CH649782A5

CH649782A5 - Procede pour la production d'insuline humaine.

Info

Publication number: CH649782A5
Application number: CH4886/81A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1980-07-30
Filing date: 1981-07-28
Publication date: 1985-06-14
Also published as: IT8148915A0; FR2487851A1; FR2487851B1; GB2083826B; IT1196534B; GB2083826A; KR860000894B1; JPS5729294A; KR830005866A; JPS5756878B2; IT8148915A1

Description

La présente invention concerne un procédé selon le préambule de la revendication 1.

Les procédés classiques connus de production d'insuline humaine, tels que synthèse chimique, culture de tissus in vitro ou culture de micro-organismes recombinés génétiquement, n'aboutissent qu'à de très faibles rendements, avec un coût élevé. C'est pourquoi on utilise forcément de l'insuline de provenance bovine ou porcine.

La présente invention permet d'éviter ces inconvénients de l'art antérieur. Elle est fondée sur la constatation que l'on peut obtenir de façon inattendue des cellules humaines, capables de produire de l'insuline humaine en quantité de 2 à 50 fois supérieure, par cellule, à celle que l'on obtient lors de la culture de tissus in vitro, grâce à la multiplication de cellules humaines, capables de produire de l'insuline humaine, réalisée au moyen d'animaux à sang chaud.

Le nouveau procédé selon l'invention de production d'insuline humaine est donc caractérisé par la partie caractérisante de la revendication 1.

Le procédé selon l'invention, en dehors du fait qu'il permet une production plus forte d'insuline humaine, ne nécessite pas ou très peu de milieu nutritif contenant du sérum coûteux, pour la multiplication des cellules; il facilite, bien plus que dans le cas des cultures de tissus in vitro, la conservation du milieu de culture au cours de la multiplication cellulaire. En particulier, toutes les cellules humaines capables de produire de l'insuline humaine peuvent se multiplier facilement grâce au fluide corporel nutritif, fourni par un animal à sang chaud soit par transplantation de ces cellules à l'animal, soit par mise en suspension de ces cellules dans une chambre de diffusion conçue pour recevoir le fluide corporel nutritif; l'animal est nourri de manière habituelle. Ce procédé est également caractérisé par une multiplication des cellules plus stable et plus élevée, et par une production plus abondante d'insuline humaine par cellule.

Les cellules qui conviennent sont des cellules productrices d'insuline humaine, qui se multiplient facilement dans le corps d'animaux à sang chaud. On peut citer notamment les cellules humaines qui produisent par nature de l'insuline, comme les cellules ß intactes des îlots de Langerhans du pancréas humain, celles qui sont transformées par le virus EB ou l'irradiation aux rayons X et des cellules d'insuloma provenant de patients atteints à'insuloma; les cellules de carcinome du poumon humain, qui produisent de l'insuline humaine ectopique; conviennent aussi des lignées de cellules établies des cellules ci-dessus. De même, l'utilisation de lignées de lymphoblastoïdes humains établis, facilement conservables, introduites avec les gènes dominant la production d'insuline humaine, au moyen de techniques de recombinaison génétique avec utilisation d'enzymes telles qu' ADN-ligase, nucléase et ADN-polymérase, ou par fusion cellulaire utilisant des agents tels que polyéthylèneglycol ou virus de Sendai, aboutit commodément à une multiplication cellulaire remarquablement supérieure, lorsque leurs cellules sont transplantées dans le corps d'animaux à sang chaud et à une production, par cellule, d'insuline humaine 2 à 10 fois supérieure. En outre, comme la transplantation des lignées de lymphoblastoïdes humains établis mentionnées plus haut au corps de l'animal entraîne la formation de tumeurs massives, et que ces tumeurs massives ne sont guère contaminées par les cellules de l'hôte animal, et sont désagrégées facilement, les cellules de lymphoblastoïdes humains multipliées, vivantes, peuvent être facilement récoltées.

Comme animaux utilisables conviennent tous les animaux dans lesquels les cellules peuvent se multiplier, et avantageusement les volailles comme poulet et pigeon et des mammifères comme chien,

chat, singe, chèvre, cochon, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris et souris nue. Comme cette transplantation cellulaire fait naître une immunoréaction indésirable, il est souhaitable d'utiliser un animal nouveau-né ou en bas âge, ou au stade le plus jeune possible, notamment œuf, embryon ou fœtus. Afin de réduire l'im-munoréaction, l'animal peut être traité, avant la transplantation cellulaire, par une irradiation aux rayons X ou y, de l'ordre de 200 à 600 rems, ou recevoir une injection d'antisérum ou d'agent immuno-supressif, préparé selon le procédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente une immunoréaction plus faible, même à l'état adulte, on peut y transplanter commodément et laisser s'y multiplier rapidement, sans prétraitement, toutes les cellules humaines établies.

