JPH05227964A

JPH05227964A - イミダゾリノン耐性ａｈａｓ変異体

Info

Publication number: JPH05227964A
Application number: JP4218812A
Authority: JP
Inventors: Gabriele Elfriede Dietrich; ガブリーレ・エルフリーデ・デイートリヒ
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1992-07-27
Publication date: 1993-09-07
Anticipated expiration: 2019-04-26
Also published as: BR9202950A; FI923444L; AU4335296A; HU9202485D0; IE922504A1; ZA925734B; CA2074854A1; AU2069492A; PT525384E; CA2074854C; KR100243996B1; FI114922B; FI923444A0; US5767361A; EP0525384A3; HUT65483A; MX9204420A; HU218108B; JP3523657B2; US5731180A

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は、イミダゾリノン除草剤に対して特
異的な耐性を示す変異型ＡＨＡＳ酵素をコードする単子
葉植物遺伝子に関する。これらの遺伝子の例は、野生型
ＡＨＡＳ酵素の位置６２１に在るアミノ酸置換をコード
するトウモロコシＤＮＡ配列である。【効果】この変異遺伝子を用いることで、他の植物を
形質転換して除草剤耐性を示すようにすることができ、
これに関して、本発明はまた、この遺伝子を含んでいる
宿主細胞およびベクターも提供し、そしてこれらの細胞
およびベクターは、形質転換方法で有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ
酵素（以後ＡＨＡＳ）の新規変異形態をコードする新規
なＤＮＡ配列に関する。このＡＨＡＳ酵素は、種々の植
物および幅広い範囲の微生物中で常規に産生される重要
な酵素である。正常なＡＨＡＳ機能は、イミダゾリノン
除草剤によって阻害されるが、しかしながら、変異型Ｄ
ＮＡ配列がコードした新しいＡＨＡＳ酵素は、イミダゾ
リノン除草剤存在下でも、触媒的に正常な機能を示し、
従って、それらを含んでいる植物もしくは微生物に対し
て耐除草剤性を与える。

【０００２】この新規なＤＮＡ配列はトウモロコシから
誘導され、そしてこれらは、正常なＡＨＡＳ配列の位置
６２１にアミノ酸置換を有している。このＡＨＡＳ遺伝
子配列中の上記置換の結果として、充分な機能を示す酵
素を与えるが、この酵素は、種々のイミダゾリノン除草
剤による阻害に対して特異的な耐性を示すようになる。
このような変異配列が利用できるようになると、異なる
作物植物を形質転換してイミダゾリノン除草剤に耐性を
示すようにするための道具が得られると共に、他の種類
の遺伝的形質転換実験で用いるための新規な選択性マー
カーが得られることになる。

【０００３】

【発明の背景】農業における除草剤の使用は今や広く普
及している。雑草を有効に死滅させる数多くの利用でき
る化合物が存在しているが、必ずしも全ての除草剤が、
作物植物よりも高い選択性で、望まれていない植物を駆
除するものでもなく、また動物に対して毒性を示さない
ものでもない。しばしば、雑草よりも作物植物に対して
若干のみ低い毒性を示す化合物で我慢する必要がある。
この問題に打ち勝つ目的で、除草剤に耐性を示す作物植
物の開発が農業研究の主要焦点になってきた。

【０００４】除草剤耐性の開発に関する重要な点は、除
草剤の標的部分を理解することと、そして次に、植物の
正常な生物学的機能を維持しながら阻害効果を回避する
ことができるように、作物植物中の影響を受けた生化学
的経路を操作することである。除草剤が有する生化学的
機構に関する最初の発見の１つは、構造的に無関係な一
連の除草剤化合物、即ちイミダゾリノン類、スルホニル
尿素類およびトリアゾロピリミジン類に関するものであ
った。上記除草剤の各々は、植物の成長にとって必要な
必須酵素、即ちアセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡ
Ｓ；アセトラセテートシンターゼ、またはＡＬＳとも呼
ばれる）を阻害することによって植物の成長を抑制す
る、ことが今日では知られている（Shaner他、 Plant Ph
ysiol. 76:545-546、 1984; 米国特許番号4,761,373）。
ＡＨＡＳは、アミノ酸であるイソロイシン、ロイシンお
よびバリンの合成にとって必要である。

【０００５】このＡＨＡＳ酵素は高等植物全体に渡って
存在している、ことが知られており、そしてまた、種々
の微生物、例えば酵母菌であるビール酵母菌（Saccharo
myces cerevisiae）、および腸内細菌である大腸菌（Es
cherichia coli）およびネズミチフス菌（Salmonella t
yphimurium）などの中で見つけだされている。数多くの
上記種中での正常なＡＨＡＳ産生に関する遺伝的基盤も
また、よく特徴づけされている。例えば、大腸菌および
ネズミチフス菌の両方に、ＡＨＡＳのイソ酵素が３種存
在しており、そしてこれらの２つは除草剤に対して敏感
であるが、一方その３番目のものは敏感でない。上記イ
ソ酵素の各々は、１つの大型蛋白質サブユニットと１つ
の小型蛋白質サブユニットを有しており、そしてＩｌｖ
ＩＨ、ＩｌｖＧＭおよびＩｌｖＢＮオペロンに対して配
置している。酵母中、この単一ＡＨＡＳイソ酵素はＩＬ
Ｖ２座位に対して位置している。各場合共、敏感性を示
す形態と耐性を示す形態が同定されており、そして種々
のアレレの配列が決定されている（Friden他、 Nucl. Ac
id Res. 13:3979-3993、 1985; Lawther他、 PNAS USA 7
8: 922-928、 1982; Squires他、 Nucl. Acid Res. 811:5
299-5313、 1983; Wek他、 Nucl. Acid Res. 13:4011-402
7、 1985; FalcoおよびDumas、 Genetics 109、21-35、 98
5; Falco他、 Nucl. Acid Res. 13:4011-4027、 1985）。

【０００６】タバコ中におけるＡＨＡＳ機能は、連結し
ていない２つの遺伝子ＳｕＲＡおよびＳｕＲＢによって
コードされる。成熟蛋白質におけるヌクレオチドレベル
およびアミノ酸レベルの両方において、上記２つの遺伝
子間に本質的な同一性が存在しているが、Ｎ末端の推定
トランジット領域はより実質的に異なっている（Lee他、
EMBO J. 7: 1241-1248、 1988）。一方、アラビドプシ
ス（Arabidopsis）は単一のＡＨＡＳ遺伝子を有してお
り、これもまた完全に配列決定されている（Mazur他、 P
lant Physiol. 85:1110-1117、 1987）。高等植物中のＡ
ＨＡＳ遺伝子配列間の比較において、この配列の特定領
域に関して高レベルの保存が示されており、詳細には、
少なくとも１０個の領域の配列保存が存在している。こ
のような保存されている領域は該酵素の機能にとって重
要である、と以前から仮定されており、そしてその機能
の保持は実質的配列保存に依存している、と仮定されて
いる。

