CZ169393A3 - Peg interferon conjugates - Google Patents

Description

Vynález se tedy také'týká. nových aktivovaných sloučenin (činidel), která mohou být použita pro přípravu ínterferonových konjugátů podle předloženého vynálezu. Tyto sloučeniny mají následující obecný vzorec II

RO-(CH_OCHC)

O

ί je NH nebo O, x je sele číslo nezi 1 a 1000 a. každý 2 y a s je celé číslo od 0 do 1000 a součet x,.y a z je 3 až 1000, tou podmínkou, že je-li NH nebo je-li W C a j_e H, „ 1 ° í 4· alespoň jeden z Η , 3 , r a R je nižší alkyl,

RO-ÍCřLOHO) -ÍGH^CHO) -(CH„CHO) -CILCHO έ¹

Ήl·

0=0 (lil kde R je nižší alkyl, r\ R^, R^ a R^ jsou H nebo oiethyTj x je celé číslo od 1 do 1000 a každý z y a z. je celé číslo

-:·μψoď 0 do 1000 a součet x,y a 2 je 3 až 100C.

mů . v m >*i -wSpecifičtěji, vzorec Ti zahrnuje sloučeniny následu- ^:'^Μ' jících dvou typů:

RO-(OH_nCHO) -(OKOHO) -í0R_oCHC) -0H_o0 ή, ^;í \ ^y L ‘ ²| (ΤΤΛ)

R-

_o~H0) -CH-CH-O' | 2 2,

R³ R⁴

RO-ÍCH-CHC) -(CH-CKO) -ích 21 x š | y ol o2

Ve vzorcích IIA, 113 a III R, R¹, R², R³, R⁴, R⁵ mají výše uvedený význam a x, y a z. jsou vybrány z jakékoliv komoinsce čidel, takové, že polymer, .je-li konjugován k prov v teinu umožňuje proteinu podržet si alespoň Část úrovně jeho biologické aktivity, kterou má když není konjugován, s podmínkou uvedenou'výše'poď vzorcem II. ’.........

V souladu s tímto vynálezem, při použití aktivovaných PEG činidel vzorce IIA,.IIB nebo III pro výrobu konjugátů, se vytvoří spojovací vazba mezi volnými sminoskupinami v proteinu jako je interferon (IFN) a PEG tak, že výsledný konjugát si udržuje alespoň Část biologické aktivity proteinu se sníženou imunogenicitou. Bále, spojovací skupiny vytvořené v konjugátu podle tohoto vynálezu při použití jakéhokoliv z aktivovaných polyethylenglykolu vzorce IIA, 113 nebo III produkuje proteinový konjugát, který není snad no náchylný k in vivo hydrolvtickému štěpení a není prová-z.en-n.e-V-ýho-d-ami-_í_p2’sO-b.eiiý-mi· v PEG proteinovými! konjugátech podle známého stavu techniky.

JZ^Oul£d.u-^^tlm-tjo^JB.íQ.ález.em·. R-. R . R-.. R^J. R mohou být jakýkoliv nižší alkyl, výhodně methyl. Výraz niž: alkyl označuje -nižší alk-yiové- skupiny, obsahuj-ící 1 -až· 6. atomů uhlíku, jako je methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl atd. Obecně je výhodnou alkylovou skupinou nižší alkylová skupina, obsahující od 1 do 4 atomů uhlíku, kde nejvýhodnější je methyl. R¹ , R², R³, R⁴ a R^? mohou být také vodák, ale , rt , λa R^ nejsou současně vodík.

a z mohou být 77orán / souladu s tímto vynálezem z jakaxoliv kombinace čísel takové, že výsledný konjugát obsahuje alespoň část biologické aktivity IFN, který tvoří konjugát. Je zřejmé, že součet x,y a z ε m je v obráceném poměru k množství biologické aktivity IFN, která se udrží v konjugátu. Číselná hodnota x,y, a z představuje počet glykolovýoh jednotek v polyglykolu, které tvoří konjugát. Výraz m představuje počet volných nebo dostupných aminoskupin, obsažených v IFÍÍ, které mohou reagovat s aktivovanou ?3G srněsí. Vyšší hodnoty m a x,y ji z, vede k vyšší molekulové hmotnosti konjugátu. V souladu s tím jsou podle vynálezu x, y a z jakákoliv Čísla taková, še molekulová hmotnost konjugátu, bez hmotnosti proteinu, je mezi asi 300 až asi 30000 dalton. Výhodně pro IFN je m číslo od 1 do 3· Zvláště Výhodným provedením, je monoPEGylovaný konjugát, kde m je 1, *

Získaný za takových podmínek, še se ve vysokém výtěžku získá' IFN konjugát, složený z IFW, kde pou2e.jedna volná aminokyΛ selina reagovala s PEG činidlem, vzorce II-A nebo II-N nebo III. V souladu s výhodným provedením je m 1, x,.y a z jsou^f jakékoli číslo takové, že glakol, který tvoří konjugát má průměrnou molekulovou hmotnost od asi 300 do asi 30000 dalton, výhodně asi 1000 až asi 10000 dalton, zvláště výhodně asi 1000 až asi 5000 dalton. Ve zvláště výhodném provedení je molekulová hmotnost asi 2000 dalton.

·*ΐ čiře*.

