JPS6336775A - β―マンナナーゼおよびβ―マンノシダーゼ生産能を有するアルカリ性バチルス属新菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は新規微生物に関する。更に詳しくは、βマンナ
ナーゼおよびβ−マンノシダーゼ生産能を有し、アルカ
リ側に生育の至適ｐＨを有する好アルカリ性の新規微生
物およびその利用法に関するものである。

従来の技術 β−マンナナーゼは分子内にβ−１，４−Ｄ−マンノピ
ラノシド結合を持つホモおよびヘテロのβ−Ｄ−マンナ
ンであるマンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン
、ガラクトグルコマンナ″ンなどの主要骨格であるβ−
１，４−Ｄ−マンノピラノシド結合を任意に加水分解し
、粘性を低下せしめると同時に一連のマンノオリゴ糖を
生成する酵素である。

まず、β−Ｄ−マンナンを含むものとして、アイポリ−
ナツツ（学名：フイテレファス・マクロカルバ）やコロ
ゾがよく知られている。その他β−１．４−マンナン含
有植物としてはヤシ科のフオエニクス・カナリエンシス
、オーキス・マキュラタなどが知られている。

ガラクトマンナンはイナゴマメ及びグアーの種子に含ま
れる各々の粘質物、ローカストビーンガム及びグアーガ
ムが代表的なものであり、この二種のガラクトマンナン
は、そのままあるいは化学的な改質をほどこした後、工
業的に広く使用されている。また、ガラクトマンナンは
大豆、コーヒー豆、ムラサキウマゴヤシ、アカツメフサ
、コロハなどマメ科の植物にも多く含まれている。その
他のガラクトマンナン含有植物としてはゲニスタ・スコ
パリア、ブレデイラシャ・フエロクス、レウカエナ・グ
ラウカなどが知られている。

グルコマンナン含有物としてはコンニャク（学名；アモ
ルフオファラス・コンニャク）が最も有名であるが、サ
トイモ科のアルム根、マツ属のジャックパイン、ラン科
の球根、ニジマツやノ飄すモミなどのトウヒ属の植物な
どが知られている。その他のグルコマンナン含有植物と
しては、アスパラガス・オフィシナリス、エレムラス・
フスカス、エレムラス・レゲリー、エレムラス・スペク
タビリス、ファセオラス・アウレウスなどが知られてい
る。これらは、一般にアルカリ抽出法などにより得られ
ている。また、これらβ−Ｄ−マンナンは糊料あるいは
増粘剤として、食品工業や繊維産業で工業的に大量に消
費されているものである。

これらβ−Ｄ−マンナンを任意に加水分解する酵素とし
て知られているβ−マンナナーゼは、従来から多数の研
究者の研究対象とされており、非常に多くの微生物由来
のものが検討されてきた。

例えば、〔アトパンスズ　イン　カルボハイドレート　
ケミストリー　アンド　バイオケミストリー（Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　　ａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　
　１９７６、　３２．　２９９〜３１６）特に、糸状菌
〔アクタ　ケミ力　スカンジナビ力（Ａｃｔａ。

Ｃｈｅｍ、　　５ｃａｎｄ、）、　　１９６８．　２２
．　１９２４；　　層化、　　１９６９゜４３、３１７
；バイオケミカル　ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、）、　１９８４．　２１９．８５７〕、放線菌〔ア
グリカルチュラル　アンド　バイオロジカル　ケミスト
リー（Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、　１９
８４．郵、　２１８９）　、細菌〔シアーナル　オブ　
バイオケミストリー　（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、　１９８２，９１．１１８１　；
特開昭５７−６５１８２号〕などの酵素が良く研究され
ている。

しかしながら、これらの酵素はいずれも温度安定性に劣
る場合や、培養に長時間必要なものが多く、該酵素を工
業的に安価に使用する場合に難点を残していた。

また、β−マンノシダーゼは、分子内にβ−マンノシド
結合を有する低分子のβ−Ｄ−マンナン（マンナン、グ
ルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラクトグルコマン
ナン）に作用し、非還元末端部位から順次マンノシド結
合を加水分解し、マンノースを生成する酵素である。

