PT525384E - Mutantes ahas resistentes a imidazolinona - Google Patents

Description

- 1 - $3*. Kí'1 ( Kà DESCRIÇÃO " MUTANTES AHAS RESISTENTES AIMIDAZOLINONA "

Esta invenção está relacionada com novas sequências de DNA que codificam novas formas variantes de enzima sintetase de ácido acetoxihidroxi (daqui em diante AHAS). A enzima AHAS é uma enzima crítica habitualmente produzida numa variedade de plantas e numa larga gama de microorganismos. A função normal da AHAS é inibida por herbicidas de imidazolinona; no entanto, novas enzimas AHAS codificadas pelas sequências de DNA mutantes funcionam normalmente cataliticamente mesmo na presença de herbicidas de imidazolinona e, por isso, conferem resistência herbicida às plantas ou microorganismos que as contenham.

As novas sequências de DNA são derivadas do milho e têm uma substituição de um amio-ácido na posição 621 da sequência de AHAS normal. Esta substituição na sequência do gene de AHAS resulta numa enzima completamente funcional, mas toma a enzima especificamente resistente à inibição por uma variedade de herbicidas de imidazolinona. A validade destas diferentes sequências fornecem uma ferramenta para a transformação de diferentes plantas de cultivo em resistentes a herbicidas de imidazolinona, fornecendo também novas marcas de selecção para uso noutros tipos de experiências de transformação genética.

BASES DA INVENÇÃO O uso de herbicidas na agricultura está hoje em dia largamente -2-

4< WO divulgado. Embora liaja um largo número de compostos disponíveis que destroem com eficácia ervas daninhas, nem todos os herbicidas são capazes de ter como alvo selectivo as plantas indesejáveis no seio das plantas de cultivo, assim como serem não tóxicas para animais. Frequentemente, é necessário decidir-se por compostos que são simplesmente menos tóxicos para as plantas de cultivo que para ervas daninhas. Com vista a ultrapassar este problema, o desenvolvimento de plantas de cultivo resistentes a herbicidas tem-se tomado um ponto central na investigação agrícola.

Um aspecto importante no desenvolvimento de resistência a herbicidas é uma compreensão do alvo do herbicida, e então manipular o caminho bioquímico afectado na planta de cultivo de tal forma que o efeito inibitório seja evitado enquanto a planta retém uma função biológica normal. Uma das primeiras descobertas do mecanismo bioquímico dos herbicidas está relacionada com uma série de compostos herbicidas estruturalmente não relacionados, as imidazolinonas, as sulfonilureias e as tíazolopirimidinas. É agora sabido (Shaner et ah Plant Phvsiol. 76: 545-546, 1984; Patente E. U. No. 4.761.373) que cada um destes herbicidas inibe o crescimento da planta por interferência com uma enzima essencial necessária para o crescimento da planta, acetohidroxiácido sintetase (AHAS; também referida como acetolacetato sintetase, ou ALS). A AHAS é necessária para a síntese dos amino-ácidos isoleucina, leucina e valina.

Sabe-se que a enzima AHAS está presente em plantas superiores, sendo também encontrada numa variedade de microorganismos, tais como a levedura Saccharomyces cerevisiae. e nas enterobactérias, Escherichia coli e Salmonella tvphimurium. A base genética para a produção de AHAS normal numa série destas espécies tem também sido bem caracterizado. Por exemplo, em ambas E. coli e S. tvphimurium existem três isozimas de AHAS; duas das quais -3- ίο*. ¥ Γ"* são sensíveis a herbicidas enquanto que uma terceira não c. Cada uma destas isozimas possui uma sub-unidade de proteína grande e uma pequena; e mapa para os operões IlvIH, IlvGM e IlvBN. Nas leveduras, a isozima AHAS singular foi mapeada para o local ILV2. Em cada caso, formas sensíveis e resistentes foram identificadas e sequências dos vários alelos foram determinadas (Friden et ah, Nucl. Acid Res. 13: 3979-3993, 1985; Lawther et. aL, PNAS USA 78: 922-928, 1982; Squires et al., Nucl. Acid Res 811: 5299-5313, 1983; Wek et al; Nucl. Acid Res 13: 4011-4027, 1985; Falco e Dumas, Genetics 109,21-35, 985; Falco et al, Nucl. Acids Res 13: 4011-4027,1985).

No tabaco, a função da AHAS é codificada por dois genes não ligados, SuRA e SuRB. Existe substancial identidade entre os dois genes, ambos ao nível nucleótido e ao nível dos amino-ácidos na proteína madura, embora a região transitória putativa N-terminal, difere mais substancialmente (Lee et al, EMBO J. 7: 1241-1248, 1988). A Arabidopsis. por outro lado, tem um único gene AHAS, que foi também completamente sequenciado (Mazur et al·, Plant Phvsiol. 85: 1110-1117, 1987). Comparações entre sequências dos genes AHAS em plantas superiores indicam um elevado nível de conservação de certas regiões da sequência; especificamente, existem pelo menos 10 regiões de conservação da sequência. Foi previamente assumido que estas regiões conservadas são críticas para a função da enzima, e que a retenção de tal função é dependente duma substancial conservação da sequência.

Foi recentemente relatado (Patente E.U. No. 5.013.659) que mutantes exibindo resistência a herbicida possuem mutações em pelo menos um amino-ácido em uma ou mais destas regiões conservadas. Em particular, a substituição de certos amino-ácidos por amino-ácidos do tipo selvagem nestes locais específicos na sequência da proteína AHAS mostraram ser tolerados, e de facto resulta em resistência a herbicidas pelas plantas possuindo esta mutação, -4-

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enquanto retêm a função catalítica. As mulações aqui descritas codificam quer resistência híbrida para imidazolinonas e sulfonilureias quer resistência específica a sulfonilureia, mas não foram divulgadas mutações específicas para imidazolinona. Mostrou-se que estas mutações ocorrem em ambos os locais SuRA e SuRB no tabaco; mutações similares foram isoladas em Arabidopsis e leveduras.

Resistência específica a imidazolinona foi relatado noutros lugares para uma série de plantas. A patente E.U. No. 4.761.373 duma maneira geral descreve uma AHAS alterada como uma base de resistência a herbicida em plantas, e especificamente divulga certas linhagens de milho resistentes a imidazolinona. Haughn et al. (Mol. Gen. Genet. 211 : 266-271, 1988) divulgou a ocorrência de um fenótipo similar em Arabidopsis. Sathasivan et aL (Nucl. Acid Res. 18: 2188, 1990) identificou a resistência específica a imidazolinona em Arabidopsis como sendo baseada numa mutação na posição 653 na sequência de AHAS normal. Em conformidade com a presente invenção, um gene codificando resistência específica a imidazolinona numa monocotiledónea foi agora isolado e determinado como estando associado com uma única substituição de amino-ácido numa sequência de amino-ácido de AHAS monocotiledónea do tipo selvagem.

SUMARIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece novas sequências de ácidos nucleícos codificando enzimas AHAS monocotiledónea funcionais insensíveis a herbicidas de imidazolinona, como definido pela reivindicação 1. As sequências em questão compreendem uma mutação no codão que codifica o amino-ácido serina na posição 621 na sequência AHAS de cereal (milho), ou na posição correspondente noutras sequências monocotiledónea. Outras monocotiledóneas, tais como o trigo, são também conhecidas por exibirem mutações específicas da irnidazolinona (e.g. , ATCC Nos. 40994-97). No milho, a sequência do tipo selvagem tem uma serina nesta posição. Numa inclusão preferida, a substituição é asparagina por serina, mas substituições alternativas para a serina incluem ácido aspártico, ácido glutâmico, glutamina e triptofano. Embora as sequências reivindicadas sejam originalmente derivadas de monocotiledóneas, as novas sequências são úteis em métodos para a produção de células resistentes a irnidazolinona em qualquer tipo de planta, os ditos métodos compreendem a transformação duma célula da planta alvo com uma ou mais das sequências alteradas aqui fornecidas. Altemativamente, é usada mutagénese para criar mutantes em células de plantas ou sementes contendo uma sequência de ácidos nucleícos codificando uma AHAS insensível a irnidazolinona. No caso de células de plantas mutantes isoladas na cultura de tecido, as plantas que possuem a resistência a irnidazolinona ou características de insensibilidade são então regeneradas. A invenção assim também inclui células de plantas, células bacterianas, células de fungos, culturas de tecidos de plantas, plantas adultas, e sementes de plantas que possuem uma sequência de ácidos nucleícos mutantes e cuja sequência expressa enzimas AHAS resistentes a irnidazolinona funcionais. A validade destas novas plantas resistentes a herbicida possibilitam novos métodos de crescimento plantas de cultivo na presença de imidazolinonas. Em vez de crescer plantas não resistentes, os campos podem ser plantados com as plantas resistentes produzidas por mutação ou por transformação com a sequência mutante da presente invenção, e o campo frequentemente tratado com imidazolinonas, sem dano resultante nas plantas de cultivo.

