CH650802A5

CH650802A5 - Production d'hormone de croissance humaine.

Info

Publication number: CH650802A5
Application number: CH4866/81A
Authority: CH
Inventors: Kaname Sugimoto
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1980-07-31
Filing date: 1981-07-27
Publication date: 1985-08-15
Also published as: FR2487852B1; GB2083824A; JPS5731622A; GB2083824B; IT1142590B; KR830005868A; JPS6045848B2; FR2487852A1; IT8148956A0; KR860000895B1

Description

La présente invention concerne un procédé selon le préambule de la revendication 1, à savoir un procédé amélioré pour la production d'hormone de croissance humaine, ci-après désignée par hGH.

Les procédés classiques connus de production d'hGH, tels que synthèse chimique, culture de tissus in vitro ou culture de microorganismes recombinés génétiquement, n'aboutissent qu'à de très faibles rendements, avec un coût élevé.

La présente invention permet d'éviter ces inconvénients de l'art antérieur. Elle est fondée sur la constatation que l'on peut obtenir, de façon inattendue, des cellules humaines capables de produire de l'hGH en quantité de 2 à 50 fois supérieure, par cellule, à celle que l'on obtient lors de culture de tissus m vitro, grâce à la multiplication de cellules humaines capables de produire de l'hGH, réalisée au moyen d'animaux à sang chaud.

Le procédé est donc caractérisé selon l'invention par la partie caractérisante de la revendication 1. Des exécutions particulièrement avantageuses du procédé découlent des revendications 2 à 9.

L'invention concerne également l'hormone de croissance humaine obtenue par le procédé.

Le procédé selon l'invention, en dehors du fait qu'il permet une production plus forte d'hGH, ne nécessite pas ou très peu de milieu nutritif contenant du sérum coûteux pour la multiplication des cellules et facilite, bien plus que dans le cas des cultures de tissus in vitro, la conservation du milieu de culture au cours de la multiplication cellulaire. En particulier, toutes les cellules humaines capables de produire de l'hGH peuvent se multiplier facilement grâce au fluide corporel nutritif fourni par un animal à sang chaud soit par transplantation de ces cellules à l'animal, soit par la mise en suspension de ces cellules dans une chambre de diffusion conçue pour recevoir le fluide corporel nutritif, l'animal étant nourri à la manière habituelle. Ce procédé est également caractérisé par une multiplication des cellules plus stable et plus élevée et par une production supérieure d'hGH par cellule.

Les cellules qui conviennent sont des cellules productrices d'hGH qui se multiplient facilement dans le corps d'animaux à sang chaud. On peut citer notamment les cellules humaines qui produisent par nature de l'hGH, comme les cellules acidophiles humaines intactes provenant de l'hypophyse antérieure, celles qui sont transformées par le virus EB ou par l'irradiation aux rayons X, et des cellules acidophiles d'adénome provenant d'un malade souffrant d'adénome acidophile de l'hypophyse, les cellules de carcinome du poumon humain qui produisent de l'hGH ectopique. Des lignées de cellules établies des cellules ci-dessus sont facilement réalisables. De même, l'utilisation de lignées de lymphoblastoides humains établis, facilement conservables, introduites avec les gènes dominant la production d'hGH, au moyen de techniques de recombinaison génétique avec utilisation d'enzymes tels que ADN-ligase, nucléase et ADN-polymérase, ou par fusion cellulaire utilisant des agents tels que po-lyéthylèneglycol ou virus de Sendaï, aboutit commodément à une multiplication cellulaire remarquablement supérieure, lorsque leurs cellules sont transplantées dans le corps d'animaux à sang chaud, et à une production par cellule d'hGH 2 à 10 fois supérieure. En outre, comme la transplantation des lignées de lymphoblastoides humains établis mentionnés plus haut, au corps de l'animal, entraîne la formation de tumeurs massives et que celles-ci ne sont guère contaminées par les cellules de l'hôte animal et sont désagrégées facilement, les cellules de lymphoblastoides humains multipliées vivantes peuvent être facilement récoltées.

