mg/kg, de cerca de 40 mg/kg, de cerca de 45 mg/kg, de cerca de 50 mg/kg, de cerca de 55 mg/kg, de cerca de 60 mg/kg, de cerca de 65 mg/kg, de cerca de 70 mg/kg, de cerca de 75 mg/kg, de cerca de 80 mg/kg, de cerca de 85 mg/kg, de cerca de 90 mg/kg, de cerca de 95 mg/kg, de cerca de 100 mg/kg ou uma combinação destas (isto é, cada dose mensal pode ser ou não idêntica).
[00301] Em uma outra forma de realização, uma dose única de um anticorpo da invenção é administrada ao paciente para prevenir, controlar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze ou doze vezes em intervalos de aproximadamente um mês (por exemplo, em torno de 30 dias) durante o curso de um ano, em que a dose é selecionada do grupo que consiste de cerca de 0,1 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg, de cerca de 15 mg/kg, de cerca de 20 mg/kg, de cerca de 25 mg/kg, de cerca de 30 mg/kg, de cerca de 35 mg/kg, de cerca de 40 mg/kg, de cerca de 45 mg/kg, de cerca de 50 mg/kg, de cerca de 55 mg/kg, de cerca de 60 mg/kg, de cerca de 65 mg/kg, de cerca de 70 mg/kg, de cerca de 75 mg/kg, de cerca de 80 mg/kg, de cerca de 85 mg/kg, de cerca de 9,0 mg/kg, de cerca de 95 mg/kg, de cerca de 100 mg/kg ou uma combinação destas (isto é, cada dose mensal pode ser ou não idêntica).
[00302] Em uma forma de realização, uma dose única de um anticorpo da invenção é administrada a um paciente para prevenir, controlar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT duas, três, quatro, cinco ou seis vezes em intervalos aproximadamente bimestrais (por exemplo, em torno de 60 dias) durante o curso de um ano, em que a dose é selecionada do grupo que consiste de cerca de 0,1 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg, de cerca de 15 mg/kg, de cerca de 20 mg/kg, de cerca de 25 mg/kg, de cerca de 30 mg/kg, de cerca de 35 mg/kg, de cerca de 40 mg/kg, de cerca de 45 mg/kg, de cerca de 50 mg/kg, de cerca de 55 mg/kg, de cerca de 60 mg/kg, de cerca de 65 mg/kg, de cerca de 70 mg/kg, de cerca de 75 mg/kg, de cerca de 80 mg/kg, de cerca de 85 mg/kg, de cerca de 90 mg/kg, de cerca de 95 mg/kg, de cerca de 100 mg/kg ou uma combinação destas (isto é, cada dose bimestral pode ser ou não idêntica).
[00303] Em algumas formas de realização, uma dose única de um anticorpo da invenção é administrada a um paciente para prevenir, controlar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT duas, três ou quatro vezes em intervalos aproximadamente trimestrais (por exemplo, em torno de 120 dias) durante o curso de um ano, em que a dose é selecionada do grupo que consiste de cerca de 0,1 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg, de cerca de 10 mg/kg, de cerca de 15 mg/kg, de cerca de 20 mg/kg, de cerca de 25 mg/kg, de cerca de 30 mg/kg, de cerca de 35 mg/kg, de cerca de 40 mg/kg, de cerca de 45 mg/kg, de cerca de 50 mg/kg, de cerca de 55 mg/kg, de cerca de 60 mg/kg, de cerca de 65 mg/kg, de cerca de 70 mg/kg, de cerca de 75 mg/kg, de cerca de 80 mg/kg, de cerca de 85 mg/kg, de cerca de 90 mg/kg, de cerca de 95 mg/kg, de cerca de 100 mg/kg ou uma combinação destas (isto é, cada dose trimestral pode ser ou não idêntica).
[00304] Em certas formas de realização, a via de administração para uma dose de um anticorpo da invenção a um paciente é intranasal, intramuscular, intravenosa ou uma combinação destas, mas outras vias aqui descritas também são aceitáveis. Cada dose pode ser ou não administrada por uma via idêntica de administração. Em algumas formas de realização, um anticorpo da invenção pode ser administrado por intermédio de vias múltiplas de administração simultânea ou subsequentemente com outras doses do mesmo ou um anticorpo diferente da invenção.
[00305] Em certas formas de realização, os anticorpos da invenção são administrados profilática ou terapeuticamente a um paciente. Os anticorpos da invenção podem ser profilática ou terapeuticamente administrados a um paciente de modo a prevenir, diminuir ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT ou sintoma deste.
TERAPIA DE GENE
[00306] Em uma forma de realização específica, ácidos nucléicos que compreendem sequências que codificam anticorpos da invenção ou derivados funcionais deste, são administrados para prevenir, controlar, tratar e/ou melhorar uma doença mediada por hLIGHT por via da terapia de gene. A terapia de gene refere-se à terapia realizada pela administração a um paciente de um ácido nucléico expressado ou expressável. Em uma forma de realização da invenção, os ácidos nucléicos produzem seu anticorpo codificado e o anticorpo medeia um efeito profilático ou terapêutico.
[00307] Qualquer um dos métodos para a terapia de gene disponível na técnica pode ser usado de acordo com a presente invenção. Os métodos exemplares são descritos abaixo.
[00308] Para revisão geral dos métodos de terapia de gene, ver Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12: 488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932 ; e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; Maio, 1993, TIBTECH 11(5): 155215. Os métodos habitualmente conhecidos na técnica da tecnologia de DNA recombinante que podem ser usados são descritos em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); e Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).
[00309] Em uma forma de realização preferida, uma composição da invenção compreende ácidos nucléicos que codificam um anticorpo da invenção, os ditos ácidos nucléicos sendo parte de um vetor de expressão que expressa o anticorpo ou proteínas quiméricas ou cadeias pesadas ou leves destas em um hospedeiro adequado. Em particular, tais ácidos nucléicos têm promotores, preferivelmente promotores heterólogos, operavelmente ligados à região codificadora de anticorpo, o dito promotor sendo indutível ou constitutivo, e, opcionalmente, específico de tecido. Em uma outra forma de realização particular, as moléculas de ácido nucléico são usadas em que as sequências codificadoras de anticorpo e qualquer outra sequência desejada são flanqueadas pelas regiões que promovem a recombinação homóloga em um sítio desejado no genoma, fornecendo assim a expressão intracromossômica dos ácidos nucléicos que codificam o anticorpo (Koller e Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438). Em algumas formas de realização, a molécula de anticorpo expressada é um anticorpo de cadeia única; alternativamente, as sequências de ácido nucléico incluem sequências que codificam tanto as cadeias leves quanto as pesadas ou fragmentos destas, do anticorpo.
[00310] A liberação dos ácidos nucléicos em um paciente pode ser direta, caso este em que o paciente é diretamente exposto ao ácido nucléico ou vetores que carregam o ácido nucléico ou indireta, caso este em que, as células são primeiro transformadas com os ácidos nucléicos in vitro, depois transplantadas no paciente. estes dois métodos são conhecidos, respectivamente, como terapia de gene in vivo ou ex vivo.
[00311] Em uma forma de realização específica, as sequências de ácido nucléico são diretamente administradas in vivo, onde as sequências são expressadas para produzir o produto codificado. Isto pode ser realizado por qualquer um de numerosos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, construindo-os como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriado e administrando o vetor de modo que as sequências se tornem intracelulares, por exemplo, pela infecção usando vetores retrovirais defeituosos ou atenuados ou outros vetores virais (ver a Patente U.S. No 4.980.286) ou pela injeção direta de DNA nu ou pelo uso do bombardeamento de micropartícula (por exemplo, uma pistola de gene; Biolistic, Dupont) ou revestindo com lipídeos ou receptores de superfície celular ou agentes de transfecção, encapsulação em lipossomas, micropartículas ou microcápsulas ou administrando-os na ligação a um peptídeo que é conhecido entrar no núcleo, administrando-o na ligação a um ligando submetido à endocitose mediada pelo receptor (ver, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432) (que pode ser usado para alvejar tipos de célula que especificamente expressam o receptor), etc. Em uma outra forma de realização, complexos de ácido nucléico-ligando podem ser formados em que o ligando compreende um peptídeo viral fusogênico para romper endossomas, permitindo que o ácido nucléico evite a degradação lisossômica. Já em uma outra forma de realização, o ácido nucléico pode ser alvejado in vivo para a captação e expressão específicas de célula, pelo alvejamento de um receptor específico (ver, por exemplo, as Publicações PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; W093/14188, WO 93/20221). Alternativamente, o ácido nucléico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do DNA da célula hospedeira para a expressão, pela recombinação homóloga (Koller e Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; e Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).
[00312] Em uma forma de realização específica, vetores virais que contém sequências de ácido nucléico que codificam um anticorpo da invenção são usados. Por exemplo, um vetor retroviral pode ser usado (ver Miller et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 581-599). Estes vetores retrovirais contêm os componentes necessários para o empacotamento correto do genoma viral e a integração no DNA da célula hospedeira. As sequências de ácido nucléico que codificam o anticorpo a ser usado na terapia de gene podem ser clonadas em um ou mais vetores, o que facilita a liberação do gene em um paciente. Mais detalhes a cerca de vetores retrovirais podem ser encontrados em Boesen et al., 1994, Biotherapy 6: 291-302, que descreve o uso de um vetor retroviral para liberar o gene mdr 1 às células tronco hematopoiéticas de modo a tornar as células tronco mais resistentes à quimioterapia. Outras referências que ilustram o uso de vetores retrovirais na terapia de gene são: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93: 644-651; Klein et al., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons e Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; e Grossman e Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114.
[00313] Adenovírus são outros vetores virais que podem ser usados na terapia de gene. Os adenovírus são veículos especialmente atrativos para a liberação de genes aos epitélios respiratórios. Os adenovírus naturalmente infectam os epitélios respiratórios onde eles causam uma doença branda. Outros alvos para os sistemas de liberação com base em adenovírus são o fígado, o sistema nervoso central, as células endoteliais e o músculo. Os adenovírus têm a vantagem de serem capazes de infectar as células que não se dividem. Kozarsky e Wilson, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 499-503 apresentam uma revisão de terapia de gene com base em adenovírus. Bout et al., 1994, Human Gene Therapy 5: 3-10 demonstraram o uso de vetores de adenovírus para transferir genes para os epitélios respiratórios de macacos rhesus. Outros casos do uso de adenovírus na terapia de gene podem ser encontrados em Rosenfeld et al., 1991, Science 252: 431-434; Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143-155; Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91: 225-234; Publicação PCT WO94/12649; e Wang et al., 1995, Gene Therapy 2: 775-783. Em uma forma de realização preferida, vetores adenovirais são usados.
[00314] Os vírus adeno-associados (AAV) também foram propostos para o uso na terapia de gene (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300; e Patente U.S. No 5.436.146).
[00315] Um outro método para a terapia de gene envolve transferir um gene para as células em cultura de tecido por métodos tais como eletroporação, lipofecção, transfecção mediada com fosfato de cálcio ou infecção viral. Usualmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador selecionável às células. As células são depois colocadas sob seleção para isolar aquelas células que captaram e expressaram o gene transferido. Estas células são depois liberadas a um paciente.
[00316] Nesta forma de realização, o ácido nucléico é introduzido em uma célula antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. Tal introdução pode ser realizada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo mas não limitados à transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção com um vetor viral ou bacteriófago contendo as sequências de ácido nucléico, fusão celular, transferência de gene mediada por cromossoma, transferência de gene mediada por microcélula, fusão de esferoplasto, etc. Numerosas técnicas são conhecidas no ramo para a introdução de genes estranhos em células (ver, por exemplo, Loeffler e Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217: 599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217: 618-644; Clin. Pharma. Ther. 29: 69-92 (1985)) e podem ser usadas de acordo com a presente invenção, contanto que as funções desenvolvimentais e fisiológicas necessárias das células receptoras não sejam rompidas. A técnica deve fornecer a transferência estável do ácido nucléico para a célula, de modo que o ácido nucléico seja expressável pela célula e preferivelmente passar hereditariamente e expressável pela sua progênie celular.
[00317] As células recombinantes resultantes podem ser liberadas a um paciente por vários métodos conhecidos na técnica. as células sanguíneas recombinantes (por exemplo, as células tronco hematopoiéticas ou progenitoras) são preferivelmente administradas intravenosamente. A quantidade de células previstas para o uso depende do efeito desejado, do estado do paciente, etc. e pode ser determinada por uma pessoa habilitada na técnica.
[00318] As células nas quais um ácido nucléico pode ser introduzido com propósitos de terapia de gene abrangem qualquer tipo de célula desejado, disponível e incluem mas não são limitadas às células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células sangüíneas tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células tronco ou progenitoras, em particular células tronco hematopoiéticas ou progenitoras, por exemplo, como obtidas a partir da medula óssea, sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, etc.
[00319] Em um forma de realização preferida, a célula usada para a terapia de gene é autóloga para o paciente.
[00320] Em uma forma de realização em que células recombinantes são usadas na terapia de gene, as sequências de ácido nucléico que codificam um anticorpo da invenção são introduzidas nas células tal que elas sejam expressáveis pelas células ou sua progênie e as células recombinantes são depois administradas in vivo para efeito terapêutico. Em uma forma de realização específica, células tronco ou progenitoras são usadas. Quaisquer células tronco e/ou progenitoras que possam ser isoladas e mantidas in vitro podem ser potencialmente usadas de acordo com esta forma de realização da presente invenção (ver por exemplo, a Publicação PCT WO 94/08598; Stemple e Anderson, 1992, Cell 7 1: 973-985; Rheinwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A: 229; e Pittelkow e Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61: 771).
[00321] Em uma forma de realização específica, o ácido nucléico a ser introduzido com propósitos de terapia de gene compreende um promotor indutível operavelmente ligado à região codificadora, tal que a expressão do ácido nucléico seja controlável controlando-se a presença ou ausência do indutor apropriado de transcrição.
[00322] USO EM DIAGNÓSTICO DE ANTICORPOS
[00323] Os anticorpos rotulados da invenção e derivados e análogos destes, que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT podem ser usados com propósitos de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorar uma doença mediada por hLIGHT. A invenção fornece métodos para a detecção de uma doença mediada por hLIGHT que compreendem: (a) ensaiar a expressão de um antígeno de hLIGHT em células ou uma amostra de tecido de um paciente usando um ou mais anticorpos da invenção que imunoespecificamente se ligam ao antígeno de hLIGHT; e (b) comparar o nível do antígeno de hLIGHT com um nível de controle, por exemplo, níveis em amostras de tecido normais (por exemplo, de um paciente que não tenha uma doença mediada por hLIGHT ou do mesmo paciente antes do início da doença), por meio do qual um aumento no nível ensaiado de antígeno de hLIGHT comparado com o nível de controle do antígeno de hLIGHT é indicativo de uma doença mediada por hLIGHT.
[00324] A invenção fornece um ensaio de diagnóstico para diagnosticar uma doença mediada por hLIGHT que compreende: (a) ensaiar quanto ao nível de um antígeno de hLIGHT em células ou uma amostra de tecido de um indivíduo usando um ou mais anticorpos da invenção que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT; e (b) comparar o nível do antígeno de hLIGHT com um nível de controle, por exemplo, níveis em amostras de tecido normais, por meio dos quais um aumento no nível de antígeno de hLIGHT ensaiado comparado com o nível de controle do antígeno de hLIGHT é indicativo de uma doença mediada por hLIGHT. Um diagnóstico mais definitivo de uma doença mediada por hLIGHT pode permitir que os profissionais de saúde utilizem medidas preventivas ou tratamento agressivo mais cedo prevenindo deste modo o desenvolvimento ou ainda a progressão da doença mediada por hLIGHT.
[00325] Os anticorpos da invenção podem ser usados para ensaiar os níveis de antígeno de hLIGHT em uma amostra biológica usando métodos imunoistológicos clássicos como aqui descritos ou como conhecidos por aqueles de habilidade na técnica (por exemplo, ver Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; e Jalkanen et al., 1987, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096). Outros métodos com base em anticorpo úteis para detectar a expressão de gene de proteína incluem imunoensaios, tais como o ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). Os rótulos de ensaio de anticorpo adequados são conhecidos na técnica e incluem rótulos enzimáticos, tais como, glicose oxidase; radioisótopos, tais como iodo 125 121 14 35 3 121 ( I, I), carbono ( C), enxofre ( S), trítio ( H), índio ( In) e tecnécio (99Tc); rótulos luminescentes, tais como luminol; e rótulos fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina e biotina.
[00326] Um aspecto da invenção é a detecção e diagnóstico de uma doença mediada por hLIGHT em um ser humano. Em uma forma de realização, o diagnóstico compreende: a) administrar (por exemplo, parenteral, subcutânea ou intraperitonealmente) a um paciente uma quantidade eficaz de um anticorpo rotulado que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT; b) esperar por um intervalo de tempo a seguir da administração para permitir que o anticorpo rotulado para concentrar preferencialmente nos sítios no paciente onde o antígeno de hLIGHT é expressado (e para a molécula rotulada não ligada seja depurada ao nível de fundo); c) determinar o nível de fundo; e d) detectar o anticorpo rotulado no paciente, tal que a detecção de anticorpo rotulado acima dos níveis de fundo indique que o paciente tem uma doença mediada por hLIGHT. O nível de fundo pode ser determinado por vários métodos incluindo, comparar a quantidade de molécula rotulada detectada para um valor padrão previamente determinado para um sistema particular.
[00327] Será entendido na técnica que o tamanho do paciente e o sistema de formação de imagem usado determinarão a quantidade de porção formadora de imagem necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma porção de radioisótopo, para um paciente humano, a quantidade de radioatividade injetada normalmente variará de cerca de 5 a 20 milicuries de 99Tc. O anticorpo rotulado depois preferencialmente acumular-se-á no local das células que contêm a proteína específica. A formação de imagem do tumor in vivoé descrita em S. W. Burchiel et al., “Imunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments.” (Capítulo 13 em Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S. W. Burchiel e B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).
[00328] Dependendo de diversas variáveis, incluindo o tipo de rótulo usado e do modo de administração, o intervalo de tempo a seguir da administração para permitir que o anticorpo rotulado preferencialmente se concentre nos sítios no paciente e para que o anticorpo rotulado não ligado seja depurado ao nível de fundo é de 6 a 48 horas ou de 6 a 24 horas ou de 6 a 12 horas. Em uma outra forma de realização o intervalo de tempo a seguir da administração é de 5 a 20 dias ou de 5 a 10 dias.
[00329] Em uma forma de realização, o monitoramento de uma doença mediada por hLIGHT é realizada repetindo-se o método para diagnosticar uma doença mediada por hLIGHT, por exemplo, um mês depois do diagnóstico inicial, seis meses depois do diagnóstico inicial, um ano depois do diagnóstico inicial, etc.
[00330] A presença da molécula rotulada pode ser detectada no paciente usando métodos conhecidos na técnica para o escaneamento in vivo. Estes métodos dependem do tipo de rótulo usado. Os técnicos habilitados serão capazes de determinar o método apropriado para detectar um rótulo particular. Métodos e dispositivos que podem ser usados nos métodos de diagnóstico da invenção incluem, mas não são limitados a, tomografia computadorizada (CT), varredura de corpo inteiro tal como a tomografia de emissão de posição (PET), formação de imagem pela ressonância magnética (MRI) e sonografia.
[00331] Em uma forma de realização específica, a molécula é rotulada com um radioisótopo e é detectada no paciente usando um instrumento cirúrgico responsivo à radiação (Thurston et al., Patente U.S. No 5.441.050). Em uma outra forma de realização, a molécula é rotulada com um composto fluorescente e é detectada no paciente usando um instrumento de varredura responsivo à fluorescência. Em uma outra forma de realização, a molécula é rotulada com um metal emissor de positron e é detectado no paciente usando a tomografia de emissão de positron. Já em uma outra forma de realização, a molécula é rotulada com um rótulo paramagnético e é detectado em um paciente usando a formação de imagem pela ressonância magnética (MRI).
MÉTODOS DE PRODUZIR ANTICORPOS
[00332] Os anticorpos da invenção que imunoespecificamente se ligam a um antígeno podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em particular, pela síntese química ou preferivelmente, pelas técnicas de expressão recombinantes. A prática da invenção utiliza, a menos que de outro modo indicado, técnicas convencionais na biologia molecular, microbiologia, análise genética, DNA recombinante, química orgânica, bioquímica, PCR, síntese e modificação de oligonucleotídeo, hibridização de ácido nucléico e campos relacionados dentro da habilidade da técnica. Estas técnicas são descritas nas referências aqui citadas e são totalmente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 e atualizações anuais) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Syntesis: A Practical Method, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Method, IRL Press; Birren et al. (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[00333] Anticorpos policlonais que imunoespecificamente se ligam a um antígeno podem ser produzidos por vários procedimentos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um antígeno humano pode ser administrado a vários animais hospedeiros incluindo, mas não limitados a, coelhos, camundongos, ratos, etc. para induzir a produção de soro contendo anticorpos policlonais específicos para o antígeno humano. Vários adjuvantes podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira e incluem mas não são limitados ao de Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias ativas na superfície tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianinas do lapa buraco de fechadura, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Tais adjuvantes também são bem conhecidos na técnica.
[00334] Anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas no ramo incluindo o uso de hibridoma, tecnologias recombinantes e de demonstração de fago ou uma combinação destas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando técnicas de hibridoma incluindo aquelas conhecidas no ramo e divulgadas, por exemplo, em Harlow et al.,Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2aed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonals Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981) (as ditas referências incorporadas por referência em suas totalidades). O termo “anticorpo monoclonal” como aqui usado não é limitado a anticorpos produzidos através da tecnologia de hibridoma. Outros métodos exemplares de produzir anticorpos monoclonais são debatidos aqui em outro lugar, tais como por exemplo, o uso do camundongo KM®. Os métodos adicionais exemplares de produzir anticorpos monoclonais são fornecidos nos Exemplos aqui.
[00335] Os métodos para produzir e triar quanto a anticorpos específicos usando a tecnologia de hibridoma são rotina e bem conhecidos na técnica. Em resumo, camundongos podem ser imunizados com um antígeno de hLIGHT e uma vez que uma resposta imune é detectada, por exemplo, anticorpos específicos para antígeno de hLIGHT são detectados no soro do camundongo, o baço do camundongo é colhido e os esplenócitos isolados. Os esplenócitos são depois fundidos pelas técnicas bem conhecidas para quaisquer células de mieloma adequadas, por exemplo células da linhagem de célula SP20 disponível da ATCC. Hibridomas são selecionados e clonados pela diluição limitada.
[00336] Adicionalmente, uma técnica de RIMMS (sítios múltiplos de imunização repetitiva) pode ser usada para imunizar um animal (Kilptrack et al., 1997 Hybridoma 16: 381-9, incorporado por referência em sua totalidade). Os clones de hibridoma são depois ensaiados pelos métodos conhecidos na técnica para as células que secretam anticorpos capazes de ligação a um polipeptídeo da invenção. O fluído de ascite, que no geral contém altos níveis de anticorpos, pode ser gerado imunizando-se camundongos com clones de hibridoma positivos.
[00337] Consequentemente, a presente invenção fornece métodos de gerar anticorpos cultivando-se uma célula de hibridoma que secreta um anticorpo modificado da invenção em que, preferivelmente, o hibridoma é gerado fundindo-se esplenócitos isolados de um camundongo imunizado com um antígeno de hLIGHT com células de mieloma e depois triando os hibridomas resultantes da fusão quanto aos clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de ligar-se a um antígeno de hLIGHT.
[00338] Os fragmentos de anticorpo que reconhecem antígenos específicos de hLIGHT podem ser gerados por qualquer técnica conhecida por aqueles de habilidade no ramo. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab’)2 da invenção podem ser produzidos pela clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas tais como papaína (para produzir fragmentos de Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos de F(ab’)2). Os fragmentos de F(ab’)2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada. Além disso, os anticorpos da presente invenção também podem ser gerados usando vários métodos de demonstração de fago conhecidos na técnica.
[00339] Por exemplo, anticorpos também podem ser gerados usando vários métodos de demonstração de fago. Nos métodos de demonstração de fago, domínios de anticorpo funcional são demonstrados na superfície de partículas de fago que carregam as sequências de polinucleotídeo que as codificam. Em particular, as sequências de DNA que codificam domínios VH e VL são amplificados a partir de bibliotecas de cDNA animal (por exemplo, bibliotecas de cDNA de ser humano ou murino de tecidos afetados). O DNA que codifica os domínios de VH e VL são recombinados juntos com um ligador scFv pela PCR e clonados em um vetor de fagomídeo. O vetor é submetido à eletroporação em E. coli e a E. colié infectada com fago auxiliar. O fago usado nestes métodos são tipicamente fago filamentoso incluindo fd e M13 e os domínios de VH e VL são de modo usual recombinantemente fundidos ao gene III ou gene VIII de fago. O fago que expressa um domínio de ligação de antígeno que se liga a um antígeno particular pode ser selecionado ou identificado com antígeno, por exemplo, usando antígeno rotulado ou antígeno ligado ou capturado a uma superfície sólida ou pérola. Os exemplos de métodos de demonstração de fago que podem ser usados para fabricar os anticorpos da presente invenção incluem aqueles divulgados em Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182: 41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184: 177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 952-958; Persic et al., 1997, Gene 187: 9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57: 191-280; Pedido PCT No PCT/GB91/01 134; Publicações Internacionais Nos WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401 e WO 97/13844; e Patentes U.S. Nos 5.698.426. 5.223.409. 5.403.484. 5.580.717. 5.427.908. 5.750.753. 5.821.047. 5.571.698. 5.427.908. 5.516.637. 5.780.225. 5.658.727. 5.733.743 e 5.969.108; cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00340] Como descrito nas referências acima, depois da seleção de fago, as regiões que codificam o anticorpo do fago podem ser isoladas e usadas para gerar anticorpos inteiros, incluindo anticorpos humanos ou qualquer outro fragmento de ligação de antígeno desejado e expressados em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de inseto, células vegetais, levedura e bactérias, por exemplo, como descrito abaixo. As técnicas para produzir recombinantemente fragmentos Fab, Fab’ e F(ab’)2 também podem ser utilizadas usando métodos conhecidos na técnica tais como aqueles divulgados na Publicação PCT No WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, BioTechniques 12(6): 864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34: 2634; e Better et al., 1988, Science 240: 1041-1043 (as ditas referências incorporadas por referência em suas totalidades).