【０００７】除草剤耐性を示す変異体は、このような保
存領域の１個以上の中に少なくとも１個のアミノ酸変異
を有していることが最近報告された（米国特許番号5,01
3,659）。野生型アミノ酸にとって、特にＡＨＡＳ蛋白
質配列内のこれらの特異的部位中の特定アミノ酸の置換
は耐えられるものである、ことが示され、そして実際、
このような変異を有していながら触媒機能を維持してい
る植物に、除草剤耐性をもたらした。そこに記述されて
いる変異体は、イミダゾリノン類およびスルホニル尿素
に対する交差耐性をコードするか、或はスルホニル尿素
に特異的な耐性をコードするが、しかしイミダゾリノン
に特異的な変異体は全く開示されていない。このような
変異体はタバコ中のＳｕＲＡおよびＳｕＲＢ座位の両方
に存在していることが示されており、そしてアラビドプ
シスおよび酵母菌中の同様な変異体が単離された。

【０００８】数多くの植物において、イミダゾリノンに
特異的な耐性が他にも報告されている。米国特許番号4,
761,373には、一般に、植物における除草剤耐性を基と
した改変ＡＨＡＳが記述されており、そして特に、特定
のイミダゾリノン耐性トウモロコシ系が開示されてい
る。Haughn他、（Mol. Gen. Genet. 211:266-271、 198
8）は、アラビドプシス中に同様な表現型が存在してい
ることを開示している。Sathasivan他 (Nucl. Acd Res.
18:2188、 1990）は、正常なＡＨＡＳ配列中の位置６５
３における変異を基とした、アラビドプシスにおけるイ
ミダゾリノンに特異的な耐性を同定している。本発明に
従い、単子葉植物中の、イミダゾリノンに特異的な耐性
をコードする遺伝子をここに単離し、そしてこれは、野
生型単子葉植物ＡＨＡＳアミノ酸配列中の単一アミノ酸
置換に関連している、ことを見い出した。

【０００９】

【発明の要約】本発明は、イミダゾリノン除草剤に敏感
性を示さない機能的単子葉植物ＡＨＡＳ酵素をコードす
る新規な核酸配列を提供する。問題となる配列は、トウ
モロコシ（Cornまたはmaize）のＡＨＡＳ配列中の位置
６２１に在るアミノ酸セリンをコードするコドンの中
か、或は他の単子葉植物配列中の相当する位置の中の、
変異から成る。他の単子葉植物、例えば小麦もまた、イ
ミダゾリノンに特異的な変異を表すことも知られている
（例えばATCC番号40994-97）。トウモロコシにおいて、
野生型配列は上記位置にセリンを有している。好適な具
体例において、この置換はセリンをアスパラギンに置き
換えることにあるが、セリンに対する代替置換には、ア
スパラギン酸、グルタミン酸、グルタミンおよびトリプ
トファンが含まれる。これらの請求する配列は本来単子
葉植物から誘導されるものであるが、これらの新規な配
列は、全ての種類の植物において、イミダゾリノン耐性
細胞を作り出すための方法に有効であり、そして上記方
法は、ここに提供する改変配列の１個以上を用いて標的
植物細胞を形質転換する、ことから成る。二者択一的
に、変異誘発を用いて、植物細胞中に変異体を作り出す
か、或はイミダゾリノンに敏感性を示さないＡＨＡＳを
コードする核酸配列を含んでいる種子を作り出す。組織
培養物中で単離した変異植物細胞の場合、イミダゾリノ
ン耐性を有するか或はそれに敏感性を示さない特徴を有
する植物を、その後再生させる。従って、本発明はま
た、変異核酸配列を有しておりそして機能的イミダゾリ
ノン耐性ＡＨＡＳ酵素を発現するところの、植物細胞、
細菌細胞、菌・カビ細胞、植物組織培養物、成熟植物、
および植物種子を包含している。

【００１０】このような新規除草剤耐性植物が利用でき
るようになると、イミダゾリノン存在下で作物植物を成
育させる新規な方法が可能になる。耐性を示さない植物
を成育させる代わりに、変異によるか或は本発明の変異
配列で形質転換することによって作り出した耐性植物を
畑に植え、そしてこの畑を、常規的にイミダゾリノン類
で処理しても、作物植物にはいかなる損傷も生じない。

【００１１】本発明の変異核酸配列はまた、形質転換実
験で使用するための新規な選択性マーカーも提供する。
耐性ＡＨＡＳをコードする核酸配列を、宿主細胞に転移
させるに先立って、第二遺伝子に連結した後、この全体
の構築物を宿主細胞に形質転換する。その後、阻害量の
除草剤が存在している培養物中で、推定形質転換細胞を
増殖させ、そして生き残った細胞は、この興味の持たれ
ている第二遺伝子を成功裏に取得している可能性が高
い。二者択一的に、興味の持たれている遺伝子を有する
独立プラスミド上に、上記耐性ＡＨＡＳ遺伝子を共形質
転換することができ、それによって、形質転換体全体の
約５０％が両方の遺伝子を受け取ると予想される。

【００１２】本明細書および全体に渡り以下に示す定義
を適用するものと理解すべきである。「機能的」または
「正常な」ＡＨＡＳ酵素は、必須アミノ酸であるイソロ
イシン、ロイシンおよびバリンの合成経路における第一
段階を触媒し得る酵素である。「野生型」ＡＨＡＳ配列
は、与えられた種の、イミダゾリノンに敏感な１員中に
存在している配列である。「耐性」植物は、変異を受け
ているが機能的ＡＨＡＳ酵素を産生し、そして通常阻害
レベルのイミダゾリノン存在下で成育させたとき成熟に
到達し得る、植物である。ここで用いる言葉「耐性」は
また、「耐えられる」植物、即ち表現型的に、イミダゾ
リノンに対して不利な反応を示すが致死的反応を示さな
い植物、を包含することを意図したものである。

【００１３】

【発明の詳細な記述】本発明の遺伝子は、トウモロコシ
系ＸＩ１２（取得番号75051としてAmericanType Cultur
e Collectionに寄託した種子）から単離可能であり、そ
してこれは、プラスミドｐＸＩ１２／８Ａに挿入されて
いる（取得番号68643としてAmerican Type Culture Col
lectionに寄託）。これはまた、イミダゾリノンに特異
的な除草剤耐性を示す他のいかなる変異体、例えばトウ
モロコシ系ＱＪ２２（取得番号40129としてAmerican Ty
pe Culture Collectionに細胞培養物として寄託）、或
は種々の小麦植物（取得番号40994、40995、40996およ
び40997としてAmericanType Culture Collectionに寄託
した種子）からも単離可能である。例えばイミダゾリノ
ン耐性変異体の１つから得られるＤＮＡを有するファー
ジＥＭＢＬ−３に関するゲノム状ＤＮＡライブラリー、
好適には耐性特徴に関してホモ接合性を示すライブラリ
ーを作り出した後、これを、野生型ＡＨＡＳ配列の全て
もしくは一部を含んでいる核酸プローブを用いてスクリ
ーニングする。