λ'

Pokud se čísla x,y a číslo od 1 do 1000 a každé z týkají jednotek, je :< celé je celé Číslo od 0 do 1000 součet x,y a z je 3 £z 1000

Ve výhodném provedení konjugátu vzorce Ia a 13. jsou a y 5 až 500 a z je 0 az b. Ve zvláště výhodném provedení je použitým, glvkolem směs glykolu, kde mezi 10 rá 100, a z je 0. -ejvýhodnjéím je i.nterferonový a, kde/Ia je m 1, 1, y ne mezi ; az konjumát vzorce I o

'SOU O!;-,,

Ί q

Η, χ ae £í,i 1$, y je 23i 2 s 2 js 0. ιό to odpovídá průměrné molekulové hmp tnos ti' v P2G jednotce asi 1CC0 dalton.

2s účelem. odstrmíní jakýchkoliv pochybností, týkajících se počtů jednotek v PEG molekule je charakterizace polyethylonglykolového polymeru molekulovou hmotností preferována před uváděním čísel ε počtů samotných opakujících se jednotek (33U - šelf repesting units) v PEG polymeru pomocí x, ,y -a z. Tyto-hodnoty mohou být obtížní stanovitelné- vzhledem k potenciální nehomogenitě výchozích PEC- sloučenin, které jsou obvykle definovány svoji průměrnou molekulovou hmotností a ne počtem samotných opakujících se jednotek, které obsahují. Výchozí PEG sloučeniny různých molekulových hmotností mohou být připraveny metodami v oboru známými nebo mohou být získány od obchodních dodavatelů.

případě, že hodnoty x,y a z. získané stanovením molekulových hmotností nebo jak je uvedeno dodavatelem nejsou celá Čísla (což bude obecný případ), zaokrouhlují se tyto hodnoty“'nahorumebo^J“'dolů Obvyklým způsobem· pro určení - celýchčísel pro polymerni molekulu, která pravděpodobně tvoří hlavní část polymerni směsi* — · Jes-tl-i-že -činidlo jakéhokoliv- ze--vzo-rců-IIA,.-II«-3_ne.b.o.._..

111 reaguje s ΙΡΗΤΊζ^Ι'δΓ^-οΜηΙϊΰοβ^νίοττί^ζ-^’β’ύηη’ΛΓΟ’ΙηΌ’α-^ί^noskupinu, může být konjugát získán jako směs různých reakčních produktů IPK se směsmi PZG-reaktantu. Tyto reakční produkty se tvoří jako výsledek reakce PEG činidla s jednou nebe vise volnými aminoskupinami. Tyto jsou označeny m ve vzorci TA a 19. Například, jestliže IFN obsahuje tři volné aminoskupiny, může aktivovaný PEG resktant reagovat s jednou h Smincskupin, se dvěma z volných aminoskupin nebo se vše^ii třemi. ka tito situace snes obsahuje konjugovené reakční produkty vytvořená ve všech' třech případech. Protože různé konjugované reakční produkty v této směsí mají velice se lišící molekulové hmotnosti, závisející na hodnotě m, tj.1, 2 nebo 3, mohou být tyto'reakční produkty rozděleny obvyklými metodami jako je chromatografie. Pro stanovení zdali m a x.,y a z byly zvoleny správně, mohou být separované konjugované reakční produkty zkoušeny na biologickou aktivitu stejnými způsoby použitými pro zkoušky výchozího IPR pro stanovení, zda si konjugovaný reakční produkt ještě udržuj^:e- část biologické aktivity IFN použitého pro vytvoření konjugátu. V takovém případě se mohou hodnoty m a x,y a z upravit jakýmkoliv požadovaným způsobem pro poskytnutí požadované aktivity.

V souladu s výhodným provedením je m 1. Jestliže je nt 1, může být tento konjugát získán i když jsou přítomny dvě nebo více? volných aminoskupin. Aktivovaný FEG reaktant bude nejprve reagovat s jednou z volných aminoskupin obsažených v IPN. Regulací koncentrace- činidel jako je IPR a reakčních podmínek, v souladu se standardními metodami aminové kondenv zace je možno regulovat stupen pegylace volných aminoskupin obsažených v proteinu* V proteinech, obsahujících jednu nebo více volných aminoskupin, kde jedna z volných aminoskupin je reaktivnější než ostatní aminoskupiny, mohou být podmínky zvoleny tak, že protein reaguje s aktivovanou PPG sloučeninou za vzniku sloučeniny vzorce IA nebo 13, kde m je 1. Ostatní volné aminoskupiny, obsažené v aminokyselinách, které 'tvoří protein, mohou následně reagovat s ©EG kondenzační reakcí prováděnou dále nebo použitím jiných silnějších podmínek.

Τ9*Λ O. J i í

V předloženém popise a nárocích výraz?; intsríeron a označují všechny typy interíeronuCmolskuly s interíeronovou aktivitou), například X. /1 , .4» a txJ interfercn a všechny apříklad X , β , a txJ int<

-10podtypy těchto a hybridy nebo feron může být ročních zdrojů typů, jako je ř\ 1 , ¢( 2A, 23 nebo Q^20 chiméry různých typů a/nebo podtypů* Interjskéhokoliv původu a můžebýt získán z přítkáňových kultur nebo technikami rekombinantni

DNA, reetody přípravy a izolace přírodních nebo rekombinantních interferonů jsou v oboru dobře známé a jsou popsány, např* v patentových přihláškách č. EP 43S30, EP 211143, EP 140127, DE 302SS19, USP 4503035 a US? 44141 50.