従来、これらβ−Ｄ−マンナンの非還元末端からマンノ
ース単位で加水分解する酵素として知られているβ−マ
ンノシダーゼは、動物〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　　１９７２，１１　、　１４９
３〜１５０１　：バイオシミ力　エ　バイオフィジカ　
アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）、　１９７３，２６８　、
４８８〜４９６　：バイオシミ力　エ　バイオフィジカ
　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）、１９７３，３１５　、
　１２３〜１２７）　、植物〔ジャーナル　オブ　バイ
オロジカル　ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅ
ｍ、）、１９６４．　２３９　、　９９０〜９９２）、
微生物〔バイオシミ力　エバイオフィジカ　アクタ（Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　）、１９７
８，５２２．５２１〜５３０：特開昭５１−３８４８６
号）〕などの酵素が良く研究されている。

しかしながら、これらの酵素はいずれも生産性が低く、
培養法・精製法が煩雑なものが多く、該酵素を工業的に
安価に使用する場合に難点を残していた。

発明が解決しようとする問題点 天然界に再生可能な資源として大量に存在するβ−Ｄ−
マンナンの有効利用、特に該物質の酵素的加水分解によ
るマンノオリゴ糖やマンノース、グルコース、ガラクト
ースなどの糖類を効率良く回収・利用するためには、安
定性に優れ、酵素の精製が容易であることが好ましい。

しかしながら、動物、植物、微生物などの各種の起源を
持つ従来提案されていたβ−マンノシダーゼは、既に述
べたように、該酵素の生産性の点で不十分であり、その
製法、精製法も複雑で実用化するには依然として不満足
なものであった。また、β−マンナナーゼにあっても上
記のような理由から工業的に大規模利用するには理化学
的特性、特に温度安定性、至適ｐＨなどにおいて不十分
であり、また経済性の点でも不利であった。

従って、上記の如き製造・精製の容易な、しかも高い安
定性を有するこの種の酵素を新たに開発することは、デ
ンプンと共に天然界に大量に存在する再生利用可能なβ
−マンナンを分解し、あるいは分解生成物（マンノース
、ガラクトース、グルコース、マンノオリゴ糖等）を回
収・利用する上で極めて大きな意義をもつ。

そこで、本発明の第１の目的は上記の各種要件を満足す
る新規な酵素、β−マンノシダーゼおよびβ−マンナナ
ーゼ、を高い生産効率で生成し得る新規微生物を提供す
ることにある。また、簡単かつ高い収率でこれらの酵素
を得るために上記の新規微生物を利用する方法は本発明
のもう一つの目的を構成する。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、工業的に使用するためのβ−マンナナー
ゼが具備すべきこれらの諸性質を有する酵素を生産する
能力を持つ微生物を得るべく広く天然界を検索した結果
、アルカリ性に生育の至適ｐＨを有し、バチルス属に属
するある種の微生物が上記要件を備えた酵素を産生じ、
またこれを量産性良く産生ずることを見出し、本発明を
完成したものである。

即ち、本発明はまず上記のようなβ−マンナナーゼおよ
びβ−マンノシダーゼを生産する新規微生物を提供する
ことにあり、該新規微生物はβ−マンナナーゼおよびβ
−マンノシダーゼ生産能を有し、生育の至適ｐＨをアル
カリ側に有する、バチルス属に属する新規微生物、微工
研菌寄第８８５６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８５６）であ
る。

本発明の新規菌株は本発明者等により天然界から新たに
検索・単離されたものであり、この菌株をバージニーズ
　マニュアル　オブ　デクーミナティブ　バクテリオロ
ジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｎｕａｌｏｆ　Ｄｅｔ
ｅｒｒｎｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
、第８版およびザ・ジーナス県バチルス［：Ｔｈｅ　Ｇ
ｅｎｕｓ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　：米国、デパートメント
　オブ　アグリカルチャー（Ｄｅｐｔ、ｏｆ　八ｇｒｉ
ｃａｌｔｕｒｅ）版〕に従って同定すると、好気性有胞
子桿菌であり、運動性があり、周べん毛を有し、ダラム
染色バリアプルであることからバチルス属（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｓｐ、）に属することは明らかであったが、ｐ
Ｈ７．５〜１１．５のアルカリ性で良く生育するどとか
ら、既知のバチルス属菌とは分類学上具る新菌株と考え
た。

以下の第１表に単離したβ−マンナナーゼおよびβ−マ
ンノシダーゼ生産菌の菌学的諸性質を示す。

尚、上記菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研菌寄第８８５６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８８５６）きし
て寄託している。

