BRPI0821791A2 - anticorpos bivalentes biespecíficos - Google Patents

Abstract

anticorpos bivalentes biespecíficos a presente invenção refere-se a novos anticorpos bivalentes bi- específicos com troca de domínios, sua produção e uso.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO BIVALENTE BIESPECÍFICO, MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DO MESMO, CÉLULA HOSPEDEIRA E COMPOSIÇÃO.

A presente invenção refere-se a novos anticorpos bivalentes biespecíficos, sua produção e uso.

Antecedentes da Invenção

Proteínas engenheiradas, tais como anticorpos bi ou multiespecíficos capazes de ligar-se a dois ou mais antígenos, são conhecidos no estado da técnica. Tais proteínas de ligação multiespecífica podem ser geradas utilizando técnicas de fusão de células, conjugação química ou DNA recombinante.

Uma ampla variedade de formatos de anticorpos biespecíficos recombinantes foi desenvolvida no passado recente, por exemplo, anticorpos tetravalentes biespecíficos por meio de fusão de, por exemplo, um formato de anticorpo IgG e domínios de cadeias simples (ver, por exemplo, Morrison, S.L. e outros, Nature Biotech 15 (1997) 159-163; W02001077342; e Coloma, M.J., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234).

Todos os diversos outros novos formatos em que a estrutura central do anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) não é mais retida, tais como dia, tria o tetracorpos, minicorpos, diversos formatos de cadeias simples (scFv, Bis-scFv), que são capazes de ligar-se a dois ou mais antígenos, foram desenvolvidos (Holliger, P e outros, Nature Biotech 23 (2005) 1126 1136 2005; Fischer, N., Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J e outros, Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C. e outros, Nature Biotech 25 (2007) 1290-1297)

Todos esses formatos usam ligantes ou para fundir o núcleo do anticorpo (IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) com uma proteína de ligação adicional (por exemplo, scFv) ou para fundir, por exemplo, dois fragmentos de Fab ou scFv (Fischer, N., Léger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). Embora seja óbvio que ligantes apresentem vantagens para a engenharia de anticorpos biespecíficos, eles poderão também causar problemas em ajustes terapêuticos. Na verdade, esses peptídeos estranhos poderíam dar origem a uma

2/49 resposta imune contra o próprio ligante ou à junção entre a proteína e o ligante. Ainda mais, a natureza flexível desses peptídeos os tornam mais pro' pensos a divagem proteolítica, potencialmente levando a deficiente estabilidade do anticorpo, agregação e elevada imunogenicidade. Além de se poder 5 desejar reter funções efetuadoras, tais como, por exemplo, citotoxicidade dependente de complemento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (CCDA), que são mediadas pela parte Fc, mantendo um alto grau de similaridade com anticorpos que ocorrem naturalmente.

Assim, idealmente, deve-se ter como objetivo desenvolver anti10 corpos biespecíficos que sejam muito similares em esturura geral a anticorpos que ocorrem naturalmente (como IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) com mínimo desvio de sequências humanas.

Em uma abordagem, anticorpos biespecíficos que são muito similares a anticorpos naturais têm sido produzidos usando a tecnologia de 15 quadroma (ver Milstein, C. e A.C. Cuello, Nature, 305 (1983) 537-40), com base na fusão somática de duas linhagens diferentes de células de hibridoma que expressam anticorpos monoclonais murinos com as especificidades desejadas do anticorpo biespecífico. Devido ao emparelhamento aleatório de duas cadeias pesadas e leves de anticorpos diferentes na linhagem de célu20 Ias híbridas de hibridoma (ou quadroma) resultantes, até dez espécies de anticorpos diferentes são geradas, das quais somente uma é o anticorpo biespecífico funcional desejado. Devido à presença de subprodutos emparelhados erroneamente, e rendimentos de produção significativamente reduzidos, procedimentos de purificação sofisticada são exigidos (ver, por exem25 pio, Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234). Em geral, o mesmo problema de subprodutos emparelhados erroneamente permanece se são utilizadas técnicas de expressão recombinante.

Uma abordagem para contornar o problema de subprodutos emparelhados erroneamente, que é conhecido como saliências-em-orifícios 30 (“knobs-into-holes”), visa a forçar o emparelhamento de duas cadeias pesadas de anticorpos diferentes mediante introdução de mutações nos domínios CH3 para modificar a interface de contato. Em uma cadeia, aminoácidos vo

3/49 lumosos foram substituídos por aminoácidos com cadeias laterais curtas para criar um Orifício’. Inversamente, aminoácidos com cadeias laterais grandes foram introduzidos no outro domínio CH3, para criar uma ‘saliência’. Coexpressando essas duas cadeias pesadas (e duas cadeias leves idênticas, 5 que têm de ser apropriadas para ambas as cadeias pesadas), foram observados altos rendimentos de formação de heterodímeros ( ‘saliência-orifício’) versus formação de homodímeros (Orifício-orifício’ ou ‘saliência-saliência') (Ridgway, JB, Presta, LG, Carter, P; e W01996027011). A porcentagem de heterodímeros poderia ser adicionalmente aumentada remodelando as su10 perficies de interação dos dois domínios CH3 mediante uso de uma abordagem de exibição de fagos e da introdução de uma ponte de dissulfeto para estabilizar os heterodímeros (Merchant, A.M. e outros, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S, Ridgway, JB, Wells, JA, Carter, P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35). Novas abordagens para a tecnologia de saliências-em15 orifícios são descritas em, por exemplo, in EP 1870459A1. Embora esse formato pareça muito atraente, nenhum dado que descreva a progressão para o clínico é atualmente disponível. Uma importante restrição dessa estratégia é que as cadeias leves dos dois anticorpos originais têm de ser idênticas para impedir mal-emparelhamento e formação de moléculas inativas.

Desse modo, essa técnica não é apropriada para desenvolver facilmente anticorpos bivalentes biespecíficos recombinantes contra dois antígenos partindo de dois anticorpos contra o primeiro e o segundo antígenos, na medida em que as cadeias pesadas desses anticorpos e/ou as cadeias leves idênticas têm de ser otimizadas.

Xie, Z. e outros, J Immunol Methods 286 (2005) 95-101, referemse a um novo formato de anticorpo biespecífico que usa scFvs em combinação com tecnologia de saliências-em-orifícios para a parte Fc.

Sumário da Invenção

A invenção refere-se a a anticorpo bivalente biespecífico, o qual compreende:

a) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno; e

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b) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.

Uma modalidade adicional da invenção é um método para a preparação de um a anticorpo bivalente biespecífico de acordo com a invenção que compreende as etapas de

a) transformar uma célula hospedeira com

- vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno;

- vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro;

b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem síntese dessa molécula de anticorpo; e

c) recuperar essa molécula de anticorpo dessa cultura.

Uma modalidade adicional da invenção é uma célula hospedeira que compreende

- vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno;

- vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.

Uma modalidade adicional da invenção é uma composição, preferencialmente uma composição farmacêutica ou de diagnóstico do anticorpo de acordo com a invenção.

Uma modalidade adicional da invenção é uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de acordo com a invenção e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

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Uma modalidade adicional da invenção é um método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia, caracterizado por administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

A invenção refere-se a um anticorpo bivalente biespecífico, o qual compreende:

a) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno; e

b) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.

Portanto, o anticorpo bivalente biespecífico compreende:

a) uma primeira cadeia leve e uma primeira cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno; e

b) uma segunda cadeia leve e uma segunda cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH da segunda cadeia leve e da segunda cadeia pesada são substituídos um pelo outro.

Assim, a esse anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno aplica-se o seguinte:

na cadeia leve o domínio variável VL da cadeia leve é substituído pelo domínio variável VH da cadeia pesada do anticorpo;

e na cadeia pesada o domínio variável VH da cadeia pesada é substituído pelo domínio variável VL da cadeia leve do anticorpo.

O termo anticorpo, como usado neste relatório, refere-se a anticorpos monoclonais inteiros. Tais anticorpos inteiros consistem de dois pares de uma cadeia leve (CL) e de uma cadeia pesada (CP) (esses pares de cadeia leve (CL)/cadeia pesada (CP) são abreviados aqui como CL/CP). As cadeias leves e cadeias pesadas desses anticorpos são polipeptídeos

6/49 que consistem de diversos domínios. Em um anticorpo inteiro, cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como RVCP ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende os domínios constantes de cadeia 5 pesada CH1, CH2 e CH3 (classes de anticorpos IgA, IgD e IgG) e opcionalmente o domínio constante de cadeia pesada CH4 (classes de anticorpos IgE e IgM). Cada cadeia leve compreende um domínio variável VL de cadeia leve e um domínio constante CL de cadeia leve. A estrutura de um anticorpo inteiro que ocorre naturalmente, o anticorpo IgG, é mostrada, por exemplo, 10 na figurai. Os domínios variáveis VH e VL podem ser adicionalmente subdivididos em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (RDC), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (RE) (framework regions (FR)). Cada VH e VL é composto de três RDCs e quatro REs, dispostas de 15 término amino a término carbóxi na seguinte ordem: RE1, RDC1, RE2, RDC2, RE3, RDC3, RE4 ((Janeway, CA, Jr e outros (2001). Immunobiology, 5^a ed., Garland Publishing; e Woof, J, Burton, D, Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99). Os dois pares de cadeia pesada e cadeia leve (CP/CL) são capazes de ligar-se especificamente ao mesmo antígeno. Desse modo, o anticorpo 20 inteiro é um anticorpo bivalente monoespecífico. Tais anticorpos incluem, por exemplo, anticorpos de camundongo, anticorpos humanos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos geneticamente engenheirados (anticorpos variantes ou mutantes), contanto que suas propriedades características sejam retidas. Especialmente preferidos são anticorpos hu25 manos ou humanizados, especialmente anticorpos humanos ou humanizados recombinantes.

Há cinco tipos de cadeias pesadas de anticorpos de mamíferos denotados pelas letras gregas: α, δ, ε, γ e μ (Janeway, CA, Jr e outros (2001). Immunobiology, 5^a ed., Garland Publishing'). O tipo de cadeia pesada 30 presente define a classe de anticorpos; essas cadeias são encontradas nos anticorpos IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente (Rhoades, RA; Pflanzer, RG (2002). Human Physiology, 4^a ed., Thomson Learning). Cadeias pe7/49 sadas distintas diferem em tamanho e composição; α e γ contêm aproximadamente 450 aminoácidos, enquanto μ e ε apresentam aproximadamente 550 aminoácidos.

Cada cadeia pesada tem duas regiões, a região constante e a região variável. A região constante é idêntica em todos os anticorpos do mesmo isotipo, mas difere em anticorpos de diferentes isotipos. As cadeias pesadas γ, α e δ apresentam uma região constante composta de três domínios constantes CH1, CH2 e CH3 (em uma linhagem) e uma região de articulação para flexibilidade adicional (Woof, J; Burton, D, Nat Rev Immunol 4 10 (2004) 89-99); as cadeias pesadas μ e ε apresentam uma região constante composta de quatro domínios constantes CH1, CH2, CH3 e CH4 (Janeway, CA, Jr e outros (2001). Immunobiology, 5^a ed., Garland Publishing). A região variável da cadeia pesada difere em anticorpos produzidos por diferentes células B, mas é a mesma para todos os anticorpos produzidos por uma úni15 ca célula B ou clone de célula B. A região variável de cada cadeia pesada tem aproximadamente 110 aminoácidos de comprimento e é composta de um único domínio de anticorpos.