Os ácidos nucleícos mutantes da presente invenção também fornecem novas marcas de selecção para uso em experiências de transformação. A sequência de ácidos nucleícos codificando uma AHAS resistente é ligada a um segundo gene antes de ser transferido para uma célula hospedeira, e toda a construção transformada no hospedeiro. As células putativas transformadas sEo então crescidas em cultura na presença de quantidades inibitórias de herbicida; as células sobreviventes vão ter uma elevada probabilidade de terem adquirido com sucesso o segundo gene de interesse. Alternadamente, o gene AHAS resistente pode ser co-transformado num plasmídeo independente com o gene de interesse, pelo que cerca de 50% de todos os transformantes podem ser esperados ter recebido ambos os genes.

As seguintes definições devem ser entendidas para se aplicar ao longo das especificações e reivindicações. Uma enzima "funcional" ou "normal" é uma que é capaz de catalisar o primeiro passo na via para a síntese dos amino-ácídos essenciais isoleucina, leucina e valina. Uma sequência AHAS "tipo selvagem" é uma sequência presente num membro sensível a imidazolinona de uma dada espécie. Uma planta "resistente" é uma que produz uma enzima AHAS mutante mas funcional, e que é capaz de atingir a maturidade quando crescida na presença de níveis inibitórios normais de imidazolinona. O termo "resistente", tal como aqui é usado, tem também a intenção de englobar plantas "tolerantes", i. e., aquelas plantas que fenotipicamente evidenciam reacções a imidazolinona adversas, mas não letais.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Actividade da enzima AHAS de milho plantado com 10 dias de vida ( linhagens de milho A619 ou XI12) na presença de imazetapir (Pursuit™ A) ou clororsulforona (Oust™ B). A actividade de AHAS resistente a herbicida é calculada como uma percentagem de actividade de AHAS na ausência de inibidor. O erro padrão entre ensaios é 10%.

Figura 2: Análises Southern de clones genómicos no fago EMBL3. -7- /<^t CL~~~vi

Os fagos 12-1A (de W22), 12-7A, 18-8A, 12-11, e 12-17A (dc XI12) são digeridos com Xbal ou Sall, separados num gel de agarose a 1%, transferidos para nitrocelulose e hibridizados com um fragmento de cDNA de AHAS como sonda.

Figura 3: Análises Southern de DNA genómico das linhagens de milho XI12, XA17, QJ22, A188 e B73. O DNA é digerido com Xbal, separado num gel de agarose a 1%, transferido para nitrocelulose e hibridizado com um fragmento de cDNA de AHAS como sonda.

Figura 4: Mapa de restrição do plasmídeo pCD8A. O gene de AHAS mutante de XI12 foi subclonado como um fragmento Pstl de 8kb no vector pKS (+). A localização e orientação do gene de AHAS está indicada por uma seta. Os locais de restrição de Pstl, Xhol, HindlII, Xbal e Ciai são representadas por símbolos.

Figura 5: Gel de sequenciação de nucleótidos da cadeia não codificadora (A) e a sequência de DNA da dupla cadeia (B) dos clones de AHAS W22/4-4, B73/10-4 e XI12/8A na região dos amino-ácidos 614 até 633. A posição da transição da citosina a timidina é indicada por uma seta.

Figura 6; Sequências de nucleótidos e amino-ácidos deduzidos do gene de AHAS mutante de XII2/8A.

Figura 7: Alinhamento da sequência de nucleótidos dos genes als2 de XI12/8 A, B73/7-4 e W22/1A. (*) indica a troca de bases causando a mutação na posição 621, (#) diferencia da sequência B73/7-4 e (>) representa mudanças silenciosas. -8-

Figura 8: Sequências de amino-ácidos e alinhamento dos genes als2 de XI12/8A, B73/7-4 e W22/1 A. (*) indica a mutação na posição 621, (#) marca diferenças da sequência B73/7-4, e (>) representa mudanças silenciosas.

PESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O gene da presente invenção é isolável da linhagem XI12 de milho (semente depositada com a American Type Culture Collection como Número de Acesso 75051), e foi inserido no plasmídeo pXI12/8A (depositado com a American Type Culture Collection como Número de Acesso 68643). É também isolável a partir de qualquer outro mutante resistente a herbicida específico de imidazolinona, tal como a linhagem de milho QJ22 (depositada como uma cultura de células com a American Type Culture Collection como Número de Acesso 40129), ou as várias plantas de trigo (semente depositada com a American Type Culture Collection como Números de Acesso 40994, 40995, 40996, ou 40997). Uma biblioteca de DNA genómico é criada, por exemplo, no fago EMBL-3 com DNA de um dos mutantes resistentes a imidazolinona, de preferência um que seja homozigota para a característica de resistência, e é examinado com uma sonda de ácido nucleíco compreendendo toda ou uma parte de uma sequência de AHAS do tipo selvagem.

No milho, o gene AHAS é encontrado em dois locais, alsl e als2 (Burr e Burr, Trends in Genetics 7 : 55-61, 1991); a homologia entre os dois locais é 95% ao nível dos nucleótidos. A mutação em XI12 é mapeada para o local als2 no cromossoma 5, ao passo que o gene não mutante é mapeado para o local alsl no cromossoma 4 (Newhouse et al, "Imidazolinone-resistant crops". In The Tmidazolinone Herbicides. Shaner e 0'Connor (Eds.), CRC Press, Boca Raton, FL, na imprensa) análises Southern identificam alguns clones contendo o gene als2 mutante, e alguns contendo o gene alsl não mutante. Ambos os tipos -9- Ât b*.rtn Í **\ são subolonados em veetores de sequenciação, e sequenciados pelo método de sequenciação didesoxi. A sequenciação e comparação dos genes AHAS mutante e do tipo selvagem mostra uma diferença num único nucleótido no codão que codifica o amino-ácido na posição 621 (Figura 5). Especificamente, o codão AGT que codifica a serina no tipo selvagem é modificado para AAT que codifica a asparagina na AHAS mutante (Figura 8). O gene AHAS mutante é sob outros aspectos similar ao gene do tipo selvagem, codificando uma proteína contendo 638 amino-ácidos, os primeiros 40 dos quais constituem um péptido de trânsito que se pensa estar ligado durante o transporte ao cloroplasto in vivo. A sequência do gene alsl não mutante de XI12 parece ser idêntico ao gene alsl de B73.

Os genes mutantes da presente invenção conferem resistência a herbicidas de imidazolinona, mas não a herbicidas de sulfonilureia. Tipos de herbicidas aos quais é conferida resistência são descritos por exemplo nas Patentes E.U. Nos. 4.188.487; 4.201.565; 4.221.586; 4.297.128; 4.554.013; 4.608.079; 4.638.068; 4.747.301; 4.650.514; 4.698.092; 4.701.208; 4.709.036; 4.752.323; 4.772.311; e 4.798.619.

Será percebido pelos peritos na matéria que a sequência de ácidos nucleícos representada na Figura 6 não é a única sequência que pode ser usada para conferir resistência específica a imidazolinona. Também contempladas estão aquelas sequências de ácidos nucleícos que codificam uma proteína idêntica mas que, devido à degenerescência do código genético, possuem uma sequência de nucleótidos diferente. A invenção também abrange genes codificando sequências de AHAS nas quais a mutação acima exposta está presente, mas que também codificam uma ou mais trocas de amino-ácidos silenciosas em porções da molécula não envolvidas na função de resistência ou catalítica. Também contempladas estão sequências de genes de outros monocotilcdóneas resistentes a imidazolinona que têm uma mutação na correspondente região das sequências.

Por exemplo, alterações num dado local da sequência do gene que resulte na produção de um amino-ácido quimicamente equivalente são contempladas; assim, um codão para o amino-ácido alanina, um amino-ácido hidrofóbico, pode prontamente ser substituído por um codão que codifica outro resíduo hidrofóbico, tal como a glicina, ou pode ser substituído com um resíduo mais hidrofóbico tal como a valina, leucina, ou isoleucina. Similarmente, trocas que resultem numa substituição de um resíduo carregado negativamente por outro, tal como ácido aspártico por ácido glutâmico, ou um resíduo carregado positivamente por outro, tal como lisina por arginina, pode também ser esperado para produzir um produto biologicamente equivalente. A invenção também abrange genes quiméricos, nos quais a porção do gene AHAS de milho substituída é recombinada com porções inalteradas dos genes AHAS normais de outras espécies. Assim, ao longo das especificações e reivindicações, sempre que o termo "gene AHAS de milho resistente específico a imidazolinona" é usado, tem a intenção de abranger cada uma destas inclusões alternativas bem como a sequência da Figura 6.