また、本発明の新規菌株は以下のようにしてスクリーニ
ングした。まず、採取場所は国立市谷保の圃場内におけ
る古ダタミの腐朽堆肥である。該堆肥カスを水に懸濁し
、上澄の一滴を以下の組成の寒天培地に塗抹した。使用
した寒天培地は寒天２％、０．５％のＮａ　ＨＣＯｚ　
、ヤシ油抽出残渣１％、０．５％のポリペプトン、０．
５％の酵母エキス、０．１％のに２８ＰＯ，および０．
０２％のＭｇ５Ｏ，・７Ｈ２０を含有する。かくして、
寒天平板培地で３７℃にて好気的に培養し、平板上に現
われた各コロニーを得、夫々のコロニーを更に寒天を除
いた他は上記と同様の組成の液体培地中で３０〜４０℃
にて４８〜７２時間好気的に培養した。次いで、各培養
液を１２．０００ｇにて１０分間、４℃で遠心分離し、
菌体と上澄とに分離した。かくして得た上澄液と、更に
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に菌体を懸濁させ
、得られる懸濁液とを、以下に述べるような活性測定法
により、夫々β−マンナナーゼ活性およびβ−マンノシ
ダーゼ活性を示すものを選んだ。その結果、上記のよう
な菌学的緒特性を有する菌株が分離できた。

本発明の上記新菌株はβ−マンナナーゼを菌体外に生産
し、かつβ−マンノシダーゼを菌体内に生産する能力を
有している。従ってこのものの性質を利用してこれら酵
素を有利に生産することができる。

即ち、本発明はまた上記新菌株の利用法を提供するもの
であり、該方法は該新菌株を培養し、β−マンナナーゼ
を培養液中にかつβ−マンノシダーゼを菌体内に生成・
蓄積させ、これを採取することを特徴とするものである
。この方法により得られるβ−マンナナーゼおよびβ−
マンノシダーゼは夫々以下のような理化学的特性を有し
ている。

（１）β−マンナナーゼ （イ）作用： マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、カラク
トグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
結合を非特異的に加水分解し、マンノオリゴ糖を生成す
る。

（ロ）基質特異性： β−マンナンに特異的に作用し、α−マンナンに作用し
ない。β−１，４−Ｄ−マ”／／ｆトラオース以上の分
子量をもつマンノオリゴ塘に作用し、これを加水分解す
る。

（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは８〜１０であり、６０℃、３０分間の加熱条
件下ではｐＨ６〜１０の範囲内で安定である。

（ニ）温度に対する安定性： ｐＨ８，’０．３０分間の加熱条件下では６５℃まで安
定である。

（ホ）作用適温の範囲： ６５℃近傍に至適作用温度を有する。

（へ）失活条件： ６０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ５，０および１２
．５で完全に失活する。また、ｐＨ８，０，３０分間の
処理では、８０℃で完全に失活する。

（ト）阻害および活性化： 塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン四酢酸二ナト
リウム（ＥＤＴΔＮａ２）、尿素、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）、ドデシルベンゼンスルフオン酸ナトリ
ウム（ＤＢＳ）により阻害を受ける。

（チ）クロマトフオーカシング法による等電点：５．０
〜５．４ （す）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分
子量 ４３、０００±３．０００および　５７．０００±３．
０００（ｎ）β−マンノシダーゼ （イ）作用： 非還元末端から順次β−マンノシド結合を加水分解し、
マンノースを生成する。

（ロ）基質特異性： β−メチル（エチル）−Ｄ−マンノシドを完全に分解し
、またβ−結合のマンノースを含むオリゴ糖に作用し、
マンノースを遊離する。

ｐ−ニトロフェニル−グリコシドのβ−Ｄ−マンノシド
を基質となし得るが、α−Ｄ−マンノシド、α−Ｄ−グ
ルコシド、β−Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−ガラクトシド
、β−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−キシロシド、α−り
一フコシド、β−Ｄ−グルクロニドを基質となし得ない
。

（ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは６〜７であり、４０℃、３０分間の加熱条件
下ではｐＨ６〜９の範囲内で安定である。