[00341] Para gerar anticorpos inteiros, iniciadores de PCR incluindo as sequências de nucleotídeo VH ou VL, um sítio de restrição e uma sequência flanqueadora para proteger o sítio de restrição pode ser usado para amplificar as sequências VH ou VL em clones scFv. Utilizando técnicas de clonagem conhecidas por aqueles de habilidade na técnica, os domínios VH amplificados pela PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região constante VH, por exemplo, a região constante humana gama 4 e os domínios VL amplificados pela PCR podem ser clonados em vetores que expressam uma região VL constante, por exemplo, regiões constantes capa ou lambda humanas. Os domínios de VH e VL também podem ser clonados em um vetor que expressa as regiões constantes necessárias. Os vetores de conversão de cadeia pesada e cadeia leve são depois co-transfectados em linhagens de célula para gerar linhagens de célula estáveis ou transitórias que expressam anticorpos de tamanho natural, por exemplo, IgG, usando técnicas conhecidas por aqueles de habilidade no ramo.
[00342] Para alguns usos, incluindo uso in vivo de anticorpos em seres humanos e ensaios de detecção in vitro, pode ser preferível usar anticorpos humanos ou quiméricos. Anticorpos completamente humanos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos. Anticorpos humanos podem ser fabricados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica incluindo métodos de demonstração de fago descritos acima usando bibliotecas de anticorpo derivadas de sequências da imunoglobulina humana. Ver também as Patentes U.S. Nos 4.444.887 e 4.716.111; e Publicações Internacionais Nos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741; cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00343] Em formas de realização preferidas, anticorpos humanos são produzidos. Anticorpos humanos e/ou anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo os Exemplos aqui fornecidos. Por exemplo, camundongos transgênicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenos funcionais, mas que podem expressar genes da imunoglobulina humana. Por exemplo, os complexos de gene das cadeias pesada e leve da imunoglobulina humana podem ser aleatoriamente introduzidos ou pela recombinação homóloga em células tronco embrionárias de camundongo. Alternativamente, a região variável humana, região constante e região de diversidade podem ser introduzidas nas células tronco embrionárias de camundongo além dos genes das cadeias pesada e leve humanas. Os genes da imunoglobulina de cadeia pesada e leve de camundongo podem ser tornados não funcionais separada ou simultaneamente com a introdução dos locais de imunoglobulina humana pela recombinação homóloga. Em particular, a deleção de homozigoto da região JH previne a produção de anticorpo endógeno. As células tronco embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir camundongos quiméricos. Os camundongos quiméricos são depois cruzados para produzir descendência homozigótica que expresse anticorpos humanos. Os camundongos transgênicos são imunizados na maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, toda ou uma porção de um polipeptídeo da invenção. Anticorpos monoclonais direcionados contra o antígeno podem ser obtidos a partir de camundongos imunizados, transgênicos usando a tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana abrigados pelos camundongos transgênicos rearranjam durante a diferenciação de célula B e subsequentemente sofrem a comutação de classe e mutação somática. Assim, usando uma tal técnica, é possível produzir anticorpos de IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma vista geral desta tecnologia para produzir anticorpos humanos, ver Lonberg e Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93). Para um debate detalhado desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir tais anticorpos, ver, por exemplo, as publicações PCT Nos WO 98/24893, WO 96/34096 e WO 96/33735; e as Patentes U.S. Nos 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318 e 5.939.598, que são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Outros métodos são detalhados nos Exemplos aqui. Além disso, companhias tais como a Abgenix, Inc. (Fremont, CA) e Genpharm (San Jose, CA) podem ser contratadas para fornecer anticorpos humanos direcionados contra um antígeno selecionado usando tecnologia similar àquela descrita acima.
[00344] Um anticorpo quimérico é uma molécula em que porções diferentes do anticorpo são derivadas de moléculas de imunoglobulina diferentes. Os métodos para produzir anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Morrison, 1985, Science 229: 1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125: 191-202; e Patentes U.S. Nos 5.807.715, 4.816.567, 4.816.397 e 6.331.415, que são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
[00345] Um anticorpo humanizado é um anticorpo ou sua variante ou fragmento deste que é capaz de ligação a um antígeno pré determinado e que compreende uma região de matriz tendo substancialmente a sequência de aminoácido de uma imunoglobulina humana e uma CDR tendo substancialmente a sequência de aminoácido de uma imunoglobulina não humana. Um anticorpo humanizado compreende substancialmente todos de pelo menos um e tipicamente dois, domínios variáveis (Fab, Fab’, F(ab’)2, Fabc, Fv) em que todas ou substancialmente todas das regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina non humana (isto é, anticorpo doador) e toda ou substancialmente toda das regiões de matriz são aquelas de uma seqüência de consenso da imunoglobulina humana. Preferivelmente, um anticorpo humanizado também compreende pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Ordinariamente, o anticorpo conterá tanto a cadeia leve assim como pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir as regiões de CH1, dobradiça, CH2, CH3 e CH4 da cadeia pesada. O anticorpo humanizado pode ser selecionado de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE e qualquer isotipo, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Usualmente o domínio constante é um domínio constante que fixa complemento onde é desejado que o anticorpo humanizado exiba a atividade citotóxica e a classe é tipicamente IgG1. Onde tal atividade citotóxica não é desejável, o domínio constante pode ser da classe IgG2. Os exemplos de domínios constantes VL e VH que podem ser usados em certas formas de realização da invenção incluem, mas não são limitados a, C-capa e C-gama-1 (nG1m) descrito em Johnson et al. (1997) J. Infect. Dis. 176, 1215-1224 e aqueles descritos na Patente U.S. No 5.824.307. O anticorpo humanizado pode compreender sequências de mais do que uma classe ou isotipo e selecionar constantes de domínio particulares para otimizar funções efetoras desejadas está dentro da habilidade comum na técnica. As regiões de matriz e CDR de um anticorpo humanizado não correspondem exatamente às sequências precursoras, por exemplo, a CDR doadora ou a matriz de consenso podem ser mutageneizadas pela substituição, inserção ou deleção de pelo menos um resíduo de modo que a CDR ou resíduo de matriz naquele sítio não corresponde ao anticorpo de consenso ou ao anticorpo de importação. Tais mutações, entretanto, não serão extensivas. Usualmente, pelo menos 75 % dos resíduos de anticorpo humanizados corresponderão àqueles das sequências FR e CDR precursoras, mais frequentemente 90 % e o mais preferivelmente maior do que 95 %. Anticorpos humanizados podem ser produzidos usando variedade de técnicas conhecidas no ramo, incluindo mas não limitados a, enxerto de CDR (Patente Européia No EP 239.400; Publicação Internacional No WO 91/09967; e Patentes U.S. Nos 5.225.539, 5.530.101 e 5.585.089), embutimento ou revestimento (Patente Européia Nos EP 592.106 e EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6): 805-814; e Roguska et al., 1994, PNAS 91: 969-973), embaralhamento de cadeia (Patente U.S. No 5.565.332) e técnicas divulgadas, por exemplo, na Pat. U.S. No 6.407.213, Pat. U.S. No 5.766.886, WO 9317105, Tan et al., J. Immunol. 169: 1119 25 (2002), Caldas et al., Protein Eng. 13(5): 353-60 (2000), Morea et al., Methods 20(3): 267 79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng. 9(10): 895 904 (1996), Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Sup): 5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res. 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu JS, Gene 150(2): 409-10 (1994), e Pedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3): 959-73 (1994). Ver também a Patente U.S. Pub. No US 2005/0042664 A1 (24 de Fev. de 2005), que é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Frequentemente, os resíduos de matriz nas regiões de matriz serão substituídos com o resíduo correspondente do anticorpo doador da CDR para alterar, preferivelmente melhorar, a ligação de antígeno. Estas substituições de matriz são identificadas pelos métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, pela modelagem das interações da CDR e resíduos de matriz para identificar resíduos de matriz importantes para a ligação de antígeno e comparação de sequência para identificar resíduos de matriz não usuais em posições particulares. (Ver, por exemplo, Queen et al., Patente U.S. No 5.585.089; e Reichmann et al., 1988, Nature 332: 323, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades).
[00346] Os anticorpos de domínio único, por exemplo, anticorpos que careecem das cadeias leves, podem ser produzidos peelos métodos bem conhecidos na técnica. Ver Riechmann et al., 1999, J. Immunol. 231: 25-38; Nuttall et al., 2000, Curr. Pharm. Biotechnol. 1(3): 253-263; Muilderman, 2001, J. Biotechnol. 74(4): 277302; Patente U.S. No 6.005.079; e Publicação Internacional Nos WO 94/04678, WO 94/25591 e WO 01/44301, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00347] Além disso, os anticorpos que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT, por sua vez, podem ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotípicos que “imitam” um antígeno usando técnicas bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica. (Ver, por exemplo, Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7(5): 437-444; e Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147(8): 2429-2438).
POLINUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICAM UM ANTICORPO
[00348] A invenção fornece polinucleotídeos que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção que imunoespecificamente se liga a um epítopo de hLIGHT. A invenção também abrange polinucleotídeos que hibridizam sob condições de hibridização de severidade alta, intermediária ou mais baixa, por exemplo, como definidas acima, aos polinucleotídeos que codificam um anticorpo modificado da invenção.
[00349] Os polinucleotídeos podem ser obtidos e a sequência de nucleotídeo dos polinucleotídeos determinada, por qualquer método conhecido na técnica. Visto que as sequências de aminoácido de E1, E13, E63, F19 e F23 são conhecidas (ver, por exemplo, SEQ ID NOS: 41, 42, 43, 44, 45, 102, 46, 103, 47, 48, 104, 49, 105, 106 e 50; e Acesso ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728, respectivamente, que são aqui incorporados por referência), as sequências de nucleotídeo que codificam estes anticorpos e versões modificadas destes anticorpos podem ser determinadas usando métodos bem conhecidos na técnica, isto é, códons de nucleotídeo conhecidos por codificar aminoácidos particulares são montados em um tal modo para gerar um ácido nucléico que codifica o anticorpo. Um tal polinucleotídeo que codifica o anticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados (por exemplo, como descrito em Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17: 242), que, resumidamente, envolve a síntese de oligonucleotídeos de sobreposição contendo porções da sequência que codifica o anticorpo, fragmentos ou variantes desta, recozimento e ligação destes oligonucleotídeos e depois amplificação dos oligonucleotídeos ligados pela PCR.
[00350] Alternativamente, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção pode ser gerado a partir de ácido nucléico de uma fonte adequada (por exemplo, um hibridoma tendo um dos Acessos ATCC Nos PTA-7729, PTA-7842, PTA-7818, PTA-7819 ou PTA-7728 (E1, E13, E63, F19 ou F23). Se um clone contendo um ácido nucléico que codifica um anticorpo particular não está disponível, mas a sequência da molécula de anticorpo é conhecida, um ácido nucléico que codifica a imunoglobulina pode ser quimicamente sintetizada ou obtida a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo ou uma biblioteca de cDNA gerada de ou ácido nucléico, preferivelmente poli A+ RNA, isolado de, qualquer tecido ou células que expressam o anticorpo, tal como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo da invenção) pela amplificação de PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis às extremidades 3’ e 5’ da sequência ou pela clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeo específica para a sequência de gene particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA de uma biblioteca de cDNA que codifica o anticorpo. Os ácidos nucléicos amplificados gerados pela PCR pode ser depois clonados em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na técnica.
[00351] Em certas formas de realização, as moléculas de ácido nucléico da invenção compreendem ou consistem de uma sequência de ácido nucléico como representada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 41, 42, 43, 44, 45 (que codificam uma VH) e/ou SEQ ID NOS: 102, 46, 103, 47, 48, 104, 49, 105, 106 ou 50 (que codificam uma VL) ou qualquer combinação destas (por exemplo, como uma sequência de nucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção, tal como um anticorpo de tamanho natural, cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo ou um anticorpo de cadeia única da invenção).
EXPRESSÃO RECOMBINANTE DE UM ANTICORPO
[00352] A expressão recombinante de um anticorpo da invenção (por exemplo, um anticorpo de tamanho natural, cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo ou um anticorpo de cadeia única da invenção) que imunoespecificamente se liga a um antígeno de hLIGHT requer a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleotídeo que codifica o anticorpo. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo, cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou fragmento deste (preferivelmente, mas não necessariamente, contendo o domínio variável da cadeia pesada e/ou leve) da invenção foi obtido, o vetor para a produção da molécula de anticorpo pode ser produzida pela tecnologia de DNA recombinante usando técnicas bem conhecidas no ramo. Assim, os métodos para preparar uma proteína pela expressão de um polinucleotídeo contendo um anticorpo que codifica a sequência de nucleotídeo são aqui descritos. Os métodos que são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo sequências codificadoras de anticorpo e sinais de controle transcricional e translacional apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, as técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. A invenção, assim, fornece vetores replicáveis que compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de anticorpo da invenção, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, um domínio variável de cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou um fragmento deste ou uma CDR de cadeia pesada ou leve, operavelmente ligada a um promotor. Tais vetores podem incluir a sequência de nucleotídeo que codifica a região constante da molécula de anticorpo (ver, por exemplo, Publicações Internacionais Nos WO 86/05807 e WO 89/01036; e Patente U.S. No 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em um tal vetor para a expressão da cadeia pesada inteira, da cadeia leve inteira ou tanto da cadeia pesada quanto da leve inteiras.
[00353] O vetor de expressão é transferido a uma célula hospedeira pelas técnicas convencionais e as células transfectadas são depois cultivadas pelas técnicas convencionais para produzir um anticorpo da invenção. Assim, a invenção inclui células hospedeiras contendo um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção ou fragmentos deste ou uma cadeia pesada ou leve deste ou fragmento deste ou um anticorpo de cadeia única da invenção, operavelmente ligado a um promotor heterólogo. Em formas de realização preferidas para a expressão de anticorpos de cadeia dupla, vetores que codificam tanto a cadeia pesada quanto a leve podem ser co-expressados na célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina inteira, como detalhado abaixo.
[00354] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para expressar as moléculas de anticorpo da invenção (ver, por exemplo, Patente U.S. No 5.807.715). Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências codificadoras de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências codificadoras de nucleotídeo apropriadas, expressar uma molécula de anticorpo da invenção in situ. Estas incluem mas não são limitadas a microorganismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli e B. subtilis) transformadas com DNA de bacteriófago recombinante, vetores de expressão de DNA plasmídico ou DNA cosmídico contendo sequências codificadoras de anticorpo; levedura (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas com vetores de expressão de levedura recombinante contendo sequências codificadoras de anticorpo; sistemas de célula de inseto infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovírus) contendo sequências codificadoras de anticorpo; sistemas de célula vegetal infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus mosaico da couve flor, CaMV; vírus mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo sequências codificadoras de anticorpo; ou sistemas de célula de mamífero (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, NSO e 3T3) que abrigam construções de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio de adenovírus; o promotor do vírus da vaccínia 7,5K). Preferivelmente, células bacterianas tais como Escherichia coli e mais preferivelmente, células eucarióticas, especialmente para a expressão de molécula de anticorpo recombinante inteira, são usados para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células de mamífero tais como as células do ovário do hamster chinês (CHO), em conjunção com um vetor tal como o elemento promotor do gene inicial intermediário principal de citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101; e Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2). Em formas de realização preferidas, anticorpos da invenção são produzidos em células CHO. Em uma forma de realização específica, a expressão das sequências de nucleotídeo que codificam anticorpos da invenção que imunoespecificamente se ligam a um antígeno de hLIGHT é regulada por um promotor constitutivo, promotor indutível ou promotor específico de tecido.
[00355] Em sistemas bacterianos, vários vetores de expressão podem ser vantajosamente selecionados dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo que é expressada. Por exemplo, quando uma quantidade grande de um tal anticorpo deva ser produzido, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que direcionam a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que são facilmente purificados pode ser desejável. Tais vetores incluem, mas não são limitados ao vetor de expressão de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12: 1791), em que as sequências codificadoras de anticorpo podem ser ligadas individualmente no vetor na matriz com a região codificadora lac Z de modo que uma proteína de fusão seja produzida; vetores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); e outros. Vetores pGEX também podem ser usados para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão com glutationa 5-transferase (GST). No geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas pela absorção e ligação às pérolas de glutationa agarose à matriz seguido pela eluição na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são planejados para incluir trombina ou sítios de clivagem do fator Xa protease de modo que o produto de gene alvo clonado pode ser liberado da porção GST.
[00356] Em um sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. As sequências codificadoras de anticorpo podem ser clonadas individualmente nas regiões não essenciais (por exemplo o gene da poliedrina) do vírus e colocado sob o controle de um promotor AcNPV (por exemplo o promotor da poliedrina).
[00357] Em células hospedeiras de mamífero, vários sistemas de expressão com base viral podem ser utilizados. Em casos onde um adenovírus é usado como um vetor de expressão, as sequências codificadoras de anticorpo de interesse podem ser ligadas a um complexo de controle de transcrição/tradução de adenovírus, por exemplo, a sequência promotora tardia e líder tripartida. Este gene quimérico pode ser depois inserido no genoma de adenovírus pela recombinação in vitro ou in vivo. A inserção em uma região não essencial do genoma viral (por exemplo, região E1 ou E3) resultará em um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infectados (por exemplo, ver Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1: 355-359). Os sinais de iniciação específicas também podem ser requeridos para a tradução eficiente de sequências codificadoras de anticorpo inseridas. Estes sinais incluem o códon de início de ATG e sequências adjacentes. Além disso, o códon de início deve estar na fase com a matriz de leitura das sequências codificadoras desejadas para garantir a tradução do inserto inteiro. Estes sinais de controle de tradução exógenos e códons de início podem ser de uma variedade de origens, tanto naturais quanto sintéticos. A eficiência de expressão pode ser realçada pela inclusão de elementos realçadores de transcrição apropriados, terminadores de transcrição, etc. (ver, por exemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544).
[00358] Além disso, uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida que modula a expressão das sequências inseridas ou modifica e processa o produto de gene na maneira específica desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. As células hospedeiras diferentes têm características e mecanismos específicos para o processamento e modificação pós-translacionais de proteínas e produtos gene. as linhagens de célula apropriadas ou sistemas de hospedeiro podem ser escolhidos para garantir a modificação e processamento corretos da proteína estranha expressada. Para esta finalidade, as células hospedeiras eucarióticas que possuem o mecanismo celular para o processamento apropriado do transcrito primário, glicosilação e fosforilação do produto de gene podem ser usadas. Tais células hospedeiras de mamífero incluem mas não são limitadas às células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O e T47D, NSO (uma linhagem de célula de mieloma de murino que não produz endogenamente nenhuma cadeia de imunoglobulina), CRL7O3O e HsS78Bst. Em formas de realização preferidas, anticorpos anti- hLIGHT monoclonais totalmente humanos da invenção são produzidos em células de mamífero, tais como células CHO.
[00359] Para a produção de longa duração, alto rendimento de proteínas recombinantes, a expressão estável é preferida. Por exemplo, as linhagens de célula que estavelmente expressam a molécula de anticorpo podem ser engendradas. Ao invés de usar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado pelos elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, realçador, sequências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e um marcador selecionável. A seguir da introdução do DNA estranho, as células engendradas podem ser deixadas crescer por 1 a 2 dias em um meio enriquecido e depois são trocadas para um meio seletivo. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite que as células integrem estavelmente o plasmídeo em seus cromossomas e cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhagens de célula. Este método pode ser vantajosamente usado para engendrar linhagens de célula que expressam a molécula de anticorpo. Tais linhagens de célula engendradas podem ser particularmente úteis na triagem e avaliação de composições que interagem direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo.
[00360] Vários sistemas de seleção podem ser usados, incluindo mas não limitados aos genes da timidina cinase do vírus simples do herpes (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hipoxantinaguanina fosforibosil-transferase (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202) e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22: 8-17) podem ser utilizados nas células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também, a resistência a antimetabólito pode ser usada como a base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere a resistência ao metotrexato (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O’Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, que confere a resistência ao aminoglicosídeo G-418 (Wu e Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; e Morgan e Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; Maio, 1993, TIB TECH 11(5): 155-2 15); e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Métodos habitualmente conhecidos na técnica da tecnologia de DNA recombinante pode ser rotineiramente aplicada para selecionar o clone recombinante desejado e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1, que são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
[00361] Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados pela amplificação de vetor (para uma revisão, ver Bebbington e Hentschel, O uso de vetores com base na amplificação de gene para a expressão de genes clonados em células de mamífero em DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, Nova Iorque, 1987)). Quando um marcador no sistema de vetor que expressa o anticorpo é amplificável, o aumento no nível de inibidor presente na cultura de célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Visto que a região amplificada está associada com o gene de anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).
[00362] A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeo derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecionáveis idênticos que possibilitam a expressão igual dos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, um único vetor pode ser usado que codifica e é capaz de expressar, polipeptídeos tanto de cadeia pesada quanto leve. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso de cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; e Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2197-2199). As sequências codificadoras para as cadeias pesada e leve podem compreender cDNA ou DNA genômico.
[00363] Uma vez que uma molécula de anticorpo da invenção tenha sido produzida pela expressão recombinante, a mesma pode ser purificada por qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, pela cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, particularmente pela afinidade quanto ao antígeno específico depois Proteína A e cromatografia de coluna por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos da presente invenção podem ser fundidos às sequências heterólogas de polipeptídeo aqui descritas ou de outro modo conhecidas na técnica por facilitar a purificação.
KITS
[00364] A invenção também fornece um pacote ou kit farmacêuticos que compreendem um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção, tais como um ou mais anticorpos aqui fornecidos. Opcionalmente associados com tal(is) recipiente(s) podem estar uma notificação na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, notificação esta que reflete a aprovação pela agência da fabricação, uso ou venda para a administração a seres humanos.
[00365] A presente invenção fornece kits que podem ser usados nos métodos acima. Em uma forma de realização, um kit compreende um anticorpo da invenção, preferivelmente um anticorpo purificado, em um ou mais recipientes. Em uma forma de realização específica, os kits da presente invenção contêm um antígeno de hLIGHT substancialmente isolado como um controle. Preferivelmente, os kits da presente invenção compreendem ainda um anticorpo de controle que não reagem com o antígeno de hLIGHT. Em uma outra forma de realização específica, os kits da presente invenção contêm um meio para detectar a ligação de um anticorpo modificado a um antígeno de hLIGHT (por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a um substrato detectável tal como um composto fluorescente, um substrato enzimático, um composto radioativo ou um composto luminescente ou um segundo anticorpo que reconhece o primeiro anticorpo pode ser conjugado a um substrato detectável). Em formas de realização específicas, o kit pode incluir um antígeno de hLIGHT recombinantemente produzido ou quimicamente sintetizado. O antígeno de hLIGHT fornecido no kit também pode ser ligado a um suporte sólido. Em uma forma de realização mais específica o meio de detecção do kit descrito acima inclui um suporte sólido ao qual o antígeno de hLIGHT é ligado. Um tal kit também pode incluir um anticorpo anti-humano rotulado com repórter não ligado. Nesta forma de realização, a ligação do anticorpo ao antígeno de hLIGHT pode ser detectada pela ligação do dito repórter-anticorpo rotulados.
[00366] Os seguintes exemplos são oferecidos por via de ilustração e não por via de limitação.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 - GERAÇÃO DE ANTICORPO ANTI-hLIGHT HUMANO
