ES2275275T3 - Productos resistentes a herbicidas diseñados sobre la base de la estructura. - Google Patents
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Abstract
EN LA PRESENTE SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS DE DISEÑO BASADO EN LA ESTRUCTURA PARA LA PREPARACION DE VARIANTES DE ACETOHIDROXIACIDO SINTASA (AHAS), INCLUYENDO LOS QUE MUESTRAN UNA RESISTENCIA AUMENTADA DE FORMA SELECTIVA A HERBICIDAS, TALES COMO HERBICIDAS DE IMIDAZOLINA Y HERBICIDAS QUE INHIBEN LA AHAS. LA INVENCION INCLUYE ADN AISLADOS QUE CODIFICAN PARA TALES VARIANTES, VECTORES QUE INCLUYEN LOS ADN Y PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR LOS POLIPEPTIDOS VARIANTES Y LAS PLANTAS RESISTENTES A HERBICIDAS QUE CONTIENEN LAS MUTACIONES DEL GEN AHAS ESPECIFICAS. TAMBIEN SE DESCRIBEN PROCEDIMIENTOS PARA EL CONTROL DE MALAS HIERBAS EN CULTIVOS.
Description
Productos resistentes a herbicidas diseñados
sobre la base de la estructura.
Esta invención se refiere al modelado y el
diseño basados en la estructura de variantes de la acetohidroxiácido
sintasa (AHAS) que son resistentes a las imidazolinonas y otros
herbicidas, a AHAS que inhiben herbicidas, a las propias variantes
de AHAS, a DNAs que codifican estas variantes, a plantas que
expresan estas variantes y a procedimientos de gestión de malas
hierbas.
La acetohidroxiácido sintasa (AHAS) es una
enzima que cataliza la etapa inicial de la biosíntesis de
isoleucina, leucina y valina en bacterias, levaduras y plantas. Por
ejemplo, la AHAS madura de Zea Mays es una proteína de
aproximadamente 599 aminoácidos que está localizada en el
cloroplasto (véase la Fig. 1). La enzima utiliza pirofosfato de
tiamina (TPP) y dinucleótido de flavina adenina (FAD) como
cofactores y piruvato como sustrato para formar acetolactato. La
enzima cataliza también la condensación de piruvato y
2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato. La
AHAS también es conocida como acetolactato sintasa o acetolactato
piruvato liasa (que carboxila), y se designa EC 4.1.3.18.
Probablemente, la enzima activa es como mínimo un homodímero. Ibdah
y otros (Protein Science, 3:479-S, 1994), en un
resumen, describen un modelo del sitio activo de AHAS.
Una variedad de herbicidas, entre las que están
incluidos compuestos de imidazolinona tales como imazetapir
(PURSUIT®, American Cyanamid Company-Wayne, NJ),
compuestos basados en sulfonilurea tales como sulfometuronmetilo
(OUST® - E.I. du Pont de Nemours and
Company-Wilmington, DE), triazolopirimidin
sulfonamidas (Broadstrike^{MC} - Dow Elanco; véase Gerwick y
otros, Pestic. Sci. 29:357-364, 1990),
sulfamoilureas (Rodaway y otros, Mechanisms of Selectivity of Ac
322.140 in Pady Rice, Wheat and Barley, Proceedings of the
Brighton Crop Protection Conference-Weeds, 1993),
ácidos pirimidiloxibenzoicos (STABLE® - Kumiai Chemical Industry
Company, E.I. du Pont de Nemours and Company; véase The Pesticide
Manual, 10ª ed., págs. 888-889, Clive Tomlin,
Ed., British Crop Protection Council, 49 Downing Street, Farmham,
Surrey G49, Reino Unido), y sulfonilcarboxamidas (Alvarado y otros,
patente U.S. nº. 4.883.914) actúan inhibiendo la actividad
enzimática de AHAS. (véanse Chaleff y otros, Science 224:1443,
1984); LaRossa y otros, J. Biol. Chem. 259:8753, 1984; Ray, Plant
Physiol. 75:827, 11984; Shaner y otros, Plant Physiol. 76:545,
1984). Estos herbicidas son muy efectivos y ambientalmente benignos.
Sin embargo, su uso en agricultura es limitado por no tener
selectividad, puesto que los cultivos, y también las indeseadas
malas hierbas, son sensibles a los efectos fitotóxicos de estos
herbicidas.
Bedbrook y otros, patentes U.S. nº. 5.013.659,
nº. 5.141.870 y nº. 5.378.824 describen varias variantes de AHAS
resistentes a sulfonilurea. Sin embargo, estas variantes se
obtuvieron por mutagénesis de plantas, semillas o células y
seleccionando mutantes resistentes a herbicidas, o derivaron de
tales mutantes. Este enfoque es impredecible en cuanto a que se basa
(al menos inicialmente) en la introducción al azar de una mutación
relevante, y no en un criterio de diseño racional basado en un
modelo estructural de la proteína diana.
