CZ238592A3

CZ238592A3 - Imidazolinone resistant ahas mutants

Info

Publication number: CZ238592A3
Application number: CS922385A
Authority: CZ
Inventors: Gabriele Elfriede Dietrich
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-30
Publication date: 1994-03-16
Also published as: BR9202950A; FI923444L; AU4335296A; HU9202485D0; IE922504A1; ZA925734B; CA2074854A1; AU2069492A; PT525384E; CA2074854C; KR100243996B1; FI114922B; FI923444A0; US5767361A; EP0525384A3; JPH05227964A; HUT65483A; MX9204420A; HU218108B; JP3523657B2

Description

(57) Geny jednoděložných rostlin, které kódují mutantní enzym AHAS vykazující specifickou rezistenci vůči imidazolinonovým herbicidům. Jako příklad těchto genů je možno uvést sekvence DNA kukuřice, které kódují substituci aminokyseliny v poloze 621 enzymu AHAS divokého typu. Mutantního genu se může použít pro transformaci jiných rostlin, za účelem dosažení rezistence vůči herbicidům. Řešení se také týká hostitelských buněk a vektorů obsahujících tento gen, kteréžto buňky a vektory jsou užitečné při transformačních postupech.

.- i Μ

Oblast techniky

Vynález se týká nových sekvencí DNA, které kódují nové variantní formy enzymu acetohydroxykyselina syntázy (dále AHAS). Enzym AHAS je kritickým enzymem, který je rutinně produkován v různých rostlinách a širokém rozsahu mikroorganismů. Normální funkce AHAS je inhibována imidazolinonovými herbicidy. Nové enzymy AHAS, kódované mutantními sekvencemi DNA však působí normálním katalytickým účinkem i za přítomnosti imidazolinonových herbicidů a v důsledku toho dodávají rostlinám nebo mikroorganismům, které je obsahují, rezistenci vůči tomuto herbicidu.

Nové sekvence DNA jsou odvozeny z kukuřice a obsahují v poloze 621 normální sekvence AHAS substituci aminokyseliny. Tato substituce v sekvenci genu AHAS má za následek vznik plně funkčního enzymu, ale činí enzym specificky rezistentním vůči ihibici různými imidazolinonovými herbicidy. Dostupnost těchto variantních sekvencí poskytuje prostředek pro transformaci různých plodin za účelem dosažení rezistence vůči imidazolinonovým herbicidům a kromě toho, poskytuje nové selektovatelné markéry pro použití v jiných typech experimentů genetické transformace.

Dosavadní stav techniky

Použití herbicidů v zemědělství je v současné době velmi rozšířeno. Ačkoliv existuje značný počet sloučenin, které účinné ničí plevel, ne všechny herbicidy jsou schopny se selektivně zaměřit na nežádoucí rostliny, ve srovnání s plodinami a zároveň být netoxické vůči zvířatům, často je zapotřebí se rozhodnout pro sloučeniny, které jsou jednoduše méně toxické vůči plodinám než vůči pleveli. Aby byly tyto obtíže odstraněny, zaměřil se zemědělský výzkum intenzivně na vývoj plodin, které jsou rezistentní vůči herbicidům.

Důležitým aspektem vývoje herbicidní rezistence je porozumění, na jaký cíl herbicid působí, po němž následuje manipulace postižené biochemické dráhy v plodinové rostlině tak, aby se bylo možno vyhnout inhibičnímu účinku, za současného zachování normální biologické funkce rostliny. Jeden z prvních objevů biologického mechanizmu herbicidů se týkal série strukturně nepodobných herbicidních sloučenin, t.j. imidazolinonů, sulf ony lmočovin . a triazolopyrimidinů. Nyní je známo ( Shaner a další, Plant Physiol. 76: str. 545 až 546, 1984; US patent č. 4 761 373), že všechny tyto herbicidy inhibují růst rostlin tím, že interferují s esenciálním enzymem, který je důležitý pro růst rostlin, acetohydroxykyselina syntázou (AHAS; stejný enzym bývá někdy označován termínem acetolacetát syntáza či ALS). AHAS je důležitý pro syntézu aminokyselin isoleucinu, leucinu a valinu.

Je známo, že enzym AHAS je přítomný ve vyšších rostlinách a zároveň byl zjištěn v různých mikroorganismech, jako jsou kvasinky Saccharomyces cerevisiae a enterických bakteriích Escherichia coli a Salmonella tiphimurium. Byl také dobře charakterizován genetický základ produkce normálního AHAS v mnohých z těchto druhů. Tak například, jak v E. coli, tak v S. typhimurium existují tři isosymy AHAS, přičemž dva z nich jsou citlivé vůči herbicidům, zatímco třetí nikoliv. Každý z těchto isosimů obsahuje jednu velkou a jednu malou podjednotku proteinu a mapováním jsou zařazeny do operonů ILvIH, IlvGM a IlvBN. V kvasinkách byl jediný isosym AHAS mapován do místa ILV2. V každém případě byly identifikovány senzitivní a rezistentní formy a byly stanoveny sekvence různých alel (Friden a další., Nucl. Acid Res. 13: 3979-3993, 1985; Lawther a další., PNAS USA 78: 922-928, 1982; Squires a další., Nucl. Acids Res 811: 5299-5313, 1983; Wek a další; Nucl. Acids Res 13: 4011-4027, 1985; Falco a Dumas, Genetics 109, 21-35, 985; Falco a další Nucl. Acids Res 13; 4011-4027,.1985).