Em mamíferos há somente dois tipos de cadeia leve, que são chamados lâmbda (A) e capa (k). A cadeia leve possui dois domínios suces20 sivos: um domínio constante CL e um domínio variável VL. O comprimento aproximado de uma cadeia leve é de 211 a 217 aminoácidos. Preferencialmente, a cadeia leve é uma cadeia leve capa (k), e o domínio constante CL é preferencialmente derivado de uma cadeia leve capa (k) (o domínio constante Ck).

Os termos anticorpo monoclonal ou composição de anticorpo monoclonal como usados neste relatório referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpos de uma única composição de aminoácidos.

Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser de qualquer classe (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, preferencialmente IgG ou 30 IgE), ou subclasse (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2, preferencialmente lgG1), pelo que ambos os anticorpos, dos quais deriva o anticorpo bivalente biespecífico de acordo com a invenção, apresentam uma

8/49 parte Fc da mesma subclasse (por exemplo, lgG1, lgG4 e similares, preferencialmente lgG1), preferencialmente do mesmo alotipo (por exemplo, Caucasian©).

A parte Fc de um anticorpo é um termo bem conhecido daque5 le habilitado no estado da técnica e definido com base na divagem de anticorpos por papaína. Os anticorpos de acordo com a invenção contêm, como parte Fc, preferencialmente uma parte Fc derivada de origem humana e, preferencialmente, todas as outras partes das regiões constantes humanas. A parte Fc de um anticorpo está diretamente envolvida em ativação de com10 plementos, ligação com C1 q, ativação de C3 e ligação com receptores de Fc. Embora a influência de um anticorpo no sistema de complementos seja dependente de certas condições, a ligação com C1q é causada por sítios de ligação definidos na parte Fc. Tais sítios de ligação são conhecidas no estado da técnica e descritos, por exemplo, por Lukas, T.J. e outros, J. Immunol.

127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R. e Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979)

907-917; Burton, D.R. e outros, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen,

J.E. e outros, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E. e outros, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M. e outros, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A. e outros, Immunology 86 (1995) 319-324; e EP 0 20 307 434. Esses sítios de ligação são, por exemplo, L234, L235, D270, N297,

E318, K320, K322, P331 e P329 (numeração de acordo com índice de Kabat EU; ver abaixo). Anticorpos das subclasses lgG1, lgG2 e lgG3 usualmente mostram ativação de complementos, ligação com C1q e ativação de C3, considerando que lgG4 não ative o sistema de complementos, não se ligue a 25 C1q e não ative C3. Preferencialmente, a parte Fc é uma parte Fc humana.

O termo anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo que compreende uma região variável, isto é, região de ligação, proveniente de uma fonte ou espécie e pelo menos uma porção de uma região constante derivada de uma fonte ou espécie diferente, usualmente preparado por téc30 nicas de DNA recombinante. Anticorpos quiméricos que compreendem uma região variável murina e uma região constante humana são preferidos. Outras formas preferidas de anticorpos quiméricos abrangidos pela presente

9/49 invenção são aquelas em que a região constante foi modificada ou mudada daquela do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação a ligação com C1q e/ou ligação com receptores de Fc (RFc). Esses anticorpos quiméricos são também referidos como anticorpos de troca de classes. Anticorpos quiméricos são o produto de genes para imunoglobulina expressos que compreendem segmentos de DNA que codificam regiões variáveis de imunoglobulina e segmentos de DNA que codificam regiões constantes de imunoglobulina. Métodos para produção de anticorpos quiméricos envolvem técnicas convencionais de DNA recombinante e de transfecção de genes e são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Morrison, S.L. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.202.238 e 5.204.244.

O termo anticorpo humanizado refere-se a anticorpos em que a estrutura ou regiões de determinação de complementaridade (RDC) foram modificadas para compreender a RDC de uma imunoglobulina de especificidade diferente em comparação com aquela da imunoglobulina original. Em uma modalidade preferida, uma RDC murina é enxertada na região estrutural de um anticorpo humano para preparar o anticorpo humanizado. Ver, por exemplo, Riechmann, L. e outros, Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S. e outros, Nature 314 (1985) 268-270. RDCs particularmente preferidas correspondem àquelas que representam sequências que reconhecem os antígenos observados acima para anticorpos quiméricos. Outras formas de anticorpos humanizados abrangidos pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi adicionalmente modificada ou mudada a partir daquela do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação a ligação com C1q e/ou ligação com receptores de Fc (RFc).

O termo anticorpo humano, como usado neste relatório, pretende incluir anticorpos que apresentam regiões variáveis e regiões constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Anticorpos humanos são bem-conhecidas no estado da técnica

10/49 (van Dijk, M.A. e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368374). Anticorpos humanos podem também ser produzidos em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes de, após imunização, produzir um repertório ou uma seleção completa de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Transferência do arranjo de genes para imunoglobulina de linhagem germinativa humana nesses camundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos após desafio com antígeno (ver, por exemplo, Jakobovits, A. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A. e outros, Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M. e outros, Year Immunol. 7 (1993) 33-40). Anticorpos humanos podem também ser produzidos em bibliotecas de apresentação em fagos (Hoogenboom, H.R. e Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D. e outros, J. Moi. Biol. 222 (1991) 581-597). As técnicas de Cole e outros e Boerner e outros são também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole e outros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); e Boerner, P. e outros, J. Immunol. 147 (1991) 8695). Como já mencionado para anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados de acordo com a invenção, o termo anticorpo humano como usado neste relatório também compreende esses anticorpos que são modificados na região constante para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação a ligação com C1q e/ou ligação com RFc, por exemplo, por meio de troca de classes, isto é, mudança ou mutação de partes Fc (por exemplo, a partir de mutação de lgG1 para lgG4 e/ou lgG1/lgG4).

O termo anticorpo humano recombinante, como usado neste relatório, pretende incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isoldos de uma célula hospedeira tais como células NS0 ou CHO ou originárias de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico para genes para imunoglobulina humana ou anticorpos expressos mediante uso de um vetor de expressão recombinante transfectado emu ma célula

11/49 hospedeira. Tais anticorpos humanos recombinantes apresentam regiões variáveis e regiões constantes de uma forma rearranjada. Os anticorpos humanos recombinantes de acordo com a invenção foram submetidos a hipermutação somática in vivo. Assim, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivadas de e relacionadas com sequências de linhagem germinativa humana VH e VL, não poderão existir naturalmente no repertório in vivo de linhagens germinativas de anticorpos humanos.

O domínio variável (domínio variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)), como usado neste relatório, denota cada um dos pares cadeias leves e cadeias pesadas que é envolvido diretamente na ligação do anticorpo com o antígeno. Os domínios de cadeias leves e cadeias pesadas humanas variáveis têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões estruturais (RE) cujas sequências são amplamente conservadas, conectadas por três regiões hipervariáveis (ou regiões de determinação de complementaridade, RDCs). As regiões estruturais adotam uma conformação de folha β e as RDCs poderão formar laços que se ligam à estrutura de folha β. As RDCs em cada cadeia são mantidas em sua estrutura tridimensional pelas regiões estruturais e formam juntamente com as RDCs da outra cadeia o sítio de ligação com antígenos. As regiões RDC3 de cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpos desempenham um papel particularmente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e, portanto, proporcionam um objetivo adicional da invenção.

Os termos hiperregião variável ou porção de um anticorpo que se liga a antígeno, quando usados aqui, referem-se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis por ligação com antígeno. A hiperregião variável compreende resíduos de aminoácidos das regiões de determinação de complementaridade ou RDCs. Regiões Estruturais ou REs são aquelas regiões de domínio variável diferentes dos resíduos de hiperregião variável como definidos aqui. Portanto, as cadeias leves e pesadas de um anticorpo compreendem do término N ao término C os domínios

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FR1, RDC1, RE2, RDC2, RE3, RDC3 e RE4. RDCs em cada cadeia são separadas por esses aminoácidos estruturais. Especialmente, RDC3 da cadeia pesada é a região que mais contribui para ligação com antígeno. Regiões RDC e RE são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

Os domínios constantes da cadeia pesada e da cadeia leve não são envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo com um antígeno, mas apresentam várias funções efetuadoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, anticorpos ou imunoglobulinas são divididas nas classes:

O termo anticorpo bivalente biespecífico, como usado neste relatório, refere-se a um anticorpo conforme descrito acima em que cada um dos dois pares de cadeias pesadas e cadeias leves (CP/CL) liga-se especificamente a um antígeno diferente, isto é, a primeira cadeia pesada e a primeira cadeia leve (que se originam de um anticorpo contra um primeiro antígeno) ligam-se juntamente de modo específico a um primeiro antígeno, e a segunda cadeia pesada e a segunda cadeia leve (que se originam de um anticorpo contra um segundo antígeno) ligam-se juntamente de modo específico a um segundo antígeno (como representado na figura 2); tais anticorpos bivalentes biespecíficos são capazes de ligar-se especificamente a dois antígenos diferentes ao mesmo tempo, e não mais que dois antígenos, ao contrário, por um lado, de um anticorpo monoespecífico capaz de ligação apenas com um antígeno, e, por outro lado, por exemplo, um anticorpo tetravalente tetraespecífico que pode ligar-se a quatro moléculas de antígeno ao mesmo tempo.

De acordo com a invenção, a razão de um anticorpo bivalente biespecífico desejado em comparação com produtos secundários indesejados pode ser aperfeiçoada pela substituição de certos domínios em somente um par de cadeia pesada e cadeia leve (CP/CL). Enquanto o primeiro dos dois pares CP/CL origina-se de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno e é deixado essencialmente inalterado, o segundo dos

13/49 dois pares CP/CL origina-se de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno e é alterado pela seguinte substituição:

cadeia leve: substituição do domínio variável VL da cadeia leve pelo domínio variável VH da cadeia pesada desse anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, e cadeia pesada: substituição do domínio variável VH da cadeia pesada pelo domínio variável VL da cadeia leve desse anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno.

Assim, os anticorpos bivalentes biespecíficos resultantes são anticorpos artificiais que compreendem

a) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno; e

b) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que a cadeia leve (de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno) contém um domínio variável VH em vez de VL, e em que a cadeia pesada(de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno) contém um domínio variável VL em vez de VH.

Em um aspecto adicional da invenção, essa razão aperfeiçoada de um anticorpo bivalente biespecífico desejado em comparação com produtos secundários indesejados pode ser adicionalmente aperfeiçoada por uma das duas seguintes alternativas:

A) Primeira alternativa (ver figura 3):

Os domínios CH3 desse anticorpo bivalente biespecífico de acordo com a invenção podem ser alterados pela tecnologia de saliênciasem-orifícios que é descrita em detalhes com diversos exemplos in, por exemplo, W096/027011, Ridgway, JB e outros, Protein Eng 9 (1996) 617621; e Merchant, A.M. e outros, Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681. Nesse método, as superfícies de interação dos dois domínios CH3 são alteradas para aumentar a heterodimerização de ambas as cadeias pesadas que contêm esses dois domínios CH3. Cada um dos dois domínios CH3 (das duas cadeias pesadas) pode ser saliência, enquanto a outra é o orifício. A in

14/49 trodução de uma ponte de dissulfeto estabiliza os heterodímeros (Merchant, A.M. e outros, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S, Ridgway, JB, Wells, JA, Carter, P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35) e eleva o rendimento.

Portanto, em modalidade preferida, os domínios CH3 de um anticorpo bivalente biespecífico em que o primeiro domínio CH3 e o segundo domínio CH3 encontram-se cada um em uma interface que compreende uma interface original entre os domínios CH3 do anticorpo são alterados pela tecnologia de saliências-em-orifícios, incluindo estabilização adicional por meio de introdução de uma ponte de dissulfeto nos domínios CH3 (descrita in \NO9Q/Q270M, Ridgway, JB e outros, Protein Eng 9 (1996) 617-621; Merchant, A.M. e outros, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; e Atwell, S, Ridgway, JB, Wells, JA, Carter, P„ J Mol Biol 270 (1997) 26-35) para promover a formação do anticorpo bivalente biespecífico.