Une multiplication cellulaire stabilisée et une augmentation de la production d'insuline humaine peuvent être réalisées par transplantations répétées, utilisant une combinaison de différents animaux à sang chaud autres que l'homme; par exemple, ces objectifs peuvent être atteints par implantation d'abord de cellules humaines chez un hamster, où elles se multiplient, puis par réimplantation chez la souris nue. En outre, la transplantation répétée peut s'effectuer avec des animaux de la même classe ou division, aussi bien qu'avec ceux de la même espèce ou genre.

L'endroit où les cellules humaines sont implantables peut être tout site de l'animal où les cellules se multiplient; par exemple la cavité allantoïque, où les voies intraveineuse, intrapêritonéale ou sous-cutanée.

En dehors de cette transplantation directe des cellules dans le corps d'un animal, toutes les cellules humaines établies classiques capables de produire de l'insuline humaine peuvent se multiplier grâce à l'utilisation de fluide corporel nutritif, apporté par le corps d'un animal par inclusion, par exemple par voie intrapêritonéale, dans le corps de l'animal d'une chambre de diffusion classique, de taille et

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de forme variées, munie d'une membrane poreuse filtrante, d'un ultrafiltre, ou de fibre creuse dont la dimension des pores a un diamètre de l'ordre de 10~7 à 10~5 m, qui empêche la contamination par pénétration des cellules de l'hôte à l'intérieur de la chambre de diffusion, et permet l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut avoir une forme appropriée, elle peut être placée par exemple sur l'hôte animal, et laisser circuler le fluide corporel du corps de l'animal vers la chambre, ce qui permet l'observation de la suspension de cellules dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres latérales transparentes, prévues dans la paroi de cette chambre, ainsi que le remplacement par échange avec une chambre nouvelle; de cette façon, la multiplication cellulaire augmente à un niveau encore supérieure par rapport à la durée de vie de l'animal, et la production de cellules par animal est augmentée, sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise une telle chambre de diffusion, comme les cellules humaines multipliées peuvent être récoltées facilement et qu'aucune immunoréaction n'est suscitée en raison de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, tout animal à sang chaud peut être utilisé comme hôte conformément à l'invention, sans traitement préalable, destiné à réduire l'immunoréaction. L'alimentation de l'hôte animal implanté avec des cellules humaines peut être effectuée facilement par un procédé classique, même après la transplantation de cellules, et ne nécessite aucun soin particulier.

La multiplication maximale des cellules est atteinte au bout de 1 à 20 semaines environ, après la transplantation. Lorsque les cellules humaines établies implantées dans l'animal sont des cellules de tumeur humaine, ou des lignées de lymphoblastoïdes humains, la multiplication cellulaire maximale est atteinte en 1 à 5 semaines après la transplantation cellulaire, en raison de leurs vitesses de multiplication très supérieures.

Le nombre de cellules humaines pouvant être obtenues par hôte s'étage entre IO7 et 1012 ou plus. Autrement dit, le nombre de cellules humaines transplantées dans le corps de l'animal est multiplié par 102 à 107 ou plus, ou est environ égal à 10 à 106 fois plus celui qui est atteint par le procédé de culture in vitro de tissu, utilisant un milieu nutritif. Il en ressort bien que ces cellules peuvent être utilisées pour la production d'insuline humaine.

En ce qui concerne l'induction de l'insuline, on peut utiliser tout procédé dans lequel les cellules humaines obtenues par le mode opératoire mentionné plus haut y libèrent de l'insuline humaine. Par exemple, les cellules humaines multipliées obtenues par multiplication en ascite, en suspension et récolte à partir de cet ascite, ou par extraction de tumeur massive, formée sous la peau, et récolte après désagrégation de ladite tumeur, sont mises en suspension à une concentration de l'ordre de 104 à 108 cellules/ml dans un milieu nutritif, maintenues à une température voisine de 20 à 40° C, puis sont soumises à cette température à l'action d'un inducteur d'insuline pendant 1 à 20 h, pour produire l'insuline humaine. Les inducteurs d'insuline préférés sont des saccharides comme glucose, mannose, fructose, ribose et xylitol; des aminoacides comme arginine, lysine et leucine; des hormones peptidiques comme glucagon et hormone adrénocorticotrope (ACTH); des cations métalliques comme K+ et Ca++.

L'insuline humaine ainsi obtenue peut être recueillie facilement par des techniques de purification et de séparation utilisant des modes opératoires classiques, tels que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Lorsque l'on souhaite disposer d'une préparation d'insuline humaine encore plus purifiée, on peut l'obtenir par une combinaison des techniques mentionnées plus haut, avec des techniques classiques comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, Chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et électro-phorèse.

La préparation d'insuline humaine ainsi obtenue peut être utilisée seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administration interne ou externe, ou de diagnostic, en vue de la prévention et du traitement de maladies humaines.

L'insuline humaine est dosée dans le milieu de culture par le procédé d'immunoessai d'enzyme décrit par K. Kato et coll., « J. Biochem.», vol. 78, pp. 235-237 (1975), et sa quantité est exprimée en Unités Internationales d'insuline humaine (UI), IUI d'insuline humaine étant définie comme la quantité d'insuline qui diminue le taux de sucre sanguin du lapin à 64 mg/dl en 1 h, ou à 45 mg/dl, 2 h après son injection par voie sous-cutanée.

Les exemples suivants constituent une illustration non limitative de formes de réalisation du procédé selon l'invention.

Exemple 1

Des cellules désagrégées d'insuloma humain, obtenues par extraction à partir d'un malade à insuloma et hachage, sont implantées par voie sous-cutanée à des souris nues adultes, qui sont ensuite nourries de manière habituelle, pendant 3 semaines. Les tumeurs massives, résultantes, qui se forment sous la peau et pèsent environ 10 g chacune, sont désagrégées par extraction, hachage et mise en suspension dans une solution saline physiologique, contenant de la collagé-nase. Après lavage avec du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum fœtal de bovidé, les cellules sont remises en suspension, de façon à obtenir une concentration de l'ordre de 10s cellules/ml de préparation fraîche du même milieu contenant 20 mmol de D-glucose en tant qu'inducteur d'insuline; elles sont ensuite mises à incuber à 37° C pendant 4 h, pour donner de l'insuline humaine. Puis les cellules sont soumises aux ultrasons, et la quantité d'insuline humaine présente dans la partie surnageante est dosée. La production est voisine de 1000 nUI/cellule. Les cellules témoins, obtenues par culture in vitro de cellules d'insuloma humain dans du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionné de 10% en volume/volume de sérum fœtal de bovidé, et mises en incubation à 37° C, sont traitées comme précédemment avec l'inducteur d'insuline. La production d'insuline humaine n'est que de 200 (xUI/cellule.

Exemple 2

Des cellules désagrégées d'insuloma humain obtenues comme dans l'exemple 1 et une lignée de cellules lymphoblastoïdes leucémiques humaines de Namalwa sont mises ensemble en suspension dans un récipient de solution saline contenant 140 mmol de NaCl, 54 mmol de KCl, 1 mmol de NaH2P04 et 2 mmol de CaCl2, pour donner des concentrations respectives voisines de 103 cellules/ml. La suspension de cellules, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation de la même solution saline contenant du virus de Sendai préinactivé, transférée environ 5 min après le mélange dans un incubateur à 37° C, et y est agitée pendant 30 min environ pour réaliser le fusionnement des cellules, introduisant l'aptitude à la production d'insuline humaine des cellules d'insuloma humain dans la lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains. Après clonage selon un procédé classique de la couche de cellules d'hybridoma capable de produire de l'insuline humaine, on implante cette souche par voie intrapêritonéale à des souris nues adultes, qui sont nourries ensuite de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives résultantes, de 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour induire l'insuline humaine, mais en remplaçant les 20 mmol de D-glucose par 30 mmol de L-arginine. La production d'insuline humaine est de l'ordre de 3200 |iUI/cellule. L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1, par culture in vitro de lignée de Namalwa de lymphoblastoïdes fusionnés humains, et exposition des cellules multipliées à l'inducteur d'insuline. La production d'insuline humaine n'est que de 100 nUI/cellule environ.

Exemple 3

Après injection d'antisérum, préparé à partir de lapins selon un procédé classique, à des hamsters nouveau-nés afin de réduire leur immunoréaction possible résultant de la transplantation de cellules, on implante à ces animaux par voie sous-cutanée une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à la production d'insuline des cellules d'insuloma humain est introduite comme indiqué dans l'exemple 2, puis on les nourrit de

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manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant environ 10 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour produire de l'insuline humaine. Cette production est de l'ordre de 2300 )iUI/cellule.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains fusionnés JBL, et exposition des cellules multipliées à un inducteur d'insuline. La production d'insuline humaine n'est que de l'ordre de 200 nUI/cellule.

Exemple 4

Des rats nouveau-nés sont implantés par voie intraveineuse avec une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains de Namalwa, dans laquelle l'aptitude à produire de l'insuline humaine des cellules d'insuloma humain est introduite comme dans l'exemple 2, puis ils sont nourris de manière habituelle pendant 4 semaines. Les tumeurs massives résultantes, environ 40 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1, pour produire de l'insuline humaine. Cette production est de l'ordre de 2600 p.UI/cellule.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 3. La production d'insuline humaine n'est que de 100 |iUI/cellule.

Exemple 5

Des souris adultes sont irradiées avec 400 rems de rayons X afin de réduire leur immunoréaction, implantées par voie sous-cutanée avec des cellules d'insuloma humain, obtenues comme dans l'exemple 2, et nourries de manière habituelle pendant 3 semaines. Les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour produire de l'insuline humaine. La production de cette insuline est de l'ordre de 1000 |iUI/cellule.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de cellules d'insuloma humain, et exposition des cellules multipliées à l'inducteur d'insuline. La production d'insuline humaine n'est que de 200 (iUI/cellule.

Exemple 6

Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'insuline humaine des cellules d'insuloma humain est introduite comme dans l'exemple 3, est mise en suspension dans du sérum physiologique, et le tout est transféré dans une chambre de diffusion ayant un volume interne de l'ordre de 10 ml, et dont la membrane filtrante a une dimension de pores de l'ordre de 0,5 (i de diamètre; cette chambre est incorporée par voie intrapêritonéale à l'intérieur d'un rat adulte. Au bout de 4 semaines, pendant lesquelles le rat est nourri de manière habituelle, on enlève cette chambre. La densité en cellules humaines atteinte dans la chambre par l'opération ci-dessus est de l'ordre de 5 x 109 cellules/ml, ce qui est 103 fois supérieur à ce que l'on obtient lors de la culture in vitro au moyen d'un incubateur à C02. Les cellules ainsi obtenues sont traitées comme dans l'exemple 1 pour induire de l'insuline humaine. La production de cette dernière est voisine de 2500 nUI/cellule.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 3. La production d'insuline humaine n'est que d'environ 200 |iUI/cel-lule.

Exemple 7

Une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire de l'insuline humaine des cellules d'insuloma humain est introduite comme dans l'exemple 3, est implantée dans la cavité allantoïque d'œufs embryonnés, préalablement mis à incuber à 37° C pendant 5 d. Après remise en incubation de ces œufs à cette température pendant une semaine supplémentaire, les cellules humaines multipliées sont récoltées. Elles sont ensuite traitées comme dans l'exemple 1 pour donner de l'insuline humaine. La production de cette insuline est de l'ordre de 2000 |iUI/cellule.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 3. La production d'insuline humaine n'est que de l'ordre de 200 )iUI/ cellule.

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Claims

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1. Procédé pour la production d'insuline humaine par multiplication de cellules humaines capables d'en produire, caractérisé en ce que, avant de les exposer à l'action d'un inducteur d'insuline, on soumet lesdites cellules à l'action in vivo d'un fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud.

2. Procédé selon la revenidcation 1, caractérisé en ce que lesdites cellules sont transplantées directement dans le corps de l'animal à sang chaud.

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REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules se multiplient dans un dispositif, qui leur apporte le fluide nutritif corporel de l'animal.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire l'insuline sont des cellules ß intactes des îlots de Langerhans du pancréas humain, celles qui sont transformées par le virus EB ou l'irradiation aux rayons X, des cellules d'insuloma de patients humains, des cellules de carcinome de poumons humains.

6. Procédé selon l'une des revedendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules capables de produire l'insuline humaine sont des cellules hybridoma obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoïdes leucémiques humains avec l'une des cellules décrites dans la revendication 5.

7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'inducteur d'insuline est un saccharide comme glucose, man-nose, fructose, ribose, xylitol, un aminoacide comme arginine,

lysine, leucine; une hormone peptidique comme glucagon, hormone adrénocorticotrope; un cation métallique comme K+, Ca+ + , ou le mélange de plusieurs d'entre eux.

8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille comme poulet ou pigeon, un mammifère comme chien, chat, singe, chèvre, cochon, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue.

9. Insuline humaine obtenue par le procédé selon une des revendications 1 à 8.