CZ331797A3 - Produkty rezistentní na herbicidy vyvíjené na struktuře založeným způsobem - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká na struktuře založeného modelování a vývoje variant kyselina hydroxyoctová syntetasy (AHAS), které jsou rezistentní na imidazoliny a jiné herbicidy, AHAS inhibující herbicidy, jejich AHAS variant, DNA kódující tyto varianty, rostlin, které expr)$ují tyto varianty a metody pro zvládání plevele.

Dosavadní stav techniky

Kyselina hydroxyoctová syntetasa (AHAS) je enzym, který katalyzuje počáteční krok v biosyntese isoleucinu, leucinu a valinu u bakterií, kvasinek a rostlin. Například, zralá AHAS od Zea Mays je přibližně 599-aminokyselinový protein, který je lokalizován na chloroplastech (viz obrázek 1). Enzym využívá thiamin pyrofosfát (TPP) a flavin adenin dinukleotid (FAD) jako kofaktory a pyruvát jako kofaktory pro vytvoření acetolaktátu. Enzym také katalyzuje kondenzaci pyruvátu a 2-ketobutyrátu za tvorby acetohydroxybutyrátu. AHAS je také známá jako acetolaktát syntetasa nebo acetolaktát pyruvát lyasa (karboxylační) a je označen jako EC 4.1.3.18. Aktivní enzym je pravděpodobně alespoň homodimer. Ibdah et al., (Protein Science 3: 479 - S, 1994), v abstraktech, popisuje jeden model pro aktivní místo AHAS.

Mnoho herbicidů včetně imidazolinonových sloučenin jako je imazethapyr (PUPSUIT^R - Američan Cyanamid Company - Wayne, NJ), na sulfonylmočovině založených sloučenin jako je sulfometuron • · · ··· ·

·· ···· ·· _t • · · · · ·· • · ··· · ·t * ♦ · · · ·· • · · · ·· ·· *·* ·· ··· methyl (OUST^R - E.I. du Pont de Nemours and Company

- Wilmington, DE), triazolopyrimidinových sulfonamidů (Broadstrike tm - Dow Elanco; viz Gerwick et al., Pestic. 29: 357 - 364, 1990), sulfamoylmočovin (Rodaway et al., Mechanisms of Selectively of Ac 322, 140 v Paddy Rice, Wheat and Barley, Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference

- Weeds, 1993), pyrimidy1-oxy-benzoových kyselin (Stable^R

- Kumiai Chemical Industry Company, E.I. du Pont de Nemours and Company; viz The Pesticide Manual 10. vydání, str. 888 - 889, Clive Tomlin, vyd., British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Parmham, Surrey G49 7PH, United Kingdom), a sulfonyIkarboxamidy (Alvaro et al., U.S. patent č. 4883914) účinkují inhibicí AHAS enzymatické aktivity, (viz Cheleff et al., Science 224: 1443, 1984; LaRossa et al., J. Biol. Chem. 259: 8753, 1984; Ray, Plant Physiol. 75: 827, 11984; Shaner et al., Plant Physiol., 76: 545, 1984). Tyto herbicidy jsou vysoce účinné a neškodné pro prostředí. Jejich použití je v zemědělství nicméně omezeno nedostatkem jejich selektivity, protože plodiny, stejně jako nežádoucí plevel, jsou senzitivní na fytofoxický účinek těchto herbicidů.

Beďbrook et al., U.S: patent č. 5013659, 5141870 a 5378824, popsal několik sulfonylmočovin rezistentních na AHAS varianty. Nicméně, tyto varianty byly získány bud mutagenizováním rostlin, semen nebo buněk a selekcí mutantů rezistentních na herbicidy, nebo byly odvozeny od takových mutantů. Tento přístup je nepředvídatelný v tom, že spoléhá (alespoň z počátku) na náhodnou šanci zavedení relevantní mutace, spíše než na racionální přístup ve vývoji založený na strukturálním modelu cílového proteinu.

• · • · ·· a kompozice, «· • ·· ··· · · • · · ·· ·€ ·

Tak zde stále ještě existuje potřeba pro metody které poskytují selektivní širokospektrou a/nebo specifickou rezistenci na herbicidy u kultivovaných plodin. Vynálezci objevily, že variantní formy AHAS selektivně rezistentní na herbicidy a rostliny, které je obsahují, mohou být připraveny na struktuře založeným modelováním AHAS proti pyruvát oxidase (POX), identifikováním herbicid vazebných míst na AHAS modelech a projektováním specifických mutací, které mění afinitu herbicidu pro vazbu na vazebné místo. Tyto varianty a rostliny nejsou inhibovány nebo zabíjeny jednou nebo více třídami herbicidů a zachovávají dostatečnou AHAS enzymatickou aktivitu pro podporu růstu plodiny.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 je ilustrací sekvence 600 aminokyselin korespondujících přibližně 599 aminokyselinové sekvenci kyselina hydroxyoctová syntetasy (AHAS) z Zea Mays, která je dána jako příklad AHAS enzymu. Sekvence nezahrnuje transitní sekvenci a zvláštní glycin je pozůstatek ze štěpícího místa pro trombin. Zbytky Met53, Argl28 a Phel35 jsou uvedeny tučně.

Obrázek 2 je ilustrací sestavení sekvence kukuřičné AHAS a pyruvát oxidasy (POX) z Lactobaci1lus planarum.

Obrázek 3 je schematickou representací sekundární struktury AHAS podjednotky. Rádné elementy sekundární struktury, α-šroubovice a β-listu, jsou znázorněny jako kroužky a elipsy, v příslušném pořadí, a jsou počítány separátně pro každou ze tří domén podjednotky. Regiony smyček a závitů jsou reprezentovány černou linkou, s čísly reprezentujícími přibližné začátky a ······ φ φ · φ« ·· • · · φφφφ φφφφ • φφφφ φ · · · φφφ • · φφφ φ φ φ φφφφ φ •φ φφφφ φφφ • Φ ·♦· φφ φφφ «φ φφ konce elementů. Umístění vazebných míst pro kofaktor a známých mutačních míst je ukázáno oktahedrony a hvězdičkami, v příslušném pořadí.

Obrázek 4 ilustruje počítačem generovaný model aktivního místa kukuřičné AHAS s imazethapyrem (PURRSUIT^R herbicid) modelovaným do vazebného místa.

Obrázek 5 je ilustrací homologie mezi AHAS aminokyselinovou sekvencí odvozenou z různých druhů rostlin. pAC 751 je kukuřičný ais 2 AHAS izonezym jak je exprivován z pAC 751 E. coli expresního vektoru jak je uvedeno na obrázku 1; kukuřičný ais 2 je kukuřičný ais 2 AHAS izoenzym; kukuřičný ais 1 je kukuřičný ais 1 AHAS izoenzym; Tabák 1 je tabákový AHAS SurB izoenzym; Athcsr 12 je Arabinopsis thaliana Csr 1.2. AHAS gen; Bnaal 3 je Brassica napus AHAS III izoenzym; a Bnaal 2 je Brassica napus AHAS II izoenzym.

pAC 751 a kukuřičný ais 2 jsou identické geny s tou výjimkou, Že kukuřičný ais 2 začíná v počátku transitní sekvence a pAC 751 začíná v putativním zralém N-terminálním místě a dalším glycinem na N-konci v důsledku sekvence rozpoznávající trombin v pGEX-2T expresním vektoru. N-terminální glycin není zralou aminokyselinou v této pozici.

Sestavení aminokyselinové sekvence AHAS proteinů bylo generováno PILEUP (GCG Package - Genetics Computer Group, lne., - University Research Park - Madison-WI). Konsensuální sekvence byla generována PRETTY GCG Package).

Obrázek 6 je fotografickou ilustrací SDS-polyakrylamidového

• ·· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · · • · 9 ·

99· « · ·· gelu barveného na proteiny ukazující purifikaci kukuřičné AHAS. Linie obsahují (zleva doprava): A, markey molekulové hmotnosti; B, surový extrakt z E. coli; C, glutathion agarosa afinitně purifikovaný přípravek; D: trombinové trávení afinitně purifikovaného přípravku; E: druhý běh přes glutathion-agarosovou kolonu a Sephacryl S-100 gelovou filtraci.

Obrázek 7 je grafickým znázorněním výsledků in vitro testů na enzymatickou aktivitu přirozených a mutantních AHAS proteinů za absence a za přítomnosti zvýšených koncentrací imazethapyru (PURRSUIT^R herbicid). Osa Y representuje % aktivity mutantního enzymu, kde 100% hodnota je měřena za absence inhibitoru.

Obrázek 8 je grafickou ilustrací výsledků in vitro testů na enzymatickou aktivitu přirozených a mutantních AHAS proteinů za absence a za přítomnosti zvýšených koncentrací sulfometuron methylu (OUST^R herbicid). Osa Y representuje % aktivity mutantního enzymu, kde 100% hodnota je měřena za absence inhibitoru.

Obrázek 9 je grafickou ilustrací výsledků in vitro testů na enzymatickou aktivitu přirozených a mutantních AHAS proteinů od Arabidopsis za absence a za přítomnosti zvýšených koncentrací imazethapyru (PURSUIT^R herbicide) a sulfometuron methylu (OUST^R herbicid). Osa Y reprezentuje % aktivity mutantního enzymu, kde 100% hodnota je měřena za absence inhibitoru.

Obrázek 10 je grafickou ilustrací výsledků in vitro testů na enzymatickou aktivitu přirozeného AHAS proteinu a Metl24His mutantního AHAS proteinu od Arabidopsis za absence a za přítomnosti zvýšených koncentrací imazethapyru (PURSUIT^R herbicid) a sulfometuron methylu (OUST^R herbicid). Osa

Y representuje % aktivity mutantního enzymu, kde 100% hodnota je měřena za absence inhibitoru.

Obrázek 11 je grafickou ilustrací výsledků in vitro testů na enzymatickou aktivitu přirozeného AHAS proteinu a Argl99Glu mutantního AHAS proteinu od Arabinopsis za absence a za přítomnosti zvýšených koncentrací imazethapyru (PURSUIT^R herbicid) a sulfometuron methylu (OUST® herbicid). Osa Y representuje % aktivity mutantního enzymu, kde 100% hodnota je měřena za absence inhibitoru.

Obrázek 12 je schematickou ilustarcí DNA vektoru použitého pro transformaci rostlin, kde tento vektor obsahuje nptll gen (kódující rezistenci na kanamycin) pod kontrolou 35S promotoru a AHAS gen (přirozený nebo variantní) pod kontrolou Arabidopsis AHAS promotoru.

Obrázek 13 je fotografie ukazující vývoj výhonků tabákových rostlin transformovaných Arabidopsis AHAS genem obsahujícím bud Metl24Ile nebo Argl99Glu mutaci a netransformovaných kontrol. Rostliny byly kultivovány po 18 dnů po přenesení do media obsahujícího 0,25 μΜ imazethapyru.

Obrázek 14 je fotografie ukazující tabákové rostliny transformované Arabidopsis AHAS genem obsahujícím bud Metl24Ile, Metl24His nebo Argl99Glu mutaci a netransformovaných kontrol, které byly postřikovány dvakrát dávkou (100 g/ha) imazethapyru.

Obrázek 15 je fotografie ukazující výsledky germinačních testů provedených za přítomnosti herbicidu CL 299,263

Ί

• · · ··· · » • · · · · • · · · · e· * · · » ·· • · · ·· * · · · · «· (imazamox), které byly provedeny na semenech získaných primárních transformantú tabákových rostlin, které byly transformovány Arabidopsis AHAS genem obsahujícím jednu z Metl24Ile, Metl24His nebo Argl99Glu mutací.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje na struktuře založenou modelační metodu pro produkci AHAS variantních proteinů rezistentních na herbicidy. Metoda obsahuje:

(a) sestavení cílového AHAS proteinu na pyruvát oxidasovém templátu nebo tomuto ekvivalentní AHAS modelování pro odvození trojrozměrné struktury cílového AHAS proteinu;

(b) modelování jednoho nebo více herbicidů do trojrozměrné struktury pro lokalizaci vazebného místa pro herbicid v cílovém AHAS proteinu;

(c) selekci alespoň jedné aminokyselinové pozice v cílovém AHAS proteinu jako cíle pro mutaci, kde mutace pozměňuje afinitu alespoň jednoho herbicidu k vazebnému místu;

(d) mutaci DNA kódující cílový AHAS protein pro produkci mutantní DNA kódující variantní AHAS obsahující mutaci, jako je, například, alespoň jedna odlišná aminokyselina v pozici; a (e) expresi mutované DNA v jedné buňce, za podmínek, za kterých je produkován variantní AHAS obsahující mutaci, jako je, například, odlišná aminokyselina(y) v pozici.

• · · · · · • · · * · · · « • · · * • · · ♦ ♦ kt·

• ·« ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · ··· ·· ··

Metoda může dále obsahovat:

(f) expresi DNA kódující přirozený AHAS protein paralelně ve druhé buňce;

(g) purifikaci přirozených a variantních AHAS proteinů z buněk;

(h) testování přirozených a variantních AHAS proteinů na katalytickou aktivitu v konversi pyruvátu na acetolaktát nebo v kondenzaci pyruvátu a 2-ketobutyrátu za tvorby acetohydroxybutyrátu, za absence a za přítomnosti herbicidu, a (i) opakování kroků (c) - (h), kde je DNA kódující AHAS variantu v kroku (e) použita jako AHAS kódující DNA v kroku (c) , dokud není identifikován první AHAS variantní protein rezistentní na herbicid, který má vlastnosti:

(i) za absence alespoň jednoho herbicidu (a) má katalytickou aktivitu, která je sama dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován; nebo (b) má katalytickou aktivitu v kombinaci s nějakým jiným AHAS variantním proteinem rezistentním na herbicid, který může být stejný nebo jiný než první AHAS variantní protein, která je dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován;

kde buňky vyžadují AHAS aktivitu pro přežívání; a ·· ·· •· « ♦ •· «· • · · · ·· • *· • ·· 4 (ii) má katalytickou aktivitu, která je více rezistentní k alespoň jednomu herbicidu než přirozená AHAS.

Je také poskytnuta alternativní na struktuře založená modelační metoda pro produkci AHAS variantních proteinů rezistentních na herbicidy. Tato metoda obsahuje:

(a) sestavení cílového AHAS proteinu na prvním AHAS templátu odvozeném od polypeptidů majícím sekvenci podle obrázku 1 nebo jeho funkčního kvivalentu pro odvození trojrozměrné struktury cílového AHAS proteinu;

(b) modelování jednoho nebo více herbicidu do trojrozměrné struktury pro lokalizaci vazebného místa pro herbicid v cílovém AHAS proteinu;

(c) selekci alespoň jedné aminokyselinové pozice v cílovém AHAS proteinu jako cíle pro mutaci, kde mutace pozměňuje afinitu alespoň jednoho herbicidu k vazebnému místu;

(d) mutaci DNA kódující cílový AHAS protein pro produkci mutantni DNA kódující variantní AHAS obsahující mutaci v pozici; a (e) expresi mutované DNA v jedné buňce, za podmínek, za kterých je produkován variantní AHAS obsahující mutaci v pozici.

Tato metoda může dále obsahovat:

(f) expresi DNA kódující přirozený AHAS protein paralelně ve druhé buňce;

• · · · · · • · · • · · · · • v · • · · ♦ · * · »

·· 9

9999 •· · · • ·· 9 • · · · 99

99

9999 (g) purifikaci přirozených a variantních AHAS proteinů z buněk;

(h) testování přirozených a variantních AHAS proteinů na katalytickou aktivitu v konverzi pyruvátu na acetolaktát nebo v kondensaci pyruvátu a 2-ketobutyrátu za tvorby acetohydroxybutyrátu, za absence a za přítomnosti herbicidu; a (i) opakování kroků (c) - (h), kde je DNA kódující AHAS variantu v kroku (e) použita jako AHAS kódující DNA v kroku (c), dokud není identifikován první AHAS variantní protein rezistentní na herbicid, který má vlastnosti:

(i) za absence alespoň jednoho herbicidu (a) má katalytickou aktivitu, která je sama dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován; nebo (b) má katalytickou aktivitu v kombinaci s nějakým jiným AHAS variantním proteinem rezistentním na herbicid také exprivovaným v buňce, který může být stejný nebo jiný než první AHAS variantní protein, která je dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován;

kde buňky vyžadují AHAS aktivitu pro přežívání; a (ii) má katalytickou aktivitu, která je více rezistentní k alespoň jednomu herbicidu než přirozená AHAS.

V jiném alternativním provedení metoda obsahuje:

1 • · ♦

templátu a majícím ··

AHAS ·· ·· • · · • · ·· ··· · • · ·· ·· • · · · · · * · · * · · · · * · · • · · «· *·· (a) sestavení cílového AHAS proteinu na prvním majícím identifikované vazebné místo pro herbicid sekvenci podle obrázku 1 nebo jeho funkčním ekvivalentu pro odvození trojrozměrné struktury cílového AHAS proteinu;

(b) selekci alespoň jedné aminokyselinové pozice v cílovém

AHAS proteinu jako cíle pro mutaci, kde mutace pozměňuje afinitu alespoň jednoho herbicidu k vazebnému místu;

(c) mutaci DNA kódující cílový AHAS protein pro produkci mutantní DNA kódující variantní AHAS obsahující mutaci v pozici; a (d) expresi mutované DNA v jedné buňce, za podmínek, za kterých je produkován variantní AHAS obsahující mutaci v pozici.

Tato metoda může dále obsahovat:

(e) expresi DNA kódující přirozený AHAS protein paralelně ve druhé buňce;

(f) purifikaci přirozených a variantních AHAS proteinů z buněk;

(g) testování přirozených a variantních AHAS proteinů na katalytickou aktivitu v konverzi pvruvátu na acetolaktát nebo v kondensaci pyruvátu a 2-ketobutyrátu za tvorby acetohydroxybutyrátu, za absence a za přítomnosti herbicidu; a (h) opakování kroků (b) - (g), kde je DNA kódující AHAS variantu v kroku (d) použita jako AHAS kódující DNA v kroku (b), ·» 9 9 9 9

4 4 ···

4444 •4 •99 •9 · 9 •9 •· · · dokud není identifikován první AHAS variantní protein rezistentní na herbicid, který má vlastnosti:

(i) za absence alespoň jednoho herbicidu (a) má katalytickou aktivitu, která je sama dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován; nebo (b) má katalytickou aktivitu v kombinaci s nějakým jiným AHAS variantním proteinem rezistentním na herbicid také exprivovaným v buňce, který může být stejný nebo jiný než první AHAS variantní protein, která je dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován;

kde buňky vyžadují AHAS aktivitu pro přežívání; a (ii) má katalytickou aktivitu, která je více rezistentní k alespoň jednomu herbicidu než přirozená AHAS.

V preferovaném provedení výše uvedených metod je katalytická aktivita za absence herbicidu alespoň okolo 5 % a lépe více než asi 20 % katalytické aktivity přirozené AHAS. Pokud je herbicid imidazo1 inonový herbicid, pak AHAS variantní protein rezistentní na herbicid preferovaně má:

(i) katalytickou aktivitu za absence herbicidu vyšší než asi 20 % katalytické aktivity přirozené AHAS;

(ii) katalytickou aktivitu, které je relativně více rezistentní na přítomnost imidazolinonových herbicidů ve · 0 0 0 0 0 0 0 · · 0 0 • 00 0 * · · 0 0 0 0 • 0 0 0 0 · · 0 0 ·«· • 9 0 0 0 · · 0 · 0 · · 0 «· 0 0 0 0 · 0 » ♦ · ··· 00 000 0 0 <0 srovnání s přirozenou AHAS; a ( i i i ) katalytickou aktivitu, která je relativné více citlivá na přítomnost sulfonylmočovinových herbicidů ve srovnání s imidazolinonovými herbicidy.

Předkládaný vynález dále poskytuje izolovanou DNA kódující variantní proteiny kyselina hydroxyoctová syntetasy (AHAS), kde variantní proteiny obsahují AHAS proteiny modifikované:

(i) substitucí alespoň jednoho různého aminokyselinového zbytku v aminokyselinovém zbytku sekvence podle obrázku 1

vybraného ze	! skupiny, která se	skládá z P48, G49, S52,	M53 ,
A84, A95, T96, S97, G98,	P99,	G100,	A10 1 ,	V125,	R127,	R128,
M129, 1130,	G131 ,	T132,	D1 33 ,	F135,	Q136 ,	D186,	1187,	T259,
T260, L261,	M262,	G263 ,	R267,	M277,	L278 ,	G279,	H281 ,	G282 ,
T283, V284,	G300,	V301 ,	R302,	F303 ,	D304,	R306,	V307,	T308,
G309, K310,	1311 ,	E312,	A313,	F31 4,	A31 o,	S316,	R317,	A318,
K319, 1320,	E329,	1330,	K332,	N333 ,	K334 ,	0335,	T404 ,	G413 ,
V414, G415,	Q416,	H417,	Q418,	M419,	W420,	A421 ,	A42 2,	L434,
S435, A437,	G438,	L439 ,	G440,	A441 ,	M442 ,	G443,	D467,	S468 ,
S469, L471,	N473,	L477,	M479 ,	Q495 ,	H496,	L497,	G498,	M499 ,
V501, Q502,	Q504,	D505 ,	R506,	Y508,	K509,	A510,	N511 ,	R512,
A513, H514,	T515,	S524 ,	H572,	Q573 ,	E574 ,	H575,	V576,	L577,
P578. M579,	1580,	P581 ,	G583,	G584,	funkč	nich ekvivalentů

kteréhokoliv z výše uvedených a jakékoliv kombinace kteréhokoliv z výše uvedených.

(ii) delecí více než 5 aminokyselinových zbytků předcházejících, nebo více než 5 aminokyselinových zbytků následujících alespoň jednomu aminokyselinovému zbytku • · ····

sekvence podle obrázku 1 vybraného ze skupiny, která se skládá

z P48	. G49,	S52,	M53, E54, A84, A95	, T96,	S97,	G98, P99, G100,
A1 0 1 ,	V125,	R127,	R128,	M129,	1130,	G131 ,	TI32,	D133 ,	F135,
Q13 6 ,	D186,	1187,	T259,	T260,	L261 ,	M262,	G263 ,	R267,	M277,
L278 ,	G279 ,	H281 ,	G282 ,	T283,	V284 ,	G300,	V301 ,	R302,	F303,
D304,	R306,	V307,	T308,	G309,	K310,	1311 ,	E312,	A313 ,	F314,
A3 1 5 ,	S3 1 6,	R317,	A318,	K319,	1320,	E329,	1330,	K332,	N333 ,
K334,	0335,	T404,	G413 ,	V414,	G4 1 5,	Q416 ,	H417,	Q41 8,	M419,
W420 ,	A421 ,	A422,	L434,	S435,	A437,	G438,	L439,	G440,	A441 ,
M442 ,	G443 ,	D467,	S468,	S469,	L471 ,	N473 ,	L477,	M479,	Q495,
H496,	L497,	G498,	M499,	V501 ,	Q502,	Q504,	D505,	R506,	Y508,
K509,	A510,	N51 1 ,	R512,	A513,	H514,	T515,	S524,	H572,	Q573,
E574,	H575,	V576,	L577,	P578,	M579,	1580,	P581 ,	G583,	G584,
funkčních ekvivalentů kteréhokoliv	z výše	uvedených a	j akéko1 iv

kombinace kteréhokoliv z výše uvedených;

(iií) delecí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(iv) adicí alespoň funkčního ekvivalentu (v) delecí alespoň funkčního ekvivalentu jednoho aminokyselinového mezi Q124 a H150 sekvence jednoho aminokyselinového mezi G300 a D324 sekvence zbytku nebo jeho podle obrázku 1;

zbytku nebo jeho podle obrázku 1;

(vi) adicí alespoň funkčního ekvivalentu nebo jednoho aminokyselinového mezi G300 a D324 sekvence zbytku nebo jeho podle obrázku 1:

(vi i) jakoukoliv kombinací kteréhokoliv z výše uvedených.

V tomto systému počítání koresponduje zbytek č. 2 putativnímu aminokyselinovému konci zralého proteinu, t.j. po odstranění chloroplast zaměřujícího peptidu.

Výše uvedené modifikace jsou zaměřeny na změnění schopnosti herbicidu, a preferovaně imidazolinonového herbicidu, Ínhibovat enzymatickou aktivitu proteinu. V preferovaném provedení kóduje izolovaná DNA na herbicidy rezistentní variantu AHAS. Také jsou poskytnuty DNA vektory obsahující DNA kódující tyto AHAS varianty, varianty AHAS proteinů samotné, a buňky, kultivované in vivo nebo v buněčné kultuře, které exprivují AHAS varianty nebo obsahují tyto vektory.

V jiném aspektu poskytuje předkládaný vynález metodu pro udělení rezistence na herbicidy buňkám nebo buňce a zejména rostlině buňce nebo buňkám jako jsou například semena. AHAS gen, preferovaně Arabidopsis thaliana AHAS gen, je mutován pro pozměnění schopnosti herbicidu ínhibovat enzymatickou aktivitu AHAS. Mutantní gen je klonován do kompatibilního expresního vektoru a gen je transformován do buňky citlivé na herbicidy za podmínek, za kterých je exprivován v dostatečné hladině pro udělení rezistence na herbicidy buňce.

Také jsou poskytovány metody pro kontrolu plevele, kde plodina obsahující AHAS gen rezistentní na herbicidy podle předkládaného vynálezu je kultivována a ošetřována plevel kontrolujícím účinným množstvím herbicidu.

Také je popsána na struktuře založená modelační metoda pro přípravu prvního herbicidu, který inhibuje AHAS aktivitu. Metoda obsahu j e:

·· ···· ·· • · ·· • · · • · · · • · • · · · (a) sestavení cílového AHAS proteinu na pyruvát oxidasový templát nebo AHAS modelování jeho funkčního ekvivalentu pro odvození trojrozměrné struktury cílového AHAS proteinu;

(b) modelování druhého herbicidu majícího AHAS inhibiční aktivitu do trojrozměrné struktury pro odvození umístění, struktury vazebného místa pro herbicid nebo jejich kombinace v cílovém AHAS proteinu; a (c) vývoj non-peptidového prvního herbicidu, který bude interagovat s, a preferovaně se bude vázat na, AHAS aktivitu inhibující účinnou část vazebného místa, kde první herbicid inhibuje AHAS aktivitu dostatečně pro porušení životaschopnosti buněk, které vyžadují AHAS aktivitu pro svou životaschopnost.

Alternativní na struktuře založená modelační metoda pro přípravu prvního herbicidu, který inhibuje AHAS aktivitu, je také popsána. Metoda obsahuje:

(a) sestavení cílového AHAS proteinu na první AHAS templát odvozený od polypeptidů majícího sekvenci podle obrázku 1 nebo jeho funkčního ekvivalentu, pro odvození trojrozměrné struktury cílového AHAS proteinu;

(b) modelování druhého herbicidu majícího AHAS inhibiční aktivitu do trojrozměrné struktury pro odvození umístění, struktury vazebného místa pro herbicid nebo jejich kombinace v cílovém AHAS proteinu; a (c) vývoj non-peptidového prvního herbicidu, který bude interagovat s, a preferovaně se bude vázat na, AHAS aktivitu

Γ7

inhibující účinnou část vazebného místa, kde první herbicid inhibuje AHAS aktivitu dostatečně pro porušení životaschopnosti buněk, které vyžadují AHAS aktivitu pro svou životaschopnost.

Preferovaně v každé metodě obsahuje první herbicid alespoň jednu funkční skupinu, která interaguje s funkční skupinou vazebného místa.

zahrnuje racionální vývoj nebo na

Předkládaný vynález struktuře založené modelování modifikovaných verzí enzymu AHAS a AHAS inhibujících herbicidů. Tyto modifikované enzymy (AHAS) variantní proteiny) jsou Předkládaný vynález také varianty, vektory proteiny a buňky, poskytnuty metody pro produkci rezistence na herbicidy u rostlin které rez i s tentní zahrnuj e obsahuj í které exprivují

DNA, tyto tyto na účinek herbicidů, které kóduj í tyto DNA, AHAS variantní varianty. Dále jsou exprivováním těchto variant a metody pro kontrolu plevele. DNA a AHAS varianty podle předkládaného vynálezu byly objeveny ve studiích, které byly založeny na molekulárním modelování struktury AHAS.

Racionální na struktuře založený vývoj AHAS variant a AHAS inhibujících herbicidů

Na herbicidy rezistentní varianty AHAS podle předkládaného vynálezu jsou použitelné v udílení rezistence na herbicidy rostlinám, a mohou být projektovány s POX modelem, AHAS modelem nebo jejich funkčními ekvivalenty, jako jsou například transketolasy, karboligasy, pyruvát dekarboxylasy, proteiny, které váží FAD a/nebo TPP jako kofaktor, nebo jakékoliv proteiny, které mají strukturální vlastnosti podobné k POX ·· • · · ·· · · • · • · · · aúnebo AHAS; s AHAS modelem jako je model mající sekvenci podle obrázku 1; nebo s funkčním ekvivaletem sekvence podle obrázku 1 včetně varianty modelované z předchozího modelu. Proteiny, které mohou být použity, obsahují jakékoliv proteiny mající méně než kořenovou průměrnou čtvercovou odchylku menší než 3,5 angstromů ve svých Ca uhlících ve vztahu k jakékoliv z výše uvedených molekul. Na AHAS zaměřené herbicidy mohou být podobně modelovány z těchto templátů. Funkční ekvivalent AHAS aminokyselinové sekvence je sekvence mající významnou, t.j. 60 - 70% homologii, zejména v konzervovaných regionech jako je, například, putativní vazebné místo. Stupeň homologie může být určen jednoduchým sestavením baží na programu známém v oboru, jako je, například, GAP a PILEUP s GCG. Homologie znamená identické aminokyseliny nebo konzervativní substituce. Funkční ekvivalent určitého aminokyselinového zbytku v AHAS proteinu podle obrázku 1 je aminokyselinový zbytek jiného AHAS proteinu, který, když je seřazen se sekvencí podle obrázku 1 programem v oboru známým, jako je například GAP a PILEUP s GCG, je ve stejné pozici jako aminokyselinový zbytek podle obrázku 1.

Kroky racionálního vývoje typicky obsahují: (1) sestavení cílového AHAS proteinu s POX pozadím nebo strukturou nebo s AHAS pozadím nebo strukturou; (2) volitelně, a pokud má AHAS pozadí identifikované vazebné místo pro herbicid, modelování jednoho nebo více herbicidů do trojrozměrné struktury pro lokalizaci vazebného místa pro herbicid do cílového proteinu; (3) selekci mutace na základě modelu; (4) místně řízenou mutagenesi; a (5) expresi a purifikaci variant. Další kroky mohou zahrnovat (6) testování enzymatických vlastností a (7) hodnocení vhodných variant srovnáním s vlastnostmi přirozeného typu AHAS. Každý krok je diskutován odděleně dále.

• · ···· ·· • · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · • · · · · 4 4 • 4 4 • 4 4 Φ

1. Molekulární modelování

Techniky molekulárního modelování (a zejména modelování proteinové homologie) mohou dát pochopení struktury a aktivity daného proteinu. Strukturální model proteinu může být určen přímo z pokusných dat jako je rentgenová krystalografie, nepřímo pomocí modelování homologie a podobně, nebo kombinací těchto metod (viz White et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23, 349, 1994). Výklad trojrozměrné struktury AHAS poskytuje základ pro vývoj racionálního schématu pro mutaci určitého aminokyselinového zbytku v AHAS, která udělí polypeptidu rezistenci na herbicid.

Molekulární modelování struktury Zea Mays AHAS, za použití templátu známé rentgenové krystalové struktury příbuzné pyruvát oxidasy (POX) od Lactobaci 1lus plantarum, poskytuje trojrozměrný model AHAS struktury, který je použitelný pro vývoj AHAS variant rezistentních na herbicidy nebo AHAS inhibujících herbicidů. Tento modelační postup má výhodu toho, že AHAS a POX sdílí mnoho biochemických charakteristik a mohou být odvozeny od společného genu (Chang et al., J. Bacteriol. 170: 3937, 1988).

Vzhledem k vysokému stupni mezidruhové homologie v AHAS mohou být modelované AHAs zde popsané nebo jejich funkční ekvivalenty použity jako templáty pro vývoj AHAS variantních proteinů.

Odvození jednoho modelu za použití interaktivní molekulární grafiky a seskupení je podrobně popsáno dále. Trojrozměrná AHAS struktura, která vznikla z tohoto postupu, určuje přibližnou prostorovou orientaci aktivního místa enzymu a vazebného místa nebo kapsy inhibitoru jako je herbicid včetně, ale nejenom, • · ···· · * • · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ·· ·*· ·· imidazo1 inonových herbicidů. Model je potom upraven a reinterpretován na základě biochemických studií, které jsou také popsány dále.

Modelování proteinové homologie vyžaduje sestavení primární sekvence studovaného proteinu s druhým proteinem, jehož krystalová strukrura je známa. Pyruvát oxidasa (FOX) byla vybrána pro modelování AHAS homologie, protože POX a AHAS sdílejí mnoho biochemických charakteristik. Například, jak POX, tak AHAS mají stejné aspekty enzymového reakčního mechanismu, stejně jako kofaktoru a potřeby kovů. V obou enzymech jsou pro enzymatickou aktivitu požadovány thiamin pyrofosfát (TPP), flavin adenin dinukleotid (FAD) a divalentní kationt. FAD zprostředkuje redukční reakci během katalýzy v POX, ale předpokládané má pouze strukturální funkci v AHAS, což je možná pozůstatek z evoluce AHAS z POX. Oba enzymy utilizují pyruvát jako substrát a tvoří hydroxyethyl thiamin pyrofosfát jako stabilní intermediát reakce (Schloss, J.V. et al. , v Biosynthesis of branched chain amino acids, Barak, Z.J.M., Chipman, D.M., Schloss, J.V. (eds) VCH Publishers, Weinheim, Germany, 1990).

Dále. AHAS aktivita je přítomna v chimérických POX-AHAS proteinech skládajících se z N-terminální poloviny POX a C-terminální poloviny AHAS a je zde malý stupeň AHAS aktivity vykazovaný POX samotnou. AHAS a POX také vykazují podobné vlastnosti v roztoku (Risse, B. et al., Protein Sci. 1: 1699 a

1710, 1992; Singh, B.K., a Schmitt, G.K. (1989), FEBS Letters, 258: 113; Singh, B.K. et al., (1989) v: Prospects for Amino Acid Biosynthesis Inhibitors in Crop Protection and Pharmaceutical Chemistry, (Lopping, L.G., et al., vyd., BCP Monograph str. 87).

• · · · 4 · • · • · • · • 444 • 4 · ··

4· • ·4 4

Se zvýšenou koncentrací proteinu podléhají jak POX, tak AHAS postupné přeměně z monomerů na dimery a tetramery. Zvýšení v koncentraci FAD také indukuje vyšší řády sestavení podjednotek. V tetramerické formě jsou oba proteiny nejvíce stabilní k teplu a chemické denaturaci.

Dále, krystalová struktura POX z Lactobaci1lus planarum byla popsána Mullerem et al., Science 259: 965, 1993. Vynálezci tohoto vynálezu zjistili, že na základě stupně fyzikální, biochemické a genetické homologie mezi AHAS a POX může být rentgenová krystalická POX použita jako strukturální počáteční bod pro modelování homologie AHAS struktury.

Nicméně, AHAS a L. planarum POX sekvence nejsou dostatečně podobné pro úplné počítačové sestavení. Celkem je pouze asi 20% aminokyselin identických, zatímco asi 50% reziduí je stejné třídy (t.j. acidické, bazické, aromatické, a podobně). Nicméně, pokud je sekvence srovnána s ohledem na klasifikace hydrofobních a hydrofilních zbytků, potom odpovídá 500 ze 600 aminokyselin. Určení sekundární struktury pro AHAS (Holley et al., Proč. Nati. Acad. Sci USA 86: 152, 1989) ukázalo silnou podobnost k aktuální sekundární struktuře POX. Pro téměř 70% zbytků odpovídá předpokládaná sekundární struktura struktuře POX.

POX monoomery se skládají ze tří domén, kde všechny mají centrální, paralelní β-list se zkřížením skládajícím se z α-šroubovic a dlouhých smyček. (Muller et al., Science 259: 965, 1993). Topologie listů se liší mezi doménami, t.j. v první a ve třetí doméně jsou řetězce sestaveny do β-listu v sekvenci

2- 1-3-4-6-5, zatímco v β-listu druhé domény se sekvence čte

3- 2-1-4-5-6.

Počítačové generované sestavení bylo založeno na určení sekundární struktury a na homologii sekvence. Byla použit běžná metoda párového sestavení sekvence, kterou popsal Needleman and Wunch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970. Dvě sekvence byly seřazeny pro maximalizaci skoré seřazení. Skoré seřazení (skoré homologie) je sumou skoré pro všechny páry seřazených zbytků, plus volitelných pokut za vložení mezer do seřazení. Skoré pro seřazení párů zbytků je tabelovaná číselná hodnota. Systém skorování homologie je založen na pozorování frekvence divergence mezi danými páry zbytků. (MO Dayhoff, RM Schwartz and BC Orcutt Atlas of Protein Sequence and Structure, sv. 5. suppl. 3 str. 345 - 362, 1978).

Seřazení bylo dále vylepšeno přemístěním mezer tak, aby sekonzervovaly kontinuální řádné sekundární struktury. Aminokyselinové substituce generováné hodnocením pravděpodobných schémat seřazení byly srovnávány prostředky interaktivní molekulární grafiky. Bylo vybráno seřazení s nejvíce konzervativními substitucemi s ohledem na určitou funkčnost aminokyselin v daném místě. Konečné seřazení POX a AHAS je ukázáno na obrázku 2. Byla identifikována konzervativní seskupení zbytků, zejména pro TPP vazebné místo a pro části FAD vazebného místa. Seřazení odhalilo vysoký stupeň podobnosti mezi AHAS a POX pro první doménu, pro většinu částí druhé domény a pro asi polovinu třetí domény. Většina regionů, které byloy špatně seřazeny a mohly se různě skládat v POX a AHAS byla očekávána na povrchu proteinu a nebyly zahrnuty ve vazbě kofaktoru nebo inhibiční vazbě. Určení mutačních míst není významně ovlivněno malými posuny v seřazení.

Většina TPP vazebných zbytků je vysoce konzervována v POX a ·· ···· ·· · ·· ·· • · · ···· · Λ ·· • ···· · · 9 ···· • · ··· · · · ···· · • · ···· ···

4»· ♦ · · ·* ··· «···

AHAS (např. P48 - G49 - G50). V některých případech se zbytky těsné k TPP liší mezi POX a AHAS, ale zůstávají v regionu, který je vysoce konzervován (například, zbytky 90 - 110). Na druhou stranu, FAD vazebné místo se zdá být méně konzervované. Ačkoliv byly některá FAD vazebná místa vysoce konzervována (například D325-I326-D327-P328), jiná se jasně lišila mezi POX a AHAS (napříkad zbytky ve smyčce v pozici 278 - 285 nejsou homologní). Podrobná analýza ukázala, že, alespoň pro některá z méně konzervovaných kontaktních míst, byly interakce zprostředkovány spíše polypeptidovou kostrou než postranními řetězci. Proto, konzervace byla vyžadována pouze pro složení polypeptidu a nikoliv pro aminokyselinovou sekvenci (například kostra ze zbytků 258 - 263 se váže na ribitol řetězec FAD). Polovina vazebných míst pro adenin a izoalloxazin se jasně liší.

Po sestavení primární struktury byl postaven model homologie transpozicí AHAS aminokyselinové sekvence na POX templátovou strukturu. Chybějící koordináty byly vytvořeny postupně za použití templátů aminokyselinových zbytků pro kompletování nedefinovaných postraních řetězců. Prohledávání data bank a minimalizace energie malých částí molekuly byly použity pro kompletování konformace nedefinovaných smyčkových regionů. Kofaktory TPP a FAD byly modelovány do jejich vazebných míst, tento model byl potom podroben kompletní, 500 cyklové minimalizaci energie. Veškeré počítačové modelování bylo provedeno na IRIS Indigo Elán R4000 Workstation od Silicon Graphics Co. Interaktivní molekulové modelování a minimalizace energie byly provedeny za použití Quanta/CHARMm 4.0 od Molecular Simulations lne. Během tohoto kroku byla konformace stabilní, což ukazuje, že žádné silné nežádoucí interakce, jako jsou ·· ···· • · » • · ··· • · · · • · · · ···

•	··	··
··	• · ·	•
•	• ·	• Φ
•	• ··· ·	•
•	* ·	•
···	··	··

například těsné van der Waalsovi kontakty, se nevyskytly.

Výsledky jsou schematicky ukázány na obrázku 3.

Charakteristiky předpokládané AHAS struktury

Prohlídka modelované AHAS struktury popsané výše ukázala, že většina proteinu se skládá s kostrou, které je energeticky přiměřená, s většinou hydrofilních postraních řetězců přístupných rozpouštědlu. Povrchy (3—listů jsou hladké a mají na sobě místo pro překřížené regiony, které jsou na ně připojeny.

Model pro dimerické AHAS byl generován duplikováním koordinátů energeticky minimalizovaných monemerických AHAS supervložením dvou kopií na dvě POX podjednotky za použití párů Ca koordinátů jak je definováno ve schématu sestavení.

Polypeptidový řetězec AHAS se skládá do tří podobně složených domén složených z šestiřetězcového paraleního β-listu jádra obklopeného dlouhými smyčkami a α-šroubovicemi. Dvě podjednotky jsou seřazeny tak, že první doména jedné podjednotky je v těsné blízkosti kofaktorových vazebných domén 2 a 3 jiné podjednotky. Rozpouštědlem vyplněný prostor zůstává mezi podjednotkami v tomto místě. Tato kapsa, která je definována vlivem tří domén, je předpokládaným vstupním místem pro substrát. Je také předpokládáno, že to je vazebné místo pro herbi c i dy.

Vnitřní povrch vazebné kapsy je nastíněn kofaktory. Thiazol TPP je umístěn na dně kapsy. Doména 3 dává vnitřnímu povrchu kapsy krátkou α-šroubovici, která umísťuje svou osu směrem k pyrofosfátu na TPP, což kompenzuje fosfátový náboj svým dipolárním momentem. Tato kritická šroubovice, která začíná

99

99

G498, otočkovým zbytkem v těsném kontaktu s TPP, a která končí v F507, obsahuje tři známá mutační místa pro rezistenci na sulfonylureu: V500, W503 a F507 (viz U.S.Patenty č. 5.013.659; 5.141.870; a 5.378.824). V doméně 1 je zmyčka definována jako P48 - S52 (mezi β-řetězcem 2 a a-šroubovicí 2) je W503, mutace, ve které vzniká rezistence na imidazolinony. Zbytky Y47 až G50 jsou také v kontaktu s TPP. Tato smyčka je sousedící s P184

- Q189, jinak otočené, která spojuje poslední řetězec β-listu domény 1 s β-řetězcem, který spojuje s doménou 2. Uvnitř kapsy, poblíž jejího vchodu, je dlouhý region domény 1, který interaguje s komplementárním řetězcem domény 2. Residua 125

- 129 a 133 - 137 domény 1 a residua 304 - 313 domény 2 jsou na povrchu kapsy. Záhyb skládající se z T96 - G100 je mezi smyčkou 125 - 129 a TPP. Další řetězec domény 3 a dva regiony domény 2, které ohraničují vazebnou kapsu, jsou na opačném rohu kapsy. Zbytky 572, 575, 582 a 583 domény 3 definují povrch kapsy na jedné straně. Zbývající část vnitřního povrchu kapsy je definována FAD a smyčkou L278 - G282, která kontaktuje izoa11oxazinový kruh FAD.

Strukturální modely AHAS proteinu mohou být také použity pro racionální vývoj herbicidů nebo AHAS inhibitorů.

2. Modelování herbicidů do vazebných míst

Imazethapyr, aktivní imidazolinon v PURSUIT^R byl umístěn do svého předpokládaného vazebného místa za použití intraktivní molekulární grafiky (obr. 4) a softwaru popsaného výše (obr.4). K185 byl vybrán jako kotva pro interakci s nábojem karboxylové skupinyNH-CO jednotka imidazo1inonu byla umístěna pro tvorbu vodíkových můstků na G50 a A51. Toto umístilo methylový ······ · · · 4 4 · • · · · · · · ·· · · e · · · · · · · ·· · · • · · ♦ · · · · ···· · • · · » · ···· • · 9·9 · 4 · · · · · 9Í substituent imazethapyru těsně k V500 kostry malé α-šroubovice. Tato isopropylová skupina je pravděpodobně vázána hydrofobními zbytky aminokyselin v regionu zbytků 125 - 135, které vytvářejí vnitřní povrch kapsy. Pyridinový kruh je nejpravděpodobněji sandwichován mezi A134 nebo F135, F507 a W503. W503 také interaguje se systémem imidazolinonového kruhu.

Podobným způsobem byly modelovány sulfonylmočovinové herbicidy do místa, které částečně přesahuje popsané vazebné místo pro imidazo1inon. Překrytí sulfonylmočovinových a imidazo1 inonových vazebných míst byl v souladu s pokusy kompetiční vazby a se stanovenými mutantními daty, která ukazují, že stejná mutace u kukuřice, W503L, může vytvářet rezistenci na oba herbicidy. V těchto modelech je většina známých mutačních míst, která udílejí rezistenci na sulfonylmočovinové herbicidy, t.j. G50, A51, K185, V500, W503, F507, v těsném kontaktu s navázanými herbicidy. P126 a A51 jsou vyžadovány pro udržení K185 postranního řetězce v místě generováním hydrofobního póru. S582, místo pro specifickou imidazolinonovou rezistenci, je dále od vazebného regionu a je umístěno v regionu, kde je homologie tak slabá, že je očekávána změna ve složení. FAD vazebné místo má zjevně nízkou homologii mezi AHAS a POX v tomto regionu; S582 je zbytek, který udílí rezistenci u kukuřice a tento S582 a s ním sousedící zbytky jsou v těsném kontaktu s aktivním místem kapsy. Je předpokládáno, že FAD a region smyčky obsahující zbytky 278 až 285 je posunut mírně od třetí domény, (dole na obrázku 4) a že smyčka, která obsahuje S582 se skládá do prostoru mezi šroubovicí v pozici 499 až 507 a smyčkou v pozicích 278 až 285. D305, jiné známé místo mutace, je těsně u FAD a moduluje interakce mezi doménami 1 a 2. M280 může být bud obsažen v umístění šroubovice do pozice • · · · · · · · · · · · · ·«· ···· ···« • · · · · · · · · ··· • · · · · 9 9 9 9999 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 99 999 99 99

498 až 507, nebo přímo v inhibični vazbě. M280 a D305 mohou být také přímo obsaženy v inhibični vazbě, pokud se domény l a 2 posunou o něco blíže k sobě.

3. Selekce mutací

Specifické aminokyselinové zbytky jsou zjištěny jako místa pro zavedení mutací do primární sekvence AHAS. Tyto aminokyseliny jsou vybrány na základě jejich umístění tak, že pokud je pozice aminokyselinového zbytku modifikována, pak bude výsledkem alterace (t.j. snížení) v afinitě herbicidu pro vazebné místo. Není nutné, aby pozice mutace byla ve vazebném místu, protože aminokyselinové zbytky mimo kapsu mohou samy o sobě alterovat náboj nebo konfiguraci vazebného místa. Selekce cílových míst pro mutace je dosažena za použití molekulárních modelů jak jsou popsány výše. Například podle modelu uvedeného výše, arginin v pozici 128 (označený jako R128 na obrázku 1 za použití jednopísměného kódu pro aminokyseliny) je umístěn poblíž vchodu do vazebného místa pro substrát a herbicid a má velký stupeň konformační volnosti, který dovoluje, aby se účastnil transportu nabitých herbicidů do vazebného místa. Proto je tento zbytek substituován alaninem pro odstranění jak jeho náboje, tak jeho dlouhého hydrofobního řetězce (vzniklá mutace je označena R128A).

Mutace mohou obsahovat jednoduché substituce, které nahrazují přirozenou sekvenci jakoukoliv jinou aminokyselinou.

Alternativně mohou mutace obsahovat delece nebo adice jedné nebo více aminokyselin, preferovaně více než 5, v daném místě. Přidané sekvence mohou obsahovat aminokyselinovou sekvenci, o které je známo, že existuje v jiném proteinu, nebo mohou

4 ···· 4 4 · · ·4 4 ♦ · 4 4 · · · 4 4 44 • · · · · · · 4 1« 4 44 • · · · · · 4 f> 4 4 4 4· ♦ · · 4 ♦ · 4 4·

4 · 4 44 444 a·4 4 obsahovat zcela syntetickou sekvenci. Dále, více než jedna mutace a/nebo více než jeden typ mutace mohou být zavedeny do jednoho polypeptidů.

4. Místně řízená mutagenese

DNA kódující AHAS může být manipulována tak, aby byly zavedeny požadované mutace. Mutagenese je provedena za použití metod, které jsou standartní v oboru, jak je popsáno, například, v Higuchi, R., Rekombinant PCR, v M.A. Innis, et al., vvd., PCR Protocols: A Guide to Methods and App1 ications, Academics Press, str. 177 - 183, 1990.

5. Exprese a purifikace variant

Mutovaná a variantní AHAS sekvence je klonována do DNA expresního vektoru (viz např. příklad 3) a je expri^bvána ve vhodné buňce, jako je například E. coli. Preferovaně je DNA kódující AHAS navázána na transkripční regulační element a variantní AHAS je exprivována jako část fúzního proteinu, například, gluthation-S-transferasy, pro usnadnění purifikace (viz příklad 3, dále). Variantní AHAS je potom purifikována za použití afinitní chromatografie nebo jakékoliv jiné vhodné metody v oboru známé. Purifikace” AHAS polypeptidů označuje izolaci AHAS polypeptidů ve formě, která umožňuje měření jeho enzymatické aktivity bez interference s jinými složkami buňky, ve které je polypeptid exprivován.

6. Testování enzymatických vlastností

Purifikované varianty AHAS mohou být testovány na jednu nebo • a a · a · ·· • · a a· a a a a a a* • · a a aa • · · ·· » a a a »· · více následujících vlastností:

a) specifickou nebo katalytickou aktivitu pro konverzi pyruvátu na acetolaktát (vyjádřenou jako jednotky/mg čisté AHAS, kde jednotka aktivity je definována jako 1 pmol acetolaktátu produkovaný/hodinu), nebo na kondenzaci pyruvátu a

2-ketobutyrátu za tvorby acetohydroxybutyrátu (vyjádřenou jako jednotky/mg čisté AHAS, kde jednotka aktivity je definována jako 1 pmol acetohydroxybutyrátu produkovaný/hodinu);

b) úroveň inhibice herbicidu, jako je například, imidazolinon (vyjádřenou jako IC50, koncentrací, při které je 50 % aktivity enzymu inhibováno); a

c) selektivitu rezistence na vybraný herbicid vs. jiné herbicidy. Index selektivity je def inována j ako násobek rezistence mutantu k imidazo1inonům ve vztahu k přirozenému enzymu, dělený násobkem rezistence stejného mutantu k jinému herbicidu také ve vztahu k přirozenému typu). Násobek rezistence k herbicidu ve vztahu k přirozenému typu enzymu je vyjádřen jako IC50 varianty dělený IC50 přirozeného typu.Index selektivity je tak reprezentován následující rovnicí:

IC50 varianty pro herb.A/ICgo přirozeného typu pro herb. A

S.I. = -----------------------------------------------------------------

ICso varianty pro herb.B/ICso přirozeného typu pro herb. B

Vhodné testovací systémy pro tato určení zahrnují, ale nejsou omezeny na, ty, které jsou popsány v příkladu 4, dále.

······ 9 9 · 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 < · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 · 9 · ···· · ·· 9 9 9 9 9 9 9

999 99 999 99 99

7.a. Hodnocení vhodných variant

Enzymatické vlastnosti variant AHAS polypeptidů jsou srovnávány s přirozeným typem AHAS. Preferovaně, dané mutace vedoucí k AHAS variantnímu polypeptidu, který si zachovává in vitro enzymatickou aktivitu k pyruvátu a nebo pyruvátu a 2-ketobutyrátu, t.j. konverzi pyruvátu na acetolaktát nebo kondenzaci pyruvátu a 2-ketobutyrátu za tvorby acetohydroxybutyrátu, (a tak se očekává jeho biologická aktivita in vivo), zatímco vykazuje katalytickou aktivitu, která je o něco více rezistentní k vybranému herbicidu, než je aktivita přirozeného typu AHAS. Preferovaně variantní AHAS vykazuje:

(i) za absence alespoň jednoho herbicidu (a) katalytickou aktivitu, která je sama dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován; nebo (b) katalytickou aktivitu v kombinaci s nějakým jiným AHAS variantním proteinem rezistentním na herbicid, který může být stejný nebo jiný než první AHAS variantní protein, která je dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován;

kde buňky vyžadují AHAS aktivitu pro přežívání; a (ii) katalytickou aktivitu, která je více rezistentní k alespoň jednomu herbicidu než přirozená AHAS;

a která je relativně více rezistentní k herbicidu než je • · · · • · přirozená AHAS.

Proto, jakýkoliv specifický AHAS variantní protein nemusí nezbytně mít úplnou katalytickou aktivitu pro udržení životaschopnosti buněk, ale musí mít nějakou katalytickou aktivitu, samostatnou nebo v kombinaci s katalytickou aktivitou dalších kopií stejné AHAS varianty a/nebo v kombinaci s katalytickou aktivitou jiných AHAS variantních proteinů, v množství dostatečném pro udržení životaschopnosti buněk, které vyžadují AHAS aktivitu pro životaschopnost. Například, katalytická aktivita může být zvýšena na minimální akceptovatelné hladiny zavedením mnoha kopií varianty kódujících genů do buňky nebo zavedením genu, který dále obsahuje relativně silný promotor pro zvýšení produkce varianty.

Více rezistentní znamená, že katalytická aktivita varianty je zmenšena herbicidy, pokud vůbec, o menší stupeň než je herbicidem zmenšena katalytická aktivita přirozeného typu AHAS. Preferované více rezistentní varianty AHAS si uchovávají dostatečnou katalytickou aktivitu pro udržení životaschopnosti buněk, rostlin nebo organismů tam, kde si při stejné koncetraci herbicidu přirozený typ AHAS nezachovává dostatečnou katalytickou aktivitu pro udržení životaschopnosti buněk, rostlin nebo organismů.

Preferovaně je katalytická aktivita za absence herbicidů alespoň okolo 5 %, a lépe je více než 20 % vzhledem ke katalytické aktivitě přirozeného typu AHAS za absence herbicidů. Nejvíce preferované AHAS varianty jsou více rezistentní k imidazolinonovým herbicidům než k jiným herbicidům jako jsou herbicidy založené na sulfonyImočovině, s tím, že v některých • · · · · · · · · ·· · · • · · ···· ···· • ···· · · · · ··· • · · · · · · · · · · · · • · · · · · ··· • · · · · ·· ··· «· aplikacích není selektivita ani potřebná, ani preferovaná.

U imidazolinon rezistentních variant AHAS je preferováno, aby AHAS variantní protein měl:

(i) katalytickou aktivitu za absence uvedeného herbicidu vyšší než asi 20% katalytické aktivity uvedené přirozené AHAS;

(ii) katalytickou aktivitu, které je relativně více rezistentní na přítomnost imidazolinonových herbicidů ve srovnání s přirozenou AHAS; a (ii i) katalytickou aktivitu, která je relativně více citlivá na přítomnost sulfonylmočovinových herbicidů ve srovnání s imidazolinonovými herbicidy. Nejvíce preferované herbicid-rezistentní AHAS varianty vykazují minimální specifickou aktivitu okolo 20 jednotek/mg, minimální nebo žádnou inhibici imidazo1inonem a index selektivity od asi 1,3 do asi 3000 ve vztahu k jiným herbicidům.

Bez vazby na teorii se soudí, že systematické a interaktivní aplikace této metody na přirozený typ nebo na jiný cílový AHAS protein budou vést k produkci AHAS variant majících požadované vlastnosti vysoké enzymatické aktivity jak byla popsána výše a rezistence na jednu nebo na více tříd herbicidů. Například, mutace přirozené AHAS sekvence v určité pozici na danou aminokyselinu mohou vést k mutantu, který vykazuje vysoký stupeň rezistence na herbicidy, ale signifikantní ztrátu enzymatické aktivity k pyruvátu nebo pyruvátu a 2-ketobutyrátu. Ve druhé aplikaci výše uvedené metody bude potom počáteční nebo cílový AHAS polypeptid touto variantou (místo přirozeného typu AHAS).

·· ···· · · · · ♦ ·· • · · · · «· ···· • · · · · · · » · · «· • · · · · · · « »· · · • · · · · · ··· • Φ ··* ·· ··· 4· ··

Racionální vývoj potom obsahuje substituování jiných aminokyselin v původně mutovaných pozicích a/nebo přidání nebo deletování aminokyselin ve vybraných místech nebo rozsazích s očekáváním zachování rezistence na herbicidy, ale také se zachováním vyšší hladiny enzymatické aktivity.

Na struktuře založený racionální vývoj na herbicidy rezistentních AHAS proteinů nabízí mnoho výhod proti konvenčním přístupům, které spočívají v náhodné mutagenesy a selekci. Například, pokud substituce určité aminokyseliny za jinou vyžaduje substituci více než jednoho nukleotidu v kodonu, pak je pravděpodobnost, že se toto vyskytne náhodně tak nízká,, že není prakticky použitelná. Oproti tomu, dvojité i trojité změny v nukleotidové sekvenci v kodonu mohou být snadno provedeny, pokud jsou naznačeny přístupem racionálního vývoje. Například, jedna racionálně vyvinutá mutace pro udělení selektivní rezistence na imidazolinon vyžaduje změnu z argininu na glutamat. Arginin je kódovaný CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG, zatímco glutamát je kódovaný GAA a GAG. Protože žádný z kodonu pro arginin nezačíná GA, bude tato mutace vyžadovat dvojitou substituci sousedních nukletoidů, která se při náhodné mutagenezi vyskytuje tak vzácně, že je to nepředvídatelné a neopakovatelné s jakoukoliv jistotou úspěchu. Ačkoliv mutační frekvence může být zvýšena během náhodné mutageneze, alterace nukleotidové sekvence budou mít stejnou pravděpodobnost výskytu v celém AHAS genu, za absence předchozího zaměření mutací. Toto zvyšuje šanci na získání irelevantních mutací, které interferují s enzymatickou aktivitou. Obdobně, bude vzácné, za použití náhodné mutageneze, najít mnohotné aminokyselinové substituce, delece, nebo mutace substituce/de1ece, které dávají rezistenci na herbicidy a zároveň udržují katalytickou aktivitu. Deleční mutace, které • · · · udílejí rezistenci na herbicidy, jsou také nepravděpodobné za použití přístupu náhodné mutagenese. Delece by měly být omezeny na malý region a měly by se vyskytovat v tripletech tak, aby se zachoval AHAS čtecí rámeček pro zachování enzymatické aktivity.

Nicméně, při použití racionální na struktuře založeného přístupu jsou dvojité aminokyselinové substituce a/nebo deleční mutace relativně snadno dosažitelné a přesně zaměřené. Dále, různé mutageny použité v náhodné mutagenesy vytvářejí specifické typy mutací. Například, azid sodný vytváří bodové substituční mutace u rostlin, zatímco radiace vytváří spíše delece. V souladu s tím by musely být použity dva protokoly mutageneze pro získání mnohotné kombinace substitucí/delecí.

Konečně, předkládaná na struktuře založená metoda pro racionální vývoj na herbicidy rezistentních AHAS umožňuje opakovaná vylepšení mutací rezistence na herbicidy, kterýžto krok není usnadněn náhodnou mutagenezí. Identifikace mutačního místa pro rezistenci na herbicidy náhodnou mutagenezí může dát malou, pokud nějakou, prediktivní hodnotu pro zlepšení charakteristik mutantu. Předkládaný na struktuře založený přístup, na druhé straně, umožňuje určení vylepšení na základě pozice, prostředí a funkce aminokyselinové pozice ve strukturálním modelu.

Metoda opakovaného vylepšení také umožňuje nezávislou manipulaci se třemi důležitými vlastnostmi AHAS: úrovní rezistence, selektivitou rezistence a katalytickou účinností. Například mohou být vyvinuty kompenzatorní mutace prediktivním způsobem. Pokud má určitá mutace škodlivý účinek na aktivitu enzymu, pak může být druhá kompenzatorní mutace použita • · · · · · · · • · · ·· • · · · · ·· • · · · ·· • · · ·· • · · · · · · • · · · · • · ·· · · • ·· · · • 4 · · · ·· *· · · • · · · · · · pro znovuobnovení aktivity. Například, změna v náboji uvnitř domény, když je zbytek s nábojem vložen nebo ztracen díky mutaci může být kompenzována zavedením druhé mutace. Předpovězení pozice a typu zbytku pro zavedení, deletování nebo substituci ve druhém místě pro nahrazení enzymatické aktivity vyžaduje znalost strukturálné-funkčních vztahů odvozených z modelu jako je ten, který je zde popsán.

7.b. Vývoj nepeptidových herbicidů nebo AHAS inhibitorů

Chemická entita, která alteruje a může být vhodná do aktivního místa cílového proteinu nebo se váže na jakoukoliv pozici, kde může inhibovat aktivitu, může být vyvinuta metodami v oboru známými, jako je například, počítačový vývojový program, který se uplatňuje ve vývoji sloučenin, které specificky interagují s receptorovým místem.

Příkladem takového programu je LUDI (Biosym Technologies San Diego, CA) (viz také Lam et al., Science 263: 380, 1994: Thompson et al., J. Med. Chem., 37: 3100, 1994).

Vazebná kapsa, a zejména ty zbytky, u kterých bylo identifikováno, že jsou zahrnuty v inhibiční vazbě, mohou být použity jako kotevní body pro vývoj inhibitoru.

Vývoj místně specifických herbicidů je výhodný při kontrole druhů plevele, u kterých se může spontálně vyvinout rezistence na herbicidy v této oblasti, zejména díky mutacím AHAS genu.

vektory • · · • » · · 9

Na herbicidy rezistentní AHAS varianty: DNA, polypeptidy

Předkládaný vynález také obsahuje izolované DNA molekuly kódující varianty AHAS polypeptidů rezistentních na herbicidy. Geny kódující AHAS polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být odvozeny od jakéhokoliv druhu, a preferovaně od rostliných druhů, a mutace udílející rezistenci na herbicidy mohou být zavedeny do ekvivalentních pozic v jakémkoliv z těchto AHAS genů. Ekvivalence pozic daných kodonů v různých AHAS genech je funkcí konzervace primární aminokyselinové sekvence a jeho proteinu a retence podobné trojrozměrné struktury. Například, obrázek 5 ilustruje vysoký stupeň sekvenční homologie mezi AHAS polypeptidy odvozenými od různých rostliných druhů. Tyto AHAS polypeptidy vykazují alespoň 60 - 70% celkovou homologii. Bez vazby na teorii se soudí, že v regionech polypeptidu majících vysoce konzervovanou sekvenci bude také zachována konformace polypeptidového řetězce. Tak je možné použít AHAS-kodující sekvenci od jednoho druhu pro molekulární modelování, pro předem určené zavedení mutací do AHAS genu od druhého druhu pro iniciální testování a opakovaná vylepšení, a konečně, zavedení optimalizovaných mutací do AHAS odvozených od ještě třetích rostliných druhů pro expresi v transgenních rostlinách.

V jedné sérii provedení kódují tyto AHAS DNA varianty AHAS polypeptidu a preferovaně AHAS polypeptidu z kukuřice podle obrázku 1, kterýžto polypeptid je modifikován substitucí v nebo delecí před nebo za jedním nebo více aminokyselinových zbytků podle obrázku 1, P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, K128, M129, 1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T2S9, T260, L261, M262,

7

G263,	R267,	M277,	L278,	G279,	H281 ,	G282,	T283,	V284,	G300 ,
V301 ,	R302,	F303 ,	D304,	R306,	V307,	T308,	G309,	K310,	1311,
E312,	A313 ,	F314,	A315,	S316,	R317,	A3 1 8 ,	K319,	1320,	E329,
1330,	K332,	N333,	K334,	0335,	T404,	G413 ,	V414,	G415,	Q416,
H417,	Q418,	M419 ,	W420,	A421 ,	A422 ,	L434,	S435 ,	A437,	G438 ,
L439,	G440,	A441 ,	M442 ,	G443 ,	D467,	S468 ,	S469,	L471 ,	N473 ,
L477,	M479,	Q495,	H496,	L497,	G498,	M499,	V501 ,	Q502,	Q504,
D505,	R506,	Y508 ,	K509,	A510,	N51 1 ,	R512 ,	A513 ,	H514,	T515,
S524,	H572 ,	Q573,	E574,	H575,	V576,	L577,	P578,	M579,	1580 ,
P581 ,	G583 ,	G584,	funkčních ekvivalentů kteréhokoliv	z výše
uvedených;	inzercí	nebo	delecí	mezi	Q124	a H150	podl e	obráz

nebo jejich funkčních ekvivalentů; inzercí nebo delecí mezi

G300 a D324 podle obrázku 1 nebo jejich funkčních ekvivalentů; a jakékoliv kterýchkoliv z výše uvedených.

Mutace, ať zavedené do polypeptidu podle obrázku 1 nebo do ekvivalentních pozic v jiném rostlině AHAS genu, mohou obsahovat alterace v DNA sekvenci, které vedou k prosté substituci jakékoliv jedné nebo více aminokyselin nebo delecím více než 5 aminokyselinových zbytků předcházejících nebo více než 5 aminokyselinových zbytků následujících jakémukoliv místu výše uvedenému. Vhodné aminokyselinové substituenty zahrnují, ale nejsou omezeny na, přirozeně se vyskytující aminokyseliny.

Alternativně mohou mutace obsahovat alterace v DNA sekvenci takové, že je jedna nebo více aminokyselin přidáno nebo deletováno v rámečku ve výše uvedených pozicích. Preferovaně obsahují adice okolo 3 až do asi 30 nukleotidů a delece obsahují asi od 3 do 30 nukleotidů. Kromě toho, jednotlivý mutantní polypeptid může obsahovat více než jednu podobnou nebo různou mutaci .

• ·

• 4 ··

Předkládaný vynález obsahuje DNA a korespondující RNA sekvence, stejně jako sense a antisense sekvence. Sekvence nukleové kyseliny kódující AHAS polypeptidy mohou být obklopeny přirozenými AHAS regulačními sekvencemi, včetně promotoru, enhancerů, odpovídajících elementů, signálních sekvencí, polyadeny1ačních sekvencí, intronů, 5’- a 3'- nekódujících regionů, a podobně. Dále, nukleové kyseliny mohou být modifikovány pro změnu stability, rozpustnosti, vazebné afinity a specificity. Například, kódující sekvence pro variantní AHAS může být selektivně methylována. Sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může být také modifikována značkou schopnou poskytnutí detegovatelného signálu, bud přímo nebo nepřímo. Příkladné značky zahrnují radioizotopy, fluorescentní molekuly, biotin a podobně.

Vynález také poskytuje vektory obsahující nukleové kyseliny kódující AHAS varianty. Velké množství vektorů, včetně plasmidů a houbových vektorů, bylo popsáno pro expresi v mnoha eukaryotických a prokaryotických hostitelích. Výhodně mohou vektory také obsahovat promotor operativně navázaný na AHAS kódující část. Kódovaná AHAS může být exprivována za použití jakéhokoliv vhodného vektoru a hostitelské buňky, za použití metod zde popsaných nebo citovaných nebo jinak známých odborníkům v patřičném oboru. Příklady vhodných vektorů zahrnují bez omezení na pBIN založené vektory, pBluescript vektory a pGEM vektory.

Předkládaný vynález také obsahuje jak variantní na herbicid rezistentní polypeptidy, tak jejich peptidové fragmenty. Jak bylo vysvětleno výše, variantní AHAS polypeptidy mohou být odvozeny od polypeptidu kukuřice ukázaného na obrázku 1 nebo od

9

jakéhokoliv rostliného nebo mikrobiálního AHAS polypeptidu, preferovaně od rostliného AHAS polypeptidu. Polypeptidy mohou být dále modifikovány, například, fosforylací, sulfatací, acylací, glykosylací, a jinými modifikacemi proteinů. Polypeptidy mohou být izolovány od rostlin, nebo od hetero 1ogních organismů nebo buněk (včetně, ale bez omezení, bakterií, kvasinek, hmyzích, rostliných a savčích buněk) do kterého byl gen kódující variantní AHAS polypeptid zaveden a exprivován. Kromě toho, AHAS polypeptidy mohou být modifikovány značkou schopnou poskytnutí detegovatelného signálu, bud přímo nebo nepřímo, včetně radioizotopů, fluorescentních sloučenin, a podobně.

Chemicky rezistentní rostliny a rostliny obsahující variantní AHAS geny

Předkládaný vynález obsahuje transgenní buňky, včetně, ale nejen, semen, organismů a rostlin, do kterých byly zavedeny geny kódující AHAS varianty rezistentní na herbicidy. Neomezující příklady vhodných rostlin, do kterých mohou být zavedeny, jsou uvedeny v tabulce 1 dále:

·· • · · · · • · · · · · • · · ·· • · · · · · · • · · · ··· ·· ··

Tabulka 1

Rostliny, které mohou být příjemci

Běžné jméno	Rod	Latinské jméno
Kukuři c e		Gramineae	Zea mays
Kukuři ce,	Dent	Gramineae	Zea mays
			dent i f ormi s
Kukuř i ce,	flint	Gramineae	Zea mays vulgaris
Kukuři ce,	pop	Gramineae	Zea mays
			mi crosperma
Kukuř i ce,	j emná	Gramineae	Zea mays amylacea
Kukuři ce,	s1adká	Gramineae	Zea mays
			amy1easaccharate
Kukuři ce,	sladká	Gramineae	Zea mays saccharate
Kukuř i ce,	Waxy	Gramineae	Zea mays ceratina

Pšenice,	Dinke1	Poo ideae	Tri t i cum	spěl ta
Pšenice,	durum	Poo ideae	Tri t i cum	durum
Pšenice,	ang1 i cká	Pooideae	Tr i t i cum	turg idum
Pšenice,	velká špalda	Poo i deae	Tr i t i cum	spe1 ta
Pšenice,	po 1 i sh	Pooideae	Tr i t i cum	po 1 onium
Pšenice,	poulard	Pooideae	Tr i t i cum	monococcum
Pšenice,	j ednozrnná	Pooideae	Tri t i cum	monococcum
Pšenice,	j emná	Pooideae	Tri t i cum	aes t ivum

Rýže

Oryza sativa americká divoká Gramineae

Zizania aquatica

Rýže, australská

Gramineae

Oryza aus trali ens i s ·· • · • · · · · ··

Rýže, indická Rýže, červená Rýže, tuscarora Rýže, západoafrická	Grami neae Gramineae Gramineae Gramineae	Zizania aquatica Oryza glaberrima Zizania aquatica Oryza glaberrima
J ečmen	Poo ideae	Hordeum vulgare
Ječmen	Poo ideae	Hordeum irregulare
Abys s ini an intermediate také iregular
Ječmen, Ancestarl	Poo i deae	Hordeum spontaneum
twor
Ječmen, bezvousý	Poo ideae	Hordeum trifurcatum
Ječmen, egyptský	Poo ideae	Hordeum trifurcatum
Ječmen, fourrrowed	Poo ideae	Hordeum vulgare
Ječmen, sixrowed	Poo ideae	polys t i chon Hordeum vulgare
Ječmen, tworowed	Pooideae	hexast i chon Hordeum distichon
Bavlna, Abroma	Di cotyledonaea	Abroma augusta
Bavlna, Američan	Malvaceae	Gossypium hirsutum
Upland
Bavlna, Asiatic Tree	Malvaceae	Gossypium arboreum
též Indián Tree
Bavlna, Brazilian,	Malvaceae	Gossypium barbadense
též Kidney, a		brasiliense
Pernambuco
Bavlna, Levant	Malvaceae	Gossypium herbaceum
Bavlna, Long Silk	Malvaceae	Gossypium barbadense

také Long Staple, • · · · • · • · • ·

• · · · ·

Sea Island

Bavlna, mexican,	Malvaceae	Gossypium hirsutum
též Short Staple
Sojové boby, Sója	Leguminosae	Glycine max
Cukrová řepa	Chenopodi aceae	Beta vulgaris alt i s s ima
Cukrová třtina	dřeviny	Arenga pinnata
R a j č e	Solanaceae	Lycopers i con esculentum
Rajče, Cherry	Solanaceae	Lycopers i con esculentum ceras i f ořme
Rajče, Common	Solanaceae	Lycopers i con esculentum communae
Rajče, Currant	Solanaceae	Lycopers i con pimpinellifoli um
Rajče, Husk	Solanaceae	Physalis ixocarpa
Rajče, Hyenas	Solanaceae	Solanum incanum
Rajče, Pear	Solanaceae	Lycopers i con

esculentum pyr i f ořme

Rajče, Tree	Solanaceae	Cyphomandra betacea
Lilek brambor Lilek brambor španě1ský,	Solanaceae Convolvulaceae	Solanum tuberosum Ipomoea batatas

sladký brambor • · ···· ♦· · · · ·· • · · ···· ···· • · ··· · · · · · ·· • · ··· · · · ···· · • · ···· ··· • a · · · « · a a a a a a a

Zito, common	Poo ideae Poo ideae	Secale cereale Secale montanum
Zito, Mountain
Pepř, Bell	Solanaceae	Capsicum annuum gros sum
Pepř, Bird	Solanaceae	Capsicum annuum
též kayenský,		minimum
guine j ský
Pepř, Bonnet	Solanaceae	Capsicum sinense
Pepř, Bullnose	Solanaceae	Capsicum annuum
též sladký		gros sum
Pepř, Cherry	Solanaceae	Capsicum annuum ceras i formě
Pepř, Cluster,	Solanaceae	Capsicum annuum
též Red Cluster		fasciculatum
Pepř, Cone	Solanaceae	Capsicum annuum cono ides
Pepř, Goat	Solanaceae	Capsicum frutescens
též Spur
Pepř, Long	Solanaceae	Capsicum frutescens 1ongum
Pepř ,	Solanaceae	Capsicum annuum
Oranamental Red		abreviatum
též Wrinkled
Pepř, Tabasco	Solanaceae	Capsicum annuum
Red		cono ides
Locika, zahradní	Compos i tae	Lactuca sativa
Locika, Asparagus	Compos i tae	Lactuca sativa
též celer		asparagina
Locika, modrá	Compos i tae	Lactuca perennis
Locika, modrá	Compos i tae	Lactuca pulchella

• · ···· ·· · · · · · « · · ···· ···· • ···· · · · · ··· • · · · · · · · · · · · · ·· · · · · ··· ·· ··· · · · · · ·· ··

též Chicory Locika, kapusta	Compos i tae	Lactuca sativa
též hlávková		cápi tata
Locika, Cos	Composi tae	Lactuca sativa
též Longleaf,		1ong i f o 1 i a
Romaine
Locika, Crinkle	Compos i tae	Lactuca sativa
též Curled		cr i spa
Cutting Leaf
Celer	Umbel1iferae	Apium graveolens dul ce
Celer, bělený,	Umbe11 i f erae	Apium graveolens
též zahradní		dul ce
Celer, kořenový, též	Umbe11 i f erae	Apium graveolens
Turniprooted		rapaceum
Lilek jedlý	Solanaceae	Solanum melongena
Cirok obecný	Sorghum	všechny druhy
To 1 i ce vo j t ěška	Leguminosae	Medicago sativum
Mrkev	Umbel1iferae	Daucus carota sativa
Fazole, pnoucí	Leguminosae	Phaseolus vulgaris vulgari s
Fazole, Sprouts	Leguminosae	Phaseolus aureus
Fazole, Brazilian	Leguminosae	Canavali a
Broad		ens i f ormi s

·· · ··· ·· • · · · « • ♦ ··· ·· • · · · ·· • · · ·· • · · · · · · • ·· ·♦ ·· · ·· · • ·· · · • · ··· · · • · · · ··· ·· ··

Fazole, Broad Fazole, Common,	Leguminosae Leguminosae	Vicia faba Phaseolus vulgaris
též Francouzská bílá, Kidney Fazole, egyptská	Leguminosae	Dolichos lablab
Fazole, dlouhá,	Leguminosae	Vigna
též Yardlong		sesquipedali s
Fazole, Winged	Leguminosae	Psophocarpus
Oves setý, též	Avena	tetragono1obus Sat iva
Common, Side Tr ee Oves černý, též	Ave na	Strigosa
Br i s 11e Lops i ded Oves, Br i s 11e	Avena
Hrách, také zahradní	Leguminosae	Pisum sativum
zelený, Shelling		sat ivum
Hrách, Blackeyed	Leguminosae	Vigna sinensis
Hrách, Edible	Leguminosae	Pisum sativum
Podded		axiphium
Hrách, Grey	Leguminosae	Pisum sativum
Hrách, křídlatý	Leguminosae	s p e c i o s um Tetragonolobus
Hrách, Wrinkled	Leguminosae	purpureus Pisum sativum
Slunečnice	Compos i tae	medullare Helianthus annuus
Tykev, podzimní,	Di cotyledoneae	Cucurbita maxima

·♦					•	• ·		··
	•	•	•	•	··	• ·	•	•
•	•	···	•	•	•	• ·		··
•	•	• ·	•	•	•	• · · ·	•	•
•	•	•	•	•	•	•	•	•
··		···		·♦	»··	« ·		• ·

zimní

Tykev, liánovitá též letní	Dicotyledoneae	Cucurbita pepo melopepo
Tykev, Turban	Dicotyledoneae	Cucurbita maxima turbani f ormi s
Okurka	Di cotyledoneae	Cucumis sativus
Okurka, africká	Dicotyledoneae	Mamordica charantia
též hořká
Okurka, Squirting	D i coty1edoneae	Ecballium elaterium
též divoká
Okurka, divoká	Dicotyledoneae	Cucumis anguria
Topol kalifornský	dřeviny	Populus trichocarpa
Topol, evropský		Populus nigra
černý
Topol, š edý		Populus canescens
Topol, lombardy		Populus italica
Bříza, Silverleaf		Populus alba

též bílá

Tabák	Solanaceae	Nicot iana
Arabidops i s	Cruci f erae	Arabidops i s
thaliana		thaliana

Trávy	Lolium
Trávy	Agros t i s Jiné rodiny trav
Jetel	Leguminosae

Exprese variant AHAS polypeptidů v transgenních rostlinách ··· · • · ·· ·· uděluje vysokou hladinu rezistence na herbicidy, vcetne, ale nejenom, imidazolinonových herbicidů jako je, například, imazethapyr (PURSUIT^R), která umožňuje použití těchto herbicidu v průběhu kultivace transgenních rostlin.

Metody pro zavedení cizorodých genů do rostlin jsou v oboru známé. Neomezující příklady takovýchto metod zahrnují infekci Agrobacterium, bombardování částicemi, ošetření protoplastů polyethy1englyko1em (PEG), elektroporaci protoplastů, mikroinjekci, makroinjekci, injekci odnoží, dráhu pollen tube , imbibici sušených semen, perforaci laserem, a elektroforesu. Tyto metodu jsou popsány v, například, B. Jenes et al., a S.W: Ritchie et al., v Transgenic Plants, sv. 1, Engeneering and Utilization, vyd. S. D. Kung, R. WU, Academics Press, lne., Harcourt Brace Jovanovich 1993; a L. Mannonen et al., Criticals Rewiews in Biotechno1ogy, 14: 287 - 310, 1994.

V preferovaném provedení je DNA kódující variantní AHAS klonována do DNA vektoru, obsahujícího markerový gen pro antibiotickou rezistenci a rekombinantní AHAS DNA, obsahující plasmid je potom zaveden do Agrobacterium tumefaciens obsahujícího Ti plasmid. Tento binární vektorový systém je popsán například v U.S. patentu č. 4.490838 a v An et al., Plant Mol. Biol. Manual A3: 1 - 19 (1988). Transformované Agrobacterium je potom ko-kultivováno s listovými disky od recipientní rostliny pro umožnění infekce a transformace rostliných buněk. Transformované rostlině buňky jsou potom kultivovány v regeneračním mediu, které navozuje tvorbu výhonků, nejprve za přítomnosti vhodného antibiotika pro selekci transformovaných buněk, potom za přítomnosti herbicidu. V rostliných buňkách, které byly úspěšně transformovány DNA

I 'š -ť o kódující AHAS rezistentní na herbicidy se tvorba výhonků vyskytuje i za přítomnosti herbicidu, který inhibuje tvorbu výhonků z netransformovaných buněk. Po potvrzení přítomnosti variantní AHAS DNA za použití, například, polymerasové řetězové reakce (PCH) analýzy, jsou transformované buňky testovány na svou schopnost odolávat postřiku herbicidem a na svou schopnost germinace semen a iniciace kořenů a proliferace za přítomnosti herbicidu.

Jiné aplikace

Metody a kompozice podle předkládaného vynálezu mohou být použity při na struktuře založeném racionálním vývoji AHAS variant rezistentních na herbicidy, které mohou být inkorporovány do rostlin pro navození selektivní rezistence na herbicidy u rostlin. Intermediální varianty AHAS (například, varianty, které vykazují suboptimální specifickou aktivitu, ale vysokou rezistenci a selektivitu, nebo naopak) jsou užitečné jako templáty pro vývoj druhé generace AHAS variant, která si uchovává specifickou aktivitu a vysokou rezistenci a selektivitu.

Geny pro AHAS rezistentní na herbicidy mohou být transformovány do různých druhů plodin v jedné nebo v mnoha kopiích pro navození rezistence na herbicidy. Genetické zpracování plodin s redukovanou sensitivitou na herbicidy může:

1) zvýšit spektrum a flexibilitu aplikace specificky účinných a pro prostředí neškodných herbicidů jako jsou imidazolinonové herbicidy;

9· ····· · • · · ·· • · ··· ·· • · · · ·· • · · ·· ·· ··· ·«

2) zvýšit komerční hodnotu těchto herbicidů;

3) redukovat tlak plevelu na polích zemědělských účinným použitím herbicidů na herbicidy rezistentních zemědělských plodinách a v souladu s tím zvýšit výnos;

4) zvýšit prodej semen pro rostliny rezistentní na herbicidy;

5) zvýšit rezistenci na poškození rostlin z předávkování herbicidů aplikovaných při dřívějším pěstění;

6) snížit citlivost na změny v charakteristikách herbicidů vzniklých v důsledku vedlejších klimatických podmínek; a

7) zvýšit toleranci k nesprávně nebo chybně aplikovaným herb i c i dům.

Například, mohou být kultivovány transgenní plodiny obsahující AHAS variantní protein. Plodina může být ošetřena plevel kontrolujícím účinným množstvím herbicidu, na který je AHAS variantní transgenní rostlina rezistentní, což vede ke kontrole plevele bez škodlivého ovlivnění kultivované plodiny.

DNA vektory popsané výše, které kódují AHAS varianty rezistentní na herbicidy mohou být dále využity tak, že exprese AHAS variant poskytuje selektovatelný markér pro transformaci buněk vektorem. Zamýšlená recipientní buňka může být v kultuře nebo in šitu, a AHAS variantní gen může být použit samostatně nebo v kombinaci s jinými selektovatelnými markéry. Jediným požadavkem je, aby byla recipientní buňka citlivá na cytotoxický účinek příbuzného herbicidu. Toto provedení má výhodu relativně • · · · · · ·· • · · ·· • · · · · ·· • · · · ·· • · · ·· ·· ····β *· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · • · · · nízké ceny a chybění toxicity, například, na imidazo1inonu založených herbicidů, a může být použito v jakémkoliv systému, který vyžaduje DNA mediovanou transformaci.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady jsou míněny jako ilustrace vynálezu bez j eho omezení.

Příklad 1: Vývoj AHAS variant rezistentních na herbicidy

Zbytky, které jsou umístěny těsně u navrhovaného vazebného místa pro herbicid podle modelu, který byl popsán výše, byly vybrány pro mutagenesy pro vývoj aktivního AHAS polypeptidu se sníženou vazebnou kapacitou pro herbicid. Každé místo na povrchu vazebné kapsy bylo uvažováno ve smyslu potenciálních interakcí s jinými zbytky v kapse, stejně jako s kofaktory a herbicidy. Například, při adici pozitivně nabitého zbytku je uvažováno, že bude interferovat s distribucí náboje uvnitř vazebného místa, což povede ke ztrátě afinity vazby negativně nabitého herbicidu.

Byly identifikovány tři zbytky jako nejvíce užitečné pro mutagenesi:

1) O F135 se soudilo, že interaguje jak s isoa11oxazi novým kruhem FAD, tak s aromatickou skupinou herbicidů. V souladu se strategií zavedení více nabitých zbytků do vazebné kapsy byl tento zbytek změněn na arginin.

2) M53 kontaktuje šroubovici 498 - 507. Tato šroubovice obsahuje známá mutační místa rezistence na herbicidy a je také

♦ · <· • · · • ·· • · · · · • · · ·· ·· předpokládána ve vazbě TPP. Dále, o substituci kyseliny glutamové v pozici 53 se soudí, že usnadňuje interakci s K185, což redukuje afinitu K185 ke karoxylatové skupině imazethapyru.

3) R128 je umístěn poblíž vchodu do kapsy, kde se soudí, že se účastní počátečního transportu nabitých herbicidů do vazebné kapsy. Tento zbytek byl změněn na alanin pro odstranění jeho náboje a jeho dlouhého hydrofobního postranního řetězce.

Příklad 2: Místně řízená mutageneze AHAS pro produkci variant rezistentních na herbicidy

Arabidopsis AHAS gen byl insertován v rámečku na 3' konec kódujícího regionu genu pro glutathion-S-transferasu v pGEX-2T vektoru (Pharmacia). Konstrukce vektoru tímto způsobem uchovává šesti aminokyselinovou thrombin rozpoznávající sekvenci ve spojení exprivovaného glutathion-S-transferasa/AHAS fúzního proteinu.Trávení thrombinem exprivovaného fúzního proteinu vede k AHAS proteinu s N-koncovou počáteční pozicí na konci přechodného peptidu v putativním místě pro zpracování přechodného peptidu, s reziduálním N-koncovým glycinem odvozeným od rozpoznávacího místa pro thrombin. Konečný amino-konec štěpeného AHAS proteinu se skládá z Gly-Ser-Ser-I1e-Ser. Místně řízené mutace byly zavedeny do AHAS genu v tomto vektoru.

Místně řízené mutace byly konstruovány podle PCR metody podle Higuchi (Recombinant PCR, v MA Innis, et al., PCR protocols: A Guide to Methods and Applications, Academics Press, San Diego, str. 177 - 183, 1990). Dva PCR produkty, každý přesahující mutační místo, byly amp1 ifikovány. Primery v přesahujjícím regionu obsahovaly mutace. Přesahující PCR amplifikované • · fragmenty byly kombinovány, denaturovány a tepelně zpracovány dohromady, za produkce dvou možných heteroduplexních produktů se zkrácenými 3' konci. Zkrácené 3'-konce byly rozšířeny Taq DNA polymerasou za produkce fragmentu, který byl sumou dvou přesahujících PCR produktů obsahujících požadovanou mutaci. Následující reamplifikace tohoto fragmentu s pouze dvěma zevními primery vedla k obohacení produktu kompletní délky. Produkt obsahující mutaci byl potom znovu zaveden do Arabidopsis AHAS genu v pGEX-2T vektoru.

Příklad 3: Exprese a purifikace AHAS variant

A. Metody

E. coli (DH5a) buňky transformované pGEX~2T vektorem obsahujícím bud přirozený typ AHAS genu kukuřice (vektor označený pAC751), Arabidopsis Ser653Asn mutant, nebo Arabidopsis Ile401Phe mutant, byly kultivovány přes noc v LB bujónu obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu. Kultura E. coli kultivovaná přes noc byla ředěna 1:10 v 1 1 LB, 50 pg/ml ampicilinu, a 0,1% objem/objem protipěnivého přípravku A. Kultura byla inkubována při 37 °C s třepáním, dokud ODeoo nedosáhlo přibližně 0,8. Byla přidána isopropylthiogalaktosa (IPTG) do konečné koncentrace 1 mM a kultura byla inkubována po další tři hodiny.

Buňky byly sklízeny centrifugací při 8670 x g po 10 minut na JA-10 rotoru a byly resuspendovány v 1/100 původního objemu kultury v MTPBS (16 mM Na₂HPO4, 4 mM NaH₂PO4, 150 mM NaCl, pH 7,3). Byly přidány Triton X-100 a lysozym v konečné koncentraci 1% objem/objem a 100 pg/ml, v příslušném pořadí. Buňky byly inkubovány při 30 °C po 15 minut, ochlazeny na 4 °C na ledu a

* · · · · • · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · ··· ·· ·· • · · · · byly lysovány sonikací po 10 sekund stupněm 7 s Branson Sonifier Cell Disrupter vybaveném mikrotip sondou. Buněk prostý extrakt byl centrifugován při 35000 x g po 10 minut při 4 °C. Supernatant byl slit a krok centrifugace byl opakován.

Purifikace exprivovaných fúzních proteinů byla provedena modifikovaným způsobem podle Smith a Johnson (Gene 67: 31 40, 1988). Supernatant byl ohřát na pokojovou teplotu a byl zaveden do 2 ml kolony glutathion-agarosových korálků (sírová vazba, Sigma) ekvi1ibrovaných v MTPBS. Kolona byla následně promyta MTPBS při pokojové teplotě, dokud A28O eluátu neodpovídal této hodnotě pro MTPBS. Fúzní protein byl potom eluován za použití roztoku obsahujícího 5 mM redukovaného glutathionu v 50 mM Tris HCI, pH 8,0. Eluovaný fúzní protein byl ošetřen přibližně 30 NIH jednotkami thrombinu a byl dialyzován proti 50 mM citrátu pH 6,5 a 150 mM NaCl.

Fúzní protein byl tráven při pokojové teplotě přes noc. Trávené vzorky byly dialyzovány proti MTPBS a pasážovány dvakrát přes glutathion agarosovou kolonu ekvi1ibrovanou v MTPBS pro odstranění glutathion transferasového proteinu. Proteinová frakce, která se nenavázala na kolonu, byla odebrána a byla koncentrována ultrafi 1trací na YM10 filtru (Amicon). Koncentrované vzorky byly zavedeny na 1,5 x 95 cm Sephacryl S-100 gelovou filtrační kolonu ekvi1ibrovanou v gelovém fitračním pufru (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,0). Dvou ml frakce byly odebrány při průtoku 0,14 ml/min. Stabilita enzymu byla testována uskladněním enzymu při 4 °C v gelovém filtračním pufru s přidáním 0,02% azidu sodného a za přítomnosti nebo za absence 2 mM thiamin pyrofosfátu a 100 μΜ flavin adenin dinukleotidu (FAD).

• · *

·· ···· ·· • · · ·· • · ··· ·· • · · · ·· • · · ·· • · · · · · · • · • · • ♦ · · · • · · • · · ·

B. Výsledky

E. coli transformovaná pAC751 plasmidem obsahujícím přirozený AHAS gen downstream a v rámečku s GST genem exprivovala při indukci IPTG 91 kDa protein. 91 kDa protein vykazoval předpokládanou molekulovou hmotnost GST/AHAS fúzního proteinu (součet 26 a 65 kDa, v příslušném pořadí). Při pasážování buněk prostého extraktu DH5ct/pAC751 přes glutathion-agarosový afinitní gel, promytí a eluování volného glutathionu byl získán přípravek bohatý na 91 kDa protein (obrázek 6, linie C). Šesti aminokyselinové rozpoznávací místo pro thrombin zapracované do spojení GST a AHAS bylo úspěšně štěpeno thrombinem (obrázek 6, linie D). Přípravek štěpeného fúzního proteinu se skládal z očekávaného 26 kDa GST proteinu a 65 kDa kukuřičného AHAS proteinu. Kukuřičný AHAS protein byl purifikován do homogenity druhou pasáží přes glutathion-agarosovou kolonu pro afinitní vyloučení GST a byl podroben konečnému kroku Sephacryl S—100 gelové filtrace pro eliminaci thrombinu (Obrázek 6, linie E). 65 kDa protein je rozpoznán na western blotech monoklonální protilátkou namířenou proti kukuřičnému AHAS peptidu.

Purifikovaný přirozený kukuřičný AHAS byl analyzován elektrospreyovou hmotovou spektrometrií a bylo určeno, že má molekulovou hmotnost 64996 daltonů (data nejsou ukázána). Předpokádaná hmotnost, jak je vypočítána z určené aminokyse1onové sekvence genu inzertovaného do pGEX-2T vektoru, je 65058. 0,096% diskrepance mezi empiricky určenou a předpokládanou hmotností byla v mezích variability hmotového spektrometru. Blízkost dvou určení hmotnosti naznačuje, že zde nejsou chybně inkorporované nukleotidy během konstrukce expresního vektoru, ani jakékoliv posttranslační modifikace • · · · · ·

proteinu, které by mohly způsobit velké změny v molekulové hmotnosti. Kromě toho, chybění nepravých peaků v přípravku purifi kovaného enzymu ukazuje, že vzorek byl prostý kontaminace.

Příklad 4: Enzymatické vlastnosti AHAS variant

Enzymatické vlastnosti přirozených a variantních AHAS produkovaných E. coli byly měřeny modifikací metody podle Sing et al., (Anal. Biochem., 171: 173 - 179, 1988) následovně:

Reakční směs obsahující 1 x AHAS testovací pufr (50 mM HEPES, pH 7,0, 100 mM pyruvát, 10 mM MgC12, 1 mM thiamin pyrofosfát (TPP) a 50 μΜ flavin adenin dinukleotid (FAD)) byla získána bud ředěním enzymu v 2x testovacím pufru nebo přídavkem koncentrovaného enzymu do lx AHAS testovacího pufru. Všechny testy obsahující imazethapyr a asociované kontroly obsahovaly konečnou koncentraci 5% DMSO díky adici imazethapyru do testovací směsi jako 50% DMSO roztoku. Testy byly provedeny v konečném objemu 250 μΐ při 37 °C na mikrotitračních plotnách. Po umožnění vývoje reakce po 60 minut byla akumulace acetolaktátu měřena kolorimetricky jak popsal Singh et al., Anal. Biochem. 171: 173 - 179, 1988.

Kukuřičná AHAS exprivovaná a purifikovaná z pAC751 jak je popsáno v příkladu 3, výše, je aktivní v konverzi pyruvátu na acetolaktát. Celá aktivita AHAS je závislá na přítomnosti kofaktorů FAD a TPP v testovacím mediu. Žádná aktivita nebyla detegována, pokud byla přidána pouze FAD do testovacího media. Aktivita purifikovaného enzymu s pouze TPP, nebo bez kofaktorů, byla menší než 1 % aktivity detekované za přítomnosti jak TPP, tak FAD. Normálně je AHAS přítomná v surových rostliných • · · · · · • · • · ·· ·· • · · • *· • · · · · ·· ··· extraktech velmi labilní, zejména za absence substrátu a kofaktorů. Oproti tomu, purifikovaná AHAS z bakteriálních expresních systémů nevykazovala žádnou ztrátu katalytické aktivity, pokud byla skladována jeden měsíc při 4 °C v 50 mM HE/ES pH 7,0, 150 mM NaCl, 0,02% NaN3 za přítomnosti nebo za absence FAD a TPP. Kromě toho, žádné degradační produkty nebyly viditelné v těchto přípravcích, pokud byly vyšetřovány na SDS-PAGE gelech.

Specifické aktivity přirozené AHAS a M124E, R199A a F206R variant jsou ukázány v tabulce 2, níže. Jak je určeno ze sestavení na obrázku 5, M124E mutace v Arabidopsis AHAS je ekvivalentní M53E mutaci kukuřice, R199A mutace v Arabidopsis AHAS je ekvivalentní R128A mutaci kukuřice, a F206R mutace v Arabidopsis AHAS je ekvivalentní F135R mutaci kukuřice. Mutace vyvinuté ve strukturálním modelu kukuřičné AHAS byly použity pro identifikaci ekvivalentních aminokyselin v dvojděložním Arabidopsis AHAS genu a byly inkorporovány do a testovány v Arabidopsis AHAS genu. Tato translace a inkorporace racionálně vyvinutých herbicidových mutací do dvojděložního Arabidopsis AHAS genu mohou usnadnit hodnocení rezistence na herbicidy u dvojdě1ožních rostlinných druhů.

·· ···· • · · • · ··· • · · · • * · ·· ···

• ·· ·· ·· · ·« « • · · · ·

Specifická aktivita

Tabulka 2

1 1 1 1	specifická aktivita	1 % katalytické | aktivity ve srovnání| s přirozeným typem | I
1 |přirozený typ	99,8	1 100 |
|Met124G1U	9, 15	9,16 |
|Arg199A1a	86,3	86,5 |
|Phe206Arg 1	5,07	5,1 | 1

R199A mutace udržuje vysokou hladinu katalytické aktivity (tabulka 2), zatímco vykazuje signifikantní hladinu rezistence na imazethapyr (obr. 7). Důležité je, že tato varianta si zachovává úplnou citlivost na sulfonylmočoviny (obr. 8). Tak tato varianta splňuje kriteria vysoké specifické aktivity a selektivní rezistence na herbicidy. Oproti tomu, M124E substituce vede k téměř úplné rezistenci na imazethapyr (obr. 7), ale také vykazuje vážně redukovanou katalytickou aktivitu (tabulka 2). Ve vztahu k rezistenci na imidazolinon vykazuje tato varianta vyšší citlivoxt na sulfonylmočovinu (obr. 8), což naznačuje, že tento zbytek je dobrým kandidátem pro vytvoření mutací, které udílejí selektivně rezistenci. Substituce aminokyseliny jiné než kyseliny glutamové může napomoci uchování katalytické aktivity. F206R substituce dává podobné výsledky jako jsou ty, které jsou pozorovány u M124E varianty, ale chybí ji selektivita rezistence.

99 99

9 9 9 9

9 9 99 · 99 9 9 9

9 9 9

999 99 99

999999

9 9 99

9 999 99

9 9 « ·· • · · ··

99999

Příklad 5: Opakovaná vylepšení AHAS variant rezistentních na herbicidy za použití přístupu racionálního vývoje

Změna zbytku 124 v AHAS z Met na Glu jak je popsáno v příkladu 4 výše uděluje rezistenci na imidazolinony, ale také redukuje enzymatickou aktivitu na 9,2% hodnoty přirozeného typu. Model kukuřičné AHAS struktury popsaný výše naznačuje, že Met53 (ekvivalentní Arabidopsis Metl24 zbytku) interaguje se sérií hydrofobních zbytků na straně α-šroubovice, která je odvozena od separátní podjednotky, ale jsou v těsné blízkosti Met53. Tak, hydrofobní interakce mezi Met53 a zbytky na šroubovici mohou stabilizovat jak asociaci podjednotka/podjednotka, tak konformaci aktivního místa. Soudilo se, že substituce hydrofobního Met zbytku s nabitým glutamatovým zbytkem s největší pravděpodobností destabilizuje inter-podjednotkové hydrofobní interakce a vede ke ztrátě katalytické aktivity.

Na základě analýz struktura/funkce byla potom aktivita původního Arabidopsis Metl24Glu (ekvivalentního ke kukuřičnému Met53Glu) mutantního enzymu opakovaně vylepšena substitucí více hydrofobní aminokyseliny (Ile) v této pozici. Hydrofobní charakter Ile postraního řetězce vedl k znovunavození aktivity na úroveň přirozeného typu (specifická aktivita 102, ekvivalentní 102% aktivity přirozeného typu), ale s větší objem Ile postraního řetězce byl stále schopen udržet signifikantní hladinu rezistence na imidazolinon (obr. 9).

Při srovnání, substituce histidinového zbytku do této pozice vedla k AHAS variantě vykazující specifickou aktivitu 42,5, ekvivalentní 42,6% aktivity přirozeného typu. Tento mutant, nicméně, vykazoval vysoký stupeň rezistence na PURSUIT^R.

• · · · · · • ·

• · • · · · · • · · · · · · • · · · • · · · · · a

Příklad 6: Opakovaná vylepšení AHAS variant rezistentních na herbicidy za použití přístupu racionálního vývoje

Jiným příkladem opakované vylepšení za použití metod podle předkládaného vynálezu je Argl28Ala varianta. Strukturální model kukuřičné AHAS naznačuje, že Arg 128 zbytek, který je umístěn na okraj vazebného místa pro herbicid, se účastní zavádění nabitých substrátů a herbicidů do vazebného místa pro herbicid a do aktivního místa. Arg 128 je daleko od TPP skupiny, která váže iniciální molekulu pyruvátu v reakčním mechanismu AHAS, což vysvětluje, proč substituce Arabidopsis AHAS Arg 199 (ekvivalentní k kukužičnému Argl28) za alanin má malý účinek na katalytickou aktivitu enzymu. Strukturální model dále ukazuje, že v této pozici může být provedena více radikální změna pro dosažení hladiny rezistence za udržení vysoké hladiny katalytické aktivity. Na tomto základě bylo provedeno opakované vylepšení mutace pro substituci pozitivně nabitého argininového zbytku za negativně nabitý glutamatový zbytek. Takto mutovaný enzym měl vylepšené hladiny rezistence na PURSUIT^R za zachování vysoké úrovně aktivity (specifická aktivita 114, ekvivalentní 114% aktivity přirozeného typu) (obr. 11).

Příklad 7: Zaměnitelnost AHAS odvozených od různých druhů v na struktuře založeném racionálním vývoji AHAS variant rezistentních na herbicidy

Strukturální model trojrozměrné struktury AHAS je sestaven s jednoděložnou AHAS sekvencí jako je například ta, která je odvozena od kukuřice, jak bylo popsáno výše. Pro zavedení mutací do AHAS odvozených od dvojdě1ožných druhů jako je Arabidopsis byly sekvence AHAS odvozené od jednodě1ožných a dvojdě1 ožných • · · · · · 9 9 · 9 99 9

9 9 9 9 99 9 9 99

9 9 99 9 9 9 9 9 99

9 999 9 9 9 99999

9 9 9 9 9 9 99

999 99 999 9999 druhů sestaveny za použití GAP a PILEUP programů (Genetics Computer Group, 575, Sequence Drive, Madison, WI 53711). Ekvivalentní pozice jsou určeny z počítačově generovaného sestavení. Mutace jsou potom zavedeny do dvojdě1ožného AHAS genu jak bylo popsáno výše. Po expresi mutantniho AHAS proteinu v E. coli a hodnocení jeho biochemických vlastnosstí (t.j. specifické aktivity a rezistence na herbicidy) je mutantni gen zaveden do dvojděložné rostliny rostlinou transformační metodou jak byla popsána výše.

Příklad 8: Produkce rostlin rezistentních na herbicidy transformací racionálně vyvinutými AHAS geny

DNA konstrukty:

Racionálně vyvinuté AHAS variantní geny obsažené v expresních vektorech E. coli byly použity jako zdroj DNA restrikčních fragmentů pro nahrazení ekvivalentních restrikčních fragmetnů v Arabidopsis AHAS genu. Tento gen je přítomen v 5,5 kb fragmentu genomové DNA, který také obsahuje Arabidopsis AHAS promotor, Arabidopsis AHAS terminační sekvenci a 5'- a 3'- sousedící DNA. Po provedení DNA sekvencování přes mutační místa pro potvrzení přítomnosti správných mutací byl celý 5,5 kb fragment z každého plasmidu insertován do na pBIN založeného rostliného transformačního vektoru (Mogen, Leiden, Netherlands). Rostlinný transformační vektor také obsahoval neomycin fosfotransferasa II (nptll) gen pro rezistenci na kanamycin řízený 35S promotorem viru květákové mozaiky. Konečný vektorový konstrukt je ukázán na obrázku 12. Vektory obsahující Arabidopsis AHAS geny s Metl24Ile, Metl24His, a Argl99Glu mutace (korespondující Met53Ile, Met53His a Argl28Glu mutacím AHAS sekvence u kukuřice

Φ © φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φ ♦ · · · «· φφφφ · · · · · φ Φ Φ ΦΦΦ • Φ φφφ Φ φ ř φφφφ φ

Φ Φ φφφφ φφφ

ΦΦ ΦΦΦ Φ Φ ΦΦΦ «Φ ΦΦ jak je ukázáno na obr. 1) byly označeny pJK002, pJK003, a pJK004, v příslušném pořadí.

Každý z těchto vektorů byl transformován do Agrobacterium tumefaciens kmene LBA4404 (R&D Life Technologies, Gaithersburg, MD) za použití transformační metody popsané v An et al., Plant. Mol. Biol. Manual., A3: 1 - 19 (1988).

Transformace rostlin

Transformace listových disků Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38 byla provedena podle Horshc et al., (Science, 227: 1229 1231, 1985) s drobnými modifikacemi. Listové disky byly odebrány od rostliny kultivované za sterilních podmínek a byly ko-kultivovány horní stranou dolů v Murashige Skoog mediu (Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO) po 2-3 dny při 25 °C ve tmě se kmeny Agrobacterium tumefaciens obsahujícími plasmidy pJK002, pJK003, nebo pJK004. Disky byly blotovány za sucha a přeneseny do regeneračního Murashige Skoog media s B5 vitaminy obsahujícími 1 mg/1 benzyladeninu a 0,1 mg/1 1-naftyloctové kyseliny, 100 mg/1 kanamycinu a 500 mg/1 cefotaximu (vše získáno od S i gma) .

Nejprve byly transformanty selektovány rezistencí na kanamycin udílenou nptll genem přítomným ve transformačních vektorech. Výhonky odvozené z listových disků byly excidovány a umístěny na čerstvém Murashige Skoog hormonů prostém mediu obsahujícím cefotaxim a kanamycin.

• · · · · · • ·· • ·· · · • ·· • ·· «· · ·· • · · · « · · · · · • · · • · « ·

In vivo rezistence na herbicidy přeneseny do koncentraci

Tabákové výhonky rezistentní na kanamycin media obsahujícího 0,25 μΜ imazethapyru. Při imidazo1inonového herbicidu nebyly schopné netransformované tabákové výhonky (obsahující endogenní přirozený typ AHAS) iniciace tvorby byly pozorovány mutantních AHAS byly této kořínků. Oproti tomu, iniciace kořínků a růst u tabákových výhonků transformovaných každým z genů. Kořínky vyvíjené z výhonků transformovaných Metl24Ile a Argl99Glu mutantními přirozeným typem jsou ukázány na obrázku 1. Kromě transformované Metl24Ile nebo Argl99Glu mutantními g/ha) geny spolu s toho, rostliny geny byly rezistentní na postřik dvojnásobnou dávkou (100

13). Charakter růstu kořínků . netransformovaných rostlin herbicidem naznačují, rezistenci na herbicidy udílí rezistenci na imazethapyru (obr. transformovaných vs chování po postřiku vyvíjených genů pro herbicidy in vivo.

stejně jako že exprese racionálně

Detekce racionálně vyvíjených genů u tabáku rezistentního na herbi cidy

Genomová DNA byla izolována od AHAS transformovaných rostlin tabáku a přítomnost Arabidopsis AHAS variantních genů byla potvrzena PCR analýzou. Rozdíly mezi nukleotidovými sekvencemi Arabidopsis AHAS genu a dvěma AHAS geny tabáku byly využity pro vývoj PCR primerů, které amplifikují pouze Arabidopsis gen na pozadí genomové DNA tabáku. Racionálně vyvinuté geny rezistence na herbicidy byly detegovány, jak je ukázáno, amplifikací DNA fragmentu správné velikosti, ve většině rostlin rezistentních na herbicidy. Žádný PCR signál nebyl pozorován u netransformovaných

Φ · · · · • · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · ·

tabákových rostlin.

Segregace transformovaných AHAS genů

Pro monitorování segregace racionálně vyvinutých AHAS genů u transformovaných rostlin byly provedeny germinační testy. Semena byla umístěna v hormonů prostém Murashige Skoog mediu obsahujícím více než 2,5 μΜ PURSUIT^R a 100 μΜ kanamycinu. Vzniklé semenáčky byly vizuálně odečítány na rezistenci nebo na citlivost na herbicid.

Protože rostliny tabáku jsou diploidní, bylo očekáváno, že potomstvo samoopy1ených rostlin by mělo segregovat 3:1 rezistentní:ci11 ivé, což odráží existenci 1 semenáčku homozygotního pro rezistentní AHAS gen, 2 semenáčků heterozygotních pro rezistentní AHAS gen a 1 semenáčku postrádajícího rezistentní AHAS gen.

Výsledky ukazují, že rezistentní AHAS geny jsou segregující v očekávaném poměru 3:1, což podporuje závěr, že rezistence na herbicidy je udílena jednou, dominantní kopií racionálně vyvíjeného AHAS genu.

Tyto výsledky ukazují, že racionální vývoj genů AHAS rezistentní na herbicidy může být použit pro produkci rostlin, které vykazují na herbicidy rezistentní růst in vivo.

Příklad 9: Produkce rostlin zkříženě rezistentních na různé herbicidy transformací racionálně vyvinutými AHAS geny

Tabákové rostliny transformované racionálně vyvinutými AHAS geny jak bylo popsáno v příkladu 8, výše, byly také testovány na zkříženou rezistenci na jiný herbicid, CL 299263 (také známý jako imazamox). Germinační testy byly provedeny na semenech získaných od primárních transformantů obsahujících Metl24Ile, Metl24His a Argl99Glu Arabidopsis AHAS variantní geny, za přítomnosti nebo za absence 2,5 μΜ CL 299263 (obr. 15). Tato koncentrace herbicidu způsobuje těžkou zakrslost a odbarvení přirozených rostlin tabáku. Tabákové rostliny transformované Metl24His genem vykazovaly vyšší hladinu rezistence (obr. 15). Argl99Glu transformanty vykazovaly střední hladinu rezistence, zatímco Metl24Ile vykazovaly slabou rezistenci (obr.15).

Všechny patenty, aplikace, články, publikace a testovací metody jsou zde uvedeny jako odkazy.

Mnoho variací předkládaného vynálezu bude odborníkům v oboru zřejmých ve světle výše uvedeného podrobného popisu. Takové variace spadají plně do rozsahu připojených patentových nároků.

Claims (9)

1. Způsob modelování založený na struktuře pro produkci AHAS variantního proteinu rezistentního na herbicidy vyznačující se t í m, že obsahuje:

(a) sestavení cílového AHAS proteinu na pyruvát oxidasovém templátu nebo ekvivalentu AHAS modelování pro odvození trojrozměrné struktury uvedeného cílového AHAS proteinu;

(b) modelování jednoho nebo více herbicidů do uvedené trojrozměrné struktury pro lokalizaci vazebného místa pro herbicid v uvedeném cílovém AHAS proteinu;

(c) selekci alespoň jedné aminokyselinové pozice v uvedeném cílovém AHAS proteinu jako cíle pro mutaci, kde uvedená mutace pozměňuje afinitu alespoň jednoho herbicidu k uvedenému vazebnému místu;

(d) mutaci DNA kódující uvedený cílový AHAS protein pro produkci mutantni DNA kódující variantní AHAS obsahující uvedenou mutaci v uvedené pozici; a (e) expresi mutované DNA v jedné buňce, za podmínek, za kterých je produkován uvedený variantní AHAS obsahující mutaci uvedené pozici.

2. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 1 vyznačující se tím, že dále obsahuje:

(f) expresi DNA kódující přirozený AHAS protein paralelně ve druhé buňce;

(s) purifikaci uvedených přirozených a uvedených variantních AHAS proteinů z uvedených buněk;

(h) testování uvedených přirozených a uvedených variantních

AHAS proteinů na katalytickou aktivitu v konverzi pyruvátu na acetolaktát nebo v kondenzaci pyruvátu a 2-ketobutyrátu za tvorby acetohydroxybutyrátu, za absence a za přítomnosti uvedeného alespoň jednoho herbicidu; a (i) opakování kroků (c) - (h), kde je uvedená DNA kódující uvedenou variantu v kroku (e) použita jako AHAS kódující DNA v kroku (c), dokud není identifikován první AHAS variantní protein rezistentní na herbicid, který má vlastnosti:

(i) za absence alespoň jednoho herbicidu (a) má katalytickou aktivitu, která je sama dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován; nebo (b) má katalytickou aktivitu v kombinaci s nějakým jiným AHAS variantním proteinem rezistentním na herbicid, který může být také exprivován v uvedené buňce, který může být stejný nebo jiný než první AHAS variantní protein, kde tato aktivita je dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován;

• · ···· ·· * · ··· • · · ········ • · ··· · · ·· ··· • · · · · · · · ···· · • · · · · ···· ·· ··· ·· ··· ···· kde buňky vyžadují AHAS aktivitu pro přežíváni; a (ii) má katalytickou aktivitu, která je více rezistentní k alespoň jednomu herbicidu než je aktivita přirozené AHAS.

3. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedený ekvivalent AHAS modelování je vybrán ze skupiny skládající se z transketo 1 as, karboligas a pyruvát dekarboxy1asy.

4. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 2 vyznačující se tím, že uvedená katalytická aktivita za absence uvedeného více než jednoho herbicidu je větší než asi 20 % katalytické aktivity uvedené přirozené AHAS za absence uvedeného alespoň jednoho herbicidu.

5. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 4 vyznačující se tím, že uvedený herbicid je imidazolinonový herbicid a uvedený první AHAS variantní protein rezistentní na herbicidy má:

(i) katalytickou aktivitu za absence uvedeného herbicidu vyšší než asi 20% katalytické aktivity uvedené přirozené AHAS;

(ii) katalytickou aktivitu, které je relativně více rezistentní na přítomnost imidazolinonových herbicidů ve srovnání s přirozenou AHAS; a (iii) katalytickou aktivitu, která je relativně více citlivá na přítomnost sulfonylmočovinových herbicidů ve srovnání s imidazolinonovými herbicidy.

4 4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 4 * 4 4 4 4 4

4 4 · sou

4 4 4444 • 4 4

6. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku vyznačující se tím, že uvedené herbicidy j vybrány ze skupiny skládající se z imidazolinonů, sulfonylmočovin, triazolopyrimidinových sulfonamidů, pyrimydy1-oxy-benzoových kyselin, sulfamoylmočovin, sulfokarboxamidů, a jejich kombinací.

7. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku vyznačující se tím, že uvedený cílový AHAS protein je odvozen od Arabidopsis thaliana.

8.

je E.

Způsob modelování n a č u j ící co 1 i .

založený na se tím, struktuře podle nároku 1 že uvedenou první buňkou

Způsob modelování n a č u j ící v y z druhými buňkami jsou E.

založený na se tím, co 1 i .

struktuře podle nároku 2 že uvedenými prvními a

10. Způsob modelování vyznačuj ící založený na se tím, struktuře podle nároku 1 že uvedený cílový AHAS protein obsahuje protein mající sekvenci podle obrázku 1 nebo jeho funkční ekvivalent.

11. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 1 c í se t í vyznačuj í ze skupiny, která se skládá z:

(i) substituce aminokyselinový zbytek sekvence skupiny skládající se z P48, alespoň jedné m, že uvedená mutace je vybrána jiné aminokyseliny za podle obrázku 1 vybraný ze

G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96,

• · ···· ·· · • · · · · · · • ···· · · · • · · · • · · · • · · · • · · · « • · · • · · · • · • · • · • · · · · « • · · · • · · ·· ··· S97, G98, P99, G100, Al 01, V125, R127, R1 28, M129, 1130, G131 T132 , D133 , F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261, M262, G263 , R267, M277, L278, G279 , H281 , G282, T283, V284, G300, V301 , R302, F303, D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E312, A313 , F314, A315, S316, R317, A318, K319, 1320, E329, 1330, K332, N333, K334, 0335 , T404, G413 , V414, G415, Q416, H417, Q418, M4 1 9 , W420, A421 , A422, L434, S435, A437, G438 , L439, G440, A441 , M442 , G443 , D467, S468, S469, L471, N473 , L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501, Q502, Q504, D505 , R506, Y508, K509, A510, N511 , R5 1 2 , A513, H514, T515 , S524 , H572, Q573, E574, H575, V576, L577, P578, M579, 1580, P581 , G583 a G584, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše uvedených a jakékoliv kombinace kteréhokoliv z výše uvedených (ii) delece ví ce než 5 aminokyse 1inový ch zbytků předcházej ících, nebo více ne ž 5 aminokyselinových zbytků následujících alespoň jednomu aminokyselinovému zbytku sekvence podle obrázku 1 vybraného ze skupiny, která se sklád z P4S , G49, S52, M53, E54, A84, A95 , T96, S97, G98, P99, G100 A101 , V125, R127, R128, M129, 1130, G131 , T132, D133, F135 , Q136, D186, 1187, T259, T260, L261 , M262 , G263, R267, M277, L278, G279, H281 , G282 , T283, V284, G300 , V301, R302, F303 , D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311 , E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, 1320, E329, 1330, K332, N333 , K334, 0335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M4 1 9 , W420, A421 , A422, L434, S435, A437, G438, L439, G440, A441 , M44 2 , G443 , D467 , S468 , S469, L471 , N473 , L477, M479, Q495, H496, L497, G498 , M499, V501 , Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511 , R512, A5 1 3 , H514, T515, S524, H572, Q573, E574, H575, V576, L577, P578, M579, 1580 , P581, G583, G5 84,

funkčních ekvivalentů kteréhokoliv uvedených a z výše a

j akéko1 iv • · · • · kombinace kteréhokoliv z výše uvedených;

(iii) delece alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(iv) adice alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(v) delece alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi G300 a D324 sekvence podle obrázku 1;

(vi) adice alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi G300 a D324 sekvence podle obrázku 1; nebo (vii) jakoukoliv kombinací kteréhokoliv z výše uvedených.

12. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 11 vyznačující se tím, že uvedená substituce je vybrána ze skupiny skládající se z Met53Trp, Met53Glu, Met53Ila, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel53Arg, Ile330Phe, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše uvedených nebo kombinace kterýchkoliv z výše uvedených.

13. Způsob modelování založený na struktuře pro produkci AHAS variantního proteinu rezistentního na herbicidy vyznačující se tím, že uvedený způsob obsahuje:

(a) sestavení cílového AHAS proteinu na prvním AHAS templátu odvozeném od polypeptidu majícího sekvenci podle obrázku 1 nebo • ·· • · · · jeho funkčním ekvivalentu pro odvození trojrozměrné struktury cílového AHAS proteinu;

(b) modelování jednoho nebo více herbicidů do uvedené trojrozměrné struktury pro lokalizaci vazebného místa pro herbicid v uvedeném cílovém AHAS proteinu;

(c) selekci alespoň jedné aminokyselinové pozice v uvedeném cílovém AHAS proteinu jako cíle pro mutaci, kde uvedená mutace pozměňuje afinitu alespoň jednoho herbicidu k uvedenému vazebnému místu;

(d) mutaci DNA kódující uvedený cílový AHAS protein pro produkci mutantní DNA kódující variantní AHAS obsahující uvedenou mutaci v uvedené pozici; a (e) expresi mutované DNA v jedné buňce, za podmínek, za kterých je produkován uvedený variantní AHAS obsahující mutaci v uvedené pozici.

14. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 13 vyznačující se t í m, že dále obsahuje:

(f) expresi DNA kódující přirozený AHAS protein paralelně ve druhé buňce;

(g) purifikaci uvedených přirozených a uvedených variantních AHAS proteinů z uvedených buněk;

(h) testování uvedených přirozených a uvedených variantních AHAS proteinů na katalytickou aktivitu v konversi pyruvátu na • ·· ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · • · · ♦ · · · acetolaktát nebo v kondensaci pyruvátu a 2-ketobutyrátu za tvorby acetohydroxybutyrátu, za absence a za přítomnosti uvedeného alespoň jednoho herbicidu; a (i) opakování kroků (c) - (h), kde je uvedená DNA kódující uvedenou variantu v kroku (e) použita jako AHAS kódující DNA v kroku (c), dokud není identifikován první AHAS variantní protein rezistentní na herbicid, který má vlastnosti:

(i) za absence alespoň jednoho herbicidu (a) má katalytickou aktivitu, která je sama dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován; nebo (b) má katalytickou aktivitu v kombinaci s nějakým jiným AHAS variantním proteinem rezistentním na herbicid, který může být také exprivován v uvedené buňce, který může být stejný nebo jiný než první AHAS variantní protein, kde tato aktivita je dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován;

kde buňky vyžadují AHAS aktivitu pro přežívání; a (ii) má katalytickou aktivitu, která je více rezistentní k alespoň jednomu herbicidu než je aktivita přirozené AHAS.

15. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedená katalytická aktivita za absence uvedeného více než jednoho herbicidu je větší než asi 20 % katalytické aktivity uvedené přirozené AHAS.

······ ·· · ·· ·· ··· ···· ···· • ···· · · · · ··· • · · · · · · · ···· · • · ···· ··· ·· ··· ·· ··« ·· ··

16. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 15 vyznačující se t í m, že uvedený herbicid je imidazo1inonový herbicid a uvedený první AHAS variantní protein rezistentní na herbicidy má:

(i) katalytickou aktivitu za absence uvedeného herbicidu vyšší než asi 20% katalytické aktivity uvedené přirozené AHAS;

(ii) katalytickou aktivitu, které je relativně více rezistentní na přítomnost imidazo1inonových herbicidů ve srovnání s přirozenou AHAS; a (iii) katalytickou aktivitu, která je relativně více citlivá na přítomnost sulfonylmočovinových herbicidů ve srovnání s imidazolinonovými herbicidy.

17. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 13 vyznačující se tím, že uvedené herbicidy jsou vybrány ze skupiny skládající se z imidazolinonů, sulfonylmočovin, triazolopyrimidinových sulfonamidů, pyrimydy1-oxy-benzoových kyselin, sulfamoylmočovin, sulfokarboxamidů, a jejich kombinací.

18. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 13 vyznačující se t í m, že uvedený cílový AHAS protein je odvozen od Arabidopsis thaliana.

19. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 13 vyznačující se tím, že uvedenou první buňkou je E. coli.

·· ···

20. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 19 vyznačující se tím, že uvedenými prvními a druhými buňkami jsou E. coli.

21. Způsob modelování vyznačuj í c založený na struktuře podle nároku 13 se t í m, že uvedená mutace je vybrána ze skupiny, která se skládá z:

(i) substituce alespoň jedné jiné aminokyseliny za aminokyselinový zbytek sekvence podle obrázku 1 vybraný ze skupiny skládající se z P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96,

S97, G98, P99, G100, A101,

T132, D133, F135, Q136,D186,

G263, R267, M277, L278,G279,

V301, R302, F303, D304,R306,

E312, A313, F314, A315,S316,

1330, K332, N333, K334,0335,

H417, Q418, M419, W420,A421,

L439, G440, A441, M442,G443,

L477, M479, Q495, H496,L497,

D505, R506, Y508, K509,A510,

S524, H572, Q573, E574,H575,

P581 ,

V125, R127, R128, M129, 1130, G131 ,

1187, T259, T260, L261 , M262, H281 , G282, T283, V284, G300, V307, T308, G309, K310, 1311, R317, A318 , K319, 1320, E329, T404, G413, V414, G415, Q416, A422, L434, S435, A437, G438, D467, S468, S469, L471 , N473 , G498, M499 , V501 , Q502, Q504 , N5 11 , R512, A513 , H514, T515, V576 , L577, P578, M579, 1580,

G583 a G584, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše uvedených a jakékoliv kombinace kteréhokoliv z výše uvedených.

(ii) delece více než 5 aminokyselinových zbytků předcházejících, nebo více než 5 aminokyselinových zbytků následujících alespoň jednomu aminokyselinovému zbytku sekvence podle obrázku 1 vybraného ze skupiny, která se skládá z P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131, T132, D133, F135, • · ···· ·· • · · ·· • · · · · ·· • · · · ·· • · · ·· ·· ··· ··

Q136, D186, 1187, T259, T260, L261 , M262, G263 , R267, M277, L278, G279, H281 , G282, T283, V284, G300 , V301 . R302, F303, D304 , R306, V307, T308, G309, K310, 1311 , E312, A313, F314, A315, S316, R317, A3 1 8 , K319, 1320, E329 , 1330, K332, N333 , K334, 0335, T404, G413 , V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420 , A421 , A422, L434, S435 , A437, G438 , L439, G440, A441 , M442, G443 , D467, S468, S469, L471 , N473 , L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501 , Q502, Q504, D505 , R506, Y508, K509, A510, N51 1 , R512, A513 , H514, T5 1 5 , S524, H572, Q573 , E574 , H575, V576, L577, P578, M579, 1580 , P581 , G583, G584, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše uvedených a j akékoliv

kombinace kteréhokoliv z výše uvedených;

(iii) delece alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(iv) adice alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(v) delece alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi G300 a D324 sekvence podle obrázku 1;

(vi) adice alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi G300 a D324 sekvence podle obrázku 1; nebo (vii) jakoukoliv kombinací kteréhokoliv z výše uvedených.

22. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 21 vyznačující se tím, že uvedená substituce je ·· ···· · · • · · ·· • · ··· ·· • · · · ·· • · · ·· ·· ··· ·· • ·· ·· • · · ® · · • · · · · • · · · · · · • · · · ··· ·· ·· vybrána ze skupiny skládající se z Met53Trp, Met53Glu, Met53Ila, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel53Arg, Ile330Phe, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše uvedených nebo kombinace kterýchkoliv z výše uvedených.

23. Způsob modelování založený na struktuře pro produkci

AHAS variantního proteinu rezistentního na herbicidy vyznačující se tím, že uvedený způsob obsahuje:

(a) sestavení cílového AHAS proteinu na prvním AHAS templátu majícím identifikované vazebné místo pro herbicid a majícím sekvenci podle obrázku 1 nebo jeho funkčním ekvivalentu pro odvození trojrozměrné struktury cílového AHAS proteinu;

(b) selekci alespoň jedné aminokyselinové pozice v uvedeném cílovém AHAS proteinu jako cíle pro mutaci, kde uvedená mutace pozměňuje afinitu alespoň jednoho herbicidu k uvedenému vazebnému místu;

(c) mutaci DNA kódující uvedený cílový AHAS protein pro produkci mutantní DNA kódující variantní AHAS obsahující uvedenou mutaci v uvedené pozici; a (d) expresi mutované DNA v jedné buňce, za podmínek, za kterých je produkován uvedený variantní AHAS obsahující mutaci v uvedené pozici.

24. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 23 vyznačující se tím, že dále obsahuje:

(e) expresi DNA kódující přirozený AHAS protein paralelně ve φ φφ φφ φφ φ · φ φ φ · · · · φ φ ··· · φ φ · φ φ φφφ φφ φφ ·· φφφφ·» φφφφ · • ·φφφ ·· φ φ · · ·· φ · φφφ <*· Φ·· φφ druhé buňce;

(f) purifikaci uvedených přirozených a uvedených variantních AHAS proteinů z uvedených buněk;

(g) testování uvedených přirozených a uvedených variantních AHAS proteinů na katalytickou aktivitu v konverzi pyruvátu na acetolaktát nebo v kondenzaci pyruvátu a 2-ketobutyrátu za tvorby acetohydroxybutyrátu, za absence a za přítomnosti uvedeného alespoň jednoho herbicidu; a (h) opakování kroků (b) - (g), kde je uvedená DNA kódující uvedenou variantu v kroku (d) použita jako AHAS kódující DNA v kroku (b), dokud není identifikován první AHAS variantní protein rezistentní na herbicid, který má vlastnosti:

(i) za absence alespoň j ednoho herbicidu (a) má katalytickou aktivitu, která je sama dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován; nebo (b) má katalytickou aktivitu v kombinaci s nějakým jiným AHAS variantním proteinem rezistentním na herbicid, který může být také exprivován v uvedené buňce, který může být stejný nebo jiný než první AHAS variantní protein, kde tato aktivita je dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován;

kde buňky vyžadují AHAS aktivitu pro přežívání; a • · (ii) má katalytickou aktivitu, která je více rezistentní k alespoň jednomu herbicidu než je aktivita přirozené AHAS.

25. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 24 vyznačující se t í m, že uvedená katalytická aktivita za absence uvedeného více než jednoho herbicidu je větší než asi 20 % katalytické aktivity uvedené přirozené AHAS.

26. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 25 vyznačující se tím, že uvedený herbicid je imidazolinonový herbicid a uvedený první AHAS variantní protein rezistentní na herbicidy má:

(i) katalytickou aktivitu za absence uvedeného herb i c i du vy š š í než asi 20 % katalytické aktivity uvedené přirozené AHAS;

(ii) katalytickou aktivitu, které je relativně více rezistentní na přítomnost imidazolinonových herbicidů ve srovnání s přirozenou AHAS; a (iii) katalytickou aktivitu, která je relativně více citlivá na přítomnost sulfonylmočovinových herbicidů ve srovnání s imidazolinonovými herbicidy.

27. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 23 v y z n a č u j í c í s e t í m, že uvedené herbicidy jsou vybrány ze skupiny skládající se z imidazolinonů, sulfonylmočovin, triazolopyrimidinových sulfonamidů, pyrimydyl-oxy-benzoových kyselin, sulfamoylmočovin, sulfokarboxamidů, a jejich kombinací.

• · « · • ·

28. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedený cílový AHAS protein je odvozen od Arabidopsis thaliana.

29. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedenou první buňkou je E. co 1 i.

30. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedenými prvními a druhými buňkami jsou E. coli.

31. Způsob modelování založený na struktuře podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedená mutace je vybrána ze skupiny, která se skládá ze:

(i) substituce alespoň jedné jiné aminokyseliny za aminokyselinový zbytek sekvence podle obrázku 1 vybraný ze

skupiny skládající : se z P48, G49, S52, M53, E54 , A84, A95, T9 S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131 TI 32, D1 33 , F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261 , M262, G263, R267, M277, L278, G279, H281, G282 , T283 , V284, G300, V301 , R302, F303 , D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311 , E312, A313, F314, A3 15, S316, R317, A318, K319, 1320, E329, 1330, K332, N333, K334, 0335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, A437, G438, L439, G440 , A441 , M442 , G443, D467, S468 , S469, L471 , N473, L477, M479 , Q495, H496, L497, G498, M499, V501 , Q502, Q504, D505, R506 , Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524 , H572 , Q573, E574, H575, V576, L577, P578, M579, 1580 , P581 , G583 a G584, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše

• · • · · · • · • · ··» · · • · · * β e • · · · · ·· ··· ·· uvedených a jakékoliv kombinace kteréhokoliv z výše uvedených.

(ii) delece více než 5 aminokyselinových zbytků předcházejících, nebo více než 5 aminokyselinových zbytků následujících alespoň jednomu aminokyse1 i novému zbytku sekvence podle obrázku 1 vybraného ze skupiny, která se skládá

z P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101 , V125, R127, R128, Ml 29, 1130, G131 , T132, D133, F135, Q136, Dl 86, 1187, T259, T260, L261 , M262, G263, R267, M277, L278, G279, H281 , G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R306 , V307, T308, G309, K310, 1311 , E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, 1320, E329, 1330, K332, N333, K334, 0335, T404, G413 , V414, G415, Q416, H417, Q418, M419 , W420, A421 , A422, L434, S435, A437, G438, L439, G440, A441 , M442 , G443 , D467, S468, S469, L471 , N473 , L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501 , Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515 , S524, H572, Q573 , E574, H575, V576, L577, P578, M579, 1580, P581, G583, G584, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv 2 : výše uvedených a j akékoliv

kombinace kteréhokoliv z výše uvedených;

(iii) delece alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(iv) adice alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(v) delece alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi G300 a D324 sekvence podle obrázku 1;

······ · · · ·· · ·

9 9 9 9 · · · ···· • · · · · « · · · ·· 9 • · · · 9 · · · ·····

V* 9 9 9 9 9 99

9 9 999 99 999 9 99 9 (vi) adice alespoň jednoho aminokyse funkčního ekvivalentu mezi G300 a D324

1 lnového sekvence zbytku nebo jeho pod 1e obrázku 1;

nebo (vi i) jakoukoliv kombinaci kteréhokoliv _z výše uvedených.

na struktuře podle nároku 31 í m, že uvedená substituce je z Met53Trp, Met53Glu, Met53Ila Phel53Arg, Ile330Phe, funkčních uvedených nebo kombinace

32. Způsob modelování založený vyznačující se t vybrána ze skupiny skládající se Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, ekvivalentů kteréhokoliv z výše kterýchkoliv z výše uvedených.

33. Izolovaná DNA kódující kyselina protein syntetasy (AHAS), kde uvedený AHAS protein modifikovaný:

hydroxyoctová variantní variantní protein obsahuje (i) substitucí alespoň jedné jiné aminokyseliny za aminokyselinový zbytek sekvence podle obrázku 1 vybraný ze skupiny skládající se z P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131,

T132, Dl 33, F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261 , M262, G263 , R267, M277, L278, G279, H281 , G282, T283, V284, G300, V301 , R302, F3O3 , D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E3 12 , A313, F314, A315, S3 1 6, R317, A318, K319, 1320, E329, 1330, K332, N333, K334, 0335, T404, G413 , V414, G415, Q4 1 6 , H4 1 7 , Q418, M419, W420, A421 , A422, L434, S435, A437 , G438 , L439 , G440, A441 . M442, G443, D467, S468, S469, L471 , N473 , L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501 , Q502, Q504, D505 , R506 , Y508, K509, A510, N51 1 , R512 , A5 1 3 , H5 1 4 , T515, S524 , H572 , Q573 , E574, H575, V576, L577, P578, M579, 1580,

výše

P581, G583 a G584, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z uvedených a jakékoliv kombinace kteréhokoliv z výše uvedených.

(ii) delecí více než 5 aminokyselinových zbytků předcházejících, nebo více než 5 aminokyselinových zbytků následujících alespoň jednomu aminokyselinovému zbytku sekvence podle obrázku 1 vybraného ze skupiny, která se skládá z P48, G49, S52, M53, ES4, A84, A95, T96, S97, G98, P99, GIGO, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131, ΊΊ32, D133, F135,

Q136, D186, 1187, T259, T260, L261, M262, G263, R267,M277,

L278, G279, H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302,F303,

D304, R306, V307, T308, G309, K310, 1311, E312, A313,F314,

A315, S316, R317, A318, K319, 1320, E329, 1330, K332,N333,

K334, 0335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418,M419,

W420, A421, A422, L434, S435, A437, G438, L439, G440,A441,

M442, G443, D467, S468, S469, L471, N473, L477, M479,Q495,

H496, L497, G498, M499, V501, Q502, Q504, D505, R506,Y508,

K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572,Q573,

E574, H575, V576, L577, P578, M579, 1580, P581, G583,G584, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše uvedených a jakékoliv kombinace kteréhokoliv z výše uvedených;

(iii) delecí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(iv) adicí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(v) delecí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi G300 a D324 sekvence podle obrázku 1;

• · · · ··· nebo j eho obrázku 1‘, okyselinového zbytku

D324 sekvence podle (vi) adicí alespoň jednoho amin funkčního ekvivalentu mezi G300 a nebo (vii) jakoukoliv kombinací kteréhokol i v _z výše uvedených.

34. DNA podle nároku 33, kde uvedené modifikace pozměňují schopnost herbicidu inhibovat enzymatickou aktivitu uvedeného proteinu.

35. DNA podle nároku 34, kde uvedený herbicid je vybrán ze skupiny skládající se z imidazolinonú, sulfonylmočovin, triazolopyrimidinových sulfonamidu, pyrimydyl-oxy-benzoových kyselin, sulfamoylmočovin, sulfokarboxamidů, a jejich kombinací

36. DNA podle nároku 33, kde uvedený cílový AHAS protein je odvozen od Arabidopsis thaliana.

37. DNA podle nároku 33, kde uvedená substituce je vybrána ze skupiny skládající se z Met53Trp, Met53Glu, Met53Ila, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel53Arg, Ile330Phe, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše uvedených nebo kombinace kterýchkoliv z výše uvedených.

38. DNA podle nároku 37, kde uvedený variantní AHAS protein má (a) za absence alespoň jednoho herbicidu (i) má katalytickou aktivitu, která je sama dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován; nebo • · · a · (ii) má katalytickou aktivitu v kombinaci s nějakým jiným AHAS variantním proteinem rezistentním na herbicid, který může být také exprivován v uvedené buňce, který může být stejný nebo jiný než první AHAS variantní protein, kde tato aktivita je dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován;

kde buňky vyžadují AHAS aktivitu pro přežívání; a (b) má katalytickou aktivitu, která je více rezistentní k alespoň jednomu herbicidu než je aktivita přirozené AHAS.

39. DNA podle nároku 33, kde uvedená variantní AHAS má více než asi 20 % katalytické aktivity přirozeného typu AHAS.

40. DNA podle nároku 39, kde uvedená variantní AHAS je alespoň 2-krát více rezistentní na na imidazolinonech-založené herbicidy než na na sulfonylmočovině založené herbicidy.

41. DNA vektor obsahující DNA sekvenci podle nároku 33 operativně navázanou na transkripční regulační element.

42. Buňka obsahující DNA sekvenci kódující AHAS odvozenou od DNA vektoru podle nároku 41, kde uvedená buňka je vybrána ze skupiny skládající se z bakteriálních, houbových, rostlinných, hmyzích a savčích buněk.

43. Buňka podle nároku 42, která je rostlinou buňkou.

44. Semeno obsahující buňku podle nároku 43.

♦ · · · · · • · · ♦ · 4 · 9

9 9 9 • · · • · · · 9

DNA

45. podle

46.

Variantní AHAS nároku 33.

protein obsahující protein kódovaný

Variantní AHAS protein obsahující

AHAS protein modifikovaný (i) substitucí alespoň jedné jiné aminokyseliny za aminokyselinový zbytek sekvence podle obrázku 1 vybraný ze skupiny skládající se z P48, G49, S52, M53 , E54, A84, A95, T96 S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261, M262,

G263, R267, M277, L278, G279, H281, G282, T283, V284,G300,

V301, R302, F303, D304, R306, V307, T308, G309, K310,1311,

E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, 1320,E329,

1330, K332, N333, K334, 0335, T404, G413, V414, G415,Q416,

H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, A437,G438,

L439, G440, A441, M442, G443, D467, S468, S469, L471,N473,

L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501, Q502,Q504,

D505, R506, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514,T515,

S524, H572, Q573, E574. H575, V576, L577, P578, M579,1580.

P581, G583 a G584, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše uvedených a jakékoliv kombinace kteréhokoliv z výše uvedeních.

(ii) delecí více než 5 aminokyselinových zbytků předcházejících, nebo více než 5 aminokyselinových zbytků následujících alespoň jednomu aminokyselinovému zbytku sekvence podle obrázku 1 vybraného ze skupiny, která se skládá

z P48 , G49, S52, M53 , E54, A84, A95 , T96, S97, G98, P99, G100 A1 0 1 , VI 25, R127, R128 , M129, 1130, G131 , T132, , D133, F135, Q136, D186, 1187, T259 , T260, L261 , M262 , G263. , R267 , M277, L278 , G279 , H281 , G282 , T283, V284, G300, V301 _: , R302 , F303,

·· · · · · « -> · • · ·· ·· • · · • * · · « · · · · • · ·♦ «· kombinace kteréhokoliv z výše uvedených;

(ii i) delecí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1;

(iv) adicí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi Q124 a H150 sekvence podle obrázku 1:

(v) delecí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi G300 a D324 sekvence podle obrázku 1;

(vi) adicí alespoň jednoho aminokyselinového zbytku nebo jeho funkčního ekvivalentu mezi G300 a D324 sekvence podle obrázku 1; nebo (vii) jakoukoliv kombinací kteréhokoliv z výše uvedených.

47. Variantní AHAS protein podle nároku 46, kde uvedené modifikace pozměňují schopnost herbicidu inhibovat enzymatickou aktivitu uvedeného proteinu.

48. Variantní AHAS protein podle nároku 46, kde uvedený herbicid je vybrán ze skupiny skládající se z imidazolinonú, sulfonylmočovin, triazolopyrimidinových sulfonamidů, pyrimydy1-oxy-benzoových kyselin, sulfamoylmočovin, sulfokarboxamidů, a jejich kombinací.

49. Variantní AHAS protein podle nároku 46, kde uvedený AHAS protein je odvozen od Arabidopsis thaliana.

50. Variantní AHAS protein podle nároku 46, kde uvedená substituce je vybrána ze skupiny skládající se z Met53Trp, Met53Glu, Met53Ila, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel53Arg, Ile330Phe, funkčních ekvivalentů kteréhokoliv z výše uvedených nebo kombinace kterýchkoliv z výše uvedených.

51. Variantní AHAS protein podle nároku 46, kde uvedený variantní AHAS protein má (a) za absence alespoň jednoho herbicidu (i) má katalytickou aktivitu, která je sama dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován; nebo (ii) má katalytickou aktivitu v kombinaci s nějakým jiným AHAS variantním proteinem rezistentním na herbicid, který může být také exprivován v uvedené buňce, který může být stejný nebo jiný než první AHAS variantní protein, kde tato aktivita je dostatečná k tomu, aby udržela životaschopnost buněk, ve kterých je exprivován;