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Verfahren zur selektiven Abspaltung von Sulfenyl-Schutzgruppen aus N-Sulfenyl-Aminosäurederivaten Bei der Synthese von Peptiden durch Kupplung von Aminosäuren oder Peptiden müssen im allgemeinen die an der Kupplungsreaktion nicht beteiligten funktionellen Gruppen geschützt werden.
So können beispielsweise Carboxyl@gruppen durch Veresterung, die Merkaptogruppe durch Benzylierung oder Tritylierung blockiert werden. Zum Schutz der Aminogruppen stehen die Carbobenzoxygruppe und davon. abgeleitete farbige Schutzgruppen, die Toluolsulfonylgruppie, der Phthalyl- und Formylrest, die tert.-Butyloxycarbonyl- gruppe, die Tritylgruppe u. a. zur Verfügung. Die zur Blockierung verwendeten Gruppen müssen am Ende der Synthese ohne Beeinträchtigung des Moleküls abspaltbar sein.
Wird ein Peptid in mehreren Stufen aufgebaut, so muss nach jeder einzelnen Kondensationsreaktion eine geschützte Amino- oder Carboxylgruppe wieder in Freiheit gesetzt werden, damit an dieser Stelle ein weiteres Aminosäurederivat (wobei unter Aminosäurederivaten auch Pepitide zu verstehen sind) ankondensiert werden kann, während alle übrigen Schutzgruppen, vor allem auch diejenigen der Seitenketten, intakt bleiben sollen. Die erwähnte Gruppe muss also selektiv abspaltbar sein.
Eine Ausführungsform der Peptidsynthese, die. man insbesondere anwendet, um Racemisierung zu vermeiden, besteht darin, dass man das, Peptid vom Carboxy- lende her aufbaut, indem man die einzelnen Aminosäu- ren, deren a-Aminogruppe geschützt ist, der Reihe nach ankondensiert und nach jeder Kondensation die a-Amino-Schutzgruppe abspaltet.
Ein neues Verfahren dieser Art ist die sogenannte Feststoffträgersynthese, bei der die Endcarboxylgruppe durch eine Esterbin- dung mit einem hydroxylgruppenhaltigen Polymeren, beispielsweise einem Copolymeren von Styrol und Divinylbenzol, das durch Hydroxymethylgruppen teilweise substituiert ist, verknüpft ist (vgl. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 [1963]).
Als Kupplungsmethoden haben sich bei der Synthese vom Carboxylende her die Methode der aktivierten Ester, die Methode der gemischten Anhydride und die Carbodiimidmethode bewährt. Die Wahl geeigneter Schutzgruppen bietet jedoch Schwierigkeiten, insbesondere, wenn das Peptid funktionelle Gruppen in den Seitenketten aufweist. Die Carbobenzoxygruppe, die sich durch Hydrogenolyse selektiv gegenüber verschiedenen anderen Schutzgruppen, z.
B. tert.-Butyloxycar- bonyl, Trifluoracetyl, abspalten liesse, kommt nicht in Betracht, wenn das zu synthetisierende Peptid schwefelhaltige Aminosäuren, wie Methionin oder Cystein, enthält. Durch stark alkalische Mittel, wie Natrium in flüssigem Ammoniak abspaltbare Gruppen, z. B. Toluolsulfonyl, können meist bei langkettigen, empfindlichen Peptiden nicht verwendet werden. Auch stark saure Mittel, z. B. Salzsäure., wie sie zur Abspaltung der Formylgruppe erforderlich ist, greifen in den meisten Fällen das Peptid zu stark an.
Die Trityl- gruppe, die unter milden Bedingungen durch Säuren abspaltbar ist, kann wegen sterischer Hinderung bei der Kupplung nach der Methode der aktivierten. Ester und der gemischten: Anhydride nicht verwendbar werden (ausser beim Glycin) und führt auch bei der Car- bodiimidmethode zu schlechten Ausbeuten. Weitere Nachteile der Tritylgruppe sind Schwierigkeiten bei ihrer Einführung und Instabilität Trityl-geschützter Verbindungen.
Von Zervas et a1. wurde nun vorgeschlagen, als a-Amino-Schutzgruppe bei Peptidsynthesen die Sulfe- nylgruppe, z. B. Triphenylmethylsulfenyl oder o-Nitro- phenylsulfenyl, zu verwenden (vgl. J. Am. Chem. Soc. 85, 3660 [1963]).
Diese Gruppe ist, wie die Trityl- gruppe, unter milden sauren Bedingungen abspaltbar, ohne jedoch die ungünstigen Eigenschaften des Trityl- restes hinsichtlich Einführung, Stabilität und Kupplung zu besitzen. Weitere Vorteile sind die sehr gute Kristal- lisationsfähigkeit der Sulfenylderivate und die Farbigkeit der Nitrophenylsulfenylderivate.
Zur Abspaltung der Sulfenylgruppe kann nach Zer- vas Chlorwasserstoff in Alkohol oder nichtpolaren Lösungsmitteln, bei Raumtemperatur verwendet werden.. Es hat sich jedoch gezeigt, dass bei grösseren Pep-
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tiden, die in der Seitenkette in saurem Medium abspaltbare Schutzgruppen enthalten, z. B. die tert.-Buty- loxycarbonylgruppe, mit der Abspaltung der Sulfenyl- gruppe teilweise auch die Seitenketten-Schutzgruppe, insbesondere die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, abgespalten wird.
Von Zervas ist auch Essigsäure zur Abspaltung der Sulfenylgruppe vorgeschlagen worden; die Abspaltung verläuft jedoch sehr langsam und ergibt ein durch zahlreiche Umwandlungsprodukte des Sulfenyl- restes verunreinigtes Gemisch, das schwer zu reinigen ist.
Es wurde nun gefunden, dass die Sulfenylgruppe wesentlich rascher und besser selektiv abgespalten wird, wenn man die eine solche Amino-Schutzgruppe enthaltenden Aminosäurederivate, die mindestens eine andere säurelabile Schutzgruppe aufweisen mit einer schwachen anorganischen Säure, die mit der entsprechenden Sulfensäure ein gemischtes Anhydrid zu bilden vermag, behandelt.