Výhoda použití činidel vzorců IIA, 113 a III, kde alespoň jeden z R¹, R², íc\ ^4 nižší alkyl, zejména methylíalkyí-substituovaných-Činidel) spočívá -v neočekávaném zvýšení výtěžku konjugátu, tj. PEGylovaného proteinu, při použití alkyl substituovaných činidel ve srovnání' s odpovídajícími nesubstituovanými činidly, Alkylsubstituovaná činidla poskytují alespoň dvojnásobné množství konjugátů za stejnou reakční dobu v porovnání s odpovídajícími nesubstituovanými činidly při přípravě takových konjugátů.

Při podání pacientům pro'terapeutické účely by konjugáty vzorců IA a IA připravené z výše popsaných substituovaných činidel, měly mít neočekáně zvýšený poločas rozpadu in vivo v krevním proudu pacienta při porovnání s konjugátem vy'.....tvo reným- z Odpo víd a j í c ích nes uhs t i t uo váných 'činidel I I ^_kdý'ž in vivo poločas rozpadu je přímo úměrný molekulové hmotnosti konjugátu, konjugát vytvořený ze substituovaného činidla překvapivě bude mít jak delší poločas rozpadu tak vyšší molekulovou hmotnost proti konjugátu získanému z nesubstituovaného Činidla. Delší poločas rozpadu .terap.eutickéhc. činidla.v krev- . ním proudu pacienta poskytuje zvýšenou účinnost podání činidla pacientovi. HaDříklsd konjugáty vyrobené z alkylsubstituováných Činidel mohou být. podávány méně častěji a/nebo v nižších množstvích než konjugáty vyrobená z odpovídajících nesubstituovaných činidel. 2a účelem zvýšení účinnosti podání biolo-11gioky aktivních proteinových konjugátů s pólyethylenglykolem, byly použity zvýšené molekulové hmotnosti polyethylsnglykolu při tvorbě těchto proteinových konjugátů, Avšak biologická účinnost aktivního konjugovaného IFK se snižuje se zvyšováním molekulové hmotnosti. Avšak při použití konjugátů podle vynálezu získaných se substituovanými činidly, se účinnost podání zvyšuje, ve srovnání s použitím odpovídajícího í nesubstituovaného kcnjugátu s menším zvýšením molekulové hmotnosti.

V dalším provedení se předložený vynález také týká způsobů přípravy nových konjugátů.

Konjugáty vzorce I-A mohou být připraveny následovně·:

• v·

-12RO(CH₂CHO)_x

λ.

(CH_zCHO)_y— (CH₂(JHO)_z-CH2CHNH2 + R2 R³ r4

PEG-amirt

NH₂-protein v

RO-(CH₂CHO)_X

R¹ —(CHjCHO)— (CHjCHOJj-CHgCHNH #.........

- protein m

l-A

12“ 4 5 kde R, R , R , R-* a. R a R , m a x,y a. z mají výše uvedený význam s tou podmínkou, ze alespoň jekýkoiiv jeden nebo více ze substituentu R¹, R^, r\ aohou být nižší alkyl.

V této reakci se F2G-amin smísí se sloučeninou vzorce 17 v uhlovodíkovém nebo chlorovaném uhlovodíkovém rozpouštědle zs vzniku sloučeniny vzorce ÍIA. 'Sloučenina vzorce TIi může kondenzovat ve vodném prostředí s jednou nebo více volnými sminoskupinami za vzniku konjugátu vzorce IA. Reakce může být provedena za podmínek obvyklých pro kondenzaci aminů ve vodném prostředí. Obecně se reakce provádí ve standardním. vodmém tlumívém roztoku, majícím pH mezi 7 a 10 za vzniku konjugátu vzorce IA. Tatp reakce může poskytovat P2G proteinový konjugát o různých molekulových hmotnostech vzávislostí na počtu volných aminoskupin v proteinu a době reakce. P2G proteinové konjugáty mohou být pak rozděleny na své individuální složky obvyklými metodami jako je vysoce citlivá kapalinová chromatografie (HPLO) nebo gelové elektrof oréza. Eohou být použity· jakékoliv běžné podmínky pro ¹ dělení sloučenin podle molekulové hmotnosti' pomocí HPLC

nebo.	gel	ové
děnu	pod	le
bylo	zde	jí
	Tpw	ko
dajíc	1-f b n	re

konjugát vzorce 13 muže být připraven podle násle— 14— r5 /V

O <

II

CI-C-CI

OH

RCHCHjCHO)* i—(CH₂CHO)j- (CHjCHO^-CHjCHOH

Ř² R³ R<

PEG-alfcohol

LA/ÁJ

IV

R¹

RO-ťCHsCHOk

A, y°\ ňh (CH₂CHO)y (CH₂CHO)j-CH₂CH \^ζ | I i II

R² R³ r< o

-interferon l-B kde 3, R¹, H², R-¹, 3 uvedeny.

oodmínka jsou vyse

Sloučenina vzorce 17 se získá kondenzací fosg

2-hydroxypyridinem (substituovaným, je-li 3? = niž sa použití jakékoliv obvyklé metody pro. kondenzaci du kyseliny s alkoholem.

enu s čí alkyl) halogeniKondenzace PES alkoholu se sloučeninou vzorce 17 se provádí za použiti obvyklých podmínek pro kondenzaci alkoholu s karbonátem za vzniku sloučeniny vzorce II-3. Sloučenina vzorce II-3 se kondenzuje s proteinem přes jednu nebo více volných aminoskupin v proteinu za vzniku sloučeniny vzorce 1-3., Tato reakce se provádí způsobem popsaným pro kondenzaci sloučeniny vzorce IIA za vzniku kcnjugátu vzorce I-A. 7 závislosti na počtu volných aminoskupin obsažených v. proteinu, který reaguje se sloučeninou vzorce II-3, může být konjugát vzorce 1-3 vytvořen jako směs konjugátů, majících rozdílné molekulová hmotnosti. Tato konjugátová směs. může být. dělena způsoby popsanými již dříve v tomto popise.