Sequências de DNA de AHAS isoladas da presente invenção são úteis para transformar plantas de cultivo alvo, e assim conferir resistência a imidazolinona. Existe uma larga variedade de técnicas correntes para realizar transformação directa ou indirecta de plantas superiores com DNA exógeno, e qualquer método pelo qual a nova sequência possa ser incorporada no genoma hospedeiro, e herdado de maneira estável pela sua descendência, é contemplado pela presente invenção. A característica de resistência específica a imidazolinona é herdada como um único gene nuclear dominante. O nível de resistência a imidazolinona é aumentado quando o gene está presente num estado homozigota; -11 - -11 -

Ai tais plantas de milho, por exemplo, Lêm um nível de resistência de cerca de 1.000 vezes o de uma planta não resistente. Plantas heterozigotas quanto à característica, no entanto, têm uma resistência de cerca de 50-500 vezes o duma planta não resistente. A transformação de células de plantas pode ser mediado pelo uso de vectores. Um método comum para alcançar a transformação é o uso de Agrobacterium tumefaciens para introduzir um gene estranho na célula da planta alvo. Por exemplo, a sequência de AHAS mutante é inserida num plasmídeo vector contendo as sequências flanqueadoras no Ti-plasmídeo T-DNA. O plasmídeo é então transformado para E. coli. Um acoplamento triparental entre esta estirpe, uma estirpe Agrobacterium contendo um Ti-plasmídeo desarmado contendo as funções de virulência necessárias para efectuar a transferência da AHAS que contém sequências de T-DNA para o cromossoma da planta alvo, e uma segunda estirpe de E. coli contendo um plasmídeo com sequências necessárias para levar a cabo a transferência das construções de AHAS de E. coli para Agrobacterium. Uma estirpe recombinante de Agrobacterium. contendo as sequências necessárias para a transformação de plantas é usada para infectar discos de folhas. Os discos são desenvolvidos em meio de selecção e os regenerantes transformados com sucesso são identificados. As plantas recuperadas são resistentes aos efeitos do herbicida quando crescidas na sua presença. Os vírus de plantas também fornecem um meio possível para a transferência de DNA exógeno.

Captação directa por células de plantas também pode ser empregue. Tipicamente, os protoplastos das plantas alvo são colocados em cultura na presença do DNA a ser transferido, e de um agente que promove inserção do DNA pelos protoplastos. Agentes úteis para este fim são o polietileno glicol ou fosfato de cálcio. -12- h*.rfr C~~—

Altemativamente, a inserção de DNA pode ser estimulado por electroporação. Neste método, um pulso eléctrico é usado para abrir temporariamente os poros numa membrana de célula de protoplasto, e o DNA na solução circundante é então arrastado para a célula através dos poros. Similarmente, a microinjecção pode ser empregue para distribuir o DNA directamente numa célula, e de preferência directamente no núcleo da célula.

Em cada uma das técnicas anteriores, a transformação ocorre numa célula de planta em cultura. Posteriormente ao evento de transformação, as células de plantas devem ser regeneradas para todas as plantas. Técnicas para a regeneração de plantas maduras de culturas de calos ou protoplastos são agora bem conhecidas para um largo número de diferentes espécies (ver, e. g., Handbook of Plant Cell Culture. Vols. 1-5, 1983-1989 McMillan, N. Y.): Assim, uma vez alcançada a transformação, é do conhecimento dos peritos a regeneração de plantas maduras a partir de células de plantas transformadas. Métodos alternativos estão agora disponíveis que não requerem necessariamente o uso de células isoladas, e por consequência, técnicas de regeneração de plantas, para alcançar a transformação. Estes são geralmente referidos como métodos "balísticos" ou "de aceleração de partículas", nos quais partículas de metal revestidas de DNA são propeladas para as células de plantas quer por "energia de carga de pólvora" (Klein et al, Nature 327: 70-73, 1987) quer por descarga eléctrica (EPO 270 356). Deste modo, as células de plantas em cultura ou órgãos ou células reprodutivos de plantas, e. g. pólen, pode ser transformado de forma estável com a sequência de DNA de interesse.

Em certos dicots e monocotiledóneas a inserção directa do DNA é o método preferido de transformação. Por exemplo, no milho, a parede celular das células em cultura é digerida num tampão com uma ou mais enzimas de -13- /êi b*.rh C~^( t^x degradação de paredes celulares, tais como a celulase, hemicclulase e pcctinase, para isolar protoplastos viáveis. Os protoplastos são lavados várias vezes para remover as enzimas, e misturados com um plasmídeo vector contendo o gene de interesse. As células podem ser transformadas quer com PEG (e. g. PEG 4000 20%) quer por electroporação. Os protoplastos são colocados num filtro de nitrocelulose e cultivados num meio implantado com células de milho funcionando como culturas de alimentação. Após 2-4 semanas, as culturas no filtro de nitrocelulose são colocadas num meio contendo cerca de 0,32 μΜ da imidazolinona e mantidas no meio durante 1-2 meses. Os filtros de nitrocelulose com as células de plantas são transferidos para meio fresco com herbicidas e células cultivadas cada duas semanas. As células não transformadas cessam de crescer e morrem após algumas semanas. A presente invenção pode ser aplicada para a transformação de virtualmente qualquer tipo de planta, não só monocotiledónea mas também dicot. Entre as plantas de cultivo para as quais a transformação para resistência a herbicidas é contemplada são o milho, trigo, arroz, painço, aveia, cevada, sorgo, girassol, batata-doce, alfafa, beterraba, espécies Brassica. tomate, pimenta, soja, tabaco, melão, abóbora, batata, amendoim, ervilha, algodão, ou cacau. As novas sequências podem também ser usadas para transformar espécies decorativas, tal como a rosa, e espécies arborizadas, tais como o pinheiro e o choupo.

As novas sequências da invenção são também úteis como marcas de selecção em estudos genéticos de plantas. Por exemplo, em transformação de plantas, sequências que codificam resistência a imidazolinona podem ser ligadas a um gene de interesse que é usado para transformar uma célula de planta alvo sensível a imidazolinona. A construção compreendendo tanto o gene de interesse como a sequência de resistência a imidazolinona é introduzida na célula de planta, e as células de plantas são então crescidas na presença de uma quantidade -14- /Ί

inibitória de uma imidazolinona. Alternadamente, o segundo gene de interesse pode ser co-transformado, num plasmídeo distinto, para as células hospedeiras. As células de plantas que sobreviverem a um tal tratamento presumivelmente adquiriram o gene de resistência bem como o gene de interesse, e assim, somente os transformantes sobrevivem ao processo de selecção com o herbicida. A confirmação da transformação e expressão com sucesso de ambos os gene pode ser alcançada por hibridização Southern do DNA genómico, por PCR ou por observação da expressão fenotípica dos genes. A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.

EXEMPLOS 1. Confirmação da Resistência a Herbicidas Total de Plantas em XII2

Plantas XI12 são tratadas com herbicidas em 10 dias até ao estádio de folha V3 (4-5 folhas, das quais 3 têm lígulas visíveis). É aplicado imazetapir a taxas de 2000, 500, 250, 125 e 62,5% g/ha. É aplicado clorossulforano a 32, 16, 8, 4 e 2 g/ha. As plantas são tratadas após a emergência a um volume de pulverizador de 400 1/ha. Após a pulverização, as plantas são colocadas na estufa para posterior observação.

As plantas XI12 não são afectadas a todas as taxas de tratamento com imazetapir; no entanto, não é notado um aumento visível de resistência a clorossulforano. Assim, a XI12 exibe resistência selectiva ao nível total da planta a imidazolinona (ver Figura 1). A resistência em XI12 é também mostrada ser herdada como um único alelo dominante de um gene nuclear. Os XII2 resistentes heterozigotas são autopolinizadas, e espera-se para o segregado da progénie aotopolinizada uma razão 3:1 de resistência/susceptibilidade para um único alelo dominante de um gene nuclear. Neste estudo, as plantas semeadas segregadas são pulverizadas após a emergência com doses letais de imazetapir (125 ou 250 g/ha) seguindo os protocolos de pulverização acima descritos, para estabelecer segregação para resistência.