Comme animaux utilisables conviennent tous les animaux dans lesquels les cellules peuvent se multiplier et, avantageusement, les volailles comme poulet et pigeon et des mammifères comme chien, chat, singe, chèvre, cochon, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris et souris nue. Comme cette transplantation cellulaire fait naître une immunoréaction indésirable, il est souhaitable d'utiliser un animal nouveau-né ou en bas âge, ou au stade le plus jeune possible comme œuf, embryon ou fœtus. Afin de réduire l'immunoréac-tion, l'animal peut être traité avant la transplantation cellulaire par une irradiation aux rayons X ou de l'ordre de 200 à 600 rem, ou recevoir une injection d'antisérum ou d'agent immunosuppressif préparé selon le procédé classique. Comme la souris nue, utilisée comme animal à sang chaud, présente une immunoréaction plus faible, même à l'état adulte, on peut y transplanter commodément et laisser s'y multiplier rapidement, sans prétraitement, toutes les cellules humaines établies.

Une multiplication cellulaire stabilisée et une augmentation de la production d'hGH peuvent être réalisées par transplantation répétée utilisant une combinaison de différents animaux à sang chaud; par exemple, ces objectifs peuvent être atteints par implantation d'abord de cellules humaines chez un hamster où elles se multiplient, puis par réimplantation chez la souris nue. En outre, la transplantation répétée peut s'effectuer avec des animaux de la même classe ou division aussi bien qu'avec ceux de la même espèce ou du même genre.

L'endroit où les cellules humaines sont implantables peut être tout site de l'animal où les cellules se multiplient, par exemple la cavité allantoïque, les voies intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée.

En dehors de cette transplantation directe des cellules dans le corps d'un animal, toutes les cellules humaines établies classiques capables de produire de l'hGH peuvent se multiplier grâce à l'utilisation de fluide corporel nutritif apporté par le corps d'un animal par

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inclusion, par exemple par voie intraperitoneale, dans le corps de l'animal d'une chambre de diffusion classique, de taille et de forme variées, munies d'une membrane poreuse filtrante, d'un ultrafiltre ou de fibre creuse, dont la dimension des pores a un diamètre de l'ordre de 10-7 à 10-5 m, qui empêche la contamination par pénétration des cellules de l'hôte à l'intérieur de la chambre de diffusion et qui permet l'apport du fluide corporel nutritif de l'animal aux cellules. De plus, comme la chambre de diffusion peut être éventuellement de forme appropriée, elle peut être placée par exemple sur l'hôte animal pour laisser circuler le fluide corporel du corps de l'animal vers la chambre, ce qui permet l'observation de la suspension de cellules dans la chambre par une ou par plusieurs fenêtres latérales transparentes prévues dans la paroi de cette chambre, ainsi que le remplacement par échange avec une chambre fraîche; de cette façon, la multiplication cellulaire augmente à un niveau encore supérieur par rapport à la durée de vie de l'animal et la production de cellules par animal est encore augmentée sans sacrifice de l'hôte. En outre, lorsqu'on utilise une telle chambre de diffusion, comme les cellules humaines multipliées peuvent être récoltées facilement et qu'aucune immunoréaction n'est suscitée en raison de l'absence de contact direct entre les cellules humaines et celles de l'hôte animal, tout animal à sang chaud peut être utilisé comme hôte conformément à l'invention, sans traitement préalable destiné à réduire l'immunoréaction.

L'alimentation de l'hôte animal implanté avec des cellules humaines peut être effectuée facilement par un procédé classique,

même après la transplantation de cellules, et ne nécessite aucun soin particulier.

La multiplication maximale des cellules est atteinte au bout de 1 à 20 sem environ après la transplantation. Lorsque la lignée de cellules humaines établies implantée dans l'animal provient d'une tumeur humaine ou des lignées de lymphoblastoides humains, la multiplication cellulaire maximale est atteinte entre 1 à 5 sem après la transplantation cellulaire, en raison de leurs vitesses de multiplication très supérieures.

Le nombre de cellules humaines obtenues par hôte peut s'étager entre IO7 et 1012 ou plus. Autrement dit, le nombre de cellules humaines transplantées dans le corps de l'animal est multiplié par 102 à 107 ou plus, ou est environ égal à 10 à 106 fois ou plus à celui qui est atteint par le procédé de culture in vitro de tissu utilisant un milieu nutritif; il en ressort que ces cellules peuvent être utilisées pour la production d'hGH.

En ce qui concerne le procédé d'induction de l'hGH, on peut utiliser tout procédé dans lequel les cellules humaines obtenues par le mode opératoire mentionné plus haut libèrent de l'hGH. Par exemple, les cellules humaines multipliées obtenues par multiplication en ascite en suspension et récolte à partir de cet ascite ou par extraction de tumeur massive formée sous la peau et récolte après désagrégation de ladite tumeur sont mises en suspension à une concentration de l'ordre de 104 à 108 cellules/ml dans un milieu nutritif, maintenues à une température voisine de 20 à 40°C; elles sont ensuite soumises à cette température à l'action d'un inducteur d'hGH pendant 1 à 20 h pour produire l'hGH. Les inducteurs préférés d'hormone de croissance sont des aminoacides comme lysine, arginine, trypto-phane, leucine, des acides casamino et L-DOPA, des métabolites d'aminoacides comme sérotonine, et des peptides.

L'hGH ainsi obtenue peut être recueillie facilement par des techniques de purification et de séparation utilisant des modes opératoires classiques tels que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyophilisation. Lorsque l'on souhaite disposer d'une préparation d'hGH encore plus purifiée, on peut l'obtenir par une combinaison des techniques mentionnées plus haut avec des techniques classiques comme adsorption et désorption avec échange d'ions, filtration sur gel, Chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et électrophorèse.

Comme la préparation d'hGH ainsi obtenue est identique immu-nologiquement à une préparation-étalon d'hGH, elle peut être avantageusement utilisée, seule ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, pour injection, administration externe, interne, ou diagnostic, en vue de la prévention et du traitement de maladies humaines, aussi bien que pour la stimulation de la croissance humaine.

Dans la présente description, la production d'hGH dans le milieu de culture est dosée par le procédé de radio-immuno-essai décrit par S.M. Glick et coll., «Nature», vol. 199, p. 784 (1963), et est exprimée en poids, rapporté à ceux de la préparation-étalon de hGH distribuée par le National Institute of Health.

Les exemples suivants constituent une illustration non limitative de forme de réalisation du procédé selon l'invention.

Exemple 1 :

Des cellules désagrégées d'adénome acidophile humain obtenues par extraction à partir d'un malade souffrant d'adénome acidophile de la glande hypophysaire, puis par broyage, sont implantées par voie sous-cutanée à des souris nues adultes qui sont nourries de manière habituelle pendant 3 sem. Les tumeurs massives résultantes formées sous la peau et pesant 10 g chacune sont désagrégées par extraction, par broyage, puis sont mises en suspension dans du sérum physiologique contenant de la trypsine. Après lavage avec du milieu Earle 199 (pH 7,2), les cellules sont additionnées avec 10% en volume/volume de sérum fœtal de bovidé, puis remises en suspension dans une préparation fraîche du même milieu contenant 30 mM de L-arginine en tant qu'inducteur d'hormone de croissance; on laisse incuber à 37 C pendant 6 h pour produire l'hGH. Les cellules sont alors soumises aux ultra-sons et l'hGH surnageante est dosée: sa production est de l'ordre de 500 ng/ml de suspension de cellules.