[00367] Neste exemplo, a geração de anticorpos anti-hLIGHT humano monoclonais usando camundongos transcromossômicos (camundongos KM®) (WO 02/43478, WO 02/092812, Ishida e Lonberg, IBC’s 11aAntibody Engineering Meeting. Abstract (2000); e Kataoka, S. IBC’s 13aAntibody Engineering Meeting. Abstract (2002)) imunizados com hLIGHT recombinant solúvel é descrita. Os anticorpos aqui descritos especificamente tingiram linhagens de célula hLIGHT estavelmente transfectadas, (EL4- hLIGHT e HEK 293hLIGHT) e não as linhagens de célula precursora. Do mesmo modo, eles se ligam a hLIGHT endogenamente expressado na superfície do hibridoma da célula T humana (IL23.D7) (Ware et al. 1986 Lymphokine Res 5 313-24) na ativação. Juntos, estes dados indicam que os anticorpos imunoespecificamente se ligam a hLIGHT. Os anticorpos isolados reconhecem um de dois epítopos em hLIGHT como determinado pelos experimentos de bloqueio cruzado, como descrito abaixo. Além disso, os anticorpos foram capazes de bloquear hLIGHT expressado na ligação da superfície da célula às formas de fusão de receptor-Fc solúveis tanto de HVEM humano quanto o LTβR. O hLIGHT solúvel induz a secreção das quimiocinas CCL20 e RANTES da linhagem de célula epitelial colônica humana HT29.14s (ATCC HTB-38) em uma maneira dependente da dose. A incubação de hLIGHT solúvel com anticorpos anti-hLIGHT bloqueia a secreção mediada por hLIGHT tanto de CCL20 quanto de RANTES a partir das células HT29.14s. Além disso, a pré-incubação de hLIGHT expressado na superfície de célula (EL4-hLIGHT) com estes anticorpos anti-hLIGHT bloqueia a secreção de quimiocina induzida por hLIGHT ligada à membrana a partir de células HT29. Juntos, estes resultados ilustram características funcionais e estruturais do anticorpo anti-hLIGHT totalmente humano monoclonal e fornecem evidência de sua utilidade no tratamento de doenças mediadas por hLIGHT.
MATERIAIS E MÉTODOS
[00368] Preparação de Antígeno: O antígeno usado para as imunizações na geração de anticorpos anti-hLIGHT totalmente humanos foi uma versão solúvel de hLIGHT que é truncada para incluir apenas a região extracelular, de partida da glicina na posição de aminoácido 66 para valina 240 e contém um rótulo de epítopo FLAG no terminal amino da proteína (SEQ ID NO: 54). A produção desta molécula foi anteriormente relatada (Rooney et al. 2000 J Biol Chem 275 14307-15).
[00369] O ácido nucléico (SEQ ID NO: 51) que codifica a sequência de aminoácido de hLIGHT de tamanho natural (SEQ ID NO: 52) foi clonado a partir de células de hibridoma de célula T I123.D7 ativada pela transcriptase reversa-PCR (Mauri et al. 1998 Immunity 8 21-30). A linhagem de célula 1123 (um subclone D7) é um hibridoma de célula T de CD4+ humano (Ware et al. 1986 Lymphokine Res 5 313-24). O produto de PCR hLIGHT foi subclonado no vetor de expressão de mamífero pcDNA3.1 (+) para criar pcDNA3.1-hLIGHT. O domínio extracelular (que codifica Gly66 para Val240) foi amplificado de pcDNA3-hLIGHT pela PCR usando os seguintes iniciadores com sítios de restrição incorporados: avançado, 5’-GTAGGAGAGATGGTCACCCGCCT-3’ (SEQ ID NO: 80). reverso, 5’-GGAACGCGAATTCCCACGTGTCAGACCCATGTCCAA T-3 ‘ (SEQ ID NO: 81).
[00370] O produto de PCR de hLIGHT amplificado foi digerido com EcoRI e ligado nos sítios SnaBI e EcoRI de pCDNA3.1-VCAM-FLAG, que codifica a sequência líder VCAM1 seguida pelo epítopo FLAG para a produção de proteína secretada, rotulada com FLAG no terminal N (SEQ ID NO: 52).
[00371] Para produzir uma linhagem de célula estável para a produção de hLIGHT solúvel, células HEK293 foram transfectadas usando o método do fosfato de cálcio e clones estáveis foram selecionados com G418 (Invitrogen, Corp.) e triados quanto à produção de hLIGHT pelo ELISA. hLIGHT solúvel foi purificado a partir de sobrenadantes de cultura de células cultivadas em DMEM contendo 1,0 % de soro fetal bovino definido (Hyclone Laboratories, Logan, UT). hLIGHT solúvel foi purificado pela cromatografia de afinidade com anticorpo anti-FLAG (M2) ligado às pérolas de agarose. hLIGHT solúvel foi eluído da coluna usando 20 mM de glicina, 150 mM de NaCl, pH 3,0 e imediatamente neutralizado o pH pela coleta em 50 mM de Tris, pH 7,4. A concentração de proteína foi determinada pela absorbância a 280 nm.
[00372] A sequência de nucleotídeo de um hLIGHT a partir do códon de início (ATG) até a parada (TGA) (SEQ ID NO: 51): ATGGAGGAGA GTGTCGTACG GCCCTCAGTG TTTGTGGTGG ATGGACAGAC CGACATCCCA 60 TTCACGAGGC TGGGACGAAG CCACCGGAGA CAGTCGTGCA GTGTGGCCCG GGTGGGTCTG 120 GGTCTCTTGC TGTTGCTGAT GGGGGCCGGG CTGGCCGTCC AAGGCTGGTT CCTCCTGCAG 180 CTGCACTGGC GTCTAGGAGA GATGGTCACC CGCCTGCCTG ACGGACCTGC AGGCTCCTGG 240 GAGCAGCTGA TACAAGAGCG AAGGTCTCAC GAGGTCAACC CAGCAGCGCA TCTCACAGGG 300 GCCAACTCCA GCTTGACCGG CAGCGGGGGG CCGCTGTTAT GGGAGACTCA GCTGGGCCTG 360 GCCTTCCTGA GGGGCCTCAG CTACCACGAT GGGGCCCTTG TGGTCACCAA AGCTGGCTAC 420 TACTACATCT ACTCCAAGGT GCAGCTGGGC GGTGTGGGCT GCCCGCTGGG CCTGGCCAGC 480 ACCATCACCC ACGGCCTCTA CAAGCGCACA CCCCGCTACC CCGAGGAGCT GGAGCTGTTG 540 GTCAGCCAGC AGTCACCCTG CGGACGGGCC ACCAGCAGCT CCCGGGTCTG GTGGGACAGC 600 AGCTTCCTGG GTGGTGTGGT ACACCTGGAG GCTGGGGAGG AGGTGGTCGT CCGTGTGCTG 660 GATGAACGCC TGGTTCGACT GCGTGATGGT ACCCGGTCTT ACTTCGGGGC TTTCATGGTG 720 TGA 780
[00373] Sequência de aminoácido de um hLIGHT de tamanho natural de 240 aminoácidos (SEQ ID NO: 52): MEESVVRPSV FVVDGQTDIP FTRLGRSHRR QSCSVARVGL GLLLLLMGAG LAVQGWFLLQ 60 LHWRLGEMVT RLPDGPAGSW EQLIQERRSH EVNPAAHLTG ANSSLTGSGG PLLWETQLGL 120 AFLRGLSYHD GALVVTKAGY YYIYSKVQLG GVGCPLGLAS TITHGLYKRT PRYPEELELL 180 VSQQSPCGRA TSSSRVWWDS SFLGGVVHLE AGEEVVVRVL DERLVRLRDG TRSYFGAFMV 240
[00374] Sequência de nucleotídeo de um hLIGHT rotulado com FLAG solúvel (sequências líder VCAM mostradas, seguidas pela sequência que codifica FLAG em negrito) (SEQ ID NO: 53) ATGCCTGGGA AGATGGTCGT GATCCTTGGA GCCTCAAATA TACTTTGGAT ΆATGTTTGCA 60 GCTTCTCAAG CTGACTACAA GGACGACGAT GACAAGTACG TAGGAGAGAT GGTCACCCGC 120 CTGCCTGACG GACCTGCAGG CTCCTGGGAG CAGCTGATAC AAGAGCGAAG GTCTCACGAG 180 GTCAACCCAG CAGCGCATCT CACAGGGGCC AACTCCAGCT TGACCGGCAG CGGGGGGCCG 240 CTGTTATGGG AGACTCAGCT GGGCCTGGCC TTCCTGAGGG GCCTCAGCTA CCACGATGGG 300 GCCCTTGTGG TCACCAAAGC TGGCTACTAC TACATCTACT CCAAGGTGCA GCTGGGCGGT 360 GTGGGCTGCC CGCTGGGCCT GGCCAGCACC ATCACCCACG GCCTCTACAA GCGCACACCC 420 CGCTACCCCG AGGAGCTGGA GCTGTTGGTC AGCCAGCAGT CACCCTGCGG ACGGGCCACC 480AGCAGCTCCC GGGTCTGGTG GGACAGCAGC TTCCTGGGTG GTGTGGTACA CCTGGAGGCT 540 GGGGAGGAGG TGGTCGTCCG TGTGCTGGAT GAACGCCTGG TTCGACTGCG TGATGGTACC 600 CGGTCTTACT TCGGGGCTTT CATGGTGTGA 660
[00375] A sequência de aminoácido de um hLIGHT rotulado com FLAG solúvel de 183 aminoácidos (FLAG em negrito) (SEQ ID NO: 54): DYKDDDDKGE MVTRLPDGPA GSWEQLIQER RSHEVNPAAH LTGANSSLTG SGGPLLWETQ 60 LGLAFLRGLS YHDGALVVTK AGYYYIYSKV QLGGVGCPLG LASTITHGLY KRTPRYPEEL 120 ELLVSQQSPC GRATSSSRVW WDSSFLGGVV HLEAGEEVVV RVLDERLVRL RDGTRSYFGA 180 FMV 240
[00376] As células EL4 (ATCC TIB-39) foram estavelmente transduzidas com um retrovírus contendo o cDNA que codifica hLIGHT de tamanho natural para a geração da linhagem de célula EL4-hLIGHT.
[00377] Preparação da proteína de fusão de Fc: A clonagem, expressão e purificação das proteínas de fusão de receptor solúveis contendo a região Fc da IgG1 humana e os domínios de ligação de ligando de LTβR humano e HVEM human foram anteriormente descritas (Rooney et al. 2000 Methods Enzymol 322 345-63). Em resumo, as regiões extracelulares de HVEM e LTβR foram isolados pelas reações da cadeia da polimerase usando iniciadores com sítios de endonuclease de restrição incorporados e ligados na matriz no vetor de baculovírus pVL1392 (Pharmingen) contendo a IgG1 de Fc humana. células de inseto de Trichoplusia ni High-Five BTI-TN-5b1-4 (Tn5) (Invitrogen Corp.) foram infectadas com os baculovírus recombinantes LTβR:Fc ou HVEM:Fc para a produção de proteína (ver a purificação de anticorpo e proteína).
[00378] Camundongos: camundongos KM® trans-cromossômicos humanos (WO 02/43478, WO 02/092812, Ishida e Lonberg, IBC’s 11a Antibody Engineering Meeting. Abstract (2000); e Kataoka, S. IBC’s 13a Antibody Engineering Meeting. Abstract (2002)) que abrigam fragmentos de cromossoma humanos que codificam a região de imunoglobulina humana foram obtidos da Kirin Brewery Co., Ltd., Japão e foram alojados na instalação para animais no Gemini Science (La Jolla, CA). Uma vista geral da tecnologia para produzir anticorpos humanos está descrita em Lonberg e Huszar 1995 Int Rev Immunol 13 65-93. Os animais transgênicos com um ou mais genes da imunoglobulina humana (capa ou lambda) que não expressam imunoglobulinas endógenas são descritos, por exemplo, na Patente U.S. No 5.939.598. Os métodos adicionais para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos são descritos (ver, por exemplo, WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Patente U.S. Nos 5.413.923, 5.625.126, 5.633.425, 5.569.825, 5.661.016, 5.545.806, 5.814.318, 5.885.793, 5.916.771, e 5.939.598). O desenvolvimento de genes bovinos quee carregam imunoglobulina humana, vacas TC, é descrito em Ishida e Lonberg (ver Ishida 2000 11aAntibody Engineering Meeting, Kuroiwa et al. 2004 Nat Genet 36 775-80, Kuroiwa et al. 2002 Nat Biotechnol 20 889-94).
[00379] Imunização: A proteína recombinante hLIGHT solúvel rotulada com FLAG foi misturada com um volume igual de adjuvante de Freund completo (CFA, Sigma) e uma emulsão foi preparada. Camundongos foram imunizados com 10 a 50 μg de proteína subcutaneamente (s.c.) e foram reforçados s.c. com 10 a 20 μg de proteína emulsificada em adjuvante de Freund incompleto (IFA, Sigma) em intervalos de 2 a 3 semanas por 2 a 3 reforços. Uma injeção final intravenosa (i.v.) de 10 μg de hLIGHT solúvel rotulado com FLAG sem adjuvante foi dado 3 dias antes da fusão.
[00380] Produção de Hibridoma: Os camundongos que demonstram o título de anticorpo específico de IgG anti-hLIGHT mais alto no seu soro, como determinado pelo ELISA de hLIGHT e FACS usando células EL4 transduzidas com hLIGHT versus células precursoras EL4, foram selecionados para a produção de anticorpos monoclonais. Os baços foram colhidos e suspensões de célula única foram fundidas à linhagem de célula de mieloma SP2/O-Ag14 (ATCC, Manassas, VA) em uma razão de 5:1 com 50 % de polietileno glicol (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN). As fusões foram plaqueadas em placas de fundo chato de 96 reservatórios em uma densidade ótima (aqui 1 x 106/ml) em meio de DMEM-10 completo (Meio de Eagle Modificado de Dulbecco com 10 % de soro bovino fetal (FBS, Invitrogen, Corp.), 1 % de aminoácidos não essenciais, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de sulfato de estreptomicina (todos da BioWhittaker, Walkersville, MD), suplemento HAT (Sigma) e 10 % de Fator de Clonagem de Hibridoma (HCF, Biovaris, San Diego, CA)) e cultivados a 37°C em um incubador de CO2 a 10 %. Aproximadamente 2800 reservatórios de 2 fusões foram triados pelo ELISA quanto aos anticorpos específicos de hLIGHT contendo capa humanos. Os anticorpos de IgG anti-hLIGHT humanos foram confirmados pela análise citométrica de fluxo usando células hLIGHT-EL4 versus células precursoras EL4. Os reservatórios positivos também foram testados quanto a atividade de bloqueio de receptor pela pré- incubação de meios de cultura de extinção de hibridoma bruto com células EL4-hLIGHT e tingimento com HVEM:Fc ou LTβR:Fc na metade da saturação. Os reservatórios positivos foram expandidos e submetidos de 3 a 5 rodadas de clonagem pela diluição limitante para se obter anticorpos monoclonais.
[00381] Purificação de Anticorpo e Proteína:Para a purificação de anticorpo, hibridomas foram cultivados em garrafas rolantes de 2 litros a 350 mililitros a 1 litro/garrafa ou em um sistema Integra de 1 litro (INTEGRA Bioscience, Inc., Ijamsville, MD) com meio SFM de hibridoma (Invitrogen, Corp.) suplementado com soro bovino fetal com IgG ultra baixo (Invitrogen, Corp.).
[00382] A produção de proteínas recombinantes LTβR:Fc e HVEM:Fc humanas e de camundongo foi anteriormente relatada (Rooney et al. 2000 Meth. Enzymol. 322: 345-63) e foram geradas infectando-se 1 litro de suspensão de células Tn5 por 4 dias. Tanto os anticorpos monoclonais humanos quanto as proteínas de fusão Fc foram purificadas do meio de cultura usando gel de Proteína A recombinante-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences). O meio condicionado gerado nas garrafas rolantes foi primeiro concentrado usando um sistema de fluxo tangencial Ultrasette (Pall Corp., East Hills, NY). O meio condicionado foi filtrado com uma unidade de filtração a vácuo de 0,22 μm (Millipore, Bedford, MA) e carregado em uma coluna de Proteína A-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) de tamanho apropriado para a quantidade de anticorpo humano no meio. A coluna foi lavada cuidadosamente com 20 volumes da coluna de PBS e o anticorpo foi eluído com 0,1 M de Gly-HCl, pH 3,6, 0,15 M de NaCl e neutralizado com 1 M de Tris-HCl, pH 8,0. As frações foram analisadas pela SDS-PAGE e as frações positivas foram reunidas e concentradas com um concentrador centrífugo (Vivaspin, 50.000 MWCO: Sartorius, Gettingen, Alemanha).
[00383] As colunas de dessalinização Sephadex G-25, (NAP, Amersham Biosciences), foram usadas para a troca de tampão para PBS, pH 7,4. Finalmente, o anticorpo foi esterilizado em filtro usando filtros de seringa com 0,22 μm de diãmetros de poro e a concentração de anticorpo foi determinada pelo método de Lowry. O teor de pirogênio foi determinado usando um ensaio de Lisado de Amebócito de Limulus (LAL) (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA). Os limites de detecção deste ensaio são 0,06 EU/mg. Se o teste foi negativo, as amostras foram consideradas livres de endotoxina.
[00384] ELISA de quantificação de IgG Humana: para determinar a quantidade de anticorpo humano presente nos sobrenadantes e estoques purificados o seguinte protocolo foi usado.
[00385] Anticorpo específico de Fcy anti-ser humano de cabra (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) foi revestido nas placas de 96 reservatórios (Nunc, Dinamarca) em tampão de carbonato a 0,5 μg/reservatório por 1 hora a 37°C. as placas foram depois bloqueadas com Super block (Pierce, Rockford, IL) por 30 minutos seguido pela adição das amostras às placas. Curvas padrão foram geradas usando IgG humano total (Sigma) ou IgG1 ou IgG4 humanas purificadas (Kirin Brewery Co., Ltd). As placas foram incubadas por 1 hora a 37°C, lavadas em PBS/1 % de BSA/0,1 % de Tween20 (Sigma) e o anticorpo ligado foi detectado com anticorpo específico de Fcy anti-humano de cabra conjugado a peroxidase de rábano (HRP, Jackson Immunoresearch Laboratorie, West Grove, PA) por 1 hora a 37°C. O substrato de TMB (Sigma) foi adicionado por 10 minutos e a reação foi interrompida com H2SO4 (LabChem, Pittsburgh, PA). A OD foi medida a 450 nm em uma leitora de microplaca.
[00386] Cultura de célula de mamífero: A linhagem de célula 11-23 humana (subclone D7), uma linhagem de hibridoma de célula T CD4+ (Ware et al. 1986 Lymphokine Res 5 313-24), foi mantida em RPMI 1640 contendo 10 % de FBS (HyClone Laboratories, Logan, UT) e 100 U/ml de penicilina/100 μg/ml de estreptomicina (Life Technologies, Grand Island, NY). A linhagem de célula HT29.14s humana, a linhagem de célula EL4- hLIGHT e a linhagem de célula 293-hLIGHT foram todas mantidas em DMEM contendo 10 % de FBS (HyClone Laboratories, Logan, UT). Todas as células de mamífero foram cultivadas em um incubador umidificado com 5 % de CO2 a 37°C.
[00387] ELISA de detecção de anticorpo anti-hLIGHT: Os títulos de anticorpo, a especificidade e produção pelos hibridomas foram determinados pelo ELISA. Em resumo, placas de fundo chato de 96 reservatórios foram revestidas com 50 μl de hLIGHT solúvel rotulado com FLAG a 5 μg/ml em tampão de carbonato (pH 9,4) durante a noite a 4°C ou a 37°C por 1 hora. Depois de lavar duas vezes com PBS/0,1 % de Tween 20, as placas foram bloqueadas com PBS/1 % de BSA/0,1 % de Tween20 a 37°C por 1 hora. O soro, sobrenadante ou anticorpo purificado foram diluídos em tampão de bloqueio, adicionados aos reservatórios e as placas foram incubadas por 1 hora a 37°C. As placas foram lavadas 4 vezes com PBS/0,1 % de Tween 20 e o anticorpo de detecção de capa anti-humano de ovelha conjugado com peroxidase (The Binding Site, Birmingham, UK) foi adicionado a uma diluição de 1:2000. A seguir de uma incubação de 1 hora a 37°C, as placas foram lavadas e o substrato de TMB (Sigma) foi adicionado e incubado na temperatura ambiente por 10 a 30 minutos. A reação foi interrompida com H2SO4 (LabChem) e uma leitora de microplaca mediu a densidade óptica a 450 nm.
[00388] Citometria de Fluxo:Os títulos de anticorpo, especificidade e afinidades de ligação relativas foram determinados pela análise citométrica de fluxo usando linhagens de célula transduzidas com EL4 estáveis em hLIGHT ou uma linhagem de célula T I123.D7 ativada com 6 a 15 horas de PMA (40 ng/ml) + inonomicina (500 ng/ml). As células foram lavadas uma vez em tampão de tingimento: PBS + 2 % de FBS + 0,01 % de NaN3 + 10 mM de EDTA, depois recolocadas em suspensão em soro, sobrenadante ou anticorpos purificados em um volume de 50 μl. As células foram incubadas com os anticorpos em gelo por 20 minutos, lavadas duas vezes em tampão de tingimento depois recolocadas em suspensão em um anticorpo secundário rotulado com IgG-APC anti-humano de cabra (APC anti-humano de burro, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA). A seguir de uma incubação de 20 minutos em gelo, as células foram lavadas uma vez e fixadas 10 minutos com 1 % de paraformaldeído ou submetidos a uma lavagem final, depois as células foram recolocadas em suspensão em tampão de tingimento e as amostras adquiridas usando citômetros de fluxo FACScan ou FACS Calibur (Becton Dickinson Biosciences, Palo Alto, CA). Os dados foram analisados usando os softwares CELLQUEST (Becton Dickinson Biosciences) ou FLOW JO (TreeStar, Inc., San Carlos, CA).
[00389] Ensaios de bloqueio cruzado de anticorpo anti-hLIGHT: Um protocolo de ELISA foi usado para determinar se os anticorpos ligam o mesmo epítopo de hLIGHT. Placas de ELISA de fundo chato de 96 reservatórios NUNC foram revestidas com o anticorpo anti-hLIGHT humano em tampão de carbonato a 2 μg/ml por 1 hora a 37°C. As placas foram lavadas e depois bloqueadas com PBS/MBSA/Tween 20. O anticorpo anti- hLIGHT humano foi depois pré-incubado com hLIGHT solúvel rotulado com FLAG humano recombinante por 30 minutos a 4°C. As combinações de anticorpo-proteína hLIGHT foram adicionadas à placa e incubadas por 1 hora a 4°C. Depois de 3 lavagens, o hLIGHT ligado foi detectado com Ig com rótulo de epítopo anti-FLAG de M2-camundongo conjugado com peroxidase (Sigma). A inibição percentual foi determinada usando a OD de cada amostra na seguinte fórmula: % de inibição = (max - amostra/max)*100.
[00390] Análise de citocina humana.Um painel de 8 citocinas humanas no meio de cultivo de células HT29.14s tratadas foi medido usando a tecnologia multiplex e seguindo as instruções do fabricante (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). A detecção de CCL20 no meio de cultura de células HT29.14s foi realizada pelo ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) usando as instruções do fabricante.
[00391] Ensaio in vitro para o bloqueio mediado por anticorpo da ligação de LIGHT expressado na superfície da célula às proteínas de fusão de Fc receptor solúvel. Células le5 EL4 hLIGHT foram incubadas com concentrações classificadas de cada anticorpo por 30 minutos a 4°C. Quantidades sub-saturantes de HVEM:Fc-biotina (3 μg/ml) ou LTβR:Fc-His (3 μg/ml) (Alexis Biochemicals) foram depois adicionados às células e incubados por 30 minutos a 4 graus C. As células foram depois lavadas 2x com 200 μl de tampão FACS (1 x PBS 2 % de FBS + 0,02 % de azida). HVEM:Fc-biotina ou LTβR:Fc-His foram detectados por uma incubação de 30 minuto com SA-APC a 2,5 μg/ml ou anti-His-HRP respectivamente. As células foram depois analisadas em um citômetro de fluxo FACScaliber (Becton Dickinson). As células mortas foram desativadas do dispersor avançado vs. plotagem do dispersor lateral e meios geométricos de cada histograma foram calculados usando FLOWJO (TreeStar, San Carlos, CA, USA).
Isolamento de genes de anticorpo anti-hLIGHT humano.
[00392] As células de hibridoma cultivadas (124E63, 124F23, 124E1, 124E13 e 124F19), que produzem anticorpos E63 (IgG3), F23 (IgG4), E1 (IgG1), E13 (IgG1) e F19 (IgG1), respectivamente, foram coletadas pela centrifugação. O RNA total foi purificado a partir destas células usando kit RNEASY (QIAGEN Inc., Valencia, CA) seguindo as instruções do fabricante. O Kit de Amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech Co., Ltd., Palo Alto, CA) foi usado para a clonagem de cDNA que codifica a região variável dos genes de imunoglobulina de RNA de célula de hibridoma total. Em resumo, o cDNA do primeiro filamento foi preparado pela transcriptase reverse de 2 microgramas de RNA. Este cDNA foi usado como um padrão para a reação da cadeia da polimerase (PCR) para amplificar a região variável e uma parte da região constante de cadeias pesada e leve (VH e VL, respectivamente). Os iniciadores 3’ usados para a amplificação dos genes da cadeia pesada e leve nas reações de 5’ RACE foram HH-2 (SEQ ID NO: 64) (região constante da cadeia H) e HK-2 (SEQ ID NO: 65) (região constante da cadeia leve), respectivamente. As sequências amplificadas também contiveram as sequências líder. A reação foi como segue: 2,5 unidades de PFU ULTRA DNA polimerase (Stratagene, La Jolla, CA); 0,2 μM de Iniciador 3’ (para a cadeia pesada: IgGlp, para a cadeia leve: hk5, Tabela 2); 1 X Mistura A de Iniciador Universal para a extremidade 5’ (mistura A de iniciador UMP incluído no kit SMART RACE); 200 μM de mistura de dNTP; 1 mM de MgCl2; Tampão Puff Ultra (a concentração final é 1x); e padrão de cDNA.
[00393] O programa de termociclagem foi de 5 ciclos de: 94°C x 30 s, 72°C x 3 min. 5 ciclos de: 94°C x 30 s, 70°C x 30 s, 72°C x 3 min. 25 ciclos de: 94°C x 30 s, 68°C x 30 s, 72°C x 3 min seguido por uma extensão a 72°C x 7 min. Os fragmentos de DNA amplificados foram coletados pela eletroforese em gel de agarose e purificado pelo Kit de Extração em Gel QIAQUICK (Qiagen Co., Ltd., Alemanha). Os fragmentos de DNA purificados de VH e LV foram integrados no vetor PCR 4 Blunt-TOPO usando o Kit de Clonagem pela PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) e cada plasmídeo da construção foi transformado na E. coli e depois clonado. As sequências de nucleotídeo de cada inserto (HV e LV) nos plasmídeos da construção foram analisados usando iniciadores de vetor universal específico M13F (SEQ ID NO: 58) e M13R (SEQ ID NO: 59). Com base na sequência obtida de VH e VL, iniciadores de oligonucleotídeo foram planejados para amplificar a VH e VL respectivas (ver a Tabela 2).
[00394] Os cDNAs que codificam VH e VL de E63, F23, E1 e F19 foram subclonados pela PCR a partir de vetores PCR4 Blunt-TOPO no vetor de expressão IgG1. Porque E13 foi um hibridoma de IgG subtipo 1 com uma única cadeia capa (ver abaixo), não houve necessidade de subclonar o cDNA E13 em um vetor IgG1 para outras análises.
[00395] Primeiro, iniciadores de oligonucleotídeo contendo sítios de reconhecimento de enzima de restrição 5’-SalI e 3’-NheI foram planejados para amplificar a região variável da cadeia pesada (VH) pela PCR. Por exemplo, no caso de E63VH, a PCR foi realizada usando DNA mini-prep pTopoE63VH como um padrão, E63HF85 (SEQ ID NO: 60) e E63HR38 (SEQ ID NO: 61) como iniciadores (ver a Tabela 2) com PFU ULTRA DNA polimerase. Depois da digestão com NheI e SalI, o produto de PCR foi sub- clonado no vetor de expressão IgG1 (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, N5KG1-Val Lark (um vetor modificado de N5KG1 (Patente U.S. No 6.001.358)) que foi pré-digerido com NheI e SalI (fragmento de DNA de 8,9 quilobases). A existência de VH foi analisada pela digestão de restrição.
[00396] Em seguida, iniciadores de oligonucleotídeo contendo sítios de reconhecimento de enzima de restrição 5’ BglII e 3’ BsiWI foram planejados para amplificar a região variável da cadeia leve (VL) pela PCR. Por exemplo, seguindo a subclonagem do E63VH descrito acima, o E63VL foi inserido no vetor N5KG1-Val Lark-VH pela digestão do vetor de DNA com BglII e BsiWI. O fragmento de DNA de 9,1 kb foi depois isolado. Similar à construção de VH, um conjunto de iniciador para a PCR de VL foi planejado para conter os sítios de reconhecimento para 5’BglI e 3’BsiWI. Estes iniciadores, E63LF84 (SEQ ID NO: 62) e E63LR43 (SEQ ID NO: 63), foram usados para amplificar VL a partir de pTopoE63VL DNA plasmídico mini-prep. O produto de PCR foi digerido com BglII e BsiWI e isolado pela eletroforese em gel de agarose e purificação em gel. Este fragmento, contendo E63VL, foi ligado ao vetor de 9,1 kb preparado com T4 DNA ligase e usado para transformar células Top10 (Invitrogen). Os transformantes de E. coli positivos foram selecionados. Este vetor de expressão, pG1K112E63, foi purificado e a presença tanto da região E63VL quanto da E63VH foram confirmadas pela análise de restrição.
[00397] A geração de vetores para produzir anticorpos F23G1, E1G1 e F19G1 recombinantes foi realizada essencialmente da mesma maneira como E63G1. A amplificação pela PCR do F23VH foi realizada usando F23HF86 (SEQ ID NO: 66) e F23HR55 (SEQ ID NO: 67). Os iniciadores de amplificação de F23VL foram F23LF36 (SEQ ID NO: 68) e F23LR43 (SEQ ID NO: 69). A amplificação pela PCR do E1VH foi realizada usando E1 HFSalI (SEQ ID NO: 70) e E1 HRNheI (SEQ ID NO: 71). A amplificação pela PCR de E1 VL capa(A), E1 VL capa(B) e E1 VL capa(C) foi realizada usando E1 KF2+3BglII (SEQ ID NO: 74) emparelhada com E1KR2BsiWI (SEQ ID NO: 75) ou EIKR3BsiWI (SEQ ID NO: 76). A amplificação pela PCR de F19VH foi realizada usando F19HFSalI (SEQ ID NO: 72) e F19HRNheI (SEQ ID NO: 73). A amplificação pela PCR de F19L capa(A) e F19L capa(B) foi realizada usando F19KR1+2BsiWI (SEQ ID NO: 77) e F19KF1+2+3BglII (SEQ ID NO: 79). A amplificação pela PCR de F19L capa(C) foi realizada usando F19KR3BsiWI (SEQ ID NO: 78) e F19KF1+2+3BglII (SEQ ID NO: 79). Os vetores resultantes, pKLG1/F23, pKLG1/E1 e pKLG1/F19 também são confirmados pela digestão com enzima de restrição e sequenciamento. F19L capa(D) não foi amplificado pela PCR devido a uma mudança de matriz de leitura, que foi detectada pela análise de sequência, que produziu um segmento de terminal C do anticorpo.
[00398] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia pesada (VH) de E63 (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 43): ATGAAACACC TGTGGTTCTT CCTCCTCCTG GTGGCAGCTC CCAGATGGGT CCTGTCCCAG 60 GTGCAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT CGGAGACCCT GTCCCTCACC 120 TGCATTGTCT CTGGTGGCTC CGTCAGCAGT GGTGGTTACT ACTGGAGCTG GATCCGGCAG 180 CCCCCAGGGA AGGGACTGGA GTGGATTGGG TATATCTATT ACAGTGGGAG CACCAACTAC 240 AACCCCTCCC TCAAGAGTCG AGTCACCATA TCAGTAGACA CGTCCAAGAA CCAGTTCTCC 300 CTGAAGCTGA GCTCTGTGAC CGCTGCGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGATGGATT 360 ACTATGTTTC GGGGAGTTGG GTTCGACCCC TGGGGCCAGG GAACCCTGGT CACCGTCTCC 420 TCA 480
[00399] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve (VL) de E63 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 48): ATGTCGCCAT CACAACTCAT TGGGTTTCTG CTGCTCTGGG TTCCAGCCTC CAGGGGTGAA 60 ATTGTGCTGA CTCAGTCTCC AGACTTTCAG TCTGTGACTC CAAAGGAGAA AGTCACCATC 120 ACCTGCCGGG CCAGTCAGAG CATTGGTAGT AGCTTACACT GGTACCAGCA GAAACCAGAT 180 CAGTCTCCAA AGCTCCTCAT CAAGTATGCT TCCCAGTCCT TCTCAGGGGT CCCCTCGAGG 240 TTCAGTGGCA GTGGATCTGG GACAGATTTC ACCCTCACCA TCAATAGCCT GGAAGCTGAA 300 GATGCTGCAG CATATTACTG TCATCAGAGT AGTAGTTTAC CTCTCACTTT CGGCGGAGGG 360 ACCAAGGTGG AGATCAAA 420
[00400] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia pesada de F23 (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 45): ATGGACCTCC TGCACAAGAA CATGAAACAC CTGTGGTTCT TCCTCCTCCT GGTGGCAGCT 60 CCCAGATGGG TCCTGTCCCA GGTGCAGCTA CAGCAGTGGG GCGCAGGACT GTTGAAGCCT 120 TCGGAGACCC TGTCCCTCAC CTGCGCTGTC TATGGTGGGT CCTTCAGTGG TTACTACTGG 180 AACTGGATCC GCCAGCCCCC AGGGAAGGGG CTGGAGTGGA TTGGGGAAAT CAATCAGTAC 240 AACCCGTCCC TCAAGAGTCG AGTCACCATA TCAGTAGACA CGTCCAAGAA CCAGTTCTCC 300 CTGAAGCTGA GCTCTGTGAC CGCCGCGGAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGATA 360 GCAACAGCTG ATAAAGGGTA CTACGGTTTG GACGTCTGGG GCCAAGGGAC CACGGTCACC 420 GTCTCCTCA 480
[00401] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve de F23 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 50): ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTTCTGC TGCTCTGGCT CCCAGGTGCC 60 AGATGTGCCA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA 120 GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGGGC ATTAGCAGTG CTTTAGCCTG GTATCAGCAG 180 AAACCAGGGA AAGCTCCTAA GCTCCTGATC TATGATGCCT CCAGTTTGGA AAGTGGGGTC 240 CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 300 CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGT CAACAGTTTA ATAGTTACCC GCTCACTTTC 360 GGCGGAGGGA CCAAGGTGGA GATCAAA 420
[00402] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia pesada de E1 (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 41): ATGGAGTTGG GGCTGTGCTG GGTTTTCCTT GTTGCTATTT TAGAAGGTGT CCAGTGTGAG 60 GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCTTG GTACAGCCTG GGGGGTCCCT GAGACTCTCC 120 TGTGCAGCCT CTGGATTCAC CTTCAGTAGA TTTAACATGA ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA 180 GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT TTCATACATT AGTAGTAGTA GTTATACCAT ATACTACGCA 240 GACTCTGTGA AGGGCCGATT CACCATCTCC AGAGACAATG CCAAGAACTC ACTGGATCTG 300 CAAATGAACA GCCTGAGAGA CGAGGACACG GCTGTGTATT ACTGTGCGAG GAGTATAGCA 360 GCAGCTTTTG ACTACTGGGG CCAGGGAGCC CTGGTCACCG TCTCCTCA 420
[00403] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve #1 de E1 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 102): ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTTCTGC TGCTCTGGCT CCCAGGTGCC 60 AGATGTGCCA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA 120 GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGGGC ATTAGCAGTG CTTTAGCCTG GTATCAGCAG 180 AAACCAGGGA AAGCTCCTAA GCTCCTGATC TATGATGCCT CCAGTTTGGA AAGTGGGGTC 240 CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 300 CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGT CAACAGTTTA ATAGTTACCG TACACTTTTG 360 GCCAGGGGAC CAAGCTGGAG ATCAAA 420
[00404] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve #2 de E1 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 46): ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 60 GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC 120 CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTACT TAACCTGGTA CCAGCAGAAA 180 CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA 240 GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG 300 CCTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGGTA GCTCAATGTA CACTTTTGGC 360 CAGGGGACCA AGCTGGAGAT CAAA 420