2. Extraccão de AHAS

Sementes de XI12 são semeadas em terra numa estufa mantida a uma temperatura de dia/noite de 80°C e 15 horas de fotoperíodo. As plantas são colhidas duas semanas após terem sido plantadas. A porção fundamental dos rebentos é usada para a extracção de AHAS. 5 g do tecido é pulverizado em nitrogénio líquido e então homogeneizado em tampão de análise AHAS compreendendo tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5) contendo piruvato 10 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 5 mM, FAD 100 μΜ (flavina adenina dinucleótida), valina 1 mM, leucina 1 mM, glicerol a 10% e cisteína 10 mM. O homogenado é centrifugado a 10.000 rpm durante 10 min e 3 ml do sobrenadante são aplicados numa coluna Bio-Rad Econo-Desalting equilibrada (10 DG) e eluídos com 4 ml de tampão de análise AHAS. A actividade de AHAS é medida pela estimativa do produto, acetolactato, após conversão em acetoína por descarbolixilação na presença de ácido. Misturas de reacção padrão contêm a enzima em fosfato de potássio 50 mM (pH 7,0) contendo piruvato de sódio 100 mM, MgCl210 mM, pirofosfato de tiamina 1 mM, FAD 10 μΜ, e concentrações apropriadas de diferentes inibidores. Esta mistura é incubada a 37°C durante 1 a 3 horas dependendo dum modo geral

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da experiência. Αυ fíni deste período de incubação, a reacção é parada com a adição de H2SO4 para obter uma concentração final de 0,85% de H2S04 no tubo. O produto da reacção é permitido descarboxilar a 60°C durante 15 minutos. A acetoína formada é determinada por incubação com creatina (0,17%) e l-naftol (1,7% em NaOH 4N). A absorção do complexo colorido formado é medida a 520 nm. A actividade de AHAS de B73, A619, ou outras linhagens de milho de tipo selvagem é altamente sensível à inibição por imazetapir (PURSUIT™) com tuna I50 de 1 μΜ (ver Figura 1). Contrariamente a esta observação, a XI12 mostra 70-80% de actividade de enzima ás mais elevadas concentrações (100 μΜ) de PURSUIT™ ou Arsenal™ (imazepir), e cerca de 70% na presença de SCEPTER™ (imazequina). Este resultado mostra um aumento de 100 vezes na tolerância da actividade de AHAS de XII2 para imazetapir quando comparada com a actividade de AHAS in vitro de A619. A sensibilidade da actividade de AHAS das duas linhagens a sulfonilureias dá uma figura diferente. Na presença de OUST™ (sulfometurona metilo), a 100 nM, a actividade de AHAS de XII2 é somente 15-20%. A actividade de AHAS de A619 na presença de OUST™ é 5-10%, e na presença de PURSUIT™ é 15-20% (ver Figura 1). 3. Clonagem dos Genes AHAS de ΧΙ12

Sementes dos mutantes de XII2 derivados de uma linhagem de cultura de tecidos de milho resistente a imidazolinona são plantadas; as plantas daí obtidas parecem ser segregadoras para 0 fenótipo de AHAS mutante. Com o fim de obter material de semente resistente homozigota, uma população de plantas de XI12 mutantes são autopolinizadas. Após a selecção de resistentes a herbicida para três períodos de crescimento consecutivos, as sementes são homozigotas para o gene AHAS mutante. As sementes homozigotas são recuperadas e usadas para cultivar plantas para serem usadas para serem usadas em isolamento do gene AHAS. O DNA é extraído de plantas novas estioladas com 7 dias de vida de uma linhagem de XI12 homozigota. 60 g do tecido da planta é pulverizado em nitrogénio líquido, e transferido para 108 ml de tampão de extracçãò de DNA (NaCl 1,4 M, Ctáb a 2% (hexadecilo trimetiío brometo de amónio), tris-Cl 100 mM pH 8,0, EDTA 20 mM, Mercaptoetanol a 2%) e 54 ml de água. Após incubação a 50-60°C durante 30 minutos a suspensão é extraída com uma quantidade igual de clorofórmio. O DNA é precipitado por adição de uma quantidade igual de tampão de precipitação (Ctab a 1%, Tris-Hcl 50 mM pH 8,0, EDTA 10 mM). Para purificar o DNA genómico, é levada a cabo uma centrifugação a alta velocidade em CsCl 6,6 M e brometo de etídio (rotor Ti80, 50.000 rpm, 20°C, 24 horas). O DNA purificado é extraído com sal de Butanol saturado e dialisado durante 25 horas contra 3 doses de 1 1 de tampão de diálise (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 0,1 Μ). A concentração do DNA genómico de XI12, 310 mg/ml, é determinada espectrofotometricamente. O rendimento é 0,93 mg. O DNA genómico de XI12 é usado para criar uma biblioteca genómica no fago EMBL-3. O DNA é parcialmente digerido com Mbol e os fragmentos são separados num gradiente de sacarose para produzir uma gama de tamanhos entre 8 a 22 kb antes de serem clonados no local BamHl de EMBL-3. Após a obtenção de 2,1 x 106 clones independentes, a biblioteca é uma vez amplificada. O título da biblioteca é determinado como 9 x 1010 pfu/ml.

Para obter sondas para análises da biblioteca de XI12, uma biblioteca de cDNA de W22 (do tipo selvagem) no gtl 1 lambda, adquirida em Clontech Inc., CA, é examinada minuciosamente com uma sonda BamHl de 800 -18- nt isolada de um clone genómico AHAS de Arabidopsis. Os fagos são colocados em placas numa densidade de 50.000 pfu/15 cm de prato, transferidos para filtros de nitrocelulose, pre-hibridizados em 6x SSC, SDS a 2% durante 2 horas e hibridizados com a sonda AHAS de Arabidopsis em 6x SSC, SDS a 2% durante a noite. Um fago positivo é identificado, posteriormente purificado e usado para a subclonagem de um fragmento EcoRl de 1,1 kb. O fragmento EcoRl de 1,1 kb é subclonado no pGemA-4 e usado como sonda para identificar os genes AHAS de XI12. A biblioteca genómica de XI12 é colocada em pratos de 12-15cm (concentração de 50.000 pfu/prato) e é examinada com a sonda de cDNA AHAS de W22. Os filtros são pré-hibridizados (2 horas) e hibridizados (durante a noite) em tampão Church (Fosfato de sódio 0,5 M, EDTA 1 mM, BSA 1%, SDS 7%) a 65°C e lavados a 65°C em 2x SSC, SDS 2% e 0,3 x SSC, SDS 0,2%. 12 placas positivas são obtidas de um total de 7,5 x 105 pfu examinadas e 5 clones positivos são posteriormente purificados e isolados de acordo com Chisholm (BioTechniques 7: 21-23, 1989). Análises Southern (ver Figura 2) mostram que os clones de fago representam dois tipos de clones AHAS: os clones Tipo-1 continham um fragmento grande de Xbal (> 6,5 kb) que hibridiza com a sonda de cDNA AHAS, os clones Tipo-2 continham dois fragmentos 2,7 e 3,7 kb de Xbal que hibridizam com a sonda de cDNA AHAS. Southern genómico de DNA de XI12 demonstrou, que os fragmentos de Xbal obtidos por digestão do DNA genómico e por hibridização com a sonda de cDNA AHAS correspondem aos fragmentos de Xbal identificados nos clones de fago de XI12 (ver Figura 3). Digestão de restrição e Análises Southern também demonstraram que dos 5 clones AHAS, um clone representa os genes als2 mutantes e quatro representam o gene alsl.

Os genes AHAS correspondendo ao local do mutante localizado no -19- h*~rh ví cromossoma 5 (clone 12/8A) e o local não mutante localizado no cromossoma 4 (clone 12/17A) são subclonados como um fragmento Pstl (clone 12/8A) ou como fragmento Xbal (clone 12/17A) no vector de sequenciação pBluescript Π KSml3 (+) (pKS+; Stratagene). Ambos os fragmentos de 2,7 e 3,7 kb de Xbal do fago 12/17 A contêm uma cópia completa dos genes AH AS que são identificados. A sequência de cada um é obtida por sequenciação dideóxi (estojos de sequenciação Farmácia T7) usando iniciadores complementares à sequência codificadora de AH AS.

Os métodos de extracção de DNA, clonagem da biblioteca genómica e análise da biblioteca são como descritas para o DNA genómico de XI12. Os genes AHAS de B73 são subclonados no vector de sequenciação pKs+ como fragmentos de Xbal e são sequenciados. A sequência é obtida por sequenciação dideóxi, usando iniciadores complementares à sequência codificante de AHAS como descrito para os genes AHAS de SI12.

Uma biblioteca genómica de W22 em EMBL2 adquirida em Clontech Inc., CA é examinada. Os fagos são colocados numa densidade de 50.000 pfu/7 polegadas de prato, transferidos para filtros de nitrocelulose, e hibridizados com a sonda de cDNA AHAS de W22 acima descrita (condições de pré-hibridização e hibridização: 6 x SSC, SDS 0,5%, 1 x timo de vitela a 100 mg/ml de Denhard, 65°C, condições de lavagem: 3X x SSC, SDS 0,2% durante 2 horas a 65°C, e 0,3 x SSC, SDS 0,2% durante 2 horas). Dois fagos positivos (12/1A e 12/4-4) são identificados e posteriormente purificados. O clone genómico 12/1A de W22 é subclonado como dois 0,78 kb (pGemA-4) e 3,0 kb (pGemA-14; Promega) fragmentos Sall no vector pGem-A2, e como um fragmento de Xbal de 6,5 kb para o vector pKS+ (pCD200). A sequência de cadeia codificante do gene AHAS de W22 é obtida por -20-

C í sequenciação didesoxi de deleções encaixadas criadas a partir dos subclones pGem A-14 e pGem A-4 do fago 12-1 A. Esta sequência é usada para desenhar oligonucleótidos complementares à cadeia não codifícante AHAS. A sequência da cadeia não codifícante é obtida por sequenciação dideóxi do clone pCD200 usando iniciadores complementares à cadeia codifícante. Em consequência da complementação da sequência do gene AHAS de W22, iniciadores de ambas as cadeias de DNA são desenhados e usados para a sequenciação dos genes AHAS isolados das bibliotecas genómicas de XI12 e B73. 4. Clonagem dos Genes AHAS de OJ22 A sequência do gene que codifica a AHAS na linhagem de milho QJ22, que é selectivamente resistente a imidazolinonas, é também determinada. Uma biblioteca genómica de QJ22 é preparada num vector EMBL3. Uma biblioteca de 800.000 fagos é examinada com um fragmento Sall/Clal de 850 nucleótidos isolado de um clone AHAS (A-4) derivado da linhagem de milho W22 do tipo selvagem. Cinco fagos positivos são seleccionados e submetidos a uma segunda série de análise para purificar parcialmente o fago. Os fagos parcialmente purificados são analisados por PCR para determinar se algum clone representa o gene alsl de QJ22. Tais clones são identificados como um fragmento de Xbal de 3,7 kb com um local de gene específico Smal na posição 495. A segunda análise indica a presença de um único clone positivo com estas características. O produto da PCR é purificado usando um estojo comercial (Magic PCR Preps) de Promega, e o DNA purificado é sequenciado com um sistema de sequenciação polimerase Taq "finol", também a partir de análises de sequência Promega de ambas as cadeias do DNA do AHAS mutante de QJ22 mostram uma transição nucleótida de G para A no codão para o amino-ácido 621. Esta mutação é idêntica àquela vista em XI12 e o restante da sequência é típica de um gene alsl.