Dessa maneira, em um aspecto da invenção esse anticorpo bivalente biespecífico caracteriza-se pelo fato de que o domínio CH3 de uma cadeia pesada e o domínio CH3 da outra cadeia pesada encontram-se cada um em uma interface que compreende uma interface original entre os domínios CH3 do anticorpo;

em que essa interface é alterada para promover a formação do anticorpo bivalente biespecífico, em que a alteração caracteriza-se pelo fato de que:

a) o domínio CH3 de uma cadeia pesada é alterado, de modo que, na interface original do domínio CH3 de uma cadeia pesada que encontra a interface original do domínio CH3 da outra cadeia pesada no anticorpo bivalente biespecífico, um resíduo de aminoácido seja substituído por um resíduo de aminoácido que apresenta um volume maior de cadeia laterais, gerando desse modo uma protuberência na interface do domínio CH3 de uma cadeia pesada que é posicionável em uma cavidade na interface do domínio CH3 da outra cadeia pesada, e

b) o domínio CH3 da outra cadeia pesada é alterado, de modo que, na interface original do segundo domínio CH3 que encontra a

15/49 interface original do primeiro domínio CH3 no anticorpo bivalente biespecífico, um resíduo de aminoácido seja substituído por um resíduo de aminoácido que apresenta um volume menor de cadeia laterais, gerando desse modo uma cavidade na interface do segundo domínio CH3 na qual é posicionável uma protuberência na interface do primeiro domínio CH3.

Preferencialmente, o resíduo de aminoácido que apresenta um volume maior de cadeias laterais é selecionado do grupo que consiste em arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W).

Preferencialmente, o resíduo de aminoácido que apresenta um volume menor de cadeias laterais é selecionado do grupo que consiste em alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).

Em um aspecto da invenção, ambos os domínios CH3 são adicionalmente alterados pela introdução de cisteína (C) como aminoácido nas posições correspondentes de cada domínio CH3 tal que a ponte de dissulfeto entre ambos os domínios CH3 possa ser formada.

Em outra modalidade preferida da invenção, ambos os domínios CH3 são alterados pelo uso de resíduos R409D; K370E (K409D) para resíduos de saliências e D399K; E357K para resíduos de orifícios descritos, por exemplo, in EP 1870459A1.

ou

B) Segunda alternativa (ver Figura 4):

Pela substituição de um domínio constante CH3 de cadeia pesada por um domínio constante CH1 de cadeia pesada; e o outro domínio constante CH3 de cadeia pesada é substituído por um domínio constante CL de cadeia leve.

O domínio constante CH1 de cadeia pesada pelo qual o domínio CH3 de cadeia pesada é substituído pode ser de qualquer classe Ig (por exemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) ou subclasse Ig (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2).

O domínio constant CL de cadeia leve pelo qual o domínio CH3 de cadeia pesada domínio é substituído pode ser do tipo lâmbda (λ) ou capa

16/49 (κ), preferencialmente do tipo capa (κ).

Assim, uma modalidade preferida da invenção é um anticorpo bivalente biespecífico que compreende:

a) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno; e

b) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e em que opcionalmente

c) o domínio CH3 de uma cadeia pesada e o domínio CH3 da outra cadeia pesada cada encontra-se em uma interface que compreende uma interface original entre os domínios CH3 do anticorpo;

em que essa interface é alterada para promover a formação do anticorpo bivalente biespecífico, em que a alteração caracteriza-se pelo fato de que:

ca) o domínio CH3 de uma cadeia pesada é alterado, de modo que, na interface original do domínio CH3 de uma cadeia pesada que encontra a interface original do domínio CH3 da outra cadeia pesada no anticorpo bivalente biespecífico, um resíduo de aminoácido seja substituído por um resíduo de aminoácido que apresenta um volume maior de cadeias laterais, gerando desse modo uma protuberância na interface do domínio CH3 de uma cadeia pesada que é posicionável em uma cavidade na interface do domínio CH3 da outra cadeia pesada e cb) o domínio CH3 da outra cadeia pesada é alterado, de modo que, na interface original do segundo domínio CH3 que encontra a interface original do primeiro domínio CH3 no anticorpo bivalente biespecífico, um resíduo de aminoácido seja substituído por um resíduo de aminoácido que apresenta um volume menor de cadeias laterais, gerando desse modo uma cavidade na interface do segundo domínio CH3 na qual uma protuberância na interface do primeiro domínio CH3 é posicionável; ou d)

17/49 um domínio constante CH3 de cadeia pesada seja substituído por um domínio constante CH1 de cadeia pesada; e o outro domínio constante CH3 de cadeia pesada seja substituído por um domínio constante CL de cadeia leve.

Os termos antígeno ou molécula de antígeno, como usados neste relatório, são usados de forma intercambiável e referem-se a todas as moléculas que podem se ligar especificamente por um anticorpo. O anticorpo bivalente biespecífico liga-se especificamente a um primeiro antígeno e a um segundo antígeno distinto. O termo antígenos como usado neste relatório inclui, por exemplo, proteínas, diferentes epítopos em proteínas (como diferentes antígenos no significado da invenção) e polissacarídeos. Inclui principalmente partes (revestimentos, cápsulas, paredes celulares, flagelos, fímbras e toxinas) de bactárias, vírus e outros microorganismos. Lipídios e ácidos nucleicos são antigênicos somente quando combinados com proteínas e polissacarídeos. Antígenos não microbianos exógenos (non-self) podem incluir pólen, clara de ovo e proteínas de tecidos e órgãos transplantados ou na superfície de células de sangue transfundido. Preferencialmente, o antígeno é selecionado do grupo que consiste em citocinas, proteínas da superfície celular, enzimas e receptores.

Antígenos tumorais são aqueles antígenos que são apresentados por moléculas MHO I ou MHC II na superfície de células tumorais. Esses antígenos podem às vezes ser apresentados por células tumorais e nunca pelas células normais. Nesse caso, eles são chamados antígenos específicos a tumores (AETs) e normalmente resultam de uma mutação específica a tumor. Mais comuns são antígenos que são apresentados por células tumorais e células normais, e eles são chamados antígenos associados a tumores (AATs). Linfócitos T citotóxicos que reconhecem esses antígenos poderão ser capazes de destruir as células tumorais antes de se proliferarem ou sofrerem metástase. Antígenos tumorais podem também se encontrar na superfície do tumor na forma de, por exemplo, um receptor mutado, em cujo caso eles serão reconhecidos por células B.

Em uma modalidade preferida, pelo menos um dos dois antíge

18/49 nos diferentes (primeiro e segundo antígenos), aos quais o anticorpo bivalente biespecífico liga-se especificamente, é um antígeno de tumor.

Em outra modalidade preferida, os dois antígenos diferentes (primeiro e segundo antígenos), aos quais o anticorpo bivalente biespecífico liga-se especificamente, são antígenos tumorais; nesse caso, o primeiro e o segundo antígenos podem também ser dois epítopos diferentes na mesma proteína específica a tumor.

Em outra modalidade preferida, um dos dois antígenos diferentes (primeiro e segundo antígenos), aos quais o anticorpo bivalente biespecífico liga-se especificamente, é um antígeno de tumor e o outro é um antígeno de célula efetuadora, como, por exemplo, um receptor de células T, CD3, CD16 e similares.

Em outra modalidade preferida, um dos dois antígenos diferentes (primeiro e segundo antígenos), aos quais o anticorpo bivalente biespecífico liga-se especificamente, é um antígeno de tumor e o outro é uma substância anticâncer tal como uma toxina ou um inibidor de quinase.

Como usado neste relatório, que se liga especificamente a ou liga-se especificamente a referem-se a um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno. Preferencialmente, a afinidade de ligação do anticorpo que se liga especificamente a esse antígeno é em termos de valor KD de 10⁹ mol/l ou menos (por exemplo, 10'¹° mol/l), preferencialmente com um valor KD de 10’¹° mol/l ou menos (por exemplo, 10‘¹² mol/l). A afinidade de ligação é determinada com um ensaio padrão de ligação, tal como técnica de ressonância de plasmons de superfície (Biacore®).

O termo epítopo inclui qualquer determinante polipeptídico capaz de ligação específica a um anticorpo. Em certas modalidades, determinante epítopo inclui grupamentos superficiais de moléculas quimicamente ativos tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcares, fosforila ou sulfonila, e, em certas modalidades, poderá apresentar características estruturais tridimensionais específicas e ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que se liga por um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo liga-se especificamente a um antígeno

19/49 quando reconhece preferencialmente seu antígeno-alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas.

Uma modalidade adicional da invenção é um método para a preparação de um anticorpo bivalente biespecífico de acordo com a invenção, compreendendo esse método

a) transformar uma célula hospedeira com

- vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma cadeia leve e um cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antigeno

- vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antigeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro;

b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem sín- tese dessa molécula de anticorpo; e

c) recuperar essa molécula de anticorpo dessa cultura.

Em geral, há dois vetores que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada desse anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antigeno, e, adicionalmente, dois vetores que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada desse anticorpo que se liga especificamente a um segundo antigeno. Um dos dois vetores codifica a respectiva cadeia leve e o outro dos dois vetores codifica a respectiva cadeia pesada. Entretanto, em um método alternativo para a preparação de um anticorpo bivalente biespecífico de acordo com a invenção, apenas um primeiro vetor que codifica a cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antigeno e apenas um segundo vetor que codifica a cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo que se liga especificamente a um segundo antigeno podem ser usados para transformar a célula hospedeira.

A invenção abrange um método para a preparação dos anticor-ί pos que compreende cultivar as células hospedeiras correspondentes sobj condições que permitem síntese das moléculas de anticorpos e recuperarl i

20/49 esses anticorpos dessa cultura, por exemplo, expressando

- uma primeira sequência de ácidos nucleicos que codifica a cadeia leve de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno,

- uma segunda sequência de ácidos nucleicos que codifica a cadeia pesada desse anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno,

- uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica a cadeia leve de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que o domínio variável VL da cadeia leve é substituído pelo domínio variável VH da cadeia pesada, e

- uma quarta sequência de ácidos nucleicos que codifica a cadeia pesada desse anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que o domínio variável VH da cadeia pesada é substituído pelo domínio variável VL da cadeia leve.

Uma modalidade adicional da invenção é uma célula hospedeira que compreende

- vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno,

- vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.

Uma modalidade adicional da invenção é uma célula hospedeira que compreende

a) um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve e um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno,

b) um vetor que compreende uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve e um vetor que compreende uma molécula de á

21/49 cido nucleico que codifica a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.

Uma modalidade adicional da invenção é uma composição, preferencialmente uma composição farmacêutica ou de diagnóstico do anticorpo bivalente biespecífico de acordo com a invenção.

Uma modalidade adicional da invenção é uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo bivalente biespecífico de acordo com a invenção e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Uma modalidade adicional da invenção é um método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia, método este caracterizado por administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo bivalente biespecífico de acordo com a invenção.

O termo ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico, como usado neste relatório, pretende incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico poderá ser de filamento simples ou de filamento duplo, mas preferencialmente é DNA de filamento duplo.

Como usadas neste relatório, as expressões célula, linhagem de células e cultura de células são usadas de maneira intercambiável e todas essas designações incluem progênie. Desse modo, as palavras transformantes e células transformas incluem a célula-objeto primária e culturas derivadas dessa célula sem levar em conta o número de transferências. Entende-se também que todas as progênies não poderão ser exatamente idênticas em teor de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Progênies variantes que apresentam a mesma função ou atividade biológica como exibida na célula originalmente transformada são incluídas. Onde se pretendem designações distintas, estas serão evidentes a partir do contexto.