【００１４】トウモロコシにおいて、該ＡＨＡＳ遺伝子
は２つの座位ａｌｓ１およびａｌｓ２に見付け出され
（Burr and Burr、 Trends in Genetics 7:55-61、 199
1）、これらの２つの座位の間の相同性は、ヌクレオチ
ドレベルで９５％である。ＸＩ１２の変異は、染色体５
上の座位ａｌｓ２に対して配置しており、一方非変異遺
伝子は、染色体４上の座位ａｌｓ１に対して配置してい
る（Newhouse他、「イミダゾリノン耐性作物」（imidaz
olinonx-resistant crops）、The Imidazolinon Herbic
ides、 ShanerおよびO'Connor編集、CRC Press、 Boca Ra
ton、 FL出版）。変異ａｌｓ２遺伝子を含んでいるいく
つかのクローン、および非変異ａｌｓ１遺伝子を含んで
いるいくつかを、サザン分析で同定する。両方の種類を
配列決定用ベクターにサブクローン化した後、ジデオキ
シ配列決定方法で配列決定する。

【００１５】野生型および変異ＡＨＡＳ遺伝子の配列決
定および比較を行うことで、位置６２１のアミノ酸をコ
ードするコドン中の単一ヌクレオチドの差を示す（図
５）。特に、この野生型中のセリンをコードするコドン
ＡＧＴが、変異ＡＨＡＳ中のアスパラギンをコードする
ＡＡＴに変化している（図８）。この変異ＡＨＡＳ遺伝
子は、それ以外、野生型遺伝子と同じである、即ち６３
８個のアミノ酸［これらの最初の４０個は、インビボで
クロロプラストの中に輸送されるとき開裂すると考えら
れるシグナルペプチドを構成している］を有する蛋白質
をコードする。ＸＩ１２からのａｌｓ１非変異遺伝子の
配列は、明らかに、Ｂ７３からのａｌｓ１遺伝子と同じ
である。

【００１６】本発明の変異遺伝子は、イミダゾリノン除
草剤に対する耐性を与えるが、スルホニル尿素除草剤に
対する耐性は与えない。耐性を与える除草剤の種類に関
しては、例えば米国特許番号4,188,487；4,201,565；4,
221,586；4,297,128；4,554,013；4,608,079；4,638,06
8；4,747,301；4,650,514；4,698,092；4,701,208；4,7
09,036；4,752,323；4,772,311；および4,798,619に記
述されている。

【００１７】図６に示す核酸配列のみが、イミダゾリノ
ンに特異的な耐性を与えるために使用できる配列ではな
いことは、本分野の技術者に理解されるであろう。同じ
蛋白質をコードするが、遺伝子コードの縮重のため、異
なるヌクレオチド配列を有する、核酸配列も考えられ
る。本発明はまた、上記変異が存在しているＡＨＡＳ配
列をコードするが、耐性もしくは触媒機能には関係して
いない分子の一部の中の、１個以上のサイレントアミノ
酸変化もコードする、遺伝子も包含している。これらの
配列の相当領域に変異を有するところの、他のイミダゾ
リノン耐性単子葉植物から得られる遺伝子配列、も考え
られる。

【００１８】例えば、与えられた部位において化学的に
同等なアミノ酸産生をもたらす、遺伝子配列中の変化が
考えられ、従って、アミノ酸であるアラニン、即ち疎水
性アミノ酸のためのコドンを、他の疎水性残基、例えば
グリシンをコードするコドンで置換するのは容易であ
り、或はより高い疎水性残基、例えばバリン、ロイシン
またはイソロイシンで置換することもできる。同様に、
負に電荷した１つの残基を他の残基の代わりに用いる、
例えばグルタミン酸をアスパラギン酸に置き換えるか、
或は正に電荷した１つの残基を他の残基の代わりに用い
る、例えばアルギニンをリジンに置き換えること、など
の変化も、生物学的に同等な産生物を与えると期待され
得る。本発明はまたキメラ遺伝子も包含しており、ここ
では、該トウモロコシＡＨＡＳ遺伝子の置換された一部
を、他の種から得られる正常なＡＨＡＳ遺伝子の未変化
部分と再結合させる。従って、本明細書および請求の範
囲全体に渡って、言葉「イミダゾリノンに特異的な耐性
を示すトウモロコシＡＨＡＳ遺伝子」を用いる場合、こ
れは、上記代替具体例の各々、並びに図６の配列、を包
含することを意図している。

【００１９】本発明の単離ＡＨＡＳＤＮＡ配列は、標
的作物植物を形質転換してイミダゾリノン耐性を与える
に有効である。現在では、外因性ＤＮＡを用いた高等植
物の直接もしくは間接形質転換を達成するための、幅広
い範囲の技術が存在しており、そして本発明では、この
新規な配列を宿主ゲノムの中に組み込むことができ、そ
して安定にその子孫に受け継がせることができる、いか
なる方法も考えられる。イミダゾリノンに特異的な耐性
特徴は、単一の優性核遺伝子として受け継がれる。この
イミダゾリノン耐性レベルは、この遺伝子がホモ接合状
態で存在しているとき上昇し、このようなトウモロコシ
植物は、例えば、非耐性植物のそれの約１，０００倍か
ら成る耐性レベルを有している。しかしながら、この特
徴に対してヘテロ接合を示す植物は、非耐性植物のそれ
の約５０〜５００倍から成る耐性を示す。

【００２０】植物細胞の形質転換は、ベクターを用いて
仲介させることができる。形質転換を達成するための普
通の方法は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス
（Agrobacterium tumefaciens）を用いて、外来遺伝子
を標的植物細胞に導入することである。例えば、Ｔｉ−
プラスミドのＴ−ＤＮＡ中のフランキング配列を含んで
いるプラスミドベクターに該変異ＡＨＡＳ配列を挿入す
る。その後、このプラスミドを大腸菌に形質転換する。
この菌株と、Ｔ−ＤＮＡ配列を含んでいるＡＨＡＳを該
標的植物染色体に転移させるに必要な毒性機能を有する
武装解除Ｔｉ−プラスミドを含んでいるアグロバクテリ
ウム菌株と、大腸菌からアグロバクテリウムへの該ＡＨ
ＡＳ構築物の転移を可能にするに必要な配列を有するプ
ラスミドを含んでいる第二大腸菌株、との間の３親交配
を行う。植物の形質転換に必要な配列を含んでいる組換
え型アグロバクテリウム菌株を、葉の盤を感染させるた
めに用いる。盤を選択用培地上で増殖した後、成功裏に
形質転換した再生物を同定する。この回収した植物は、
除草剤存在下で成育させたとき、その除草剤の影響に対
して耐性を示す。植物ウイルスもまた、外因性ＤＮＡの
転移を行うための可能な手段を与える。