（ニ）温度に対する安定性： ｐＨ６，５，３０分間の加熱条件下では４５℃まで安定
である。

（ホ）作用適温の範囲： ５０℃近傍に至適作用温度を有する。

（へ）失活条件： ４０℃、３０分間の処理条件下ではｐ）１５．０および
１０で完全に失活する。また、ｐＨ６，５，３０分の処
理では、５５℃で完全に失活する。

（ト）ゲル濾過法による分子量： ６３、０００±３．０００ 本発明の新規な菌株の利用法につき更に詳しく説明する
。上記のようなβ−マンナナーゼおよびβ−マンノシダ
ーゼ生産菌を適当な培地に接種し、該菌体の生育温度の
観点から３０〜４０℃にて、４８〜７２時間、好気的に
培養する。ここで、培地は炭素源、窒素源の他、必要に
応じて無機塩、微量栄養素を含むものである。

まず、炭素源としては従来公知の各種材料を使用するこ
とができ、例えばコンニャク粉、ローカストビーンガム
、キャロブガム、グアーガムあるいはこれらを含有する
植物などを典型例として例示できる。

また、窒素源としても特に制限はなく、酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーンステイープリカー、アミノ酸
液、大豆粕などの有機態窒素、あるいは硫安、尿素、鋼
酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機態窒素な
どが安価かつ人手容易なものとして例示できる。

尚、有機態窒素源は炭素源となることはいうまでもない
。更に、このような炭Ｍ’ｔＲ１窒素源の他、一般に使
用されている各種の塩、例えばマグネシウム塩、カリウ
ム塩、リン酸塩、鉄塩等の無機塩、ビタミンなどを添加
することも可能である。

本発明の方法において使用するのに適した培地は、例え
ば１％のコンニャク粉、２％のポリペプトン、０．２％
の酵母エキス、０．１％のに２ＨＰ○４および０．２％
のＭｇＳＯ３・７Ｈ２０を含有する液体培地であり得る
。

また、本発明の利用法における上記微生物の生育ｐＨは
塩基性の範囲内であるので、適当なアルカリを用いて上
記培地のｐＨ値を調整する必要がある。

そのために０．５％炭酸水素す）　ＩＪウムを典型例と
して挙げることができるが、これに限定されず水酸化ナ
トリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸ナ
トリウム、水酸化カルシウムなどのアルカリ試薬も使用
できる。

本発明の利用法において」二記閑はまずβ−マンノシダ
ーゼを菌体内に生、産し、そこに蓄積する。

この閑の培養はバッチ式、連続式のいずれによっても実
施することができ、生成する酵素の分離・精製は例えば
以下のようにして実施することができる。

即ち、まず培養液中の菌体を遠心分離、濾過などの公知
の手段で集菌した後、得られた菌体をそのままマンノオ
リゴ糖の加水分解反応に使用することも可能であり、こ
れは経済的に有利である。

また、勿論これを更に精製して使用することもできる。

そのために、例えば菌体破砕抽出後、硫安による塩析、
エタノーノペアセトン、インプロパツール等による溶媒
沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等に
よる一般的な酵素精製法により精製することができる。

以下に、本発明のβ−マンノシダーゼの好ましい精製法
の１例につき説明する。好アルカリ性バチルス属に属す
るＡ　Ｍ−００１菌株を、例えば上記のような培地に植
菌し、３７℃にて４８時間好気的に培養して得られる培
養液を、１２，０００ｒ、ｐ、ｍ　、　０℃にて３０分
間遠心分離して菌体を集め、湿重量１０ｇの菌体を得る
。次いで該菌体を氷水中で冷却しながら１３ｍＭ燐酸緩
衝液（ｐＨ７，０）に懸濁して超音波破砕を数回に分け
、計３分間程度行う。次いで、１２．０００ｒ、ｐｌｍ
　、Ｑ℃にて３０分間遠心分離して残渣を除き、上澄液
５０ｍ１を得る。次いで該上澄液に硫酸アンモニウムを
加えて７５％飽和とし、４℃で一夜放置する。生じた沈
殿を濾別し、１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解
させ、−夜４℃で同緩衝液に対して透析する。

生じた沈殿を遠心分離して除き、得られた上澄液を同上
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−）ヨパール６５０Ｍに吸
着させ、０．１〜０．５ＭのＮａＣ１を含む同上緩衝液
の濃度勾配法によって酵素を溶出する。