Sloučenina vzorce 13 může být také připravena'za použití následujícího reakčního schéma:

RO-(CH2CHO^(CH₂CHOý(CH₂CHO)_z-CH₂CHO li J.3

R . R _ B . R — C=0 lil

NHz-interferon

	Γ” 0 — Ϊ RCHC^CHOJHCHaCHO^CHjCHOJrCHa CH- Ό ^NHA' & FPR*	—interferon l-B

-17kde R, R¹, R², R³, R⁴, R⁵, zde výše.

x a y mají definovaný význam reakčním schéma se PEC—alkohol kondenzuje se sloučeninou vzorce IV ze vzniku sloučeniny vzorce III. V této reakci se sloučenina vzorce 113 vytvoří jako meziprodukt, který reaguje se druhým mol PEG-alkoholu za vzniku sloučeniny vzorce.III. Při provedení této reakce je PEG-alkohol přítomen v alespoň 2 mol na mol sloučeniny vzorce IV. V tomto postupu může být použit, jakýkoliv obvyklý způsob pro kondenzaci alkoholu s karbonátem. Sloučenina vzorce III reaguje s interferonem za vzniku konjugátu vzorce 1-3 způsobem popsaným pro konverzi sloučeniny vzorce IIA na sloučeninu vzorce I A* V závislosti na množstvích volných aminoskupin obsazených v proteinu, kondenzace sloučeniny vzorce III s proteinem poskytuje směs. konjugátů, které mohou být rozděleny na své jednotlivé složky způsoby popsanými zde výše.· pro oddělení konjugátu vzorce IA.

V souladu s tímto vynálezem bylo zjištěno, že interfhranové konjugáty podle vynálezu mohou mít stejnou použitelnost' jako protein použitý pro tvorbu konjugátu. Proto jsou tyto konjugáty. terapeuticky aktivní stejným způsobem jako protein, ze kterého byly připraveny a mohou být použity jako protein samotný bez vzniku nežádoucích imunitních odezev, které mohou být spojeny s podáváním samotných proteinů subjek tům. Předložený vynález tak také tečk’ zahrnuje farmaceutické přípravky na bázi sloučenin vzorce I nebo jejich solí a způsoby jejich přípravy.

Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu použitá pro kontrolu nebo prevenci chorob obsahují iaterřeronoyý korjurat obecního vzorce I a tetracsuticky inertní, nntoxieký a terapeuticky přijatelný nosičový materi-áu Farmaceutické přípravky oro soužití výše uvedené mohou být připraveny o dávkovány způsoben, který je v souladu s lékařskou praxi <ΐ*3^*ίέ Οθρο V ÚVGílli Ti-0 nj. O li’'⁷' ΙΈ-βΓ’Θ 7 5 3 J IscSílYj stiiV ^θόΠΟΐϋ-·* vého pscianta, místo doručování proteinového kcnjugátu, způsob podávání a jiné faktory známé lékařům. .......

Následující příklady představují ilustrativní opovědění předloženého vynálezu, aniž by jej jakkoliv omezovaly»

V těchto příkladech, Jeffamine ÍÚ-2G70 je monomethoxypolyoxyalkylenpropylaminový polymer 's přůněrnou molekulovou hmotnosti 2070, odvozený od propylen s ethylenoxidu, který je složen z. polyethylenglvkolového řetězce a obsahuje průměrně.. 30% náhodně zabudovaných.. propylenoxidov,ých. skupin.. . _..

Jeffamin M—10-00 je.; monomethoxypolyslkyíenpropylaminový polymer s průměrnou molekulovou hmotností 1000, odvozený od propylen a ethylenoxidu, který je složen z polyethylenglykolového řetězce, obsahujícího. 14 % specificky zabudovaných propylenoxidových skupin, kde x je průměrně. 18,6, y má průměr 1,6 a z je 0 (x,y a 2 jsou zde použit;/ va stejném významu, jak byl uveden výše).

Všechna činidla popsaná v těchto příkladech mohou být uchovávána v dessikátcreoh z jantarového skla při 4 °G až ďó ' své spotřeby»' Pro 'každou modifikaci' oyly použ i ty Čerstvé^- ' oodílv.

Příkladv crcvedení wnálezu

Přiklaď 1

Příprava alfa,alfa-oxomethylen-bis/omega-methoxypoiy ioxyí,2-ethandiyl)/33u 111

Ze suspenze 1,5 -g UF2G ímethoxypoiyethylsngly,:ol ) (mol, hmotn. -oOCC) v 80 ml suchého toluenu se oddestiluje 50 ml rozpouštědla, uoztok se oak och_aci

- ”1 C P.

se p0,5 mg di-z-15pyridyiksrbonátu. výsledná ames se pak refluxuje po 24 hodin* LťOSLQK 3Θ Ό 9 0 il·!.'·? Ó. l· cí Vv’3±0Gná 3 GŽ PíliflP 3° CG 2. 3 promyje malým objemem toluenu a pak diethyletheru. Pevná látka se psk suší ve vysokém vakuu, získá se 0,ó g alía,slfaoxomethylen-bis(cmegs-nethoxypclyíoxy-1,2-ethsndiyl)SEU 111 jako bílého prášku. PSG-nodiíikovsný interferon se připraví způsobem 1 popsaným dále.