【００２１】植物細胞の直接的吸収も利用できる。典型
的には、標的植物のプロトプラストを、転移すべきＤＮ
Ａ、およびプロトプラストによるＤＮＡの吸収を促進す
る薬剤、が存在している培養物の中に置く。これに関し
て有効な薬剤はポリエチレングリコールまたは燐酸カル
シウムである。

【００２２】二者択一的に、エレクトロポレーションを
用いてＤＮＡ吸収を刺激することができる。この方法で
は、電気パルスを用いて、プロトプラスト細胞膜の中に
一時的な穴を開けた後、この穴を通して、その回りにあ
る溶液中のＤＮＡを細胞の中に引き込ませる。同様に、
ミクロ注入を用いて、該ＤＮＡを直接細胞の中に配達す
ることもでき、好適には、細胞の核の中に直接配達する
ことができる。

【００２３】前記技術の各々において、培養中の植物細
胞の中で形質転換が生じる。この形質転換を生じさせた
後、これらの植物細胞を完全な植物に再生させる必要が
ある。カルスもしくはプロトプラスト培養物から成熟植
物に再生させる技術は、数多くの異なる種に関して今日
ではよく知られている（例えば、「植物細胞培養のハン
ドブック」（Handbook of Plant Cell Culture）、 1-5
巻、 1983-1989 McMillan、 N.Y.参照）。従って、形質転
換を達成した後、この形質転換した植物細胞から成熟植
物を再生させることは本技術の知識内である。

【００２４】今日では、形質転換する目的で、必ずしも
単離した細胞を用いる必要がない、従って、植物再生技
術を用いる必要がない代替方法が利用できる。これらは
一般に、「弾道」または「粒子促進」方法と呼ばれてお
り、ここでは、火薬充填（Klein他、 Nature 327: 70-7
3、 1987）または電気放電（EPO 270 356）のどちらか
で、ＤＮＡをコートした金属粒子を植物細胞の中に入れ
る。この方法では、培養中の植物細胞か、或は植物の再
生産性器官または細胞、例えば花粉が、興味の持たれて
いるＤＮＡ配列で安定に形質転換され得る。

【００２５】特定の双子葉植物および単子葉植物では、
ＤＮＡの直接的吸収が好適な形質転換方法である。例え
ば、トウモロコシでは、培養した細胞の細胞壁を、１種
以上の細胞壁分解酵素、例えばセルラーゼ、ヘミセルラ
ーゼおよびペクチナーゼが入っている緩衝液中で消化さ
せて、生存可能なプロトプラストを単離する。これらの
プロトプラストを数回洗浄して、上記酵素を除去した
後、興味の持たれている遺伝子を含んでいるプラスミド
ベクターと混合する。これらの細胞を、ＰＥＧ（例えば
２０％のＰＥＧ４０００）を用いるかエレクトロポレー
ションで形質転換することができる。これらのプロトプ
ラストを、ニトロセルロースフィルター上に置き、そし
て支持培養物として機能するトウモロコシ細胞を埋め込
んだ培地の上で培養する。２〜４週後、該ニトロセルロ
ースフィルター中の培養物を、イミダゾリノンが約０．
３２μＭ入っている培地の上に置き、そしてこの培地中
に１〜２カ月間維持する。これらの植物細胞を有するニ
トロセルロースフィルターを、２週毎、除草剤と保護細
胞とが入っている新鮮な培地に移す。形質転換しなかっ
た細胞は増殖を止め、そして数週間後に死滅する。

【００２６】本発明は、単子葉および双子葉両方の、実
際上全ての種類の植物を形質転換するために応用でき
る。形質転換して除草剤耐性を与えようとする作物植物
の中には、トウモロコシ、小麦、米、キビ、カラス麦、
大麦、モロコシ、ヒマワリ、サツマイモ、アルファルフ
ァ、サトウダイコン、アブラナ種、トマト、コショウ、
大豆、タバコ、メロン、カボチャ、ジャガイモ、ピーナ
ッツ、綿、またはカカオがある。この新規な配列はま
た、鑑賞用種、例えばバラ、および木の種類、例えば松
およびポプラなどを形質転換するためにも使用できる。

【００２７】本発明の新規な配列はまた、植物遺伝学研
究における選択性マーカーとしても有効である。例え
ば、植物の形質転換において、イミダゾリノン耐性をコ
ードする配列を興味の持たれている遺伝子に連結させ
て、これを、イミダゾリノンに敏感な標的植物細胞を形
質転換するために用いる。この興味の持たれている遺伝
子とイミダゾリノン耐性配列の両方を含んでいる構築物
を植物細胞の中に導入した後、これらの植物細胞を、阻
害量のイミダゾリノン存在下で増殖させる。二者択一的
に、別のプラスミド上に存在している興味の持たれてい
る第二遺伝子を、宿主細胞に共形質転換することができ
る。上記処理で生き残る植物は、恐らくは該耐性遺伝子
と共に該興味の持たれている遺伝子を取得しており、従
って、形質転換体のみが、該除草剤を伴う選択過程で生
き残る。両方の遺伝子に関する成功した形質転換および
発現の確認は、ゲノム状ＤＮＡのサザンハイブリッド形
成か、ＰＣＲか、或はこれらの遺伝子の表現型発現の観
察によって達成され得る。

【００２８】以下に示す非制限的実施例によって本発明
を更に詳しく説明する。

【００２９】

【実施例】

１．ＸＩ１２に関する完全植物の除草剤耐性の立証１０日令からＶ３葉段階（葉４〜５枚中の３枚が、見る
ことが可能な小舌を有している）まで、ＸＩ１２植物を
除草剤で処理する。イマゼタピルを、２０００、５０
０、２５０、１２５および６２．５ｇ／ｈａから成る割
合で使用する。クロルスルフロンは３２、１６、８、４
および２ｇ／ｈａで使用する。発芽後、４００Ｌ／ｈａ
から成る噴霧容積で植物を処理する。噴霧後、更に一層
の観察を行うため、温室の中に植物を置く。

【００３０】ＸＩ１２植物は、全ての割合のイマゼタピ
ル処理で、影響を受けなかったが、しかしながら、クロ
ルスルフロンに対する耐性の上昇は全く見られない。従
って、完全植物レベルで、ＸＩ１２は、イミダゾリノン
に対する選択的耐性を示している（図１参照）。

【００３１】ＸＩ１２における耐性は核遺伝子の単一優
性アレレとして受け継がれる、ことも示されている。ヘ
テロ接合耐性ＸＩ１２を自殖させ、そしてこの自殖させ
た子孫は、核遺伝子の単一優性アレレで期待される３耐
性：１敏感の比率で分かれる。この試験で、耐性に関す
る分離を確立する目的で、上述した噴霧プロトコルの
後、致死量（１２５または２５０ｇ／ｈａ）のイマゼタ
ピルを、上記分離用苗に噴霧する。

