Procédé de préparation de stéroïdes 21-hydroxylés L'invention est relative à un procédé pour intro- duire un groupe hydroxy :en position 21 des sté roïdes de la série du prégnane.
On sait que la plupart des hormones de cette série, comme la désoxycorticostérone, la cortisone, l'hydrocortisone, la Al-déhydrocortisone ou prédini- sone, le Ai-déhydrocortisol ou prednisolone, com- portent un groupement hydroxyle en position 21.
La 21-hydroxy-prégnane-3,20-dione se prête à l'obtention de dérivés doués d'un certain pouvoir anesthésique.
L'introduction de l'hydroxyle en 21 se fait essen tiellement par voie chimique, mais cette opération ne réussit pas toujours bien, notamment lorsque le prégnane ne comporte pas d'hydroxyle en 17, le brome que l'on essaie d'introduire en 21 pour le remplacer ensuite par un hydroxyle se fixant égale ment en position 17.
La présente invention permet donc l'introduc tion de l'hydroxyle en 21 en une seule étape par utilisation de matières premières nouvelles ou non utilisées jusqu'ici, pour la production des stéroïdes appartenant à la série du 21-hydroxy-prégnane.
On a trouvé qu'en soumettant divers composés stéroïdes de la série du prégnane à l'action d'un champignon de l'espèce Colletotrichum Lindemu- thiianum, ordre des melanconiales, famille des melanr coniaceae ou en exposant ces composés à l'action d'enzymes oxydants isolés à partir de cultures de tels micro-organismes,
on obtient des produits hydroxylés en 21. Il est à noter que toutes les espèces de la famille des melaneo@niaceae ne sont pas efficaces au même degré pour obtenir l'introduction de l'hydro xyle en 21: Diverses espèces de Colletotrichum Lin- demuthianum ont été isolées et caractérisées avec soin.
Des descriptions de plusieurs de ces espèces se trouvent dans les traités de mycobactériologie et dans la littérature scientifique.
On a pu isoler, à partir d'une gousse de haricot atteinte d'anthracnose une souche particulièrement active ainsi qu'on le verra dans ce qui suit. Cette souche est enregistrée dans les laboratoires de la titulaire, sous le No U 230.
<I>Particularités de la souche U 230</I> Sur milieu gélosé- à base de décocté de pommes de terre et de saccharose, la souche U 230, en 6 à 10 jours de culture, à une température voisine de 24o C, présente un mycélium de couleur sombre dont les conidiophores. supportent de petites conidies noires, de forme oblongue plus ou moins incurvée,
sans sécrétion de pigment exooellulaire diffusant dans la gélose.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on soumet le stéroide de la série du pré- gnane à une fermentation dans une culture submer gée dans des conditions d'aérobiose d'un champi- gnon de l'espèce Colletotrichum Lindemuthianum, de préférence sur un milieu gélosé,
par exemple à base de saccharose et de décocté de pommes de terre ou à l'action d'enzymes. correspondantes. On peut récolter les conidies qui se sont développées au cours de cette première culture et les utiliser en vue de l'.ensemencement stérile d'un milieu de culture
approprié contenu dans des fioles d'Erlenmeyer, par exemple. Cette seconde fermentation ayant lieu à une température appropriée, peut "être conduite sur un appareil d'agitation à secousses. La mise en oeu- vre du procédé selon l'invention peut se faire com me sui :
après une période variant entre 1 et 10 Jours, on introduit dans le milieu de fermenta tion une solution dans un solvant approprié du sté- roïde de la série du prégnance,
laisse le milieu incuber pendant une période de temps comprise entre douze et cinquante heures et caractérise le prégnane 21-hy- droxylé obtenu dans une partie aliquote du milieu de culture avant de l'isoler par la suite d'opérations habituelles comportant après extraction une purifi cation par <RTI
ID="0002.0019"> chromatographie, ou des recristallisations ou transformations en dérivés caractéristiques per- mettant die le séparer des produits secondaires die la fermentation ou du produit de départ non trans- formé. En effet,
le micro-organisme dont l'emploi caractérise la présente invention, peut, d'ans certains cas et selon 1a nature du stéroïde employé, fixer sur une certaine quantité de celui-ci encore un ou plu sieurs hydroxyles. en d'autres positions qu'en 21.
Le milieu de culture liquide du Colletotrichum Lindemuthîanum comporte, de préférence, une sour ce d'hydrate die carbone telle que le glucose, le sac charose ou l'amidon. En outre,
une source d'azote minéral telle que des nitrates ou dies sels d'ammo nium peut être utilisée. On peut, évidemment, com pléter cette dernière ou lui substituer une source d'azote organique telle qu'un hydrolysat de pro- téines, de la farine de soja,
de la farine de grains de coton, etc. Des sels minéraux comme des phos phates, des sels de potassium, des sels de fer, de magnésium ou de calcium peuvent être utiles. Un tampon tel que le carbonate de calcium peut servir, quoique le px ne soit généralement pas très modifié par la fermentation.
Au cours de la fermentation qui, sur une grande échelle, peut être réalisée dans des cuves équipées pour une fermentation dans une culture submergée dans des conditions d'aérobiose, le milieu est agité et aéré de la façon classique utilisée dans l'industrie des antibiotiques. Il est parfois nécessaire de se ser vir d'un agent antimousse.
Selon une forme d'exécution du procédé selon l'invention, le stéroïde de la série du prégnane qu'on désire hydroxyler en position 21 ;
peut être introduit dans le milieu de fermentation sous forme solide finement divisée ou sous forme de solution dans un solvant qui ne gêne pas la croissance du Colleto- trichum Lindemuthianum. L'addition peut être effec tuée au début de la fermentation ou encore au cours de cette dernière. On peut également opérer l'hydro- xylation en
soumettant le prégnane à l'action du jus fermenté ou à celle d'un extrait enzymatique d'une culture du micro-organisme de l'invention, préparé suivant les méthodes classiques de l'enzymologie.
Après hydroxylation, le stéroïde cherché peut être caractérisé par la chromatographie sur papier qui fournit, en outre, des renseignements sur le taux de transformation et peut permettre un contrôle de ladite transformation en cours d'opération. On l'isole ensuite par les procédés connus.
Des hydroxylations biologiques en 21 ont déjà été décrites avec d'autres micro-organismes. (Meystre et al., Helv. 1954,<I>37,</I> 1548).
Dans les exemples suivants, on peut également utiliser toute souche die Colletotrichum Lindemu- thianum issue de la souche<B>U230</B> et obtenue à partir de cette dernière par mutations classiques, par exemple traitement aux rayons X, aux ultra-sons ou à l'ypérite azotée.
Exemple 1 <I>Préparation de la</I> Al-déhydrocortisone 17a,21-dihydroxy-Al,-'-prégnadiène-3,11,20-trione) <I>a) Préparation de la</I> 17a-hydroxy- AM-prégnadiène-3,11,20-trione Ce composé est préparé à partir de la 17a- hydroxy-2,4-dibromo-prégnane-3,11,20-trione décrite dans, l'exemple 4 du brevet suisse No 324083.
5 g de ce dérivé dibromé, F. 269-270, [U]20 = + 621, (c = 0,5 1%, acétone) sont introduits dans 20 em3 die collidine redistillée. On fait passer un cou rant d'azote et d'istillt sous agitation environ 15 cm3 de collidine en un quart d'heure.
On laisse refroidir le résidu et le reprend par 50 cm3 du mélange eau- glace et 15 cm3 d'acide chlorhydrique concentré. Le précipité formé est essoré et lavé à l'eau jusqu'à ce que les eaux de lavage ne donnent plus, la réaction des chlorures. On essore et sèche à 40,, C.
D'après le dosage fait par spectrographie dans l'U.V. à 230 mu le produit renferme 50 % de 17a- hydroxy-A1,4-,prégnadsène-3,11,20-trione que l'on isole par chromatographie sur alumine. On obtient environ 1,7 g de diène cherché, F.
2440 C, [ ]20 = + 1421) (c = 1 1%, chloroforme). Pour le purifier, on l'empâte à reflux sous agitation d'ans 3 volumes d'éthanol absolu, glace et essore..
On obtient 1,2 g environ die produit pur, F. 2450 C (le produit fond', recristallise et fond à nouveau vers 2801, C, [a]20 = + 140,, (c = 1%, RTI ID="0002.0234" WI="21" HE="4" LX="1458" LY="1733"> chloroforme).
Microanalyse : C.1H2304 = 342,43 Calculé : C73,66 % H 7,65 % O 18,69 Trouvé:
73,6 7,7 18,7 Ce produit est soluble en d@iméthylformamide, dii- oxane, peu soluble (de 1 à 2 % à température ordi- naire) en:
méthanol, méthylcellosolve, méthyl éthyl- cétone, insoluble dans l'eau, éther isopropylique. Il est nouveau, mais sa préparation ne figure qu'à titre descriptif dans le cadre de la présente invention. <I>b)
</I> Hydroxylation <I>biologique</I> On cultive le Colletatrichum Lindemuthianum pendant dix jours à 24,
1 C sur un milieu gélosé à base de 2 % de saccharose et die 20 % de décocté de pommes de terre. On récolte les canidies dans de l'eau distillée. La suspension obtenue sert à
ense mencer stérilement unie fiole d'Erlenmeyer de 1 litre contenant 100 cm3 d'un milieu composé comme suit Glucose pur . . . . . . . . . . . . . .<B><I>10g</I></B> Extrait de malt . .<B>.....</B> . . . 5 g Farine de soja . . . . . . . . . . . .<B>10g</B> Chlorure de sodium<B>......</B> 5 g Corn steep sec . . . . . . . . . .
5 g Carbonate de calcium <B>......</B> 1 g Eau de ville q.s. pour 1000 cm3 dont le pli a été préalablement ajusté à<B>6,8-7,0</B> par la potasse et qui a été stérilisé par chauffage die trente minutes à la température de 1200 C.
Après cinq jours de culture à 240 C sur un appareil à secousses (85 battements par minute, course 8 cm), on ajoute à 100 cm3 de culture, 1 cm3 d'une solution acétonique à 1% de 17(x-hydroxy-A',4-prégnadiène- 3,11,20-trione préparée comme indiqué plus haut dans l'exemple a).
Une nouvelle incubation de ving- quatre heures dans les mêmes conditions conduit au 3,11,20-tricéto-17a,21-dihydroxy-A',4-prégnadiène avec un rendement de 50 0/0, ainsi qu'il ressort des déterminations chromatographiques sur papier que l'on effectue, comme suit, sur 50 cm3 de bouillon de culture:
le bouillon est filtré @et le mycélium est lavé deux fois avec 5 cm3 d'acétone que l'on joint au filtrat. On épuise ensuite le mycélium à deux reprises avec 50 c<I>e</I> de chloroforme et épuise le fil- trat précédent avec ces 100 cm3 de chloroforme, puis deux fois encore avec, chaque fois,
20#W de chlo- roforme. Les extraits chloroformiques réunis sont lavés d'abord avec une solution aqueuse de bicar- bonate, puis à l'eau, on sèche sur sulfate de magné sium et évapore à sec sous vide.
Le résidu est repris par 1 cm3 de méthanol et sert à la chromatographie sur papier. On utilise du. papier Whatman No 1 lavé au benzène et au méthanol.
Avant la chromatogra- phie, la feuille de papier est immergée dans une solu tion de propylène-glycol à 30'%. Après avoir laissé égoutter, on fait la chromatographie en utilisant pour le stérôïde du toluène saturé de propylène- glycol avec un développement de huit à quinze heu res.
La révélation dies taches se fait sont par fluores- cence en lumière U.V., soit par réaction colorée.
En interposant la feuille séchée entre une source d'ultra-violet filtré (7 < , max = 2400 A) et un écran fluorescent, les endroits, où se trouvent les stéroïdes absorbant l'U.V. sont visibles sur l'écran sous forme de taches violettes sur un fond lumineux.
La réaction colorée utilisée est celle de Mader et Buck, Anal. Chem., 1952, 24, 666, avec le chlo rure die .triphényl tétrazolium qui donne une colora- tion rouge, sur fond blanc avec les stéroïdes possé dant la fonction cétol R-CO-CH,
OH. En effectuant des essais témoins avec plusieurs dilutions successi- ves de Ai-déhydrocortisone dans le même solvant, on constate que le produit die départ a été trais- formé en A'-déhydrocortisone avec un rendement de 50,
% environ. Exempté 2 <I>Préparation de la</I> AI-déhydrocortisone On opère pour la fermentation comme dans l'exemple 1 b), mais en travaillant avec 400 mg clé 17-hydroxy-01,4-prégnadiène-3,11,20-trione et en employant un volume <B>de</B> milieu de culture 40 fois plus grand que dans l'exemple 1.
4 filtres de milieu de culture fournissent, après filtration <B>du</B> mycélium, lavage à l'acétone et extraction au chloroforme selon le procédé de l'exemple 1, un extrait sec pesant 1,4 g à 1,6 g d'aspect gras,
que l'on lave à plusieurs reprises avec un total de 25 cm3 d'éther isopropyli- que froid qui éâmnne les huiles ct laisse un insoluble de couleur crème renfermant les stéroïdes. Une chro- matographie sur alumine de cet
insoluble repris par benzène et élué par chloroforme fournit la A'-déhy- droeortisone identique à tout point de vue avec le produit décrit dans la littérature (Herzog et colt., Science, 1955, 121, 176).
Exemple 3 Hydroxylation microbiologique <I>de la progestérone</I> En ajouitant à une culture de cinq jours de la souche<B>U230</B> de Colletotrichum Lindemuthianum effectuée dans les mêmes conditions. que dans l'exemple 1 b), pour 100 cmO de culture, 1 em3 d'une solution acétonique à 1 g lu/o de progestérone, on constate,
après une nouvelle incubation de vingt- quâtre heures, extraction au chloroforme dans les conditions précédemment décrites puis chromatogra phie sur papier, la formation de stéroïdes porteurs d'hydroxyle en 21.
Exemple 4 On opère comme dans l'exemple 3, mais on uti lise, à la place de la progestérone, la 3,20-prégnane@ dione. La chromatographie sur papier montre la formation de composés porteurs d'hydroxyle en 21.