Příprava PSG-modifikcvaného interferonu-alfa

Způsob. 1: Rekombinantni interferon-alfa (5 mi proteinu ns ml) se dislyzuj.e proti pufru, obsahujícímu 5 mh octanu sodného, pH 5,0, 120 mil NaCl. Přidá se thiokysnát draselný do konečné koncentrace 0,5 Lí a pH se upraví přídavkem jedné desetiny objemu 111 trici-hydroxidu sodného, pK 11,9, získá se konečné pH roztoku 10,0. P3G činidlo se přidá k proteinu v molárním poměru 3:1 vztaženo na pevné látky nebo rozpuštěného v Z&I30 (objem 3230 oyl menší než 10 13 celkového objemu)►”bonifikace probíhala při teplotě místnosti po dobu 30 minut až 4 hodin s následujícím přídavkem 12 L-glycínu (ρ·Η δ, 3) na konečnou koncentraci 20 mm pro znemožnění další modifikace. PSG-modifikóvsný protein byl srážen přídavkem 3,5« síranu amonného, 50 m2 fosforečnanu sodného, pH 7,0 na konečnou koncentraci 1,1 b síranu amonného (1,0 b síranu amonného ns PEC—10000), sraženina se odddelí odstředěním, oromyje se a znovu se rozpustí ve 25 m.e octanu amonném, pH 5,0· PSG-modifikovsné oroteihv se čistí chrcmatcmrsfií na hycrofcbní výměnné koloně (n.?př. 75 x 7,5 mm) jako je BioRad T3K Phsnyl-5-Ρΐ

nebo moyopeari ťheny	1-5502, zs	použití grádi	entu	snížení sír
nu amonného v 50 mh	fosforečná.	o ij ' C 2 j £ W	Ύ »Λ· • y V A	hlternativn
:.e Ři-;tí	ornou filtr	“ΑΊ* ť*i '-i'1 ’ '> . - .λ _ ι_· . > -	<' p. r.	ácr.vlu 3- 20 C

.neon use χ 3,2 cm kolona) ovin ovanu '·’ - v-_n·.

’ - ......-- - / } u sodném ,rh 5,u),

noaony nu (PSG,-1PH) nebe dvě iPEG^-i?K) vazbu PPG, byi suojen, sahus1 x ftanove.o absorbancí oři 260 na-nebo kolo• PPG—xFl·; byl skladován ·ρ·ρΐ· rimetricucu zkouškou (Pierce) °G v nuřru, obsahujíoím 50 mlí fosforečnanu sošného, oH 7,0, 0,3 h síranu amonného.

Způsob 2: Interferon ok-2e v koncentraci proteinu přibližně o mg ns ml, byl dislyzovsn v 5 min octsnu sodném, pH 5,0,

0,12 »'chlorid sodný. Koncentrace proteinu byla stanovena měřením absorbsnce při 260 nm za použití 1,0 mg *ml jako extinkoního koeficientu. Roztok proteinu byl smísen s modifikačním činidlem v molárním poměru 1:3 proteiničinidlo. modifikační reakce byla iniciována úpravou pH na 10,0 za použití jedné desetiny objemu 0,1M I^R^Oy-NaGH, pH 10,7. ?o inkubaci pří teplotě místnosti po jednu hodinu bvls reakce ukončena přídavkem, jedné dvacetiny objemu 1 U glycinu, pH 7,5. Po 3-5 minutách bylo pH sníženo na 5,0-6,0 přídavkem jedné dvacetiny objemu 1 ží octanu sodného, pH 4,0.

..... Roztok,^-Obsahují-cí 'FEG-interferon, rušící činidlo·· a nerno difikovaný interferon byl zředěn čtyřnásobně 40 mOi octanem amonným, pH 4,5 a umístěn do CM-celulosové kolony OYhatmanK Gíl-52, přibližně 0,5 ml pryskyřice na mg proteinu). Po.promy-tí -kolony-5'objemy 4Ό· m-M-.-octanu -sm-on-n-éfe©·, -p-H-4-,-5~by-l-?-SG-interferon a nemodifikovsný^iTTterferon eluovsn za použTťí^-11= neárního gradientu ch nu amonném, pH 4,5. Prskce, obsahu;

neárního gradientu chloridu sodného (0-0,5 lě) ve 40 mú octaí orotein byly identifikovány abso-r bsneí při 260 nm a PSG-interferon · oSšahujícf frakce byly identifikovány pomocí SD3-?7GZ.

?E!G“ I. Ω v ? PÍG P Oxl q ό ]_ θ OVOU i JL * Γ 30 ΩΣ C hr Οίΐί tografií dělící podle velikosti,na koloně, K3).

kdnnrnaoin 2 lony byly analyzovány pomocí 333-Ρ73Ξ a píky bujícího, PSG-interferon, oyly spojeny.