V tabáku je funkce AHAS kódována dvěma nepřipojenými geny SuRA a SuRB. Tyto dva geny jsou v podstatě identické, jak na úrovni nukelotidů, tak na úrovni aminokyselin maturovaného proteinu, ačkoliv se N-terminální, předpokládáná transitní oblast odlišuje podstatněji (Lee a další, EMBO J. 7 : str. 1241 - 1248, 1988). Arabidopsis na druhé straně obsahuje jediný gen AHAS, který byl také úplně sekvenován (Mazur a další, Plant Physiol. 85: 1110 - 1117, 1987). Porovnání sekvencí genů AHAS ve vyšších rostlinách ukazuje na vysoký stupeň konzervace určitých oblastí této sekvence. Konkrétně existuje přinejmenším 10 oblastí konzervace sekvence. Nedávno se předpokládalo, že tyto konzervované oblasti jsou kritické, pokud se týče funkce enzymu a že zachování této funkce je závislé na podstatné konzervaci sekvence.

Nedávno bylo oznámeno (US patent č. 5 013 659), že mutanty , vykazující herbicidní rezistenci, obsahují mutace v alespoň jedné aminokyselině v jedné nebo více těchto konzervovaných oblastí. Zejména se zjistilo, že substituce určité aminokyseliny za aminokyselinu divokého typu v těchto specifických místech proteinové sekvence AHAS je tolerována a skutečně se projevuje dosažením herbicidní rezistence rostliny, která takovou mutaci obsahuje, při zachování katalytické funkce ezymu. Popsané mutace kódují bud křížovou rezistenci vůči imidazolinonům a sulfonylmočovinám nebo specifickou rezistenci vůči sulfonylmočovinám, nebyly však zveřejněny mutace, které by byly specifické pro imidazolinony. Bylo prokázáno, že k takovým mutacím dochází u tabáku jak na místě SuRA, tak na místě SuRB. Podobné mutace byly také izolovány u Arabidopsis a kvasinek.

Imidazolinon-specifická rezistence byla oznámena u mnoha různých rostlin v jiných pramenech. V US patentu č. 4 761 373 byl obecně popsán modifikovaný AHAS, jakožto základ herbicidní rezistence rostlin a konkrétně zde jsou uvedeny určité imidazolinon-rezistentní linie kukuřice. Haughn a další (Mol.Gen. Genet. 211 : 266 - 271, 1988) oznámili přítomnost podobného fenotypu v Arabidopsis. Sathasivan a další ( Nucl. Acid Res. 18: 2 188, 1990) zjistili, že imidazolinon-specifická rezistence u Arabidopsis je založena na mutaci v poloze 653 normální sekvence AHAS. Nyní byl v souvislosti s tímto vynálezem izolován gen kódující imidazolinon-specifickou rezistenci u jednoděložných rostlin a bylo zjištěno, že je založen na substituci jediné aminokyseliny v sekvenci aminokyselin AHAS divokého typu jednoděložných rostlin.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou nové sekvence nukleových kyselin, kódující funkční enzymy AHAS jednoděložných rostlin, které jsou necitlivé vůči imidazolinonovým herbicidům. Tyto sekvence obsahují mutaci v kodonu, který kóduje aminokyselinu serin v poloze 621 sekvence AHAS kukuřice nebo v odpovídající poloze sekvencí jiných monokotyledonů. Je známo, že jiné monokotyledony, jako je pšenice, také vykazují imidazolinon-specifické mutace (například ATCC č. 40994 - 97). U kukuřice obsahuje tato sekvence divokého typu v této poloze serin. V přednostním provedení tohoto vynálezu je serin nahrazen asparaginem, nicméně však existují i alternativní možnosti substituce šeřinu kyselinou aspartovou, kyselinou glutamovou, glutaminem a tryptofanem. Nárokované sekvence jsou sice původně odvozeny z monokotyledonů, jsou však užitečné i při způsobech produkce imidazolinon-rezistentních buněk rostlin jakéhokoliv typu. Při těchto metodách se buňka cílové rostliny transformuje jednou nebo více pozměněnými sekvencemi podle vynálezu. Alternativně se pro vytvoření mutantů v buňkách rostlin nebo semenech, obsahu jících sekvenci nukleových kyselin, kódující imidazolinonnecitlivý AHAS, používá mutageneze. V případě mutantních buněk rostlin izolovaných z tkáňové kultury, se pak regenerují rostliny, které obsahují charakteristický znak rezistence nebo necitlivosti (insenzitivity) vůči imidazolinonům. Do rozsahu vynálezu spadají také buňky rostlin, bakteriální buňky, houbové buňky, buněčné tkáňové kultury, dospělé rostliny a semena rostlin, které obsahují mutantní sekvenci nukleových kyselin a které exprimují funkční imidazolinon-rezistentní enzymy AHAS.

Dostupnost těchto nových herbicidně rezistentních rostlin umožňuje vyvinout nové metody pěstování plodin za přítomnosti imidazolinonů. Místo toho, aby se pěstovaly nerezistentní rostliny, mohou se pole osít rezistentními rostlinami zísaknými mutací nebo transformací mutantními sekvencemi podle tohoto vynálezu, načež se pole obvyklým způsobem ošetří imidazolinony, aniž by došlo k poškození plodiny.

Mutantní nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu také poskytují nové selektovatelné markéry pro použití při transformačních experimentech. Sekvence nukleových kyselin, která kóduje rezistentní AHAS, se připojí k druhému genu před transferem do hostitelské buňky a celý konstrukt se transformuje do hostitele. Předpokládané transformované buňky se potom nechají růst v kultuře za přítomnosti inhibičních množství herbicidu. U buněk, které přežijí, existuje vysoká pravděpodobnost, že došlo k úspěšnému zabudování požadovaného druhého genu. Alternativně se může postupovat tak, že se gen rezistentního AHAS ko-transformuje na nezávislém plasmidú s požadovaným genem,přičemž přibližně u 50 % všech transformantů je možno očekávat, že získaly oba geny.

Následuje vysvětlení některých pojmů, kterých se používá v tomto popisu a v nárocích. Pod pojmem funkční nebo normální enzym AHAS se rozumí enzym AHAS, který je schopen katalýzovat první supeň syntetické dráhy vedoucí k esenciálním aminokyselinám isoleucinu, leucinu a valinu. Pod pojmem sekvence AHAS divokého typu se rozumí sekvence, která je přítomná v imidazolinon-senzitivním členu daného druhu. Pod pojmem rezistentní rostlina se rozumí rostlina, která produkuje mutantní, ale funkční enzym AHAS a která je schopna dosáhnout zralosti při růstu za přítomnosti imidazolinonů o koncentraci, která normálně vykazuje inhibiční účinek. Poj6 mu rezistentní se v souvislosti s rostlinami používá v tomto popisu také ve významu tolerantní, t.j. jedná se o rostliny, které fenotypicky vykazují nepříznivé, ale nikoliv lethální reakce vůči imidazolinonům.

i

Přehled obrázků na výkrese

Na obr. 1 je uveden graf závislosti aktivity enzymu

AHAS u desetidenních semenáčků kukuřice ( kukuřice linie (R)

A619 nebo XI12) ne koncentraci imazethapyru (Pursuit A) /TS J nebo chlorsulfuronu (Oust B) . Aktivita herbicidnš rezistentního AHAS se vypočítá jako procentický podíl aktivity AHAS za nepřítomnosti inhibitoru. Směrodatná odchylka při těchto pokusech činí 10 %.

Na obr. 2 je znázorněna Southernova analýza genomových klonů ve fágu EMBL3. Fágy 12-1A (z W22), 12-7A, 18-8A, 12-11 a 12-17A (z XI12) se štěpí Xbal nebo Sall, provede se separace na 1% agarózovém gelu, přenos na nitrocelulózu a hybridizace s cDNA fragmentem AHAS, jako nukleotidovou sondou.

Na obr. 3 je uvedena Southernova analýza genomové DNA z linií kukuřice XX12, XA17, QJ22, A188 a B73. DNA se vyštěpí Xbal, separuje na 1% agarózovém gelu, přenese na nitrocelulózu a hybridizuje s cDNA fragmentem AHAS, jako nukleotidovou sondou.

Na obr. 4 je znázorněna restrikční mapa plazmidu pCD8A. Gen mutantního AHAS z XI12 se subklonuje jako 8kb fragment Pstl do vektoru pKS(+). Umístění a orientace genu AHAS je znázorněna šipkou. Restrikční místa Pstl, Xhol, HindlII, Xbal a Clal jsou označena symboly.

Na obr. 5 je znázorněn gel pro sekvenování nukleotidů s nekódujícím vláknem (A) a se sekvencí dvouvláknové DNA (B) klonů AHAS W22/4-4, B73/10-4 a XI12/8A v oblasti aminokyselin 614 až 633. Umístění přechodu cytosin-thymidin je označeno šipkou.

Na obr. 6 jsou uvedeny nukleotidové a dedukované aminokyselinové sekvence mutantního genu AHAS XI12/8A.

Na obr. 7 je uvedeno seřazení sekvence nukleotidů genů XII12/8A, B73/7-4 a W22/1A ais 2. Znakem (^x) je označena základní změna způsobující mutaci v poloze 621, znakem (=$=) jsou označeny změny ve srovnání se sekvencí B73/7-4 a znakem O) jsou označeny tiché změny.

Na obr. 8 je uvedeno seřazení sekvencí aminokyselin genů XI12/BA, B73/7-4 a W22/1A ais 2. Znakem (^x) je označena základní změna způsobující mutaci v poloze 621, znakem (ψ) jsou označeny změny ve srovnání se sekvencí B73/7-4 a znakem (>) jsou označeny tiché změny.

Gen podle tohoto vynálezu je izolovatelný z kukuřice linie XI12 (semena jsou uložena v Americké sbírce typových kultur /American Type Culture Collection - ATCC/ pod přírůstkovým číslem 75 051 ). Tento gen se vloží do plasmidů pXI12/8A (uloženého ve sbírce ATCC pod přírůstkovým, číslem 68 643) .

Tento gen je také izolovatelný z jakéhokoliv jiného imidazolinon-specifického herbicidně rezistentního mutantu, jako je kukuřice line QJ22 (uložená ve sbírce ATCC pod přírůstkovým číslem 40 129) nebo různých rostlin pšenice (semena uložena ve sbírce ATCC pod čísly 40 994, 40 995, 40 996 a 40 997). Vytvoří se knihovna genomové DNA, například ve fágu EMBL-3 s DNA z jednoho imidazolinon-rezistentního mutantu, přednostně takového, který je homozygní, pokud se týče charakteristického znaku rezistence a provede se skríning se sondou z nukleových kyselin obsahující celou sekvenci AHAS divokého typu nebo její část.

U kukuřice se gen AHAS nalézá* na dvou místech alsl a ais2 (Burr a Burr, Trends in Genetics 7: 55 - 61, 1991) . Homologie mezi těmito dvěma místy je na úrovni nukleotidů 95%.

Mutace v XI12 se mapováním zařadí na místo als2 na chromosom 5, kdežto nemutantní gen se mapováním zařadí na místo alsl na chromosom 4 (Newhouse a další., Imidazolinone-resistant crops). V The Imidiazolinone Herbicides, Shaner a 0'Connor (Eds.) ,

CRC Press, Boča Raton, Florida, USA - v tisku) jsou Southernovou analýzou identifikovány některé klony obsahující mutantní gen als2 a některé klony obsahující nemutantní gen alsl.

Oba typy se subklonují do sekvenačních vektorů a sekvenují se dideoxy-sekvenační metodou.

Sekvenováním a porovnáním genů AHAS divokého typu a mutantního se zjistí rozdíl v jediném nukleotidu v kodonu kódujícím aminokyselinu v poloze 621 (viz obr. 5) . Konkrétně, kodon AGT, kódující serin v divokém typu, je změněn na kodon AAT, kódující asparagin v mutantním AHAS (viz obr. 8) . Mutantní gen AHAS se jinak podobá genu divokého typu, kódujícímu protein obsahující 638 aminokyselin, z nichž prvních čtyřicet tvoří přechodový peptid, o němž se předpokládá, že se při transportu do chloroplastu in vivo odštěpí. Sekvence nemutantního genu alsl z XI12 se zdá být totožná se sekvencí genu alsl z B73.

Mutantní geny podle tohoto vynálezu dodávají odolnost vůči midazolinonovým herbicidům, ale nikoliv vůči sulfonylmočovinovým herbicidům. Typy herbicidů, vůči kterým se dosahuje rezistence, jsou popsány například v US patentech č.

4	188	487,	4	201	565,	4 221	586, 4	297	128,	4 554 013, 4 608	079,
4	638	068,	4	747	301,	4 650	514, 4	698	092,	4 701 208, 4 709	036,
4	752	323,	4	772	311	a 4 798	619,

Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že sekvence nukleo vých kyselin, která je znázorněna na obr. 6, není jedinou sekvencí, které je možno použít pro dodání imidazolinon-specifické rezistence. Rovněž se může použít takových sekvencí nukle9 ových kyselin, které kódují stejný protein, ale které v důsledku degenerace genetického kódu mají odlišnou nukleotidovou sekvenci. Do rozsahu vynálezu také spadají geny kódující sekvence AHAS, v nichž je přítomna výše uvedená mutace, ale které také kódují jednu nebo více tichých změn aminokyselin v těch částech molekuly, které se nepodílejí na rezistenci nebo katalytické funkci. Do rozsahu také spadají genové sekvence z jiných imidazolinon-rezistentních monokotyledonů, které obsahují mutaci v odpovídající oblasti těchto sekvencí.

Do rozsahu vynálezu tedy spadají také genové sekvence s takovými změnami, které mají za následek tvorbu chemicky ekvivalentní aminokyseliny v určitém místě. Tak například, kodon pro aminokyselinu alanin, což je hydrofobní aminokyselina, je možno snadno nahradit kodonem kódujícím jiný hydrofobní zbytek, jako například glycin nebo kodonem kódujícím hydrofobnější zbytek, jako například valin, leucin nebo isoleucin. Podobně je možno očekávat, že se získá biologicky ekvivalentní produkt, jestliže se provede výměna jednoho negativně nabitého zbytku za jiný, jako je například výměna kyseliny aspartové za kyselinu glutamovou, nebo výměna jednoho pozitivně nabitého zbytku za jiný, jako je například výměna lysinu za arginin. Do rozsahu vynálezu také spadají chimérické geny, v nichž je substituovaná část genu AHAS z kukuřice rekcmbinována s nezměněnými částmi normálních genů AHAS z jiných druhů. Jestliže se tedy v tomto popisu a nárocích používá pojmu gen AHAS imidazolinon-specifické rezistentní kukuřice, rozumí se tím kterékoliv z těchto alternativních provedení, stejně tak jako sekvence znázorněná na obr. 6.

Izolované DNA sekvence AHAS podle tohoto vynálezu jsou užitečné pro transformaci rostlin cílových plodin, jimž se má dodat rezistence vůči imidazolinonům . Pro dosažení přímé nebo nepřímé transformace vyšších rostlin exogenní DNA je v současné době k dispozici velká řada technik a do rozsahu tohoto vynálezu spadá použití jakékoliv z nich, kterou se může nová sekvence zabudovat do genomu hostitele, přičemž dochází k ustálené dědičnosti. Znak imidazolinon-specifické rezistence se dědí jakožto jediný dominantní jaderný gen. Úroveň rezistence vůči imidazolinonům se zvyšuje, je-li gen přítomen v homozygním stavu. Takové rostliny kukuřice mají například úroveň rezistence přibližně 1 000 x vyšší než nerezistentní rostliny. Rostliny, v nichž je gen přítomen v heterozygním stavu však mají rezistenci pouze asi 50 až 500násobnou ve srovnání s nerezistentními rostlinami.

Transformaci rostlinných buněk je možno zprostředkovat použitím vektorů. Obvyklou metodou, které se při transformaci používá je metoda, při niž se cizí gen zavádí do buňky cílové rostliny pomocí Agrobacterium tumefaciens, tak například, mutantní sekvence AHAS se vloží do plasmidového vektoru obsahující lemující sekvence v Ti-plasmidu T-DNA. Tento plasmid se potom transformuje do E.coli. Provede se triparentální spojení (mating) tohoto kmene, kmene agrobaceterium obsahujícího odzbrojený (disarmed) Ti-plasmid obsahující virulentní funkce potřebné pro provedení přenosu T-DNA sekvencí obsahujících AHAS do chromosomu cílové rostliny a druhého kmene E. coli, obsahujícího plasmid, v němž jsou přítomny sekvence potřebné pro mobilizaci přenosu konstruktu AHAS z E. coli do agrobacterium . Rekomibinantního kmene agrobacterium, který obsahuje potřebné sekvence pro transformaci rostliny, se použije pro infekci listových disků. Disky se nechají růst na selekčním mediu a identifikují se úspěšně transformované regeneranty. Získané rostliny jsou rezistentní vůči účinkům herbicidu, pokud se nechají růst v jeho přítomnosti. Vhodným prostředkem pro přenos exogenní DNA jsou také rostlinné viry.

Může se také použít postupu, při němž. buňky rostliny přijímají DNA přímo. Obvykle se postupuje tak, že se protoplasty cílové rostliny umístí do kultury za přítomnosti DNA, která má být přenesena a činidla podporujícího přijímání DNA protoplastem. Jako užitečná činidla tohoto typu je možno uvést polyethylenglykol nebo fosforečnan vápenatý.

Alternativně je možno stimulovat přijímání DNA elektroporací. Při této metodě se používá elektrického pulzu pro dočasné otevření pórů v buněčné membráně protoplastu, přičemž těmito póry se potom do buněk vtáhne DNA z obkolopujícího roztoku. Podobně se může pro přímé dodání DNA do buňky a přednostně do buněčného jádra, použít mikroinjekcí.

Při každé z výše uvedených technik dochází k transformaci buněk rostliny v kultuře. Po provedené transformaci je nutno z buněk rostliny regenerovat celé rostliny. Techniky regenerace zralých rostlin z callu nebo protoplastové kultury jsou nyní velmi dobře známé u velkého počtu různých druhů (viz například Handbook of Plant Cell Culture, sv.l - 5, 1983 1989, McMillan, New York, USA). Jestliže se tedy již dosáhne transformace, regenerace zralých rostlin z transformovaných buněk rostliny představuje postup spadající do rozsahu dosavadního stavu techniky.

Nyní jsou také k dispozici alternativní metody, které nutně nevyžadují použití izolovaných buněk a tedy technik regenerace rostlin, pro provedení transformace. Tyto metody bývají označovány jako balistické” nebo metody urychlování částic, při nichž se do buněk rostliny vstřelují kovové částice povlečené DNA bud pomocí náplně střelného prachu (Kleina další, Nátuře 327 : str. 70 - 73, 1987) nebo pomocí elektrického výboje ( EPO 270 356) . Tímto způsobem je možno stabilně transformovat sekvencí DNA, která je předmětem zájmu, buňky rostliny v kultuře nebo reprodukční orgány nebo buňky rostliny, například pyl.

U některých dvojděložných a jednoděložních rostlin je přímý příjem DNA přednostní metodou transformace. Tak například, u kukuřice, se buněčná stěna kultivovaných buněk rozštěpí v pufru pomocí jednoho nebo více enzymů degradujících stěnu buňky, jako je celuláza, hemiceluláza a pektináza, za účelem izolace životaschopných protoplastů. Protoplasty se něko likrát promyjí aby se odstranily enzymy a potom se smíchají s plazmidovým vektorem, obsahujícím gen, který je předmětem zájmu. Buňky je možno transformovat pomocí PEG (například 20% PEG 4 000) nebo elektroporací. Protoplasty se umístí na nitrocelulózový filtr a kultivují na mediu s uloženými buňkami kukuřice, které slouží jako živné kultury. Po dvou až čtyřech týdnech se kultury v nitrocelulózovém filtru umístí na medium obsahující přibližně 0,32 yuM imidazolinonu a na tomto mediu se udržují po dobu 1 až 2 měsíců. Nitrocelulózové filtry s buňkami rostlin se každé dva týdny přenášejí na čestvé médium s herbicidy a živnými buňkami. Netransformované buňky přestanou růst a po několika týdnech odumírají.

Předloženého vynálezu je možno použít pro transformaci v podstatě jakéhokoliv typu rostlin a to jak jednoděložných tak dvouděložných. Z plodin, u nichž je možno takové transformace pro dosažení herbicidní rezistence použít, je například možno uvést kukuřici, pšenici, rýži, proso, ječmen, oves, čirok, slunečnici, batáty, vojtěšku, cukrovou řepu, druhy Brassica, rajčata, papriku, sóju, tabák, tykev, brambory, hrách, podzemnici olejnou, bavlník nebo kakaovník. Nových sekvencí je také možno používat pro transformaci okrasných druhů rostlin, jako jsou růže a dřevnatých rostlin, jako je borovice a topol.

Nové sekvence podle vynálezu jsou také užitečné jako selektovatelné markéry při studiích genetiky rostlin. Tak například, při transformaci rostliny by bylo možno sekvence kódující rezistenci vůči imidazolinonům, připojit k genu, který je předmětem zájmu, jehož se má použít pro transformaci cílové imidazolinon-senzitivní rostlinné buňky. Do buňky rostliny se potom zavede konstrukt, který obsahuje jak gen, který je předmětem zájmu, tak imidazolinon-rezistentní sekvence a buňky rostliny se potom nechají růst za přítomnosti ihibičniího množství imidazolinonu. Alternativně se může postupovat tak, že se druhý gen, který je předmětem zájmu ko-transformuje na separátním plasmidu, do buněk hostitele. Buňky rostliny, které tento postup přežijí, budou pravděpodobně obsahovat jak gen rezistence, tak gen, který je předmětem zájmu a tudíž, pouze transformanty přežijí selekční proces za použití herbicidu. Potvrzení úspěšné transformace a exprese obou genů se může provést Southernovou hybridizací genomové DNA, PCR nebo pozorováním fenotypické exprese genů.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádaném ohledu neomezují.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Potvrzení herbicidní rezistence celé rostliny na XI12

Rostliny XI12 se ošetří herbicidy v době 10 dnů do stadia V3 listu (4-5 listů, z nichž 3 obsahují viditelné liguly) . Imazethapyr se aplikuje v dávce 2 000, 500, 250,

125 a 62,5 g/ha. Chlorsulfuron se aplikuje v dávce 32, 16,

8, 4 a 2 g/ha. Rostliny se ošetří postemergentně za použití objemu postřiku 400 1/ha. Po postřiku se rostliny umístí do skleníku , kde se dále sledují.

Při všech stupních ošetření imazethapyrem zůstávají rostliny XI12 neovlivněny. Při tom však není pozorována zvýšená rezistence vůči chlorsulfuronu. Rostliny XI12 tedy vykazují selektivní rezistenci vůči imidazolinonu, na úrovni celé rostliny ( viz obr. 1).

Rezistence rostlin XI12 je dědičná ve formě jediné dominantní alely nukleárního genu. Heterozygně rezistentní rostliny XI12 se samoopylí . Potomstvo se rozdělí v poměru 3:1 (rezistentní : susceptibilní) jak lze očekávat v případě jediné dominantní alely jaderného genu. Při této studii se segregující semenáčky postříkají postemergentně lethální dávkou imazethapyru (125 nebo 250 g/ha) za použití postřiko14 vacích postupů popsaných výše, za účelem segregace podle rezistence.

Příklad 2

Extrakce AHAS

Semena rostlin XI12 se zasejí do země ve skleníku, v němž se udržuje teplota ve dne i v noci 26,7 °C při 15 hodinové osvětlovací periodě. Rostliny se sklidí 2 týdny po zasetí. Pro extrakci AHAS se použije hlavní části výhonu. 5 g tkáně se v kapalném dusíku rozdrtí na prášek, který se potom homogenizuje s pufrem pro stanovení AHAS, který sestává z 100 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného (pH 7,5), obsahujícího 10 mM pyruvátu, 5 mM chloridu hořečnatého, 5 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 100 uM FAD (flavinadenindinukleotid), 1 mM valinu, 1 mM leucinu, 10 % glycerolu a 10 mM cysteinu. Homogenát se 10 minut odstředuje při otáčkách 10 000 min¹ a 3 ml získaného supernatantu se nanesou na ekvilibrovaný sloupec Bio-Rad Ečono-Desalting (10 DG). Eluce se provádí 4 ml pufru pro zkoušení AHAS.

Aktivita AHAS se měří stanovením obsahu produktu, acetolacetátu, po konverzi dekarboxylací za přítomnosti kyseliny na acetoin. Standardní reakční směsi obsahují enzym v 50 mM pufru na bázi fosforečnanu draselného ( pH 7,0), který obsahuje 100 mM pyruvátu sodného, 10 mM chloridu hořečnatého, 1 mM difosforečnanu thiaminu, 10 uM FAD a vhodné koncentrace různých inhibitorů. Získaná směs se inkubuje při 37 °C, po dobu 1 až 3 hodin, v závislosti na druhu prováděného pokusu. Na konci této inkubační periody se reakce zastaví přídavkem kyseliny sírové v takovém množství, aby se ve zkumavce dosáhlo konečné koncentrace 0,85 % kyseliny sírové. Reakční produkt se nechá dekarboxylovat při 60 °C v průběhu 15 minut. Vytvořený acetoin se stanoví inkubací s kreatinem ( 0,17%) a 1-naftolem (1,7% roztok v 4N hydroxidu sodném). Absorpce barevného komplexu, který vznikne, se měří při 520 nm.

Aktivita AHAS z linií B73, A619 nebo jiných linií kukuřice divokého typu je vysoce citlivá vůči inhibici ima(R) zethapyrem (Pursuit ) s hodnotou Ι₅θ 1 yuM (viz obr. 1).

V kontrastu s tímto zjištěním vykazuje XI12 70 až 80% aktivitu enzymu při nejvyšších koncentracích (100 uM) produktu Pur(R) (R) suit nebo Arsenal (imazepyr) a přibližně 70% za přitom(R) nosti produktu Scepter (imazequin). Tento výsledek ukazuje na stonásobné zvýšení tolerance aktivity AHAS z XI12 vůči imazethapyru, ve srovnání s aktivitou AHAS z A619 in vitro.

Senzitivita aktivity AHAS z těchto dvou linií vůči sulfonylmočovinám poskytuje zcela odlišný obrázek. Za přítomnosti produktu Oust' (sulfometuron methyl) o koncentraci 100 nM činí aktivita AHAS z XI12 pouze 15 až 20 %. Aktivita AHAS z

A619 za přítomnosti výrobku Oust je 5 až 10% a za přítomnos(R) ti výrobku Pursuit 15 - 20% ( viz obr. 1 ) .

Příklad 3

Klonování genů AHAS XI12

Zasejí se semena mutantu XI12 získaného z tkáňové kultury imidazolinon-rezistentní kukuřice. Rostliny získané z těchto semen jsou segregující pro mutantní fenotyp AHAS. Aby se získalo homozygně rezistentní osivo, provede se samoopylení populace rostlin mutantu XI12. Semena jsou homozygní, pokud se týče mutantního genu AHAS po selekci na herbicidní rezistenci prováděnou tři po sobě následující vegetační cykly. Homozygní semena se shromáždí a použije se jich pro vypěstování semenáčků, které slouží pro izolaci genu AHAS.

DNA se extrahuje ze sedm dnů starých etiolovaných semenáčků homozygní linie XI12. 60 g rostlinné tkáně se v kapalném dusíku rozdrtí na prášek, který se převede do 108 ml extrakčního pufru pro DNA ( 1,4 M chloridu sodného, 2,0 % Ctab /hexadecyltrimethylamoniumbromid/, 100 mM Tris-Cl o pH 8,0, mM ethyldiamintetraoctové kyseliny a 2 % merkaptoethanolu) a 54 ml vody. Suspenze se inkubuje 30 minut při 50 až 60 °C a potom se extrahuje stejným množstvím chloroformu. DNA se vysráží přídavkem stejného množství srážecího pufru (1 % Ctab, mM Tris-Cl o pH 8,0 a 10 mM ethyldiamintetraoctové kyseliny) . Genomová DNA se přečistí odstředovánim při vysoké ry- * chlosti v 6,6M roztoku chloridu česného a ethidiumbromidu (rotor Ti80, otáčky 50 000 min’''', 20 °C, 24 hodin) . Přečištěná DNA se extrahuje butanolem, který je nasycen solí a 25 hodin dialýzuje proti 3 dávkám, vždy po 1 litru dialy.začního pufru (10 mM Tris-Cl o pH 8,0, 1 mM ethyldiamintetraoctové kyseliny a 0,lM chloridu sodného). Spektrofotometricky se stanoví koncentrace genoraové DNA z XI12, která činí 310 mg/ml.

Výtěžek je 0,93 mg.

Genomové DNA z XI12 se použije pro vytvoření genomové knihovny ve fágu EMBL-3. DNA se částečně rozštěpí pomocí Mbol a získané fragmenty se separují na sacharózovém gradientu, za účelem získání fragmentů 8 až 22 kb, které se potom klonují do místa BamHI EMBL-3. Po získání 2,1 x 10 nezávislých 1 klonů se knihovna jednou amplifikuje. Titr knihovny je podle analýzy 9 x 10pfu/ml.

Za účelem získání nukleotidových sond pro analýzu knihovny XI12 se pomocí 800 nt BamHI nukleotidové sondy izolované z genomového klonu AHAS z Arabidopsis třídí cDNA knihovna W22 i i

(divokého typu) v lambda gtll (zakoupeno od firmy Clontech lne., California, USA ). Fágy se nanesou v hustotě 50 000 pfu/

15cm miska, přenesou se na nitrocelulózové filtry, předhybridizují se v 6 x SSC, 0,2% SDS po dobu 2 hodin a hybridizují se s nukleotidovou sondou AHAS z Arabidopsis v 6 x SSC, 0,2% SDS přes noc. Identifikuje se 1 pozitivní fág, který se dále pře- ’ a

----- ^s čistí a použije se ho pro subklonování 1,1 kb fragmentu EcoRI. l,lkb fragment EcoRI se subklonuje do pGemA-4 a použije se .ho jako nukleotidové sondy pro identifikaci genů AHAS XI12.

Genomová knihovna XI12 se nanese na 12 15cm misek (koncentrace 50 000 pfu/misku) a třídí se pomocí nukleotidové sondy cDNA AHAS W22. Filtry se předhybrizují ( 2 hodiny) a hybridizují ( přes noc )v Churchově pufru (0,5 M fosforečnan sodný, 1,1 mM ethyldiamintetraoctové kyseliny, 1 % BSA a 7 % SDS při 65 °C, načež se promyjí při 65 °C dvakrát SSC, 0,2% SDS a 0,3 x SSC, 0,2 % SDS. Získá se 12 pozitivních plaků z celkem 7,5 x 10^ zkoumaných pfu a 5 pozitivních klonů se dále čistí a izoluje podle Chisholma (BioTechniques 7: 21 - 23, 1989) . Southernovou analýzou (viz obr. 2) se zjistí, že fágové klony představují 2 typy klonů AHAS. Klony typu 1 obsahují 1 velký (větší než 6,5 kb) fragment Xbal, který se hybridizuje se sondou cDNA AHAS. Klony typu 2 obsahují 2,7 a 3,7 kb fragmenty Xbal, které se hybridizují se sondou cDNA AHAS. Southernova analýza genomu XI12 DNA ukazuje, že Xbal fragmenty získané rozštěpením genomové DNA a hybridizací se sondou cDNA AHAS odpovídají Xbal fragmentům identifikovaným ve fágových klonech XI12 (viz obr. 3) . Restrikční štěpení a Souther nova analýza také ukazují, že z 5 klonů AHAS představuje 1 mutatní geny als2 a 4 představují alsl gen.

Geny AHAS odpovídající mutantnímu místu na chromozomu 5 (klon 12/8A) a nemutatnímu místu na chromozomu 4 (klon 12/17A) se subklonují jako fragment Pstl (klon/8A) nebo jako fragment Xbal (12/17A) do sekvenačního vektoru pBluescript II KSml3(+) (pKS+; Stratagene). Jak 2,7kb tak 3,7kb Xbal fragment z fágu 12/17A obsahuje 1 úplnou kopii genů AHAS, které se identifikují. Sekvence každé z nich se získá dideoxy-sekvenováním (za použití sekvenačních souprav Pharmacia T7), přičemž se používá primerů, které jsou komplementární ke kódující sekvenci AHAS).

Metody extrakce DNA, klonování genomové knihovny a třídění knihovny jsou stejné jako metody popsané v souvislosti š genomovou DNA XI12. Geny AHAS z B73 se subklonují do sekvenačního vektoru pKS+ ve formě Xbal fragmentů a sekvenují se. Sekvence se získá dideoxy-sekvenováním, za použití primerů, které jsou komplementární vůči kódující sekvenci AHAS, jak je to popsáno u genu AHAS z SI12.

Roztřídí se genomová knihovna W22 v EMBL3 (zakoupená od firmy Clontech lne., California, USA). Fágy se nanesou na misky při hustotě 50 000 pfu/18cm miska. Potom se přenesou na nitrocelulózové filtry a hybridizují se sondou cDNA AHAS

W22, popsanou výše (přehybridizační a hybridizační podmínky: 6 x SSC, 0,5% SDS, IX Denhardova DNA z telecího thymu 100 mg/ml, 65 °C; promývací podmínky : 3X x SSC, 0,2% SDS 2 hodiny při 65 °C a 0,3 x SSC, 0,2% SDS 2 hodiny). Identifikují se a dále přečistí dva pozitivní fágy (12/1A a 12/4-4).

Genomový klon 12/1A z W22 se subklonuje ve formě Sall fragmentů 0,78 kb (pGemA-4) a 3,0 kb (pGemA-14 ; Promega) do vektoru pGem-A2 a ve formě 6,5kb fragmentu Xbal do vektoru pKS+ (pCD200) . Sekvence kódujícího vlákna genu AHAS W22 se získá dideoxy-sekvenováním hnízdových (nested) delecí vytvořených ze subklonů pGem A-14 a pGem A-4 fágu 12-1A. Této sekvence se použije pro sestavení oligonukleotidů, které jsou komplementární vůči nekódujícímu vláknu AHAS. Sekvence nekódujícího vlákna se získá dideoxy-sekvenováním klonu pCD200 za použití primerů, které jsou komplementární vůči kódujícímu vláknu.Při komplementaci sekvenování genu AHAS W22 se vytvoří primery obou vláken DNA a použije se jich pro sekvenování genů AHAS izolovaných z genomových knihoven XI12 a B73.

Příklad 4

Klonování genů AHAS QJ22

Také se určí sekvence genu kódujícího AHAS v linii kukuřice QJ22, která je selektivně rezistentní vůči imidazolinonům. Ve vektoru EMBL3 se vytvoří genomová knihovna QJ22. Knihovna fágu 800 000 se zkoumá pomocí 850-nukleotidového fragmentu Sall/Clal, izolovaného z klonu AHAS (A-4), odvozeného z linie kukuřice W22 divokého typu. Získá se 5 pozitivních fágů, které se podrobí druhému kolu skríningu, za účelem částečné purifikace fágu. Částečně purifikovaný fág se analyzuje PCR, aby se zjistilo, zda některý klon představuje gen alsl QJ22. Takové klony se identifikují jako 3,7kb fragment Xbal s gen-specifickým místem Smál v poloze 495. Při druhém skríningu se zjistí přítomnost jednoho pozitivního klonu, který má tyto vlastnosti.

PCR produkt se purifikuje za použití obchodně dostupné soupravy (Magie PCR Preps) od firmy Promega a přečištěná DNA se sekvenuje pomocí sekvenačního systému na bázi TAQ polymerázy fmol, také od firmy Promega. Analýza sekvence obou vláken DNA mutatní AHAS QJ22 vykazuje nukleotidový přechod od G do A v kodonu pro aminokyselinu 621. Tato mutace je totožná s mutací pozorovanou u XI12. Zbytek sekvence je typický pro gen alsl.

VÝSLEDKY

Sekvence mutatních genů AHAS se porovná se sekvencemi získanými z linií kukuřice divokého typu B73 a W22 (viz obr.7) . Mutatní gen XI12 (XI12/8A) a mutatní gen QJ22 jsou shodné s genem divokého typu, s výjimkou změny aminokyseliny v poloze 621, kde došlo k jednomu přechodu nukleotidu od AGT k AAT (viz obr. 8). Gen mutantu XI12 (XI12/8A) se liší od genu divo20 kého typu B73/7-4 přídavným rozdílem v poloze 63. Na druhé straně, nemutantní kmen AHAS XI12, klonovaný v XI12/17A je zcela homologický s odpovídajícím genem B73/10-2 v oblasti kódující maturovaný protein AHAS (data nejsou uvedena).

Uložení biologických materiálů

Ve sbírce American Type Culture Collection, 12301 Park lawn Drive, Rockville, Maryland, 20857, USA (ATCC) jsou uloženy následující biologické materiály:

E. coli XLI Blue harboring plasmid pX12/8A, uložen 3. července 1991 , pod přírůstkovým číslem ATCC 68643;

Semena kukuřice XI12, uložena 16. července 1991, pod přírůstkovým Číslem ATCC 75051.

Claims

PATENTOVÉ

N-Á1. Sekvence nukleových kyselin monokotyledonů, kódující funkční enzym AHAS, kterýžto enzym obsahuje v poloze 621 sekvence AHAS kukuřice divokého typu substituci aminokyseliny nebo který obsahuje homologickou substituci v sekvenci AHAS jiného jednoděložného druhu rostliny.
2. Sekvence podle nároku 1, kde monokotyledon je kukuřice a substituován je asparagin v poloze 621 enzymu AHAS kukuřice divokého typu.
3. Funkční enzym AHAS monokotyledonů, který zahrnuje vzhledem k enzymu AHAS monokotyledonů divokého typu substituci aminokyseliny, kterážto substituce uděluje enzymu imidazolinon-specifickou rezistenci.
4. Enzym podle nároku 3, kde monokotyledonem je kukuřice a substituce se nalézá v poloze 621 enzymu AHAS kukuřice divokého typu.
5. Enzym podle nároku 4, kde substituovanou aminokyselinou je asparagin.
6. Transformační vektor obsahující nukleovou kyselinu podle nároku 1.
7. Hostitelská buňka obsahující sekvenci nukleových kyselin podle nároku 1, nebo vektor podle nároku 6.
8. Hostitelská buňka podle nároku 7, kterou je rostlinná nebo bakteriální buňka.
9. Imidazolinon-specificky rezistentní zralá rostlina obsahující sekvenci nukleových kyselin podle nároku 1 nebo její semena nebo pyl.
10. Způsob udělování imidazolinon-specifické rezistence buňkám rostlin, vyznačující se tím, že se do buňky rostliny zavede sekvence nukleových kyselin podle nároku 1.
11. Způsob pěstování imidazolinon-specifických rezistentních rostlin, vyznačující se tím, že se pěstuje rostlina produkující enzym podle nároku 3, za přítomnosti inhibičního množství imidazolinonu.
12. Způsob selekce hostitelských buněk, které jsou úspěšné selektovány genem, který je předmětem zájmu, vyznačující se tím, že se do zvolených hostitelských buněk zavede gen, který je předmětem zájmu, připojený k sekvenci nukleových kyselin podle nároku 1 nebo gen, který je předmětem zájmu, nepřipojený, ale za přítomnosti sekvence nukleových kyselin podle nároku 1, buňky se pěstují za přítomnosti inhibičního množství imidazolinonu, načež se identifikují buňky, které přežily, jakožto buňky obsahující gen, který je předmětem zájmu.
13. Konstrukt nukleových kyselin obsahující sekvenci podle nároku 1, připojenou ke genu, který kóduje agronomicky užitečný charakteristický znak.