溶出した活性画分を集め、同上緩衝液に対して一夜、４
℃で透析した後、同上緩衝液で平衡化したハイドロオキ
シアパタイトに吸着させる。ついで、０．４ＭＩＪン酸
緩衝波緩衝液８．　Ｏ）で酵素を溶出させ、活性画分を
集めて、平均分画分子量ｉｏ、　ｏｏｏの限外濾過膜を
用いて濃縮する。濃縮酵素は、高速液体クロマトグラフ
用量白質分取精製用カラムショデックス　プロティン（
ＳＨＯＤＥＸ　ｐｒｏｔｅｉｎ）ＷＳ−２００３に充填
し、１０ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて
溶出する。かくして得られた活性画分は濃縮した後、同
上刃ラムを用いて同一条件で再度クロマトグラフィーに
かけ、得られる活性画分を濃縮し、ポリアクリルアミド
ゲルディスク電気泳動法〔アナルズ　ニューヨーク　ア
カデミツク　サイエンス（ＡＮＮ、Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、）、１２１．４０４　（１９６４）　）に
おいて均一な酵素標品１１ｍｇが得られ活性収率は１７
％であった。

なお、β−マンノシダーゼ活性の測定法並びに活性表示
法は以下の通りである。

即ち、０．２Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）０．２ｍｌ
と８ｍＭのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−マンノピラノ
シド水溶液Ｑ、２ｍｌに酵素液Ｑ、１ｍｌを混合し、４
０℃で１０分間反応させた後、０．５Ｍの炭酸ナトリウ
ム水溶液１．Ｑｍｌを添加して酵素を失活させた後、水
を加えて３ｍｌにする。着色度を葉汁光（波長４２０ｎ
ｍ）で１μｍｏｌ／ｍｌのｐ−ニトロフェノールを標準
として測定する。

酵素活性の単位は前述の条件下で１分間に１μｍｏｌの
ｐ−二トロフェノールを遊離させる酵素量を１単位とし
て表示する。

負′５２表　β−マンノシダーゼ 更に、本発明の上記菌株はβ−マンナナーゼを菌体外生
産するので、生産されるβ−マンナナーゼは培養液中に
放出され、そこに蓄積される。この閑の培養は上記と同
様に行うことができ、精製される酵素の分ｊ維精製は例
えば以下のようにして実施することができる。

即ち、まず培養液中の菌体を遠心分離、濾過などで除去
した後、得られる上澄液（粗酵素液）をそのままβ−マ
ンナンの加水分解反応に適用することも可能であり、こ
れは経済的に有利である。

また、これを更に精製して使用することもできる。

その精製法は、β−マンノシダーゼの場合と同様に実施
することができる。

以下に、本発明のβ−マンナナーゼの好ましい精製法の
１例につき説明する。好アルカリ性バチルス属に属する
本発明のＡ　Ｍ−００１菌株を、例えば上記のような培
地に植菌し、３７℃にて７２時間好気的に培養して得ら
れる培養液に、０．８％（Ｗ／Ｖ）のセタブロン（セチ
ルトリメチルアンモニウムブロマイド）を添加し、３０
分間放置後、７．０ＯＯｒ、　ｐ、　ｍ、０℃にて２０
分間遠心分離して菌体を除き、３１の上澄液を得る。次
いで、該上澄液に硫酸アンモニウムを加えて７５％飽和
とし、４℃で一夜放置する。

生じた沈澱を濾別し、ｌＯ’ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に溶解させ、−夜４℃で同緩衝液に対して透析する
。

生じた沈殿を遠心分離して除き、得られた上澄液を同上
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−）ヨパール６５０Ｍに吸
着させ、０．１〜０．５ＭのＮａＣ１を含む同上緩衝液
の濃度勾配法によって酵素を溶出する。

溶出した活性画分を集め、同上緩衝液に対して一度、４
℃で透析した後、同上緩衝液で平衡化したハイドロキシ
アパタイトに吸着させる。ついで０．０１〜０．４Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の濃度勾配法によって酵素を
溶出させると、β−マンナナーゼ活性を持った２つの画
分（Ｆ−Ａ、Ｆ−Ｂ）が得られ、２つの画分を合わせた
活性収率は２９％であった。