T. S t & L o m ř 1' ' *· » obsahující Gopha*Ϊ n C —

Příklad 2

Příprava alfa, alfa-oxc.nethyien-bis/oT.ega-nethcxyoolyKOxy—

1,2-ethandiyl/SRU 22,5

Postupem popsaným v příkladu 1 ss MPEG (mol.hmotn. 1300) převede na alfa,alfa-oxomsthylen-bis/omega-methoxypoly(oxy1 , 2-ethnnni.yl)33U 28,5 a ?EG_Tmodifikovaný interferon se připraví zs použití tohoto činidla způsobem 1 popsaným v příkladu 1₀

Příklad 3

Příprava alf a-methyl-oaega-/2-//(2-p.yridinyloxy )karbonyl/oxy/ethoxy/-póly-(oxy-1,2-ethsndiyl)3PU 111,7

Z roztoku 1 g MPEG molekulové hmotnosti pOOO rozpuštěného ve 50 ml suchého CH^Ol^ se oddestiluje 10 ml rozpouštědla. Roztok se ochladí ns teplotu místnosti a přidá se 152 mg (0,6 mM) di-2-p.vridyl-karbonátu a 4 Eg DMA?. Výsledný roztok se pak míchá 14 hodin a rozpouštědlo se odstraní za vakua. Zbytek se trituruje s diethyletherem a výsledná sraženina se odfiltruje. Produkt se pak rozpustí v 7 ml suchého glymu, ohřeje pro vyvolání rozpuštění a výsledný roztek se nechá zchladnout a stát při teplotě místnosti po něxciik hoše pak odfiltruje a promyje se 2 x 5 látka se pak suší ve vakuové sušárně a pod proudem dusíku. Získá se 0,7 g alfa-/(2-pyridinyloxy)kerbonyl/omega-methoxyp.oly Íoxy-1 ,2-ethandiyi )3RG 111,7· Elementární analýza oro ΰ din. Výsledná sraženina mi suchého slymu. Pevná '9*Ί vvpoc ϊ 4- no ?4,57 3 C, 9,02 1 ; p 'ι-J f. j i‘^x4 2^<J1*2^V 111,7' ·-’ ~ 23 G Ϊ n eron iraven z použití minia znuscoem

D -j U O -ix.V ac u

Příklad 4

Příprava alfa- (2-pyridinyloxy)ke.rbonyl/ouega-aethexypoly (oxy· 1,2-ethandiyl)SRU 225

Postupem poosanýa v příkladu 3 se KPEG molekulové hmotnosti lOCCO převede ns alfa-/(2-pyridinyloxy)ksrbonyl/oaegaaethoxypoly ícx.y-1,2-ethsndiyl), 33’J 225·

Elementární analýza pro G^H^NO^lCI^GH^O)225¹ vypočteno 54,54 % 0, 9,08 % H, 0,14 % N nalezeno 54,54 % 'C, 9,12 ja H, 0,11’^ N. - ..........PEC—modifikovaný interferon byl připraven sa použití tohoto činidla způsobem 1 popsaným v příkladu 1.

Přiklad 5

Příprava alfa-methyl-oaega-/2-/2-//2-pyridinyloxy )karbonyl/oxy/-p r op oxy/propoxy/póly(oxy-ΐ,2-ethandiy 1)33U 54,7

Z roztoku 0,5 g alfa-2-/2-íhydroxypropoxyJpropylAomega methoxypóly(oxy-1,2-ethandiyl)33U 54,7 ve 40 ml suchého GH^Gl·^ se oddestilujeΪ5 al rozpčuštěaTa7~K' r oz'ťokú^_ se’’p’ak— přidá 108 ag di-2-pyridylksrbcnátu, 4 ag EMA? s několik kuli Sek 4A molekulového síta. Směs se pak míchá přes noc, filfeáfl a rozpouštědlo se pak, odstraní za sníš ené ho tl aku. z by tek se čistí způsobem, chromatografie vylučující podue velikosti:

OLO iidlo odpovídá z o rc s IE 3- 1 i

CH(0H_o0H_o0) OH-HCCH.CH

(113-1 i-Eu-modii iKovany interferon byl tohoto činidla způsobem 1 popsaným v kde n je asi 64.

připraven zs použití, příkladu 1.

Příklad 6

Pří ρ r av a al f a- me t hy 1 - o me g a- /2- /2- // (2 - py r i d i ny 1 o xy) k ar bo ny 1/oxy/propoxy/propoxy/polyíoxy-í,2-ethandiyl)3RU 110

Postupem popsaným, v příkladu 5 byl alf a-2-/2-(hydroxypropoxy )propyl/-03iega-aiethoxypoly (oxy_1 ·, 2-ethendiyl )SRU 110, převeden, na alfa-nethyl-onegs-/2-/2-//(2-pyřidinyloxyJkarbonyl/oxy/propoxy/propoxy/poly(oxy-1, 2-ethandiyl)3RU 110·.

Toto činidlo (113-2)oápovídá činidlu popsanému v příkladu 5 (II3-1) s tím rozdílem, že n je asi 110, oož odpovídá asi 5000 dalton.