RESULTADOS A sequência dos genes AHAS mutantes é comparada com as sequências obtida a partir das linhagens de milho do tipo selvagem B73 e W22 (ver Figura 7). O gene mutante de ΧΙ12 (XI12/8A) e o gene mutante de QJ22 e o gene do tipo selvagem são idênticos excepto para a troca de amino-ácido na posição 62 í, provocando uma única transição nucleótida de AGT para AAT (ver Figura 8). O gene de ΧΙ12 mutante ΧΙ12/8Α e o de tipo selvagem B73/7-4 mostra uma diferença adicional na posição 63. Por outro lado, o gene AHAS de XI12 não mutante clonado em XI12/17A é completamente homólogo ao correspondente B73/10-2 na região codificante para a proteína AHAS madura (resultados não mostrados).

DEPÓSITO DE MATERIAIS BIOLÓGICOS

Os seguintes materiais biológicos foram depositados com a American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20857, como se segue:

Plasmídeo pX12/8A alojando E. ço]i XLI Blue, depositado em 3 de Julho, 1991, Número de Acesso ATCC 68643.

Semente de milho XI12 depositada em 16 de Julho, 1991, Número de Acesso 75051. -22- — Λ»* ( *·"·Α

Listagem de Sequências

Sequência ID No.: 1

Tipo de Sequência: Nucleótido e Aminoácido

Comprimento da Sequência: 1969 PB’s e 638 Aminoácidos

Tipo de Cadeia: Simples Topologia: Linear

Organismo Fonte Original: Zea mavs

Propriedades: Enzima AHAS Resistente a Herbicidas AACCCTCGCG CCGCCTCCGA GACAGCCGCC GCAACC 36 ATG GCC ACC GCC GCC GCC GCG TCT ACC GCG CTC ACT 72 Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu Thr 1 5 10 GGC GCC ACT ACC GCT GCG CCC AAG GCG AGG CGC CGG 108 Gly Ala Thr Thr Ala Ala Pro Lys Al|a Arg Arg Arg 15 20 GCG CAC CTC CTG GCC ACC CGC CGC GCC CTC GCC GCG 144 Ala His Leu Leu Ala Thr Arg Arg Ala Leu Ala Ala 25 30 35 CCC ATC AGG TGC TCA GCG GCG TCA CCC GCC ATG CCG 180 Pro Ile Arg cys Ser Ala Ala ser pro Ala Het Pro 40 45 -23- /ΟΛ. r *

CL «ά iTG GCT CCC CCG GCC ACC CCG CTC CGG CCG TGG GGC let Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly 50 55 60 ;cc AC C GAT CCC CGC AAG GGC GCC GAC ATC CTC GTC Pro Thr Asp Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val 65 70 SAG TCC CTC GAG CGC TGC GGC GTC CGC GAC GTC TTC GlU Ser Leu GlU Arg Cys Gly Vai Arg ASp vai Phe 75 80 GCC TAC CCC GGC GGC GCG TCC ATG GAG ATC CAC CAG Ala Tyr pro Gly Gly Ala ser Met GlU Ile His Gin 85 90 9S GCA CTC ACC CGC TCC CCC GTC ATC GCC AAC CAC CTC Ala Leu Thr Arg Ser Pro Vai Ile Ala Asn His Leu 100 105 TTC CGC CAC GAG CAA GGG GAG GCC TTT GCG GCC TCC Phe Arg His GlU Gin Gly GlU Ala Phe Ala Ala Ser 110 115 120 GGC TAC GCG CGC TCC TCG GGC CGC GTC GGC GTC TGC Gly Tyr Ala Arg ser ser Gly Arg V*1 Gly val Cys 125 130 ATC GCC ACC TCC GGC CCC GGC GCC AÇC AAC CTT GTC He Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val 135 140 TCC GCG CTC GCC GAC GCG CTG CTC GAT TCC GTC CCC ser Ala Leu Ala ASp Ala Leu Leu Asp Ser Val Pro 14S 150 155 216 252 288 324 360 396 432 468 504 24- ATG GTC GCC ATC ACG GGA CAG GTG CCG CGA CGC ATG 540 Met Val Ala Ile Thr Gly ein val Pro Arg Arg Met 160 165 ATT GGC ACC GAC GCC TTC CAG GAG ACG CCC ATC GTC 576 Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gin GlU Th# Pro ile val 170 175 180 GAG GTC ACC cac TCC ATC ACC AAG CAC AAC TAC CTG 612 GlU Val Thr Arg ser Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu IBS 190 GTC CTC GAC GTC GAC GAC ATC CCC CGC GTC GTG CAG 648 val Leu Asp val Asp Asp Ile Pro Arjg val val Gin 195 200 GAG GCT TTC TTC CTC GCC TCC TCT GGjT CGA CCG GGG 684 GlU Ala Phe Phe Leu Ala Ser ser Gly Arg Pro Gly 205 210 215 CCG GTG CTT GTC GAC ATC CCC AAG GAC ATC CAG CAG 720 pro Val Leu val Asp Ile Pro Lys AGP Ile Gin Gin 220 225 CAG ATG GCG GTG CCT GTC TGG GAC A^G CCC ATG AGT 756 Gin Met Ala Val Pro val Trp Asp Lys Pro Ket Ser 230 235 240 CTG CCT GG6 TAC ATT GCG CGC CTT cqc AAG CCC CCT 792 Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu pro Lys Pro Pro 245 250 GCG ACT GAG TTG CTT GAG CAG GTG CTG CGT CTT GTT 828 Ala Thr GlU Leu Leu GlU Gin Val Leu Arg Leu Val 255 260 -25- GGT GAA TCC CGG CGC CCT GTT CTT TAT GTT GGC GGT B64 Gly GlU Ser Arg Arg Pro val Leu Tyr Val Gly Gly 265 270 275 GCG TGC GCA GCA TCT GGT GAG GAG TTG CGA CGC TTT 900 Ala cys Ala Ala Ser Gly GlU GlU Leu Arg Arg Phe 280 2S5 GTG GAG CTG ACT GGA ATC CCG GTC ACA ACT ACT CTT 936 Vai GlU Leu Thr Gly Ile Pro val Thr Thr Thr Leu 290 295 300 ATG GGC CTC GGC AAC TTC CCC AGC GAC GAC CCA CTG 972 Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu 305 310 TCT CTG CGC AT G CTA GGT AT G CAT GGC ACG GTG TAT 1008 ser Leu Arg Ket Leu Gly Met HÍS Giy Thr Val Tyr 315 320 GCA AAT TAT GCA GTG GAT AAG GCC GAT CTG TTG CTT 1044 Ala Asn Tyr Ala Vai ASp Lys Ala Asj» Leu Leu Leu 325 330 335 GCA CTT GGT GTG CGG TTT GAT GAT CGT GTG ACA GGG 1080 Ala Leu Gly Vai Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly 340 345 AAG ATT GAG GCT TTT GCA AGC AGG GCT AAG ATT GTG Lys Ile GlU Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val 350 355 360 CAC GTT GAT ATT GAT CCG GCT GAG ATT GGC AAG AAC His Val Asp Ile Asp Pro Alá GlU Ile Gly Lys Asn 365 370 1152 -26-