ついで、各フラクションを各々平均分画分子量ｉｏ、　
ｏｏｏの限外濾過膜を用いて濃縮し、該濃縮酵素を高速
液体クロマトグラフ用量白質分取精製用カラムショデッ
クス　プロティン（ＳＨＯＤｔＥＸ　ｐｒｏｔｅｉｎ）
ＷＳ−２００３に充填し、ｌＱｍＭリン酸緩衝波緩衝液
７．０）を用いて溶出する。かくして得られた活性画分
は濃縮した後、同上刃ラムを用いて同一条件で再度クロ
マトグラフィーにかけ、得られる活性画分を濃縮し、精
製酵素を（尋る。ついで、これらの精製酵素を５ＤＳ−
ポリアクリルアミドディスク電気泳動法　〔バイオケミ
カル＆バイオフィジカル　リサーチ　コミュニケーショ
ンズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、　
　Ｃｏｍｍｕｎ、）、　　１９６７．２８．８１５）お
よびポリアクリルアミドディスク電気泳動法〔アナルス
ニューヨーク　アカデミツク　サイエンス（ＡＮＮ、Ｎ
、　Ｙ。

ＡＣａ’ｄ、ＳＣｉ、）、１２１．４０４　１９６４）
　：］　Ｇ；：おイテ、それらの均一性を検討した結果
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドディスク電気泳動法では
Ｆ−ＡおよびＦ−Ｂ画分でのいずれにおいても各々、分
子量５７．０００±３．０００および４３．０００±３
．０００の均一のバンドが検出されたが、ポリアクリル
アミドディスク電気泳動法では、Ｆ−Δ画分については
、β−マンナナーゼ活性を有する２本のバンドが検出さ
れ、一方、Ｆ−Ｂ画分については、該電気泳動法によっ
ても均一のバンドが検出された。

尚、これらの３つのβ−マンナナーゼは、分子量を異に
する以外は、それらの酵素化学的諸性質はほぼ同一であ
った。

なお、β−マンナナーゼ活性の測定法並びに活性表示法
は以下の通りである。即ち、０．１Ｍのグリシン−Ｎａ
ＯＨ−ＮａＣ１緩衝液（ｐｔ１９．’０）　０．４ｒｎ
ｌと１％（Ｗ／Ｖ）のコンニャクマンナン水溶液Ｑ、５
ｍｌに酵素液０．１ｍｌを混合し、５０℃で１０分間反
応させた後、ソモギー〔Ｓｏｍｏｇｙｉ；ジャーナル　
オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅ＋ｎ、）、　　１９５２゜１９５、１９　〕
液１．Ｏｍｌを添加して酵素を失活させた後、沸騰水浴
中で加熱する。１０分後、水浴中で急冷し、ネルソン（
Ｎｅｌｓｏｎ、　　ジャーナル　オブ　バイオロジカル
　ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＪ）。

１９４４、皿３７５〕液１．Ｑｍｌを加えよく攪拌した
後、水を加えてｌＱｍｌにする。着色度を紫外光（波長
二６６０ｎｍ）で１００μｇ　／ｍｌのマンノースを標
準として測定する。酵素活性の単位は前述の条件下で１
分間に１μｍｏｌのマンノースに相当する還元糖を生成
するのに要する酵素■を１単位として表示する。

作用 天然界に比較的多量に存在するβ−Ｄ−マンナンはデン
プンと同様にそのまま、または化学的改質処理を施した
後、糊料、増粘剤、食品材料等として繊維、化粧品、食
品、農薬等の各種分野において広く利用されている。と
ころで、このβ−Ｄ−マンナンを有効利用するこめには
これを効率良く加水分解する酵素（βマンナナーゼ、β
−マンノシダーゼなど）を得る必要がある。即ち、β−
Ｄ−マンナンを高効率で加水分解し得る酵素を得ること
は、これを分解して有用なマンノオリゴ糖、マンノース
、グルコース、ガラクトースナトの糖類として、これを
回収、利用したり、あるいはβ−Ｄ−マンナン自体とし
て使用した後にこれを分解・除去するなどの目的のため
に極めて重要である。

このような用途において、β−マンナナーゼおよびβ−
マンノシダーゼは高温安定性を有し、しかも中性〜アル
カリ性領域に酵素反応の至適ｐＨを有するものであるこ
とが、工業的応用という観点から極めて望ましい。

しかしながら、このような目的で従来から様々な起源の
マンナン分解酵素が見出され、利用されてきたが、例え
ばβ−マンナナーゼでは高温安定性に劣るものであった
り、酵素産生微生物の培養時間が著しく長いものであり
、経済性、β−Ｄ−マンナンの分解効率の観点から望ま
しいものとはいえなかった。また、β−マンノシダーゼ
においても、生産性が低く、培養法・精製法の煩雑なも
のが多く、高価であり、工業的な大規模利用は困難であ
った。