【００３２】２．ＡＨＡＳ抽出日／夜の温度を８０℃に維持しそして日照時間を１５時
間にした温室中の土壌に、ＸＩ１２の種子を植え付け
る。植え付け後２週間で植物を収穫する。この新芽の基
底部分を用いてＡＨＡＳを抽出する。この組織の５ｇを
液体窒素中で粉末にした後、１０ｍＭのピルビン酸塩、
５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｕＭの
ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）、１ｍＭの
バリン、１ｍＭのロイシン、１０％のグリセロールおよ
び１０ｍＭのシステインが入っている１００ｍＭの燐酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）から成るＡＨＡＳ分析用
緩衝液中に均一化する。この均一物を１０，０００ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離した後、この上澄み液の３ｍＬ
を、平衡にしたBio-Rad Econo-Desaltingカラム（１０
ＤＧ）上に置き、そして４ｍＬのＡＨＡＳ分析用緩衝液
で溶離する。

【００３３】この生成物、即ちアセトラクテートを、酸
存在下の脱カルボキシル化でアセトインに変換した後、
見積もることで、ＡＨＡＳ活性を測定する。標準的反応
混合物は、１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのピロ燐酸チアミン、１０ｕＭ
のＦＡＤ、および適当濃度の異なる阻害剤が入っている
５０ｍＭの燐酸カリウム（ｐＨ７．０）中の上記酵素を
含有している。この混合物を、実験に応じ３７℃で１〜
３時間培養する。この培養期間の終了時に、この試験管
中のＨ₂ＳＯ₄最終濃度が０．８５％になるようにＨ₂Ｓ
Ｏ₄を添加することで、この反応を停止する。この反応
生成物を６０℃で１５時間脱カルボキシル化する。この
生じてくるアセトインを、クレアチン（０．１７％）と
１−ナフール（４ＮのＮａＯＨ中１．７％）と一緒に培
養することで測定する。生じてくる色複合体の吸収を５
２０ｎｍで測定する。

【００３４】Ｂ７３、Ａ６１９または他の野生型トウモ
ロコシ系で得られるＡＨＡＳ活性は、１ｕＭのＩ₅₀で、
イマゼタピル（PURSUIT^TM）による阻害に対して高い敏
感性を示す（図１参照）。この観察とは逆に、ＸＩ１２
は、より高い濃度（１００μＭ）のPURSUIT^TMまたはARS
ENAL^TM（イマゼピル）で、酵素活性の７０〜８０％を示
し、そしてSCEPTER^TM（イマゼクイン）の存在下で約７
０％を示す。この結果は、インビトロでのイマゼタピル
に対する耐性に関して、ＸＩ１２で得られるＡＨＡＳ活
性は、Ａ６１９で得られるＡＨＡＳ活性に比較して１０
０倍上昇した、ことを示している。スルホニル尿素類に
対する敏感性に関して、これらの２つの系で得られるＡ
ＨＡＳ活性は、異なる図を与えている。OUST^TM（スルホ
メツロンメチル）１００ｎＭ存在下で、ＸＩ１２が示す
ＡＨＡＳ活性は１５〜２０％のみである。OUST^TM存在下
でのＡ６１９が示すＡＨＡＳ活性は５〜１０％であり、
そしてPURSUIT^TM存在下では１５〜２０％である（図１
参照）。

【００３５】３．ＸＩ１２ＡＨＡＳ遺伝子のクローニ
ングイミダゾリノン耐性トウモロコシ組織培養系から得られ
るＸＩ１２変異体の種子を植えた後、それから得られる
植物は、変異ＡＨＡＳ表現型に関して明らかに分かれ
る。ホモ接合耐性種子材料を得る目的で、一団のＸＩ１
２変異植物を自殖させる。連続した３回の成育季節の
間、除草剤耐性に関して選択した後、これらの種子は、
該変異ＡＨＡＳ遺伝子に関してホモ接合性を示す。ホモ
接合性種子を集め、そしてこれらを用いて、ＡＨＡＳ遺
伝子単離で用いるための苗を育てる。

【００３６】ホモ接合性ＸＩ１２系の、７日令のエチオ
レート化（etiolated）苗からＤＮＡを抽出する。６０
ｇの植物組織を液体窒素下で粉末にした後、１０８ｍＬ
のＤＮＡ抽出用緩衝液［１．４ＭのＮａＣｌ、２．０％
のＣｔａｂ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ム）、１００ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２０ｍ
ＭのＥＤＴＡ、２％のメルカプトエタノール］と５４ｍ
Ｌの水の中に移す。５０〜６０℃で３０分間培養した
後、この懸濁液を同量のクロロホルムで抽出する。同量
の沈澱用緩衝液［１％のＣｔａｂ、５０ｍＭのトリス−
Ｃｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ］を加えること
で、ＤＮＡを沈澱させる。このゲノム状ＤＮＡを精製す
る目的で、６．６ＭのＣｓＣｌと臭化エチジウム中での
高速遠心分離を行う（Ｔｉ８０ローター、５０，０００
ｒｐｍ、２０℃、２４時間）。この精製したＤＮＡを塩
飽和ブタノールで抽出した後、１リットルの透析用緩衝
液［１０ｍＭのトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥ
ＤＴＡ、０．１ＭのＮａＣｌ］に対し、これを３回交換
して、２５時間透析する。このＸＩ１２のゲノム状ＤＮ
Ａの濃度が３１０ｍｇ／ｍＬであることを分光光度計で
測定する。この収量は０．９３ｍｇである。

【００３７】このＸＩ１２のゲノム状ＤＮＡを用いて、
ファージＥＭＢＬ−３に関するゲノムライブラリーを作
る。このＤＮＡを部分的にＭｂｏｌで消化した後、これ
らのフラグメントを、スクロース勾配上で分離して、８
〜２２ｋｂから成る大きさの範囲を生じさせ、これを、
ＥＭＢＬ−３のＢａｍＨ１部位にクローン化する。２．
１ｘ１０⁶個の独立クローンを得た後、このライブラリ
ーを一度増幅させる。このライブラリーのタイターを測
定した結果は、９ｘ１０¹⁰ｐｆｕ／ｍＬである。

【００３８】このＸＩ１２ライブラリーを分析するため
のプローブを得る目的で、ClontechInc.、 CAから購入し
たラムダｇｔ１１中のＷ２２（野生型）ｃＤＮＡライブ
ラリーを、アラビドプシスＡＨＡＳのゲノムクローンか
ら単離した８００ｎｔのＢａｍＨ１プローブでスクリー
ニングする。これらのファージを、密度が５０，０００
ｐｆｕ／１５ｃｍプレート、になるように撒き、ニトロ
セルロースフィルター上に転移させ、６ｘＳＳＣ、０．
２％ＳＤＳ中で２時間、前ハイブリッド形成を行った
後、６ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で一晩、アラビドプ
シスＡＨＡＳプローブにハイブリッド形成させる。１個
の陽性ファージを同定し、更に精製した後、１．１ｋｂ
のＥｃｏＲ１フラグメントのサブクローン化で用いる。
この１．１ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメントをｐＧｅｍＡ
−４にサブクローン化した後、これをプローブとして用
いて、ＸＩ１２のＡＨＡＳ遺伝子を同定する。