[00405] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve #3 de E1 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 103): ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 60 GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC 120 CTCTCCTACA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTACT TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA 180 CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCATCCA ACAGGGCCAC TGGCATCCCA 240 GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG 300 CCTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGGTA GCTCACCGTG GACGTTCGGC 360 CAAGGGACCA AGGTGGAAAT CAAA 420
[00406] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia pesada de E13 (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 42): ATGGAGTTTG GGCTGAGCTG GATTTTCCTT GCTGCGATTT TAAAAGGTGT CCAGTGTGAG 60 GTGCAGCTGG TGGAGTCTGG GGGAGGCCTG GTAAAGCCTG GGGGGTCCCT TAGACTCTCC 120 TGTGCAGCCT CTGGATTCAC TCTCAGTAAC GCCTGGATGA GCTGGGTCCG CCAGGCTCCA 180 GGGAAGGGGC TGGAGTGGGT TGGCCGTATT AAAAGCAAAA TAGATGGTGG GACAACAGAC 240 TACGCTGCAC CCGTGAAAGG CAGATTCACC ATCTCAAGAG ATGATTCAAA AAACACGCTG 300 TTTCTGCAAA TGAACAGCCT GAAAACCGAG GACACAGCCG TGTATTACTG TACCACAGCA 360 ATGGCTGGTG CGTTTGGCTT TTGGGGCCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC CTCA 420
[00407] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve de E13 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 47): ATGGAAACCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 60 GAAATTGTGT TGACGCAGTC TCCAGGCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC 120 CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCAGCTACT TAGCCTGGTA CCAGCAGAAA 180 CCTGGCCAGG CTCCCAGGCT CCTCATCTAT GGTGCATCCA GCAGGGCCAC TGGCATCCCA 240 GACAGGTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACA GACTTCACTC TCACCATCAG CAGACTGGAG 300 CCTGAAGATT TTGCAGTGTA TTACTGTCAG CAGTATGGTA GCTCACCCAT GTACACTTTT 360 GGCCAGGGGA CCAAGCTGGA GATCAAACGA 420
[00408] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia pesada de F19 (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 44): ATGAAACACC TGTGGTTCTT CCTCCTCCTG GTGGCAGCTC CCAGATGGGT CCTGTCCCAG 60 GTGCAGCTAC AGCAGTGGGG CGCAGGACTG TTGAAGCCTT CGGAGACCCT GTCCCTCACC 120 TGCGCTGTCT ATGGTGGGTC CTTCAGTGGT TACAACTGGC ACTGGATCCG CCAGCCCCCA 180 GGGAAGGGGC TGGAGTGGAT TGGGGAAATC ACTCATAGTG GAAGCACCAA TTACAACCCG 240 TCCCTCAAGA GTCGAGTCAC CATATCAGTA GACACGTCCA AGAACCAGTT CTCCCTGAAG 300 CTGAGCTCTG TGACCGCCGC GGACACGGCT GTGTATTACT GTGTGCGAGA GATTGCAGTG 360 GCTGGTACGG GCTACTACGG TATGGACGTC TGGGGCCAAG GGACCACGGT CACCGTCTCC 420 TCA 480
[00409] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve #1 de F19 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 104): ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTAC TGCTCTGGGT CCCAGGTGCC 60 AGATGTGACA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA 120 GTCACCATCA CTTGCCGGGT GAGTCAGGGC ATTAGCAGTT ATTTAAATTG GTATCGGCAG 180 AAACCAGGGA AAGTTCCTAA GCTCCTGATC TATAGTGCAT CCAATTTGCA ATCTGGAGTC 240 CCATCTCGGT TCAGTGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACTAT CAGCAGCCTG 300 CAGCCTGAAG ATGTTGCAAC TTATTACGGT CAACGGACTT ACAATGCCCC TCCCACTTTC 360 GGCGGAGGGA CCAAGGTGGA GATCAAA 420
[00410] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve #2 de F19 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 49): ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTTCTGC TGCTCTGGCT CCCAGGTGCC 60 AGATGTGCCA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT CTGCATCTGT AGGAGACAGA 120 GTCACCATCA CTTGCCGGGC AAGTCAGGGC ATTAACAGTG CTTTTGCCTG GTATCAGCAG 180 AAACCAGGGA AAGCTCCTAA GCTCCTGATC TATGATGCCT CCAGTTTGGA AAGTGGGGTC 240 CCATCAAGGT TCAGCGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 300 CAGCCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGT CAACAGTTTA ATAGTTACCC TCTCACTTTC 360 GGCGGAGGGA CCAAGGTGGA GATCAAA 420
[00411] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve #3 de F19 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 105): ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT CCCAGGTGCC 60 AGATGTGTCA TCTGGATGAC CCAGTCTCCA TCCTTACTCT CTGCATCTAC AGGAGACAGA 120 GTCACCATCA GTTGTCGGAT GAGTCAGGGC ATTAGCAGTT ATTTAGCCTG GTATCAGCAA 180 AAACCAGGGA AAGCCCCTGA GCTCCTGATC TATGCTGCAT CCACTTTGCA AAGTGGGGTC 240 CCATCAAGGT TCAGTGGCAG TGGATCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCTGCCTG 300 CAGTCTGAAG ATTTTGCAAC TTATTACTGT CAACAGTATT ATAGTTTCCC GTACACTTTT 360 GGCCAGGGGA CCAAGCTGGA GATCAAA 420
[00412] Sequência de nucleotídeo de cDNA da região variável de cadeia leve #4 de F19 capa (do códon de início (ATG) ao final da região variável) (SEQ ID NO: 106): ATGGAAGCCC CAGCGCAGCT TCTCTTCCTC CTGCTACTCT GGCTCCCAGA TACCACCGGA 60 GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA AAGAGCCACC 120 CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GGGTGTTAGC AGCTACTTAG CCTGGTACCA GCAGAAACCT 180 GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC 240 AGGTTCAGTG GCAGTGGGCC TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT 300 GAAGATTTTG CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCATCCCGT TCGGCCAAGG 360 GACCAAGGTG GAGATTCAAA 420
[00413] Sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de E63 (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 3): MKHLWFFLLL VAAPRWVLSQ VQLQESGPGL VKPSETLSLT CIVSGGSVSS GGYYWSWIRQ 60 PPGKGLEWIG YIYYSGSTNY NPSLKSRVTI SVDTSKNQFS LKLSSVTAAD TAVYYCARWI 120 TMFRGVGFDP WGQGTLVTVS S 180
[00414] Sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de E63 capa (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 8): MSPSQLIGFL LLWVPASRGE IVLTQSPDFQ SVTPKEKVTI TCRASQSIGS SLHWYQQKPD 60 QSPKLLIKYA SQSFSGVPSR FSGSGSGTDF TLTINSLEAE DAAAYYCHQS SSLPLTFGGG 120 TKVEIK 180
[00415] Sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de F23 (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 5): MDLLHKNMKH LWFFLLLVAA PRWVLSQVQL QQWGAGLLKP SETLSLTCAV YGGSFSGYYW 60 NWIRQPPGKG LEWIGEINQY NPSLKSRVTI SVDTSKNQFS LKLSSVTAAD TAVYYCAREI 120 ATADKGYYGL DVWGQGTTVT VSS 180
[00416] Sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve F23 capa (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 10): MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCAIQLTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSALAWYQQ 60 KPGKAPKLLI YDASSLESGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQFNSYPLTF 120 GGGTKVEIK 180
[00417] Sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de E1 (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 1): MELGLCWVFL VAILEGVQCE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSR FNMNWVRQAP 60 GKGLEWVSYI SSSSYTIYYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLDL QMNSLRDEDT AVYYCARSIA 120 AAFDYWGQGA LVTVSS 180
[00418] Sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve #1 de E1 capa (E1 capa(a)) (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 82): MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCAIQLTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG ISSALAWYQQ 60 KPGKAPKLLI YDASSLESGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQFNSYRTLL 120 ARGPSWRS 180
[00419] Sequência de aminoácido do cDNA da região variável de cadeia leve #2 E1 capa (E1capa(B)) (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 6): METPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLTWYQQK 60 PGQAPRLLIY GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSMYTFG 120 QGTKLEIK 180
[00420] Sequência de aminoácido do cDNA da região variável de cadeia leve #3 de E1 capa (E1capa(C)) (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 83): METPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSYRASQSVS SSYLAWYQQK 60 PGQAPRLLIY GASNRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG 120 QGTKVEIK 180
[00421] Sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de E13 (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 2): MEFGLSWIFL AAILKGVQCE VQLVESGGGL VKPGGSLRLS CAASGFTLSN AWMSWVRQAP 60 GKGLEWVGRI KSKIDGGTTD YAAPVKGRFT ISRDDSKNTL FLQMNSLKTE DTAVYYCTTA 120 MAGAFGFWGQ GTLVTVSS 180
[00422] Sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de E13 capa (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 7): METPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK 60 PGQAPRLLIY GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPMYTF 120 GQGTKLEIKR 180
[00423] Sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de F19 (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 4): MKHLWFFLLL VAAPRWVLSQ VQLQQWGAGL LKPSETLSLT CAVYGGSFSG YNWHWIRQPP 60 GKGLEWIGEI THSGSTNYNP SLKSRVTISV DTSKNQFSLK LSSVTAADTA VYYCVREIAV 120 AGTGYYGMDV WGQGTTVTVS S 180
[00424] Sequência de aminoácido do cDNA da região variável de cadeia leve #1 de F19 capa (F19capa(a)) (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 90): MDMRVPAQLL GLLLLWVPGA RCDIQLTQSP SSLSASVGDR VTITCRVSQG ISSYLNWYRQ 60 KPGKVPKLLI YSASNLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDVATYYG QRTYNAPPTF 120 GGGTKVEIK 180
[00425] Sequência de aminoácido do cDNA da região variável de cadeia leve #2 de F19 capa (F19capa(B)) (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 9): MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCAIQLTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQG INSAFAWYQQ 60 KPGKAPKLLI YDASSLESGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQFNSYPLTF 120 GGGTKVEIK 180
[00426] Sequência de aminoácido do cDNA da região variável de cadeia leve #3 de F19 capa (F19capa(C)) (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 91): MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCVIWMTQSP SLLSASTGDR VTISCRMSQG ISSYLAWYQQ 60 KPGKAPELLI YAASTLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISCL QSEDFATYYC QQYYSFPYTF 120 GQGTKLEIK 180
[00427] Sequência de aminoácido do cDNA da região variável de cadeia leve #4 de F19 capa (F19capa(D)) (sequência líder (negrito) e região variável) (SEQ ID NO: 92): MEAPAQLLFL LLLWLPDTTG EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQGVS SYLAWYQQKP 60 GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGPGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWHPVRPR 120 DQGGDS 180 Tabela 2: Iniciadores de DNA Sintetizados
Figure img0002
[00428] O camundongo KM® é descrito, por exemplo, em Fishwild et al. 1996, Nat. Biotechnol. 14: 845-51; Lonberg et al. 2005 Nat. Biotechnol. 9: 1117-1125; Tomizuka et al. 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722-7; Tomizuka 1997 Nat Genet. 16: 133-43, cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Devido à natureza do camundongo KM®(por exemplo, mais do que um gene da cadeia capa foi integrado no genoma de murino na geração da cepa transgênica em capa) é possível ter mais do que um cDNA da cadeia leve capa expressado a partir de um hibridoma clonal. Para determinar se este é o caso, um mínimo de dez clones de cDNA são sequenciados. Em casos onde mais do que um cDNA de anticorpo da cadeia leve capa é isolado (por exemplo, E1 e F19), várias construções são geradas contendo os vários pares de cDNA da cadeia pesada combinados com cada cDNA capa. Estas construções de expressão são transfectadas em células 293F usando 293FECTIN (Invitrogen, San Diego, CA). Os sobrenadantes de cultura de setenta e duas horas são depois testados quanto a atividade de anticorpo para identificar o(s) par(es) correto(s) de cadeia pesada e leve que imunoespecificamente se liga(m) a hLIGHT (por exemplo, pelo Western blot, ELISA ou outro método similar). Favor dirigir-se ao Exemplo 3 abaixo para um método exemplar de caracterização de anticorpos (por exemplo, E1 e F19) tendo cadeias capa múltiplas.
[00429] Produção de anticorpo humano recombinante anti-hLIGHT a partir de células 293F: Culturas em suspensão de células 293F foram mantidas em meio de expressão Freestile 293 sob agitação a ~120 rpm/min em um incubador umidificado com CO2 a 8 % a 37°C. Para a exprssão transitória de anticorpos recombinantes, 3 x 107células 293F foram transfectadas com 30 μg de cada plasmídeo que codifica as versões de IgG1 recombinantes dos anticorpos anti-hLIGHT E63 ou F23 usando 293-fectina (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo as instruções do fabricante. Os transfectantes foram deixados crescer em suspensão em 30 ml de meio de expressão FREESTILE 293 por 5 dias sob condições de crescimento normais. O meio de cultivo foi colhido e as células removidas pela centrifugação a uma velocidade de 300 g seguido pela filtração através de um filtro de 0,22 μm. A concentração de anticorpo presente neste material não purificado é determinada pelo ELISA de hIgG e usado para ensaios in vitro para avaliar as propriedades funcionais dos anticorpos comutados na subclasse.
RESULTADOS
[00430] Os camundongos KM® foram imunizados com hLIGHT rotulado com FLAG recombinante solúvel em CFA/IFA. Vários dos camundongos incitaram anticorpos específicos anti-hLIGHT, com uma variação nos títulos específicos de hLIGHT IgG humano medida pelo tingimento na análise de ELISA e FACS de células hLIGHT-EL4. Os esplenócitos dos respondedores mais altos foram fundidos com células de mieloma para gerar hibridomas que produzem anti-hLIGHT humano. A produção de anticorpos anti-hLIGHT pelos hibridomas individuais foi determinada na triagem primária pelo ELISA de anti-hLIGHT. Nesta triagem o anticorpo anti-FLAG foi revestido na placa para capturar hLIGHT recombinante rotulado com FLAG em um esforço bem sucedido para mascarar o epítopo FLAG e prevenir a isolação de hibridomas que produzem anticorpo anti-FLAG. Os meios de clones positivos no ELISA foram usados em uma triagem secundária pelo tingimento de citometria de fluxo da linhagem de célula hLIGHT-EL4 para confirmar a identificação de anticorpos que imunoespecificamente se ligam à forma nativa de hLIGHT.
[00431] Os hibridomas positivos foram testados quanto a atividade antagonística pela classificação da capacidade dos anticorpos produzidos pelo hibridoma para bloquear a ligação de HVEM:Fc e LTβR:Fc às células hLIGHT-EL4. Esta atividade de bloqueio foi normalizada para a concentração de anticorpo determinada pelo ELISA de IgG humana. Os 15 candidatos principais foram clonados pela diluição limitante para produzir hibridomas monoclonais, enquanto que o resto foi congelado. Purificações em escala pequena foram produzidas a partir de culturas de extinção (<1 mg) para estes 15 anticorpos para caracterização adicional e classificação com base nos seguintes critérios: afinidade de ligação relativa para hLIGHT, a capacidade para bloquear a ligação de HVEM:Fc e LTβR:Fc humanos às células hLIGHT-EL4, bloqueio cruzado entre si e a capacidade para bloquear a secreção de quimiocina mediada por hLIGHT solúvel e expressado na superfície da célula a partir da linhagem de célula epitelial colônica HT29.14s. Com base nestes estudos, as propriedades dos 5 candidatos selecionados principais (E1, E13, E63, F23 e F19) são apresentadas na FIG. 3.
[00432] Os anticorpos anti-hLIGHT monoclonais E1, E13, E63, F23 e F19 cada um ligou-se especificamente à linhagem de célula T humana ativada (I123.D7) e à linhagem de célula que expressa hLIGHT estável hLIGHT-EL4, mas não aos precursores EL4 ou células I123.D7 em repouso (FIG. 1A). A ligação deste anticorpo anti-hLIGHT humano atingiu a saturação (FIG. 1B). A afinidade de ligação de errado constante funcioal de cada anticorpo foi determinada titulando-se a quantidade de anticorpo necessária para rotular as células hLIGHT-EL4 (FIGS. 2A e 2B). a análise de regressão não linear foi realizada para determinar a medição da afinidade de ligação funcional ou EC50 para cada candidato (FIG. 3). Uma faixa de afinidades funcionais foi observada. Uma EC50 baixa assim como um alto nível de tingimento (intensidade de fluorescência média (MFI)) na saturação foram ambas consideradas ideais durante a os processos de classificação e seleção.
[00433] Os anticorpos foram testados pelo ELISA para determinar se eles competem entre si quanto a ligação a hLIGHT solúvel (FIG. 4). Dois grupos de epítopo de hLIGHT foram identificados nesta análise. Os “anticorpos E” (E1, E13 e E63) bloquearam cruzado entre si e os “anticorpos F” (F19 e F23) bloquearam cruzado entre si. Entretanto, os “anticorpos E” não foram capazes de bloquear cruzado os “anticorpos F” e vice e versa. Como esperado, todos os anticorpos bloquearam a si mesmo neste ensaio.
[00434] A capacidade de E1, E13, E63, F23 e F19 para bloquear as proteínas de fusão HVEM:Fc e LT13R:Fc humanas para hLIGHT expressado na superfície da célula usando um ensaio com base no fluxo citométrico é mostrada nas FIGS. 5A e 5B e FIGS. 6A e 6B respectivamente. Nestes experimentos, quantidades classificadas de cada anticorpo foram adicionadas à linhagem de célula EL4-hLIGHT seguidas pela adição de uma quantidade de sub-saturação da proteína de fusão receptora. As proteínas de fusão receptoras foram detectadas pelos anticorpos anti-His para LTβR:Fc rotulado com His ou estreptavidina-PE para HVEM:Fc biotinilado. Como mostrado, cada um dos anticorpos bloquearam a proteína de fusão receptora da ligação de hLIGHT, em contraste com o anticorpo M2 anti-influenza totalmente humano de controle que não teve nenhum efeito sobre cada ligação de Fc- receptor. Em cada experimento, todos os anticorpos bloquearam a ligação de receptor em uma maneira dependente da dose possibilitando a análise pela regeressão não linear para determinar a dose de IC50 (FIG. 3). Estes valores foram levados em consideração quando da classificação dos candidatos potenciais.
[00435] Para provar diretamente que os anticorpos antagonísticos da invenção bloqueiam a sinalização mediada por hLIGHT, um ensaio para medir a sinalização mediada por hLIGHT in vitro foi estabelecido. Para este propósito, a linhagem de célula epitelial colônica HT29.14s, que expressa tanto LTβR quanto HVEM, foi tratada com quantidades classificadas de hLIGHT solúvel e o meio de cultivo foi analisado quanto a presença de citocinas secretadas em um curso de tempo de vários dias. Usando ELISAs padrão e a análise multiplex de série de suspensão, foi determinado que hLIGHT induz CCL20, IL-8 e RANTES em uma maneira dependente da dose (FIG. 7 e FIGS. 8A e 8B). a FIG. 7 representa uma titulação de dose de hLIGHT solúvel colhido no dia 3. TNF recombinante foi usado como um controle positivo para a indução de quimiocina através dos receptores TNF, enquanto que a linfotoxina (LTα1β2) foi usada como um controle positivo para a sinalização através de LTβR. a fosfatase alcalina bacteriana rotulada com FLAG (FLAG-BAP) foi usada como um controle negativo de proteína irrelevante rotulada. Como esperado, os níveis de quimiocina produzidos contactando-se as células com hLIGHT foram equivalentes àqueles induzidos pelo LTαβ, ao passo que TNF foi mais eficaz na indução de CCL20 e IL-8, mas induziu níveis similar de RANTES. Este ensaio de resposta celular é usado para medir a sinalização de hLIGHT e avaliar a capacidade de anticorpos da invenção para bloquear os eventos de sinalização mediados por hLIGHT in vitro.
[00436] No ensaio de indução de CCL20 em HT29.14s mediada por hLIGHT, quantidades classificadas dos anticorpos anti-hLIGHT foram pré- incubadas com uma quantidade constante de hLIGHT solúvel recombinante, depois adicionadas às células HT29.14s (FIG. 9). Os níveis de quimiocina foram ensaiados nos dias 3 ou 4 após o tratamento e comparados com os níveis induzidos pelo hLIGHT solúvel sozinho ou hLIGHT solúvel pré- incubado com uma proteína M2 anti-influenza humana totalmente irrelevante como um controle de isótipo. Nestes ensaios, os anticorpos da invenção aqui testados bloquearam a indução de CCL20 mediada por hLIGHT solúvel em uma maneira dependente da dose. em alguns casos, a análise de regressão não linear foi capaz de produzir valores IC50.
[00437] Sem desejar estar ligado por qualquer mecanismo ou teoria particular, acredita-se que a sinalização iniciada pela ligação de hLIGHT de superfície celular aos seus receptores cognatos em outras células pode ser crítica para exercer a atividade co-estimulatória de célula T observada através das interações de HVEM ou produção de quimiocina aumentada através de LTβR expressado nas células de origem estrômica ou epitelial no intestino, baço ou linfonodos. A indução de CCL20 no intestino parece ser regulado mais pela expressão de ligandos de LTβR nas células que entram em contato com células epiteliais do que pelos fatores solúveis (Rumbo et al. 2004 Gastroenterology 127 213-23). Portanto, um ensaio de sinalização de hLIGHT de superfície celular foi desenvolvido para avaliar a capacidade dos nossos anticorpos para bloquear hLIGHT na superfície celular. Neste ensaio as células hLIGHT-EL4 fixadas em formalina foram usadas para induzir quimiocinas incubando-as com células HT29.14s em uma maneira similar ao ensaio de hLIGHT solúvel. Estas células induziram CCL20 e RANTES em níveis equivalentes como o hLIGHT solúvel. Quando quantidades classificadas de anticorpos anti-hLIGHT foram pré-incubadas com células hLIGHT-EL4 fixadas, a indução de RANTES foi bloqueada para os níveis observados quando nenhuma das células que expressam hLIGHT foi adicionada (FIG. 10). Em experimentos idênticos CCL20 foi igualmente inibido.
[00438] Quando juntos, estes dados indicam que os anticorpos da invenção podem bloquear a sinalização de hLIGHT tanto solúvel quanto ligado à membrana in vitro.
EXEMPLO 2 - CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-HUMANOS DE CAMUNDONGO COMERCIALMENTE DISPONÍVEIS
[00439] Bloqueio Cruzado de Anticorpo. Os experimentos de bloqueio cruzado foram conduzidos como descrito no Exemplo 1 usando anticorpos anti-hLIGHT monoclonais de camundongo disponíveis da R&D Systems (“mAb de camundongo da R&D”) e Abnova (“mAb de camundongo da Abnova”), assim como os anticorpos anti-hLIGHT humanos monoclonais identificados no Exemplo 1, para avaliar qual epítopo de hLIGHT que os anticorpos ligam. Os resultados estão apresentados na FIG. 11.
[00440] Os resultados mostram que o mAb de camundongo da R&D se liga ao mesmo epítopo como os anticorpos monoclonais E1, E13 e E63 humanos (“anticorpos E humanos”), assim como o mesmo epítopo como os anticorpos F19 e F23 monoclonais humanos (“anticorpos F humanos”). Assim, ao contrário dos anticorpos monoclonais anti-hLIGHT E & F humanos identificados no Exemplo 1, que foram descobertos ligar-se imunoespecificamente apenas a um dos dois epítopos distintos, o mAb de camundongo da R&D se liga a ambos os grupos de epítopo de hLIGHT. Isto é, os anticorpos E humanos e os anticorpos F humanos identificados no Exemplo 1 não bloquearam cruzado entre si. Os anticorpos E humanos bloquearam cruzado outros anticorpos E humanos e os anticorpos F humanos bloquearam cruzado outros anticorpos F humanos; ao passo que os anticorpos E humanos e os anticorpos F humanos todos foram capazes de bloquear cruzado o mAb de camundongo da R&D. Similarmente, o mAb de camundongo da R&D bloqueou cruzado os anticorpos E humanos assim como os anticorpos F humanos.
[00441] Os resultados também mostram que o mAb de camundongo da Abnova não liga o epítopo que é ligado pelos anticorpos E humanos e os anticorpos F humanos. Isto é, o mAb de camundongo da Abnova não foi bloqueado cruzado por nenhum dos anticorpos E1, E13, E63, F19 ou F23 humanos, nem foi o mAb de camundongo da Abnova capaz de bloquear cruzado nenhum dos anticorpos E1, E13, E63, F19 ou F23 humanos.
[00442] Atividade de bloqueio de anticorpos quanto a ligação de HVEM:Fc às células 293 hLIGHT. Os anticorpos E1, E13 e F19 anti- hLIGHT humanos monoclonais, o mAb de camundongo da R&D, os anticorpos policlonais anti-hLIGHT de cabra comercialmente disponíveis (R&D Systems) e os anticorpos policlonais anti-hLIGHT de coelho (eBioscience) foram testados quanto a sua capacidade para bloquear a ligação de HVEM:Fc às células 293 que expressam hLIGHT como descrito no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na FIG. 12 e FIG. 14B. Todos os quatro anticorpos monoclonais foram capazes de inibir a ligação em uma maneira dependente da dose, como determinado pela análise de FACS.
[00443] Os anticorpos policlonais de cabra R&D também foram capazes de inibir a ligação do HVEM:Fc, ao passo que o anticorpo policlonal de coelho da eBioscience não foi.
[00444] Atividade de bloqueio de anticorpos quanto a ligação de LTβR:Fc às células 293 hLIGHT. Os anticorpos E1 e E13 anti-hLIGHT monoclonais humanos, o mAb de camundongo da R&D, os anticorpos policlonais anti-hLIGHT de cabra comercialmente disponíveis (R&D Systems) e os anticorpos policlonais anti-hLIGHT de coelho (eBioscience) foram testados quanto a sua capacidade para bloquear a ligação de LTβR:Fc às células 293 que expressam hLIGHT como descrito no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na FIG. 13 e FIG. 14B. Todos os quatro anticorpos monoclonais foram capazes de inibir a ligação em uma maneira dependente da dose, como determinado pela análise de FACS. Os anticorpos policlonais de cabra da R&D também foram capazes de inibir a ligação do LTβR:Fc, ao passo que o anticorpo policlonal de coelho da eBioscience não foi.
[00445] Ligação ao hLIGHT nativo e desnaturado. Cinco microgramas de LIGHT humano solúvel foi fervido em amostra tampão 2 x SDS (desnaturado) ou não tratados (nativo) e depois ambos foram diluídos em série em incrementos de 6x. 5 μl de cada diluição de hLIGHT foi manchada simultaneamente sobre membranas de PVDF de 0,2 μm hidratadas (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando uma pipeta de 8 canais múltiplos. As manchas foram deixadas secar ao ar depois re-hidratadas, bloqueadas (1 x TBST (solução salina tamponada com Tris Tween-20) + 2,5 % de leite desnatado + 0,02 % de azida de sódio). Cada mancha foi sondada com 5 μg/ml de cada anticorpo primário (ver abaixo). As manchas foram lavadas 3x em 1x TBST seguido pelos Abs secundários biotinilados (Biotina-Cabra αHumano (Vector Labs, Burlingame, CA), Biotina-Cabra α camundongo (Jackson labs, Bar Harbor, ME), Biotina-Camundongo α cabra (Sigma- Aldrich corp., St. Louis, MO) ) a 5 μg/ml. As manchas foram lavadas 3x em 1x TBST seguido pelo super SAHRP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A quimioluminescência foi usada para a detecção usando o kit de detecção ECL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e o sinal foi visualizado pela exposição à película de formação de imagem X-OMAT AR (Kodak, Rochester, Nova Iorque).
[00446] Os anticorpos primários testados foram os mAb anti-hLIGHT humanos E1, E13, E63, F19, F23 (ver o Exemplo 1), anticorpos anti-hLIGHT monoclonais de murino comercialmente disponíveis da R&D Systems (“mAb de camundongo da R&D”) e Abnova (“mAb de camundongo da Abnova”), uma preparação de anticorpo policlonal anti-hLIGHT de cabra (R&D Systems “pAb de cabra da R&D”) e duas preparações de anticorpo policlonal anti- hLIGHT de coelho (eBioscience (“pAb de coelho da eBioscience”) e Peprotech (“pAb de coelho Peprotech”)).
[00447] Os resultados são mostrados na FIG. 15 e FIG. 16. Os “anticorpos E” monoclonais anti-hLIGHT humanos da invenção (E1, E13 e E63) testados neste ensaio imunoespecificamente se ligam tanto à forma nativa quanto à desnaturada de hLIGHT solúvel (FIG. 15A e FIG. 16). O anticorpo E63 imunoespecificamente se liga a concentrações mais baixas de hLIGHT nativo (o o limite mais baixo de detecção é de 3,9 ng de hLIGHT nativo) do que o hLIGHT desnaturado (o limite mais baixo de detecção é de 139 ng de hLIGHT desnaturado). O anticorpo E1 também imunoespecificamente se liga a concentrações mais baixas de hLIGHT nativo (o limite mais baixo de detecção é de 23 ng de hLIGHT nativo) quando comparado ao hLIGHT desnaturado (o limite mais baixo de detecção é de 139 ng de hLIGHT desnaturado). O anticorpo E13 imunoespecificamente se liga tanto à forma nativa quanto à desnaturada de hLIGHT com o limite mais baixo de detecção de 0,64 ng para ambas as formas de hLIGHT.
[00448] Ao contrário dos “anticorpos E” anti-hLIGHT monoclonais humanos, os “anticorpos F” anti-hLIGHT monoclonais humanos da invenção (F19 e F23) testados neste ensaio imunoespecificamente se ligam à forma nativa de hLIGHT solúvel (o limite mais baixo de detecção é de 23 ng de hLIGHT nativo), mas não à forma desnaturada, mesmo nas concentrações mais altas (>5000 ng) de hLIGHT desnaturado (FIG. 15A e FIG. 16).
[00449] Cada um dos anticorpos anti-hLIGHT monoclonais de camundongo comercialmente disponíveis (mAb de camundongo da R&D e mAb de camundongo da Abnova) testados neste ensaio imunoespecificamente se ligam tanto à forma nativa quanto à desnaturada de hLIGHT solúvel. O mAb de camundongo da R&D imunoespecificamente se liga às concentrações mais baixas de hLIGHT nativo (o limite mais baixo de detecção é de 23 ng de hLIGHT nativo) quando comparado ao hLIGHT desnaturado (o limite mais baixo de detecção é de 139 ng de hLIGHT desnaturado). O mAb de camundongo da Abnova imunoespecificamente se liga a concentrações aproximadamente iguais tanto da forma nativa quanto da desnaturada de hLIGHT solúvel (o limite mais baixo de detecção é de 0,64 ng de hLIGHT nativo ou desnaturado, respectivamente).
[00450] As três preparações de anticorpo policlonal anti-hLIGHT comercialmente disponíveis (pAb de cabra da R&D, pAb de coelho da eBioscience e pAb de coelho da Peprotech) cada uma ligada tanto à forma nativa quanto à desnaturada de hLIGHT solúvel. O pAb de cabra da R&D imunoespecificamente se liga a concentrações levemente mais baixas de hLIGHT nativo (o limite mais baixo de detecção é de 0,04 ng de hLIGHT nativo) quando comparado ao hLIGHT desnaturado (o limite mais baixo de detecção é de 0,13 ng de hLIGHT desnaturado). O pAb de coelho da eBioscience também imunoespecificamente se liga a concentrações levemente mais baixas de hLIGHT nativo (o limite mais baixo de detecção é de 0,4 ng de hLIGHT nativo) quando comparado com o hLIGHT desnaturado (o limite mais baixo de detecção é de 1,2 ng de hLIGHT desnaturado). Similarmente, o pAb de coelho da Peprotech também imunoespecificamente se liga a concentrações levemente mais baixas de hLIGHT nativo (o limite mais baixo de detecção é de 0,04 ng de hLIGHT nativo) quando comparado com hLIGHT desnaturado (o limite mais baixo de detecção é de 0,13 ng de hLIGHT desnaturado).