Die Sulfenyl-Schutzgruppe ist eine Verbindung der Formel R-S-, worin R für Aralkyl oder Aryl, das vorzugsweise durch negative Substituenten substituiert ist, steht. Die Sulfenylgruppe ist insbesondere eine Trityl-, o-Nitrophenyl-, p-Nitrophenyl- oder o,p-Dinitrophenyl- gruppe.
Schwache anorganische Säuren, die mit dem Sulfe- nylrest ein gemischtes Anhydrid zu bilden vermögen, sind in erster Linie die Cyanwasserstoffsäure und die Thioschwefelsäure, ferner schweflige Säure und Schwefelwasserstoff.
Die erfindungsgemässe Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart einer schwachen organischen Säure, z. B. einer niederen Alkansäure wie Essigsäure, durchgeführt. Sie verläuft in schwach saurer Lösung schon bei Raumtemperatur sehr rasch und vollständig. Es werden, insbesondere bei Verwendung von Blausäure, keine schwer abtrennbaren Nebenprodukte gebildet. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens ist, dass es gestattet, die Sulfenylgruppe in Gegenwart säurelabiler Gruppen, z. B. der tert.-Butyloxycarbonylgruppe, selektiv abzuspalten, ohne dass diese Gruppe auch nur im mindesten angegriffen werden.
Man kann daher bei der Synthese von Peptiden, die basische Aminosäuren, wie Lysin oder Ornithin enthalten, die Aminogruppen der Seitenkette durch die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, die a-Aminogruppe der anzukondensierenden Aminosäure oder des anzukondensierenden Peptids durch die Sulfenylgruppe schützen. Nach der Kondensation lässt sich die a-Aminogruppe des gebildeten Peptids nach dem erfindungsgemässen Verfahren unter vollständiger Erhaltung der tert.-Butyloxycarbonylgruppen abspalten.
Ebenso kann die Sulfenylgruppe in Gegenwart einer Trityl-geschützten Merkaptogruppe selektiv abgespalten werden. Die genannte Verwendung der N-SuI- fenyl-Schutzgruppe neben der tert.-Butyloxycarbonyl- gruppe zum Schutze von Aminogruppen der Seitenkette eignet sich insbesondere auch für die Feststoffträ- gersynthese. Hierbei verwendet man vorzugsweise Thioschwefelsäure, weil die Reaktion damit besonders schnell verläuft.
In den folgenden Beispielen wird die Abspaltung der Sulfenylgruppe aus verschiedenen Aminosäuren gezeigt. In gleicher Weise wird die Sulfenylgruppe auch aus Sulfenyl-geschützten Peptiden abgespalten.. Weitere Beispiele zeigen den Aufbau von Peptiden unter Verwendung der Sulfenyl-Schutzgruppe, vor allem auch in Gegenwart der tert.-Butyloxycarbonylgruppe. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 L-Valyl-L-phenylalaninmethylester- hydrochlorid aus o-Nitrophenylsulfenyl-L- valyl-L-phenylalanin-methylester. 0,4 g (0,93 mMol) o-Nitrophenylsulfenyl-L-valyl- L-phenylalanin-methylester (vgl. J. Am. Chem. Soc. 85, 3660 et seq. [1963]) werden in 20 ml einer 5,6-proz. 2-n. Lösung von Cyanwasserstoffsäure in Methanol gelöst. Die klare, gelbe Lösung wird mit 5 ml Eisessig versetzt und in verschlossenem Kolben während 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Danach zeigt die dünnsch.ichtchromatographische Analyse einer Probe der nunmehr stark aufgehellten Lösung, dass vollständige Abspaltung der o-V'itrophe- nylschutzgruppe eingetreten ist. Das Reaktionsgemisch wird am Vakuum bis fast zur Trockne eingeengt, der Rückstand mit 20 ml trockenem Äther aufgenommen und der hellgelben, fast klaren Lösung 2 ml einer 2-n. Lösung von Chlorwasserstoff in Essigester zugesetzt. Es bildet sich eine ölige Fällung, welche beim Anreiben zu einer kristallinen Masse erstarrt. Die festen Anteile werden abfiltriert, mit 10 ml trockenem Äther verrieben und erneut filtriert.
Auf diese Weise werden 230 mg (78,8 0lo d. Th.) chromatographisch reines L-Valyl-L-phenylalanin-methylester-hydrochlorid, F. 197-199 , erhalten.
Aus den Filtraten können nach Eindampfen 163 mg (96,7 d. Th.) hellgelbes, fast reines o-Nitro- phenylrhodanid, F. 130-132 , erhalten werden, welches nur noch eine Spur L-Valyl-L-phenylalanin-me- thylester-hydrochlorid enthält.
Beispiel 2 N±-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin- methylester-acetat aus Na-o-Nitrophenylsulfenyl- NE-tert.-butyloxycarbonyl-L- lysin-methylester. 1,24 g (3 mMol) Na-o-Nitrophenylsulfenyl- Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester werden in 60 ml einer 5,6-proz. 2-n. Lösung von Cyanwasser- stoffsäure in Methanol gelöst. Die klare, gelbe Lösung wird mit 15 ml Eisessig versetzt und in verschlossenem Kolben während 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Die dünnschichtehromatographische Analyse einer Probe der Lösung zeigt, dass die o-Ni- trophenylsulfenylschutzgruppe vollständig abgespalten ist, während die tert.-Butyloxycarbonylschutzgruppe nicht angegriffen wird. Das Reaktionsgemisch wird sodann am Vakuum bis fast zur Trockne eingeengt und der Rückstand mit 50 ml Äther und 5 ml 2-n. Essigsäure aufgenommen. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und die Ätherschicht (I) noch zweimal mit je 5 ml 2-n. Essigsäure extrahiert. Die vereinigten wässrig-essigsauren Extrakte werden am Vakuum zu einem öligen Sirup eingeengt, der zur Entfernung des restlichen Wassers und der Essigsäure zweimal mit je 5 ml Benzol verrieben und jeweils wieder zur Trockne verdampft wird.
Nach Trocknen am Hochvakuum bei 30#7' erstarrt der ölige Rückstand zu einer farblosen, kristallinen Masse, welche mit Äther verrieben und filtriert wird. So werden 0,54 g (56,4 0,'o d. Th.) Ne-tert.- Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester-acetat (II) als weisses Kristallpulver, F. 79-81', erhalten.
Aus dem Ätherfiltrat kann durch Einengen, Abfiltrieren der--aus-
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geschiedenen Kristalle und Waschen mit Äther eine zweite Fraktion von 11, (245 mg = 27,6 % d. Th.) in Form eines leicht bräunlichen Kristallpulvers vom F. 77-79 gewonnen werden.
Beide Fraktionen sind ge- mäss Dünnschichtchromatogramm auf Silicagel-Schich- ten im System I = tert.-Amylalkohol-i-Propanol-Was- ser (100:40:10) einheitlich (Rf = 0,35). Insbesondere kann kein L-Lysin-methyl-ester oder L-Lysin (Rf = 0,0 im angegebenen System für beide Substanzen) nachgewiesen werden.
Die Ätherphase I wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Dabei werden 0,56 g (100 0/0 d. Th.) o-Nitrophenylrhodanid, F. 130-133 , erhalten. Es enthält noch Spuren von Na-tert.-Butyloxycarbo- nyl-L-lysin-methyl-ester.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: a) 4,08 g (7,4 mMol) des Kupfer-(II)-Komplex von Ne-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin werden in 37,2 ml 2-n. Natronlauge suspendiert. Dazu werden unter Rühren und allmählichem Erwärmen auf 40-45 insgesamt 2,22 g (14,76 mMol) D-Weinsäure in mehreren Portionen zugesetzt. Nach etwa 30 Minuten ist eine klare, intensiv blaue Lösung entstanden, der man in mehreren Portionen insgesamt 0,55 g (7,38 mMol) Thioace- tamid zufügt. Das ausgefallene, dunkelbraune Kupfersulfid wird über Celite abfiltriert und die klare, leicht gelbe Lösung auf 30 ml eingeengt.
Nach Zusatz von 75 ml Dioxan gibt man, 3,2 g (17 mMol) o-Nitrophe- nylsulfenylchlorid in mehreren Portionen zu. Die dunkelgrüne Suspension wird während 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, sodann mit 150 ml Wasser verdünnt, filtriert, mit 150 ml Äther überschichtet und extrahiert. Die Ätherschicht wird verworfen, die wäss- rige Phase noch einmal mit 1.50 ml Äther extrahiert und sodann bei 0 mit 1-n. Schwefelsäure auf pH = 1-2 gestellt. Die Lösung wird sofort zweimal mit je ca. 150 m1 eiskaltem Äther extrahiert.
Man wäscht die Ätherextrakte mit 100 ml gesättigter Kochsalzlösung neutral, trocknet sie über Magnesiumsulfat und engt sie auf etwa 30 ml ein. Zu der klaren, intensiv gelben Lösung fügt man sodann, 3,5 ml (19 mMol) Dicyclohe- xylamin, wonach sofort Kristallisation eintritt.
Die Kristalle werden nach kurzem Stehen abfiltriert, mit reichlich trockenem Äther gewaschen und getrocknet. Auf diese Weise werden 7,59 g (88,5 % d. Th.) Na-o-Ni- trophenylsulfenyl-NE-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-di- cyclol#.exylammoniumsalz von F. 198-2011' erhalten. Aus Methanol umkristallisiert schmilzt die Substanz dann bei 197,5-198,5 ; sie ist chromatographisch einheitlich.
b) Aus 3,98 g (6,87 mMol) des obigen Salzes wird mittels wässriger Zitronensäure in Essigester die freie Säure hergestellt. Diese wird in 10 ml trockenem Äther gelöst und die Lösung mit 15,3 ml einer 0,46-m. Lösung von Diazomethan in Äther versetzt. Man lässt das Reaktionsgemisch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen, wäscht dann, mit Wasser, 1-n. Zitronensäure und 1-n. Kaliumbicarbonat und Wasser, trocknet die ätherische Lösung über Natriumsulfat und dampft sie zur Trockne ein. Auf diese Weise werden 2,82 g (99,3 o/a d. Th.) Na-o-Nitrophenylsulfenyl-NE-tert.-bu- tyloxycarbonyl-L-lysin-methylester erhalten.
Nach Umkristallisieren aus Äther/Petroläther schmilzt die Substanz bei 71-72 . [a]DZo = -32 0,4 (c = 3 %, DMF). Die Verbindung ist chromatographisch einheitlich:
Beispiel 3 NE-tert.-Butyloxycarbonyl-L- lysyl-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L- lygin-methylester-monochloracetat aus Na-o-Nitrophenyl-sulfenyl-NE- tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nf-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysin-methylester. 0,32 g (0,5 mMol) Na-o-Nitrophenylsulfenyl-NE- tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Ns-tert.-butyloxycarbon- yl-L-lysin-methylesterwerden in 15 ml einer 5,6-proz. 2-n. Lösung von Cyanwasserstoffsäure in Methanol gelöst. Nach Zugabe von 3,8 ml Eisessig wird das Gemisch während 20 Stunden in verschlossenem Kolben bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Die dünnschichtchro- matographische Analyse einer Probe der Lösung zeigt, dass alles Ausgangsmaterial verschwunden ist. Die klare, hellgelbe Lösung wird mit 1,0 ml einer 4,73-proz. Lösung (0,5 mMol) von Monochloressigsäure in Methanol versetzt und im Vakuum bei 25 bis fast zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit 30m1 Äther und 30m1 2-n. Essigsäure aufgenommen, die wässrige Schicht abgetrennt und die Ätherphase (I) zweimal mit je 30 ml Essigsäure extrahiert. Die klaren, fast farblosen wässrigen Fraktionen werden vereinigt und bei 25 am Hochvakuum eingedampft.
Nach ca. sechsstündigem Trocknen am Hochvakuum über Phos- phorpentoxyd und Kaliumhydroxyd verbleiben 0,29 g (100 % d. Th.) eines leicht gelblichen Öls, welches sich in drei Lösungsmittelsystemen bei der Dünnschichtchromatographie als einheitlich erweist. Es handelt sich hierbei um Ns-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-NE-tert.- butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester-monochloracetat.
Die Ätherfraktion I wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Dabei werden 0,12 g leicht gelblich gefärbtes o-Nitrophenylrhodanid vom F. 118 bis 126 erhalten.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 0,64 g (2,0 mMol) NE-tert.-B.utyloxycarbonyl-L-ly- sin-methylester-acetat werden in 10 ml Essigester suspendiert und bei 0 einmal mit 5 ml und einmal mit 3 ml eiskalter 2-n. Pottaschelösung geschüttelt, die Essigesterlösung dann mit 3 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und bei 30 im Vakuum zur Trockne verdampft. Es bleiben 0,54 g N±tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-mehtylester (freie Base) als farbloses Öl zurück.
Dieses wird in 15 ml reinem Acetonitril gelöst, 2,16 mMol Na-o-Nitrophenyl-NE-tert.- butyloxycarbonyl-L-lysin zugegeben, die klare, gelbe Lösung auf-15 gekühlt und mit einer auf-15 abgekühlten Lösung von 0,62 g (3,0 mMol) Dicyclohexylcarbomdi- imid in 4 ml Acetonitril versetzt. Die Mischung wird bei -15 während 30 Minuten gerührt und dann drei Tage bei 0 stehen gelassen.
Der ausgeschiedene Dicycioh@exylharnstoff wird abfiltriert, das gelbe Filtrat bei 40 vollständig eingedampft und der Rückstand in 20 ml warmem Essigester aufgenommen. Nach Abfil- trieren weiteren Dicyclohexylharnstoffs und Waschen mit 1-n. wässriger Zitronensäurelösung, 1-n. Kaliumbi- carbonatlösung und Wasser wird die klare, gelbe Essigesterschicht über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der schaumige Rückstand kristallisiert rasch beim Verreiben mit wenig Essigester.
Die kristalline Masse wird aus Essigester/Petroläther umkristallisiert, wobei 0,87 g (68,2 % d. Th.) reiner Na-o-Nitrophenyl- sulfenyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Ne-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysin-methylester vom F. 144-146 er-
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halten werden. Aus der Mutterlauge können weitere 1,134 g (10,4 /o d. Th.) etwas weniger reinen Substanz vom F. 141-143' gewonnen werden.
Beispiel 4 Abspaltung der o-Nitrophenylsulfenyl (NPS)-Schutzgruppe mit schwach essigsaurer Natriumthiosulfatlösung.
Zu einer Lösung von 20 mg o-Nitrophenylsulfenyl- glycin in 0,8 ml Methanol werden nacheinander 0,1 ml einer 1-m. Natriumthiosulfatlösung und 0,1 ml Eisessig gegeben. Die zuerst intensiv gelbe Lösung verfärbt sich nach Zugabe von Eisessig momentan und nimmt einen hellen, grüngelben Farbton an.
Nachdem die Reaktionslösung 5 Minuten bei Raumtemperatur gestanden hat, wird eine Probe davon auf Silicagel- Dünnschichtplatten aufgetragen und sogleich chromato- graphiert. Als einzige Ninhydrin-positive Substanz kann Glycin nachgewiesen werden; Rf = 0,05 im System I. o-Nitrophenylsulfenylglycin (Rf = 0,30) ist nicht feststellbar.
Auf analoge Weise werden die NPS-Gruppen aus den in der Tabelle angegebenen Aminosäuren und Peptiden bzw. deren Estern abgespalten. Der Rf-Wert ist im System 1 bestimmt.
EMI4.24
<tb> Tabelle
<tb> Ausgangsverbindung <SEP> Rf-Wert <SEP> Spaltprodukt <SEP> Rf-Wert
<tb> NPS-L-Prolin <SEP> 0,32 <SEP> L-Prolin <SEP> 0,05
<tb> NPS-L-Valin <SEP> 0,39 <SEP> L-Valin <SEP> 0,13
<tb> NPS-Glycinäthylester <SEP> 0,70 <SEP> Glycinäthylester <SEP> 0,16
<tb> Glycyl-L-phenylNPS-Glycyl-L-phenyl- <SEP> alanin-methylalanin-methylester <SEP> 0,69 <SEP> ester <SEP> 0,31
<tb> L-Valyl-L-pheNPS-L-ValyI-L-phe- <SEP> nylalanin-methylnylalanin-methylester <SEP> 0,73 <SEP> ester <SEP> 0,
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In allen Fällen ist die Abspaltung der o-Nitro-phe- nyisulfenylschutzgruppe nach 5 Minuten vollständig.
Die Ausgansstoffe können wie folgt hergestellt werden: 0,45 g (2 mMol) o-Nitrophenylsulfenyl-gl.ycin und 0,43 g (2 mMol) L-Phenylalanin-methylester-hydrochlo- rid werden in 15 ml trockenem Acetonitril suspendiert. Dazu werden 0,28 ml (0,20 g = 2 mMol) Triäthylamin gegeben. Der gelben Suspension werden 5 ml amin- freies Dimethylformamid zugesetzt und das Gemisch auf -5 gekühlt. Unter Rühren wird sodann eine kalte Lösung von 0,45 g (2,2 mMol) Dicyclohexylcarbodi- imid in 4 ml Acetonitril zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wird während 30 Minuten bei -5 gerührt und über Nacht (ca. 16 Stunden) bei 0 aufbewahrt. Sodann gibt man unter Rühren bei 5 0,1 ml Eisessig zu, lässt eine Stunde stehen und filtriert dann den Dicyclohexylharnstoff ab. Das gelbe Filtrat wird am Vakuum eingedampft, der ölige, gelbe Rückstand mit ca. 10 ml Essigester aufgenommen und nach Abfiltrie- ren des Dicyclohexylharnstoffs mit 1-n. wässriger Zitroiiensäurelösung, 1-n. Natriumbiearbonatlösung und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Natri- umsulfat getrocknet und eingedampft.
Es bleiben 0,82 g eines gelben Öls zurück, das aus Benzol/Petrol- äther kristallisiert. Man erhält 0,163 g einer gelben kristallinen Substanz vom F. 98-100 . Nach Umkri- stallisieren aus Aceton/Petroläther ist der F. 101-102 ; HD=0 = -5 -! 0,5 (c = 2 %, DMF).
Beispiel 5 Abspaltung der o-Nitrophenylsulfenylschutzgruppe mit schwach essigsaurer Natriumthiosulfatlösung in Gegenwart der tert.-Butyloxycarbonyl (BOC)-Schutzgruppe.
Zu einer Lösung von 20 mg N -o-Nitrophenylsul- fenyl-Na-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin in 0,8 ml Methanol werden nacheinander 0,1 ml einer 1-m. Lösung von Natriumthiosulfat in Wasser und 0,1 ml Eisessig gegeben. Nachdem die Lösung 5 Minuten lang bei Raumtemperatur gestanden hat, wird eine Probe davon auf eine Silicagel-Dünnschichtplatte aufgetragen und sogleich chromatographiert. Ausser NE-tert.-Butyl- oxycarbonyl-L-lysin kann keine Ninhydrin-positive Substanz nachgewiesen werden.
Auf analoge Weise werden die in der Tabelle aufgeführten Verbindungen gespalten. Der Rf-Wert ist im System I bestimmt.
EMI4.80
<tb> Tabelle
<tb> Ausgangsverbindung <SEP> Rf-Wert <SEP> Spaltprodukt <SEP> Rf-Wert
<tb> Na-NPS-N±-BOC-L- <SEP> N±-BOC-L-LysinLysin-methylester <SEP> 0,70 <SEP> methylester <SEP> 0,35
<tb> Nn-NPS-N±-BOC-L- <SEP> N=-BOC-L-LysylLysyl-NF-BOC-L- <SEP> NF-BOC-L-lysinlysin-methylester <SEP> 0,73 <SEP> methylester <SEP> 0,45
Die BOC-Gruppe wird in keinem Fall angegriffen. Beispiel 6 NE-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester-acetat aus Na-o-Nitrophenylsulfenyl-N- tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester mittels schwefliger Säure.
4,13 g (10 mMol) Na-o-Nitrophenylsulfenyl- NE-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester werden in 100 ml Methanol gelöst. Der klaren, orangegelben Lösung werden 50 ml Wasser zugesetzt, wodurch eine gelbe Emulsion entsteht, welche mit Schwefeldioxid gesättigt wird. Nach 25 Minuten ist eine klare, hellgelbe Lösung entstanden, die während 2 Stunden in verschlossenem Kolben bei Raumtemperatur aufbewahrt wird. Sodann wird das Reaktionsgemisch am Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 ml eingeengt, in 50 ml Methanol aufgenommen und mit 0,98 g (10 mMol) Kaliumacetat und 2 ml Eisessig versetzt. Es entsteht sogleich ein kristalliner Niederschlag von Kalium-S-o-nitrophenyl-thiosulfat.
Zur Vervollständigung der Kristallisation wird die Kristallsuspension eine Stunde lang im Kühlschrank aufbewahrt, sodann filtriert und der Filter-Rückstand mit wenig kaltem Methanol ausgewaschen. Man erhält 2,2 g (81 % d. Th.) Kalium-S-o-nitrophenyl-thiosulfat. Filtrat und Waschflüssigkeit werden gemeinsam am Vakuum eingedampft, mit 50 ml Essigester aufgenommen und zur Beseitigung letzter Spuren von Essigsäure erneut eingedampft. Diese Operation wird dreimal wiederholt.
Der Rückstand wird in 30 ml Essigester gelöst, auf 0 abgekühlt und einige Zeit bei dieser Temperatur gehal-
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ten. Inzwischen auskristallisiertes Kalium-S-o-nitrophe- nyl-thiosulfat (0,3 g = 11 % d. Th.) wird abfiltriert und die klare, nahezu farblose Lösung erneut zur Trockne verdampft. Durch erneutes Lösen, in Essigester, Kühlen, Filtrieren und Eindampfen kann weiteres Kalium- S-o-nitrophenyl-thiosulfat abgetrennt werden.
Letzte Spuren Kalium-S-o-nitrophenyl-thiosulfat werden beseitigt, indem man aus Essigester/Äther-Gemisch umkristallisiert, wobei von den zuerst abgeschiedenen öligen Anteilen abdekantiert wird. Aus der so gereinigten Lösung kristallisiert NE-tert.-Butyloxycarbonyl-L-ly- sin-acetat in nahezu farblosen Nadeln aus. Sie werden abfiltriert und mit wenig kaltem Essigester/Äther-Ge- misch gewaschen. Es werden zunächst 1,9 g (60 0/0 d. Th.) N±-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester- acetat, F. 72-74 , erhalten.
Aus der Mutterlauge können weitere 0,9 g (28 0/0 d. Th.) kristallisiertes N±-tert.- Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester-acetat vom F. 74-77 erhalten werden.
Beispiel 7 Abspaltung der o-Nitrophenylsulfenyl-Schutzgruppe mit verdünnter schwefliger Säure in Gegenwart der tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe und gegebenenfalls der tert.-Butylester-Schutzgruppe.
40 g Na-o-Nitrophenylsulfenyl-Ns-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysin-methylester werden mit einer gesättigten Lösung von Schwefeldioxyd in einem Gemisch aus gleichen Volumenteilen Methanol und Wasser versetzt. Die Substanz geht zunächst nur zum Teil in Lösung, ist aber nach einer Stunde klar gelöst. In geeigneten zeitlichen Abständen werden. dem Reaktionsgemisch Proben vorn jeweils 0,1 ml entnommen, welche eingedampft, kurz am Vakuum getrocknet und in 0,1 ml Methanol gelöst werden. Diese Proben werden dünnschicht-chromatographisch analysiert.
Es zeigt sich, dass die NPS-Schutzgruppe bereits nach 30 Minuten vollständig abgespalten ist.
Auf analoge Weise werden die NPS-Gruppen aus den in der Tabelle angegebenen NPS-Peptidderivaten abgespalten. Die Rf-Werte sind im System I bestimmt, die Abspaltung der NPS-Gruppe ist in allen Fällen nach 30 Minuten beendet.
Bei Verwendung von 2 Äquivalenten Chlorwasserstoff statt Schwefeldioxyd wird gleichzeitig die tert.-Butyloxycarbonylgruppe teilweise abgespalten.
EMI5.51
<tb> Tabelle
<tb> Ausgangsverbindung <SEP> Rf-Wert <SEP> Spaltprodukt <SEP> Rf-Wert
<tb> Na-o-Nitrophenylsul- <SEP> N±-tert.-Butylfenyl-N-tert.-butyl- <SEP> oxycarbonyl-Loxycarbonyl-L-lysyl <SEP> lysyl-L-prolylL-prolyl-L-valyl-gly- <SEP> Lrvalyl-glycincin-äthylester <SEP> (I) <SEP> 0,82 <SEP> äthylester <SEP> 0,36
<tb> Na-o-Nitrophenylsulfenyl-N-tert.-butyl- <SEP> N±-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl- <SEP> oxycarbonyl-LLrvalyl-L-tyrosyl-L- <SEP> lysyl-L-valyl-Lprolin-tert.-butyl- <SEP> tyrosyl-L-prolinester <SEP> (1I) <SEP> 0,87 <SEP> tert.-butylester <SEP> 0,62
Die Ausgangsstoffe können wie folgt hergestellt werden:
a) Herstellung von Na-o-Nitrophenylsulfenyl-N$- tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin- äthylester: Aus 6,5 g (11 mMol) Na-o-Nitrophenylsulfenyl- Na-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysin-dicyclohexylammo- niumsalz wird mittels verdünnter wässriger Zitronensäure die freie Säure in Essigester hergestellt. Diese wird in 70 ml Acetonitril gelöst. Zu der klaren, gelben Lösung werden 3 g (10 mMol) L-Prolyl-L-valyl-gly- cin-äthylester gegeben. Das Gemisch wird sodann auf -15 abgekühlt, wobei sich eine kristalline Substanz abscheidet.
Durch Zugabe von 20 ml Dimethylform- amid wird diese zum grössten Teil wieder in Lösung gebracht. Bei einer Innentemperatur von -14 bis -16 werden sodann 2,5 g (12 mMol) Dicyclohexylcarbodi- imid in mehreren Portionen während 45 Minuten zugegeben, wobei sich kristalliner Dicyclohexylharnstoff abscheidet. Nach beendeter Zugabe wird noch weitere 30 Minuten bei -14 bis -16 und 18 Stunden bei +2 gehalten. Sodann lässt man das Reaktionsgemisch 48 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen, gibt dann 0,2 ml Eisessig zu und lässt 2 Stunden lang reagieren.
Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird sodann abfiltriert und mit wenig kaltem Acetonitril und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 2,0 g (74 0/0 d. Th.) dieses Nebenproduktes, F. 228-230 .
Das Filtrat und die Waschlösungen werden gemeinsam am Vakuum eingedampft, wobei 12 g eines gelben Öls erhalten werden. Dieses Rohprodukt wird in 150 ml Essigester gelöst. Die klare, gelbe Lösung wird mit 2-n. Zitronensäurelösung, Wasser, 2-n. Natriumbi- carbon.atlösung und 5 %iger wässriger Natriumsulfatlö- sung gewaschen, wie üblich getrocknet und eingedampft. Es bleiben 8,1 g eines gelben Öls zurück, das aus Äther kristallisiert werden kann.
Auf diese Weise werden 4,1 g (61 % d. Th.) Na-o-Nitrophenyl-sulfenyl- Ne- - tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-gly- cin-äthylester, F. 78-80 , [a]D211 = -109 0,5 , erhalten. Die Verbindung ist in 3 Systemen chromatogra- phisch einheitlich.
b) Herstellung von Na-o-Nitrophenylsulfenyl-N±- tert. - butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prol- yl-tert.-butylester: Aus 6,5 g (11 mMol) Na-o-Nitrophenylsulfenyl- NE-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysin.-dicyclohexylammo- niumsalz wird mittels wässriger Zitronensäurelösung in Essigester die freie Säure hergestellt. Sie wird in 50 ml Acetonitril gelöst. Zu der klaren, gelben Lösung werden 4,4 g (10 mMol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-prolin-tert.- butylester gegeben, der sich gleichfalls klar auflöst.
Unter leichter Kühlung werden sodann 2,3 g (11 niMol) Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form in mehreren Portionen während 30 Minuten nach und nach eingetragen. Während dieser Zeit beginnt Dicyc- lohexylharnstoff in Form von farblosen Kristallnadeln auszukristallisieren. Man rührt bei Raumtemperatur noch weitere 10 Stunden, gibt sodann 0,2 ml Eisessig zu, lässt 45 Minuten reagieren und kühlt das Gemisch auf +3 . Sodann wird filtriert, mit Acetonitril und Äther nachgewaschen und das Filtrat zusammen mit den Waschflüssigkeiten am Vakuum zur Trockne verdampft. Der schaumig-amorphe Rückstand wird noch während 2 Stunden bei 60 im Vakuum getrocknet.
Auf diese Weise werden 9,2 g (100 % d. Th.) roher Na-o- Nitrophenylsulfenyl - NE - tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl- L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin7tert.-butylester (1I) erhalten.
4,0 g dieses Produktes werden in 50 ml Essigester gelöst und bei 0 mit 2-n. Zitronensäurelösung und 2-n. Pottaschelösung gewaschen, die Essigesterlösung wie üblich getrocknet und eingedampft. Es werden 4,0 g ge-
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reinigtes 1I in Form eines gelben, schaumig-amorphen Feststoffes, welcher zwischen 95' und 115 erweicht, erhalten. Im Chromatogramm (2 Systeme) lassen sich nur Spuren von Verunreinigungen nachweisen, die Mikroanalyse gibt die erwarteten Werte. [a]D2 = -56 0,5' (c = 2 in Methanol).
Beispiel 8 NE-tert.-Butyloxycarbonyl-L- lysin-methylester-acetat aus Na-Pentachlorphenylsulfenyl-NE- tert: butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester mittels Cyanwasserstoffsäure.
1,04 g (1,9 mMol) Na-Pentachlorphenylsulfenyl- Nt-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester werden in 33 ml einer 2-n. Lösung von Cyanwasserstoffsäure in Methanol suspendiert, 10 ml Eisessig zugegeben. und in verschlossenem Gefäss während 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Sodann wird die farblose Suspension am Vakuum zur Trockne verdampft, der Rückstand mit 50 ml Äther aufgenommen und von unlöslichem, kristallinem Pentachlorphenyl- rhodanid (0,28 g, F. 175-180 ) abfiltriert. Die klare, farblose Lösung wird dreimal mit je 50 ml 2-n. Essigsäure extrahiert, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und am Vakuum zur Trockne verdampft.
Hierbei werden weitere 0,36 g Pentachlorphenylrhoda- nid erhalten. Die Essigsäureextrakte werden gemein sam am Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand zur Entfernung von restlicher Essigsäure und Wasser mehrmals mit wenig trockenem Benzol verrieben und jeweils wieder zur Trockne verdampft. Auf diese Weise erhält man 0,55 g (90 % d. Th.) NE-tert.- Butyloxycarbonyl-L-lysinmethylester-acetat vom F. 70-75'. Im Dünnschicht-Chromatogramm lassen sich nur Spuren von Verunreinigungen nachweisen. Lysin- methylester oder Lysin ist nicht nachweisbar.
Das als Nebenprodukt erhaltene Pentachlorphe- nylrhodanid wird durch Hochvakuum-Sublimation gereinigt. Das schwach gelbliche Sublimat ist analysenrein und schmilzt bei l78-180 .
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden: 3,1- g (10 mMol) Ne-tert.-Butyloxycarbonyl-L-ly- sin-methylester-acetat werden in 25 ml Chloroform gelöst. Zur klaren Lösung werden 2,8 ml (2,0 g, 20 mMol) Triäthylamin gegeben. Unter kräftigem Rühren werden sodann 3,2 g (10 mMol) Pentachlorphenyl- sulfenylchlorid in mehreren Portionen eingetragen. Es entsteht eine Suspension, die während 19 Stunden bei Raumtemperatur gerührt wird. Danach ist der grösste Teil des Ungelösten in Lösung gegangen.
Geringe Reste (0,2 g) von festen Anteilen werden durch Filtration entfernt, das farblose Filtrat mit Wasser, 2-n. Zitronensäurelösung, 2-n. Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne verdampft. Es bleiben 5,8 g eines öligen Rückstandes, welcher aus Äther/Petroläther-Ge- misch kristallisiert werden kann. Es werden 3,2 g (59,4 % d. Th.) N -Pentachlorphenyl-sulfenyl-NE-tert- .-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester, F. 80-81 , erhalten.
Eine Probe der Substanz wird zur Analyse zweimal aus Äther/Petroläther-Gemisch umkristallisiert und schmilzt dann bei 81-81,5', [a]D20 = +26 0,5 (c = 2 in Methanol). Beispiel 9 Abspaltung verschiedener Aryl.sulfenyl-Schutzgruppen mittels schwefliger Säure.
40 mg (ca. 0,1 mMol) N -Pentachlorphenylsulfe- nyl-NE-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester werden in 2 ml einer gesättigten Lösung von Schwefeldioxyd in einem Gemisch von gleichen Teilen Methanol und Wasser suspendiert. Die Substanz geht nur zum Teil in Lösung. In zeitlichen Abständen werden dem Reaktionsgemisch Proben von jeweils 0,1 ml entnommen, welche eingedampft, kurz am Vakuum getrocknet und in 0,1 ml Methanol gelöst werden. Diese Proben werden dünnschicht-chromatographisch untersucht. Es zeigt sich, dass die Pentachlorphenvlsulfenylgruppe bereits nach 30 Minuten vollständig abgespalten ist.
Der Rf-Wert des Ausgangsmaterials im System I ist 0,85, derjenige des erhaltenen NE-tert.-Butyloxycarbo- nyl-L-lysin-methylesters 0,35.
Auf analoge Weise wird die 2,4-Dinitrophenylsulfe- nyl-Schutzgruppe aus Na-2,4-Dinitrophenylsulfenyl- NE-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester abgespalten. Hier ist die Spaltung erst nach etwa 24 Stunden vollständig. Der Rf-Wert des Ausgangsmaterials im System I ist 0,92, derjenige des Spaltproduktes wie oben 0,35.
Das Ausgangsprodukt Na-2,4-Dinitrophenylsulfe- nyl-Nt--tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester kann wie folgt hergestellt werden: 3,2 g (10 mMol) NE-tert: Butyloxycarbonyl-L-ly- sin-methylester-acetat werden in 25 ml Chloroform gelöst. Zu der klaren Lösung werden 2,8 ml (2,0 g, 20 mMol) Triäthylamin gegeben. Unter kräftigem Rühren werden sodann 2,4 g (10 mMol) 2,4-Dinitrophenyl- sulfenyl-chlorid in mehreren Portionen während 20 Minuten eingetragen. Die gelbe Suspension wird während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Nach dieser Zeit ist nur noch wenig ungelöstes Material vorhanden, welches abfiltriert wird (0,05 g). Das klare, gelbe Filtrat wird mit Wasser, 2-n. Zitronensäurelö- sung, 2-n. Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, mit festem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Es werden 5,1 g eines gelben Öls erhalten, welches in Äther gelöst, von wenig ungelöstem Nebenprodukt abfiltriert und bis zur beginnenden Kristallisation mit Petroläther versetzt wird. Die Lösung wird während ca. 4 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt, wobei sich nach und nach reichliche Mengen gelber Kristalle abscheiden.
Zur Vervollständigung der Kristallisation hält man während 20 Stunden bei 0', filtriert die Kristalle ab und wäscht mit Petroläther. Man gewinnt so 3,2 g (62 % d. Th.) Na-2,4-Dinitro- phenyl-sulfenyl-Na-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysin-me- thylester (I), F. 77-82'. Durch nochmaliges Umkristal- lisieren erhält man ein analysenreines Präparat, F. 84-8:1,5 .
Beispiel 10 N±-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin- methylester-formiat bzw. -propionat aus Na-o-Nitrophenylsulfenyl-Na-tert.-butyloxy- carbonyl-L-lysin-methylester mittels Cyanwasserstoffsäure.
1,24 g (3 mMol) Na-o-Nitrophenylsulfenyl- NE-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester (I) werden in 60 ml einer 2-n. Lösung von Cyanwasserstoff in Methanol gelöst. Man setzt der klaren, gelben Lösung 1.5 ml 85 O/oige wässrige Ameisensäure zu und bewahrt
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das Gemisch während 20 Stunden bei Raumtemperatur in verschlossenem Gefäss auf. Sodann wird am Vakuum zur Trockne verdampft, der Rückstand zur Entfernung von noch vorhandener Ameisensäure mit 40 ml Benzol aufgenommen, und erneut zur Trockne verdampft. Diese Operation wird zweimal wiederholt.
Der gelbliche Rückstand wird in 50 ml Äther gelöst und die Lösung dreimal mit je 25 ml 2-n. wässriger Ameisensäure und dreimal mit je 25 ml Wasser extra- hiert. Aus der Ätherschicht können 0,56 g (100 % d. Th.) o-Nitrophenyl-rhodanid, F. 121-123 , gewonnen werden. Die wässrigen Extrakte werden vereinigt, am Vakuum eingedampft, mit Benzol wie üblich von restlichem Wasser und Essigsäure befreit und während einer Stunde bei 40 am Hochvakuum getrocknet. Es bleiben 1,25 g eines leicht bräunlichen Öls zurück: NE-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester-formiat.
Auf analoge Weise werden aus 1,24 g 1, 60 ml 2-n. Cyanwasserstoff in Methanol und 15 ml Propionsäure 1,08 g NE-tert.-Butyloxycarbonyl-L lysin methylester- propionat in Form einer teilweise kristallinen, hellbraunen Substanz erhalten.
Beide Präparate sind chromatographisch einheitlich.
Beispiel 11 N±-tert.-Butyloxycarbonyl-L- lysin-methylester-acetat aus N -PentacWorphenylsulfenyl-NE- tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin- methylester mittels schwefliger Säure.
a) 5,40 g (10 mMol) N -Pentachlorphenylsulfenyl- Ne--tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester werden in 200m1 Methanol gelöst. Der klaren, farblosen Lösung werden 100 ml Wasser zugesetzt, wodurch eine farblose Emulsion entsteht, welche mit Schwefeldioxyd gesättigt wird. Nach 50 Minuten ist die Lösung nur noch schwach trüb. Sie wird während 11/2 Stunden; in verschlossenem Kolben bei Raumtemperatur aufbewahrt, Sodann wird das Reaktionsgemisch am Vakuum zur Trockne verdampft. Man erhält 7,8 g eines kristallinen Rückstandes, welcher aus einem Gemisch von 400m1 Essigester und 50m1 Methanol umkristallisiert wird.
Es werden 4,5 g (72 % d. Th.) farbloses, kristallines 5-Pentachlorphenylthioschwefelsäuresalz des NE- tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylesters, F. 142 bis 144 (Zersetzung) erhalten. Eine Probe dieser Substanz wird aus Essigester umkristallisiert und schmilzt dann bei 145-146 C.
b) 2,50 g (4 mMol) des unter a) erhaltenen Salzes werden in 30 ml Methanol gelöst. Dazu wird eine Lösung von 0,416 g (4,3 mMol) wasserfreiem Kali- umacetat in 10 ml Methanol gegeben. Dabei entsteht ein kristalliner, farbloser Niederschlag von Kalium- S-pentachlorphenylthiosulfat. Das Reaktionsgemisch wird während einer Stunde im Kühlschrank bei +3 aufbewahrt, sodann filtriert und der Filterrückstand mit kaltem Methanol gewaschen. Man erhält 1,38 g (84 (l/a d. Th.) Kalium-S-pentachlorphenylthiosulfat, F. 230 (Zersetzung).
Das Filtrat wird gemeinsam mit der Waschflüssigkeit am Vakuum eingedampft, in 30 ml Essigester unter Erwärmen gelöst und auf 0 abgekühlt. Hierbei scheidet sich weiteres Kalium-S-penta- chlorphenylthiosulfat (50 mg, 3 % d. Th.) aus, das durch Filtration entfernt wird. Das Filtrat wird eingeengt und mit Petroläther versetzt. Nach Animpfen kristallisieren 1,08 g (84 % d. Th.) NE-tert.-Butyloxycar- bonyl-L-lysin-methylester-acetat aus, welches nach nochmaligem Umkristallisieren bei 73-75 schmilzt.
Beispiel 12 S-Trityl-L-cystein aus N-o-Nitrophenylsulfenyl-S- trityl-L-cystein mittels Cyanwasserstoffsäure.
a) 40 mg (= ca. 0,08 mMol) N-o-Nitrophenylsulfe- nyl-S-trityl-L-cystein werden in 2 ml einer 2-n. Lösung von Cyanwasserstoffsäure in Methanol gelöst. Nach Zugabe von 0,5 ml Eisessig wird das Gemisch in. verschlossenem Gefäss bei Raumtemperatur aufbewahrt. In zeitlichen Abständen werden Proben entnommen, welche am Vakuum eingedampft und dünnschicht- chromatographisch analysiert werden. Es zeigt sich, dass die Abspaltung der NPS-Schutzgruppe nach etwa 24 Stunden vollständig ist. Cystein oder Cystin ist nicht vorhanden.