【００３９】このＸＩ１２のゲノムライブラリーを１２
枚の１５ｃｍプレート上に撒き（５０，０００ｐｆｕ／
プレートから成る濃度）、そしてＷ２２ＡＨＡＳｃＤ
ＮＡプローブでスクリーニングする。これらのフィルタ
ーを前ハイブリッド形成（２時間）させ、そしてChurch
緩衝液（０．５Ｍの燐酸Ｎａ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％
のＢＳＡ、７％のＳＤＳ）中６５℃でハイブリッド形成
（一晩）させた後、２ｘのＳＳＣ、０．２％のＳＤＳお
よび０．３ｘのＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ中、６５℃で
洗浄する。スクリーニングした全体の７．５ｘ１０⁵ｐ
ｆｕから、１２個の陽性プラークが得られ、そして５個
の陽性クローンを更に精製した後、Chisholm（BioTechn
iques 7:21-23、 1989）に従って単離する。サザン分析
（図２参照）の結果、これらのファージクローンは次の
２つの型のＡＨＡＳクローンを表すことが示された：１
型クローンは、ＡＨＡＳのｃＤＮＡプローブにハイブリ
ッド形成する１つの大型Ｘｂａｌ（＞６．５ｋｂ）フラ
グメントを含んでおり、２型クローンは、該ＡＨＡＳｃ
ＤＮＡプローブにハイブリッド形成する２．７および
３．７ｋｂから成る２つのＸｂａｌフラグメントを含ん
でいた。ＸＩ１２ＤＮＡのゲノムサザンの結果、ゲノ
ム状ＤＮＡを消化した後、該ＡＨＡＳのｃＤＮＡプロー
ブにハイブリッド形成する、ことによって得られるＸｂ
ａｌフラグメントは、該ＸＩ１２ファージクローン中で
同定されたＸｂａｌフラグメントに相当している、こと
が明らかに示された（図３参照）。制限消化およびサザ
ン分析もまた、上記５個のＡＨＡＳクローンの中で、１
つのクローンは変異ａｌｓ２遺伝子を表しており、そし
て４つがａｌｓ１遺伝子を表している、ことを示してい
る。

【００４０】染色体５の上に存在している変異座位に相
当するＡＨＡＳ遺伝子（クローン１２／８Ａ）と、染色
体４上に存在している非変異座位（クローン１２／１７
Ａ）とを、Ｐｓｔｌフラグメント（クローン１２／８
Ａ）またはＸｂａｌフラグメント（１２／１７Ａ）とし
て、配列決定用ベクターpBluescript II KSm113(+)（pK
S+; Stratagene）にサブクローンする。ファージ１２／
１７Ａからの、２．７ｋｂおよび３．７ｋｂのＸｂａｌ
フラグメントの両方共、同定されたＡＨＡＳ遺伝子の１
つの完全なコピーを含んでいる。ＡＨＡＳコーディング
配列に相補性を示すプライマーを用いたジデオキシ配列
決定（Pharmacia T7配列決定用キット）を用いて、上記
各々の配列を得る。

【００４１】ＤＮＡ抽出、ゲノムライブラリーのクロー
ニングおよびこのライブラリーのスクリーニングに関す
る方法は、上記ＸＩ１２ゲノム状ＤＮＡに関して記述し
たのと同様である。Ｂ７３ＡＨＡＳ遺伝子を、Ｘｂａ
ｌフラグメントとしての配列決定用ベクターｐＫＳ＋に
サブクローンした後、配列決定する。該ＳＩ１２ＡＨ
ＡＳ遺伝子に関して記述したのと同様に、ＡＨＡＳコー
ディング配列に相補性を示すプライマーを用いたジデオ
キシ配列決定により、上記配列を得る。

【００４２】Clontech Inc.、 CAから購入したＥＭＢＬ
３に関するＷ２２のゲノムライブラリーをスクリーニン
グする。これらのファージを、密度が５０，０００ｐｆ
ｕ／７インチプレート、になるように撒き、ニトロセル
ロースフィルター上に転移させ、上述したＷ２２ＡＨ
ＡＳｃＤＮＡプローブにハイブリッド形成させる
（［前ハイブリッド形成およびハイブリッド形成条件：
６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１ＸのDenhardの１００
ｍｇ／ｍＬ子ウシ胸腺ＤＮＡ、６５℃、洗浄条件：３Ｘ
ｘＳＳＣ、０．２％のＳＤＳ、６５℃で２時間、そして
０．３ｘＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで２時間］。２個の陽
性ファージ（１２／１Ａおよび１２／４−４）を同定し
た後、更に精製する。

【００４３】Ｗ２２のゲノムクローン１２／１Ａを、
０．７８ｋｂ（ｐＧｅｍＡ−４）および３．０ｋｂ（ｐ
ＧｅｍＡ−１４；Promega）から成る２つのＳａｌｌフ
ラグメントとして、ベクターｐＧｅｍ−Ａ２にサブクロ
ーン化し、そして６．５ｋｂのＸｂａｌフラグメントと
してベクターｐＫＳ＋（ｐＣＤ２００）にサブクローン
化する。ファージ１２−１ＡのサブクローンｐＧｅｍＡ
−１４およびｐＧｅｍＡ−４から作り出したところの、
重ねた欠失をジデオキシ配列決定することによって、上
記Ｗ２２ＡＨＡＳ遺伝子のコーディング鎖配列を得
る。この配列を用いて、ＡＨＡＳ非コーディング鎖に相
補性を示すオリゴヌクレオチドを設計する。該コーディ
ング鎖に相補性を示すプライマーを用いたクローンｐＣ
Ｄ２００のジデオキシ配列決定により、上記非コーディ
ング鎖の配列を得る。該Ｗ２２ＡＨＡＳ遺伝子の配列
に相補させることで、両方のＤＮＡ鎖のプライマーを設
計し、そしてこれらを用いて、該ＸＩ１２およびＢ７３
のゲノムライブラリーから単離したＡＨＡＳ遺伝子を配
列決定する。