[00451 ] Inibição da atividade biológica de células que expressam um receptor de hLIGHT. Experimentos também foram empreendidos como descrito no Exemplo 1 para determinar se os anticorpos anti-hLIGHT monoclonais de camundongo comercialmente disponíveis foram capazes de bloquear competitivamente hLIGHT solúvel da ligação ao LTβR e HVEM expressado na superfície da célula em células HT29.14s. Os resultados são apresentados na FIG. 17 (CCL20) e FIG. 18 (RANTES) e mostram que nem o mAb de camundongo da R&D nem o mAb de camundongo da Abnova foram capazes de inibir a produção de quimiocina CCL20 ou RANTES mediada por LIGHT por estas células, ao passo que os mAbs E13 humano e F23 humano foram capazes de reduzir a secreção de quimiocina aos níveis de fundo.
EXEMPLO 3 - CARACTERIZAÇÃO DE CADEIAS CAPA DE F19 E E1 Anticorpo anti-hLIGHT humano
[00452] Os procedimentos debatidos no Exemplo 1 foram usados para encontrar um par de cadeia capa-cadeia pesada preferido dos anticorpos produzidos pelos hibridomas de E1 e F19. Com base nos resultados destes experimentos, foi mostrado que Elcapa(B) (SEQ NO: 6) é a cadeia leve capa preferida dos anticorpos de hLIGHT produzidos pelo hibridoma E1 e Fl9capa(B) (SEQ ID NO: 9) é a capa cadeia leve preferida dos anticorpos de hLIGHT produzidos pelo hibridoma de F19.
[00453] Os anticorpos de cadeia capa única recombinantes foram gerados pela transfecção transitória de vetores de expressão de mamífero contendo os genes da cadeia pesada emparelhados com cada um dos genes da cadeia capa individuais que existiram nas células de hibridoma precursoras. Este material foi depois testado em paralelo com os anticorpos purificados gerados a partir dos respectivos hibridomas precursores.
[00454] Os ensaios de ligação de anticorpo foram realizados como descrito no Exemplo 1. O par cadeia capa-cadeia pesada que compreende E1capa(B) ou F19capa(B) especificamente tingiu as linhagens de célula estavelmente transfectadas com hLIGHT, (HEK 293-hLIGHT) a um grau equivalente comparado com os respectivos anticorpos produzidos com hibridoma precursor (FIG. 19).
[00455] Os experimentos de ELISA do bloqueio cruzado foram realizados como indicado no Exemplo 1 e os resultados indicaram que estes anticorpos recombinantes reconhecem os mesmos epítopos em hLIGHT como seus Abs de hibridoma precursor (Figura 20).
[00456] Os anticorpos recombinantes de cadeia capa única foram testados ainda como descrito no Exemplo 1 quanto a sua capacidade para bloquear a ligação de hLIGHT expressado na superfície da célula às formas de fusão de receptor-Fc solúveis Tanto do HVEM quanto do LTβR humanos (FIG. 21), Os níveis de bloqueio não foram idênticos para os Abs precursores.
[00457] Finalmente, os anticorpos capa únicos recombinantes foram testados quanto a sua capacidade para inibir a secreção de CCL20 mediada por LIGHT a partir de células epiteliais colônicas HT29 como descrito nos Exemplos 1 e 2 (FIG. 22 e FIG. 23). Nestes experimentos, a incubação de hLIGHT solúvel com anticorpos anti-hLIGHT bloqueia a secreção mediada por hLIGHT de CCL20 a partir de células HT29.14s similares aos hibridomas precursores.
[00458] Além disso, os recombinantes de cadeia capa única também mantém a especificidade dos anticorpos produzidos pelo hibridoma precursor na avaliação por dot blot de LIGHT nativo vs. desnaturado (dados não mostrados).
[00459] Juntos, estes resultados indicam que o E1 capa(B) (SEQ ID NO: 6) é a cadeia capa leve preferida para o uso em combinação com a cadeia pesada E1 (SEQ ID NO: 1) e o F19capa(B) (SEQ ID NO: 9) é a cadeia capa leve preferida para o uso em combinação com a cadeia pesada F19 (SEQ ID NO: 4).
EXEMPLO 4 - LIGAÇÃO DE ANTICORPO E BLOQEUIO MEDIADO POR ANTICORPO DA LIGAÇÃO DE HVEM:Fc E LTβR:Fc ÀS VARIANTES DE POLIMORFISMO DE NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNP) DE LIGHT
[00460] Pelo menos duas variantes de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) não sinonimas existem para LIGHT humano (FIG. 24). Uma variante de SNP codifica um ácido glutâmico (E) ou uma lisina (K) na posição de aminoácido 214 e a outra variante de SNP codifica uma serina (S) ou uma leucina (L) na posição de aminoácido 32. Como mostrado nas FIGS. 24A-24B, a freqüência alélica de cada variante de SNP através de uma variedade de populações étnicas varia. Assim, anticorpos de hLIGHT que se ligam a uma dada variante de SNP podem ser mais eficazes no tratamento ou prevenção de uma doença mediada por hLIGHT ou sintoma deste nestas populações étnicas tendo uma incidência mais alta da variante SNP dada.
[00461] Neste exemplo, os anticorpos de hLIGHT aqui fornecidos foram mostrados ligar variantes de SNP de hLIGHT não sinônimas que estão presentes nos domínios extracelular e citoplásmico de hLIGHT. A ligação destes anticorpos às variantes de SNP também correlacionaram com a capacidade do anticorpo para bloquear eficazmente HVEM:Fc e LTβR:Fc à variante de SNP de hLIGHT e também bloquear eficazmente a atividade biológica das células que expressa um receptor de hLIGHT.
[00462] Ligação de Anticorpo. As titulações de dose de anticorpos F23 e E1 capa(B) foram realizadas como no Exemplo 1 para determinar se estes anticorpos ligam variantes de SNP de hLIGHT expressado na superfície da célula. Uma linhagem de célula EL4 foi usada nestes experimentos, que foi preparada essencialmente como descrito no Exemplo 1 e estavelmente expressada na superfície da respectiva variante SNP de hLIGHT. Como mostrado nas FIGS 25A e 25C, respectivamente, cada um dos anticorpos F23 e E1capa(B) ligou ambas as variantes de SNP 214E-32S e 214E-32L. Entretanto, como mostrado na FIG. 25B, apenas o anticorpo F23 e não o E1capa(B), reconheceu a variante SNP 214K-32S.
[00463] Os anticorpos F23 (um IgG1), F19, E63 e E1capa(B) também foram testados para determinar se houve uma diferença entre a capacidade dos “anticorpos F” e dos “anticorpos E” para reconhecer cada forma da variante de SNP. Como mostrado nas FIGs. 26A e 26B, os anticorpos F23 e F19 ligam-se a ambas as formas de SNP 214E e 214K de hLIGHT. Entretanto, os anticorpos E63 e E1capa(B) ligam apenas a forma predominante de LIGHT 214E e não a 214K (FIGS. 26A e 26B).
[00464] Atividade de bloqueio de anticorpos para a ligação de HVEM:Fc e LTβR:Fc à variante de SNP de LIGHT 214K-32S. Visto que o anticorpo F23 ligou tanto a forma predominante (214E) quanto a forma menos predominante (214K) das variantes de LIGHT, foi em seguida determinado se o anticorpo F23 bloquearia a ligação de HVEM:Fc ou LTβR:Fc. O bloqueio mediado pelo anticorpo das proteínas de fusão receptoras foi realizado como no Exemplo 1. Em resumo, a linhagem de célula EL4-214K-32S foi incubada com quantidades crescentes de anticorpos anti-LIGHT seguido pela adição de HVEM:Fc ou LTβR:Fc. Os efeitos desta pré incubação sobre a ligação ao receptor foram avaliados pela detecção de HVEM:Fc ou LTβR:Fc como no Exemplo 1. Como mostrado na FIG. 25D, o anticorpo F23 eficazmente bloqueou tanto a ligação de HVEM:Fc quanto a de LTβR:Fc à variante 214K-32S de LIGHT.
[00465] Inibição da atividade biológica mediada pela variante de SNP de LIGHT da superfície celular de células que expressa um receptor de LIGHT. Este estudo foi empreendido para determinar se os anticorpos anti- hLIGHT humanos monoclonais anteriormente mostrados que se ligam a ambas as variantes de SNP de hLIGHT 214K e 214E foram também capazes de bloquear eficazmente a secreção de RANTES em células epiteliais colônicas humanas, HT29.14s, que expressam tanto LTβR quanto HVEM, pelas variantes de SNP 214E ou 214K de hLIGHT expressado na superfície da célula ou variantes de SNP de hLIGHT solúvel deste. No ensaio de indução de RANTES em HT29.14s mediada por LIGHT expressado na superfície celular, quantidades classificadas de anticorpos anti-hLIGHT foram pré-incubadas com um número constante de células quee expressam variantes SNP de hLIGHT (214K ou 214E). Os níveis de quimiocina foram ensaiados no dia 3 pós-tratamento e comparados aos níveis induzidos pelo hLIGHT solúvel sozinho, células que expressa hLIGHT sozinho ou células pré- incubadas com uma IgG human irrelevante como uma proteína de controle de isótipo.
[00466] Nestes ensaios, os anticorpos aqui fornecidos (F19 e F23) bloquearam a indução de RANTES induzida por hLIGHT solúvel e ambas as variantes de SNP de hLIGHT expressado na superfície celular (214E ou 214K) em uma maneira dependente da dose. O anticorpo anti-hLIGHT monoclonal de camundongo comercialmente disponível da R&D Systems (o mAb de camundongo da R&D, como no Exemplo 1) não foi capaz de bloquear a secreção de quimiocian mediada por hLIGHT solúvel ou expressado na superfície celular, independente da variante de SNP. Os controles positivos tanto de variantes de hLIGHT expressado na superfície da célula quanto de hLIGHT recombinante solúvel induziram níveis equivalentes de RANTES e a pré-incubação do hIgG de isótipo de controle negativo com as variantes de hLIGHT expressado na superfície da célula ou hLIGHT recombinante solúvel não reduziram os níveis de RANTES significantemente.
[00467] Debate. Dos trinta polimorfismos de nucleotídeo único positivo (SNPs) no local genômico de hLIGHT, pelo menos dois hLIGHT não sinônimos existem com dados de freqüência associados com eles (FIG. 24). Um codifica um ácido glutâmico (-0,9) ou uma lisina (0,1) na posição de aminoácido 214 de hLIGHT e reside na região extracelular de hLIGHT. O outro codifica uma serina (0,99) ou uma leucina (0,011) no resíduo de aminoácido 32 e reside na região citoplásmica de hLIGHT. O local genômico de hLIGHT reside em uma região cromossômica, ch19p13.3, que contém um local de suscetibilidade para a doença do intestino inflamatório (Rioux et al. (2000) Am J Hum Genet. 66: 1863-70) e assim sugere que um SNP pode ser um correlato da freqüência da doença de IBD. Portanto, foi de interesse determinar se os anticorpos anti-hLIGHT antagonísticos aqui fornecidos foram capazes de reconhecer variantes de SNP não sinônimas de hLIGHT.
[00468] Neste exemplo, nós testamos a capacidade dos anticorpos anti- hLIGHT para ligar variantes SNP de hLIGHT estavelmente expressadas na superfície de linhagens de célula EL4. Como mostrado nas FIGS 25A e 25B, F23 liga ambas as variantes de SNP 214E e 214K, enquanto E1capa(B) liga apenas a forma predominante 214E. F23 igualmente bloqueia a ligação de HVEM:Fc ou LTβR:Fc a estas células (FIG. 25D). Como esperado, o SNP citoplásmico não parece afetar a ligação de cada anticorpo (FIG. 25C). Quando “anticorpos E” e “anticorpos F” foram testados, apenas os anticorpos F foram capazes de se ligar a ambas variantes de SNP 214K e 214E (FIGS. 26A e 26B). O anticorpo de mAb de camundongo da R&D comercial também foi capaz de ligar ambas as variantes de SNP (dados não mostrados).
[00469] Além do bloqueio do anticorpo anti-hLIGHT de versões solúveis dos receptores para as variantes de SNP de LIGHT in vitro, a indução de quimiocina mediada por SNP de hLIGHT de superfície celular também foi inibida pelos anticorpos anti-hLIGHT desta invenção. Neste ensaio, as linhagens de célula EL4 que expressam as variantes de SNP de hLIGHT 214E ou 214K foram fixadas com formalina e usadas para tratar a linhagem de célula epitelial colônica HT29. Como mostrado na FIG. 27, estas linhagens de célula sozinhas induziram níveis similares de RANTES comparados a 1 μg de LIGHT solúvel. Os “anticorpos F” Anti-hLIGHT foram testados pré-incubando-se as linhagens de célula que expressam hLIGHT com quantidades classificadas de anticorpo e comparada com os controles de isotipo ou o mAb de camundongo comercialmente disponível da R&D. Tanto F23 e F19capa(B) inibiram a secreção de RANTES mediada pela variante de SNP que expressa a linhagem celular. Entretanto, o mAb de camundongo da R&D e o controle negativo de isotipo humano não inibem a secreção de RANTES pela variante de SNP de LIGHT. Isto foi a despeito do fato de que o mAb de camundongo da R&D foi capaz de ligar ambas as variantes de SNP. Estes resultados não apenas demonstram que os anticorpos F23 e F19capa(B) desta invenção bloqueiam a sinalização pela variante de SNP de LIGHT, mas também demonstram superioridade ao mAb de camundongo comercial da R&D.
EXEMPLO 5 - ESTUDO DA EFICÁCIA IN VIVO DE 124F23 NO MODELO DA DOENÇA DO ENXERTO VERSUS HOSPEDEIRO XENOGÊNICA AGUDA
[00470] Neste exemplo, a eficácia in vivo de um anticorpo anti- hLIGHT aqui fornecido foi avaliada em um modelo de doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) xenogênica aguda de murino. O anticorpo F23 foi mostrado neste modelo diminuir a patologia principal global (diarréia, inflamação peritoneal e ascite e inflamação intestinal) e histopatologia (severidade da inflamação, extensão da inflamação, dano/atrofia de vilosidade e envolvimento percentual), assim como uma diminuição no número de células T no baço.
[00471] Purificação de PBMC humana a partir do sangue integral: O sangue integral foi coletado de doadores saudáveis entre as idades de 18 e 50 pelo programa de doador de sangue normal no Scripps Green Hospital (La Jolla, CA) e heparina foi adicionada para prevenir a coagulação. Nenhuma raça, etnicidade ou gênero foi especificado. O sangue foi diluído em PBS e depois disposto em camada com FICOLL-PLAQUE Plus (Amersham Biosciences). As células mononucleares foram separadas do soro e as plaquetas pela centrifugação a 1800 RPM sem a ruptura. A interface contendo a PBMC foi depois coletada e lavada duas vezes com PBS.
[00472] Modelo In Vivo da Doença do Enxerto Versus Hospedeiro Aguda: Um modelo da doença do enxerto versus hospedeiro xenogênica aguda foi usado para testar o potencial terapêutico do anticorpo humano anti-LIGHT de F23 (124F23G1) humano in vivo (Watanabe et al. 2006 1006. Clin Immunol. 120 247-59), essencialmente como esboçado na FIG. 28. Em resumo, camundongos machos imunodeficientes combinados severos (SCID) de idade de 5 a 10 semanas foram injetados no dia -2 com 20 μg de receptor IL2 beta anti-camundongo de rato (anticorpo da cadeia IL2Rβ) (TMβ1, Tanaka et al. 1993 J Exp Med. 178 1103) para esgotar as células matadoras naturais de murino. No dia seguinte (dia -1), os camundongos receberam 2,5 Gy de irradiação sub-letal usando uma fonte de césio para permitir a migração das células humanas ao trato intestinal. No dia seguinte (dia 0) os camundongos receberam 10 milhões de células mononucleares de sangue periférico humano total em PBS pela injeção intraperitoneal seguido imediatamente pela injeção intravenosa de anticorpos LIGHT anti-humano humanos (124F23G1) ou hIgG1 humano de controle negativo (anti- dinitrofenol (anti-DNP), Kirin Brewery Co. Ltd.) em uma dose de 100 μg em 100 μl de PBS. As células T humanas expandem e induzem uma doença equivalente à do enxerto versus hospedeiro e sintomas desta, resultando, por exemplo, em perda de peso, hematuria, hidroperitôneo, infiltrados de célula inflamatória no fígado e trato intestinal e eventualmente em morte. A doença é primariamente mediada pelas células T humanas visto quee a transferência de células T sozinhas induz sintomas similares. O peso corporal foi determinado a cada 3-4 dias e os camundongos receberam o anticorpo anti- IL2R13 semanalmente. No dia 12 os camundongos foram sacrificados e analisados quanto a patologia principal e sintomas de doença, os baços foram coletados para a análise citométrica de fluxo e os cecos para histologia e o soro foi coletado para a análise de citocina e anticorpo humanos (Watanabe et al. 1006. Clin Immunol. 120 247-59).
[00473] Análise funcional In Vivo de anticorpos monoclonais humanos de LIGHT anti-humano. A patologia principal observada no dia 12 foi marcada como segue: diarréia (0 ou 1), hemorragia no intestino e cavidade peritoneal e peritonite (cada classificada 0, 1, 2 ou 3 como nenhuma, branda, moderada ou severa, respectivamente). A soma de todos os sintomas de doença foi usada para determinar a contagem da patologia principal total. Como mostrado na FIG. 29, camundongos que receberam o anticorpo de controle ou PBMCs sozinho (nenhuma injeção de anticorpo) todos demonstraram sintomas de GVHD, com contagens de patologia mais alta do que os camundongos que receberam anticorpo anti-LIGHT 124F23G1.
[00474] A análise histopatológica foi realizada em seções H&E do ceco e classificadas como segue: severidade da inflamação, extensão da inflamação, dano/atrofia de vilosidade e envolvimento percentual (cada uma classificada 0, 1, 2 ou 3 como nenhuma, branda, moderada ou severa, respectivamente). A contagem final foi uma soma de cada categoria, com uma contagem máxima de 12 para cada camundongo. Como mostrado na FIG. 30, os camundongos que receberam o anticorpo de controle ou PBMCs sozinhas (nenhuma injeção de anticorpo) tiveram histopatologia similar, ao passo que os camundongos injetados com 124F23G1 não tiveram nenhum sinal histológico de doença. Um exemplo da histologia do ceco observado nos animais tratados com anti-LIGHT é ilustrado na FIG. 31 A, que mostra uma estrutura de vilosidade, sub-mucosa e camada muscular uniformes, assim como uma falta de ascite ou sangue. Ao contrário, a histologia do ceco de um animal tratado com anticorpo de controle tem marcas proeminentes da doença, incluindo sub-mucosa cheia com ascite, sinais de hemorragia intestinal indicada pelos grupos de eritrócitos e infiltrados de linfócito proeminentes (FIG. 31 B).
[00475] As análises dos baços estavam de acordo com a patologia principal e histopatologia. As células T humanas estavam presentes nos baços de camundongos tratados com os anticorpos de controle, mas o número de células T humanas em animais tratados com 124F23G1 foi significantemente mais baixo do que o número de células T nos animais de controle (FIG. 32).
[00476] Nos estudos de seguimento, ambas as versões a que esgota a célula T (IgG1) e/ou a que não esgota (IgG4PE) dos anticorpos anti-hLIGHT podem ser usadas para avaliar o mecanismo de melhora da doença, tal como se as células T estão sendo bloqueadas pelo anticorpo ou ao invés sofrem apoptose.
[00477] Debate: A Doença do ennxerto versus hospedeiro aguda (GVHD) é uma complicação maior associada com o transplante de células tronco hematopoiéticas alogênicas. A GVHD é no geral definida como o ataque amplo contra tecidos do hospedeiro pelas células T do doador. A seguir do transplante, a imunossupressão sistêmica é o método corrente para prevenir a GVHD, entretanto isto pode levar às infecções patogênicas oportunísticas e a recaída da leucemia. Portanto, o bloqueio dos sinais co- estimulatórios de célula T é uma das alternativas mais promissoras em relação aos imunossupressores. Relatos recentes indicam que a co-estimulação por LIGHT-HVEM de células T desempenha um papel patogênico crítico na GVHD (Xu et al. (2007) 109: 4097-4104). Assim, anticorpos anti-LIGHT antagonísticos podem ter eficácia terapêutica para GVHD. A eficácia in vivo demonstrada no modelo de GVHD xenogênico agudo demonstra este potencial.
[00478] Um modelo xenogênico agudo de GVHD onde PBMCs humanas são injetadas em camundongos SCID sub-letalmente irradiados esgotou as células NK (FIG. 28). Neste modelo, a irradiação inicia o dano intestinal e as células T medeiam para a inflamação intestinal da doença. Os animais mostram sinais severos da doença dentro de aproximadamente 12 dias após a injeção de PBMC. As marcas da doença incluem a inflamação intestinal manifestada em hemorragia, ascite e atrofia de vilosidade. Em um estudo inicial, o tratamento de camundongos com 100 microgramas de anticorpo anti-LIGHT (124F23G1) reduziu a patologia principal observada no intestino (FIG. 29). Igualmente esta redução foi corroborada por uma análise mais refinada pela histopatologia do ceco, onde o tratamento com anticorpo anti-LIGHT leva a nenhuma doença detectável (FIG. 30). A FIG. 31A mostra a seção tingida com H&E representativa do ceco de um animal tratado com anti-LIGHT. Ao contrário, o ceco de um animal tratado com anticorpo de controle demonstra marcas de inflamação grave no intestino, incluindo manchas vermelhas de células indicativas de hemorragia, a sub-mucosa cheia de fluido totalmente curvada e infiltrado de linfócito (FIG, 31 B). Neste modelo, as células T humanas transferidas são primariamente responsáveis pela indução de doença e os números de célula T esplênicas tendem a correlacionar-se com a gravidade da doença. O tratamento com anticorpo anti-LIGHT significantemente reduziu os números de célula T humana totais no baço (FIG. 32). Assim, quando juntos, estes dados indicam que os anticorpos anti-LIGHT mostraram eficácia in vivo neste modelo, reduzindo significantemente os sinais de doença em relação ao controle negativo. EXEMPLO 6 - ANÁLISE CRISTALOGRÁFICA DE RAIO X DE UMA INTERAÇÃO DE ANTICORPO LIGHT/ANTI-LIGHT HUMANO (F23) O anticorpo F23G1 (ou fragmento Fab deste) é usado para avaliar a natureza do reconhecimento preferencial de hLIGHT trimérico nativo. A análise estrutural possibilita a identificação de contatos específicos de resíduos de aminoácido entre o anticorpo anti-hLIGHT e a molécula hLIGHT para definir ainda mais o epítopo conformacional reconhecido pelo anticorpo. A cristalização de complexos de Fab LIGHT-anti-LIGHT é realizada pelos métodos padrão de difusão de vapor por sitting drop (ver, por exemplo, McRee 1993 Em: Practical Protein Crystallography (Academic Press, San Diego, CA) at pp. 1-23; Rhodes 1993 Em: Crystallography Made Crystal Clear (Academic Press, San Diego, CA) at pp. 8-10, 2938. Os cristais são analisados usando um SYNCHROTRON e os dados analisados usando o conjunto de software CCP4 (Science & Technology Facilities Council, Computational Science and Engineering Department), que é uma coleção de programas diferentes que abrangem a maior parte das computações requeridas para a cristalografia macromolecular. Como aqueles habilitados na técnica avaliarão, outros anticorpos de hLIGHT aqui fornecidos podem ser similarmente usados para determinar a ligação de epítopo de hLIGHT e resíduos de contato de aminoácido.
EXEMPLO 7 - ESTUDO DA EFICÁCIA IN VIVO DE 124F23 NO MODELO DA DOENÇA DE COLITE Modelo de transferência de célula T humana de colite.
[00479] Análogo ao modelo de transferência de CD4+/CD45Rbhi de colite de camundongo descrito em Morrissey et al. (1993) J Exp Med. 178 237, camundongos RAG-/- são injetados com células T ingênuas humanas (CD45RA+CD45RO-). Neste modelo, uma cepa HLA transgênica (C57BL/6NTac-[KO]Abb-[Tg]DR-4) igualada ao tipo HLA de um doador humano é retrocruzada em um fundo RAG-/- (B6.129S6-Rag2tmIFwaN12) para possibiltar a apresentação de antígeno entre APCs do camundongo receptor e as células T doadoras humanas. Esta interação é necessária para o reconhecimento de célula T da microflora do intestino, que é considerada ser responsável pela ativação e retorno das células T para o intestino. Os animais experimentaram perda de peso e doença enfraquecedora, junto com inflamação intestinal not observada nos camundongos RAG-/-. Em certos grupos, um anticorpo anti-hLIGHT humano (por exemplo, F23) é administrado em uma dose de 100 μg (ou, por exemplo, variando de 2 μg - 500 μg) por animal pela injeção intravenosa simultaneamente com a administração de célula T doadora humana. Em certos grupos, o anticorpo anti-hLIGHT é administrado em vários intervalos de tempo antes e/ou depois da administração de célula T doadora humana. Porque os anticorpos anti-LIGHT ligam LIGHT expressado na superfície de células T ativadas, os sintomas de doença são prevenidos e/ou tratados. Em estudos de seguimento, tanto as versões de esgotamento de célula T (IgG1) e/ou a de não esgotamento (IgG4PE) dos anticorpos anti-hLIGHT podem ser usadas para avaliar o mecanismo de melhora da doença. Por exemplo, anticorpos anti-LIGHT IgG4 são capazes de bloquear a co-estimulação e sobrevivência de célula T.
EXEMPLO 8 - MODELO DE IBD DE DOENÇA HUMANA EM CAMUNDONGOS SILENCIADOS EM LIGHT HUMANO
[00480] Como debatido aqui em outro lugar, LIGHT foi anteriormente implicado na patologia da doença de IBD (ver, por exemplo, Wang et al. 2005 J. Immunol. 174: 8173-82; Wang et al. 2004 J. Clin. Invest. 113: 826-35; Cohavy et al. 2005 J. Immunol. 174: 646-53). Neste exemplo, um modelo de camundongo silenciado em hLIGHT de IBD é criado e os anticorpos humanos anti-hLIGHT monoclonais da invenção são administrados ao animal para avaliar a eficácia in vivo destes anticorpos no tratamento da IBD. Porque estes anticorpos foram anteriormente mostrados bloquear a ligação do receptor de hLIGHT, a atividade de bloqueio biológica de hLIGHT (ver, por exemplo, os Exemplos de 1 a 4) e tratamento de GVHD (Exemplo 5), é esperado que os anticorpos de hLIGHT da invenção também sejam eficazes no tratamento da IBD.
[00481] Geração do Silenciamento de LIGHT. Camundongos rompidos no gene de LIGHT de camundongo que também têm uma inserção alvejada do gene humano de LIGHT são gerados usando métodos padrão de alvejamento de gene pela recombinação homóloga. Em resumo, as células ES de camundongo alvejadas ao gene são produzidas pela eletroporação de uma construção alvejadora de gene em células ES do tipo selvagem. A recombinação homóloga entre o genoma da célula ES e duas regiões de homologia no vetor de alvejamento que flanqueia o gene LIGHT humano resultando na substituição do gene LIGHT do camundongo com o gene LIGHT humano. Um blastocisto é depois implando em fêmeas pseudo- grávidas levando à geração de camundongo quimérico. O cruzamento produz os animais silenciados em LIGHT homólogos.
[00482] Modelos IBD de doença humana. Os animais silenciados em hLIGHT são usados em modelos estabelecidos de IBD. Um modelo estabelecido de IBD inclui a administração de dextran sulfato de sódio (DSS) na água de beber (ver, por exemplo, Mahler et al. 1998 Am J Physiol. 274G544-51). Em resumo, a colite experimental é induzida dando-se 3,5 % (p/v) de DDS (peso mol. 36.100-45.000; TbD Consultancy, Uppsala, Suécia) na água de beber acidificada ad libitum por 5 dias. A administração de DDS é depois interrompida e os camundongos recebem apenas água de beber acidificada por 16 dias até a necropsia no dia 21. Esta dose induz colite moderada a severa enquanto minimiza a mortalidade, embora outras doses possam ser usadas. O intestino grosso é depois coletado e o ceco é separado do cólon. A fixação de tecido e tingimento com H&E padrão são depois realizados para determinar a severidade da inflamação e lesões. Os camundongos são avaliados quanto a patologia, histopatologia, síndrome de enfraquecimento e/ou morte.
[00483] Um segundo modelo estabelecido de IBD inclui a administração retal de ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) (ver, por exemplo, Neurath, et al. 1995 J Exp Med. 182 1281-90). Em resumo, para induzir colite, camundongos são levemente anestesiados com metofano e um cateter 3,5F é depois cuidadosamente inserido no cólon, tal que o tempo seja de cerca de 4 cm. proximal ao ânus. Para induzir a colite, 0,5 mg de reagente de hapteno TNBS (Sigma, St. Louis, MO) em 50 % de etanol (para romper a barreira instestinal) é inserido no lumen do cólon por intermédio do cateter adaptado em uma seringa de 1 ml. Nos experimentos de controle, os camundongos recebem apenas 50 % de etanol. O volume de injeção total é de 100 μl em ambos os grupos deixando o TNBS ou etanol atingir o cólon inteiro, incluindo o ceco e o apêndice. Os animais são depois mantidos em uma posição vertical por 30 segundos e retornados para suas gaiolas. ou o modelo de transferência de CD4+/CD45Rbhi de colite de camundongo (ver, por exemplo, Morrissey, et al. 1993 J Exp Med. 178 237-44). Anticorpos anti-LIGHT pode der depois usados para o tratamento e prevenção da doença estabelecida, tal como em doses de 2 a 500 μg por animal, essencialmente como descrito acima. O intestino grosso é depois coletado e o ceco é separado do cólon. Em vários pontos de tempo depois disso, o intestino é removido e a fixação de tecido e tingimento com H&E padrão são depois realizados para determinar a severidade da inflamação e lesões. Os camundongos são avaliados quanto a patologia, histopatologia, síndrome de enfraquecimento e/ou morte.
[00484] Um terceiro modelo estabelecido de IBD é o modelo da transferência de CD4+/CD45RBhi de colite de camundongo (ver, por exemplo, Morrissey, et al. 1993 J Exp Med. 178 237-44). Em resumo, as células T de linfonodo CD4+ purificada são classificadas de acordo com a sua expressão de CD45RB e injetada nos camundongos silenciados em hLIGHT. A fixação de tecido padrão e tingimento de H&E é depois realizada para determinar a severidade da inflamação e lesões. Os camundongos são avaliados quanto a patologia, histopatologia, síndrome de enfraquecimento e/ou morte.
[00485] Os anticorpos anti-LIGHT (por exemplo, doses de 2 a 500 μg por animal) podem ser usados com qualquer modelo de IBD, tal como aqueles descritos acima, para avaliar a eficácia no tratamento e prevenção de IBD, essencialmente como descrito acima. Porque estes anticorpos foram anteriormente mostrados bloquear a ligação do receptor de hLIGHT, a atividade de bloqueio biológico de hLIGHT (ver, por exemplo, os Exemplos de 1 a 4) e tratamento de GVHD (Exemplo 5), é esperado que os anticorpos de hLIGHT da invenção também são eficazes no tratamento da IBD.
[00486] As formas de realização da presente invenção descritas acima são intencionadas a serem meramente exemplares e aqueles habilitados na técnica reconhecerão ou serão capazes de averiguar usando não mais do que experimentação de rotina, numerosos equivalentes para os procedimentos específicos aqui descritos. Todos de tais equivalentes são considerados como estando dentro do escopo da presente invenção e são abrangidos pelas seguintes reivindicações. Além disso, como usado neste relatório descritivo e reivindicações, as formas singulares “um,” “uma” e “o”, “a” incluem formas plurais a menos que o conteúdo claramente dite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a “um anticorpo” inclui uma mistura de dois ou mais de tais anticorpos e outros. Adicionalmente, os técnicos ordinariamente habilitados reconhecerão que sequências operacionais devem ser apresentadas em alguma ordem específica para o propósito de explicação e reivindicação, mas a presente invenção considera várias mudanças além de tal ordem específica.
[00487] Os conteúdos de todas as referências aqui descritas são por meio deste incorporados por referência.
[00488] Outras formas de realização estão dentro das seguintes reivindicações.