そこで、本発明者等は種々検索し、好アルカリ性バチル
ス属に属するある種の微生物が有用なβ−マンナナーゼ
およびβ−マンノシダーゼを高い生産率で同時に生産す
ることを見出した。これらの酵素はいずれも上記β−Ｄ
−マンナンの加水分解反応における諸要件を満足するも
のであり、従来知られてし・た各酵素の諸問題点をいず
れも解決するものであることがわかった。

即ち、まず本発明の新規微生物はβ−マンナナーゼを菌
体外生産するので、酵素の分離・精製は極めて容易であ
り、労力、製造コストの点で大巾な改善が期待できる。

更に、この酵素は高温安定性に優れ、しかもアルカリ側
（ｐＨ８〜１０）に酵素反応の至適ｐＨを有しているの
で、アルカリ条件下で行われる各種植物からのβ−マン
ナンの抽出操作後、従来のように酸性条件とするための
操作を施すことなくそのまま酵素分解反応に移行するこ
とが可能であり、作業性、経済性の点で大巾な改善が望
める。

更に、本発明の上記微生物はβ−マンノシダーゼを菌体
内生産する。このβ−マンノシダーゼははほぼ中性領域
に酵素反応の至適ｐＨを有するので、上記のような抽出
操作後わずかなｐＨ調節を施した後、次の分解反応に移
行することができる。また、この酵素はβ−マンナナー
ゼを含む培養上澄の分離の際に得られる菌体をそのまま
あるいは簡単な分離・精製操作を施した後使用でき、労
力、量産性、経済性の点で有利である。

かくして、本発明の新規微生物によれば、β−Ｄ−マン
ナンを加水分解し、分解生成物を有効利用したり、β−
Ｄ−マンナン自体を糊料等として使用した後分解・除去
するのに有用なβ−マンナナーゼおよびβ−マンノシダ
ーゼを効率良く生産し、しかもこれら酵素がｐＨ安定性
、高温安定性等において浸れているので、これら酵素の
工業的な大規模利用が可能となる。

実施例 以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。

実施例１ 好アルカリ性細菌バチルスＡ　Ｍ−００１菌株（Ｆ［Ｅ
ＲＭＰ−８８５６）を５００ｍ１容の三角フラスコ中の
、グアーガム０，５％、コーンステイープリカー５％、
硫安０．１％、Ｋ２ＨＰ　０４０．１％、Ｍｇ５Ｏ＜・
７８２００．０２％および炭酸ソーダ０．２５％を含む
培養液１００ｍ１（ｐＨ９，５）に植菌し、３７度で４
８時間、２０Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、　　で振とう培養した
。ついで、該培養液を１２．００Ｏｒ、　ｐ、　ｍ、、
０℃にて３０分間遠心分離して菌体と培養上澄とを回収
した。まず、回収した菌体を５ｍｌの１０ｍＭ燐酸緩衝
液に懸濁後、超音波破砕機にて菌体を破砕した。ついで
、この菌体破砕液を１２．　ｏｏｏｒ、　ｐ、　ｍ、に
て０℃で３０分間遠心分離し、得られた上澄み液のβ−
マンノシダーゼ活性を測定した結果、１４単位／ｍ１で
あった。ついで、上記培養液上澄中のβ−マンナナーゼ
活性を上記のように測定した結果、５３単位／ｍｌであ
った。

発明の効果 以上詳しく述べたように、本発明によればβ−Ｄ−マン
ナンを効率良く加水分解するβ−マンナナ−せおよびβ
−マンノシダーゼを同時に生産する、好アルカリ性バチ
ルス属に属する新規な微生物が提供される。この新規微
生物の生産する両酵素はβ−Ｄ−マンナンの加水分解反
応に要求される諸条件をいずれも満足し、高い効率でこ
れを分解し、使用後の分解・除去並びに分解生成物の有
効利用を著しく容易にすると共に経済的にも大１１な改
善を保証し得るものである。