PEG modifikovaný interferon byl připraven zn použití tohoto činidla způsobem 1 popsaným v příkladu 1· ed 7

Rřírrsva polymeru rcexhyloxiran- oxiran .-vr Λν*7 k*·η λ.·' Λ’’ 1 /r 7« 7 Γ· /ργΠ·*>’·' Ť ? Ί ’ ř I ptppr*

I 1 v ta’ Λ : χ Js/ i i , J. / ·... . X - . O f \ S L ---.i 'j « . * _r X/2-// .2-oyrid.

z roztoku 1 g Jeff aminu i-2070 (Texaco Jnemical -->o. j ve

-S4“ ml suchého GH„G1_? se oddestiluje 15 ml rozpouštědla. Roztok se ochladí as 0 °C a přidá se 215 mg oi-2-pyrictylkarQ bonátu. Výsledný roztok se míchá delší 4 hodiny při 0 'G, ‘ Dotom se rozpouštědlo odstraní zs sníženého tisku, zbytek \y . r t r\ α 1 (T; 0 H odle velikosti, sporuhy se osk čistí pomoci dvou koxon, pěných ζε sebou (50 Ά ε 1000 9l). Produkt vykazuje dva v UV oři 232 nm ε 310 nm.

Toto činidlo odpovídá sloučenině' vzorce ΐϊ A-1

CH₃OCK₂Ctí₂C (CKgCHC) _a-CH₂GH. - NH * ?

IT

I

GH-

(II A-1 )

Λ kde 3? je H, 3r je H nebo methyl a jako průměrná distribuce , -,2 rje n. 32 je-li. Η H a n je 10 je-li H methyl.

P2G»aodifikcvsaý interferon se připraví použitím tohoto činidla způsobem 2 popsaným v příkladu 1«

Příklad-8................. - ------ -------------— — ------------------Příprava polymeru methyloxiran -oxiran - /2-//(3-methyl2-pvridinyloxy) kar bonyl/am ino/pr opylme thy 1 ether U.O/O= 10/32)

Postupem popsaným v příkladu 7 reaguje 1 --2070 s bis i3-methyl-2-pyriáyl)ksrbonáten za vzniku polymerní

Jeffaminu methyloxiran - oxiran /2·//( 3-mathyl-2-oyridinyl>xy i ksroonvl/ =mino/orcoyj.metrivi&tner : Γ· 'Ά—. * ·*· / · ·· \ i ...Lv L— 1 u / j s J s ^z'-i rs-i.. ;‘tt λ i \ ! ; . b_ A -L í tL. li ί (XX *r i ;

Toto činidlo iΙΤή-2)cdpovídá činidlu z , - ,.· , „ V) ,·

O ul i.ί 1? J £ G j.. _h tý lji j 2 v a ,J ý -j-1 j *

-25P2G—modif inc v ·,ην inti-rn'; tolioto íinidla znisobev 1 cc

-řínrava polymeru methyloxiran jyriGiayloxy)karbonyl/amine/propyl S,6) rnnrvvon z' cl·· <- -mA.

- oxiran - , /2-//(2Aethyletheru (TO/O 1,5/ .Postupem popsaným v příkladu 7 reaguje 0,6 g Jeffamini il-ICOO (Texaco Chemical Co.) se 155,5 mg di-2-pyridylkarbonátu ze vzniku polymeru methyloxiran - oxiran - /2-//(2pyridinyloxy )karbonyl/amino/propylmethylether , blok (&C/C² 1,5/18,6). ^v

Ten poskytuje sloučeninu vzoroe IIA-3 o

fl c

CH,0(CH„CH_o0)_1P HCH-OHO). .CHHH- N·^ \0 3 < 2 1S,0 z₍ 1,0 2 X.T

(IIA-3) ‘3 ^Vi‘3 mající uvedenou průměrnou distribuci jednotek polymerního produktu.

P2G-módiTikovaný interfsron se připraví za použití tohoto činidla způsobem 1 popsaným v přikladu 1.

Antivirová účinnost interferonu: Antivirová účinnost interfsronu a PEG-modifikcvnného interferonu se stanoví (Ruben; a spol., (l?21)J.7irol.37:755- 755; Panillotti a svol.,(1951) p +* H n q ι',η -τ ί r q 1 '75* · v fk ?_ 9} C «I 'j ;7 55 o i ** č'· '“p ’ ·? Ir- Γ~· lý ‘‘•V ' H v A ;y nr*. _w

Τ’ Π '/A γ 7 b Ί íi c — τ -Γ <c '·^Γ 3 O j o ΊΟ V 7 ' c'; ú O ji 'Zit· 7 νο zkoušce η croteinu.

Speciíl;

aktivitu 2 z 1Ο~ jednotek as mg

Podmínky 20 už i té oro modifikaci interfe^o^u b··¹'/ založeny na optimalizovaných protokolech jak je popsáno. PEC-modifikace byla analyzována pomocí SD3-PAS2 ne konverzi interferonu na .mcncPEG-interferon v různých česech inkubace (chemií ké reaktivity) a as distribuci různých druhů PSG-interferonových konjugátů í místní selektivita). 7 3D3-PX-E byly PSCmodifikované druhy pozorovány jako slaběji migrující pruhy na gelu. Oba interíerony, jak monoPSG i diPEG byly získány v. dostatečném výtěžku tak, že tyto druhy .mohly být..vyčištěny, z reakčních směsí hydrofobní interakční chromatografií. Čištěné PEG-interíerony byly testovány na antivirovou aktivitu a porovnány s nemodifikovanými interferon-a2a standardy.

Molekulové hmotnosti použitých polymerů i jejich antivirová aktivita u jejich pegylovaných derivátů' jsou uvedeny v tabulce I.

Tabulka 1 ' .......

Fyzikální vlastnosti PEG činidel a biologické aktivit?/ jeich proteinových konjugátů

CJ.