Claims (15)

1. Anticorpo isolado, caracterizadopelo fato de que se liga a um epítopo de hLIGHT, em que o anticorpo compreende: A. (a) uma VH de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo o Acesso ATCC No PTA-7819; e (b) uma VL de um anticorpo produzido pelo hibridoma tendo o Acesso ATCC No PTA-7819, ou B. (b) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo o Acesso ATCC No PTA-7819; e (c) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo o Acesso ATCC No PTA-7819.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é produzido pelo hibridoma tendo o Acesso ATCC No PTA-7819.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VH) tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4; e (b) uma sequência variável de cadeia leve (VL) tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das sequências de SEQ ID Nos: 90, 91 ou 92.
4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (1) um CDR1 de VH de SEQ ID NO: 20; (2) um CDR2 de VH de SEQ ID NO: 21; e (3) um CDR3 de VH de SEQ ID NO: 22; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo um VL selecionado do grupo que consiste de: (1) um CDR1 de VL de SEQ ID NO: 93, um CDR2 de VL de SEQ ID NO: 96 e um CDR3 de VL de SEQ ID NO: 99; (2) um CDR1 de VL de SEQ ID NO: 94, um CDR2 de VL de SEQ ID NO: 97, e um VL de CDR3 de SEQ ID NO: 100; e (3) um CDR1 de VL de SEQ ID NO: 95; um CDR2 de VL de SEQ ID NO: 98 e um CDR3 de VL de SEQ ID NO: 101.
5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio constante de IgG.
6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio constante de IgG1 ou IgG4.
7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo totalmente humano, ou o anticorpo é um anticorpo quimérico ou humanizado, ou o anticorpo é um fragmento de ligação de antígeno, ou o anticorpo é um fragmento de Fab, fragmento de F(ab’)2, Fv de cadeia única (sFv), diacorpo, triacorpo ou minicorpo.
8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal ou um anticorpo recombinante.
9. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido nas reivindicações 1 a 8.
10. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelo fato de que (i) compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica (a) uma sequência de aminoácido de VH de um anticorpo produzido por um hibridoma depositado como Acesso ATCC No PTA-7819; e (b) uma sequência de aminoácido de VL de um anticorpo produzido por um hibridoma depositados como Acesso ATCC No PTA-7819; ou (ii) compreende uma sequência de ácido nucléico que codifica: (a) uma CDR1 de VH, CDR2 de VH e CDR3 de VH de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo o Acesso ATCC No PTA-7819 e (b) uma CDR1 de VL, CDR2 de VL e CDR3 de VL de um anticorpo produzido por um hibridoma tendo o Acesso ATCC No PTA-7819; ou (iii) compreende ou que consiste de uma sequência de ácido nucléico que codifica um anticorpo produzido por um hibridoma depositado como Acesso ATCC No PTA-7819; (iv) compreende (a) uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 44; e (b) uma sequência mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nos: 104, 105 ou 106.
11. Vetor, caracterizadopelo fato de que compreende a molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 10.
12. Método para produzir um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizadopelo fato de compreender cultivar uma célula hospedeira que compreende um vetor como definido na reivindicação 11 sob condições que promovam a produção do anticorpo.
13. Hibridoma, caracterizadopelo fato de que produz um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
14. Hibridoma de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que tem o Acesso ATCC No PTA-7819.
15. Kit, caracterizadopelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou a composição como definida na reivindicação 9.
BRPI0716088A 2006-08-28 2007-08-24 anticorpo isolado, composição, molécula de ácido nucléico isolada, vetor, método para produzir um anticorpo, hibridoma, e, kit BRPI0716088B8 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US84077406P 2006-08-28 2006-08-28
US60/840774 2006-08-28
US89787507P 2007-01-25 2007-01-25
US60/897875 2007-01-25
PCT/US2007/018832 WO2008027338A2 (en) 2006-08-28 2007-08-24 Antagonistic human light-specific human monoclonal antibodies