At AAG CAG CCA CAT GTG TCC ATC TGT GCA GAT GTT AAG 1188 Lys Gin Pro His val ser Ile cys Ala Asp val Lys 375 380 CTT GCT TTG CAG GGC ATG AAT GCT CTT CTT GAA GGA 1224 Leu Ala Leu Gin Gly Met Asn Ala LeU Leu Glu Gly 385 390 395 AGC ACA TCA AAG AAG AGC TTT GAC TTT GGC TCA TGG 1260 Ser Tftr Ser Lys Lys Ser Fhe Asp Phè Gly Ser Trp 400 406 AAC GAT GAG TTG GAT CAG CAG AAG AGG GAA TTC ccc 1296 Asn Asp Glu Leu Asp Gin Gin Lys Ar£ Glu Phe Pro 410 415 420 CTT GGG TAT AAA ACA TCT AAT GAG GAG ATC CAG CCA 1332 Leu Gly Tyr Lys Tbr ser Asn Glu GlU ile Gin Pro 425 430 CAA TAT GCT ATT CAG GTT CTT GAT GAG CTG ACG AAA 1368 Gin Tyr Ala Ile Gin val Leu Asp GlU Leu Thr Lys 435 440 GGC GAG GCC ATC ATC GGC ACA GGT GTT GGG CAG CAC 1404 Gly Glu Ala Ile ile Gly Thr Gly Vajl Gly Gin HÍS 445 450 455 CAT ATG TGG GCG GCA CAG TAC TAC AQT TAC AAG CGG 1440 Gin Met Trp Ala Ala Gin Tyr Tyr Ttir Tyr Lys Arg 460 4é5 CCA AGG CAG TGG TTG TCT TCA GCT GGT CTT GGG GCT 1476 Pro Arg Gin Trp Leu Ser ser Ala Gly Leu Gly Ala 470 475 480 -27-b<- γ t ATG GGA TTT GGT TTG CCG GCT GCT GCT GGT GCT TCT Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala ser 485 490 GTG GCC AAC CCA GGT GTT ACT GTT GTT GAC ATC GAT Vai Ala Asn pro Gly Vai Thr Val Val Asp Ile Asp 495 500 GGA GAT GGT AGC TTT CTC ATG AAC GTT CAG GAG CTA Gly Asp Gly Ser Phe Leu Met Asn Val Gin Glu Leu 505 510 S15 GCT ATG ATC CGA ATT GAG AAC CTC CC& GTG AAG GTC Ala Met Ile Arg Ile GlU Asn Leu PrO Val Lys Val 520 525 TTT GTG CTA AAC AAC CAG CAC CTG GGG ATG GTG GTG Phe Vai Leu Asn Asn Gin HÍS Leu Gly Met Val Val 530 535 540 CAG TGG GAG GAC AGG TTC TAT AAG GCC AAC AGA GCG Gin Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala 545 550 CAC ACA TAC TTG GGA AAC CCA GAG AAT GAA AGT GAG HÍS Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Asn G1U Ser Glu 555 560 ATA TAT CCA GAT TTC GTG ACG ATC GCC AAA GGG TTC Ile Tyr Pro Asp Phe Vai Thr Ile Ala Lys Gly Phe 565 570 575 AAC ATT CCA GCG GTC CGT GTG ACA AAG AAG AAC GAA Asn Ile Pro Ala Vai Arg val Thr Lys Lys Asn GlU 580 585 1512 1548 1584 1620 1656 1692 1728 1764 1800 -28- S~) GTC CGC GCA GCG ATA AAG AAG ATG CTC GAG ACT CCA 1836 Vai Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu GlU Thr Pro 590 595 600 GGG CCG TAC CTC TTG GAT ATA ATC GTC CCA CAC CAO 1872 Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile val Pro His Gin 605 610 GAG CAT GTG TTG CCT ATG ATC CCT AAT GGT GGG GCT 1908 Glu His Vai Leu Pro Met Ile pro As& Gly Gly Ala 615 620 TTC AAG GAT ATG ATC CTG GAT GGT GAT GGC AGG. ACT 1944 Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly As^> Gly Arg Thr 625 630 635 GTG TAC 1950

Vai Tyr 638 1969 tgatctaaaa tccagcaag -29-

At

Sequência ID No.: 2

Tipo de Sequência: Nucleótído e Aminoácido Comprimento da Sequência: 1969 PB's e 638 Aminoácidos Tipo de Cadeia: Simples Topologia: Linear

Organismo Fonte Original: Zea mavs Propriedades: Enzima AH AS Sensível a Herbicidas AACCCTCGCG CCGCCTGCGA GACAGCCGCC GCAACC 36 ATG GCC ACC GCC GCC GCC GCG TCT ACC GCG CTC ACT 72 Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala ser Thir Ala Leu Thr 1 5 10 GGC GCC ACT ACC GCT GCG CCC AAG GCG AGG CGC CGG 108 Gly Ala Thr Thr Ala Ala Pro Lys Ala Arg Arg Arg 15 20 GCG CAC CTC CTG GCC ACC CGC CGC GCC CTC GCC GCG 144 Ala His Leu Leu Ala Thr Arg Arg Ala Leu Ala Ala 25 30 35 CCC ATC AGG TGC TCA GCG GCG TCA CGC GCC ATG CCG 180 Pro Ile Arg Cys Ser Ala Ala ser Pro Ala Ket Pro 40 45 ATG GCT CCC CCG GCC ACC CCG CTC CGG CCG TGG GGC 216 Met Ala Pr© Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro Trp Gly 50 55 60 -30- -30-

/¾ k*.yfr ccc ACC GAT CCC CGC AAG GGC GCC GAC ATC CTC GTC 252 Pro Thr Asp pro Arg Lys Gly Ala Asp He Leu Val 65 70 GAG TCC CTC GA6 CGC TGC GGC GTC CGC GAC GTC TTC 288 Qlu Ser Leu Glu Arg Cys Gly vai Arg Asp Val Phe 75 80 GCC TAC CCC GGC GGC GCG TCC ATG GAG ATC CAC CAG 324 Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met GlU Xle Bis em 85 90 95 GCA CTC ACC CGC TCC CCC GTC ATC GCC AAC CAC CTC 360 Ala Leu Thr Arg Ser Pro Vai Xle Ala Asn Kis Leu 100 105 TTC CGC CAC GAG CAA GGG GAG GCC TTT GCG GCC TCC 396 Phe Arg His GlU Gin Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser 110 115 120 GGC TAC GCG CGC TCC TCG GGC CGC GTC GGC GTC TGC 432 Gly Tyr Ala Arg ser Ser Gly Arg val Gly val Cys 125 130 ATC GCC ACC TCC GGC CCC GGC GCC Aqc AAC CTT GTC 468 Xle Ala Thr ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu val 135 140 TCC GCG CTC GCC GAC GCG CTG CTC GAT TCC GTC CCC 504 ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser val Pro 145 150 155 ATG GTC GCC ATC ACG GGA CAG GTG CÇG CGA CGC ATG 540 Met Vai Ala Zle Thr Gly Gin Vai pro Arg Arg Met 160 165 -31 - -31 -

At W*"1 ATT GGC ACC GAC GCC TTC CAG GAG ACG CCC ATC GTC 576 Xle Gly Thr Asp Ala Phe Gin GlU Thr Pro Ile Vai 170 175 180 GAG GTC ACC CGC TCC ATC ACC AAG CAC AAC TAC CTG 612 GlU vai Thr Arg Ser Ile Thr Lys HiS Asn Tyr Leu 185 190 GTC CTC GAC GTC GAC GAC ATC CCC CGC GTC GTG CAG 648 Vai Leu Asp vai Asp Asp Ile Pro Arg Vai Vai Gin 195 200 GAG GCT TTC TTC CTC GCC TCC TCT GGT CGA CCG GGG 684 GlU Ala Phe Phe Leu Ala ser ser Gly Arg pro Gly 205 210 215 CCG GTG CTT GTC GAC ATC CCC AAG GAC ATC CAG CAG 720 Pro Vai Leu Vai Asp Zle Pro Lys ASP ile Gin Gin 220 225 CAG ATG GCG GTG CCT GTC TGG GAC AAG CCC ATG AGT 756 Gin Het Ala Vai Pro vai Trp Asp Lys Pro Met Ser 230 235 240 CTG CCT GGG TAC ATT GCG CGC CTT CCC AAG CCC CCT 792 Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu pro Lys pro Pro 245 250 GCG ACT GAG TTG CTT GAG CAG GTG ctg CGT CTT GTT 828 Ala Thr GlU Leu Leu GlU Gin Vai Leu Arg Leu Vai 255 260 GGT GAA TCC CGG CGC CCT GTT CTT TAT GTT GGC GGT 864 Gly GlU Ser Arg Arg Pro Vai Leu Tyr Vai Gly Gly 265 270 275 -32- -32-