【００４４】４．ＱＪ２２ＡＨＡＳ遺伝子のクローニ
ング選択的にイミダゾリノンに耐性を示すところの、トウモ
ロコシ系ＱＪ２２中のＡＨＡＳをコードする遺伝子配列
も決定する。ＱＪ２２のゲノムライブラリーをＥＭＢＬ
３ベクターで調製する。野生型トウモロコシ系Ｗ２２か
ら誘導したＡＨＡＳクローン（Ａ−４）から単離したと
ころの、８５０個のヌクレオチドから成るＳａｌＩ／Ｃ
ｌａＩフラグメントを用いて、８００，０００個のファ
ージから成るライブラリーをスクリーニングする。５個
の陽性ファージを選び、そしてこれらに、２回目のスク
リーニングを受けさせて、このファージを部分的に精製
する。この部分的に精製したファージをＰＣＲで分析し
て、どのクローンがＱＪ２２ａｌｓ１遺伝子を表すか
を決定する。遺伝子に特異的なＳｍａＩ部位を位置４９
５に有する３．７ｋｂのＸｂａＩフラグメントとして、
上記クローンを同定する。上記２番目のスクリーニング
で、このような特性を有する単一陽性クローンの存在を
示す。

【００４５】Promegaから入手した市販キット（Magic P
CR Preps）を用いて、該ＰＣＲ生成物を精製し、そして
この精製したＤＮＡを、Ｔａｑポリメラーゼ配列決定系
「ｆｍｏｌ」で配列決定し、また、ＱＪ２２変異ＡＨＡ
ＳのＤＮＡの鎖両方に関するPromega配列決定分析で、
アミノ酸６２１のためのコドンにおけるＧからＡへのヌ
クレオチド転移を示す。この変異は、ＸＩ１２中で見ら
れる変異と同じであり、そしてこの配列の残りの部分
は、ａｌｓ１遺伝子の典型である。

【００４６】結果これらの変異ＡＨＡＳ遺伝子の配列を、野生型トウモロ
コシ系Ｂ７３およびＷ２２から得られる配列と比較する
（図７参照）。ＡＧＴからＡＡＴへの単一ヌクレオチド
のトランジションを生じさせるところの、位置６２１の
アミノ酸変化以外は、ＸＩ１２変異遺伝子（ＸＩ１２／
８Ａ）とＱＪ２２変異遺伝子と野生型遺伝子とは同じで
ある（図８参照）。このＸＩ１２変異体ＸＩ１２／８Ａ
および野生型Ｂ７３／７−４遺伝子は、位置６３に、追
加的な差を示している。他方、ＸＩ１２／１７Ａにクロ
ーン化した非変異ＸＩ１２ＡＨＡＳ遺伝子は、この変
異ＡＨＡＳ蛋白質の遺伝情報を指定する領域に関し、相
当するＢ７３／１０−２に対して完全な相同性を示して
いる（データは挙げていない）。

【００４７】生物学的材料の寄託以下に示す生物学的材料を、American Type Culture Co
llection、 12301 Parklawn Drive、 Rockville、 Marylan
d、 20857に下記の如く寄託した。

【００４８】プラスミドｐＸ１２／８Ａを有する大腸菌
ＸＬＩＢｌｕｅを、取得番号ATCC68643で、1991年7月3
日に寄託した。

【００４９】ＸＩ１２トウモロコシ種子を、取得番号AT
CC 75051で、1991年7月16日に寄託した。

【００５０】

【表１】

【００５１】

【表２】

【００５２】

【表３】

【００５３】

【表４】

【００５４】

【表５】

【００５５】

【表６】

【００５６】

【表７】

【００５７】

【表８】

【００５８】

【表９】

【００５９】

【表１０】

【００６０】

【表１１】

【００６１】

【表１２】

【００６２】

【表１３】

【００６３】

【表１４】

【００６４】

【表１５】

【００６５】

【表１６】

【００６６】

【表１７】

【００６７】

【表１８】

【００６８】

【表１９】

【００６９】

【表２０】

【００７０】

【表２１】本発明の特徴および態様は以下のとおりである。

【００７１】１．機能的ＡＨＡＳ酵素［この酵素は、
野生型単子葉植物ＡＨＡＳ酵素に比較してアミノ酸置換
を有しており、そしてこの置換が、イミダゾリノンに特
異的な耐性をこの酵素に与えている］をコードする単子
葉植物の核酸配列。

【００７２】２．該単子葉植物がトウモロコシであ
り、そして該置換が、該野生型トウモロコシＡＨＡＳ酵
素中の位置６２１に在る第１項の配列。

【００７３】３．その置換されたアミノ酸がアスパラ
ギンである第２項の配列。

【００７４】４．単子葉植物の野生型ＡＨＡＳ酵素に
比較してアミノ酸置換を有しており、そしてこの置換
が、イミダゾリノンに特異的な耐性をこの酵素に与えて
いる単子葉植物の機能的ＡＨＡＳ酵素。

【００７５】５．該単子葉植物がトウモロコシであ
り、そして該置換が、該野生型トウモロコシＡＨＡＳ酵
素中の位置６２１に在る第４項の酵素。

【００７６】６．その置換されたアミノ酸がアスパラ
ギンである第５項の酵素。

【００７７】７．第１項の核酸を含んでいる形質転換
ベクター。

【００７８】８．第１項の核酸配列か、或は第７項の
ベクター、を含んでいる宿主細胞。

【００７９】９．植物細胞または細菌細菌である第８
項の宿主細胞。

【００８０】１０．第１項の核酸配列か、或はそれか
ら得られる種子または花粉、を有する、イミダゾリノン
に特異的な耐性を示す成熟植物。

【００８１】１１．第１項の核酸配列を植物細胞に与
えることから成る、イミダゾリノンに特異的な耐性を植
物細胞に与える方法。

【００８２】１２．第４項の酵素を産生する植物を、
阻害量のイミダゾリノン存在下で培養することから成
る、イミダゾリノンに特異的な耐性を示す植物を成育さ
せる方法。

【００８３】１３．第１項の核酸配列に連結している
か、或は連結していないが第１項の核酸配列存在下で、
興味の持たれている遺伝子を有望な宿主細胞に与え、阻
害量のイミダゾリノン存在下で上記細胞を培養した後、
この興味の持たれている遺伝子を含んでいるものとして
生存している細胞を同定する、ことから成る、興味の持
たれている遺伝子で成功裏に形質転換した宿主細胞を選
択する方法。

【００８４】１４．農業経営上有益な特性をコードす
る遺伝子に連結させた第１項の配列を含んでいる核酸構
築物。

【図面の簡単な説明】

【図１】イマゼタピル（imazethapyr）（Pursuit^TM A）
またはクロルスルフロン（chorsulfuron）（Oust^TM B）
の存在下での、１０日令のトウモロコシ苗（トウモロコ
シ系Ａ６１９またはＸＩ１２）のＡＨＡＳ酵素活性。阻
害剤無しＡＨＡＳ活性のパーセントとして、除草剤耐性
ＡＨＡＳ活性を計算する。実験間の標準誤差は１０％で
ある。

【図２】ファージＥＭＢＬ３のゲノム状クローンのサザ
ン分析。ファージ１２−１Ａ（Ｗ２２からの）、１２−
７Ａ、１８−８Ａ、１２−１１および１２−１７Ａ（Ｘ
Ｉ１２からの）を、ＸｂａｌまたはＳａｌｌで消化し、
１％アガロースゲル上で分離し、ニトロセルロース上に
転移させた後、プローブとしてのＡＨＡＳｃＤＮＡフ
ラグメントにハイブリッド形成させる。

【図３】トウモロコシ系ＸＩ１２、ＸＡ１７、ＱＪ２
２、Ａ１８８およびＢ７３からのゲノム状ＤＮＡのサザ
ン分析。このＤＮＡを、Ｘｂａｌで消化し、１％アガロ
ースゲル上で分離し、ニトロセルロース上に転移させた
後、プローブとしてのＡＨＡＳｃＤＮＡフラグメント
にハイブリッド形成させる。

【図４】プラスミドｐＣＤ８Ａの制限地図。ＸＩ１２か
らの変異ＡＨＡＳ遺伝子を、８ｋｂのＰｓｔｌフラグメ
ントとして、ベクターｐＫＳ（＋）にサブクローン化し
た。このＡＨＡＳ遺伝子の位置および方向を矢印で示
す。Ｐｓｔｌ、Ｘｈｏｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩお
よびＣｌａＩの制限部位を記号で表す。

【図５】アミノ酸６１４〜６３３領域中の、ＡＨＡＳク
ローンＷ２２／４−４、Ｂ７３／１０−４およびＸＩ１
２／８Ａの非コーディング鎖（Ａ）および二本鎖ＤＮＡ
配列（Ｂ）に関するヌクレオチド配列決定ゲル。シトシ
ンからチミジンへの転位位置を矢印で示す。

【図６】ＸＩ１２／８Ａ変異ＡＨＡＳ遺伝子のヌクレオ
チドおよび推定アミノ酸配列。

【図７】ＸＩ１２／８Ａ変異ＡＨＡＳ遺伝子のヌクレオ
チドおよび推定アミノ酸配列。

【図８】ＸＩ１２／８Ａ変異ＡＨＡＳ遺伝子のヌクレオ
チドおよび推定アミノ酸配列。

【図９】ＸＩ１２／８Ａ変異ＡＨＡＳ遺伝子のヌクレオ
チドおよび推定アミノ酸配列。

【図１０】ＸＩ１２／８Ａ、Ｂ７３／７−４およびＷ２
２／１Ａａｌｓ２遺伝子のヌクレオチド配列の並列。
（＊）は、位置６２１の変異の原因となる塩基変化を示
し、（＃）は、Ｂ７３／７−４配列との差を示し、そし
て（＞）は、サイレント変化を表す。

【図１１】ＸＩ１２／８Ａ、Ｂ７３／７−４およびＷ２
２／１Ａａｌｓ２遺伝子のヌクレオチド配列の並列。
（＊）は、位置６２１の変異の原因となる塩基変化を示
し、（＃）は、Ｂ７３／７−４配列との差を示し、そし
て（＞）は、サイレント変化を表す。

【図１２】ＸＩ１２／８Ａ、Ｂ７３／７−４およびＷ２
２／１Ａａｌｓ２遺伝子のヌクレオチド配列の並列。
（＊）は、位置６２１の変異の原因となる塩基変化を示
し、（＃）は、Ｂ７３／７−４配列との差を示し、そし
て（＞）は、サイレント変化を表す。

【図１３】ＸＩ１２／８Ａ、Ｂ７３／７−４およびＷ２
２／１Ａａｌｓ２遺伝子のヌクレオチド配列の並列。
（＊）は、位置６２１の変異の原因となる塩基変化を示
し、（＃）は、Ｂ７３／７−４配列との差を示し、そし
て（＞）は、サイレント変化を表す。

【図１４】ＸＩ１２／８Ａ、Ｂ７３／７−４およびＷ２
２／１Ａａｌｓ２遺伝子のヌクレオチド配列の並列。
（＊）は、位置６２１の変異の原因となる塩基変化を示
し、（＃）は、Ｂ７３／７−４配列との差を示し、そし
て（＞）は、サイレント変化を表す。

【図１５】ＸＩ１２／８Ａ、Ｂ７３／７−４およびＷ２
２／１Ａａｌｓ２遺伝子のヌクレオチド配列の並列。
（＊）は、位置６２１の変異の原因となる塩基変化を示
し、（＃）は、Ｂ７３／７−４配列との差を示し、そし
て（＞）は、サイレント変化を表す。

【図１６】ＸＩ１２／８Ａ、Ｂ７３／７−４およびＷ２
２／１Ａａｌｓ２遺伝子のアミノ酸配列および並列。
（＊）は、位置６２１の変異を示し、（＃）は、Ｂ７３
／７−４配列との差を示し、そして（＞）は、サイレン
ト変化を表す。

【図１７】ＸＩ１２／８Ａ、Ｂ７３／７−４およびＷ２
２／１Ａａｌｓ２遺伝子のアミノ酸配列および並列。
（＊）は、位置６２１の変異を示し、（＃）は、Ｂ７３
／７−４配列との差を示し、そして（＞）は、サイレン
ト変化を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 5/10 15/60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】機能的ＡＨＡＳ酵素［この酵素は、野生
型単子葉植物ＡＨＡＳ酵素に比較してアミノ酸置換を有
しており、そしてこの置換が、イミダゾリノンに特異的
な耐性をこの酵素に与えている］をコードする単子葉植
物の核酸配列。
【請求項２】単子葉植物の野生型ＡＨＡＳ酵素に比較
してアミノ酸置換を有しており、そしてこの置換が、イ
ミダゾリノンに特異的な耐性をこの酵素に与えている単
子葉植物の機能的ＡＨＡＳ酵素。
【請求項３】請求項１の核酸を含んでいる形質転換ベ
クター。
【請求項４】請求項１の核酸配列か、或は請求項３の
ベクター、を含んでいる宿主細胞。
【請求項５】請求項１の核酸配列か、或はそれから得
られる種子または花粉、を有する、イミダゾリノンに特
異的な耐性を示す成熟植物。
【請求項６】請求項１の核酸配列を植物細胞に与える
ことから成る、イミダゾリノンに特異的な耐性を植物細
胞に与える方法。
【請求項７】請求項２の酵素を産生する植物を、阻害
量のイミダゾリノン存在下で培養することから成る、イ
ミダゾリノンに特異的な耐性を示す植物を成育させる方
法。
【請求項８】請求項１の核酸配列に連結しているか、
或は連結していないが請求項１の核酸配列存在下で、興
味の持たれている遺伝子を有望な宿主細胞に与え、阻害
量のイミダゾリノン存在下で上記細胞を培養した後、こ
の興味の持たれている遺伝子を含んでいるものとして生
存している細胞を同定する、ことから成る、興味の持た
れている遺伝子で成功裏に形質転換した宿主細胞を選択
する方法。
【請求項９】農業経営上有益な特性をコードする遺伝
子に連結させた請求項１の配列を含んでいる核酸構築
物。