Publications (4)

Publication Number Publication Date
BRPI0716088A2 BRPI0716088A2 (pt) 2013-10-01
BRPI0716088A8 BRPI0716088A8 (pt) 2020-03-31
BRPI0716088B1 true BRPI0716088B1 (pt) 2020-12-08
BRPI0716088B8 BRPI0716088B8 (pt) 2021-05-25

Family

ID=39126775

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0716088A BRPI0716088B8 (pt) 2006-08-28 2007-08-24 anticorpo isolado, composição, molécula de ácido nucléico isolada, vetor, método para produzir um anticorpo, hibridoma, e, kit

Country Status (29)

Country Link
US (4) US8058402B2 (pt)
EP (3) EP2484696B1 (pt)
JP (2) JP5209625B2 (pt)
KR (2) KR101374983B1 (pt)
AU (1) AU2007290570C1 (pt)
BR (1) BRPI0716088B8 (pt)
CA (1) CA2661782C (pt)
CO (1) CO6170363A2 (pt)
CR (1) CR10652A (pt)
CY (1) CY1114719T1 (pt)
DK (2) DK2484696T3 (pt)
EA (1) EA021255B1 (pt)
ES (2) ES2439994T3 (pt)
GT (1) GT200900043A (pt)
HR (1) HRP20131215T1 (pt)
IL (2) IL197158A (pt)
MA (1) MA31347B1 (pt)
MX (1) MX2009002151A (pt)
MY (1) MY162024A (pt)
NI (1) NI200900027A (pt)
NO (1) NO20091235L (pt)
NZ (2) NZ596091A (pt)
PL (1) PL2292663T3 (pt)
PT (1) PT2292663E (pt)
RS (1) RS53120B (pt)
SG (1) SG170032A1 (pt)
TN (1) TN2009000051A1 (pt)
TW (2) TWI405771B (pt)
WO (1) WO2008027338A2 (pt)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2824167C (en) * 2002-09-06 2018-09-25 Amgen Inc. Therapeutic human anti-il-1r1 monoclonal antibody
ES2439994T3 (es) * 2006-08-28 2014-01-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anticuerpos antagonistas monoclonales humanos específicos de LIGHT humano
US20090136427A1 (en) * 2007-09-18 2009-05-28 La Jolla Institute For Allergy And Immunology LIGHT Inhibitors For Asthma, Lung and Airway Inflammation, Respiratory, Interstitial, Pulmonary and Fibrotic Disease Treatment
US9700606B2 (en) * 2008-07-08 2017-07-11 La Jolla Institute For Allergy And Immunology HVEM/BTLA, HVEM/CD 160 and HVEM/gD cis complexes and methods of use
NZ592420A (en) 2008-10-02 2012-12-21 Emergent Product Dev Seattle Cd86 antagonist multi-target binding proteins
EP2411412B1 (en) * 2009-03-24 2015-05-27 Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. Humanized antibodies against light and uses thereof
US9982023B2 (en) 2011-11-15 2018-05-29 Sanford-Burnham Medical Research Institute Compositions and methods for treating autoimmune and inflammatory disorders
US20130315913A1 (en) 2012-03-26 2013-11-28 Sanofi Anti-light antibody therapy for inflammatory bowel disease
JP6265970B2 (ja) * 2012-03-26 2018-01-24 サノフイ 安定なＩｇＧ４に基づく結合剤の製剤
ES2702246T3 (es) * 2012-03-26 2019-02-28 Sanofi Sa Formulaciones de agente de unión IgG4 estables
US9592289B2 (en) * 2012-03-26 2017-03-14 Sanofi Stable IgG4 based binding agent formulations
JP6153019B2 (ja) 2013-01-31 2017-06-28 国立大学法人 東京大学 リゾホスファチジルセリン受容体機能調節活性を有する化合物
CN106170498A (zh) * 2014-01-14 2016-11-30 科马布有限公司 抗‑light抗体
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
TWI555513B (zh) * 2014-05-27 2016-11-01 奇美醫療財團法人奇美醫院 管體窄化監測裝置及其監測方法
JP6369721B2 (ja) 2014-07-04 2018-08-08 国立大学法人 東京大学 リゾホスファチジルセリン誘導体
MA41414A (fr) * 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
HK1257443A1 (zh) * 2015-08-21 2019-10-18 The Children's Hospital Of Philadelphia 治疗具有dcr3或dcr3网络基因中的遗传变异的患者的自身免疫病症的方法
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
US10610104B2 (en) 2016-12-07 2020-04-07 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
EP3554342B1 (en) 2016-12-14 2024-07-24 Biora Therapeutics, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tnf inhibitor
GB201701194D0 (en) * 2017-01-24 2017-03-08 Capella Bioscience Ltd Antigen binding molecules that bind light
US11312781B2 (en) 2018-01-24 2022-04-26 Capella Bioscience Ltd. Antigen binding molecules that bind LIGHT
WO2019246313A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a tnf inhibitor
US20220249814A1 (en) 2018-11-19 2022-08-11 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
EP4056232A4 (en) 2019-09-13 2023-09-13 Kyowa Kirin Co., Ltd. DCR3 VARIANT
WO2021102173A1 (en) * 2019-11-21 2021-05-27 Unity Biotechnology Antibodies directed to tie-2 and methods of use
CN121197633A (zh) 2019-12-13 2025-12-26 比特比德科有限责任公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
CN118818053A (zh) * 2020-04-01 2024-10-22 阿瓦洛治疗公司 涉及过量游离light的方法和治疗
EP4376888A4 (en) * 2021-07-26 2025-07-02 Avalo Therapeutics Inc METHODS OF TREATING ULCERATIVE COLITIS WITH ANTI-LIGHT ANTIBODIES
CA3240327A1 (en) * 2022-01-05 2023-07-13 Avalo Therapeutics, Inc. Methods of treating asthma with anti-light antibodies
CN119998321A (zh) 2022-09-27 2025-05-13 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性识别light的抗体及其应用
WO2025195443A1 (zh) * 2024-03-21 2025-09-25 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 特异性结合LIGHT和C5a的多特异性抗体以及组合物及其应用

Family Cites Families (246)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US452281A (en) 1891-05-12 Railway signaling device
US627366A (en) 1899-06-20 John treleaven
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US4044126A (en) 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
USRE28819E (en) 1972-12-08 1976-05-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Dialkylated glycol compositions and medicament preparations containing same
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4328245A (en) 1981-02-13 1982-05-04 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4410545A (en) 1981-02-13 1983-10-18 Syntex (U.S.A.) Inc. Carbonate diester solutions of PGE-type compounds
US4358603A (en) 1981-04-16 1982-11-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Acetal stabilized prostaglandin compositions
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4409239A (en) 1982-01-21 1983-10-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Propylene glycol diester solutions of PGE-type compounds
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
AU584417B2 (en) 1985-04-01 1989-05-25 Lonza Group Ag Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
ATE120454T1 (de) 1988-06-14 1995-04-15 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
EP0436597B1 (en) 1988-09-02 1997-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
US5734033A (en) 1988-12-22 1998-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antisense oligonucleotides inhibiting human bcl-2 gene expression
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0394827A1 (en) 1989-04-26 1990-10-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Chimaeric CD4-immunoglobulin polypeptides
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
WO1991006287A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Enzytech, Inc. Protein microspheres and methods of using them
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5585112A (en) 1989-12-22 1996-12-17 Imarx Pharmaceutical Corp. Method of preparing gas and gaseous precursor-filled microspheres
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
AU654811B2 (en) 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
IT1246382B (it) 1990-04-17 1994-11-18 Eurand Int Metodo per la cessione mirata e controllata di farmaci nell'intestino e particolarmente nel colon
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
WO1992006180A1 (en) 1990-10-01 1992-04-16 University Of Connecticut Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
US5543390A (en) 1990-11-01 1996-08-06 State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University Covalent microparticle-drug conjugates for biological targeting
DE69133036T2 (de) 1990-11-09 2003-02-06 Stephen D. Gillies Cytokine immunokonjugate
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
DE69123241T2 (de) 1990-12-14 1997-04-17 Cell Genesys Inc Chimärische ketten zur transduktion von rezeptorverbundenen signalwegen
DK0580737T3 (da) 1991-04-10 2004-11-01 Scripps Research Inst Heterodimere receptorbiblioteker ved anvendelse af phagemider
WO1992019244A2 (en) 1991-05-01 1992-11-12 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine A method for treating infectious respiratory diseases
ES2154637T3 (es) 1991-05-14 2001-04-16 Univ Connecticut Aportacion de genes dirigidos que codifican proteinas inmunogenicas.
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
ES2149774T3 (es) 1991-06-05 2000-11-16 Univ Connecticut Aportacion dirigida de genes que codifican proteinas secretoras.
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
US5844095A (en) 1991-06-27 1998-12-01 Bristol-Myers Squibb Company CTLA4 Ig fusion proteins
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5824307A (en) 1991-12-23 1998-10-20 Medimmune, Inc. Human-murine chimeric antibodies against respiratory syncytial virus
AU3434393A (en) 1992-01-17 1993-08-03 Regents Of The University Of Michigan, The Targeted virus
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US6271242B1 (en) 1992-02-10 2001-08-07 Bristol-Myers Squibb Co. Method for treating cancer using a tyrosine protein kinase inhibitor
GB9203459D0 (en) 1992-02-19 1992-04-08 Scotgen Ltd Antibodies with germ-line variable regions
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US6010715A (en) 1992-04-01 2000-01-04 Bertek, Inc. Transdermal patch incorporating a polymer film incorporated with an active agent
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH07505773A (ja) 1992-04-03 1995-06-29 ヤング　アレキサンダー　ティー 標的化されたウイルスベクターを用いた遺伝子治療
US6024975A (en) 1992-04-08 2000-02-15 Americare International Diagnostics, Inc. Method of transdermally administering high molecular weight drugs with a polymer skin enhancer
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
AU701578B2 (en) 1992-08-21 1999-02-04 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
KR950703640A (ko) 1992-10-09 1995-09-20 가일 케이,나우톤. 간 보존 세포(liver reserve cells)
AU680459B2 (en) 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5441050A (en) 1992-12-18 1995-08-15 Neoprobe Corporation Radiation responsive surgical instrument
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
US6274552B1 (en) 1993-03-18 2001-08-14 Cytimmune Sciences, Inc. Composition and method for delivery of biologically-active factors
US5985307A (en) 1993-04-14 1999-11-16 Emory University Device and method for non-occlusive localized drug delivery
US5523092A (en) 1993-04-14 1996-06-04 Emory University Device for local drug delivery and methods for using the same
WO1994025591A1 (en) 1993-04-29 1994-11-10 Unilever N.V. PRODUCTION OF ANTIBODIES OR (FUNCTIONALIZED) FRAGMENTS THEREOF DERIVED FROM HEAVY CHAIN IMMUNOGLOBULINS OF $i(CAMELIDAE)
AU691820B2 (en) 1993-07-15 1998-05-28 Cancer Research Campaign Technology Limited Prodrugs of protein tyrosine kinase inhibitors
US6004534A (en) 1993-07-23 1999-12-21 Massachusetts Institute Of Technology Targeted polymerized liposomes for improved drug delivery
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
US5925376C1 (en) 1994-01-10 2001-03-20 Madalene C Y Heng Method for treating psoriasis using selected phosphorylase kinase inhibitor and additional compounds
US5618709A (en) 1994-01-14 1997-04-08 University Of Pennsylvania Antisense oligonucleotides specific for STK-1 and method for inhibiting expression of the STK-1 protein
PT1231268E (pt) 1994-01-31 2005-11-30 Univ Boston Bancos de anticorpos policlonais
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5834252A (en) 1995-04-18 1998-11-10 Glaxo Group Limited End-complementary polymerase reaction
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
JPH10503371A (ja) 1994-07-29 1998-03-31 スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 新規化合物
GB9415379D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5759542A (en) 1994-08-05 1998-06-02 New England Deaconess Hospital Corporation Compositions and methods for the delivery of drugs by platelets for the treatment of cardiovascular and other diseases
US5911995A (en) 1994-08-19 1999-06-15 Regents Of The University Of Minnesota EGF-genistein conjugates for the treatment of cancer
US5587459A (en) 1994-08-19 1996-12-24 Regents Of The University Of Minnesota Immunoconjugates comprising tyrosine kinase inhibitors
US5660854A (en) 1994-11-28 1997-08-26 Haynes; Duncan H Drug releasing surgical implant or dressing material
EP0805678B1 (en) 1995-01-05 2003-10-29 THE BOARD OF REGENTS acting for and on behalf of THE UNIVERSITY OF MICHIGAN Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
EP1323346B1 (en) 1995-01-17 2006-06-28 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
GB9501567D0 (en) 1995-01-26 1995-03-15 Pharmacia Spa Hydrosoluble 3-arylidene-2-oxindole derivatives as tyrosine kinase inhibitors
US5998596A (en) 1995-04-04 1999-12-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibition of protein kinase activity by aptameric action of oligonucleotides
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5983134A (en) 1995-04-23 1999-11-09 Electromagnetic Bracing Systems Inc. Electrophoretic cuff apparatus drug delivery system
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
ES2268705T3 (es) 1995-06-01 2007-03-16 Kishimoto, Tadamitsu Inhibidor del crecimiento de celulas leucemicas que contienen un derivado oligonucleotidico antisentido frente al gen del tumor de wiloms (wt1).
US6316652B1 (en) 1995-06-06 2001-11-13 Kosta Steliou Drug mitochondrial targeting agents
GB9515975D0 (en) 1995-08-04 1995-10-04 Zeneca Ltd Chemical compounds
US6167301A (en) 1995-08-29 2000-12-26 Flower; Ronald J. Iontophoretic drug delivery device having high-efficiency DC-to-DC energy conversion circuit
EP0850051A2 (en) 1995-08-31 1998-07-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
US5863904A (en) 1995-09-26 1999-01-26 The University Of Michigan Methods for treating cancers and restenosis with P21
GB9601081D0 (en) 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
US6039975A (en) 1995-10-17 2000-03-21 Hoffman-La Roche Inc. Colon targeted delivery system
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6127366A (en) 1995-11-22 2000-10-03 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DE69620445T2 (de) 1995-12-08 2002-12-12 Janssen Pharmaceutica N.V., Beerse (imidazol-5-yl)methyl-2-chinolinoderivate als farnesyl protein transferase inhibitoren
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5958769A (en) 1996-01-18 1999-09-28 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for mediating cell cycle progression
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
EP1011669A4 (en) 1996-01-30 2001-09-12 Merck & Co Inc FARNESYL PROTEIN TRANSFERASE INHIBITORS
JP2000504014A (ja) 1996-01-30 2000-04-04 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド ファルネシル―タンパク質転移酵素の阻害剤
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
US6495520B2 (en) 1996-03-22 2002-12-17 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis Inducing Molecule II and methods of use
US7964190B2 (en) 1996-03-22 2011-06-21 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for decreasing T-cell activity
WO1997034911A1 (en) 1996-03-22 1997-09-25 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule ii
US6479254B2 (en) 1996-03-22 2002-11-12 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule II
US6635743B1 (en) 1996-03-22 2003-10-21 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule II and methods of use
US5891889A (en) 1996-04-03 1999-04-06 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US5883105A (en) 1996-04-03 1999-03-16 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6080870A (en) 1996-04-03 2000-06-27 Merck & Co., Inc. Biaryl substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
US6063930A (en) 1996-04-03 2000-05-16 Merck & Co., Inc. Substituted imidazole compounds useful as farnesyl-protein transferase inhibitors
DE19617461A1 (de) 1996-05-02 1997-11-06 Bayer Ag Acylmercapto-triazolyl-Derivate
US6300501B1 (en) 1996-05-22 2001-10-09 Warner-Lambert Company Histidine-(N-benzyl glycinamide) inhibitors of protein farnesyl transferase
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
TW345603B (en) 1996-05-29 1998-11-21 Gmundner Fertigteile Gmbh A noise control device for tracks
US5648239A (en) 1996-06-21 1997-07-15 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human camp-dependent protein kinase inhibitor homolog
US6071935A (en) 1996-06-27 2000-06-06 Pfizer Inc. Derivatives of 2-(2-oxo-ethylidene)-imidazolidin-4-one and their use as farnesyl protein transferase inhibitors
CA2260767A1 (en) 1996-07-19 1998-01-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Fas ligand-like protein, its production and use
NZ513800A (en) 1996-08-12 2001-09-28 Welfide Corp Treatment of diseases using Rho kinase inhibitors
US5985317A (en) 1996-09-06 1999-11-16 Theratech, Inc. Pressure sensitive adhesive matrix patches for transdermal delivery of salts of pharmaceutical agents
US6030982A (en) 1996-09-13 2000-02-29 Schering Corporationm Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6040305A (en) 1996-09-13 2000-03-21 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US5945429A (en) 1996-09-13 1999-08-31 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US5885834A (en) 1996-09-30 1999-03-23 Epstein; Paul M. Antisense oligodeoxynucleotide against phosphodiesterase
HUP0000116A3 (en) 1996-10-01 2000-08-28 Stanford Res Inst Int Taste-masked microcapsule compositions and methods of manufacture
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
US6131570A (en) 1998-06-30 2000-10-17 Aradigm Corporation Temperature controlling device for aerosol drug delivery
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
US6013662A (en) 1996-12-30 2000-01-11 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
US6093737A (en) 1996-12-30 2000-07-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US5939439A (en) 1996-12-30 1999-08-17 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DE69732306T2 (de) 1997-01-16 2006-01-12 Massachusetts Institute Of Technology, Cambridge Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
WO1998032741A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Zeneca Limited Inhibitors of farnesyl protein transferase
US5860957A (en) 1997-02-07 1999-01-19 Sarcos, Inc. Multipathway electronically-controlled drug delivery system
ZA981080B (en) 1997-02-11 1998-08-12 Warner Lambert Co Bicyclic inhibitors of protein farnesyl transferase
TW591030B (en) 1997-03-10 2004-06-11 Janssen Pharmaceutica Nv Farnesyl transferase inhibiting 1,8-annelated quinolinone derivatives substituted with N- or C-linked imidazoles
US6120751A (en) 1997-03-21 2000-09-19 Imarx Pharmaceutical Corp. Charged lipids and uses for the same
BRPI9809391B8 (pt) 1997-04-14 2021-05-25 Amgen Res Munich Gmbh processo para a produção de um receptor de antígeno anti-humano, anticorpo humano e composição farmacêutica
US6060082A (en) 1997-04-18 2000-05-09 Massachusetts Institute Of Technology Polymerized liposomes targeted to M cells and useful for oral or mucosal drug delivery
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6228865B1 (en) 1997-06-17 2001-05-08 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6051582A (en) 1997-06-17 2000-04-18 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6211193B1 (en) 1997-06-17 2001-04-03 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6225322B1 (en) 1997-06-17 2001-05-01 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6159984A (en) 1997-06-17 2000-12-12 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
US6239140B1 (en) 1997-06-17 2001-05-29 Schering Corporation Compounds useful for inhibition of farnesyl protein transferase
US6140467A (en) 1997-07-07 2000-10-31 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
US7118742B2 (en) 1997-07-07 2006-10-10 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
US6998108B1 (en) 1997-07-07 2006-02-14 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antibodies to p30 polypeptides and methods making and using same
US6346388B1 (en) 1997-08-13 2002-02-12 Smithkline Beecham Corporation Method of identifying agonist and antagonists for tumor necrosis related receptors TR1 and TR2
TR200000415T2 (tr) 1997-08-15 2000-08-21 Cephalon Inc. Prostat kanserinin tedavi edilmesi için birleşimler.
US5948433A (en) 1997-08-21 1999-09-07 Bertek, Inc. Transdermal patch
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
US6103723A (en) 1997-10-17 2000-08-15 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DK1025088T3 (da) 1997-10-22 2001-11-12 Astrazeneca Ab Imidazolderivater og deres anvendelse som farnesylproteintransferaseinhibitorer
WO1999020612A1 (en) 1997-10-22 1999-04-29 Astrazeneca Uk Limited Imidazole derivatives and their use as farnesyl protein transferase inhibitors
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
WO1999021537A1 (fr) 1997-10-28 1999-05-06 Bando Chemical Industries, Ltd. Feuille de timbre cutane et procede de production d'une feuille de base pour timbre
AU753157B2 (en) 1997-11-03 2002-10-10 Georgetown University Medical Center VEGI, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
US6124465A (en) 1997-11-25 2000-09-26 Rhone-Poulenc S.A. Farnesyl transferase inhibitors, their preparation, the pharmaceutical compositions which contain them and their use in the preparation of medicaments
EP1045846B1 (en) 1997-11-28 2003-05-02 Lg Chemical Limited Imidazole derivatives having an inhibitory activity for farnesyl transferase and process for preparation thereof
US6054466A (en) 1997-12-04 2000-04-25 Merck & Co., Inc. Inhibitors of farnesyl-protein transferase
US6242196B1 (en) 1997-12-11 2001-06-05 Dana-Farber Cancer Institute Methods and pharmaceutical compositions for inhibiting tumor cell growth
US6335156B1 (en) 1997-12-18 2002-01-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine 14-3-3σ arrests the cell cycle
CN1158277C (zh) 1998-02-02 2004-07-21 Lg化学株式会社 具有哌啶结构的法尼转移酶抑制剂及其制备方法
AU2972199A (en) 1998-02-20 1999-09-06 Reinhard Ebner Apoptosis inducing molecule ii and methods of use
EP1076663B1 (en) 1998-04-27 2004-02-18 Warner-Lambert Company LLC Functionalized alkyl and alkenyl side chain derivatives of glycinamides as farnesyl transferase inhibitors
US6048736A (en) 1998-04-29 2000-04-11 Kosak; Kenneth M. Cyclodextrin polymers for carrying and releasing drugs
CA2336139C (en) 1998-06-24 2008-10-14 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
HRP20000904A2 (en) 1998-07-06 2001-12-31 Janssen Pharmaceutica Nv Farnesyl protein transferase inhibitors for treating arthropathies
US6034053A (en) 1998-07-13 2000-03-07 Wayne Hughes Institute EGF-isoflavone conjugates for the prevention of restenosis
US6372747B1 (en) 1998-12-18 2002-04-16 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
US6362188B1 (en) 1998-12-18 2002-03-26 Schering Corporation Farnesyl protein transferase inhibitors
FR2787327B1 (fr) 1998-12-21 2003-01-17 Aventis Pharma Sa Compositions contenant des inhibiteurs de farnesyle transferase
US6432959B1 (en) 1998-12-23 2002-08-13 Schering Corporation Inhibitors of farnesyl-protein transferase
DK1140938T3 (da) 1999-01-11 2003-12-22 Univ Princeton Højaffinitetsinhibitorer for målvalidering og anvendelser heraf
US6399633B1 (en) 1999-02-01 2002-06-04 Aventis Pharmaceuticals Inc. Use of 4-H-1-benzopryan-4-one derivatives as inhibitors of smooth muscle cell proliferation
US6245759B1 (en) 1999-03-11 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
US6143766A (en) 1999-04-16 2000-11-07 Warner-Lambert Company Benzopyranone and quinolone inhibitors of ras farnesyl transferase
EP1179347A4 (en) 1999-05-21 2002-06-26 Takeda Chemical Industries Ltd CONTROL SUBSTANCES FOR LIVER FUNCTION
US6256533B1 (en) 1999-06-09 2001-07-03 The Procter & Gamble Company Apparatus and method for using an intracutaneous microneedle array
US6458935B1 (en) 1999-06-23 2002-10-01 Merck & Co., Inc. Radiolabeled farnesyl-protein transferase inhibitors
DE60042789D1 (de) 1999-11-29 2009-10-01 Bac Ip B V Immobilisierte antigenbindende moleküle aus einer domäne
US6403581B1 (en) 2000-01-19 2002-06-11 American Cyanamid Company Method of inhibition of farnesyl-protein transferase using substituted benz (cd) indol-2-imine and-amine derivatives
US6261595B1 (en) 2000-02-29 2001-07-17 Zars, Inc. Transdermal drug patch with attached pocket for controlled heating device
WO2001079496A2 (en) 2000-03-13 2001-10-25 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Ligand for herpes simplex virus entry mediator and methods of use
RU2252786C2 (ru) 2000-09-08 2005-05-27 Микромет Аг Конструкции антител и хемокинов и их применение при иммунологических нарушениях
CN1487996B (zh) 2000-11-30 2010-06-16 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
WO2002066050A1 (en) 2001-02-23 2002-08-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Casoase 3 inhibitors
US7476536B2 (en) 2001-05-11 2009-01-13 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Artificial human chromosome containing human antibody a light chain gene
EP1411952B1 (en) 2001-06-29 2009-04-22 Glykos Finland Oy Use of at least one glycoinhibitor substance against infectious diseases
US20040038349A1 (en) 2001-07-27 2004-02-26 Hilbert David M. Heteromultimeric TNF ligand family members
AR035119A1 (es) * 2001-08-16 2004-04-14 Lilly Co Eli Anticuerpos humanos antagonistas anti-htnfsf13b
EP1336619A3 (en) 2002-02-19 2003-12-10 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Combination of a HVEM-LIGHT inhibitor and an immunosuppressive agent in the treatment or prevention of immune disorders
WO2003089575A2 (en) * 2002-04-15 2003-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to tl5
WO2003089579A2 (en) 2002-04-15 2003-10-30 Advanced Bionutrition Corporation Incorporation of anaerobic bacteria in feed formulation
WO2005035575A2 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
EP1833848A2 (en) 2004-12-09 2007-09-19 Lajolla Institute for Allergy and Immunology Novel tnf receptor regulatory domain
ES2439994T3 (es) * 2006-08-28 2014-01-27 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anticuerpos antagonistas monoclonales humanos específicos de LIGHT humano

Also Published As

Publication number Publication date
US8461307B2 (en) 2013-06-11
HRP20131215T1 (hr) 2014-01-31
AU2007290570C1 (en) 2013-08-15
CY1114719T1 (el) 2016-10-05
AU2007290570B2 (en) 2013-01-10
KR101314362B1 (ko) 2013-10-10
TN2009000051A1 (en) 2010-08-19
WO2008027338A2 (en) 2008-03-06
EP2292663A2 (en) 2011-03-09
TWI405771B (zh) 2013-08-21
ES2643687T3 (es) 2017-11-23
JP2013153749A (ja) 2013-08-15
EP2484696B1 (en) 2017-08-16
MX2009002151A (es) 2009-07-03
RS53120B (sr) 2014-06-30
HK1153209A1 (en) 2012-03-23
CA2661782C (en) 2019-04-16
IL216381A0 (en) 2011-12-29
EA200970234A1 (ru) 2010-02-26
WO2008027338A3 (en) 2008-07-24
NZ575163A (en) 2011-12-22
NZ596091A (en) 2012-07-27
US8974787B2 (en) 2015-03-10
MY162024A (en) 2017-05-31
SG170032A1 (en) 2011-04-29
ES2439994T3 (es) 2014-01-27
JP5751680B2 (ja) 2015-07-22
IL197158A (en) 2014-09-30
BRPI0716088B8 (pt) 2021-05-25
CO6170363A2 (es) 2010-06-18
JP2010502183A (ja) 2010-01-28
NI200900027A (es) 2011-10-25
CA2661782A1 (en) 2008-03-06
GT200900043A (es) 2010-04-29
US20130230536A1 (en) 2013-09-05
TW200825104A (en) 2008-06-16
TW201343676A (zh) 2013-11-01
NO20091235L (no) 2009-04-29
AU2007290570A2 (en) 2010-09-09
IL197158A0 (en) 2011-08-01
DK2292663T3 (da) 2013-11-04
US8058402B2 (en) 2011-11-15
US20150337046A1 (en) 2015-11-26
EP2064243A2 (en) 2009-06-03
KR101374983B1 (ko) 2014-03-17
BRPI0716088A8 (pt) 2020-03-31
EP2292663B1 (en) 2013-10-02
AU2007290570A1 (en) 2008-03-06
EP2484696A1 (en) 2012-08-08
MA31347B1 (fr) 2010-05-03
JP5209625B2 (ja) 2013-06-12
US20120076798A1 (en) 2012-03-29
PT2292663E (pt) 2013-11-04
US20100021466A1 (en) 2010-01-28
BRPI0716088A2 (pt) 2013-10-01
EA021255B1 (ru) 2015-05-29
PL2292663T3 (pl) 2014-03-31
CR10652A (es) 2009-05-13
KR20130064814A (ko) 2013-06-18
KR20090057285A (ko) 2009-06-04
DK2484696T3 (en) 2017-10-02
EP2292663A3 (en) 2011-11-23
US9771419B2 (en) 2017-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9771419B2 (en) Antagonistic human light-specific human monoclonal antibodies
KR101125127B1 (ko) 자가면역 및 염증성 질병과 기관 이식 거부반응의 치료를위해 사용되는 길항제 항-ｃｄ４０ 항체의 사용 방법
TW200909447A (en) Antigen binding proteins that bind PAR-2
KR20210086671A (ko) 항-vegf 항체 및 항-조직 인자 항체-약물 접합체의 조합을 사용하여 암을 치료하는 방법
CN101663321B (zh) 拮抗型人light特异性人源性单克隆抗体
AU2013203359B2 (en) Antagonistic human LIGHT-specific human monoclonal antibodies
RU2854627C1 (ru) Биспецифические канинизированные антитела для лечения атопического дерматита
HK1153209B (en) Antagonistic human light-specific human monoclonal antibodies

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B25F Entry of change of name and/or headquarter and transfer of application, patent and certif. of addition of invention: change of name on requirement

Owner name: KIRIN PHARMA KABUSHIKI KAISHA (JP) ; LA JOLLA INSTITUTE FOR ALLERGY AND IMMUNOLOGY (US)

Free format text: A FIM DE ATENDER A ALTERACAO DE NOME REQUERIDA ATRAVES DA PETICAO NO 870200020709, DE 12/02/2020, E NECESSARIO ESCLARECER A DIVERGENCIA ENTRE O NOME DA EMPRESA TITULAR DO PEDIDO E O NOME DA EMPRESA QUE TEVE SEU NOME ALTERADO.

B25L Entry of change of name and/or headquarter and transfer of application, patent and certificate of addition of invention: publication cancelled

Owner name: KYOWA HAKKO KIRIN CO., LIMITED (JP) ; LA JOLLA INSTITUTE FOR ALLERGY AND IMMUNOLOGY (US)

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 25.6 NA RPI NO 2566 DE 10/03/2020 POR TER SIDO INDEVIDA.

B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: LA JOLLA INSTITUTE FOR ALLERGY AND IMMUNOLOGY (US) ; KYOWA KIRIN CO., LTD. (JP)

B25G Requested change of headquarter approved

Owner name: LA JOLLA INSTITUTE FOR ALLERGY AND IMMUNOLOGY (US) ; KYOWA KIRIN CO., LTD. (JP)

B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 08/12/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 24/08/2007 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF

B15V Prolongation of time limit allowed