O termo transformação, como usado neste relatório, refere-se a processo de transferência de um vetor/ácido nucleico para uma célula hospedeira. Se células sem barreiras formidáveis de paredes celulares são usadas como células hospedeiras, transfecção é realizada, por exemplo, pelo método da precipitação de fosfato de cálcio como descrito por Graham

22/49 θ Van der Eh, Virology 52 (1978) 546ss. No entanto, outros métodos para introdução de DNA em células, tais como injeção nuclear ou fusão de protoplastos, poderão também ser utilizados. Se células procarióticas ou células que contêm construções substanciais de paredes celulares são usadas, por exemplo, um método de transfecção é tratamento com calico usando cloreto de calico como descrito por Cohen, F.N. e outros, PNAS. 69 (1972) 7110ss.

Produção de anticorpos recombinantes usando transformação é bem-conhecida no estado da técnica e descrita, por exemplo, nos artigos de revisão de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. e outros, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G. e outros, Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880, bem como in US 6.331.415 e US 4.816.567.

Como usada neste relatório, expressão refere-se ao processo pelo qual um ácido nucléico é transcrito em mRNA e/ou ao processo pelo qual o mRNA transcrito (também referido como transcrito) é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Os transcritos e os polipeptídeos codificados são coletivamente referidos como produto genético. Se o polinucleotídeo é derivado a DNA genômico, expressão em uma células eucariótica poderá incluir splicing do mRNA.

Um vetor é uma molécula de ácido nucléico, em particular autorreplicante, que transfere uma molécula de ácido nucléico introduzida para e/ou entre células hospedeiras. O termo inclui vetores que funcionam principalmente para inserção de DNA ou RNA em uma célula (por exemplo, integração cromossômica), replicação de vetores que funcionam principalmente para a replicação de DNA ou RNA, e vetores de expressão que funcionam para transcrição e/ou tradução do DNA ou RNA. Também incluídos são vetores que proporcionam mais de uma das funções conforme descrito.

Um vetor de expressão é um polinucleotídeo que, quando introduzido em uma célula hospedeira apropriada, pode ser transcrito e traduzido em um polipeptídeo. Um sistema de expressão usualmente refere-se a uma célula hospedeira adequada compreendida de um vetor de expressão que pode funcionar para produzir um produto de expressão desejado.

23/49

Os anticorpos bivalentes biespecíficos de acordo com a invenção são preferencialmente produzidos por meios recombinantes. Tais métodos são amplamente conhecidos no estado da técnica e compreendem expressão de proteína em células procarióticas e eucarióticas com subsequen5 te isolamento do polipeptídeo de anticorpo e usualmente purificação em uma pureza farmaceuticamente aceitável. Para a expressão de proteína, ácidos nucleicos que codificam cadeias leves e pesadas ou fragmentos destas são introduzidos em vetores de expressão por meio de métodos padrões. Expressão é realizada em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas 10 apropriadas semelhantes a células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, lêvedo ou células de E.coli, e o anticorpo é recuperado das células (sobrenadante ou células após lise). Os anticorpos bivalentes biespecíficos poderão estar presentes em células inteiras, em um lisato de células ou sob forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Puri15 ficação é realizada a fim de eliminar outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por meio de técnicas padrões, incluindo tratamento alcalino/SDS, cromatografia em coluna e outras bem conhecidas no estado da técnica. Ver Ausubel, F. e outros, ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publi20 shing e Wiley Interscience, Nova lorque (1987).

Expressão em células NSO é descrita por, por exemplo, Barnes, L.M. e outros, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; e Barnes, L.M. e outros, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Expressão transiente é descrita por, por exemplo, Durocher, Y. e outros, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Clonagem 25 de domínios variáveis é descrita por Orlandi, R. e outros, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 4285-4289; e Norderhaug, L. e outros, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Um sistema de expressão transiente preferido (HEK 293) é descrito por Schlaeger, E.-J., e Christensen, K., in Cytotechnology 30 30 (1999) 71-83, e por Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191199.

As sequências de controle que são adequadas para procarion

24/49 tes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação de ribossomos. Células eucarióticas são sabidas utilizar promotores, potencializadores e sinais de poliadenilação.

Ácido nucleico é operavelmente ligado quando é colocado em relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou sequência condutora de secreção é operavelmente ligado a DNA para um polipeptídeo se ele é expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potencializador é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomos é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele é posicionado de modo a facilitar tradução. Geralmente, operavelmente ligado significa que as sequências de DNA que se ligam são contíguas, e, no caso de uma sequência condutora de secreção, contíguas e na estrutura de leitura. No entanto, potencializadores não têm de ser contíguos. Ligação é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeos sintéticos são usados de acordo com prática convencional.

Os anticorpos bivalentes biespecíficos são adequadamente separados do meio de cultura por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade. DNA ou RNA que codificam os anticorpos monoclonais é prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais. As células de hibridoma podem servir como fonte desses DNA e RNA. Uma vez isolado, o DNA poderá ser introduzido em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tais como células HEK 293, células CHO ou células de mieloma que não produzem de outro modo proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais recombinantes nas células hospedeiras.

Variantes (ou mutantes) de sequências de aminoácidos do anticorpo bivalente biespecífico são preparados introduzindo mudanças de nu

25/49 cleotídeos apropriadas no anticorpo DNA, ou por síntese de nucleotídeos. Tais modificações podem ser realizadas, contudo, somente em uma faixa muito limitada, por exemplo, conforme descrito acima. Por exemplo, as modificações não alteram as características do anticorpo mencionadas acima, tais como o isotipo da IgG e a ligação a antígeno, mas poderão aperfeiçoar o rendimento da produção recombinante, a estabilidade da proteína ou facilidade da purificação da proteína.

Os exemplos seguintes, listagem de sequências e figuras são proporcionados para ajudar na compreensão da presente invenção, cujo verdadeiro escopo é apresentado nas reivindicações anexas. Entende-se que modificações podem ser efetuadas nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da invenção.

Listagem de Sequências

NO ID SEQ: 1 sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo de tipo selvagem <IGF-1R>.

NO ID SEQ: 2 sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo de tipo selvagem <IGF-1R>,

NO ID SEQ: 3 sequência de aminoácidos da cadeia pesada*** (CP***) do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH, em que o domínio VH da cadeia pesada é substituído pelo domínio VL da cadeia leve - variante A.

NO ID SEQ: 4 sequência de aminoácidos da cadeia leve*** (CL***) do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH, em que o domínio VL da cadeia leve é substituído pelo domínio VH da cadeia pesada - variante A.

NO ID SEQ: 5 sequência de aminoácidos do ectodomínio HisEstreptavidina de IGF-1R que se liga a marcador peptídico (IGF-1R-His-SBP ECD).

NO ID SEQ: 6 sequência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo de tipo selvagem Angiopoietina-2 <ANGPT2>.

NO ID SEQ: 7 sequência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo de tipo selvagem Angiopoietina-2 <ANGPT2>.

NO ID SEQ: 8 sequência de aminoácidos do domínio CH3 (Saliências) com uma troca T366W para uso na tecnologia de saliências-em26/49 orifícios.

NO ID SEQ: 9 sequência de aminoácidos do domínio CH3 (Orifício) com uma troca T366S, L368A, Y407V para uso na tecnologia de saliências-em-orifícios.

NO ID SEQ: 10 sequência de aminoácidos da cadeia pesada*** (CP***) do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH, em que o domínio VH da cadeia pesada é substituído pelo domínio VL da cadeia leve - variante B.

NO ID SEQ: 11 sequência de aminoácidos da cadeia leve*** (CL***) do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH, em que o domínio VL da cadeia leve é substituído pelo domínio VH da cadeia pesada - variante B.

NO ID SEQ: 12 sequência de aminoácidos do ectodomínio HisEstreptavidina de IGF-1R que se liga a marcador peptídico (IGF-1R-His-SBP ECD).

Descrição das Figuras

Figura 1 Figura esquemática de IgG, um anticorpo inteiro que ocorre naturalmente específico para um antígeno com dois pares de cadeias pesadas e leves que compreendem domínios variáveis e constantes em uma ordem normal.

Figura 2 Figura esquemática de um anticorpo bivalente biespecífico que compreende: a) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno; e b) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.

Figura 3 Figura esquemática de um anticorpo bivalente biespecífico que compreende: a) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno; e b) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e em que os domínios CH3 de ambas as cadeias pesadas são alterados pela tecnologia de saliências-em-orifícios .

Figura 4 Figura esquemática de um anticorpo bivalente biespe27/49 cífico que compreende: a) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno; e b) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro, e em que um dos domínios constantes CH3 de ambas as cadeias pesadas é substituído por um domínio constante CH1 de cadeia pesada; e o outro domínio constante CH3 de cadeia pesada é substituído por um domínio constante CL de cadeia leve.

Figura 5 Esquema de sequências de proteína da cadeia pesada*** CP*** <IGF-1R> do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH.

Figura 6 Esquema de sequências de proteína da cadeia leve*** CL*** <IGF-1R> do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH (com um domínio constante capa CL de cadeia leve).

Figura 7 Mapa de plasmídeos do vetor de expressão pUCCP***-IGF-1R da cadeia pesada*** CP*** <IGF-1R>.

Figura 8 Mapa de plasmídeos do vetor de expressão pUCCL***-IGF-1R da cadeia leve*** CL*** <IGF-1R>.

Figura 9 Mapa de plasmídeos do vetor de expressão 4700-HygOriP.

Figura 10 Princípio do ensaio de formação de ponte celular IGF1R-ANGPT2 por FACS em células que expressam I24 IGF-1R para detectar a presence de anticorpo biespecífico funcional <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH.

Figura 11 Esquema IGF-1R ECD Biacore.

Figura 12 SDS-PAGE e cromatografia por exclusão de tamanho de anticorpo monoespecífico bivalente purificado <IGF-1R> com troca VLVH (lgG1*), com CP* e CL* isolados de sobrenadantes de culturas de células após transfecão transiente de células HEK293-F.

Figura 13 Ligação de anticorpo monoespecífico <IGF-1R> com troca VL-VH e anticorpo de tipo selvagem <IGF-1R> com IGF-1R ECD em um ensaio de ligação baseado em ELISA.

Figura 14 SDS-PAGE de mistura de anticorpos <ANGPT2-IGF28/49

R> com troca VL-VH purificada de sobrenadantes de culturas de células provenientes de células HEK293-F transientemente transfectadas.

Figura 15 Resultados para Amostras A a F de ensaio de formação de ponte celular IGF-1R-ANGPT2 por FACS em células que expressam I24 IGF-1R para detector a presence de anticorpo biespecífico funcional <ANGPT2-IGF-1 R> com troca VL-VH em mistura de anticorpos purificada. Amstras de proteínas purificada A a F:

A = I24 não tratada

B = I24 + 2 pg/mL de hANGPT2 + Isotipo hlgG

D = I24 + 2 pg/mL de hANGPT2 + Mistura proveniente de coexpressão de anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH e anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> que compreende anticorpo biespecífico <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH

E = I24 + 2 pg/mL de hANGPT2 + anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2>

F = I24 + 2 pg/mL de hANGPT2 + anticorpo de tipo selvagem <IGF-1R>.

Exemplos

Métodos materiais & gerais

Informação geral com relação às sequências de nucleotídeos de cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas humanas é fornecida in: Kabat, E.A. e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Os aminoácidos das cadeias de anticorpos são numeradas e referidas de acordo com numeração EU (Edelman, G.M. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A. e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).