Les cellules témoins obtenues par culture in vitro de cellules d'adénome acidophile humaine dans du milieu de Earle 199 (pH 7,2), additionnées de 10% en volume/volume de sérum fœtal de bovidé et mises à incuber à 37' C, sont traitées comme plus haut avec l'inducteur d'hormone de croissance: la production d'hGH n'est alors que de l'ordre de 100 ng/ml de suspension de cellules.

Exemple 2:

Des cellules désagrégées d'adénome acidophile humain obtenues par extraction à partir d'un malade souffrant d'adénome acidophile de la glande hypophysaire, puis par broyage, et une lignée de lymphoblastoides leucémiques humains de Namalwa sont mises ensemble en suspension dans un récipient avec une solution saline contenant 140 mM de NaCl, 54 mM de KCl, 1 mM de NaH2P04 et 2 mM de CaCI2, de manière à donner des concentrations cellulaires respectives de l'ordre de 103/ml. Cette suspension, refroidie à la glace, est mélangée avec une préparation de la même solution saline contenant du virus de Sendaï préalablement inactivé par irradiation ultra-violette, le tout transféré dans un incubateur à 37'C environ 5 min après le mélange et y est agité pendant 30 min environ pour réaliser la fusion cellulaire introduisant, dans la lignée de lympho-blastoïdes leucémiques humains, l'aptitude des cellules d'adénome acidophile humain à produire de l'hGH. Après clonage selon un procédé classique des cellules d'hybridome capables de produire l'hGH, ces cellules sont implantées par voie intrapéritonéale dans des souris blanches adultes qui sont ensuite nourries de manière habituelle pendant 5 sem. Les tumeurs massives résultantes pesant environ 15 g chacune sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2, mais les 30 nM de L-argine sont remplacés par de la L-DOPA. La production de l'hGH est voisine de 1800 ng/ml de suspension de cellules.

L'expérimentation témoin est conduite comme dans l'exemple 1 par culture in vitro des cellules d'hybridome et par exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone de croissance. La production de l'hGH n'est que de 100 ng/ml de suspension de cellules.

Exemple 3:

Après injection d'antisérum préparé à partir de lapin selon le procédé classique à des hamsters nouveau-nés, afin de réduire l'immunoréaction possible résultant de la transplantation des cellules, on implante à ces animaux par voie sous-cutanée une lignée de lym-

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phoblastoïdes leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire l'hGH des cellules d'adénome acidophile humain est introduite comme dans l'exemple 2; les animaux sont ensuite nourris de manière habituelle pendant 3 sem. Les tumeurs massives résultantes formées sous la peau et pesant 10 g chacune sont extraites et traitées 5 comme dans l'exemple 1. La production d'hGH est de l'ordre de 2000 ng/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est conduite comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de lignée de lymphoblastoides leucémiques humains JBL fusionnés et par exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone de croissance. La production d'hGH n'est que de 200 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 4:

A des rats nouveau-nés on implante par voie intraveineuse une lignée de lymphoblastoides humains de Namalwa, dans laquelle l'aptitude à produire l'hGH des cellules d'adénome acidophile humain est introduite comme dans l'exemple 2; puis on nourrit les rats de manière habituelle pendant 4 sem. Les tumeurs massives résultantes pesant environ 40 g chacune sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour donner l'hGH. La production d'hGH est voisine de 1500 ng/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de lignée de lymphoblastoides leucémiques humains de Namalwa fusionnés et par exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone de croissance. La production d'hGH n'est alors que de 100 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 5:

Des souris adultes sont irradiées avec environ 400 rem de rayons X, afin de réduire leur immunoréaction; on leur implante par voie sous-cutanée des cellules d'adénome acidophile humain obtenu comme dans l'exemple 1 et elles sont nourries de manière habituelle pendant 3 sem. Les tumeurs massives résultantes formées sous la peau et pesant 15 g chacune sont extraites et traitées comme dans l'exemple 2; la production d'hGH est de l'ordre de 600 ng/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de cellules d'adénome acidophile humain, et par exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone de croissance. La production d'hGH n'est que de l'ordre de 200 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 6:

Une lignée de lymphoblastoides leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude à produire l'hGH des cellules d'adénome acidophile humain est introduite comme dans l'exemple 3, est mise en suspension dans du sérum physiologique et le tout est transféré dans une chambre de diffusion de 10 ml environ de volume interne, munie d'une membrane dont la dimension du diamètre des pores est voisine de 0,5 |i. Cette chambre est incluse par voie intrapéritonéale chez un rat adulte et est enlevée du rat après 4 sem durant lesquelles le rat a été nourri à la manière habituelle. La densité en cellules humaines dans cette chambre, atteinte lors de cette opération, est d'environ 5 x 109 cellules/ml, ce qui est 103 fois supérieur ou plus à ce que l'on obtient par culture in vitro au moyen d'un incubateur à C02. Les cellules ainsi obtenues sont traitées comme dans l'exemple 1 pour produire l'hGH; cette production est d'environ 2200 ng/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de lignée de lymphoblastoides leucémiques humains JBL et par exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone de croissance. La production d'hGH n'est que de 200 ng/ml de suspension cellulaire.

Exemple 7:

Une lignée de lymphoblastoides leucémiques humains JBL, dans laquelle l'aptitude des cellules d'adénome acidophile humain à produire de l'hGH a été introduite comme dans l'exemple 3, est implantée dans la cavité allantoïque d'oeufs embryonnés préalablement mis à incuber à 37° C pendant 5 d. Après mise en incubation de ces œufs à cette même température pendant 1 sem supplémentaire, les cellules humaines multipliées sont récoltées, puis traitées comme dans l'exemple 1 pour donner l'hGH. La production en hGH est voisine de 1300 ng/ml de suspension cellulaire.

L'expérimentation témoin est réalisée comme dans l'exemple 1 par culture in vitro de lignée de lymphoblastoides leucémiques humains JBL fusionnés et par exposition des cellules multipliées à l'action de l'inducteur d'hormone de croissance. La production d'hGH n'est que de 200 ng/ml de suspension cellulaire.

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Claims

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1. Procédé pour la production d'hormone de croissance humaine par multiplication de cellules humaines capables d'en produire, caractérisé en ce que, avant de les exposer à l'action d'un inducteur de cette hormone, on soumet lesdites cellules à l'action d'un fluide corporel nutritif d'un animal à sang chaud.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules sont transplantées directement dans le corps de l'animal à sang chaud.

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REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdites cellules se multiplient dans un dispositif dans lequel on leur apporte le fluide nutritif corporel de l'animal.

4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le dispositif est une chambre de diffusion.

5. Procédé selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire l'hormone de croissance sont des cellules humaines acidophiles intactes provenant de l'hypophyse antérieure, celles qui sont transformées par le virus EB ou par irradiation aux rayons X, ou des cellules d'adénome acidophiles humaines.

6. Procédé selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire l'hormone de croissance sont des cellules établies des cellules décrites dans la revendication 5.

7. Procédé selon une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les cellules humaines capables de produire l'hormone de croissance sont des cellules d'hybridome obtenues par fusion cellulaire d'une lignée de lymphoblastoides leucémiques humains avec une des cellules décrites dans l'une des revendications 5 ou 6.

8. Procédé selon une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'inducteur de l'hormone est formé paT un aminoacide, notamment lysine, arginine, tryptophane, leucine, par des acides casamino, par un métabolite d'aminoacide comme sérotonine ou par un Polypeptide.

9. Procédé selon une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'animal à sang chaud est une volaille comme poulet ou pigeon, un mammifère comme chien, chat, singe, chèvre, cochon, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue.

10. Hormone de croissance humaine obtenue par le procédé selon une des revendications 1 à 9.