Sloučenina			antivi	rová aktiv
z		1'Í.LLí 0 M _-L £	Í7.	kontroly)
J- / 5 “l < í 1 *		oolvmeru	mcncPEG	r' 7 ”
J 3 *t		10000	25	ř*» X
......3. .		7 vA v	40	....... . , 4.
1		5000	40	: v T\ í> JJ
ó		5000	40	FD
				· *1-.
5		3 0 0 0	Ol
7		20 70	~r >	FD
2		1 -< -Λ Λ i JL» w	70	ND
5		ί V	1 v ϋ	40

;= n« vano i

1.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ Ν 1 R O K Y

   Interferohový konjugát obecného vzorce I

   Γ I , ! RO- {CHgCHO )_χ” (CI^CHO )^- (CH^CHO) _z-CH2CH-W^x^^x^NH - —interferon

   R^J

   Η^Ί kde R je nižáí alkyl, R¹, R², R³ a R⁴ jsou H nebo hižší alkyl, a je vybráno z; celých čísel 1 až do počtu dostupných aminoskupin v interferonu,

   W je O nebo NH, h

   x je celé číslo mezi 1 a 1000 a každý y a z je celé číslo od O do 1000 a součet x,y a z je 2 až 1000, s tou podmínkou, že alespoň jeden z R^ alkyl.

   R², R³ tí⁴ je^iiiáí
2. 2. Interferonový konjugát podle nároku 1, kde x,y a z jsou vybrány tak, že molekulová hmotnost polymerní jednotky v konjugátu. je v rozsahu od asi 300 dalton do asi 30000 dalton.

   Interferonový konjugát podle nároku 1, kde m je-1.

   4.

   Interferonový konjugát podle nároku 1, kde R je methyl·
3. 5· Interferonový konjugát podle nároku 2, kde x,y a z jsou vybrány tak, že molekulová hmotnost polymerní jednotky v konjugátu je v rozsahu od asi 1000 dalton do asi 5000 dalton·

   -28€·♦ Interferonový konjugát podle nároku 2, kde x,y a z jsou vybrány tak, že molekulová hmotnost polymerní jednotky v konjugátu je v rozsahu od asi 1000 do 2000 dalton.
4. 7· Interferonový konjugát podle nároku 1, kde x a y jsou 5,0 až 500,0 a z je 0,0 až 4,0.
5. 8. Interferonový konjugát podle nároku 1, kde x je 10,0 až 100,0, y je 1,0 až 10,0 a z Je 0.
6. 9o Interferonový konjugát podle nároku 1, kde interferonemje interferoa Λ2Α.
7. 10. Interferonový konjugát podle nároku 9, kde W je NH, a je 1, Η,Η² a R* jsou CH^, R¹ je H, x je 18,6, y je 1,6 a z je 0.
8. 11. Sloučenina obecného vzorce II (II) kde R je nižší alkyl, R¹, R^, r\ R^ a R^ jeou H nebo nižší alkyl, ' —' —.....” ' ' ' ' ' -'W je NH nebo O, x je celé číslo mezi 1 a 1000 a každý z y a z je celé čí šlo od 0 do 1000 a součet x,y a z je 3 až 1000, s

   z tou podmínkou, že je-li W NH nebo je-li lí O a je H alespoň jeden z R¹, R², R^ a S⁴ je nižší alkyl.

   -2912. Sloučenina podle nároku 11, kde x.,y a z. jsou zvoleny ták, Že molekulová hmotnost uvedené sloučeniny je v rozmezí oď asi 300 dalton až asi 30000 dalton.
9. 13* Sloučenina podle nároku 11, kde £ je methyl.
10. 14. Sloučenina podle nároku 13, kde x je 10,0 až 100,0, y je 1,0 až 10,0 a z je 0,0 až 4,0.
11. 15. Sloučenina obecného vzorce III kde E. je nižší alkyl, R¹, E², E³ a E⁴ jsou H. nebo methyl, x je celé číslo od 1 do 1000 a každý z y a z je celé číslo od 0 ďo 1000 a součet-x,y až je 3 až 1000.
12. 16. Sloučenina podle nároku 15, kde x,y a z jsou vybrány tak, že molekulové hmotnost uvedené sloučeniny je v rozsahu od asi 300- dalton do asi 30000 dalton.

    w 1
13. 17. Sloučenina podle nároku 15, kde alespoň oeden z Ε , E², fi³ a E⁴ je nižší alkyl.
14. 18. Sloučenina podle nároku 15, kde R je methyl.
15. 19. Interferonová konjugáty podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 pro použití jako terapeuticky účinná sloučeniny při léčbě nebo profylaxi chorob.
16. 20. Způsob přípravy interferonového konjugátu podle které hokoliv z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že. zahrnuje reakci sloučeniny podle nároků 11 až 18 3 interferonem nebo jeho solí a izolaci interferonového konjugátu z reakční směsi.

    . Farmaceutická příoravky, vyznačující se tím, že obsahují interferonový konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 a terapeuticky 'přijatelný inertní nosič.
17. 22. Farmaceutické přípravky pro léčení nebo profylaxi imunomodulačních chorob jako jsou neoplastické choroby nebo infekční choroby, vyznačující se tím, že obsahují interferonový konjugát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10a terapeuticky inertní nosič.
18. 23. ,... Použití interferonových konjugátů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 pro výrobu léčiv pro použití při léčení nebo profylaxi chorob.

    i : ’J4“ /