Técnicas de DNA recombinante

Métodos padrões foram usados para manipular DNA conforme descrito in Sambrook, J. e outros, Molecular cloning: A laboratory manual·, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque,

29/49

1989. Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções do fabricante.

Síntese de genes

Segmentos de genes desejados foram preparados de oligonucleotídeos produzidos por síntese química. Os segmentos de genes com 600 1800 pb de comprimento, que são flanqueados por sítios de restrição singulares para divagem por endonuclease, foram unidos por recozimento e ligação de oligonucleotídeos, incluindo amplificação por RCP, e subsequentemente clonados via os sítios de restrição indicados, por exemplo, Kpnl/SacI ou Ascl/Pacl, em um vetor de clonagem pGA4 baseado em pPCRScript (Stratagene). As sequências de DNA dos fragmentos de genes subclonados foram confirmadas por sequenciamento de DNA. Fragmentos de síntese de genes foram ordenados de acordo com especificações fornecidas em Geneart (Regensburg, Alemanha).

Determinação de sequências de DNA

Sequências de DNA foram determinadas por sequenciamento de filamento duplo realizado em MediGenomix GmbH (Martinsried, Alemanha) ou Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Alemanha).

Análise de sequências de DNA e de proteínas e controle de dados das sequências

O pacote de softwares versão 10.2 da GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) e o pacote Vetor NT1 Advance versão 8.0 da Infomax foram usados para criação, mapeamento, análise, anotação e ilustração de sequências.

Vetores de expressão

Para a expressão das variantes de plasmídeos de expressão de anticorpos descritas para expressão transiente (por exemplo, em HEK293 EBNA ou HEK293-F), foram aplicadas células baseadas em uma organização de cDNAs com um promotor CMV-íntron A ou em uma organização genômica com um promotor CMV.

Além do cassette de expressão de anticorpos, os vetores continham:

30/49

- uma origem de replicação que permite replicação desse plasmídeo em E. coli, e

- um gene para β-lactamase que confere resistência a ampicilina em E. coli.

A unidade de transcrição do gene para anticorpo é composta dos seguintes elementos:

- sítio(s) de restrição único(s) na extremidade 5’,

- o potencializador e o promotor iniciais imediatos do citomegalovírus humano,

- seguidos pela sequência de íntron A no caso da organização de cDNAs,

- uma região não traduzida 5’ de um gene para anticorpo humano,

- uma sequência sinalizadora de cadeia pesada de imunoglobulina,

- a cadeia de anticorpo humano (de tipo selvagem ou com troca de domínios) ou como organização de cDNAs ou como organização genômica com uma organização éxons-íntrons de imunoglobulina,

- uma região não traduzida 3’ com uma sequência sinalizadora de poliadenilação, e

- sítio(s) de restrição único(s) na extremidade 3’.

Os genes de fusão que compreendem as cadeias de anticorpos como descritas abaixo foram gerados por RCP e/ou síntese de genes e unidos por meio de métodos e técnicas recombinantes conhecidos pela ligação dos segmentos de ácidos nucleicos, por exemplo, usando sítios de restrição únicos nos respectivos vetores. As sequências de ácidos nucleicos subclonadas foram verificadas por sequenciamento de DNA. Para transfecções transients, quantidades maiores dos plasmídeos foram preparadas mediante preparação de plasmídeos a partir de culturas de E. coli transformadas (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Técnicas de cultura de células

Técnicas padrões de cultura de células foram usadas conforme

31/49 descrito in Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc..

Anticorpos biespecíficos foram expressos por cotransfecção transiente dos respectivos plasmídeos de expressão em células HEK293EBNA que crescem de modo aderente ou em células HEK29-F que crescem em suspensão conforme descrito abaixo.

Transfecções transientes em sistema HEK293-EBNA

Anticorpos biespecíficos foram expressos por cotransfecção transiente dos respectivos plasmídeos de expressão (por exemplo, codificando a cadeia pesada e cadeia pesada modificada, bem como a correspondente cadeia leve e cadeia leve modificada) em células HEK293-EBNA que crescem de modo aderente (linhagem de células embrionárias 293 de rim humano que expressam antigen nuclear a vírus de Epstein-Barr; número de depósito ATCC No. CRL-10852, Lot. 959 218, Coleção de culturas tipo americano), cultivadas em DMEM (meio Dulbecco modificado por Eagle, Gibco), suplementadas com IgG SFB Ultrabaixo a 10% (soro fetal bovino, Gibco), L-Glutamina 2 mM (Gibco) e 250 pg/ml de Geneticina (Gibco). Para transfecção, Reagente de Transfecção FuGENE™ 6 (Roche Molecular Biochemicals) foi usado sob uma razão de reagente FuGENE™ (pl) para DNA (pg) de 4:1 (variando de 3:1 a 6:1). Proteínas foram expressas a partir dos respectivos plasmídeos usando uma razão molar de plasmídeos que codificam cadeias leves e cadeias pesadas (modificadas e de tipo selvagem) de 1:1 (equimolar), variando de 1:2 a 2:1, respectivamente. As células foram alimentadas no 3^o dia 3 com L-Glutamina até 4 mM, Glicose [S/gma] e NAA [G/bco], Sobrenadantes de culturas de células contendo anticorpos biespecíficos foram colhidos do 5^o ao 11° após transfecção por centrifugação e armazenados a -20°C. Informação geral em relação à expressão recombinante de imunoglobulinas humanas em, por exemplo, células HEK293 é fornecida in: Meissner, P. e outros, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.

Transfecções transientes em sistema HEK293-F

Anticorpos biespecíficos foram gerados por transfecção transien

32/49 te dos respectivos plasmídeos (por exemplo, codificando a cadeia pesada e cadeia pesada modificada, bem como a correspondente cadeia leve e cadeia leve modificada), usando o sistema HEK293-F (Invitrogen) de acordo com a instrução do fabricante. Em resumo, células HEK293-F (Invitrogen) que crescem em suspensão ou em um balão de agitação ou em um fermentador com agitação em meio de expressão sem soro Freestyle 293 (Invitrogen) foram transfectadas com uma mistura dos quatro plasmídeos de expressão e 293fectina ou fectina (Invitrogen). Para balão de agitação de 2 L (Corning), células HEK293-F foram semeadas sob uma densidade de 1,0E*6 células/mL em 600 mL e incubadas a 120 rpm, 8% de CO2. No dia seguinte, as células foram transfectadas sob uma densidade celular de cerca de 1,5E*6 células/mL com cerca de 42 mL de mistura de A) 20 mL de OptiMEM (Invitrogen) com 600 pg de DNA total de plasmídeo (1 pg/mL) que codifica a cadeia pesada ou cadeia pesada modificada, respectivamente, e a correspondente cadeia leve sob uma razão equimolar, e B) 20 ml de OptiMEM + 1,2 mL de 293 fectina ou fectina (2 pl/mL). De acordo com o consumo de glucose, solução de glicose foi adicionada durante o curso da fermentação. O sobrenadante contendo os anticorpos secretados foi colhido após 5-10 dias e os anticorpos foram diretamente purificados do sobrenadante ou o sobrenadante foi congelado e armazenado.

Determinação de proteínas

A concentração de proteínas de anticorpos e derivados purificados foi determinada determinando a densidade óptica (DO) a 280 nm, usando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos de acordo com Pace e outros, Protein Science, 1995, 4, 24111423.

Determinação da concentração de anticorpos em sobrenadantes

A concentração de anticorpos e derivados em sobrenadantes de culturas de células foi estimada por imunoprecipitação com contas de Agarose com Proteína A (Roche). 60 pL de contas de Agarose com Proteína A são lavados três vezes em TBS-NP40 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, Nonidet-P40 a 1%). Subsequentemente, 1 - 15 mL de sobrenadante de cul

33/49 tura de células foram aplicados às contas de Agarose com Proteína A préequilibradas em TBS-NP40. Após incubação por 1 h a temperatura ambiente, as contas foram lavadas em uma coluna de filtração Ultrafree-MC (Amicon), uma vez com TBS-NP400.5 mL, duas vezes com 0,5 mL de 2x solução salina tamponada com fosfato (2xSTF, Roche) e brevemente quatro vezes com 0,5 mL de citrato de Na 100 mM, pH 5,0. Anticorpo ligado foi eluído por adição de 35 pl de Amostra de Tampão LDS NuPAGE® (Invitrogen). Metade da amostra foi combinada com Agente Redutor de Amostra NuPAGE® ou deixada sem redução, respectivamente, e aquecida por 10 min a 70°C. Consequentemente, 5-30 pl foram aplicados a um NuPAGE® Bis-Tris SDSPAGE 4-12% (Invitrogen) (com tampão MOPS para SDS-PAGE não reduzido e tampão MES com aditivo de tampão que processa antioxidante NuPAGE® (Invitrogen) para SDS-PAGE reduzido) e corado com Azul de Coomassie.

A concentração de anticorpos e derivados em sobrenadantes de culturas de células foi quantitativamente medida por cromatografia por afinidade CLAE. Resumidamente, sobrenadantes de culturas de células que contêm anticorpos e derivados que se ligam a Proteína A foram aplicados a uma coluna A/20 Applied Biosystems Poros em KH2PO4 200 mM, citrato de sódio 100 mM, pH 7,4, e eluídos da matriz com NaCI 200 mM, ácido cítrico 100 mM, pH 2,5, em um sistema Agilent HPLC 1100. A proteína eluída foi quantificada por absorbância de UV e integração de áreas de pico. Um anticorpo padrão lgG1 purificado serviu como padrão.

Alternativamente, a concentração de anticorpos e derivados em sobrenadantes de culturas de células foi medida por Sanduíche-lgG-ELISA. Em resumo, placas de microtitulação de 96 poços StreptaWell High Bind Strepatavidin A (Roche) foram revestidas com 100 pL/poço de molécula de captura de IgG anti-humana biotinada F(ab’)2<h-FcY> BI (Dianova) sob 0,1 pg/mL por 1 h a temperatura ambiente ou alternativamente durante a noite a 4°C, e, subsequentemente, lavadas três vezes com 200 pL/poço de STF, Tween 0,05% (STFT, Sigma). 100 pL/poço de uma série de diluições em STF (Sigma) dos respectivos sobrenadantes de culturas de células contendo

34/49 anticorpos foram adicionados aos poços e incubados por 1-2 h em um agitador de placas de microtitulação a temperatura ambiente. Os poços foram lavados três vezes com 200 pL/poço de STFT e anticorpo ligado foi detectado com 100 pl de F(ab‘)2<hFcv>POD (Dianova) sob 0,1 pg/mL como anti5 corpo de detecção por 1-2 h em um agitador de placas de microtitulação a temperatura ambiente. Anticorpo de detecção não ligado foi lavado três vezes com 200 pL/poço de STFT e o anticorpo de detecção ligado foi detectado por adição de 100 pL de ABTS/poço. Determinação de absorbância foi realizada em um Espectrômetro Tecan Fluor sob um comprimento de onda 10 de medição de 405 nm (comprimento de onda de referência de 492 nm).

Purificação de proteínas

As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes de culturas de células filtrados com referência a protocolos padrões. Em resumo, anticorpos foram aplicados a uma coluna de Proteína A Sefarose (GE heal15 thcare) e lavados com STF. Eluição de anticorpos foi obtida sob pH 2,8 seguida de imediata neutralização da amostra. Proteína agregada foi separada de anticorpos monoméricos por meio de cromatografia por exclusão de tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em STF ou em Histidina 20 mM, NaCl 150 mM, pH 6,0. Frações de anticorpos monoméricos foram combinadas, 20 concentradas se necessário usando, por exemplo, um concentrador centrífugo Amicon Ultra MILLIPORE (30 MWCO), congeladas e armazenadas a 20°C ou -80°C. Parte das amostras foi destinada a subsequente análise e caracterização analítica de proteínas, por exemplo, por SDS-PAGE, cromatografia por exclusão de tamanho ou espectrometria de massa.