At b*.yh GCG TGC GCA GCA TCT GGT GAG GAG TTG CGA CGC TTT 900 Ala cys Ala Ala ser Gly GlU GlU Leu Arg Arg Phe 280 285 GTG GAG CTG ACT GGA ATC CCG GTC ACA ACT ACT CTT 936 val GlU Leu Thr Gly Xle pro val Thr Thr Thr Leu 290 295 300 ATG GGC CTC GGC AAC TTC CCC AGC GAC GAC CCA CTG 972 Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp pro Leu 305 310 TCT CTG CGC ATG CTA GGT ATG CAT GGC ACG GTG TAT 1008 ser Leu Arg Met Leu Gly Met Hls Gly Thr val Tyr 315 320 GCA AAT TAT GCA GTG GAT AAG GCC GA|T CTG TTG CTT 1044 Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu 325 330 335 GCA CTT GGT GTG CGG TTT GAT GAT CGT GTG ACA GGG 1080 Ala Leu Gly val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly 340 345 AAG ATT GAG GCT TTT GCA AGC AGG GÇT AAG ATT GTG 1116 Lys Xle GlU Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Xle Val 350 355 360 CAC GTT GAT ATT GAT CCG GCT GAG A?T GGC AAG AAC 1152 xis Val Asp Ile Asp Pro Ala GlU Xle Gly Lys Asn 365 370 AAG CAG CCA CAT GTG TCC ATC TGT GCA GAT GTT AAG 1188 Lys Gin Pro Kis val Ser Ile cys Ala Asp val Lys 375 380 -33- Á*- feu. i't< CL—^ ( ca CTT GCT TTG CAG GGC ATG AAT GCT CTT CTT GAA GGA 1224 Leu Ala Leu Gin Gly Met Asn Ala Leu Leu GlU Gly 385 390 395 AGC ACA TCA AAG AAG AGC TTT GAC TTT GGC TCA TGG 1260 Ser Thr ser Lys Lys Ser Phe Asp Phe Gly ser Trp 400 405 AAC GAT GAG TTG GAT CAG CAG AAG AGG GAA TTC CCC 1296 Asn Asp GlU Leu Asp Gin Gin Lys Arg GlU Phe Pro 410 415 420 CTT GGG TAT AAA ACA TCT AAT GAG GAG ATC CAG CCA 1332 Leu Gly Tyr Lys Thr ser Asn GlU GlU Ile Gin Pro 425 430 CAA TAT GCT ATT CAG GTT CTT GAT GAG CTG ACG AAA 1368 Gin Tyr Ala He Gin Vai Leu Asp GlU Leu Thr Lys 435 440 GGC GAG GCC ATC ATC GGC ACA GGT GTT GGG CAG CAC 1404 Gly Glu Ala Xle Ile Gly Thr Gly Vai Gly Gin His 445 450 455 CAT ATG TGG GCG GCA CAG TAC TAC ACT TAC AAG CGG 1440 Gin Met Trp Ala Ala Gin Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg 460 465 CCA AGG CAG TGG TTG TCT TCA GCT GGT CTT GGG GCT 1476 Pro Arg Gin Trp Leu Ser ser Ala Gly Leu Gly Ala 470 475 480 ATG GGA TTT GGT TTG CCG GCT GCT GCT GGT GCT TCT 1512 Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ser 485 490 -34- -34-

GTG GCC AAC CCA GGT GTT ACT GTT GTT GAC ATC GAT 1548 val Ala Asn Pro Gly Val Thr val val Asp ile Asp 495 SOO GGA GAT GGT AGC TTT CTC ATG AAC GTT CAG GAG CTA 1584 Gly ASp Gly ser Phe Leu Met Asn val Oln GlU Leu 505 510 515 GCT ATG ATC CGA ATT GAG AAC CTC CCG GTG AAG GTC 1620 Ala Met Ile Arg Ile GlU Asn Leu Pro Val Lys Val 520 525 TTT GTG CTA AAC AAC CAG CAC CTG GGG ATG GTG GTG 1656 Phe Val Leu Asn Asn Gin His. Leu Gliy Met Val Val 530 535 540 CAG TGG GAG GAC AGG TTC TAT AAG GCC AAC AGA GCG 1692 Gin Trp GlU Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala 545 550 CAC ACA TAC TTG GGA AAC CCA GAG AAT GAA AGT GAG 1728 His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro GlU A$n GlU Ser GlU 555 560 ATA TAT CCA GAT TTC GTG ACG ATC GCC AAA GGG TTC 1764 Ile Tyr Pro Asp Phe val Thr Ile Ala Lys Gly Phe 565 570 575 AAC ATT CCA GCG GTC CGT GTG ACA AAG AAG AAC GAA 1800 Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys Asn GlU 580 5B5 GTC CGC GCA GCG ATA AAG AAG ATG CTC GAG ACT CCA 1836 val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu GlU Thr Pro 590 595 600 -35-

GGG CCG TAC CTC TTG GAT ATA ATC GTC CCA CAC CAG 1872 Giy Pro Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Vai Pro HiS Gin 605 610 GAG CAT GTG TTG CCT ATG ATC CCT AGT GGT GGG GCT 1908 GlU His Vai Leu Pro Met lie Pro ser Gly Gly Ala 615 620 TTC AAG GAT ATG ATC CTG GAT GGT GAT GGC AGG ACT 1944 Phe Lys Asp Met ile Leu Asp Gly Asp Gly Arg Thr 625 630 635 GTG TAC 1950 Vai Tyr 638

TGATCTAAAA TCCAGCAAG 1969 -36-

Cl

Sequência ID No.: 3

Tipo de Sequência: Nucleótido e Aminoácido Comprimento da Sequência: 1969 PB’s c 638 Aminoácidos Tipo de Cadeia: Simples Topologia: Linear

Organismo Fonte Original: Zea mavs Propriedades: Enzima AHAS Sensível a Herbicidas AACCCTCGCG CCGCCTCCGA GACAGCCGCC GCAACC 36 ATG GCC ACC GCC GCC GCC GCG TCT ACÇ GCG CTC ACT 72 Met Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ala Leu Thr 1 5 10 GGC GCC ACT ACC GCT GCG CCC AAG GCG AGG CGC CGG 108 Gly Ala Thr Thr Ala Ala Pro Lys Ale Arg Arg Arg 15 20 GCG CAC CTC CTG GCC ACC CGC CGC GCC CTC GCC GCG 144 Ala HÍS Leu Leu Ala Thr Arg Arg Ala Leu Ala Ala 25 30 35 CCC ATC AGG TGC TCA GCG GCG TCA CCC GCC ATG CCG 180 Pro Ile Arg Cys ser Ala Ala Ser Pro Ala Met Pro 40 45 ATG GCT CCC CCG GCC ACC CCG CTC CGG CCG TGG GGC 216 Met Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg pro Trp Gly 50 55 60 -37-

Jkt b*. rh C—^ ( wi ccc ACC GAG CCC CGC AAG GGT GCT GAC ATC CTC GTC 252 Pro Thr GlU pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val 65 70 QAG TCC CTC GAG CGC TGC GGC GTC CGC GAC GTC TTC 288 GlU Ser Leu GlU Arg Cys Gly Vai Arg Asp Vai Phe 75 80 GCC TAC CCC GGC GGC GCG TCC ATG GAG ATC CAC CAG 324 Ala Tyr Pro Gly Gly Ala ser Met GlU Ile His Gin 85 90 95 GCA CTC ACC CGC TCC CCC GTC ATC GCC AAC CAC CTC 360 Ala Leu Thr Arg ser Pro Vai Ile Ala Asn Kis Leu 100 105 TTC CGC CAC GAG CAA GGG GAG GCC TTT GCC GCC TCC 396 Phe Arg Hls GlU Gin Gly GlU Ala Phie Ala Ala Ser 110 115 120 GGC TAC GCG CGC TCC TCG GGC CGC GTC GGC GTC TGC 432 Gly Tyr Ala Arg ser Ser Gly Arg V4l Gly val cys 125 130 ATC GCC ACC TCC GGC ccc GGC GCC ACC AAC CTA GTC 468 He Ala Thr ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val 135 140 TCC GCG CTC GCC GAC GCG CTG CTC GAT TCC GTC CCC 504 Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu ASP ser Val Pro 145 150 155 ATG GTC GCC ATC ACG GGA CAG GTG CCG CGA CGC ATG 540 Met Vai Ala Ile Thr Gly Gin Vai Pro Arg Arg Met 160 165 -38- C_-—-_v {ί--χ ATT GGC ACC GAC GCC TTC CAG GAG ACG CCC ATC GTC 57 6 Trp Gly Thr Asp Ala Phe Gin GlU Thr Pro Ile Val 170 175 ISO GAG GTC ACC CGC TCC ATC ACC AAG CAC AAC TAC CTG 612 GlU Vai Thr Arg Ser Ile Thr Lys HÍS Asn Tyr Leu 185 190 GTC CTC GAC GTC GAC GAC ATC CCC cqc GTC GTG CAG 648 Vai Leu Asp Vai Asp Asp lie Pro Arg Val Val Gin 195 200 GAG GCT TTC TTC CTC GCC TCC TCT G0T CGA CCA GGG 684 GlU Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly 205 210 215 CCG GTG CTT GTC GAC ATC CCC AAG GAC ATC CAG CAG 720 Pro Vai Leu val Asp Ile pro Lys Asp Ile Gin Gin 220 225 CAG ATG GCG GTG CCT GTC TGG GAC AAG CCC ATG AGT 756 Gls Met Ala Val Pro Val Trp Asp Lys pro Met Ser 230 235 240 CTG CCT GGG TAC ATT GCG CGC CTT CCC AAG CCC CCT 792 Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys Pro Pro 245 250 GCG ACT GAG TTG CTT GAG CAG GTG CTG CGT CTT GTT 828 Ala Thr Glu Leu Leu GlU Gin Val Leu Arg Leu Val 255 260 GGT GAA TCG CGG CSC CCT GTT CTT TAT GTG GGC GGT Gly Glu Ser Arg Arg Pro Val Leu Tyr Vai Gly Gly 265 270 275 864