特許出願人　　　　新技術開発事業団 秋野　利部 中村　信之 掘越　弘毅

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）β−マンナナーゼおよびβ−マンノシダーゼ生産
   能を有し、生育の至適ｐＨをアルカリ性に有するバチル
   ス属に属する微生物、微工研菌寄第８８５６号。
2. （２）β−マンナナーゼおよびβ−マンノシダーゼ生産
   能を有し、アルカリ性に生育の至適ｐＨを有するバチル
   ス属に属する微生物、微工研菌寄第８８５６号を培養し
   、以下に示す理化学的性質を有するβ−マンナナーゼお
   よびβ−マンノシダーゼを生成・蓄積させ、これを採取
   することを特徴とする上記微生物の利用法。 （ I ）β−マンナナーゼ （イ）作用： マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラク
   トグルコマンナンのβ−１，４−Ｄ−マンノピラノシド
   結合を非特異的に加水分解し、マンノオリゴ糖を生成す
   る。 （ロ）基質特異性： β−マンナンに特異的に作用し、α−マンナンに作用し
   ない。β−１，４−Ｄ−マンノテトラオース以上の分子
   量をもつマンノオリゴ糖に作用し、これを加水分解する
   。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは８〜１０であり、６０℃、３０分間の加熱条
   件下ではｐＨ６〜１０の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性： ｐＨ８．０、３０分間の加熱条件下では６５℃まで安定
   である。 （ホ）作用適温の範囲： ６５℃近傍に至適作用温度を有する。 （ヘ）失活条件： ６０℃、３０分間の処理条件ではｐＨ５．０および１２
   ．５で完全に失活する。また、ｐＨ８．０、３０分間の
   処理では、８０℃で完全に失活する。 （ト）阻害および活性化： 塩化第二水銀、硝酸銀、エチレンジアミン四酢酸二ナト
   リウム（ＥＤＴＡＮａ＿２）、尿素、ドデシル硫酸ナト
   リウム、ドデシルベンゼンスルフォン酸ナトリウムによ
   り阻害を受ける。 （チ）クロマトフォーカシング法による等電点：５．０
   〜５．４ （リ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法による分
   子量 ４３，０００±３，０００および５７，０００±３，０
   ００（II）β−マンノシダーゼ （イ）作用： 非還元末端から順次β−マンノシド結合を加水分解し、
   マンノースを生成する。 （ロ）基質特異性： β−メチル（エチル）−Ｄ−マンノシドを完全に分解し
   、またβ−結合のマンノースを含むオリゴ糖に作用しマ
   ンノースを遊離する。 ｐ−ニトロフェニル−グリコシドのβ−Ｄ−マンノシド
   を基質となし得るが、α−Ｄ−マンノシド、α−Ｄ−グ
   ルコシド、β−Ｄ−グルコシド、α−Ｄ−ガラクトシド
   、β−Ｄ−ガラクトシド、β−Ｄ−キシロシド、α−Ｌ
   −フコシド、β−Ｄ−グルクロニドを基質となし得ない
   。 （ハ）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： 至適ｐＨは６〜７であり、４０℃、３０分間の加熱条件
   下ではｐＨ６〜９の範囲内で安定である。 （ニ）温度に対する安定性： ｐＨ６．５、３０分間の加熱条件下では４５℃まで安定
   である。 （ホ）作用適温の範囲： ５０℃近傍に至適作用温度を有する。 （ヘ）失活条件： ４０℃、３０分間の処理条件下ではｐＨ５．０および１
   ０で完全に失活する。また、ｐＨ６．５、３０分の処理
   では、５５℃で完全に失活する。 （ト）ゲル濾過法による分子量： ６３，０００±３，０００
3. （３）上記培養を３０〜４５℃の範囲内の温度下で好気
   的に行うことを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載
   の微生物の利用法。
4. （４）上記培養液のｐＨが７．５〜１１．５の範囲内に
   あることを特徴とする特許請求の範囲第２項または第３
   項に記載の微生物の利用法。
5. （５）上記微生物の培養後、培養液から菌体を分離し、
   そのままβ−マンノシダーゼの粗酵素とするかまたは更
   に精製して精製β−マンノシダーゼを得ることを特徴と
   する特許請求の範囲第２〜４項のいずれか１項に記載の
   微生物の利用法。
6. （６）上記微生物の培養後、培養上澄液を分離し、その
   ままβ−マンナナーゼの粗酵素液とするか、あるいは更
   に精製して精製マンナナーゼを得ることを特徴とする特
   許請求の範囲第２〜４項のいずれか１項に記載の微生物
   の利用法。