SDS-PAGE

O sistema de gel Pre-Cast NuPAGE® (Invitrogen) foi usado de acordo com a instrução do fabricante. Em particular, foram usados géis PreCast 10% ou 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS (pH 6,4) e um tampão de operação MES NuPAGE® (géis reduzidos, com aditivo de tampão que pro30 cessa antioxidante NuPAGE®) ou tampão de operação MOPS (géis não reduzidos).

Cromatografia analítica por exclusão de tamanho

35/49

Cromatografia por exclusão de tamanho para a determinação da agregação e estado oligomérico de anticorpos foi realizada por cromatografia CLAE. Resumidamente, anticorpos purificados de Proteína A foram aplicados a uma coluna G3000SW Tosoh TSKgel sob NaCI 300 mM, KH2PO4/K2HPO4 50 mM, pH 7,5, em um sistema Agilent HPLC 1100 ou a uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) em 2 x STF em um sistema Dionex HPLC. A proteína eluída foi quantificada por absorbância de UV e integração de áreas de pico. Padrão de Filtração em Gel BioRad 151-1901 serviu como padrão.

Espectrometria de massa

A massa total desglicosilada de anticorpos crossover foi determinada e confirmada via espectrometria de massa por ionização por eletropulverização (EM-IEP). Resumidamente, 100 pg de anticorpos purificados foram desglicosilados com N-Glicosidase F 50 mil (PNGaseF, ProZyme) em KH2PO4/K2HPO4 100 mM, pH 7, a 37°C por 12-24 h sob uma concentração de proteína de até 2 mg/ml e subsequentemente dessalgados via CLAE em uma coluna Sephadex G25 (GE Healthcare). A massa das respectivas cadeias pesadas e leves foi determinada por EM-IEP após desglicosilação e redução. Em resumo, 50 pg de anticorpos em 115 μΙ foram incubados com 60 μΙ de TCEP 1M e 50 μΙ de cloridreto de Guanidina 8 M e subsequentemente dessalgados. A massa total e a massa das cadeias pesadas e leves reduzidas foram determinadas via EM-IEP em um sistema Q-Star Elite MS equipado com uma fonte NanoMate.

Ligação de IGF-1R ECD em ELISA

As propriedades de ligação dos anticorpos gerados foram avaliadas em um ensaio ELISA com o domínio extracelular domínio (DEC ou ECD) de IGF-1R. Por esse motivo, o domínio extracelular de IGF-1R (resíduos 1-462) que compreende a sequência condutora natural e os 12 domínios LI ricos em cisteína do ectodomínio da cadeia alfa de IGF-IR humano (de acordo com McKern e outros, 1997; Ward e outros, 2001) fundidos em um marcador peptídico que se liga a His-Estreptavidina no término N (HisSBP) foram clonados em um vetor pcDNA3 derivado e transientemente ex

36/49 presso em células HEK293F. A sequência protéica de IGF-1R-His-SBP ECD é fornecida em NO ID SEQ: 12. Placas de microtitulação de 96 poços StreptaWell High Bind Strepatavidin A (Roche) foram revestidas com 100 pL/poço de sobrenadante de cultura de células contendo proteína de fusão solúvel IGF-1R-ECD-SBP durante a noite a 4°C e lavadas três vezes com 200 pL/poço de STF, Tween 0,05% (STFT, Sigma). Subsequentemente, 100 pL/poço de uma série de diluições do respectivo anticorpo e como anticorpo de referência de tipo selvagem <IGF-1R> em STF (Sigma), incluindo BSA a 1% (fração V, Roche), foram adicionados aos poços e incubados por 1-2 h em um agitador de placas de microtitulação a temperatura ambiente. Para a série de diluições, a mesma quantidade de anticorpo purificado foi aplicada aos poços. Os poços foram lavados três vezes com 200 pL/poço de STFT e anticorpo ligado foi detectado com 100 pL/poço de F(ab‘)2<hFcv>POD (Dianova) sob 0,1 pg/mL (1:8000) como anticorpo de detecção, por 1-2 h em um agitador de placas de microtitulação a temperatura ambiente. Anticorpo de detecção não ligado foi lavado três vezes com 200 pL/poço de STFT e o anticorpo de detecção ligado detectado mediante adição de 100 pL ABTS/poço. Determinação de absorbância foi realizada em um Espectrômetro Tecan Fluor sob um comprimento de onda de medição de 405 nm (comprimento de onda de referência de 492 nm).

IGF-1R ECD Biacore

Ligação dos anticorpos gerados a IGF-1R ECD humana foi também investigada por ressonância de plásmons de superfície utilizando um instrumento BIACORE T100 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). Resumidamente, para medições por afinidade, anticorpos IgG de Cabra Anti-Humanos, JIR 109-005-098, foram imobilizados em uma lâmina CM5 via acoplamento de amina para apresentação dos anticorpos contra IGF-1R ECD-Fc humana marcada. Ligação foi medida em tampão HBS (HBS-P (HEPES 10 mM, NaCI 150 mM, Tween 20 0,005%, pH 7,4), 25°C. IGF-1R ECD (R&D Systems ou purificado domesticamente) foi adicionada em várias concentrações em solução. Associação foi medida por meio de uma injeção de IGF-1R ECD de 80 segundos a 3 minutos; dissociação foi medida lavan37/49 do a a superfície da lâmina com tampão HBS por 3 - 10 minutos e urn valor KD foi estimado usando um modelo de ligação Langmuir 1:1. Devido a baixo nível de densidade de carga e de captura de anticorpos monovalentes <IGF1R>, obteve-se ligação de IGF-1R ECD. Dados de controle negativos (por 5 exemplo, curvas de tampão) foram subtraídos de curvas de amostra para correção de desvio intrínseco de referência do sistema e para redução de sinais de ruído. Software de Avaliação Biacore T100 versão 1.1.1 foi usado para análise de sensorgramas e para cálculo de dados de afinidade. A Figura 11 mostra um esquema do ensaio Biacore.

Exemplos 1

Produção, expressão, purificação e caracterização de anticorpo bivalente monoespecífico <IGF-1R>, em que os domínios variáveis CL e CH1 são substituídos um pelo outro (abreviado aqui como anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH).

Exemplo 1A

Produção dos plasmídeos de expressão para o anticorpo bivalente monoespecífico <IGF-1R> com troca VL-VH

As sequências para os de domínios variáveis cadeias pesadas e leves do anticorpo bivalente monoespecífico <IGF-1R> com troca VL-VH, 20 incluindo as respectivas sequências condutoras descritas neste exemplo, são derivadas da cadeia pesada (NO ID SEQ: 1, plasmídeo 4843-pUC-CPIGF-1R) e da cadeia leve (NO ID SEQ: 2, plasmídeo 4842-pUC-CL-IGF-1R) de um anticorpo humano <IGF-1R> descrito in \NO 2005/005635, e os domínios constantes das cadeias pesada e leve são derivados de um anticorpo 25 humano (C-capa e lgG1).

Os segmentos de genes que codificam a sequência condutora, o domínio variável (VL) da cadeia leve e o domínio humano constante da cadeia pesada 1 (CH1) do anticorpo <IGF-1R> foram unidos e fundidos com a extremidade 5’ dos domínios Fc dos domínios humanos constantes γ1 da 30 cadeia pesada (Articulação-CH2-CH3). O DNA que codifica a respectiva proteína de fusão resultante da troca do domínio VH pelo domínio VL (troca VHVL) foi gerado por síntese de genes e é denotado como <IGF-1R> CP***

38/49 (NO ID SEQ; 10) a seguir. Inicialmente, os domínios VL-CH1 foram fundidos com a sequência ligeiramente diferente (NO ID SEQ: 3); devido aos reduzidos rendimentos de expressão dessa ligação, SEQ10 que mostra rendimentos de expressão comparáveis aos de anticorpos de tipo selvagem foi esco5 Ihida.

Os segmentos de genes para a sequência condutora, o domínio variável (VH) da cadeia pesada e o domínio humano constante (CL) da cadeia leve foram unidos como cadeia independente. O DNA que codifica a respectiva proteína de fusão resultante da troca do domínio VL pelo domínio 10 VH (troca VL-VH) foi gerado por síntese de genes e é denotado como <IGF1R> CL*** (Cadeia Pesada***) (NO ID SEQ: 11) a seguir. Inicialmente, os domínios VH-CL foram fundidos com a sequência ligeiramente diferente (NO ID SEQ: 4); devido aos reduzidos rendimentos de expressão dessa ligação, NO ID SEQ: 11 que mostra rendimentos de expressão comparáveis aos de 15 anticorpos de tipo selvagem foi escolhida.

A Figura 5 e a Figura 6 mostram uma vista esquemática da sequência protéica da cadeia pesada modificada <IGF-1R> CP*** e da cadeia leve modificada <IGF-1R> CL***.

A seguir, os respectivos vetores de expressão são resumida20 mente descritos:

Vetor pUC-CP***-IGF-1R

O vetor pUC-CP***-IGF-1 R é um plasmídeo de expressão, por exemplo, para expressão transiente de uma cadeia pesada CP*** de <IGF1R> com troca VL-VH (cassette de expressão organizado de cDNA; com 25 CMV-íntron A) em células HEK293 (EBNA) ou para expressão estável em células CHO.

Além do cassette de expressão de <IGF-1R> CP***, este vetor contém:

- uma origem de replicação do vetor pUC18 que permite replicação desse plasmídeo em E. coli, e

- um gene para β-lactamase que confere resistência a ampicilina em E. coli.

A unidade de transcrição do gene para <IGF-1R> CP*** é com39/49 posta dos seguintes elementos:

- o sítio de restrição Ascl na extremidade 5',

- o potencializador e promotor iniciais imediatos do citomegalovírus humano,

- seguidos da sequência de íntron A,

- uma região não traduzida 5’ de um gene para anticorpo humano,

- uma sequência sinalizadora de cadeia leve de imunoglobulina,

- a cadeia CP*** madura de <IGF-1R> humano que codifica uma fusão do domínio variável humano (VH) de cadeia pesada e do domínio constante humano (CL) da cadeia leve capa fundidos na extremidade 5’ dos domínios Fc dos domínios constantes humanos y1 de cadeia pesada (Articulação-CH2-CH3),

- uma região não traduzida 3’ com uma sequência sinalizadora de poliadenilação, e

- o sítio de restrição SgrAI na extremidade 3’.

O mapa de plasmídeos do vetor de expressão pUC-CP***-IGF1R de <IGF-1R> CP*** com troca VL-VH na cadeia pesada*** é mostrado na Figura 7. A sequência de aminoácidos de <IGF-1R> CP*** (incluindo sequência sinalizadora) é fornecida em NO ID SEQ: 10.

Vetor pUC-CL***-IGF-1R

O vetor pUC-CL***-IGF-1 R é um plasmídeo de expressão, por exemplo, para expressão transiente de uma cadeia leve CL*** de <IGF-1R> com troca VL-VH (cassette de expressão organizado de cDNA; com CMVíntron A) em células HEK293 (EBNA) ou para expressão estável em células CHO.

Além do cassette de expressão de <IGF-1R> CL***, este vetor contém:

- uma origem de replicação do vetor pUC18 que permite replicação desse plasmídeo em E. coli, e

- um gene para β-lactamase que confere resistência a ampicilina em E. coli.