-39-Ãt rfr M GC6 TGC GCA GCA TCT GGT GAG GAG TTG CGA CGC TTT 900 Ala cys Ala Ala Ser Gly GlU Glu Leu Arg Arg Phe 280 285 GTG GAG CTG ACT GGA ATC CCG GTC ACA ACT ACT CTT 936 Vai G1U Leu Thr Gly Ile Pro val Thr Thr Thr Leu 290 295 300 ATG GGC CTC GGC AAC TTC CCC AGC GAG GAC CCA CTG 972 Het Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser ASp Asp Pro Leu 305 310 TCT CTG CG C ATG CTA GGT ATG CAT GGÇ ACG GTG TAT 1008 ser Leu Arg Het Leu Gly Het Kis Gly Thr val Tyr 315 320 GCA AAT TAT OCA GTG GAT AAG GCC GAy CTG TTG CTT 1044 Ala Asn Tyr Ala Vai ASp Lys Ala Asp Leu Leu Leu 325 330 33S GCA CTT GGT GTG CGG TTT GAT GAT CGT GTG ACA GGG 1080 Ala Leu Gly Vai Arg Phe Asp ASp Artg Val Thr Gly 340 345 AAG ATT GAG GCT TTT GCA AGC AGG GQT AAG ATT GTG 1116 Lys lie Glu Ala Phe Ala ser Arg Ala Lys Ile Val 350 355 360 CAC GTT GAT ATT GAT CCG GCT GAG ATT GGC AAG AAC 1152 His Vai Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn 365 370 AAG CAG CCA CAT GTG TCC ATC TGT GÇA GAT GTT AAG 1188 Lys Gin Pro His Vai ser ile cys Ala Asp Val Lys 375 380 -40- αττ GCT ττβ CAG GGC ATG AAT GCT CTT CTT GAA GGA 1224 Leu Ala Leu Gin Gly Met Asn Ala Leu Leu Glu Gly 385 390 395 AGC ACA TCA AAG AAG AGC TTT GAC TTT GGC TCA TGG 1260 Ser Thr ser Lys Lys Ser Phe Asp phe ely Se» Trp 400 405 AAC GAT GAG TTG GAT CAG CAG AAG AG6 GAA TTC CCC 1296 Asn Asp Glu Leu Asp Gin Gin Lys Arg Glu Phe Pro 410 415 420 CTT GGG TAT AAA ACA TCT AAT GAG GAp ATC CAG CCA 1332 Leu Gly Tyr Lys Thr Ser Asn GlU GlU ile Gin Pro 425 430 CAA TAT GCT ATT CAG GTT CTT GAT GAG CT.G ACG AAA 1368 Gin Tyr Ala Zle Gin Val Leu Asp GlU Leu Thr Lys 435 440 GGC GAG GCC ATC ATC GGC ACA GGT G7|T GGG CAG CAC 1404 Gly Glu Ala Ile Xle Gly Thr Gly vai Gly Gin His 445 450 455 CAT ATG TGG GCG GCA CAG TAC TAC ACT TAC AAG CGG 1440 Gin Met Trp Ala Ala Gin Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg 460 465 CCA AGG CAG TGG TTG TCT TCA GCT GGT CTT GGG GCT 1476 Pro Arg Gin Trp Leu Ser ser Ala Gí.y Leu Gly Ala 470 475 480 ATG GGA TTT GGT TTG CCG GCT GCT GCT GGT GCT TCT 1512 Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ser 485 490 41 - 41 - ^x b*.rfr GTG GCC AAC CCA GGT GTC ACT GTT GTT GAC ATC GAT 1548 vai Ala Asn Pro Gly Vai Thr Vai Vai Asp ile Asp 495 500 GGA GAT GGT AGC TTT CTC ATG AAC GTT CAG GAG CTA 1584 Gly Asp Gly ser ?ne Leu Met; Asn Vai Gin GlU Lau 505 510 515 GCT ATG ATC CGA ATT GAG AAC CTC CCA GTG AAG GTC 1620 Ala Met Ile Arg Ile GlU Asn Leu Pro val Lys Val 520 525 TTT GTG CTA AAC AAC CAG CAC CTG GGG ATG GTG GTG 1656 Phe vai Leu Asn Asn Gin His Leu Gly Met vai Val 530 535 540 CAG TGG GAG GAC AGG TTC TAT AAG eàc AAC AGA GCG 1692 Gin Trp GlU Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala 545 550 CAC ACA TAC TTG GGA AAC CCA GAG AAT GAA AGT GAG 1728 HiS Thr Tyr Leu Gly Asn Pro GlU Asn GlU ser GlU 555 560 ATA TAT CCA GAT TTC GTG ACG ATC GCC AAA GGG TTC 1764 Ile Tyr Pro Asp Phe Vai Thr Ile Ala Lys Gly Phe 565 570 575 AAC ATT CCA GCG GTC CGT GTG ACA aAg AAG AAC GAA 1800 Asn Ile Pro Ala Vai Arg Vai Thr Lys Lys Asn GlU 580 585 GTC CGC GCA GCG ATA AAG AAG ATG CTC GAG ACT CCA 1836 vai Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu GlU Thr Pro 590 595 600 -42- GGG CCG TAC CTC TTG GAT ATA ATC GTC CCA CAC CAG 1872

Gly Pro Tyr Leu Leu Aap Ile Ile Vai Pro Bis Gin 60S 610 GAG CAT GTG TTG CCT ATG ATC CCT AGT GGT GGG GCT 1908

Glu Bis Vai Leu Pro Met ile pro s«* βΐγ βΐγ Ala 615 620 TTC AAG GAT ATG ATC CTG GAT GGT GA? GGC AGG ACT 1944

Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly Ar? Thr 625 630 635 GTG TAC 19S0 val Tyr 638 TGATCTAAAA TCCAGCAAG 1969

Lisboa, 29 de Julho de 2001 ^ ^—“t'

ALBERTO CANELAS Agente Oficiai da Propriedade Industria) RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims (14)

1. -1- • » ’ Aí CL—_λ_ (ci REVINDICACÕES 1. Uma sequência de ácidos nucleícos monocotiledónea que codifica uma enzima AH AS funcional, cuja enzima tem substituição de amino-ácido relativamente a uma enzima AHAS monocotiledónea de tipo selvagem, cuja substituição confere à enzima resistência específica a imidazolinona. ·
2. 2. A sequência de ácidos nucleícos da Reivindicação 1 na qual a enzima AHAS funcional tem uma substituição de amino-ácido na posição 621 no milho ou a correspondente substituição em monocotiledóneas outros que não o milho.
3. 3. A sequência da Reivindicação 2 na qual o amino-ácido substituto é asparagina.
4. 4. Uma enzima AHAS monocotiledónea funcional que tem pelo menos uma substituição de amino-ácido relativamente a uma enzima AHAS monocotiledónea de tipo selvagem para conferir à enzima resistência específica a imidazolinona.
5. 5. Uma enzima AHAS monocotiledónea funcional de acordo com a Reivindicação 4 que tem uma substituição de amino-ácido.
6. 6. A enzima da Reivindicação 4 na qual o monocotiledónea é milho e a substituição é na posição 621 na enzima AHAS de milho do tipo selvagem. -2-
7. 7. A enzima da Reivindicação 6 na qual o amino-ácido substituto é asparagina.
8. 8. Um vector de transformação compreendendo o ácido nucleíco da Reivindicação 1.
9. 9. Uma célula hospedeira compreendendo a sequência de ácidos nucleícos da Reivindicação 1, ou o vector da Reivindicação 8.
10. 10. A célula hospedeira da Reivindicação 9 que é uma célula de planta ou uma célula bacteriana.
11. 11. Uma planta madura ou uma semente ou pólen da mesma, com resistência específica a imidazolinona, , contendo a sequência de ácidos nucleícos da Reivindicação 1.
12. 12. Um método para conferir resistência específica a imidazolinona a uma célula de planta que compreende prover a célula da planta com a sequência de ácidos nucleícos da Reivindicação 1.
13. 13. Um método de selecção de células hospedeiras transformadas com sucesso com um gene de interesse que compreende a provisão das células hospedeiras esperadas com o gene de interesse ligado à sequência de ácidos nucleícos da Reivindicação 1, ou não ligado mas na presença da sequência de ácidos nucleícos da Reivindicação 1, o crescimento das células na presença de uma quantidade inibitória de imidazolinona e a identificação das células -3- sobreviventes como contendo o gene de interesse.
14. 14. Uma construção de ácidos nucleícos compreendendo a sequência de ácidos nucleícos da Reivindicação 1 ligado a um gene que codifica uma característica agronomicamente útil. Lisboa, 29 de Janeiro de 2001 </ K" ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade industria! RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA