PL186091B1 - Wyizolowany DNA, wektor, komórka, warianty białkaAHAS, sposób nadawania oporności na herbicydy komórce, sposób wytwarzania opornego na herbicydy białka oraz sposoby zwalczania chwastów - Google Patents

Abstract

1. Wyizolowany DNA kodujacy wariant bialka syntazy acetohydroksykwasów (AHAS), który jest zmodyfikowany przez: ( i) podstawienie przynajmniej jednego innego aminokwasu zamiast reszty aminokwasowej w sekwencji z figury 1 wybranej z grupy obejmujacej S52. M53, E54, A81, A95, T96, S97, P99, G100, A101, R127, R128, M 129,1187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, T283, V284, G300, V301, T308, G309, K310, I311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q572, E574, H575, V576, L577, P578, 1580, P581, G583 i G584, równowazniki funkcjonalne powyzszych aminokwasów i dowolne kombinacje którychkolwiek z powyzszych; (ii) delecje nie wiecej niz 5 aminokwasów poprzedzajacych, lub nie wiecej niz 5 aminokwasów nastepujacych po przynajmniej jednej reszcie aminokwasowej w sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1) wybranej z grupy obejmujacej S52, M53, E54, A81, A95, T96, S97, P99, G100, A101, R127, R128, M 129,1187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, T283, V284, G300, V301, T308, G309, K310, 1311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, 1320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414,-G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G 468,L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q572, E574, H575, V576, L577, P578,I580, P581, G583 i G584, równowazniki funkcjonalne powyzszych aminokwasów i dowolne kombinacje którychkolwiek z powyzszych; (iii) delecje przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równowaznika pomiedzy Q124 a H 150 sekwencji z fi- gury 1 (Sekw. Nr Id.: 1); (iv) insercje przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równowaznika pomiedzy Q124 a H 150 sekwencji z fi- gury 1 (Sekw. Nr Id.: 1); (v) delecje przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równowaznika pomiedzy G300 a D324 sekwencji z fi- gury 1 (Sekw. Nr Id.: 1); (vi) insercje przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równowaznika pomiedzy G300 a D324 sekwencji z fi- gury 1 (Sekw. Nr Id.: 1); lub (vii) dowolna kombinacje którychkolwiek z powyzszych, przy czym wytworzone bialko ma ceche opornosci na herbicydy. 34. Sposób zwalczania chwastów w uprawie, znamienny tym, ze obejmuje uprawe roslin stanowiacych rosliny oporne na her- bicydy transformowane DNA jak okreslony w zastrz. 1 oraz traktowanie tej uprawy wydajna w zwalczaniu chwastów iloscia wymienio- nego herbicydu. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Dziedzina wynalazku

Wynalazek ten dotyczy opartego na strukturze modelowania i projektowania wariantów syntazy acetohydroksykwasów (AHAS) opornych na imidazolinony i inne herbicydy, herbicydów hamujących aktywność AHAS, wariantów AHAS, DNA kodujących te warianty, roślin eksprymujących te warianty oraz sposobów walki z chwastami.

Podstawa wynalazku

Syntaza acetohydroksykwasów (AHAS) jest to enzym katalizujący pierwszy etap szlaku biosyntezy izoleucyny, leucyny i waliny u bakterii, drożdży i roślin. Przykładowo, dojrzała forma AHAS z Zea mays jest białkiem liczącym około 599 aminokwasów zlokalizowanym w chloroplastach (patrz figura 1). Enzym wykorzystuje jako kofaktory pirofosforan tiaminy (TPP) i dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD), zaś pirogronian jako substrat do wytworzenia acetomleczanu. Enzym ten katalizuje również reakcję kondensacji pirogronianu i 2-ketomaślanu, co daje kwas acetohydroksymasłowy. AHAS znana jest również jako syntaza acetomleczanu lub liaza acetomleczanowo pirogronianowa (karboksylująca) i nosi oznaczenie EC 4.1.3.18. Aktywna forma enzymu jest przypuszczalnie co najmniej homodimerem. Ibdah i wsp. {Protein Science, 3:419-3, 1994), w skrótowym doniesieniu, ujawniają jeden z modeli stanu aktywnego AHAS.

Liczne herbicydy, w tym związki imidazolinonowe takie, jak imazethapyr (PURSUIT® - American Cyanamid Company -Wayne, NJ), związki oparte na sulfońylomoczniku takie jak sufomethuron methyl (OUST® - E.I. du Pont de Nemours and Company - Wilmington, DE), sulfonamidy triazolopirymidynowe (Broadstrike™ - Dow Elanco; patrz w Gerwick i wsp., Pestic. Sci. 29:357-364, 1990), sulfamoilomoczniki (Rodaway i wsp., Mechanisms of Selectively of Ac 322,140 w Paddy Rice, Wheat and Barley, Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference-Weeds, 1993), kwasy pirymidylo-oksy-benzoesowe (STABLE® Kumiai Chemical Industry Company, E.I. du Pont de Nemours and Company; patrz The Pesticide Manual wyd. 10, str.888-889, Clive Tomlin, wyd. British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Farmham, Surrey G49 7PH, Wielka Brytania), oraz sulfonylokarboksyamidy (Alvarado i wsp., patent USA nr 4,883,914) działają na zasadzie hamowania aktywności enzymatycznej AHAS. (Patrz Chaleff i wsp., Science 224:1443, 1984; LaRossa i wsp., J. Biol. Chem. 259:8753, 1984; Ray, Plant Physiol. 76:545, 1984). Herbicydy te są wysoce skuteczne i niegroźne dla środowiska. Ich wykorzystanie w rolnictwie jest jednak ograniczone przez cechujący je brak wybiórczości, gdyż rośliny uprawne są, podobnie jak niepożądane chwasty, wrażliwe na działanie fitotoksyczne tych herbicydów.

Bedbrook i wsp. w patentach USA nr nr 5,013,659, 5,141,870 i 5,378,824, ujawniają kilka wariantów AHAS opornych na sulfonylomocznik. Jednakże warianty te zostały albo otrzymane przez mutagenezę roślin, nasion lub komórek i selekcję mutantów opornych na herbicydy, albo zostały z takich mutantów wyprowadzone. Podejście takie jest nieprzewidywalne gdyż polega, przynajmniej początkowo na losowym wprowadzeniu odpowiedniej mutacji, nie zaś na racjonalnym sposobie projektowania opartym na modelu strukturalnym docelowego białka.

186 091

A zatem w obecnym stanie techniki istnieje wciąż zapotrzebowanie na sposoby i kompozycje dostarczające wybiórczej, wszechstronnej i/lub specyficznej oporności na herbicydy w roślinach uprawnych. Twórcy tego wynalazku odkryli że wybiórcze, oporne na herbicydy warianty AHAs i rośliny je zawierające mogą być przygotowane przez oparte na strukturze modelowanie AHAS na podstawie oksydazy pirogronianu (POX), zidentyfikowanie w modelu AHAS jednej lub wielu kieszeni wiążących herbicyd i zaprojektowanie specyficznych mutacji zmieniających powinowactwo herbicydu do kieszeni wiążącej. Warianty te i zawierające je rośliny nie są hamowane i zabijane przez jedną lub więcej klas herbicydów i utrzymują wystarczający poziom aktywności enzymatycznej AhAS by umożliwić wzrost uprawy.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia sekwencję 600 aminokwasów odpowiadającą liczącej około 599 aminokwasów sekwencji syntazy acetohydroksykwasów (AHAS) z Zea mays, stanowiącą przykład roślinnego enzymu AHAS. Sekwencja nie zawiera sekwencji sygnałowej, zaś dodatkowa glicyna jest pozostałością miejsca przecinania przez trombinę. Pozycje Met53, Arg 128 i Phel35 zaznaczone są wytłuszczeniem.

Figura 2 przedstawia porównanie sekwencji AHAS kukurydzy z oksydazą pirogronianową(POX) z Lactobacillus planarum.

Figura 3 jest schematycznym przedstawieniem struktury drugorzędowej podjednostki AHAS. Regularne elementy struktury drugorzędowej, α -helisy i β -płaszczyzny przedstawiono odpowiednio jako okręgi i elipsy i ponumerowano niezależnie dla każdej z trzech domen w obrębie podjednostki. Pętle i obszary skręcone oznaczono czarnymi liniami, z numerami oznaczającymi przybliżony początek i koniec elementu. Położenie miejsc wiązania kofaktorów i znanych miejsc występowania mutacji oznaczono odpowiednio ośmiokątami i gwiazdkami.

Figura 4 przedstawia wytworzony komputerowo model centrum aktywnego AHAS z kukurydzy, z cząsteczką imazethapyru (herbicyd PURSUIT®) wymodelowanym w kieszeni wiążącej.

Figura 5 przedstawia homologię pomiędzy sekwencjami aminokwasowymi AHAS uzyskanymi z różnych gatunków roślin. pAC75l oznacza izozym als2 AHAS z kukurydzy w postaci eksprymowanej z wektora E. coli pAC 751 według figury 1; Maize als2 jest to izozym als2 AHAS z kukurydzy; Maize als1 jest to izozym als1 AHAS z kukurydzy; Tobac 1 oznacza izozym SuRA aHaS tytoniu; Tobac 2 oznacza izozym SuRB AHAS tytoniu; Athcsr 12 oznacza gen Csr 1.2 kodujący AHAS z Arabidopsis thaliana; Bnaa 13 oznacza izozym AHAS III z Brassica napus zaś Bnaa 12 oznacza izozym AHAS II z Brassica napus.

Geny pAC 751 i als2 kukurydzy są identyczne z wyjątkiem tego, że ais 2 kukurydzy rozpoczyna się od początku sekwencji sygnałowej zaś pAC 751 rozpoczyna się od hipotetycznego N-końca dojrzałego białka z dodatkową glicyną na N-końcu w związku z występowaniem miejsca rozpoznawanego przez trombinę w wektorze ekspresyjnym pGEX-2T. N-końcowa glicynią nie jest aminokwasem występującym naturalnie w tej pozycji.

Porównania sekwencji aminokwasowych białek AHAS otrzymano przy użyciu programu PILEUP (pakiet GCG -Genetics Computer Group, Inc., - University Research Park Madison-WI). Sekwencję najwyższej zgodności wygenerowano przy użyciu programu PRETTY z pakietu GCG.

Figura 6 jest fotograficzną ilustracją żelu poliakrylamidowego z, SDS wybarwionego w celu wykrycia białek, ukazującą oczyszczanie AHAS z kukurydzy. Ścieżki zawierają (od lewej do prawej): A, wzorce masy cząsteczkowej; B, surowe ekstrakty z komórek E. coli; C, preparat oczyszczony chromatografią powinowactwa na złożu glutation-agaroza; D, produkty trawienia trombiną preparatu oczyszczonego chromatografią powinowactwa; E, drugie oczyszczanie na kolumnie glutation-agaroza i filtracja w żelu Sephacryl S-100.

Figura 7 jest graficzną ilustracją wyników oznaczeń aktywności enzymatycznej in vitro formy dzikiej oraz mutantów białka AHAS przy nieobecności oraz w obecności rosnących stężeń imazethapyru (herbicyd PURSUIT®). Oś Y przedstawia % aktywności enzymu zmutowanego, gdzie wartość 100% jest zmierzona przy nieobecności inhibitora.

186 091

Figura 8 jest graficzną ilustra<cj^ą wyników oznaczeń aktywności enzymatycznej in vitro formy dzikiej oraz mutantów białka AHAS przy nieobecności oraz w obecności rosnących stężeń sulfometuronu metylu (herbicyd OUST®). Oś Y przedstawia % aktywności enzymu zmutowanego, gdzie wartość 100% jest zmierzona przy nieobecności inhibitora.

Figura 9 jest graficzną, ilustracją wyników oznaczeń aktywności enzymatycznej in vitro formy dzikiej białka AHAS Arabidopsis thaliana oraz mutanta Metl24Ile białka AHAS Arabidopsis przy nieobecności oraz w obecności rosnących stężeń imazethapyru (herbicyd PURSUIT®) oraz sulfometuronu metylu (herbicyd OUST®). Oś Y przedstawia % aktywności enzymu zmutowanego, gdzie wartość 100% jest zmierzona przy nieobecności inhibitora.

Figura 10 jest graficzną ilustraccą wyników oznaczeń aktywności enzymatycznej in vitro formy dzikiej białka AHAS Arabidopsis thaliana oraz mutanta Metl24His białka AHAS Arabidopsis przy nieobecności oraz w obecności rosnących stężeń imazethapyru (herbicyd PURSUIT®) oraz sulfometuronu metylu (herbicyd OUST®). Oś Y przedstawia % aktywności enzymu zmutowanego, gdzie wartość 100% jest zmierzona przy nieobecności inhibitora.

Figura 11 jest graficzną ilus^ra<^_j^ wyników oznaczeń aktywności enzymatycznej in vitro formy dzikiej białka AHAS Arabidopsis thaliana oraz mutanta Argl99Glu białka AHAS Arabidopsis przy nieobecności oraz w obecności rosnących stężeń imazethapyru (herbicyd PURSUIT®) oraz sulfometuronu metylu (herbicyd OuSt®). Oś Y przedstawia % aktywności enzymu zmutowanego, gdzie wartość 100% jest zmierzona przy nieobecności inhibitora.

Figura 12 jest schematyczną ilustracją wektora DNA użytego do transformacji roślin, zawierającego gen nptll (kodujący oporność na kanamycynę) pod kontrolą promotora 35S oraz gen AHAS (dziki lub wariant) pod kontrolą promotora AHAS z Arabidopsis.

Figura 13 to fotografia przedstawiająca rozwój korzenia roślin tytoniu stransformowanych genem AHAS z Arabidopsis zawierającym albo mutację Metl24Ile, albo Argl99Glu a także kontroli niestransformowanej. Rośliny hodowano przez 18 dni po przeniesieniu do pożywki zawierającej 0,25 μΜ imazethapyru.

Figura 14 to fotografia przedstawiająca rośliny tytoniu stransformowane genem AHAS z Arabidopsis zawierającym albo mutację Metl24Ile, Metl24His albo Argl99Glu a także kontrolę niestransformowaną, na które rozpylono dwukrotną dawkę połową (100 g/ha) imazethapyru.

Figura 15 to fotografia przedstawiająca wyniki testów kiełkowania przeprowadzonych w obecności herbicydu CLL 299,263 (imazamox), które przeprowadzono na nasionach zebranych z pierwotnych transformantów roślin tytoniu, które stransformowano genem AHAS z Arabidopsis zawierającym albo mutację Metl24Ile, Mctl24His albo Argl99Glu.

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu modelowania opartego na strukturze w celu wytworzenia wariantu białka AHAS opornego na herbicydy. Sposób obejmuje:

(a) przyrównanie docelowego białka AHAS do wzorca oksydazy pirogronianu lub jego równoważnika modelowego AHAS w celu uzyskania trójwymiarowej struktury docelowego białka AHAS;

(b) modelowanie jednej lub więcej cząsteczek herbicydu w tej trójwymiarowej strukturze w celu zlokalizowania kieszeni wiążącej herbicyd w docelowym białku AHAS;

(c) wybór jako celu mutacji co najmniej jednej pozycji aminokwasowej w docelowym białku AHAS tak, że mutacja zmienia powinowactwo przynajmniej jednego herbicydu do kieszeni wiążącej;

(d) mutację DNA kodującego docelowe białko AHAS w celu wytworzenia zmutowanego DNA kodującego wariant AHAS zawierający mutację, taką jak na przykład co najmniej jeden inny aminokwas, w danej pozycji; oraz (e) ekspresję zmutowanego DNA w pierwszej komórce, w warunkach, w których wytwarzany jest wariant AHAS zawierający mutację, taką jak na przykład różny(e) aminokwas(y), w tej pozycji.

Sposób może jeszcze obejmować:

(f) ekspresję DNA kodującego dzikie bi^i^^o AHAS równolegle w di^r^^iej kc^^<^^:rtee;

(g) oczyszczenie dzikiego i zmienionego białka AHAS z komórek;

186 091 (h) oznaczenie aktywności katalitycznej w przemianie pirogronianu w acetomleczan lub w kondensacji pirogronianu i 2-ketomaślanu z wytworzeniem acetohydroksymaslanu dzikiego oraz zmienionego białka AHAS, w nieobecności lub obecności herbicydu; oraz (i) powtórzenie kroków (c)-(h), przy czym DNA kodujący wariant AHAS z etapu (e) jest wykorzystany jako DNA kodujący AHAS w etapie (c) dopóki nie zidentyfikuje się pierwszego wariantu AHAS opornego na herbicyd cechującego się:

(i) w nieobecności przynajmniej jednego herbicydu, (a) aktywnością katalityczną wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany; lub (b) Aktywnością katalityczną w połączeniu z jakimkolwiek wariantem białka AHAS opornym na herbicyd również eksprymowanym w tej komórce, który może być tym samym lub innym białkiem niż pierwszy wariant białka AHAS, wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany;

przy czym komórka wymaga aktywności AHAS do życia;

(ii) aktywnością katalityczną bardziej oporną na przynajmniej jeden herbicyd niż w dzikim białku AHAS

Dostarczono również alternatywnego sposobu modelowania opartego na strukturze w celu wytworzenia wariantów białka AHAS opornego na herbicydy. Sposób ten obejmuje:

(a) przyrównanie docelowego białka AHAs do pierwszego wzorca AHAS uzyskanego z polipeptydu o sekwencji aminokwasowej według figury 1 lub jego funkcjonalnego odpowiednika w celu uzyskania trójwymiarowej struktury docelowego białka AHAS;

(b) modelowanie jednej lub więcej cząsteczek herbicydu w tej trójwymiarowej strukturze w celu zlokalizowania kieszeni wiążącej herbicyd w docelowym białku AHAS;

(c) wybór jako celu mutacji co najmniej jednej pozycji aminokwasowej w docelowym białku AHAS tak, że mutacja zmienia powinowactwo przynajmniej jednego herbicydu do kieszeni wiążącej;

(d) mutację DNA kodującego docelowe białko AHAS w celu wytworzenia zmutowanego DNA kodującego wariant AHAS zawierającego mutację w danej pozycji; oraz (e) ekspresję zmutowanego DNA w pierwszej komórce, w warunkach, w których wytwarzany jest wariant AHAS zawierający mutację w tej pozycji.

Sposób ten może jeszcze obejmować:

(f) ekspresję DNA kodującego dzikie białko AHAS równolegle w drugiej komórce;

(g) oczyszczenie dzikiego i zmienionego białka AHAS z komórek;

(h) oznaczenie aktywności katalitycznej w przemianie pirogronianu w acetomleczan lub w kondensacji pirogronianu i 2-ketomaślanu z wytworzeniem acetohydroksymaślanu dzikiego oraz zmienionego białka AHAS, w nieobecności lub obecności herbicydu; oraz (i) powtórzenie kroków (c)-(h), przy czym DNA kodujący wariant AHAS z etapu (e) jest wykorzystany jako DNA kodujący AHAS w etapie (c) dopóki nie zidentyfikuje się pierwszego wariantu AHAS opornego na herbicyd cechującego się:

(i) w nieobecności przynajmniej jednego herbicydu, (a) aktywnością katalityczną wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany lub (b) aktywnością katalityczną w połączeniu z jakimkolwiek wariantem białka AHAS opornym na herbicyd również eksprymowanym w tej komórce, który może być tym samym lub innym białkiem niż pierwszy wariant białka AHAS, wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany; przy czym komórka wymaga aktywności AHAS do życia; oraz (ii) aktywnością, katalityczną bardziej oporną, na przynajmniej jeden herbicyd niż w dzikim białku AHAS. W innym alternatywnym wykonaniu sposób obejmuje:

(a) przyrówzanie nocclowcgobiałka AHAS do pierwszego wzorca zM/LASze zidzetyfikowaną kieszenią wiążącą herbicyd o sekwencji według figury 1 lub jego funkcjonalnego odpowiednika w celu uzyskania trójwymiarowej struktury docelowego białka AHAS;

186 091 (b) wybór jako celu mutacji co najmniej jednej pozycji aminokwasowej w docelowym białku AHAS tak, że mutacja zmienia powinowactwo przynajmniej jednego herbicydu do kieszeni wiążącej (c) mutację DNA kodującego docelowe białko AHAS w celu wytworzenia zmutowanego DNA kodującego wariant AHAS zawierający mutację, w danej pozycji; oraz (d) ekspresję zmutowanego DNA w pierwszej komórce, w warunkach, w których wytwarzany jest wariant AHAS zawierający mutację w tej pozycji.

Sposób ten może jeszcze obejmować:

(e) ekspresję DNA kodującego dzikie białko AHAS równolegle w drugiej komórce;

(f) oczyszczenie dzikiego i zmienionego białka AHAS z komórek;

(g) oznaczenie aktywności katalitycznej w przemianie pirogronianu w acetomleczan lub w kondensacji pirogronianu i 2-ketomaślanu z wytworzeniem acetohydroksymaślanu dzikiego oraz zmienionego białka AHAS, w nieobecności lub obecności herbicydu; oraz (h) powtórzenie kroków (b)-(g), przy czym DNA kodujący wariant AHAS z etapu (d) jest wykorzystany jako DNA kodujący AHAS w etapie (b) dopóki nie zidentyfikuje się pierwszego wariantu AHAS opornego na herbicyd cechującego się:

(i) w nieobecności przynajmniej jednego herbicydu, (a) aktywnością katalityczną wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany lub (b) aktywnością katalityczną w połączeniu z jakimkolwiek wariantem białka AHAS opornym na herbicyd również eksprymowanym w tej komórce, który może być tym samym lub innym białkiem niż pierwszy wariant białka AHAS, wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany;

przy czym komórka wymaga aktywności AHAS do życia; oraz (ii) aktywnością katalityczną bardziej oporną na przynajmniej jeden herbicyd niż w dzikim białku AHAS.

W korzystnym wykonaniu powyższych sposobów aktywność katalityczna przy nieobecności herbicydu wynosi przynajmniej około 5% a najkorzystniej przewyższa około 20% aktywności katalitycznej dzikiej AHAS. Gdy herbicydem jest herbicyd imidazolinonowy oporny na herbicyd wariant białka AHAS korzystnie cechuje się:

(i) aktywnością katalityczną przy nieobecności herbicydu przekraczającą około 20% aktywności katalitycznej dzikiej AHAS;

(ii) aktywnością katalityczną względnie bardziej oporną na obecność herbicydów imidazolinonowych w porównaniu z dziką AHAS; oraz (iii) aktywnością katalityczną względnie bardziej wrażliwą na obecność herbicydów sulfonylomocznikowych w porównaniu z herbicydami imidazolinonowymi.

Obecny wynalazek dostarcza ponadto wyizolowanych DNA kodujących warianty białka syntazy acetohydroksykwasów (AHAS) obejmujących białka AHAS zmodyfikowane przez:

(i) podstawienie przynajmniej jednego odmiennego aminokwasu zamiast reszty aminokwasowej w sekwencji z figury 1 wybranej z grupy obejmującej P48, Q49, S52, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, I187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, M277, L278, G279, H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R306, V307, T308, G309, K310, I311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, S469, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501, Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509 AS10 N511, R512, A513, K514, T515, S524, H572, Q573, E574 H575 V576, L577, P578, MS79, 1580, P581, G583, G584, ich funkcjonalne odpowiedniki oraz dowolną ich kombinację;

(ii) delecję nie więcej niż 5 aminokwasów poprzedzających lub nie więcej niż 5 aminokwasów następujących po przynajmniej jednej reszcie aminokwasowej sekwencji z figury 1 wybranej z grupy obejmującej P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98; P99,

186 091

G100, A101, V125, R127, R128, M129, I130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, I187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, M277, L278, G279, H281, G282, T283, V284, G300, V301,R302,F303, D304, R306, V307, T308, G309, K310, I311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, S469, Ł471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501, Q502, Q504, D505, R506, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q573, E574, H575, V576, L577, P578, M579, P581, G583, G584, ^ρ^θρ&^ ich odpowiedniki oraz dowolną ich kombinację;

(iii) delecję przynajmniej jednego aminokwasu z pozycji pomiędzy Q124 a H150 sekwencji z figury 1 lub jego funkcjonalPego odpowiednika;

(iv) insercję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego odpowiednika w pozycję pomiędzy Q124 a H150 sekwencji z figury 1;

(v) delecję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego odpowiednika z pozycji pomiędzy G300 a D324 sekwencji z figury 1;

(vi) insercję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego odpowiednika w pozycję pomiędzy G300 a D324 sekwencji z figury 1; lub (vii) dowolną kombinację którychkolwiek z powyższych.

W tym systemie numerowania pozycja #2 odpowiada przypuszczalnemu N-końcowi dojrzałego białka, tzn. po usunięciu peptydu kierującego do chloroplastu.

Powyższe modyfikacje są ukierunkowane pa zmianę zdolności herbicydu, a korzystnie herbicydu opartego pa imidazolipopie, do hamowania aktywności enzymatycznej białka. W korzystnym wykopaniu wyizolowany DNA koduje oporny na herbicyd wariant AHAS. Dostarczono również wektorów DNA kodujących te warianty AHAS, samych białek AHAS oraz komórek, hodowanych in vivo lub w hodowli tkankowej, eksprymujących warianty AHAS lub zawierających te wektory.

W innym aspekcie, wynalazek ten dostarcza sposobu nadawania oporności pa herbicyd komórce lub komórkom, zwłaszcza komórce lub komórkom roślippym takim, jak pa przykład nasiona. Gen kodujący HAS, korzystnie gen HAS Arabidopsis thaliana jest zmutowany tak, aby zmienić zdolność herbicydu do hamowania aktywności enzymatycznej AHAS. Zmutowany gen jest wklonowapy w odpowiedni wektor ekspresyjny, gep jest zaś gtrapsformowano do wrażliwej na herbicyd komórki w warunkach, w których jest eksprymowapy pa poziomie pa tyle wysokim, by nadać komórce oporność na herbicyd.

Rozważane są ponadto sposoby walki z chwastami, w których roślina uprawna zawierająca gen opornej pa herbicyd AHAS według przedstawianego wynalazku jest uprawiana i traktowana efektywną w zwalczaniu chwastów dawką herbicydu.

Ujawniony jest ponadto oparty pa strukturze sposób modelowania służący wytworzeniu pierwszego herbicydu hamującego aktywność AHAS. Sposób ten obejmuje:

a) przyrównanie docelowego białka AHAS do wzorca oksydazy pirogroniapowej lub jego funkcjonalnego równoważnika modelowego AHAS w celu uzyskania trójwymiarowej struktury docelowego białka' AHAS;

b) modelowanie drugiego herbicydu posiadającego aktywność hamowania AHAS w trójwymiarowej strukturze w celu uzyskania położenia, struktury, lub ich kombinacji, kieszeni wiążącej herbicyd w docelowym białku AHAS; oraz

c) zaprojektowanie pie-peptydowego pierwszego herbicydu, który będzie oddziaływał, i korzystnie wiązał się ze zdolną do hamowania aktywności AHAS częścią kieszeni wiążącej, przy czym pierwszy herbicyd hamuje aktywność AHAS w stopniu wostarczającym do zabicia komórki wymagającej do życia aktywności AHAS.

Włączony jest również alternatywny, oparty pa strukturze, sposób modelowania służący wytworzeniu pierwszego herbicydu hamującego aktywność AHAS. Sposób ten obejmuje:

a) przyrównane docelowegobiakga AHAS do pierwszej wzorca AHAS uzyskanzyo z polipeptydu o sekwencji arnipokwasowej według figury 1 lub jego funkcjonalnego odpowiednika w celu uzyskania trójwymiarowej struktury docelowego białka AHAS;

186 091

b) modelowanie drugiego herbicydu posiadającego aktywność hamowania AHAS w trórwymCarowrr strukturze w celu uzyskania położenia, struktury, lub ich kombinacji, kieszeni wiążącej herbicyd w docelowym białku AHAS; oraz

c) zaprojektowanie oie-prptydowego pierwszego herbicydu, który będzie oddziaływał, i korzystnie wiązał się ze zdolną Oo hamowania aktywności AHAS częścią kieszeni wiążącej, przy czym pierwszy herbicyd hamuje aktywność AHAS w stopniu wystarczającym do zabicia komórki wymagającej Oo życia aktywności AHAS.

Korzystnie w każdym ze sposobów pierwszy herbicyd zawiera przynarmoier jedną grupę funkcyjną odOpiaływującąj grupa funkcyjną z kieszeni wiążącej.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek ten obejmuje racjonalne projektowanie, czyli modelowanie molekularne oparte na strukturze zmodyfikowanych wersji enzymu AHAS i herbicydów hamujących AHAS. Te zmodyfikowane enzymy (warianty białka AHAS) są oporne na Opiałnoie herbicydów. Wynalazek ten obejmuje również sekwencje DNA kodujące te wnrinoty, wektory zawierające te sekwencje DNA, warianty białka AHAS oraz komórki eksprymujące te warianty. Dodatkowo dostarczone są sposoby wytwarzania oporności na herbicydy u roślin przez ekspresję tych wariantów, a także sposoby zwalczania chwastów. DNA oraz warianty AHAS w niniejszym wynalazku zostały odkryte w wyniku badań opartych na modelowaniu molekularnym struktury AHAS.

Racjonalne oparte na strukturze proroktownoir wariantów AHAS i herbicydów hamujących AHAS

Oporne na herbicydy warianty AHAS zgodnie z niniejszym wynalazkiem są przydatne w nadawaniu oporności na herbicydy roślinom i mogą być projektownoe przy zastosowaniu modelu POX, modelu AHAS lub ich funkcjonalnych odpowiedników takich, jak, przykładowo: transketolapy, karboligazy, Orkarboksylaza pirogrooiαoowα, białka wiążące FAD i/lub TPP jako kofaktor, czy jakiekolwiek mne białka posiadające cechy struktury zbliżone Oo POX i/lub AHAS; modelu AHAS takiego, jak model o sekwencji z figury 1; lub fuokcjooaloooo równoważnika sekwencji z figury 1, w tym wariantu wymodelowanego na podstawie P0prpe0oiego modelu. Do białek przydatnych w tym celu należą wszystkie białka, których odchylroio kwadratowe śreOnie na atomach węgla Ca wobec którejkolwiek z wymienionych powyżej cząsteczek jest nie mniejsze niż 3,5 angstrema. Na podstawie tych wzorców można również modelować herbicydy skierowane przeciwko AHAS. Funkcjonalnym równoważnikiem sekwencji ammokwasowej AHAS jest sekwencja cechująca się znaczącą, tzn. 60-70% homologią, zwłaszcza w obszarach konserwowanych ewolucyjnie takich, jak, przykładowo przypuszczalne kieszenie wiążące. Stopień homologii można wyznaczyć przez proste porównanie przy użyciu programów ponoych w obecnym stanie techniki takich, jak przykładowo GAP i PILEUP z pakietu GCG. Homologia oznacza tu identyczne aminokwasy lub konserwatywne podstawienia. Fuokcjooαloym rówooważnikiom danej reszty ammokwasowej w sekwencji białka AHAS z figury 1 jest reszta ammokwasowa z innego białka AHAS, która po prpyrówonoiu do sekwencji z figury 1 przy użyciu znaorgo w technice programu takiego, jak przykładowo GAP i PILEUP z pakietu GCG, znajduje się w tej samej pozycji co aminokwas z figury 1.

Etapy racjooaloego projektownoia obejmują zwykle: (1) przyrównanie docelowego białka AHAS z wzorcem lub strukturą POX albo wzorcem lub struktura AHAS; (2) ewentualoir i wówczas, gOy wzorzec AHAS ma piOentyflkowneą kieszeń wiążącą herbicyd, modelowanie jeanego lub więcej herbicydów w trójwymiarowej strukturze w celu zlokalizowania kieszeni wiążącej herbicyd w białku docelowym; (3) wybór mutacji oparty na modelu; (4) mutngroezę ukierunkowaną; oraz (5) ekspresje i oczyszczanie wariantów. Dodatkowe etapy mogą obejmować (6) oznaczanie właściwości enzymatycznych i (7) ocenę i wybór odpowiednich wnrinetów przez porównanie z właściwościami dzikiej AHAS. Każdy z tych etapów omówiono osobno poniżej.

1. Modajowaaie molekι^llnτle

Techniki modelowania molekularnego (a zwłaszcza modelowania białek opartego na homologii) mogą przyczynić się do zrozumienia struktury i aktywności danego białka.

186 091

Strukturalny model białka można otrzymać bezpośrednio na podstawie danych doświadczalnych takich, jak krystalografia rentgenowska, pośrednio przez modelowanie na podstawie homologii itp., lub kombinacje powyższych (patrz White i wsp., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 23:349, 1994). Poznanie trójwymiarowej struktury aHaS dostarcza podstawy do opracowania racjonalnej strategii mutacji konkretnych aminokwasów w AHAS, które nadadzą polipeptydowi oporność na herbicydy.

Modelowanie molekularne struktury AHAS Zea mays, przy zastosowaniu jako wzorca zbliżonej, znanej krystalograficznej struktury oksydazy pirogronianowej (POX) z Lactobacillus planarum, dostarcza trójwymiarowego modelu struktury AHAS użytecznego w projektowaniu opornych na herbicydy wariantów AHAS lub hamujących AHAS herbicydów. Taka procedura modelowania wykorzystuje fakt, że AHAS i POX charakteryzują się wieloma wspólnymi cechami biochemicznymi i ich geny mogą być wywiedzione od wspólnego przodka (Chang i wsp., J. Bacteriol., 170:3937,1988).

Ze względu na duży stopień miedzygatunkowej homologii AHAS, opisana tu wymodelowana AHAS lub jej funkcjonalne odpowiedniki mogą być również użyte jako wzorce do projektowania wariantów białka AHAS.

Uzyskanie jednego modelu przy zastosowaniu interakcyjnej grafiki molekularnej i porównań sekwencji opisano szczegółowo poniżej. Trójwymiarowa struktura AHAS otrzymana w wyniku tej procedury przewiduje przybliżone rozmieszczenie przestrzenne centrum aktywnego enzymu oraz miejsca lub kieszeni wiązania inhibitorów w tym, lecz nie jedynie, herbicydów imidazolinonowych. Model jest następnie udoskonalany i reinterpretowany na podstawie badań biochemicznych, które również opisano poniżej.

Modelowanie białek oparte na homologii wymaga przyrównania sekwencji pierwszorzędowej badanego białka do drugiego białka, którego struktura krystalograficzna jest znana. Do modelowania na podstawie homologii AHAS wybrano oksydazę pirogronianową (POX) ponieważ POX i AHAS charakteryzują się wieloma wspólnymi cechami biochemicznymi. Na przykład, POX i AHAS mają wspólne aspekty mechanizmów reakcji enzymatycznych, podobnie jak i wymagania odnośnie kofaktorów i jonów metali. Oba enzymy wymagają do działania pirofosforanu tiaminy (TPP), dinukleotydu flawino-adeninowego (FAD) oraz kationu dwuwartościowego. FAD uczestniczy w reakcji redoks podczas katalizy przez POX, ma jednak przypuszczalnie jedynie strukturalną funkcję w AHAs, co stanowi prawdopodobnie pozostałość po ewolucji AHAS z POX. Oba enzymy wykorzystują pirogronian jako substrat i tworzą pirofosforan hydroksyetylotiaminy jako stabilny produkt przejściowy reakcji (Schloss, J.V. i wsp., w: Biosynthesis of branched cham amino acids, Barak, Z.J.M., Chipman, D.M., Schloss, J.V. (red) VCH Publishers, Weinheim, Niemcy, 1990).

Dodatkowo, aktywność AhAS jest obecna w chimerycznym białku POX-AHAS zawierającym N-końcową część POX i C-końcową część AHAS, zaś sama POX wykazuje niewielki stopień aktywności AHAS. AHAS i POX wykazują również podobne właściwości w roztworze (Risse, B. I wsp., Protein Sei. 1:1699 i 1710, 1992; Singh, B.K., & Schmitt, G.K. (1989), FEBS Letters, 258:113; Singh, B.K., i wsp., (1989) w: Prospects for Amino Acid Biosynthesis Inhibitors in Crop Protection and Pharmaceutical Chemistry, (Lopping, L.G.m i wsp., red., BPC Monograph str. 87). Przy wzroście stężenia białka zarówno POX jak i aHAs przechodzą krokowo z formy monomerycznej do dimerów i tetramerów. Wzrost stężenia FAD również indukuje wyższe rzędy składania podjednostek. Forma tetrameryczna obydwu białek jest najstabilniejsza wobec temperatury i denaturacji chemicznej.

Ponadto, struktura krystaliczna POX z Lactobacillus planarum została rozwiązana przez Mullera i wsp., Science 259:965, 1993. Twórcy tego wynalazku stwierdzili, że częściowo na podstawie stopnia fizycznej, biochemicznej i genetycznej homologii między AHAS i POX, struktura krystalograficzna POX może być wykorzystywana jako strukturalny punkt wyjścia do opartego na homologii modelowania struktury AHAS.

Jednakże sekwencje AHAS i POX z L. planarum nie są dostatecznie podobne by umożliwić całkowicie skomputeryzowane porównanie. Całościowo, zaledwie około 20% aminokwasów jest identycznych, podczas gdy około 50% aminokwasów należy do podobnej klasy (tzn. kwaśnych, zasadowych, aromatycznych itd.). Jeżeli jednak porówna się sekwencje

186 091 uwzględniając podział na omicokwαsa hydrofobowe i hydrofilowe, ponad 500 z 600 aminokwasów pasuje. Przewidywania struktury drugorzędowej AHAS (Holley i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa 86:152, 1989) wykazały silne podobieństwo do właściwej struktury POX. Dla blisko 70% pozycji omicokwαsowach, przewidywana struktura drugorzędowa AHAS pasuje do struktury POX.

Monomery POX składają się z trzech domen, z których każda posiada centralną, równoległą strukturę-β z połączeniami złożonymi z α-helis i długich pętli (Muller i wsp., Science 259:965, 1993). Topologia płaszczyzn jest różna w różnych domenach, tzn. w pierwszej i trzeciej domenie łańcuchy układają się w e-płaszczyznę w kolejności 2-1-3-4-6-5, podczas gdy w e-płaszczyźnie drugiej domeny kolejność to 3-2-1-4-5-6.

Komputerowe porównania oparto na przewidywaniach struktury drugorzędowej i homologii sekwencji. Zastosowano konwencjonalny sposób porówcywocia sekwencji parami opisany przez Negdlgmana i Wuncha w J Mol. Biol. 48:443, 1970. Dwie sekwencje ułożono tak, aby uzyskać maksymalną wartość podobieństwa. Podobieństwo (homologia) jest to suma wartości podobieństwa wszystkich par porównanych reszt plus ewentualna kara za wprowadzenie do ułożenia przerw. Wartość podobieństwa pary aminokwasów jest to stabglarazowana liczba całkowita. - System naliczania podobieństwa aminokwasów oparty jest na obserwacji częstości dywergencji pomiędzy daną parą aminokwasów. (MO Dayhoff, RM Schwartz & BC Orcutt „Atlas of Protein Sequence and Structure” tom 5 supl. 3 str. 345-362, 1978).

Porównocia sekwencji zostały dalej dopracowane przez zmianę położenia przerw tak, aby zachować ciągłe obszary regularnej struktury drugorzędowej. Podstawienia ominokwasowe uzyskane przez przeanalizowanie prawdopodobnych sposobów przarównocia sekwencji porównano ze sobą przy zastosowaniu interakcyjnej grafiki molekularnej. Wybrano porównocia dające najbardziej konserwatywne podstawienia ze względu na konkretną funkcję aminokwasów w danym obszarze białka. Ostateczne porównanie sekwencji POX i AHAS przedstawiono na figurze 2. Zidentyfikowano zachowywane grupy aminokwasów, zwłaszcza w miejscu wiązociα TPP i w częściach miejsca wiązania FAD. Porównanie ujawniło znaczny stopień podobieństwa pomiędzy AHAS i POX w pierwszej domenie, większości części drugiej domeny i około połowie trzeciej domeny. Większość obszarów, które nie dawały się łatwo przyrównać i mogą mieć odmienną strukturę w POX i AHAS występuje, jak się oczekuje, na powierzchni białka i nie uczestniczy w wiązaniu kofaktorów lub inhibitorów. Nieduże przesunięcia w ułożeniu przyrównywanych sekwencji nie mają zasadniczego wpływu na przewidywanie miejsc mutacji.

Większość aminokwasów wiążących się z TPP jest wysoce zachowywanych pomiędzy POX i AHAS (np. P48-G49-G50). W niektórych przypadkach, aminokwasy będące blisko TPP różnią się pomiędzy POX i AHAS lecz pozostają w wysoce zachowywanym regionie (na przykład pozycje ominokwosowe 90-110). Z drugiej strony, miejsce wiązania FAD zdaje się być słabiej zachowywane. Mimo, że niektóre aminokwasy wiążące FAD są wysoce zachowywane (na przykład D325-I326-D327-P328) inne wyraźnie różnią się pomiędzy AHAS i POX (na przykład aminokwasy w pętli od pozycji 278 do 285 nie są homologiczne). Szczegółowa analiza ujawnia, że przynajmniej dla niektórych słabiej zachowywanych miejsc kontaktu za interakcje odpowiada szkielet polipeptadowa nie zaś łańcuchy boczne aminokwasów. A zatem wymagane jest jedynie zachowanie struktury przestrzennej polipeptydu nie zaś sekwencji aminokwasów (na przykład, szkielet polipeptydowy pozycji 258-263 wiąże łańcuch rybitolowy FAD). Połowa miejsc wiązania adeniny i iyoalloksαzaca wyraźnie się różni.

Po porównaniu struktur pierwszogyęrowych zbudowano oparty na homologii model przez transpozycję sekwencji ominokwosowych AHAS na wzorzec struktury POX. Brakujące współrzędne uzyskano stopniowo wykorzystując wzorce aminokwasów dla uzupełnienia niezdefiniowanych łańcuchów bocznych. Dla uzupełnienia konformacji niezirentyfikowocach obszarów pętli posłużono się przeszukiwaniem banków danych i minimalizacją energii małych fragmentów cząsteczki. Kofaktory TPP i FAD zostały wmodelowane we właściwe kieszenie wiązania. Model ten poddano następnie 5000 cykli minimalizacji energii. Całe modelowanie komputerowe przeprowadzono na stacji roboczej IRIS Indigo Elan R4000 wyprodukowanej przez Silicon Graphics Co. Interakcyjne modelowanie molekularne i minimolizacjg

186 091 energii przeprowadzono w programie Quanta/CHARm 4.0 firmy Molecular Simulations Inc. Podczas tego etapu konformacja była stabilna, co wskazuje ha to, że nie zachodziły żadne silnie niekorzystne oddziaływania, takie, jak na przykład bliskie kontakty van der Waalsa. Wyniki przedstawiono schematycznie na figurze 3.

Charakterystyka przewidywanej struktury AHAS

Analiza wymodelowanej struktury AHAS opisanej powyżej wykazuje, że większość białka zwija się tworząc strukturę prawdopodobną energetycznie, w której większość hydrofilowych łańcuchów bocznych jest dostępna dla rozpuszczalnika. Powierzchnie płaszczyzn-β są gładkie i pasują do przyłączonych do nich obszarów łączących.

Model dimeru AHAS wytworzono duplikując współrzędne monomeru AHAS o zminimalizowanej energii i nakładając obie kopie na dwie podjednostki POX stosując pary współrzędnych Ca według przyrównania sekwencji. Łańcuch polipeptydowy AHAS zwija się w trzy podobnie zwinięte domeny złożone z centralnej sześciołańcuchowej równoległej płaszczyzny-β otoczonej długimi „pętlami i a-helisami. Dwie podjednostki składane są tak, że pierwsza domena jednej podjednostki jest bezpośrednio zbliżona do wiążących się z kofaktorami domen 2 i 3 drugiej podjednostki. W tym miejscu pomiędzy podjednostkami pozostaje wypełniona rozpuszczalnikiem przestrzeń. Ta kieszeń, ograniczona przez zbieganie się trzech domen jest proponowanym miejscem wejścia substratu. Proponuje się również, że jest to miejsce wiązania herbicydów.

Wewnętrzna powierzchnia kieszeni wiążącej wyznaczona jest przez kofaktory. Grupa tiazolowa TPP mieści się u dołu kieszeni. Domena 3 uczestniczy w tworzeniu wewnętrznej powierzchni kieszeni poprzez krótką a-helisę, której oś skierowana jest w stronę reszty pirofosforanowej TPP i kompensuje ładunki fosforanów swym momentem dipolowym. Ta decydująca helisa, zaczynająca się w pozycji G498 - pozycji „skrętu w bliskim kontakcie z TPP zaś kończąca się w pozycji F507 zawiera trzy znane miejsca mutacji nadających oporność na sulfonylomocznik: V500, W503 i F507 (patrz patenty USA nr nr 5,013,659; 5,141,870; i 5,378,824). W domenie 1, pętla określona jako P48-S52 (pomiędzy łańcuchem-β 2 a α -hellsą2) znajduje się naprzeciwko W503, w której to pozycji mutacja nadaje oporność na imidazolinony. Aminokwasy Y47 do G50 pozostają też w kontakcie z TPP. Pętla ta sąsiaduje z P184-Q189, kolejnym skrętem, który łączy ostatni łańcuch β-płaszczyzny domeny 1 z łańcuchem-β łączącym się z domeną 2. Wewnątrz kieszeni, w pobliżu wejścia znajduje się długi obszar domeny 1 oddziaływujący z komplementarnym obszarem domeny 2. Aminokwasy 125-129 i 133-137 domeny 1 oraz aminokwasy 304-313 domeny 2 znajdują się na powierzchni kieszeni. Skręt składający się z T96-G100 znajduje się pomiędzy pętlą 125-129 a TPP. Kolejny obszar domeny 3 i dwa regiony domeny 2 wyściełające kieszeń wiążącą znajdują się w przeciwległym rogu kieszeni. Aminokwasy 572, 575, 582 i 583 domeny 3 wyznaczają powierzchnię kieszeni po jednej stronie. Pozostała część wnętrza kieszeni wyznaczana jest przez FAD i przez pętlę L278-G282 stykającą się z pierścieniem izoalloksazynowym FAD.

Modele strukturalne białka AHAS mogą być również użyte dla racjonalnego projektowania herbicydów lub inhibitorów AHAS.

2. Modelowanie herbicydów w miejscach wiążących

Imazethapyr, aktywny imidazolinon w PURSUIT®, został umieszczony w proponowanym miejscu wiązania przy zastosowaniu interakcyjnej grafiki molekularnej (figura 4). K185 wybrano jako „kotwicę” oddziaływującą z ładunkiem grupy karboksylowej. Jednostka NHCO imidazolinonu została umieszczona tak, aby utworzyć wiązania wodorowe z G50 i A51. Umieściło to podstawnik metylowy imazethapyru w pobliżu V500 w szkielecie małej a -helisy. Grupa izopropylowa jest przypuszczalnie związana z resztami hydrofobowymi aminokwasów w obszarze pozycji aminokwasowych 125-135 współtworzącym wewnętrzną powierzchnię kieszeni. Pierścień pirydynowy jest najprawdopodobniej „wciśnięty” miedzy A134 lub F135, F507 i W503. W503 oddziaływuje również z układem pierścienia imidazolinonowego.

W podobny sposób, herbicydy sulfonylomocznikowe wmodelowano w miejsce częściowo nakładające się na opisane miejsce wiązania imidazolinonu. Nakładanie się miejsc wiązania sulfonylomocznika i imidazolinonu pozostaje w zgodzie z wynikami doświadczeń

186 091 wiązania współzawodniczego oraz z dostępnymi danymi o mutacjach, które wykazują, że ta sama mutacja u kukurydzy, W503L, nadaje oporność na oba herbicydy. W tych modelach większość znanych miejsc mutacji nadających oporność na herbicydy sulfonylomocznikowe, tzn. G50, A51, K185, V500, W503, F507 są w bliskim kontakcie ze związanymi herbicydami. P126 i A51 wymagane są dla utrzymania w pozycji łańcucha bocznego K185 przez wytworzenie poru hydrofobowego. S582, miejsce specyficznej oporności na imidazolinon, jest odległe od obszaru wiązania i zlokalizowane jest w obszarze, w którym homologia jest na tyle słaba, że można spodziewać się zmian w strukturze przestrzennej. Miejsce wiązania FAD cechuje się wyraźnie słabą homologia miedzy AHAS a POX w tym obszarze; S582 jest pozycją nadającą oporność u kukurydzy, aminokwas ten i sąsiadujące z nim aminokwasy pozostają w bliskim kontakcie z kieszenią centrum aktywnego. Proponuje się, że FAD i obszar pętli obejmujący aminokwasy od pozycji 278 do 285 oddalają się nieco od trzeciej domeny (w dół na figurze 4), i że pętla zawierająca S582 zwija się w przestrzeni pomiędzy helisą w pozycji 499 do 507 a pętlą w pozycji 278 do 285. D305, inne znane miejsce nadające oporność, znajduje się blisko FAD i moduluje oddziaływanie między domenami 1 i 2. M280 może albo uczestniczyć w pozycjonowaniu helisy w pozycjach 498 do 507, albo bezpośrednio w wiązaniu inhibitorów, jeśli domeny 1 i 2 przysuną się nieco bliżej do siebie.

3. Wybór mutacji

Wybrano konkretne pozycje aminokwasowe jako miejsca do wprowadzenia mutacji w strukturze pierwszorzędowej AHAS. Aminokwasy te wybrano na podstawie ich pozycji tak, że gdy dana pozycja aminokwasowa jest zmieniona, nastąpi zmiana (tzn. zmniejszenie) powinowactwa herbicydu do kieszeni wiążącej. Nie jest konieczne, by pozycja mutacji znajdowała się wewnątrz kieszeni, gdyż aminokwasy poza samą kieszenią mogą zmieniać ładunek lub konfigurację kieszeni. Wybór miejsc docelowych mutacji dokonywany jest przy użyciu modeli molekularnych takich, jak opisane powyżej. Na przykład, zgodnie z modelem powyżej, arginina w pozycji 128 (oznaczona jako R128 na figurze 1 stosując jednoliterowy kod oznaczeń aminokwasów) zlokalizowana jest w pobliżu wejścia do kieszeni wiążącej substrat i herbicydy i cechuje się znacznym stopniem swobody konformacyjnej, który może pozwolić jej na uczestniczenie w transporcie naładowanych cząsteczek herbicydu do kieszeni wiążącej. Aminokwas ten został zatem zastąpiony alaniną w celu usunięcia zarówno ładunku, jak i długiego hydrofobowego łańcucha bocznego (uzyskana mutacja jest oznaczona R128A). Mutacje mogą obejmować pojedyncze podstawienia, zastępujące aminokwas z dzikiej sekwencji jakimkolwiek innym aminokwasem. Alternatywnie, mutacje mogą obejmować delecje lub insercje jednego lub więcej aminokwasów, korzystnie nie więcej niż 5, w danej pozycji. Wstawiona sekwencja może obejmować sekwencję aminokwasową istniejącą w innym białku, lub może też obejmować sekwencję całkowicie syntetyczną. Ponadto, więcej niż jedna mutacja i/lab więcej niż jeden rodzaj mutacji, może być wprowadzona do pojedynczego polipeptydu.

4. Mutageneza ukierunkowana

DNA kodujący AHAS może być manipulowany w celu wprowadzenia pożądanych mutacji. Mutagenezę przeprowadza się przy użyciu znanych w technice sposobów, tak, jak opisano to na przykład w Higuchi, R., Recombinant PCR., w M.A. Innis i wsp., (red.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, str. 177-183, 1990.

5. Ekspresja i oczyszczanie wariantów

Zmutowana, czyli wariantowa sekwencja AHAS jest wklonowana w wektor ekspresyjny DNA (patrz np. przykład 3) i jest eksprymowana w odpowiedniej komórce takiej, jak na przekład E. coli. Korzystnie, DNA kodujący AHAS jest połączony z elementem regulującym transkrypcję, zaś wariant AHAS eksprymowany jest w postaci białka fuzyjnego, na przykład, S-transferazy glutatibnowej, w celu ułatwienia oczyszczania (patrz przykład 3 poniżej). Wariant AHAS jest następnie oczyszczany przy użyciu chromatografii powinowactwa lub dowolnego innego, znanego w technice sposobu. „Oczyszczenie” polipeptydu AHAS oznacza wyizolowanie polipeptydu AHAS w postaci umożliwiającej pomiar jego aktywności enzymatycznej bez wpływu innych składników komórki, w której polipeptyd jest eksprymowany.

186 091

6. Oznaczanie właściwości enzymatycznych

Dla oczyszczonych wariantów AHAS można oznaczyć jedną lub więcej z następujących trzech właściwości:

a)specyficzna, czyli katalityczna aktywność w przekształcaniu pirogronianu do acetomleczanu (wyrażana w jednostkach/mg czystej AHAS, przy czym jednostka aktywności definiowana jest jako 1 pmol acetomleczanu wytworzony/godzinę), lub w kondensacji pirogronianu i 2-ketomaślanu z wytworzeniem acetohydroksymaslanu (wyrażana w jednostkach/mg czystej AHAS, przy czym jednostka aktywności zdefiniowana jest jako 1 pmol acetohydroksymaslanu wytworzony/godzinę);

j1stopień hamowaniaprzep herbierdtaki,jak na przykład, im idazolizon (wyrażony w IC₅₀, stężeniu, przy którym zahamowane jest 50% aktywności enzymu); i c1wyjiórcznść oporności na wybrany herbicyd wobec innych herbicydów. Współczynnik wybiórczości definiowany jest jako krotność oporności mutanta na imidnznlipnny względem enzymu dzikiego, podzielona przez krotność oporności tego samego mutanta na inne enzymy, również względem enzymu dzikiego. Krotność oporności na herbicyd względem enzymu dzikiego wyrażona jest przez IC₅₀ wariantu podzielony przez IC₅₀ enzymu dzikiego. Współczynnik wybiórczości (S.I.) jest zatem wyrażony następującym równaniem s _T _ IC₅0wariantu dla herbicydu A/IC^ dzikiego dla herbicydu A IC ₅0 wariantu dla herbicydu B/IC55 dzikiego dla herbicydu B

Odpowiednie systemy oznaczeń dla wyznaczenia tych wartości obejmują, lecz nie są ograniczone do opisanych szczegółowo w przykładzie 4 poniżej.

7. a. Ocena odpowiednich wariantów

Właściwości enzymatyczne wariantów pnlipeptydów AHAS porównywane są z dziką AHAS. Korzystnie, dana mutacja daje w wyniku wariant polipeptydu AHAS utrzymujący aktywność enzymatyczną in vitro wobec p^gron^u lub pirogropinpu i 2-ketomnślnnu, tzn. przekształcanie pirngroninnu w ncetomlecznp lub kondensację pirogropiapu i 2-ketomnślnpu z wytworzeniem ncetoOydrnasymaślanu (a zatem wykazujący, jak się oczekuje, aktywność biologiczną in vivo), przy wykazywaniu aktywności katalitycznej względnie bardziej opornej na wybrany herbicyd^) niż dzika AHAS. Korzystnie wariant AHAS cechuje się:

(i) w nieobecności przynajmniej jednego herbicydu, (a) aktywnością katalityczną wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany (b) aktywnością katalityczną w połączeniu z jakimkolwiek wariantem białka AHAS opornym na herbicyd również eksprymownpym w tej komórce, który może być tym samym lub innym białkiem niż pierwszy wariant białka AHAS, wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest easprymownpy; przy czym komórka wymaga aktywności AHAS do życia.

(ii) aktywnością katalityczną bardziej oporną na przynajmniej jeden herbicyd niż w dzikim białku AHAS i jest względnie bardziej oporny na herbicyd^) niż dzika AHAs.

A zatem, jakikolwiek konkretny wariant białka AHAS nie musi wykazywać całkowitej aktywności katalitycznej niezbędnej do utrzymania przy życiu komórki, musi jednak wykazywać aktywność katalityczną. w ilości, pojedynczo lub w połączeniu z aktywnością katalityczną dodatkowych kopii tego samego wariantu AHAS i/lub aktywnością katalityczną, innych wariantów jiałka(binłek1 AHAS, wystarczającej do utrzymania przy życiu komórki wymagającej do życia aktywności AHAS. NA przykład, aktywność katalityczna może być zwiększona do minimalnego dopuszczalnego poziomu przez wprowadzenie wielu kopii genu kodującego wariant do komórki lub przez wprowadzenie genu, który zawiera ponadto względnie silny promotor zwiększający produkcję wariantu.

Bardziej oporny oznacza, że aktywność katalityczna wariantu jest zmniejszana przez herbicyd(y), jeżeli w ogóle, to w stopniu mniejszym niż zmniejszana jest aktywność dzikiej AHAS przez ten herbicydy). Korzystny bardziej oporny wariant AHAS utrzymuje wystarczającą aktywność katalityczną dla utrzymania przy życiu komórki, rośliny lub organizmu,

186 091 przy czym przy tym samym stężeniu tego samego herbicydu (-ów), dzika AHAS nie utrzymałaby aktywności katalitycznej wystarczającej do utrzymania przy życiu komórki, rośliny lub organizmu.

Korzystnie, aktywność katalityczna w nieobecności herbicyd^-ów) wynosi przynajmniej 5%, a najkorzystniej, ponad 20% aktywności katalitycznej dzikiej AHAS w nieobecności herbicydu^ów). Najkorzystniejsze warianty AHAS są bardziej oporne pa herbicydy imidazolipopowe niż na inne herbicydy takie, jak herbicydy oparte pa snlfonolomoczpiknc aczkolwiek w niektórych zastosowaniach wybiórczość nie jest ani niezbędna, ani korzystna.

W przypadku wariantów AHAS opornych na imidazolipopy korzystnym jest aby wariapt AHAS cechował się (i) aktywnością katalityczną przy nieobecności tego herbicydu przekraczającą 20% aktowpości katalitycznej dzikiej AHAS;

(ii) aktywnością katalityczną względnie bardziej oporną na obecność herbicydów imidayolinonHgych w porównaniu do dzikiej AHAS; i (iii) aktywnością katalityczną, która jest względnie bardziej wrażliwa na obecność herbicydów snlfonylomocznikogtycl w porównaniu do herbicydów imidazolipopowych. Najkorzystniejsze oporne na herbicydy warianty AHAS wykazują, minimalną aktywność właściwą około 20jedpostkk/my, minimalne lub żadne hamowanie przez imidazolipop, oraz współczynnik wybiórczości w zakresie od około 1,3 do około 3000 względem innych herbicydów.

Chcąc uniknąć związania się teorią, wierzymy, że systematyczne i iteracojne zastosowanie tego sposobu do dzikiego lub innych rodzajów białka AHAS pozwoli na otrzymanie w efekcie wariantów AHAS cechujących się pożądanymi właściwościami - wysoką aktywnością enzymatyczną, jak wyjaśniono powyżej i opornością na jedną lub więcej klas herbicydów. Na przykład, mutacja dzikiej sekwencji AHAS w konkretnej pozycji do konkretnego aminokwasu może dać w efekcie mutanta wykazującego wysoki stopień oporności na herbicyd, lecz także znaczącą utratę aktywności enzymatycznej wobec pirogronianu lub pirogroniapu i 2-ketomaślapu. W drugim zastosowaniu powyższej metody, początkowym, czyli docelowym peptydem byłby ten wariant (w miejscu dzikiej AHAS). Racjonalne projektowanie polega wówczas pa podstawieniu ippocI aminokwasów w oryginalnym miejscu mutacji i/lub ipsercji lub delecji aminokwasów w wybranych punktach lub obszarach w oczekiwaniu, że utrzymana zostanie oporność na herbicyd lecz również uzyskany zostanie wysoki poziom aktywności katalitycznej.

Oparte pa strukturze racjonalne projektowanie białek AHAS opornych na herbicydy posiada wiele przewag nad konwencjonalnymi podejściami polegającymi pa losowej mutagenezie i selekcji. Na przykład, gdy zastąpienie konkretnego aminokwasu innym wymaga zmiany' więcej niż jednego nukleotydu w kodonie, prawdopodobieństwo takiego zajścia w sposób losowy jest tak Piskie, że aż niepraktyczne. W przeciwieństwie, nawet podwójne czy potrójne zmiany sekwencji nukleotydowej w kodonie mogą być łatwo wprowadzone, jeżeli wskaże pa to racjonalne projektowanie. Na przykład, jedna z racjonalnie zaprojektowanych mutacji nadających wybiórczą oporność na imidazolipop wymaga zmiany argipipy na glutaminian. Arginipa jest kodowana przez CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG, podczas gdy glutaminian kodowany jest przez GAA i GAG. Ponieważ żaden z kodonów argipipowych nie zaczyna się od GA, mutacja ta wymagałaby podwójnego podstawienia sąsiadujących ze sobą nukleotydów, co przy zastosowaniu losowej mutagenezy zachodziłoby na tyle rzadko, że byłoby nieprzewidywalne i niepowtarzalne przy jakimkolwiek prawdopodobieństwie sukcesu. Mimo, że częstość mutacji można podczas losowej mutagenezy zwiększyć, zmiany·' w sekwencji nukleotydowej zachodziłyby z jednakowym prawdopodobieństwem w całym genie AHAS, przy braku uprzedniego ukierunkowania mutacji. ZgiększołoAo to prawdopodobieństwo uzyskania nieistotnej mutacji, wpływającej niekorzystnie pa aktywność enzymatyczną. Podobnie, rzadkością byłoby, przy zastosowaniu losowej mutagenezy, odnalezienie wielokrotnych mutacji typu podstawień, delecji, lub podstawień i delecji nadających oporność pa herbicydy przy zachowaniu aktywności katalitycznej. Mutacje typu delecji, nadające oporność pa herbicydy, byłyby również mało prawdopodobne przy zastosowaniu losowej mutagepezy. Delecje mu186 091 siałyby być ograniczone do niewielkich obszarów i musiałyby zachodzić w trójkach aby utrzymać fazę odczytu AHAS dla zachowania aktywności katalitycznej.

Jednakże, przy zastosowaniu racjonalnego, opartego na strukturze podejścia stosunkowo łatwo jest uzyskać i precyzyjnie skierować podwójne podstawienia i/lub delecje aminokwasowe. Ponadto, różne mutageny stosowane w losowej mutagenezie, wytwarzają konkretne typy mutacji. Na przykład, azydek sodu tworzy u roślin pojedyncze podstawienia, podczas gdy promieniowanie wytwarza raczej delecje. Zgodnie z powyższym, uzyskanie wielu kombinacji podstawień i delecji wymagałoby użycia dwóch protokołów mutagenezy.

Ostatecznie, obecny oparty na strukturze sposób racjonalnego projektowania opornych na herbicydy wariantów AHAS pozwala na iteracyjne ulepszanie mutacji oporności na herbicydy, którego to etapu nie ułatwia losowa mutageneza. Identyfikacja miejsca mutacji nadającego oporność na herbicyd przez losową mutagenezę daje niewielkią jeżeli jakąkolwiek, zdolność przewidywania dla prowadzenia dalszych ulepszeń w charakterystykach mutanta. Z drugiej strony, obecne oparte na strukturze podejście, pozwala na wprowadzanie ulepszeń na podstawie pozycji, otoczenia i funkcji danej pozycji aminokwasowej w modelu strukturalnym.

Sposób iteracyjnego ulepszania pozwala również na niezależne manipulowanie trzema istotnymi właściwościami AHAS: poziomem oporności, wybiórczością oporności i wydajnością katalityczną. Na przykład, mutacje kompensujące mogą być projektowane w przewidywalny sposób. Jeżeli dana mutacja ma niszczący wpływ na aktywność enzymu, druga kompensująca mutacja - może być użyta dla przywrócenia wydajności. Na przykład, zmiana wypadkowego ładunku domeny po wprowadzeniu lub utraceniu na skutek mutacji naładowanego aminokwasu może być skompensowana przez wprowadzenie drugiej mutacji. Przewidywanie pozycji i rodzaju aminokwasu(-ów) wprowadzanego, usuwanego lub zamienionego w drugiej pozycji w celu przywrócenia aktywności enzymatycznej wymaga znajomości zależności struktury i funkcji uzyskanej dzięki modelowi takiemu, jak tu opisany.

.b. Projektowanie niepeptydowych herbicydów lub inhibitorów AHAS

Indywiduum chemiczne zmieniające i mogące się dopasować w centrum aktywnym docelowego białka lub wiązać się w jakiejkolwiek pozycji, w której mogłoby hamować aktywność katalityczną może być zaprojektowane sposobami znanymi w technice takimi, jak na przykład programy projektowania komputerowego wspomagające projektowanie związków specyficznie oddziaływujących z miejscem receptorowym.

Przykładem takiego programu jest LUDI (Biosym Technologies - San Diego, CA) (patrz też, Lam i wsp., Ściance 263:380, 1994; Thompson i wsp., J. Med. Chem. 37:3100, 1994).

Kieszeń wiążąca, a szczególnie pozycje aminokwasowe zidentyfikowane jako uczestniczące w wiązaniu inhibitorów mogą być wykorzystane jako punkty zakotwiczające w projektowaniu inhibitorów. Projektowanie oddziaływujących ze specyficznym miejscem herbicydów jest korzystne w walce z gatunkami chwastów, które mogą spontanicznie rozwinąć oporność na herbicydy w terenie, zwłaszcza na skutek mutacji w genie AHAS.

Oporne na herbicydy warianty AHAS: DNA, wektory i polipeptydy

Wynalazek ten obejmuje również wyizolowane cząsteczki DNA kodujące oporne na herbicydy warianty polipeptydów AHAS. Geny kodujące polipeptydy AHAS zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą pochodzić z dowolnego gatunku, korzystnie z gatunku rośliny, zaś mutacje nadające oporność na herbicydy mogą być wprowadzane w równoważnych pozycjach w dowolnym z tych genów AHAS. Równoważność danej pozycji kodonowej w różnych genach AHAS jest funkcją zarówno zachowania pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej i wyznaczonego nią białka oraz utrzymaniem podobnej struktury trójwymiarowej. Na przykład, figura 5 przedstawia wysoki stopień homologii sekwencji pomiędzy polipeptydami AHAS uzyskanymi z różnych gatunków roślin. Te polipeptydy AHAS wykazują co najmniej około 60 do około 70% ogólnej homologii. Chcąc uniknąć związania się teorią, wierzymy, że w obszarach polipeptydu wykazujących wysoce zachowywaną sekwencje, konformacja łańcucha polipeptydowego jest również zachowywana. Jest zatem możliwe, by użyć sekwencji kodującej AHAS z jednego gatunku do modelowania molekularnego, wprowadzić przewidywalnie mutacje do genu AHAS drugiego gatunku dla celów wstępnych testów i iteracyjnego

186 091 ulepszania, i ostatecznie wprowadzić zoptymalizowane mutacje do genu AHAS pochodzącego z jeszcze innego gatunku rośliny w celu ekspresji w roślinach transgenicznych.

W jednej serii wykonań, wymienione DNA AHAS kodują warianty polipeptydu AHAS, korzystnie polipeptydu AHAS kukurydzy z figury 1, w których polipeptyd jest zmodyfikowany przez podstawienie w pozycji, lub delecję poprzedzającą lub następująca po jednej lub wielu z następujących pozycji aminokwasowych z figury 1: P48, G49, S52, M53, E54, A84, A95, T96, S97, G98, P99, G100, A101, V125, R127, R128, M129, 1130, G131, T132, D133, F135, Q136, D186, 1187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, M277, L278, G279, H281, G282, T283, V284, G300, V301, R302, F303, D304, R30S, V307', T308, G309, K310,1311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, 1320, E329, 1330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, S469, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, G498, M499, V501, Q502, Q504, D505, R506, Y5O8, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q573, E574, H575, V576, L577, P578, M579,1580, P581, G583, G584, funkcjonalnych odpowiedników którychkolwiek z wyżej wymienionych; insercje lub delecje pomiędzy Q124 a HI50 z figury 1 lub ich funkcjonalnymi odpowiednikami; insercje lub delecje pomiędzy G300 a D324 z figury 1 lub ich funkcjonalnymi odpowiednikami; lub dowolną kombinację którychkolwiek z powyższych.

Mutacje, czy to wprowadzone do polipeptydu z figury 1, czy w równoważne pozycje w innym roślinnym genie AHAS, mogą obejmować zmiany w sekwencji DNA dające w efekcie pojedyncze podstawienia dowolnego jednego lub więcej aminokwasów lub delecje nie więcej niż 5 aminokwasów poprzedzających, lub nie więcej niż 5 aminokwasów za którąkolwiek z pozycji wymienionych powyżej. Odpowiednie zamienniki aminokwasowe obejmują lecz nie są ograniczane przez naturalnie występujące aminokwasy.

Alternatywnie, mutacje mogą obejmować zmiany w sekwencji DNA takie, że jeden lub więcej aminokwasów jest dodanych lub usuniętych w fazie w powyższych pozycjach. Korzystnie, insercje obejmują od około 3 do około 30 nukleotydów, zaś delecje obejmują od około 3 do około 30 nukleotydów. Ponadto pojedynczy zmutowany polipeptyd może zawierać więcej niż jedną podobną lub odmienną mutację.

Przedstawiony wynalazek obejmuje DNA i odpowiadające im sekwencje RNA, jak i sekwencje sensowne i antysensowne. Sekwencje nukleotydowe kodujące polipeptydy AHAS mogą być otoczone naturalnymi sekwencjami regulatorowymi AHAS, lub mogą być powiązane z sekwencjami heterologicznymi, w tym promotorami, enhancerami, elementami regulatorowymi, sekwencjami sygnałowymi, sekwencjami poliadenylacji, intronami, 5'- i 3' obszarami niekodującymi i im podobnymi Ponadto, wymienione kwasy nukleinowe mogą być zmodyfikowane w celu zmiany stabilności, rozpuszczalności, powinowactwa wiązania i specyficzności. Na przykład, warianty sekwencji kodujących AHAS mogą być wybiórczo zmetylowane. Sekwencje kwasów nukleinowych przedstawionego wynalazku mogą również być modyfikowane znacznikiem zdolnym dostarczyć wykrywalnego sygnału, bezpośrednio lub pośrednio. Przykładami znaczników mogą być radioizotopy, cząsteczki fluoryzujące, biotyna i im podobne.

Przedstawiony wynalazek dostarcza również wektorów obejmujących kwasy nukleinowe kodujące warianty AHAS. Znaczna liczba wektorów, w tym wektorów plazmidowych i grzybowych, została opracowana dla ekspresji w różnorodnych gospodarzach eukariotycznych i prokariotycznych. Korzystnie, wektory mogą również zawierać promotor operacyjnie połączony z częścią kodującą AHAS. Kodowana AHAS może być eksprymowana przy użyciu dowolnych stosownych wektorów i komórek gospodarza, przy użyciu metod ujawnionych lub cytowanych w tym dokumencie lub w inny sposób znanych osobom biegłym w odpowiedniej dziedzinie. Przykłady odpowiednich wektorów obejmują nieograniczająco wektory oparte na pBIN, wektory pBluescript i wektory pGEM.

Wynalazek ten obejmuje też zarówno oporne na herbicydy warianty polipeptydów AHAS, jak i ich fragmenty peptydowe. Jak wyjaśniono powyżej, warianty polipeptydów AHAS mogą pochodzić od polipeptydu kukurydzy przedstawionego na figurze 1 lub jakiego186 091 kolwiek roślinnego lub bakteryjnego polipeptydu AHAS, korzystnie roślinnego polipeptydu AHAS. Polipeptydy te mogą być dalej modyfikowane przez, na przykład, fosforylację, siarczanowanie, acylację, glikozylację lub inne modyfikacje białek. Polipeptydy mogą być izolowane z roślin lub z heterologicznych organizmów lub komórek (obejmujących, lecz nie ograniczanych przez: komórki bakterii, drożdży, owadów, roślin i ssaków) do których wprowadzono i wyeksprymowano gen kodujący wariant polipeptydu AHAS. Ponadto, polipeptydy AHAS mogą być modyfikowane znacznikiem zdolnym dostarczyć wykrywalnego sygnału, bezpośrednio lub pośrednio, w tym radioizotopami, cząsteczkami fluoryzującymi i im podobnymi.

Oporne na chemikalia rośliny oraz rośliny zawierające warianty genów AHAS Przedstawiony wynalazek obejmuje transgenijzne komórki, obejmujące, lecz nie ograniczane przez: nasiona, organizmy i rośliny, do których wprowadzono geny kodujące oporne na herbicydy warianty AHAS. Nie ograniczające przykłady odpowiednich roślin biorców wymieniono w tabeli 1 poniżej:

Tabela 1 Rośliny biorcy

Nazwa zwyczajowa	Rodzina	Nazwa systematyczna
1	2	3
Kukurydza	Gramineae	Zea mays
Kukurydza pastewna	Gramineae	Zea mays dentiformis
Kukurydza zwyczajna	Gramineae	Zea mays vulgaris
Kukurydza, odmiana „pop”	Gramineae	Zea mays microsperma
Kukurydza mączysta	Gramineae	Zea mays amylacea
Kukurydza cukrowa	Gramineae	Zea mays saccharata
Kukurydza odmmiana „waxy”	Gramineae	Zea mays ceratina,
Kukurydza cukrowa	Gramineae	Zea mays amyleasaccharata
Pszenica orkisz	Pooideae	Triticum spelta
Pszenica twarda (durum)	Pooideae	Triticum durum
Pszenica szorstka (angielska)	Pooideae	Triticum turgidum
Pszenica orkisz (odm. „large spelt”)	Pooideae	Triticum spelta
Pszenica polska	Pooideae	Triticum polonicum
Pszenica szorstka (angielska) odm. „Poulard”	Pooideae	Triticum turgidum
Pszenica samopsza	Pooideae	Triticum monococcum
Pszenica samposza (odm. „smali spelt”)	Pooideae	Triticum monococcum
Pszenica zwyczajna	Pooideae	Triticum aestivum
Ryż	Gramineae	Oryza sativa
Zizania wodna (dziki ryż amerykański)	Gramineae	Zizania aquatica
Ryż australijski	Gramineae	Oryza australiensis
Ryż indyjski (zizania wodna)	Gramineae	Zizania aquatica
Ryż czerwony	Gramineae	Oryza glaberrima
Ryż Tuscarora (zizania wodna)	Gramineae	Zizania aquatica

186 091 cd. tabeli

1	2	3
Ryż zachodnio afrykański	Gramineae	Oryza glaberrima
Jęczmień	Pooideae	Hordeum vulgare
Jęczmień abisyński, pośredni, też nieregularny	Pooideae	Hordeum irregulare
Jęczmień, odm. „ancestral tworrow”	Pooideae	Hordeum spontaneum
Jęczmień, odm. „beardless”	Pooideae	Hordeum trifurcatum
Jęczmień egispski	Pooideae	Hordeum trifurcatum
Jęczmień czterorzędowy	Pooideae	Hordeum vulgare polystichon
Jęczmień sześciorzędowy	Pooideae	Hordeum vulgare hexastichon
Jęczmień dwurzędowy	Pooideae	Hordeum distichon
Bawełna, odm. „Abroma”	Dicotyledoneae	Abroma augusta
Bawełna zwyczajna, amerykańska	Malvaceae	Gossypium hirsutum
Bawełna afrykańska	Malvaceae	Gossypium arboreum
Bawełna egipska, odm. Brazylijska	Malvaceae	Gossypium barbadense brasiliense
Bawełna indyjska	Malvaceae	Gossypium herbaceum
Bawełna egipska	Malvaceae	Gossypium barbadense
Bawełna zwyczajna, odm. meksykańska	Malvaceae	Gossypium hirsutum
Soja	Leguminosae	Glycine max
Burak cukrowy	Chenopodiaceae	Beta vulgaris altissima
Trzcina cukrowa		Arenga pinnata ,
Pomidor	Solaneaceae	Lycopersicon esculentum
Pomidor, odm. „cherry” (wiśniowa)	Solaneaceae	Lycopersicon esculentum cerasiforme
Pomidor zwyczajny	Solaneaceae	Lycopersicon esculentum commune
Pomidor, odm. „currant” (porzeczkolistna)	Solaneaceae	Lycopersicon pimpinellifolium
Miechunka	Solaneaceae	Physalis ixocarpa
Psianka	Solaneaceae	Solanum incanum
Pomidor, odm. „pear (gruszkowata	Solaneaceae	Lycopersicon esculentum pyriforme
Pomidor drzewiasty	Solaneaceae	Cyphomandra betacea
Ziemniak	Solanaceae	Solanum tuberosum
Wilec ziemniaczany (patat, batat)	Convolvulaceae	Ipomea batatas
Żyto zwyczajne	Pooideae	Secale cereale

186 091 cd. tabeli

1	2	3
Żyto górskie	Pooideae	Secale montanum
Papryka, odm. „beli”	Solanaceae	Capsicum annuum grossum
Papryka odm. Cayenne	Solanaceae	Capsicum annuum minimum
Paryka „bonnet”	Solanaceae	Capsicum sinense
Papryka słodka	Solanaceae	Capsicum annuum grossum
Papryka odm. „cherry”	Solanaceae	Capsicum annuum cerasiforme
Papryka strączkowa	Solanaceae	Capsicum annuum fasciculatum
Papryka odm. Stożkowata („cone”)	Solanaceae	Capsicum annuum conoides
Papryka odm. „goat”, „spur”)	Solanaceae	Capsicum frutescens
Papryka odm. długa	Solanaceae	Capsicum frutescens longum
Papryka ozdobna	Solanaceae	Capsicum annuum abbreviatum
Papryka Tabasco	Solanaceae	Capsicum annuum conoides
Sałata siewna	Compositae	Lattuca sativa
Sałata szparagowa	Compositae	Lattuca sativa asparagina
Sałata błękitna	Compositae	Lactuca perennis
Sałata błękitna	Compositae	Lactuca pulchella
Sałata głowiasta	Compositae	Lattuca sativa capitata
Sałata długolistna	Compositae	Lattuca sativa longifolia
Sałata kędzierzawa	Compositae	Lattuca sativa crispa
Seler	Umbelliferae	Apium graveolens dulce
Seler odm. liściasta	Umbelliferae	Apium graveolens dulce
Seler. odm. korzeniowa	Umbelliferae	Apium graveolens rapaceum
Psianka podłużna (bakłażan, oberżyna)	Solanaceae	Solanum melongena
Sorgo, wszystkie gatunki uprawne		Sorghum
Lucerna	Leguminosae	Medicago sativum
Marchew	Umbelliferae	Daucm carota sativa
Fasola zwykła tyczkowa	Leguminoseae	Phaseolus vulgaris vulgaris
Fasola złota	Leguminoseae	Phaseolm aureus
Kanawalia mieczokształtna	Leguminoseae	Canavalia ensiformis
Bób	Leguminoseae	Vicia faba
Fasola zwykła	Leguminoseae	Phaseolus vulgaris vulgaris
Wspięga pospolita (fasolnik egipski)	Leguminoseae	Dolichos lablab
	Leguminoseae	Vigna sesquipedalis

186 091 cd. tabeli

1	2	3
Łust głąbigroszek	Leguminoseae	Psophocarpus tetragonolobus
Owies zwyczajny		Avena sativa
Owies szorstki		Avena strigosa
Groch zwyczajny	Leguminoseae	Pisum sativum sativum
	Leguminoseae	Figna sinensis
Groch zwyczajny	Leguminoseae	Pisum sativum axiphium
Groch, szary	Leguminoseae	Pisum sativum speciosum
Głąbigroszek szkarłatny	Leguminoseae	Tetragonolobus purpureus
Groch odm. pomarszczona	Leguminoseae	Pisum sativum medullare
Słonecznik	Compositae	Helianthus annuus
Dynia olbrzymia	Dicotyledonae	Cucurbita maxima
Dynia zwyczajna	Dicotyledonae	Cucurbita pepo melopepo
Dynia „turban”	Dicotyledoneae	Cucurbita pepo turbaniformis
Ogórek	Dicotyledoneae	Cucumis sativus
Przepękia ogórkowata	Dicotyledoneae	Momordica charanda
Ogórek dziki	Dicotyledoneae	Ecballium elaterium
Ogórek antylski	Dicotyledoneae	Cucumis anguria
Topola balsamiczna, kalifornijska		Populus trichocarpa
Topola czarna		Populus nigra
Topola szara		Populus cansescsens
Topola włoska		Populus italica
Topola biała		Populus alba
Topola balsamiczna		Populus trichocarpa
Tytoń	Solaneaceae	Nicotiana
Rzodkiewnik	Cruciferae	Arabidopsis thaliana
Życica (rajgras)		Lolium
Mietlica		Agrostis
	Inne rodziny traw
Koniczyna	Leguminoseae

Ekspresja wariantów polipeptydów AHAS w roślinach transgenicznych nadaje wysoki stopień oporności na herbicydy obejmujące, lecz nie ograniczane przez, herbicydy imidazoli186 091 popowe takie, jak na przykład imazet^apyr (PURSUIT®), co pozwala na użycie tych herbicydów podczas uprawy tych roślin trapsyepiczpycl.

Sposoby wprowadzania obcych genów do roślin są znane w technice. Nieograniczające przykłady takich sposobów obejmują: infekcje Agrobacterium, bombardowanie cząstkami, traktowanie protoplastów glikolem polietylenowym (PEG), elektroporację protoplastów, mikroipjekcję, makropinjekcję, ipjekcję pędów rozłogowych, szlak łagiewki pyłkowej, namaczanie suchych nasion, perforacje laserem i elektroforezę. Sposoby te opisane są na przykład w: B Jenes i wsp., oraz S.W. Ritchie i wsp., w Transgenic Plants, tom 1, Engineering and Utilization pod red. S.-D. Kung, R. Wu, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich 1993; i L. Mannonen i wsp., Critical Reviews in Biotechnology, 14:287-310, 1994).

W korzystnym wykonaniu, DNA kodujący wariant AHAS jest wklonowapy w wektor DNA zawierający gep markera oporności na antybiotyk, a zrekombipowapy, zawierający DNA AHAS plazmid jest wprowadzany do Agrobacterium tumefaciens zawierającego plazmid Ti. Ten system wektora binarnego jest opisany w, na przykład, patencie USA pr 4,490,838 oraz w Ap i wsp., Plant Mol. Biol. Manual A3:1-19 (1988). Strapsformowany Agrobacterium jest następnie hodowany razem z dyskami liściowymi pochodzącymi z rośliny biorcy, co pozwala na infekcje i transformację komórek roślinnych. Stransformowape komórki roślinne są następnie hodowane w pożywce regeneracyjnej, sprzyjającej rozwojowi kiełków, najpierw w obecności odpowiedniego antybiotyku w celu selekcji otrapoformowapych komórek, następnie w obecności herbicydu. W komórkach roślinnych stransformowapych z sukcesem DNA kodującym oporną na herbicyd AHAS, rozwój kiełków zachodzi nawet przy obecności dawek herbicydu, które hamują tworzenie się kiełków z niestransformowanych komórek. Po potwierdzeniu obecności DNA wariantu AHAS przy użyciu, na przykład, analizy przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), stransformowape rośliny testowane są pod kątem zdolności przetrwania rozpylania herbicydów oraz możliwości kiełkowania nasion, zawiązywania się i wzrostu korzenia w obecności herbicydu.

Inne zastosowania

Sposoby i kompozycje przedstawionego wynalazku mogą być zastosowane do opartego pa strukturze racjonalnego projektowania opornych na herbicydy wariantów AHAS, które mogą być włączone do roślin w celu padania roślinom wybiórczej oporności. Pośrednie warianty AHAS (na przykład, warianty wykazujące suboptymalną aktywność właściwą lecz wysoką oporność i wybiórczość, lub przeciwnie) są przydatne jako wzorce do projektowania wariantów AHAS drugiej generacji zachowujących odpowiednią aktywność właściwą oraz wysoką oporność i wybiórczość.

Geny opornych na herbicydy AHAS mogą być gtrapsformowape do roślin uprawnych w jednej lub wielu kopiach w celu nadania oporności na herbicydy. Inżynieria. genetyczna gatunków uprawnych o obniżonej wrażliwości na herbicydy może:

1) Zwiększyć spektrum i elastyczność stosowania specyficznych herbicydów oraz herbicydów niegroźnych dla środowiska takich, jak herbicydy imidazolipopowe;

2) Zwiększyć wartość handlową tych herbicydów;

3) Zmniejszyć zagrożenie chwastami w uprawach poprzez efektywne zastosowanie herbicydów wobec opornych na herbicydy gatunków uprawnych i zwiększyć odpowiednio plony;

4) Zwiększyć sprzedaż nasion opornych na herbicydy roślin;

5) Zwiększyć oporność na zniszczenia upraw wywołane zanieczyszczeniem herbicydami pozostałymi po zastosowaniu w poprzednich uprawach;

6) Zmniejszyć prawdopodobieństwo zmian właściwości herbicydów wywołanych niesprzyjającymi warunkami klimatycznymi; oraz

7) Zwiększyć tolerancję na nierównomiernie lub niewłaściwie zastosowane herbicydy.

Na przykład, trapsyepicype rośliny zawierające wariant AHAS mogą być uprawiane.

Uprawa może być traktowana wydajna w zwalczaniu chwastów ilością herbicydu, na którą rośliny trapsyepicype wariantem AHAS są oporne, co da w efekcie zwalczenie chwastów w uprawie bez szkody dla rośliny uprawianej.

186 091

Opisane powyżej wektory DNA, kodujące oporne na herbicydy warianty AHAS mogą być dalej zastosowane w taki sposób, że ekspresja wariantu AHAS dostarcza markera selekcyjnego na transformację komórek wektorem. Zamierzone komórki biorcy mogą znajdować się w hodowli lub in situ, zaś geny wariantów AHAS mogą być stosowane same, lub w' kombinacji z innymi markerami selekcyjnymi. Jedynym wymaganiem jest to, aby komórka biorcy była wrażliwa na cytotoksyczne działanie danego herbicydu. To wykonanie wykorzystuje względnie niski koszt i brak toksyczności, na przykład, herbicydów opartych na imidazolinonie, i może być zastosowane we wszystkich systemach wymagających transformacji przez DNA.

Przykłady w odniesieniu do korzystnych wykonań

Następujące przykłady zamieszczono jako ilustrację przedstawionego wynalazku w sposób nieograniczający.

Przykład 1: Projektowanie opornych na herbicydy wariantów AHAS

Pozycje aminokwasowe zlokalizowane w pobliżu proponowanego miejsca wiązania herbicydu w modelu opisanym szczegółowo powyżej zostały wybrane do mutagenezy w celu zaprojektowania aktywnego polipeptydu AHAS o obniżonej zdolności wiązania herbicydu. Każde miejsce na powierzchni kieszeni zostało przeanalizowane pod kątem możliwych oddziaływań z innymi aminokwasami w kieszeni, a także z kofaktorami i herbicydami. Na przykład, wstawienie dodatnio naładowanego aminokwasu(-ów), w myśl oczekiwań będzie wpływało na rozkład ładunku w miejscu wiązania, dając w efekcie utratę powinowactwa wiązania ujemnie naładowanego herbicydu.

Trzy pozycje zidentyfikowano jako najprzydatniejsze cele mutagenezy:

1) F135, jak sądzono, oddziaływuje zarówno z pierścieniem izoalloksazynowym FAD, jak i z grupą aromatyczną herbicydów. Zgodnie ze strategią wprowadzania bardziej naładowanych aminokwasów do kieszeni wiążącej, aminokwas ten zmieniono na argininę.

2) M53 styka się z helisą 498-507. Helisa ta zawiera znane miejsca mutacji oporności na herbicydy, uczestniczy też w wiązaniu TPP. Ponadto sądzono, że podstawienie kwasu glutaminowego w pozycji 53 faworyzuje oddziaływanie z K185, zmniejszając powinowactwo K185 do grupy karboksylowej imazethapyru.

3) R128 zlokalizowany jest w pobliżu wejścia do kieszeni, gdzie, jak się sądzi, uczestniczy jest we wstępnym transporcie naładowanych herbicydów do kieszeni wiążącej. Aminokwas ten zmieniono na alaninę w celu usunięcia zarówno jego ładunku, jak i długiego hydrofobowego łańcucha bocznego.

Przykład 2: Mutageneza ukierunkowana AHAS w celu uzyskania wariantów opornych na herbicydy

Gen AHAS Arabidopsis został podłączony w fazie do 3' końca obszaru kodującego genu transferazy S-glutationu w wektorze pGEX-2T (Pharmacia). Konstrukcja wektora w ten sposób pozostawiła sześcioaminokwasową sekwencję rozpoznawaną przez trombinę na styku eksprymowanej fuzji białek transferazy S-glutationowej (GST) i AHAS. Trawienie eksprymowanej fuzji białkowej trombinądaje w efekcie białko AHAS, którego N-końcowa pozycja początkowa przypada na koniec peptydu sygnałowego w przypuszczalnym miejscu obróbki peptydu sygnałowego, gdzie resztkowa N-końcowa glicyna pochodzi z miejsca rozpoznawanego przez trombinę. Ostateczny N-koniec przeciętego białka AHAS składa się z Gly-SerSer-Ile-Ser. Do genu AHAS w tym wektorze wprowadzono mutacje ukierunkowane.

Mutacje ukierunkowane skonstruowano według sposobu wykorzystującego PGR Higuchi (Recombinant PCR w: MA Innis i wsp., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, str. 177-183, 1990). Namnożono dwa produkty pCr, z których każdy nakładał się na miejsce mutacji. Startery w obszarze nakładania się zawierały mutację. Nakładające się namnożone PCR fragmenty połączono, zdenaturowano i pozwolono na renaturacje, prowadzącą do powstania dwóch możliwych heterodupleksowych produktów o wciętych końcach 3'. Wcięte końce 3' wydłużono przy użyciu polimerazy DNA Tag, co wytworzyło fragment będący sumą nakładających się produktów PCR zawierających planowaną mutacje. Następująca potem reamplifikacja tego fragmentu przy użyciu jedynie dwóch „zewnętrznych” starterów dała w efekcie wzrost zawartości produktu o pełnej długości. Pro186 091

Oukt zawierający mutacje został następnie ponownie wprowadzony do genu AHAS Arabidopsis w wektorze pGEX2-T.

Przykład 3: Ekspresja i oczyszczanie wariantów AHAS

A. Sposoby

Komórki E. coli (DH5a) strnosformowaoe wektorem PGEX-2T zawierającym Oziki gen AHAS kukurydzy (oznaczenie wektora pAC751), mutanta Arabidopsis Ser653Asn lub mutanta Arabidopsis Ile401Phe hodowano przez noc w pożywce płynnej LB zawierającej 50pg/ml ampicyliny. Całonocna hodowla E. coli była rozcieńczana 1:10 w 1 1 LB, 50pg/ml ampicyliny oraz 0,1% obj . substancji aotifoam A. Hodowle inkubowano w 37 °C z wytrząsnoiom aż Oo uzyskania OD₆₀₀ wynoszącego około 0,8. Ipporopylktiogalnktopę (IPTG) dodano Oo końcowego stężenia 1mM i inkubownoo hodowlę przez kolejne 3 godziny.

Komórki zebrano przez wirownoie przy 8,670 xg przez 10 minut w rotorze JA10 i zawieszkoo w 1/100 wyjściowej objętości hodowli MTPBS (16 mM Na₂HPO₄, 4 nMh NHtyPO, , 150 mM NaCl, pH 7,3). Dodano Triton X-100 i lizozym do końcowego stężenia odpowiednio 1% obj. i 100 μg/ml, schłodzono w lodzie do 4°C i zEzowano przez sonikację przez 10 przy regulacji mocy w pozycji 7 sekund w sooikatorpe Braoson Sooifier Cell Disrupter wyposażonym w mikrosoodę. Wolny od komórek ekstrakt wirowano przy 35000 xg przez 10 min. w 4°C. Nadsącz pOekaotownoo i powtórzono etap wirowania.

Oczyszczanie eksprymowaoych białek fuzyjoych przeprowadzono według modyfikacji sposobu Smitha i Johnsona (Gene 67:31-40, 1988). Nadsącz ogrzano Oo temperatury pokojowej i przepuszczono przez 2 ml kolumnę z kulkami agnropowo-glutationowymi (wiązanie siarkowe, Sigma) zrównoważoną MTpBs. Kolumnę przepłukiwano następnie MTPBS w temperaturze pokojowej aż Oo osiągnięcia A₂₈0 eluatu odpowiadającego A₂₈0 MTPBS. Białko fuzyjoe wyeluowano następnie przy użyciu roztworu zawierającego 5 mM zredukowany glutation w 50 mM Tris HC1, pH 8,0. Wyeluownor białko fuzyjne traktowano oastępoie około 30 jednostkami NIH trombioy i dializowano wobec 50 mM cytrynianu pH 6,5 i 150 mM NaCl.

Białko fuzyjne trawiono przez ooc w temperaturze pokojowej. Strawione próbki dializowano wobec MTPBS i przepuszczono dwukrotnie przez kolumnę glutatiooowo-agnrozową zrównoważoną MTPBS w celu usunięcia uwolnionego białka trnosforapy glutatiooowej. Frakcje białkową nie wiążącą się z kolumną zebrano i zagęszczono przez ultraflltrację na filtrze YM10 (Amicon). Zatężoną próbkę załadowano oa kolumnę do filtrowania molekularnego 1,5x95 cm zawierającą Sephacryl S-100 zrównoważony w buforze do filtrowania molekularnego (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,0). Zbierano 2 ml frakcje przy tempie przepływu 0,14 ml/mio. Stabilność enzymu zbaOaoo przechowując enzym w 4°C w buforze do filtrowania molekularnego z dodatkiem 0,02% azydku sodu i w obecności lub nieobecności 2mM pirofosforaou tiamioy i 100 gM Oioukleotydu flawieo-adeoioowogo (FAD).

B. Wyniki

E. coli transformowana plazmidem pAC751 zawierającym dziki gen AHAS podłączonym w fazie za genem GST eksprymowała po indukcji IPTG białko o masie 91 kD. Masa białka 91 kD odpowiadała przewidywanej masie cząsteczkowej fuzji GST/AHAS (suma odpowiednio 26 kD i 65 kD) . GOy woloy od komórek ekstrakt z DH5a/pAC751 przepuszczono przez kolumnę z żelem powinowactwa glutntion-agaropα, przepłukano i wyeluownoo wolnym glutatiooem, uzyskano wzbogacony w białko 91 kD preparat (figura 6, ścieżka C). Szościonminokwasowe miejsce rozpoznawane przez trombioe wprowadzone w miejsce połączenia GST z AHAS było skutecznie trawione przez trombine (figura 6, ścieżka D). Strawiony preparat białka fuzyjoego zawierał zgodnie z oczekiwaniami 26 kD białko GST oraz 65 kD białko AHAS kukurydzy. AHAS kukurydzy oczyszczono Oo homogrooości poprzez kolejny pasaż przez kolumnę agarozowo glutationową w celu usunięcia metoda powinowactwa GST, a oastępoie poOdaoo końcowemu etapowi oczyszczania filtrownoiom molekularnym oa Sephacrylu S-100 w celu usunięcia trombioy (figura 6, ścieżka E). Białko o masie 65 kD jest rozpoznawane w hybrydyzacji typu western przez przeciwciało moooklooaloe podniesione przeciwko prptyOowi AHAS kukurydzy.

Oczyszczona dzika AHAS kukurydzy została przebadana metodą spektroskopii masowej z desorpcją polem, wyznaczona masa cząsteczkowa wynosi 64996 Oaltonów (dane nie pokazane).

186 091

Przewidywana masa, obliczona na podstawie sekwencji aminokwasowej genu wstawionego do wektora pGEX-2T wynosi 65058. Różnica 0,096% pomiędzy wyznaczoną empirycznie a przewidywaną masą mieści się w zakresie błędu spektrometru masowego. Bliskość obu wyznaczonych mas sugeruje, że nie nastąpiło żadne błędne wprowadzenie nukleotydów podczas konstrukcji wektora ekspresyjnego, ani też nie zaszły żadne modyfikacje posltranslacyjne białka, które mogłyby spowodować znaczące zmiany masy cząsteczkowej. Ponadto, brak fałszywych maksimów w widmie preparatu enzymu wskazywał na to, że próbka jest wolna od zanieczyszczeń.

Przykład 4: Właściwości enzymatyczne wariantów AHAS

Właściwości enzymatyczne dzikiej i wariantów AHAS wytwarzanych w E. coli zmierzono przy użyciu zmodyfikowanego sposobu Singha i wsp. (Anal. Biochem 171:173-179, 1988) następująco:

Mieszaninę reakcyjną, zawierającą IX bufor do oznaczeń AHAS (50 mM HEPES pH 7,0, 100 mM pirogronian 10 mM MgCl₂, 1 mM pirofosforanu tiaminy (TPP) oraz 50 pM dinukleotydu flawino-adeninowego (FAD)) otrzymano albo przez rozcieńczenie enzymu w 2X buforze do oznaczeń AHAS, albo przez dodanie stężonego enzymu do 1 X buforu do oznaczeń AHAS. Wszystkie oznaczenia, w których dodawano imazethapyru wraz z odpowiednimi kontrolami zawierały DMSO w końcowym stężeniu 5⁽% ze względu na to, że imazethapyr dodawano do mieszanin w postaci 50% roztworu w DMSO. Oznaczenia przeprowadzano w końcowej objętości 250 pl w 37 °C w płytkach mikrotitracyjnych. Reakcje prowadzono przez 60 minut, po czym mierzono akumulację acetomleczanu kolorymetrycznie według Singha i wsp. Anal. Biochem 171:173-179, 1988.

AHAS kukurydzy, wyeksprymowana i oczyszczona z pACT751 według przykładu 3 powyżej, jest aktywna w przekształcaniu pirogronianu do acetomleczanu. Pełna aktywność AHAS zależy od obecności kofaktorów fAd i TPP w środowisku reakcji. Nie stwierdzono żadnej aktywności, gdy do środowiska reakcji w dodano jedynie FAD. Aktywność oczyszczonego enzymu w obecności samego TPP lub przy braku obu kofaktorów wynosi poniżej 1% aktywności obserwowanej w obecności zarówno TPP, jak i FAD. Normalnie AHAS zawarta w surowych ekstraktach roślinnych jest bardzo niestabilna, zwłaszcza w nieobecności substratu i kofaktorów. W przeciwieństwie do niej, oczyszczona z bakteryjnych systemów ekspresyjnych AHAS nie wykazywała utraty aktywności katalitycznej po przechowywaniu przez 1 miesiąc w 4°C w 50 mM HEPES pH 7,0, 150 mM NaCl, 0,02%NaN₃, przy obecności bądź nieobecności FAD i TPP. Ponadto, nie dało się zauważyć żadnych produktów degradacji w tych przechowywanych preparatach po rozdzieleniu w żelach SDS-PAGE.

Aktywności właściwe dzikiej AHAS oraz wariantów M124E, R199A i F260R przedstawiono w tabeli 2 poniżej. Na podstawie porównania sekwencji na figurze 5, mutacja M124E AHAS Arabidopsis odpowiada mutacji M53E kukurydzy, mutacja R199A u Arabidopsis odpowiada mutacji R128A kukurydzy, zaś mutacja F206R Arabidopsis odpowiada mutacji F135R kukurydzy. Mutacje wyznaczone na podstawie modelu strukturalnego AHAS kukurydzy zostały zastosowane do zidentyfikowania równoważnych aminokwasów w genie AHAS rośliny dwuliściennej - Arabidopsis, oraz zostały włączone i przetestowane w genie AHAS Arabidopsis. Takie przełożenie i włączenie racjonalnie zaprojektowanych mutacji oporności na herbicydy do genu AHAS rośliny dwuliściennej Arabidopsis - może ułatwić badanie oporności na herbicydy u roślin dwuliściennych.

Tabela 2

Aktywność właściwa

	Aktywność właściwa	% aktywności katalitycznej w porównaniu z dzikim
dziki	99,8	100
Metl24Glu	9,15	9,16
Arg 199Ala	86,3	86,5
Phe206Arg	5,07	5,1

186 091

Mutant R199A zachowuje wysoką aktywność katalityczną (tabela 2), przy czym wykazuje znaczący stopień oporności na imazethapyr (figura 7). Co ważne, wariant ten zachowuje całkowitą wrażliwość na sulfnnylomnczpiki (figura 8). A zatem, wariant ten spełnia kryteria wysokiej aktywności katalitycznej i wybiórczej oporności na herbicydy. W przeciwieństwie do niego, podstawienie M124E daje nieomal całkowitą oporność na imazethapyr (figura 7) lecz także wykazuje poważnie obniżoną aktywność katalityczną (tabela 2). W porównaniu z opornością na imidaznlipony, wariant ten wykazuje wyższą wrażliwość na sulfonylomocznik (figura 8), co sugeruje, że pozycja ta jest dobrym kandydatem do stworzenia mutacji nadającej wybiórczą oporność. Podstawienie aminokwasem innym niż kwas glutaminowy może pomóc w utrzymaniu aktywności katalitycznej. Podstawienie F206R dało podobne wyniki, jak obserwowane dla wariantu M124E, pozbawione było jednak wybiórczości oporności.

Przykład 5: Iteracyjne ulepszanie opornego na herbicydy wariantu AHAS przy zastosowaniu strategii racjonalnego projektowania

Zmiana w pozycji 124 AHAS z Met na Glu, jak opisano to powyżej w przykładzie 4, nadawała oporność na imidnznlipop, lecz również redukowała aktywność katalityczną do 9,2% wartości dzikiej. Model struktury AHAS kukurydzy opisany powyżej sugeruje, że Met53 (równoważnik pozycji Met 124 Arabidopsis) oddziaływaje z serią aminokwasów hydrofnjnwych na jednej stronie α-helisy pochodzącej z innej podjednostki, lecz znajdującej się blisko Met53. A zatem, oddziaływanie hydrofobowe pomiędzy Met53 a aminokwasami w helisie może stabilizować zarówno asocjację podjednostek, jak i konformację centrum aktywnego. Przypuszczano, że podstawienie hydrofobowego aminokwasu Met naładowanym glutaminianem najprawdopodobniej destabilizuje międzypodjednostkowe oddziaływanie hydrofobowe powodując utratę aktywności katalitycznej.

Na podstawie tej analizy struaturalno-fUpkcJnpnlneJ, aktywność oryginalnego, zmutowanego Metl24Glu enzymu Arabidopsis (co odpowiada Met53Glu kukurydzy) została iteracyJpie ulepszona przez podstawienie bardziej hydrofobowego aminokwasu (Ile) w tej pozycji. Hydrofobowy charakter łańcucha bocznego Ile przywrócił aktywność do dzikiego poziomu (aktywność właściwa 102, odpowiadająca 102% aktywności dzikiego enzymu), jednakże większe rozmiary łańcucha bocznego Ile wciąż wystarczały do utrzymania znaczącego poziomu oporności na imidazolinon (figura 9).

Dla porównania, podstawienie w tej pozycji Wstydymy daje w rezultacie wariant AHAS wykazujący aktywność właściwą 42,5, odpowiadającą 42,6% aktywności dzikiej. Mutant ten wykazuje jednak wysoki stopień oporności na PURSUIT® (figura 10).

Przykład 6: Iteracyjne ulepszanie opornego na herbicydy wariantu AHAS przy zastosowaniu strategii racjonalnego projektowania

Inny przykład iteracyjnego ulepszania przy użyciu sposobów przedstawionego wynalazku dotyczy wariantu Arg 128Ala. Model strukturalny AHAS kukurydzy sugeruje, że aminokwas Argl28, znajdujący się na krawędzi kieszeni wiążącej herbicyd, uczestniczy w kierowaniu naładowanych substratów i herbicydów do kieszeni wiążącej herbicydy i do centrum aktywnego. Aminokwas Argl28 jest odległy od reszty TPP, która wiąże wstępną cząsteczkę pirogronianu w mechanizmie reakcji AHAS, co wyjaśnia dlaczego podstawienie Arg 199 AHAS Arabidopsis (odpowiadającej Arg 128 kukurydzy) alaniną ma niewielki wpływ na aktywność katalityczną enzymu. Model strukturalny wskazywał ponadto, że można w tej pozycji dokonać bardziej radykalnej zmiany w celu zwiększenia poziomu oporności przy utrzymaniu wysokiej aktywności katalitycznej. Na tej podstawie dokonano iteracyjnego ulepszenia mutacji przez podstawienie dodatnio naładowanej arg^niny ujemnie naładowanym glutaminianem. Tak zmutowany enzym wykazuje lepszy poziom oporności na PURSUIT® utrzymując przy tym wysoki poziom aktywności (aktywność właściwa 114, odpowiadająca 114% aktywności dzikiej) (figura 11).

Przykład 7: Wymieppnść AHAS pochodzących z różnych gatunków w opartym na strukturze racjonalnym projektowaniu opornych na herbicydy wariantów AHAS

Model strukturalny trójwymiarowej struktury AHAS jest budowany w, oparciu o sekwencję AHAS rośliny Jednnliściepnej, takiej, jak opisana powyżej sekwencja kukurydzy. W celu wprowadzenia mutacji do AHAS pochodzącej z rośliny dwuliściennej takiej, jak Ara30

186 091 bidopsis, sekwencje AHAS pochodzące z roślin jercoliŚLiecnach i dwuliściennych zostały przyrównane przy użyciu programów GAP i PILEUP (Genetics Computer Group, 575 Sequence Drive, Madison, WI 53711). Równoważne pozycje ustalane są na podstawie komputerowych porównań sekwencji. Następnie wprowadza się mutacje do genu AHAS rośliny dwuliściennej w sposób opisany powyżej. Po w^eksprymowaciu zirytowanego białka AHAS w E. coli i oznaczeniu jego właściwości biochemicznych (tzn. aktywności właściwej i oporności na herbicydy), zmutowany gen wprowadza się do rośliny dwuliściennej sposobami tgocsformoLji roślin opisocymi powyżej.

Przykład 8: Watwarzocig opornych na herbicydy roślin przez transformację racjonalnie zaprojektowanymi genami AHAS

Konstrukcje DNA

Racjonalnie zaprojektowane worionty genów AHAS zawarte w wektorach ekspresyjnych E. coli zostały użyte jako źródło fragmentów restrykcyjnych DNA w celu zastąpienia odpowiadających im fragmentów restrykcyjnych w genie AHAS Arabidopsis. Gen ten obecny jest w postaci fragmentu genomowego DNA o długości 5,5 kb, zawierającego również promotor AHAS z Arabidopsis, terminator AHAS z Arabidopsis oraz sekwencje DNA otaczające od strony 5' i 3'. Po zsgkwgncjonowoniu okolic miejsc mutacji w celu potwierdzenia obecności właściwej mutacji, cały fragment 5,5 kb z każdego z plazmidów wstawiono w wektor do transformacji roślin oparta na pBIN (Mogen, Leiden, Holandia). Wektor do transformacji roślin zawiera również gen oporności na konomycane kodujący fosfotronsferoyę neomycyny II (cptll) pod kontrolą promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora. Ostateczna konstrukcja wektora przedstawiona jest na figurze 12. Wektory zawierające geny AHAS Arabidopsis z mutacjami Metl^^Ile, Metl24His oraz Argl99Glu (odpowiadające mutacjom Met53Ilg, Met53His i Argl28Glu w sekwencji AHAS kukurydzy przedstawionej na figurze 1) oznaczono odpowiednio pJK002, pJK003 i pJK004. Każdym z tych wektorów stracsformow™ następnie Agrobacterium tumefaciens szczepu LBA4404 (R&D Life Technologies, Gaithesburg, Md) wykorzystując sposób transformacji opisany przez An i wsp., Plant Mol. Biol.. Manual A3:1-19 (1988) Plant Transformation. Transformacje dysków liściowych Nicotiana tabacum odmioca Wisconsin 38 przeprowadzono według opisu w Horsch i wsp. (Science, 277:1229-1231, 1985) z drobnymi modyfikacjami. Dyski liściowe wycięto z roślin hodowanych w jałowych warunkach i współhorowono w pozycji odwróconej w pożywce Murashige Skoog (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) przez 2-3 dni w 25 °C w ciemności wraz ze szczepami Agrobacterium tumefaciens zawierającymi plazmidy pJK002, pJK003 lub pJK004. Dyski wysuszono na bibule i przeniesiono na pożywkę regeneracyjną Murashige Skoog uzupełnioną witaminami B5 oraz zawierającą 1 mg/l benyyloademna oraz 0,1 mg/l kwasu 1-naftal()OLtowego, 100 mg/l kαnomycana oraz 500 mg/l cefotaksymu (wszystkie uzyskane z firmy Sigma).

Wstępnie transformaty selekcjonowano na podstawie oporności na kanamycynę nadawanej przez gen nptII obecny w wektorze do transformacji. Kiełki uzyskane z dysków liściowych były wycinane i umigszczoce na świeżej, wolnej od hormonów pożywce Murashige Skoog zawierającej Lefotoksym i kαnomycynę.

Oporność na herbicydy in vivo

Oporne na kαnomaLynę kiełki tytoniu przeniesiono co pożywkę zawierającą 0,25 pM imαygthoparu. Przy tym stężeniu herbicydu imidazolicocowggo niestrocsformowoce kiełki tytoniu (zawierające endogenną, dziką AHAS) cie były w stanie rozpocząć zawiązywania się korzenia. W przeciwieństwie do nich, zawiązywanie korzeni i wzrost zaobserwowano u kiełków tytoniu stronsformowocyćh każdym ze zmutowanych genów AHAS. Korzenie rozwinięte przez kiełki stracsformowace zmutowanymi genami Mgtl24Ilg i Argl99Glu wraz z dzikim przedstawiono na figurze 1. Ponadto, rośliny strAcsformowace zmutowanymi genami Metl24Ile lub Argl99Glu były oporne ca spryskiwanie dwukrotną dawką połową (100 g/ha) imazethapyru (figura 13). Obraz wzrostu korzeni u roślin stransformowocyćh w porówcaciu z ciestgocsformowocami, podobnie jak zachowanie po spryskaniu herbicydami sugerują że ekspresja racjonalnie zaprojektowanych genów oporności na herbicydy nadaje oporność ca herbicydy in vivo.

186 091

Wykrywanie racjonalnie zaprojektowanych genów u opornego na herbicydy tytoniu

Wyizolowano DNA genomowy z roślin tytoniu stransformowanych AHAS i sprawdzono obecność wariantów genów AHAS Arabidopsis przez analizę PCR. Różnice miedzy sekwencjami nukleotydowymi genu AHAS Arabidopsis i dwóch genów AHAS tytoniu wykorzystano dla zaprojektowania starterów PCR zdolnych do namnażania jedynie genu Arabidopsis na tle DNA genomowego tytoniu. Wykryto obecność racjonalnie zaprojektowanych genów oporności na herbicydy, jak wykazało to namnożenie fragmentu DNA o odpowiedniej wielkości w większości opornych na herbicydy roślin. Nie stwierdzono sygnału PCR w nietransformowanych roślinach tytoniu.

Segregacja wtransformowanych genów AHAS

W celu prześledzenia segregacji racjonalnie zaprojektowanych genów AHAS w stransformowanych roślinach, przeprowadzono testy kiełkowania. Nasiona umieszczono na wolnej od hormonów pożywce Murashige-Skoog zawierającej do 2,5 pM PURSUIT® oraz 100 pM kanamycyny. Wyrastające siewki wizualnie oceniono pod kątem oporności lub wrażliwości na herbicyd.

Ponieważ rośliny tytoniu są diploidami, oczekiwałoby się w potomstwie samozapylonych roślin segregacji roślin opornych i wrażliwych w stosunku jak 3:1, co odzwierciedlałoby obecność 1 siewki homozygotycznej względem opornego genu AHAS, 2 siewek heterozygotycznych względem opornego genu AHAs i jednej siewki pozbawionej opornego genu AHAS. Wyniki wskazują, na to, że oporne geny AHAS segregują w oczekiwanym stosunku 3:1, co podtrzymuje konkluzje, że oporność na herbicyd nadawana jest przez pojedynczą, dominującą kopie racjonalnie zaprojektowanego genu AHAS. Wyniki te wskazują na to, że racjonalne projektowanie opornych na herbicydy genów AHAS może być wykorzystane do wytworzenia roślin wykazujących oporny na herbicydy wzrost in vivo.

Przykład 9: Wytworzenie roślin opornych krzyżowo na różne herbicydy przez transformacje racjonalnie zaprojektowanymi genami AHAS

Rośliny tytoniu stransformowane racjonalnie zaprojektowanymi genami AHAS według przykładu 8 powyżej zostały również przebadane pod kątem oporności krzyżowej na inny herbicyd, CL 299,263 (znany również jako imazamoks). Testy kiełkowania przeprowadzono na nasionach zebranych z pierwotnych transformantów zawierających geny wariantów AHAS Arabidopsis Metl.24Ile, Metl24His i Argl99Glu, przy nieobecności lub w obecności 2,5 pM CL 299,263 (figura 15). Takie stężenie herbicydu powoduje poważne karłowacenie i bielenie dzikich roślin tytoniu. Rośliny tytoniu stransformowane genem AHAS Met124His wykazywały najwyższy stopień oporności (figura 15). Transformanty Argl99Glu wykazywały pośredni stopień oporności, podczas gdy Met124Ile wykazywały niewielką oporność (figura 15).

Wszystkie patenty, wnioski, artykuły, publikacje i sposoby badawcze wspomniane powyżej są niniejszym włączone przez referencje.

Osobom biegłym w tej dziedzinie nasunie się w świetle powyższego szczegółowego opisu wiele odmian przedstawionego wynalazku. Takie oczywiste odmiany są w pełni zamierzonego zasięgu dołączonych zastrzeżeń patentowych.

186 091 ‘1 ’ GSAASPAHP*10 *MAPPATPLRP*20 *.WCPTDPRKGA* *60 *TRSPVIANHG‘7O *FRI1EQCEAFA* 00 *ASGYARSSGR* Argl28 Phol3S *120 *AITGQVPRKM* 130 *IGTDAPQETP♦14 O * IVEVTRSITK*

FIG la ♦1Θ0» L.VDI PKDIOP *190* QMAVPVWDK P * 2 0 0 *HSLPQYI ARL* * 2 4 0 * ARSGEELiRRF* 2 5 0 * VELTGIPVTT* 2 6 O » TLMaLGNFPS * * 3 0 0 * GVRFDDRVTG * 310 * KIΕΛ FASRA K * 3 2 O * I VlfVDr DPAE * *36O»SKKSFDFaSW*37O*NDELDQQKRE*30O*FPLaYKTSNE* *42 0*WAAQYYTYKR*43 0*PRQWLSSAGL*4 4 0*GAMGFOLPAA* * 4 0 0 »IRI Eh J L PV KV * 4 9 0 » FV LNN Q11LG M * 5 0 0 » W Q WE D R F Y K *

540 * PAVRVTKKNE*5S0*VRAAXKKMLE*S60 *TPGPYLLDII

186 091

Met53 *DILVESLERC*40 *GVRDVFAYPG* 50 *CASMEIHQAL * VGVCIATSGP*10 0 *GATNLVSALA »110« DALLDSVPMV

150 * I1NYLVL.DVDD* 160*1 PRWQEAFF» 17 0 * LASSGRPCPV

210*PKPPATELLE*220*QVLRLVGESR»230*RPVLYVGCGC

7 0 · DDPLSLRMLG ♦ 2 0 O » M HOTWANYA » 2 9 0 * VDKA DLL LA L

0» IGKNKQPHVS* 3 4 0 »ICADVKLALQ* 3 5 0 ‘GMNALLEGST

390»EIQPQYAIQV*400*LDELTKGEAI*410*IGTaVGQHQM

450*AGASVANPGV»460»TWDIDGDGS*47 0*FLMNVQELAM

510 *ANRAUTYLGN*520*PENESEIYPD*530*FVTIAKGFNI

FIG. Ib

0 * VPIIQEHVLPM*5 0 0 * IPSGGAFKDM* S 90 * ILDGDGRTVY

186 091

FIG. 2α

Ol

__

E->

J

_

>

<

— >

HI

O

J

— j

►J

Ω

>

—

2

>

—

X

O

—

O

>

~

<

—

<

CU

—

CU

o

—-

o

>4

>

—

Ω

_

O

>

—

>

o

X

>4

—

>·

Ω

__

Ω

2

X

X

—

w

—

X

H<

—

<

_—

H4

__

n

Ω

—

Ω

X

—

o

J

—

>

O

__

X

Ol

__

ω

ca

<

—

w

X

X

<

__

Q

Z

s

X

—

_3

>4

—

ω

X

X

__

>

ι—<

__

oi

<

—

5

—

<

ca

—

X

<

Ol

—

<

Ω

—

Ω

X

—

j

<

—

0)

ca

«

«

«

«

*

*

«

*

«

«—4

O

4—4

o

r*

00

r*

CO

4—|

ł—4

4“1

P-

r*

CN

CN

co

co

ιη

ΙΛ

ł—4

4“(

4—4

4—1

CN

CN

CN

CN-

*

*

«

«

<

«

«

*

O

_

σ

>«

—

a.

X

X

<

—

ω

Z

2

O

—

o

J

—

j

HI

—

X

Ω

o

<

__

CU

CU

O

—

<

—

<

Ω

>

- X

n

><

ω

X

——

ca

F

Ω

X

ζ

O

_

<

§

—

>

Ω

—

o

σ

X

04

F

>4

—

Cu

j

——

Ω

w

—

>

ę

U

<

O

J

>

X

-

2

>

—

>

j

—

>

>

X

X

Ω

F

—

P

X

—·

X

&

o

X

s

Ω

X

O

—

d.

X

X

F

X

z

o

>

—

>

O

O

L3

—

H(

>

—

Ω

<

*

*

*

*

«

*

«

«

rd

o

4—4

O

r-

CO

r-

co

r—4

rd

O

o

kO

V0

w

4—4

(->

r*

«α·

rr

r-1

»—4

r-4

4“<

CN

CN

CN

<N

«

«

«

«

«

<

«

«

O

__

σ

X

—

X

F

-—

Ω

<

Ω

01

2

X

__

u

O

O

<

Ω

Ct

ca

o

X

c

X

*c

—

01

<

__

>

>

—

F

J

—

J

ω

—

ca

oi

—

F

2

——

Ω

Ω

—

<

>4

01

j

__

j

O

—

—

J

X

—.

X

<

Ω

>

w

X

—

H

<

—

>

ω

X

X

X

X

_

ca

u

—

υ

F

Ω

X

—

X

>4

Ω

H4

>

>

—

>

>

—

u

—

X

X

Ω

>

—

□

—

p

Z

—

2

Ω

—

Ω

Ω

—

0>

<

——

w

Hi

—

>

>·

—

X

X

—

X

<

—

X

*

«

*

*

«

«

«

*

«

r-4

o

r-

CO

Γ-

co

W

r-4

i“4

o

in

Lfl

o

o

kO

KD

n

n

cn

σι

4—4

rU

CN

CN

CN

CN

«

<

<

a

X

—

X

Ω

__

X

F

—

<

>

X

O

_

<

σ

—

O

<

—

F

O*

Hł

H4

z

<

—

o

F

—

• w

>

——

H(

>4

——

>·

O

o

J

__

X

Ω

—

w

Ω

—

03

O

X

J

w

X

X

—

X

<

X

X

<

o

Z

___

CU

<

—

<

>4

—·

F

2

Ω

X

F

__

Ω

Ω

>4

n

—

>

2

01

>4

J

F

<

—

σ

X

ca

<

2

F

cu

<

—

w

2

>

0)

X

01

—

£_,

O

<

—

<

ω

—

H4

<

—

X

2

£-«

«

«

4—4

O

σι

CD

r~~

CO

n·

r-4

4“·

o

*T

43·

ci

Cl

i_n

urt

<N

<N

CO

co

«Ή

4-4

4—4

»—4

CN

CN

*

«

«

2

<

—

<

Z

—

X

>4

Ω

Ω

>

X

2

' —

X

2

__

F

2

2

X

__

X

X

<

_

<

ω

—

ca

Q

—

>

I-I

w

J

O >

_

ca

a

—--

o

ca

_

X

X

O

CU

—

σ

X

—-

X

<

_

>

J

—

P

F

ω

—

a

F

—

<

w

—

<

F

Ω

<

ca

ω

Ω

—

o

K

—

2

X

ω

CU

X

X

2

——

F

o

O

01

—

>

CU

x

__

X

2

—

O

04

Ο»

Ω

X

>

—

X

2

—

H4

2

Ο»

—

X

*

*

«

«

«

«

«

*

4-4

O

X

Cl

Γ*

co

t-4

r-4

o

m

n

co

co

Ν’

4—4

Γ-

r-

4—4

4—4

r-4

4“ł

CN

CN

*

«

«

«

«

2

O

—-

U

P

2

ω

—

X

X

H4

—

X

F

—

X

X

—-

O·

—

L3

2

>4

—

2

F

—

X

u

—

H4

ca

ω

<

X

—

rf;

a

—

X

Q

Ω

X

ca

CU

n

—

W

X

—

>

>

—

X

o

—

o

oi

X

—

>

O

—

o

X

—

X

<

01

<

Ω

—

X

O

—

P

H4

—

H

X

X

<

X

H4

—

F

O

—

Ω

X

—

<

oi

ω

—

oi

Ω

—-

H4

>

—

>

<

o

□

<

X

<

—

<

—

o

o

*

*

*

«

41

«

«

«

4—4

o

O

O

Γ-

co

4—I

t—4

<N

CO

00

η

m

4—1

vo

v£>

4—4

4—4

4—1

4—4

CN

CN

*

«

<

*

«

«

«

*

*

*

Ό

Ό

Ό

T3

Ό

cu

V

dl

ω

Φ

Li O,

L Ol

Li °1

Li ^1

Li

Ί (fi

J CO

1 CO

Π co

Ί σι

X

<s.

X

<x

X

<

X

<

X

<

θ

X

O

X

o

X

O

X

O

X

CL

<

O-

<x

Q_

<

CL

<x

a.

<

186 091

_Q

CM

O

Ll

*

«

*

*

«

«

«

«

«

<

—

<

Hl

—

X

Z

—

Q

X

X

CA

—

O

X

24

ca

X

2

2

—

CA

i4

Z

_

Q

>

O

~

X

<

X

>

>

x

O

—

t-

H

—.

X

CA

W

Q

—

O

—

>

X

_

£

P

2

Q

2

—

2

2

Oi

ca

—

&

2

—

¢5

X

—

X

X

o

x

—

W

X

—

X

X

—

X

X

—

X

>

—.

i—<

>

__

<

><

—

2

ω

><

X

—

>

<

—.

CA

o

Z

£

>

—

E-

X

—

X

M

—

>

ΪΜ

—

Oi

X

—

>

o

—

X

X

—-

X

«

<C

*

*

«

«

«

«

-n

00

Ch

ST

en

ST

o\

T

CD

sT

n

co

co

en

*3·

tn

o

w

to

Γ-

cn

CO

co

co

sT

^3·

tn

tn

tn

η

*

♦

-tr

«

«

*

«

*

«

*

Q

X

—

X

CA

H

—

<

O<

E-

—

CU

O

—

Oi

<

—-

<

X

X

X

—

X

—

o

X

_

Hl

<

O

Q

2

X

—

X

—

Ł4

X

Hl

__

<

2

—

X

>

CJ

—

Z

O

<

—

<

et

—

X

X

—

HI

x

—

24

ca

P

—

<

Z

Q

HI

<2

—

O

a

X

—

X

E-

X

P

O

X

M

24

—

ω

w

__

X

Q

—

X

E-

X

x

—

ca

Q

—

ca

o

—

o

ω

—

Q

Hł

—

X

<

—

<

ca

—

2

>

—

X

Ο»

—

X

>

—

>

*

«

*

«

·«

«

«

*

«

n

00

ΟΆ

co

en

ST

en

ST

CO

ST

CM

CM

r-

co

p:

ST

en

O

tn

eo

o

CO

co

co

ST

ST

ST

m

tn

n

«

«

«

«

CU

__

CU

X

__

CA

O

_

O

X

2

X

Q

—

Q

CA

E-

2

—

Σ

Q

—

O

a

—.

O

h-4

__

w

<

X

E-

—

<

X

·—

>

HI

~

X

O

_

Q

X

<

—

O

H<

—

>

X

E-

ł-H

>

X

—

O

X

—

X

X

2

>

—

X

O

__

X

x

X

o

o

—

X

——

X

X

—

>

X

X

2

—

<

>-

—

X

X

—

2

X

—

w

2

_

X

CA

_

CA

Of

X

X

X

>

—

24

Z

—

X

Ε-

__

CA

u

o

Ο»

—

X

x

—

<

X

—

X

πί

X

2

—

2

<

—

HI

Q

«

*

«

«

♦

«

«

«

«

«

«

n

CO

en

00

en

ST

en

sT

co

ST

co

T-(

T-t

vo

Γ-

CM

n

CO

en

ST

n

o

n

CO

co

η

sT

ST

ST

ST

tn

n

KO

«

«

«

E-

X

>

X

X

-

2

E-

—

2

Hl

—

<

Q

2

__

CA

2

a

X

-

Oi

X

—

X

<

<

X

X

_

<

<

—

θ'

2

—

X

—

>

—

X

O

tu

—

Cu

3

o

CA

—

X

X

<

—

>

X

<

___

<

2

X

—

X

>

et

——

X

O

ić

W

<

—

X

6-

—

X

M

—

X

X

—

2

X

CA

__

HI

O

—

a

X

—

>S

>

—

>

X

X

X

>

__

24

—

2

X

—

e«

X

—

X

>

_

X

>

ω

__

p

—

*g

X

—

2-

X

—

X

Q

—

E-

<

—.

£

X

—

CA

X

—

X

—-

z

X

—

>

CA

«

*

*

«

*

«

*

«

«

«

«

tn

co

en

CD

en

sT

en

s?

CO

ST

OO

o

o

tn

KO

rM

CM

r-

00

n

ST

en

co

co

co

n

ST

ST

•ST

-T

tn

n

n

*

*

«

«

«

«

«

«

*

Cu

_

>

O

X

σ

>S

—

X

X

—

X

X

X

X

X

2

—

<

—

HI

σ

~

>

X

Q

Q

<

—.

<

>

—

X

X

—

<

OC

a

E-

X

Z

2

a

—

HI

HI

—

X

X

>

Cu

CA

__

CA

X

2

E-

—

2

X

—

HI

Q

2

—

X

ca

—

X

2

—

a

>

—

<

2

2

Oi

2

>

X

—.

X

w

—

X

X

—-

X

—

X

<

P

p

ω

_

CA

Q

O*

Q

—

X

X

—

O

X

>

X

CA

—

E-

O

—

O

a

—

o

X

X

>*

Cu

—

<

>

—

CA

>

—

>

2

—

>

<

—-

<

X

«

«

«

*

«

«

«

«

«

-tt

Γ-

co

CM

CO

en

ST

en

ST

CD

ST

co

Cn

en

n

tn

o

<—<

\t>

Γ-

CM

fO

co

cm

CM

co

n

ST

T

ST

tn

tn

tn

*

«

*

*

«

*

*

*

e

*

*

	<L» Ol	TJ a o,	TJ H Ol	TJ ω H o<	TJ ω H o.
	l en		en		ω		en		en
X	<	X	<	X	<	X	<	X	<	X
o	X	O	X	O	X	O	X	O	X	o
CL	<	X	<	X		X	<	CL	<Ł	CL

AHAS_pred *594‘DGRTVY

186 091

FIG. 3a

MIEJSCA

WIĄZANIA KOFAKTORÓW

MIEJSCA

MUTACJI a-HELISA

Do 2| g

FIG. 3b

MIEJSCA

WIĄZANIA KOFAKTORÓW

MIEJSCA

MUTACJI

TO 369

186 091

MIEJSCA

WIĄZANIA KOFAKTORÓW

FIG. 4

186 091

FIG. 5a i

Pac751 .

Maizeals2 ................................

Maizealsl ................................

SPSSSTSSTL SSSSSKSSTL SPSSSKSPLP ...SSKSPLP

S.....SPTK

SPSSSKSPT50

Tobacl	MAAA.	. .APS	PSSSAFSKTL
Tobac2	MAAA.	. .AAA	PSPS.FSKTL
Athcsrl2	MAAATTTTTT	SSSISFSTKP
Bnaal3	MAAA.	. . .TS	SSPISLTAKP
Bnaal2		. . . .M	ASFSFFGTIP
Sekwencja	MAAA-	--ATS	-S-SSFS--P
najwyższej zgodności Pac751 Maizeals2	51
PKARRRAHLL	ATRRALAAPI
Maizealsl	PKSRRRAHHL	ATRRALAAPI
Tobacl	HLTHTHIHIH	SQRRRFTISN
Tobac2	HLTPT	. .HIH	SQRRRFTISN
Athcsrl2	RRGIKSSSPS	SISAVLNTTT
Bnaal3	R. . . .	. . .PL	AISAVLNSPV
Bnaal2		. . .AT	RVSVSANSKK
Sekwencja najwyższej Λ zgodności	- -TR-	RAH-L	-IRR-LN-PI

MATAAAAS TALTGATTAA MATAATAA AALTGATTAT LPRSTFPFPH HPHKTTPPPL LPRSTFPFPH HPHKTTPPPL ISRFSLPFSL NPNKSSSSSR ISRFSLPFSL TPQKPSSRLH ASVFSLPVSV TTLPSFPRRR -SRFTLPFS- TPLK--P--100 .GSAASPAMP MAPPATPLRP WGPTDPRKGA RCSAASPAMP MAPPATPLRP WGPTDPRKGA RCSALSRATP TAPPATPLRP WGPNEPRKGS VISTNQKVSQ TEKTETFVSR FAPDEPRKGS VISTTQKVSE TQKAETFVSR FAPDEPRKGS NVTTTPSPTK PTKPETFISR FAPDQPRKGA NV. . ..APEK TDKIKTFISR YAPDEPRKGA DQDRTAS..R RENPSTFSSK YAPNVPRSGA --S-TS-A-P T-KP-TF-SR -APDEPRKGA -A

APac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej zgodności

Pac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej zgodności

FIG. 5b

-A

101 150

DILVESLERC GVRDVFAYPG GASMEIHQAL TRSPVIANHL FRHEQGEAFA DILVESLERC GVRDVFAYPG GASMEIHQAL TRSPVIANHL FRHEQGEAFA DILVEALERC GVRDVFAYPG GASMEIHQAL TRSPVIANHL FRHEQGEAFA DVLVEALERE GVTDVFAYPG GASMEIHQAL TRSSIIRNVL PRHEQGGVFA DVLVEALERE GVTDVFAYPG GASMEIHQAL TRSSIIRNVL PRHEQGGVFA DILVEALERQ GVETVFAYPG GASMEIHQAL TRSSSIRNVL PRHEQGGVFA DILVEALERQ GVETVFAYPG GASMEIHQAL TRSSTIRNVL PRHEQGGVFA DILVEALERQ GVDWFAYPG GASMEIHQAL TRSNTIRN7L PRHEQGGIFA DILVEALER- GV-DVFAYPG GASMEIHQAL TRSSVIRNVL PRHEQGGVFA , _ - RÓWNOWAŻNIK MET 53 KUKURYDZY „ _Λ _

1□1 200 ASGYARSSGR VGVCIATSGP GATNLVSALA DALLDSVPMV AITGQVPRRM ASGYARSSGR VGVCIATSGP GATNLVSALA DALLDSVPMV AITGQVPRRM ASAYARSSGR VGVCIATSGP GATNLVSALA DALLDSVPMV AITGQVPRRM AEGYARATGF PGVCIATSGP GATNLVSGLA DALLDSVPIV AITGQVPRRM AEGYARATGF PGVCIATSGP GATNLVSGLA DALLDSVPIV AITGQVPRRM AEGYARSSGK PGICIATSGP GATNLVSGLA DALLDSVPLV AITGQVPRRM AEGYARSSGK PGICIATSGP GATNLVSGLA DAMLDSVPLV AITGQVPRRM AEGYARSSGK PGICIATSGP GAMNLVSGLA DALFDSVPLI AITGQVPRRM AEGYARSSG- PGVCIATSGP GATNLVSGLA DALLDSVP-V AITGQVPRRM f

RÓWNOWAŻNIK ARG 128 KUKURYDZY

-g

186 091

FIG. 5c

RÓWNOWAŻNIK PHE 135 KUKURYDZY

Pac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej zgodności

Pac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej λ zgodności_

201 1

IGTDAFQETP

IGTDAFQETP

IGTDAFQETP

IGTDAFQETP

IGTDAFQETP

IGTDAFQETP

IGTDAFQETP

IGTMAFQETP

IGTDAFQETP

251

LVDIPKDIQQ

LVDIPKDIQQ

LVDIPKDIQQ

LIDVPKDIQQ

LIDVPKDIQQ

LVDVPKDIQQ

LVDVPKDIQQ

LIDVPKDVQQ

LVDVPKDIQQ

IVEVTRSITK

IVEVTRSITK

IVEVTRSITK

IVEVTRSITK

IVEVTRSITK

IVEVTRSITK

IVEVTRSITK

WEVTRTITK

IVEVTRSITK

QMAVPVWDKP

QMAVPVWDKP

QMAVPAWDTP

QLVIPDWDQP

QLVIPDWDQP

QLAIPNWEQA

QLAIPNWDQP

QFAIPNWEQP

QLAIPNWDQP

HNYLVLDVDD

HNYLVLDVDD

HNYLVLDVDD

HNYLVMDVED

HNYLVMDVED

HNYLVMDVED

HNYLVMDVDD

HNYLVMEVDD

HNYLVMDVDD

MSLPGYIARL

MSLPGYIARL

MSLPGYIARL

MRLPGYMSRL

MRLPGYMSRL

MRLPGYMSRM

MRLPGYMSRL

MRLPLYMSTM

MRLPGYMSRL

IPRWQEAFF

IPRWQEAFF

IPRWQEAFF

IPRWREAFF

IPRWREAFF

IPRIIEEAFF

IPRIVQEAFF

IPRIVREAFF

IPRWQEAFF

PKPPATELLE

PKPPATELLE

PKPPATEFLE

PKLPNEMLLE

PKLPNEMLLE

PKPPEDSHLE

PQPPEVSQLG

PKPPKVSHLE

PKPPA--LLE

250

LASSGRPGPV

LASSGRPGPV

LASSGRPGPV

LARSGRPGPI

LARSGRPGPV

LATSGRPGPV

LATSGRPGPV

LATSVRPGPV

LA-SGRPGPV

300

QVLRLVGESR

QVLRLVGESR

QVLRLVGESR

QIVRLISESK

QIVRLISESK

QIVRLISESK

QIVRLISESK

QILRLVSESK

QI-RL-SESK

-c

Pac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej zgodności

Pac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej ^zgodności

FIG. 5d

301

RPVLYVGGGC

RPVLYVGGGC

RPVLYVGGGC

KPVLYYGGGC

KPVLYVGGGC

KPVLYVGGCC

RPVLYVGGGS

RPVLYVGGGC

RPVLYVGGGC

351

GMHGTVYANY

GMHGTVYANY

GMHGTVYANY

GMHGTVYANY

GMHGTVYANY

GMHGTVYANY

GMHGTVYANY

GMHGTVYANY

GMHGTVYANY

ARSGEELRRF

AASGEELRRF

AASGEELCRF

SQSSEDLRRF

SQSSEELRRF

LNSSDELGRF

LNSSEELGRF

LNSSEELRRF

-NSSEELRRF

AVDKADLLLA

AVDKADLLLA

AVDKADLLLA

AVDSSDLLLA

AVDSSDLLLA

AVEHSDLLLA

AVEHSDLLLA

AVEYSDLLLA

AVDKSDLLLA

VELTGIPVTT

VELTGIPVTT

VELTGIPVTT

VELTGIPVAS

VELTGIPVAS

VELTGIPVAS

VELTGIPVAS

VELTGIPVAS

YELTGIPYAS

LGVRFDDRVT

LGVRFDDRVT

FGVRFDDRVT

FGVRFDDRVT

FGVRFDDRVT

FGVRFDDRVT

FGVRFDDRVT

FGVRFDDRVT

FGVRFDDRVT

TLMGLGNFPS

TLMGLGNFPS

TLMGLGNFPS

TLMGLGAFPT

TLMGLGAFPT

TLMGLGSYPC

TLMGLGSYPC

TFMGLGSYPC

TLMGLG-FPGKIEAFASRA

GKIEAFASRA

GKIEAFAGRA

GKLEAFASRA

GKLEAFASRA

GKLEAFASRA

GKLEAFASRA

GKLEAFASRA

GKLEAFASRA

-c

350

DD.PLSLRML DD.PLSLRML DD.PLSLRML GD.ELSLSML GD.ELSLSML DD.ELSLHML ND.ELSLQML DDEEFSLQML DD-ELSLRML

400

KIVHVDIDPA KIVHVDIDPA KIVHIDIDPA KIVHIDIDSA KIVHIDIDSA KIVHIDIDSA KIVHIDIDSA KIVHIDIDST KIVHIDIDSA -_D

186 091

ΟPac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej zgodności

Pac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej _— zgodności

FIG. 5e

-—-_D

401 450

EIGKNKQPHV SICADVKLAL QGMNALLEGS TSKKSFDFGS WNDELDQQKR EIGKNKQPHV SICADVKLAL QGMNALLEGS TSKKSFDFGS WNDELDQQKR EIGKNKQPHV SICADVKLAL QGMNTLLEGS TSKKSFDFGS WHDELDQQKR EIGKŃKQPHV SICADIKLAL QGLNSILESK EGKLKLDFSA WRQELTEQKV EIGKNKQPHV SICADIKLAL QGLNSILESK EGKLKLDFSA WRQELTVQKV EIGKNKTPHV SVCGDVKLAL QGMNKVLENR AEELKLDFGV WRNELNVQKQ EIGKNKTPHV SVCGDVKLAL QGMNKVLENR AEELKLDFGV WRSELSEQKQ EIGKNKTPHV SVCCDVQLAL QGMNEVLENR RD..VLDFGE WRCELNEQRL EIGKNKQPHV SICADVKLAL QGMN-VLE-- T-KLKLDFGS WRDELD-QKR

451 500

EFPLGYKTSN EEIQPQYAIQ VLDELTKGEA IIGTGVGQHQ MWAAQYYTYK EFPLGYKTSN EEIQPQYAIQ VLDELTKGEA IIGTGVGQHQ MWAAQYYTYK EFPLGYKIFN EEIQPQYAIQ VLDELTKGEA IIATGVGQHQ MWAAQYYTYK KHPLNFKTFG DAIPPQYAIQ VLDELTNGNA IISTGVGQHQ MWAAQYYKYR KYPLNFKTFG DAIPPQYAIQ VLDELTNGSA IISTGVGQHQ MWAAQYYKYR KFPLSFKTFG EAIPPQYAIK VLDELTDGKA IISTGVGQHQ MWAAQFYNYK KFPLSFKTFG EAIPPQYAIQ VLDELTQGKA IISTGVGQHQ MWAAQFYKYR KFPLRYKTFG EEIPPQYAIQ LLDELTDGKA IITTGVGQHQ MWAAQFYRFK KFPLG-KTFG E-IPPQYAIQ VLDELTKG-A IISTGVGQHQ MWAAQYY-YK

----— E

EPac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej zgodności

Pac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej

- zgodności_

FIG. 5f

-_E

501 550 RPRQWLSSAG LGAMGFGLPA AAGASVANPG VTWDIDGDG SFLMNVQELA RPRQWLSSAG LGAMGFGLPA AAGASVANPG VTWDIDGDG SFLMNVQELA RPRQWLSSAG LGAMGFGLPA AAGAAVANPG VTWDIDGDG SFLMNIQELA KPRQWLTSGG LGAMGFGLPA AIGAAVGRPD EVWDIDGDG SFIMNVQELA KPRQWLTSGG LGAMGFGLPA AIGAAVGRPD EVWDIDGDG SFIMNVQELA KPRQWLSSGG LGAMGFGLPA AIGASVANPD AIWDIDGDG SFIMNVQELA KPRQWLSSSG LGAMGFGLPA AIGASVANPD AIWDIDGDG SFIMNVQELA KPRQWLSSGG LGAMGFGLPA AMGAAIANPG AWVDIDGDG SFIMNIQELA KPRQWLSSGG LGAMGFGLPA AIGA-VANP- -VWDIDGDG SFIMNVQELA

551 600 MIRIENLPVK VFVLNNQHLG MWQWEDRFY KANRAHTYLG NPENESEIYP MIRIENLPVK VFVLNNQHLG MWQWEDRFY KANRAHTYLG NPENESEIYP MIRIENLPVK VFVLNNQHLG MWQWEDRFY KANRAHTFLG NPENESEIYP TIKVENLPVK IMLLNNQHLG MWQWEDRFY KANRAHTYLG NPSNEAEIFP TIKVENLPVK IMLLNNQHLG MWQWEDRFY KANRAHTYLG NPSNEAEIFP TIRVENLPVK VLLLNNQHLG MVMQWEDRFY KANRAHTFLG DPAQEDEIFP TIRVENLPVK ILLLNNQHLG MVMQWEDRFY KANRAHTYLG DPARENEIFP TIRVENLPVK VLLINNQHLG MVLQWEDHFY AANRADSFLG DPANPEAVFP TIRVENLPVK V-LLNNQHLG MWQWEDRFY KANRAHTYLG NP-NESEIFP -_F

186 091

Pac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej zgodności

Pac751

Maizeals2

Maizealsl

Tobacl

Tobac2

Athcsrl2

Bnaal3

Bnaal2

Sekwencja najwyższej ‘ ^zgQdności

601

DFVTIAKGFN

DFVTIAKGFN

DFVAIAKGFN

NMLKFAEACG

NMLKFAEACG

NMLLFAAACG

NMLQFAGACG

DMLLFAASCG

-ML-FAKACG

651 673

MIPSGGAFKD MILDGDGRTV Y..

MIPSGGAFKD MILDGDGRTV Y*.

MIPSGGAFKD MILDGDGRTV Y*.

MIPSGGAFKD VITEGDGRSS Y*.

MIPSGGAFKD VITEGDGRSS Y*.

MIPNGGTFND VITEGDGRIK Y*E MIPSGGTFKD VITEGDGRTK Y*.

LIPSGGTFKD IIV*.........

MIPSGGAFKD VITEGDGRTV Y-IPAVRVTKKN

IPAVRVTKKN

IPAVRVTKKS

VPAARVTHRD

VPAARVTHRD

IPAARVTKKA

IPAARVTKKE

IPAARVTRRE

IPAARVTKK~ • 5g

EVRAAIKKML

EVRAAIKKML

EVHAAIKKML

DLRAAIQKML

DLRAAIQKML

DLREAIQTML

ELREAIQTML

DLREAIQTML

-LRAAIQKML

ETPGPYLLDI

ETPGPYLLDI

EAPGPYLLDI

DTPGPYLLDV

DTPGPYLLDV

DTPGPYLLDV

DTPGPYLLDV dtpgpflldv

DTPGPYLLDV

-F

650

IVPHQEHVLP

IVPHQEHVLP

IVPHQEHVLP

IVPHQEHVLP

IVPHQEHVLP

ICPHQEHVLP

ICPHQEHVLP

VCPHQDHVLP

IVPHQEHVLP

FIG. 5h

G-G

Pac751 -izozym als2 AHAS z kukurydzy w postaci eksprymowanej z wektora ekspresyjnego E. coli pAC 751 (jak na figurze 1)

Maizeals2 - izozym als2 AHAS kukurydzy (roślina)

Maizealsl — izozym alsl AHAS kukurydzy (roślina)

Tobacl - izozym SuRA AHAS tytoniu (roślina)

Tobac2 - izozym SuRB AHAS tytoniu (roślina)

Athcsrl2 — gen AHAS Csr 1.2 Arabidopsis thaliana (roślina) Bnaal3 — izozym III AHAS Brassica napus (roślina)

Bnaal2 — izozym II AHAS Brassica napus (roślina)

186 091

pozostającej aktywności

FIG. 7

PURSUIT

186 091 pozostającej aktywności

FIG. 8

nM OUST

FIG. 9

186 091 % pozostającej aktywności % pozostającej aktywności

FIG. 10

FIG. 11

julM PURSUIT bb _nM OUST

186 091

FIG. 12

TYP DZIKI

Mełl24Ile

Arg 199 Glu

186 091

FIG. 14

FIG. 15

Metl24Ile 2.5jąM CL299.263

Metl24His 2.5 ajM CL 299,263

Argl99Glu Metl24His

2.5ąM CL 299,263 O ąM CL 299,263

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (36)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wyizolowany DNA kodujący wariant białka syntazy acetohydroksykwasów (AHAS), który jest zmodyfikowany przez:

   (i) podstawienie przynajmniej jednego innego aminokwasu zamiast reszty aminokwasowej w sekwencji z figury 1 wybranej z grupy obejmującej

   S52, M53, E54, A81, A95, T96, S97, P99, G100, A101, R127, R128, M129, I187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, T283, V284, G300, V301, T308, G309, K310, I311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q572, E574, H575, V576, L577, P578, I580, P581, G583 i G584, równoważniki funkcjonalne powyższych aminokwasów i dowolne kombinacje którychkolwiek z powyższych;

   (ii) delecję nie więcej niż 5 aminokwasów poprzedzających, lub nie więcej niż 5 aminokwasów następujących po przynajmniej jednej reszcie aminokwasowej w sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1) wybranej z grupy obejmującej S52, M53, E54, A81, A95, T96, S97, P99, G100, A101, R127, R128, M129, I187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, T283, V284, G300, V301, T308, G309, K310, I311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414,-G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q572, E574, H575, V576, L577, P578, I580, P581, G583 i G584, równoważniki funkcjonalne powyższych aminokwasów i dowolne kombinacje którychkolwiek z powyższych;

   (iii) delecję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy Q124 a H150 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1);

   (iv) insercję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy Q124 a H150 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1);

   (v) delecję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy G300 a D324 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1);

   (vi) insercję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy G300 a D324 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1); lub (vii) dowolną kombinację którychkolwiek z powyższych, przy czym wytworzone białko ma cechę oporności na herbicydy.
2. 2. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniona modyfikacja zmienia zdolność herbicydu do hamowania aktywności enzymatycznej wymienionego białka.
3. 3. DNA według zastrz. 2, znamienny tym, że herbicydy wybrane są z grupy obejmującej imidazolinony, sulfonylomoczniki, sulfonamidy triazolopirymidynowe, kwasy pirymidylo-oksy-benzoesowe, sulfamoilomoczniki, sulfokarboksyamidy i ich kombinacje.
4. 4. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że wymienione białko AHAS pochodzi z Arabidopsis thaliana.
5. 5. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że podstawienie to wybrane jest z grupy obejmującej Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Ph.el35Arg, Ile330Phe, funkcjonalny równoważnik któregokolwiek z powyższych lub kombinację którychkolwiek z powyższych.

   186 091
6. 6. DNA według zastrz. 5 znamienny tym, że wymieniony wariant białka AHAS cechuje się

   a) nieoObecoóciąprryyajmniej jednego herbicydu,

   i) aktywnością katalityczną wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany; lub ii) aktywnością katalityczną w połączeniu z jakimkolwiek wariantem białka AHAS opornym na herbicyd również eksprymowanym w tej komórce, który może być tym samym lub innym białkiem niż pierwszy wariant białka AHAS, wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany;

   przy czym komórka wymaga aktywności AHAS do życia; oraz;

   (b) aktywnością kc^tdit\a;^nit bzrdziej oporną pr/ynpjmnóaj jeden Oerbicydmż aktywność dzikiej AHAS.
7. 7. DNA według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony wariant AHAS cechuje się aktywnością katalityczną ponad około 20% aktywności katalitycznej dzikiej AHAS.
8. 8. DNA według zastrz. 7, znamienny tym, że wymieniony wariant AHAS jest przynajmniej’ dwukrotnie bardziej oporny na herbicydy oparte na imidapolinonie niż na herbicydy oparte na sulfonylomocpniOu.
9. 9. Wektor DNA zawierający sekwencję DNA określoną w zastrz. 1, operacyjnie połączoną z elementem regulującym transkrypcję.
10. 10. Komórka zawierająca sekwencję DNA kodującą AHAS pochodzącą z wektora DNA określonego w zastrz. 9, wybrana z grupy obejmującej komórki bakterii, grzybów, roślin, owadów i ssaków.
11. 11. Komórka według zastrz. 10, którą stanowi komórka rośliooa.
12. 12. Wariant białka AHAS, który stanowi białko kodowane przez DNA określone w zastrz. 1.
13. 13. Wariant białka AHAS, który stanowi białko AHAS zmodyfikowane przez (i) podstawienie przynajmniej' jednego Ceoeok aminokwasu zamiast reszty aminokwasowej w sekwencji z figury 1 wybranej z grupy obejmującej

    S52, M53, E54, A81, A95, T96, S97, P99, G100, A101, R127, R128, M129, I187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, T283, V284, G300, V301, T308, G309, K310, I311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, 1330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q572, E574, H575, V576, L577, P578, I580, P581, G583 i G584, równoważniki funkcjonalne powyższych aminokwasów i dowolne kombinacje którychkolwiek z powyższych;

    (ii) 0ο1ο^ nie więcej niż 5 aminokwasów poprzedzających, lub nie więcej niż 5 aminokwasów następujących po przynajmniej joOoej reszcie aminokwasowej w sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1) wybranej z grupy obejmującej S52, M53, E54, A81, A95, T96, S97, P99, G100, A101, R127, R128, M129, I187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, T283, V284, G300, V301, T308, G309, K310, I311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q572, E574, H575, V576, L577, P578, I580, P581, G583 i G584, równoważniki funkcjonalor powyższych aminokwasów i dowolne kombinacje którychkolwiek z powyższych;

    (iii) delecję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego fuokcjooaloego równoważnika pomiędzy Q124 a H150 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1);

    (iv) insercję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego fuokcjonal·oegk równoważnika pomiędzy Q124 a H150 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1);

    (v) ΟοΙοΤ przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy G300 a D324 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1);

    186 091 (vi) insercję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy G300 a D324 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1); lub (vii) dowolną kombinację którychkolwiek z powyższych, przy czym wytworzone białko ma cechę oporności na herbicydy.
14. 14. Wariant białka AHAS według zastrz. 13, znamienny tym, że określona modyfikacja zmienia zdolność herbicydu do hamowania aktywności enzymatycznej wspomnianego białka.
15. 15. Wariant białka AHAS według zastrz. 13, znamienny tym, że herbicydy wybrane są z grupy obejmującej imidazolinony, sulfonylomoczniki, sulfonamidy triazolopirymidynowe, kwasy pirymidylo-oksy-benzoesowe, sulfamoilomoczniki, sulfokarboksyamidy i ich kombinacje.
16. 16. Wariant białka AHAS według zastrz. 13, znamienny tym, że wymienione białko AHAS pochodzi z Arabidopsis thaliana.
17. 17. Wariant białka AHAS według zastrz. 13, znamienny tym, że zawiera podstawienie wybrane z grupy obejmującej Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phel35Arg, Ile330Phe, funkcjonalny równoważnik któregokolwiek z powyższych lub kombinację którychkolwiek z powyższych.,
18. 18. Wariant białka AHAS według zastrz. 13, znamienny tym, że cechuje się (a) w nieobecności przynajmniej jednego herbicydu, (i) aktywnością katalityczną wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany; lub (ii) aktywnością katalityczną w połączeniu z jakimkolwiek wariantem białka AHAS opornym na herbicyd również eksprymowanym w tej komórce, który może być tym samym lub innym białkiem niż pierwszy wariant białka AHAS, wystarczającą dla utrzymania przy życiu komórki, w której jest eksprymowany;

    przy czym komórka wymaga aktywności AHAS do życia; oraz;

    (b) aktywnością katalityczną bardziej oporną na przynajmniej jeden herbicyd niż aktywność dzikiej AHAS.
19. 19. Wariant białka AHAS według zastrz. 13, znamienny tym, że ma aktywność katalityczną ponad około 20% wyższą niż aktywność katalityczna dzikiej AHAS.
20. 20. Sposób nadawania oporności na herbicydy komórce, znamienny tym, że obejmuje (a) wklonowanie DNA określonego w zastrz. 1 w odpowiedni wektor ekspresyjny; oraz (b) transformację tej komórki tym DNA, w warunkach, w których gen ten jest eksprymowany na poziomie wystarczającym do nadania oporności na herbicyd komórce.
21. 21. Komórka przygotowana sposobem jak określono w za strz. 20.
22. 22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że zmutowany gen koduje odmienny aminokwas w przynajmniej jednej z pozycji: 53, 128,135 lub ich kombinacji.
23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że wymieniony gen jest genem AHAS Arabidopsis thaliana..
24. 24. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że komórka wybrana jest z grupy obejmującej komórki bakterii, grzybów, roślin, owadów lub ssaków.
25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że komórkę stanowi komórka roślinna.
26. 26. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że wymienioną komórkę stanowi nasienie.
27. 27. Sposób wytwarzania opornego na herbicydy białka AHAS, znamienny tym, że obejmuje:

    (a) wybór pozycji aminokwasowej w docelowym białku AHAS jako miejsca mutacji;

    (b) mutację DNA kodującego AHAS w celu wytworzenia zmutowanego DNA posiadającego mutację w tej pozycji;

    (c) ekspresję tego zmutowanego DNA w pierwszej komórce, w warunkach, w których wytwarzany jest wariant AHAS zawierający mutację w tej pozycji;

    (d) ekspresję dzikiego białka AHAS równolegle w drugiej komórce;

    (e) oczyszczenie dzikiego białka oraz wariantu białka AHAS z tych komórek;

    (f) oznaczenie aktywności katalitycznej dzikiego i wariantu białka AHAS w przekształcaniu pirogronianu do acetomleczanu, przy nieobecności oraz w obecności herbicydów imidazolinonowych lub sulfonylomocznikowych; oraz

    186 091 (g) powtarzanieetapów (a)-(g),przy cprm wymienionyzmutowanyDNA jest wykorzystywany jako DNA kodujący AHAS w etapie (b) aż do zidentyfikowania opornego na herbicydy białka cechującego się (i) aktywnością katalityczną przy nieobecności herbicydów wynoszącą o około 20% powyżej aktywności katalitycznej dzikiej AHAS;

    (ii) aktywnością katalityczną stosunkowo bardziej oporną na obecność herbicydów imidayolipopowoch w porównaniu z dziką AHAS; oraz (iii) aktywnością katalityczną stosunkowo bardziej wrażliwą na obecność herbicydów sulfonolomocynikowoch w porównaniu z herbicydami rmidazoliponowymi.
28. 28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że herbicydy wybrane są z grupy obejmującej imidayolipony, sulfonolomoczpiki, sulfonamidy triayolopirymidopowe, kwasy pirymidoloroksorbenzoesowe, sulfamoilomoczniki, sulfokarboksyamidy i ich kombinacje.
29. 29. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że wymienione białko AHAS pochodzi z Arabidopsis thaliana.
30. 30. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że womiepiopą komórkąjest E. coli.
31. 31. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że wymienione docelowe białko AHAS stanowi białko o sekwencji według figury 1.
32. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że mutacja wybrana jest z grupy obejmującej (i) podstawienie przynajmniej jednego innego aminokwasu zamiast reszty aminokwasowej w sekwencji z figury 1 wybranej z grupy obejmującej

    S52, M53, E54, A81, A95, T96, S97, P99, G100, A101, R127, R128, M129, I187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, T283, V284, G300, V301, T308, G309, K310, I311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q572, E574, H575, V576, L577, P578, I580, P581, G583 i G584, równoważniki funkcjonalne powyższych aminokwasów i dowolne kombinacje któryclikolwiek z powyższych;

    (ii) delecję nie więcej niż 5 aminokwasów poprzedzających, lub nic więcej niż 5 aminokwasów następujących po przynajmniej jednej reszcie a^inokwasowej sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1) wybranej z grupy obejmującej S52, M53, E54, A81, A95, T96, S97, P99, G100, A101, R127, R128, M129, I187, T259, T260, L261, M262, G263, R276, T283, V284, G300, V301, T308, G309, K310, I311, E312, A313, F314, A315, S316, R317, A318, K319, I320, E329, I330, K332, N333, K334, Q335, T404, G413, V414, G415, Q416, H417, Q418, M419, W420, A421, A422, L434, S435, S436, A437, G438, L439, G440, A441, M442, G443, D467, G468, L471, N473, L477, M479, Q495, H496, L497, Y508, K509, A510, N511, R512, A513, H514, T515, S524, H572, Q572, E574, H575, V576, L577, P578, I580, P581, G583 i G584, równoważniki funkcjonalne powyższych aminokwasów i dowolne kombinacje którychkolwiek z powyższych;

    (iii) delecję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy Q124 a H150 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1);

    (iv) insercję pryypajmpiej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy Q124 a H150 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1);

    (v) delecję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy G300 a D324 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1);

    (vi) insercję przynajmniej jednego aminokwasu lub jego funkcjonalnego równoważnika pomiędzy G300 a D324 sekwencji z figury 1 (Sekw. Nr Id.: 1); lub (vii) dowolną kombinację którychkolwiek z powyższych, przy czym wytworzone białko ma cechę oporności na herbicydy.
33. 33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że podstawienie to wybrane jest z grupy obejmującej Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Argl28Ala, Argl28Glu, Phe^SArg, Ile330Phe, funkcjonalny równoważnik któregokolwiek z powyższych lub kombinację którycbkolwiek z powyższych.

    186 091
34. 34. Sposób zwalczania chwastów w uprawie, znamienny tym, że obejmuje uprawę roślin stanowiących rośliny oporne na herbicydy transformowane DNa jak określony w zastrz. 1 oraz traktowanie tej uprawy wydajną w zwalczaniu chwastów ilością wymienionego herbicydu.
35. 35. Sposób zwalczania chwastów w uprawie, znamienny tym, że obejmuje uprawę roślin stanowiących rośliny oporne na herbicydy transformowane DNA jako określony w zastrz. 1 oraz traktowanie tej uprawy wydajną w zwalczaniu chwastów ilością kompozycji herbicydowej zawierającej wymieniony herbicyd.
36. 36. Komórka stransformowana DNA określonym w zastrz. 1, przy czym DNA jest eksprymowany na poziomie wystarczającym do jej nadania oporności na herbicyd tej komórce.