A unidade de transcrição do gene para <IGF-1R> CL*** é composta dos

40/49 seguintes elementos:

- o sítio de restrição Sse8387l na extremidade 5’,

- o potencializador e o promotor iniciais imediatos do citomegalovírus humano,

- seguidos pela sequência de íntron A,

- uma região não traduzida 5’ de um gene para anticorpo humano,

- uma sequência sinalizadora de cadeia pesada de imunoglobulina,

- a cadeia CL*** madura do anticorpo humano <IGF-1R> que codifica uma fusão do domínio variável humano (VL) de cadeia leve e dos domínios constantes humanos γ1 de cadeia pesada (CH1),

- uma região não traduzida 3’ com uma sequência sinalizadora de poliadenilação, e

- os sítios de restrição Sail e Fsel na extremidade 3’.

O mapa de plasmídeos do vetor de expressão pUC-CL***-IGF1R de <IGF-1R> CL*** com troca VL-VH na cadeia leve*** é mostrado na Figura 8. A sequência de aminoácidos de <IGF-1R> CL*** (incluindo sequência sinalizadora) é fornecida em NO ID SEQ: 11.

Os plasmídeos pUC-CP***-IGF-1R e pUC-CL***-IGF-1R podem ser usados para cotransfecções transientes ou estáveis, por exemplo, em células HEK293, HEK293 EBNA ou CHO (sistema de dois vetores). Para fins de comparação, o anticorpo de tipo selvagem <IGF-1R> foi transientemente expresso de plasmídeos 4842-pUC-CL-IGF-1R (NO ID SEQ: 2) e 4843-pUC25 CP-IGF-1R (NO ID SEQ: 1) análogos àqueles descritos neste exemplo.

A fim de obter níveis maiores de expressão em expressões transientes em células HEK293 EBNA, o cassette de expressão de <IGF-1R> CP*** pode ser subclonado via os sítios Ascl, SgrAI, e o cassette de expressão de <IGF-1R> CL*** pode ser subclonado via os sítios Sse8387l e

Fsel no vetor de expressão 4700 p(JC-Hyg_OriP que contém:

- um elemento OriP e

- um gene para resistência a higromicina como marcador sele-

41/49 cionável.

Unidades de transcrição de cadeias pesadas e leves podem ser subclonadas em dois vetores independentes 4700-pUC-Hyg-OriP para cotransfecção (sistema de dois vetores) ou podem ser clonadas em um vetor comum 4700-pUC-Hyg-OriP (sistema de um vetor) para subsequentes transfecções transientes ou estáveis com os vetores resultantes. A Figura 9 mostra um mapa de plasmídeos do vetor básico 4700-pUC-OriP.

Exemplo 1B

Produção dos plasmídeos de expressão do anticorpo bivalente monoespecífico <IGF-1R> com troca VL-VH

Os genes de fusão (genes de fusão CP*** e CL***) para <IGF1R> que compreendem as sequências trocadas Fab do anticorpo de tipo selvagem <IGF-1R> foram unidos com métodos e técnicas recombinantes conhecidos mediante ligação de acordo com segmentos de ácidos nucleicos.

As sequências de ácidos nucleicos que codificam CP*** e CL*** de IGF-1R foram cada uma sintetizadas por síntese química e subsequentemente clonadas em um vetor de clonagem pGA4 baseado em pPCRScript (Stratagene) em Geneart (Regensburg, Alemanha). O cassette de expressão que codifica CP*** de IGF-1R foi ligado ao respectivo plasmídeo de E. coli via os sítios de restrição Pvull e BmgBI, resultando no vetor final pUC-CP***IGF-1R; o cassette de expressão que codifica a respectivo CL*** IGF-1R foi ligado ao respectivo plasmídeo de E. coli via os sítios de restrição Pvull e Sail, resultando no vetor final pUC-CL***-IGF-1 R. As sequências de ácidos nucleicos subclonadas foram verificadas por sequenciamento de DNA. Para transfecções transientes e estáveis, quantidades maiores dos plasmídeos foram preparadas por meio de preparação de plasmídeo a partir de culturas de E. coli transformadas (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Exemplo 1C

Expressão transiente de anticorpo bivalente monoespecífico IGF-1R> com troca VL-VH, purificação e confirmação de identidade por espectrometria de massa

Anticorpo recombinante <IGF-1 R> com troca VL-VH foi expresso

42/49 por cotransfecção transiente de plasmídeos pUC-CP***-IGF-1R e pUCCL***-IGF-1R em células HEK293-F em suspensão conforme descrito acima.

O anticorpo bivalente monoespecífico <IGF-1R> com troca VLVH expresso e secretado foi purificado de sobrenadantes de culturas de células filtrados por meio de cromatografia por afinidade de Proteína A conforme descrito acima. Em resumo, o anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH contendo sobrenadantes de culturas de células provenientes de transfecções transientes foi depurado por centrifugação e fiitração e aplicado a uma coluna HiTrap MabSelect Xtra com Proteína A (GE Healthcare) equilibrada com tampão STF (Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1 mM, NaCI 137 mM e KCI 2,7 mM, pH 7,4). Proteínas não ligadas foram lavadas com tampão de equilíbrio STF seguido de tampão de citrato de sódio 0,1 M, pH 5,5, e lavadas com STF. Eluição de anticorpo foi obtida com citrato de sódio 100 mM, pH 2,8, seguida de imediata neutralização da amostra com 300 pl Tris 2 M, pH 9,0, por 2 ml de fração. Proteína agregada foi separada de anticorpos monoméricos por cromatografia por exclusão de tamanho em uma coluna de grau preparativo HiLoad 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare) em Histidina 20 mM, NaCI 150 mM, pH 6,0, e frações de anticorpos monoméricos foram subsequentemente concentradas usando um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra-15. Anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH foi congelado e armazenado a -20°C ou -80°C. A integridade do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH foi analizada por SDS-PAGE na presença e ausência de um agente redutor e subsequente coloração com azul brilhante de Coomassie conforme descrita acima. O estado monomérico do anticorpo <IGF-1R> com troca VLVH foi confirmado por cromatografia analítica por exclusão de tamanho (Figura 12). Amostras caracterizadas foram proporcionadas para subsequente análise e caracterização funcional de proteína. Espectrometria de massa ESI confirmou a massa molecular teórica do anticorpo <IGF-1R> com troca VLVH completamente desglicosilado.

Exemplo 1D

Análise das propriedades de ligação de anticorpo bivalente monoespecífico

43/49 <IGF-1R> com troca VL-VH com IGF-1R em um ELISA de ligação IGF-1R ECD e por Biacore

As propriedades de ligação de anticorpo bivalente monoespecifico <IGF-1 R> com troca VL-VH foram avaliadas em um ensaio ELISA com o domínio extracelular (ECD) de IGF-1R como descrito acima. Com essa finalidade, o domínio extracelular de IGF-1R (resíduos 1-462) que compreende a sequência condutora natural e os 12 domínios LI ricos em cisteína do ectodomínio da cadeia alfa de IGF-IR humano (de acordo com McKern e outros, 1997; Ward e outros, 2001) fundidos em um marcador peptídico que se liga a His-Estreptavidina no término N (His-SBP) foram clonados em um vetor pcDNA3 derivado e transientemente expresso em células HEK293F. A sequência protéica de IGF-1R-His-SBP ECD é fornecida acima. A curva de titulação obtida mostrou que anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH era funcional e apresentava características de ligação e cinética como as do anticorpo de tipo selvagem <IGF-1R> dentro do erro do método e, assim, pareceu plenamento funcional (Figura 13).

Essas verificações são confirmadas por Biacore com os respectivos anticorpos purificados.

Exemplo 1G

Análise das propriedades de ligação de anticorpo bivalente monoespecífico IGF-1R> com troca VL-VH com IGF-1R por FACS com células I24 que superexpressam IGF-1R

A fim de confirmar a atividade de ligação do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH ao IGF-1R superexpresso na superfície de células I24 (células NIH3T3 que expressam IGF-1R recombinante humano, Roche), é realizado estudo por FACS. Resumidamente, 5x10E5 células I24 por tubo de FACS são incubados com uma diluição de anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH purificado e anticorpo de tipo selvagem <IGF-1R> como referência e incubados sobre gelo por 1 h. Anticorpo não ligado é lavado com 4 ml de STF gelado (Gibco) + SFB a 2% (Gibco). Subsequentemente, células são centrifugadas (5 min a 400 g) e anticorpo ligado é detectado com conjugado F(ab‘)2 <hFcv>PE (Dianova) sobre gelo por 1 h protegido de luz. Anticorpo

44/49 de detecção não ligado é lavado com 4 ml de STF gelado + SFB a 2%. Subsequentemente, células são centrifugadas (5 min a 400 g), ressuspensas em 300-500 pL de STF e anticorpo de detecção ligado é quantificado em um FACSCalibur ou FACSCanto (BD (dois canais FL, 10.000 células por aquisição). Durante o experimento, os respectivos controles de isotipo são incluídos para excluir quaisquer episódios de ligação inespecífica. Ligação do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH e anticorpo de tipo de selvagem de referência <IGF-1R> a IGF-1R sobre células I24 resulta em um deslocamento comparável de intensidade média de fluorescência dependente de concentração.

Exemplos 2

Descrição de um anticorpo bivalente monoespecífico <ANGPT2> de tipo selvagem

Exemplo 2A

Produção dos plasmídeos de expressão para o anticorpo bivalente monoespecífico <ANGPT2> de tipo selvagem

As sequências para os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves de um anticorpo bivalente monoespecífico ANGPT2 <ANGPT2> de tipo selvagem, incluindo as respectivas sequências condutoras descrito neste exemplo, são derivadas de uma de cadeia pesada (NO ID SEQ: 6) e de uma cadeia leve (NO ID SEQ: 7) de anticorpo humano <ANGPT2> descritas in \NO 2006/045049, e os domínios constantes das cadeias pesadas e leves são derivados de um anticorpo humano (C-capa e lgG1).

O anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> foi clonado em plasmídeos SB04-pUC-CP-ANGPT2 (NO ID SEQ: 6) e SB06-pUC-CL-ANGPT2 (NO ID SEQ: 7) que são análogos aos vetores descritos no exemplo 1A anterior.

Para fins de comparação e para experimentos de coexpressão (ver exemplo 3), o anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> foi transientemente (co)expresso a partir de plasmídeos SB04-pUC-CP-ANGPT2 e SB06PUC-CL-ANGPT2.

Exemplo 2B

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Produção dos plasmídeos de expressão de anticorpo bivalente monoespecífico <ANGPT2> de tipo selvagem

As sequências de ácidos nucleicos que codificam as cadeias CP e CL de <ANGPT2> foram cada uma sintetizadas por síntese química e subsequentemente clonadas em um vetor de clonagem pGA4 baseado em pPCRScript (Stratagene) em Geneart (Regensburg, Alemanha). O cassette de expressão que codifica a CP de <ANGPT2> foi clonada no respectivo plasmídeo de E. coli resultando no vetor final SB04-pUC-CP-ANGPT2; o cassette de expressão que codifica a respectiva CL de <ANGPT2> foi clonado no respectivo plasmídeo de E. coli resultando no vetor final SB06-pUC-CLANGPT2. As sequências de ácidos nucleicos subclonadas foram verificadas por sequenciamento de DNA. Para transfecções transientes e estáveis, quantitidades maiores dos plasmídeos foram preparadas por meio de preparação de plasmídeo a partir de culturas de E. coli transformadas (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

Exemplos 3

Expressão de anticorpo bivalente biespecífico <ANGPT2-IGF-1R>, em que na cadeia pesada e cadeia leve que se ligam especificamente a IGF-1R os domínios constantes VL e VH são substituídos um pelo outro (abreviado aqui anticorpo <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH)

Exemplo 3A

Coexpressão transiente e purificação do anticorpo <IGF-1 R> com troca VLVH e anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> em células HEK293 EBNA para produzir anticorpo biespecífico <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH

A fim de gerar um anticorpo biespecífico funcional que reconhece IGF-1R via o anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH, Fab de um lado e <ANGPT2> via região Fab de <ANGPT2> de tipo selvagem do outro lado, os dois plasmídeos de expressão que codificam o anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH (exemplo 1A) foram coexpressos com dois plasmídeos de expressão que codificam o anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> (exemplo 2A). Admitindo uma associação estatística das cadeias pesadas de tipo selvagem CP e das cadeias pesadas CP*** com troca VL-VH, isso resulta na geração

46/49 de anticorpo biespecífico e bivalente <IGF-1R-ANGPT2> com troca VL-VH. Sob a admissão de que ambos os anticorpos são igualmente bem expressos e sem levar em conta produtos secundários, esse procedimento deve resultar em uma razão de 1:2:1 dos três produtos principais: A) anticorpo <IGF1R> com troca VL-VH, B) anticorpo biespecífico <IGF-1R-ANGPT2> com troca VL-VH, e C) anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2>. Diversos produtos secundários podem ser esperados. Entretanto, devido à troca de apenas os domínios VL-VH, a frequência de produtos secundários deve ser reduzida em comparação com o crossover completo de Fab. Observe-se por favor como o anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> mostrou rendimentos de expressão transiente maiores do que os de anticorpo de tipo selvagem <IGF1R> e de anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH; a razão de plasmídeos de anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> e plasmídeos de anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH foi deslocada em favor da expressão de anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2>.

Para gerar a mistura dos produtos principais A) anticorpo <IGF1R> com troca VL-VH, B) anticorpo biespecífico <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH , e C) anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2>, os quatro plasmídeos pUC-CP***-IGF-1R e pUC-CL***-IGF-1R e plasmídeos SB04-pUCCP-ANGPT2 e SB06-pUC-CL-ANGPT2 foram transientemente cotransfectados em células HEK293-F em suspensão conforme descrito acima. O sobrenadante colhido continha uma mistura dos produtos principais A) anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH, B) anticorpo biespecífico <ANGPT2-IGF-1 R> com troca VL-VH, e C) anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> e é denotado como Mistura biespecífica com troca VL-VH. Sobrenadantes de culturas de células contendo mistura biespecífica com troca VL-VH foram colhidos por centrifugação e subsequentemente purificados como decrito acima.

A integridade da mistura de anticorpos foi analizada por SDSPAGE na presença e ausência de um agente redutor e subsequente coloração com azul brilhante de Coomassie e por cromatografia por exclusão de tamanho conforme descrito. SDS-PAGE mostrou que havia duas cadeias pesadas e leves diferentes presentes na preparação, como esperado (gel

47/49 reduzido) (Figura 14). Amostras caracterizadas foram proporcionadas para subsequente análise e caracterização funcional de proteína.

Exemplo 3B

Detecção de anticorpo biespecífico funcional <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH em um ensaio de formação de pontes celulares por FACS em células I24 que expressam IGF-1R

A fim de confirmar a presença de anticorpo biespecífico funcional <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH na mistura biespecífica purificada com troca VL-VH dos produtos principais A) anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH, B) anticorpo biespecífico <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH, e C) anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> da coexpressão transiente descrita no exemplo 3A, foi realizado um ensaio de ligação celular de IGF-1RANGPT2 por FACS em células I24 (células NIH3T3 que expressam IGF-1R recombinante humano, Roche). O princípio do ensaio é representado na Figura 10. Um anticorpo biespecífico <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH que está presente na mistura de anticorpos purificados é capaz de ligação com IGF-1R em células I24 e com ANGPT2, simultaneamente; e, assim, formará ponte de seus dois antígenos-alvo com as duas regiões opostas Fab.

Resumidamente, 5x10E5 células I24 por tubo de FACS foram incubados com mistura total de anticorpos purificados e sobre gelo por 1 h (titulação, 160 pg/ml de mistura). Os respectivos anticorpos purificados de tipo selvagem <IGF-1R> e <ANGPT2> foram aplicados às células I24 como controles. Anticorpo não ligado foi lavado com 4 ml de STF gelado (G/bco) + SFB a 2% (Gibco), células foram centrifugadas (5 min a 400 g) e anticorpo biespecífico ligado foi detectado com 50 μΙ de ANGPT2 humano (R&D Systems), 2 pg/mL, por 1 h sobre gelo. Subsequentemente, ANGPT2 não ligado foi lavado uma ou duas vezes com 4 ml STF gelado (Gibco) + SFB a 2% (Gibco), células foram centrifugadas (5 min a 400 g) e ANGPT2 ligado foi detectado com 50 μΙ de anticorpo <ANGPT2>mlgG1-Biotina (BAM0981, R&D Systems), 5 pg/mL, por 45 min sobre gelo; alternativamente, células foram incubadas com 50 μΙ de controle mlgG1-Biotina-lsotipo (R&D Sys48/49 terns), 5 pg/mL. Anticorpo de detecção não ligado foi lavado com 4 ml de STF gelado (Gibco) + SFB a 2% (Gibco), células foram centrifugadas (5 min a 400 g) e anticorpo de detecção ligado foi detectado com 50 μΙ de conjugado Estreptavidina-PE 1:400 (Invitrogen/Zymed) por 45 min sobre gelo protegido de luz. Conjugado Estreptavidina-PE não ligado foi lavado com 4 ml de STF gelado + SFB a 2%. Subsequentemente, células foram centrifugadas (5 min a 400 g), ressuspensas em 300-500 μΙ_ de STF e conjugado Estreptavidina-PE ligado foi quantificado em um FACSCalibur (BD (dois canais de FL, 10.000 células por aquisição). Durante o experimento os respectivos controles de isotipo foram incluídos para excluir quaisquer episódios de ligação inespecífica. Adicionalmente, anticorpo bivalente monoespecífico purificado lgG1 e anticorpos <IGF-1R> e <ANGPT2> foram incluídos como controles.

Os resultados na figura 15 mostram que a incubação com mistura crossover de anticorpos purificados (anticorpo <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH) proveniente da coexpressão de um anticorpo crossover (anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH) com um anticorpo de tipo selvagem (anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2>) resultou em um significativo deslocamento na fluorescência, indicando a presença de um anticorpo biespecífico funcional <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH que foi capaz de ligação com IGF-1R em células I24 e com ANGPT2, simultaneamente; e, desse modo, forma ponte de seus dois antígenos-alvo com as duas regiões opostas Fab. Em contraste com isso, os respectivos anticorpos de controle <IGF-1R> e <Ang-2> não resultam em deslocamento na fluorescência no ensaio de ligação FACS.

Tomados juntamente, esses dados mostram que coexpressando os respectivos plasmídeos de tipo selvagem e crossover, anticorpos biespecíficos funcionais podem ser gerados. Os rendimentos de anticorpo biespecífico correto podem ser aumentados forçando a heterodimerização correta de cadeias pesadas crossover de tipo selvagem e modificadas, por exemplo, usando a tecnologia de saliências-em-orifícios, bem como estabilização com dissulfeto (ver exemplos 4).

Exemplo 4

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Expressão de anticorpo bivalente biespecífico <ANGPT2-IGF-1 R> com troca VL-VH com domínios modificados CH3 (saliências-em-orifícios)

Para aperfeiçoar adicionalmente o rendimento do anticorpo biespecífico <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH, a tecnologia de saliênciasem-orifícios é aplicada à coexpressão de anticorpos <IGF-1R> com troca VL-VH e <ANGPT2> de tipo selvagem para obter uma preparação homogênea e funcional de anticorpos biespecíficos. Com essa finalidade, o domínio CH3 na cadeia pesada* CP* do anticorpo <IGF-1R> com troca VL-VH é substituído pelo domínio CH3 (Saliências) de NO ID SEQ: 8 com uma troca T366W, e o domínio CH3 na cadeia pesada do anticorpo de tipo selvagem <ANGPT2> é substituído pelo domínio CH3 (Orifício) de NO ID SEQ: 9 com uma troca T366S, L368A, Y407V ou vice-versa. Adicionalmente, um dissulfeto pode ser incluído para aumentar a estabilidade e rendimentos, bem como resíduos adicionais que formam pontes iônicas e aumentam os rendimentos de heterodimerização (EP 1870459A1).

A coexpressão transiente e a purificação do anticorpo bivalente biespecífico <ANGPT2-IGF-1R> com troca VL-VH resultante com domínios modificados CH3 (saliências-em-orifícios) são realizadas como descritas no Exemplo 3.

Deve-se observar que uma otimização de heterodimerização pode ser obtida, por exemplo, usando diferentes tecnologias de saliênciasem-orifícios, tal como a introdução de uma ponte adicional de dissulfeto no domínio CH3, por exemplo, Y349C na cadeia de saliências e D356C na cadeia de orifícios e/ou combinadas com o uso de resíduos R409D; K370E (K409D) para resíduos de saliências e D399K; E357K para resíduos de orifícios descritos por EP 1870459A1.

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Anticorpo bivalente biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende:

   a) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno; e

   b) a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.
2. 2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio CH3 de uma cadeia pesada e o domínio CH3 da outra cadeia pesada encontram-se cada uma em uma interface que compreende uma interface original entre os domínios CH3 do anticorpo;

   em que essa interface é alterada para promover a formação do anticorpo bivalente biespecífico, em que a alteração é caracterizada pelo fato de que:

   a) o domínio CH3 de uma cadeia pesada é alterado, de modo que, na interface original do domínio CH3 de uma cadeia pesada que encontra a interface original do domínio CH3 da outra cadeia pesada no anticorpo bivalente biespecífico, um resíduo de aminoácido seja substituído por um resíduo de aminoácido que apresenta um volume maior de cadeia laterais, gerando desse modo uma protuberência na interface do domínio CH3 de uma cadeia pesada que é posicionável em uma cavidade na interface do domínio CH3 da outra cadeia pesada, e

   b) o domínio CH3 da outra cadeia pesada é alterado, de modo que, na interface original do segundo domínio CH3 que encontra a interface original do primeiro domínio CH3 no anticorpo bivalente biespecífico, um resíduo de aminoácido seja substituído por um resíduo de aminoácido que apresenta um volume menor de cadeia laterais, gerando desse modo uma cavidade na interface do segundo domínio CH3 na qual é posicionável

   2/3 uma protuberência na interface do primeiro domínio CH3.
3. 3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido que apresenta um volume maior de cadeias laterais é selecionado do grupo que consiste em arginina (R), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W).
4. 4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o resíduo de aminoácido que apresenta um volume menor de cadeias laterais é selecionado do grupo que consiste em alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V).
5. 5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que ambos os domínios CH3 são adicionalmente alterados pela introdução de cisteína (C) como aminoácido nas posições correspondentes de cada domínio CH3.
6. 6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um dos domínios constantes CH3 de ambas as cadeias pesadas é substituído por um domínio constante CH1 de cadeia pesada; e o outro domínio constante CH3 de cadeia pesada é substituído por um domínio constante CL de cadeia leve.
7. 7. Método para a preparação de um anticorpo bivalente biespecífico como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   a) transformar uma célula hospedeira com

   - vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno,

   - vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e

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   VH são substituídos um pelo outro;

   b) cultivar a célula hospedeira sob condições que permitem síntese da dita molécula de anticorpo; e

   c) recuperar a dita molécula de anticorpo da dita cultura.
8. 8. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende:

   - vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno;

   - vetores que compreendem moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro.
9. 9. Composição, preferencialmente uma composição farmacêutica ou de diagnóstico, caracterizada pelo fato de ser do anticorpo bivalente biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
10. 10. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo bivalente biespecífico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. 11. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.