Hay así necesidad en la técnica de
procedimientos y composiciones que proporcionan un espectro
selectivo amplio y/o una resistencia específica a herbicidas en
cultivos. Los autores de la presente invención han descubierto que
se pueden preparar formas variantes de AHAS resistentes
selectivamente a herbicidas y plantas que contienen las mismas,
mediante modelado basado en la estructura de AHAS contra la piruvato
oxidasa (POX), identificando la bolsa o las bolsas que se unen al
herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea en el modelo de
AHAS y diseñando mutaciones específicas que alteran la afinidad del
herbicida basado en imidazolinona o sulfonilurea para la bolsa de
unión. Estas variantes y plantas no son inhibidas o matadas por
herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea y retienen una
actividad enzimática de la AHAS suficiente para soportar el
crecimiento de los cultivos.
La Figura 1 es una ilustración de una secuencia
de 600 aminoácidos que corresponde a la secuencia de aproximadamente
599 aminoácidos de la acetohidroxi sintasa (AHAS) de Zea Mays
que se da como ejemplo de una enzima AHAS de una planta. La
secuencia no incluye una secuencia de tránsito y la glicina extra es
un vestigio de un sitio de escisión de trombina. Los restos Met53,
Arg128 y Phe115 se representan en negritas.
La Figura 2 es una ilustración del alineamiento
de la secuencia de AHAS de maíz y piruvatooxidasa (POX) de
Lactobacillus planarum.
La Figura 3 es una representación esquemática de
la estructura secundaria de una subunidad de AHAS. Los elementos
estructurales secundarios, hélices \alpha y hojas \beta se
representan como círculos y elipses, respectivamente, y están
numerados separadamente para cada uno de los tres dominios dentro de
una subunidad. Los lazos y las regiones enrolladas se representan
con líneas negras, representando los números los comienzos y las
terminales aproximados de los elementos. Las localizaciones de los
sitios cofactores de unión y los sitios de mutación conocidos se
indican por octaedros y estrellas, respectivamente.
La Figura 4 es una ilustración de un modelo
generado con ordenador del sitio selectivo de AHAS de maíz con
imazetapir (herbicida PURSUIT®) modelado en la bolsa de unión.
La Figura 5 es una ilustración de la homología
entre secuencias de aminoácidos de AHAS derivadas de diferentes
especies de plantas. PAC751 es isozima de AHAS als 2 de maíz según
se expresa del vector de expresión pAC 751 de E. coli según
la Figura 1; als 2 de maíz es la isozima de AHSA als 2 de maíz; als
1 de maíz es la isozima de AHAS als 1 de maíz; Tobac 1 es la isozima
SuRA de AHAS de tabaco; Tobac 2 es la isozima SuRB de AHAS de
tabaco; Athcar 12 es el gen Csr 1.2 de AHS de Arabidoposis
thaliana; Bnaal 3 es la isozima de AHAS de Brassica
napus; y Bnaal2 es la isozima de AHAS de Brassica
napus.
PAC 751 y als 2 de maíz son genes idénticos
excepto que als 2 de maíz empieza al comienzo de la secuencia de
tránsito y pAC 751 empieza en el sitio N-terminal
putativo maduro con una glicina adicional en el terminal N debido a
la secuencia de reconocimiento en el vector de expresión
pGEX-2T. La glicina de la terminal N no es un
aminoácido natural en esa posición.
Los alineamientos de la secuencia de aminoácidos
de las proteínas de AHAS se generaron por PILEUP (paquete de GCG -
Genetics Computer Group, Inc., -University Research Park -
Madison-WI). La secuencia de consenso se generó por
empaquetamiento PRETTY GCG.
La Figura 6 es una ilustración fotográfica de
un gel de SDS-poliacrilamida teñida para proteína
que muestra la purificación de AHAS de maíz. Los carriles contienen
(de izquierda a derecha): A, marcadores del peso molecular; B,
extracto en bruto de células de E. coli; C, preparación
purificada por afinidad de glutationa-agarosa; D,
digestión de trombina de la preparación purificada por afinidad; E,
segunda pasada a través de la columna de
glutationa-agarosa y filtración de gel de Sefacril
S-100.
La Figura 7 es una ilustración gráfica de los
resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de
las proteínas de AHAS de tipo salvaje y mutantes en ausencia y en
presencia de concentraciones crecientes de imazetapir (herbicida
PURSUIT®). El eje Y representa el % de actividad de la enzima
mutante, midiéndose el valor de 100% en ausencia de inhibidor.
La Figura 8 es una ilustración gráfica de los
resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de
las proteínas de AHAS de tipo salvaje y mutantes en ausencia y en
presencia de concentraciones crecientes de sulfometironmetilo
(herbicida OUST®). El eje Y representa el % de actividad de la
enzima mutante, midiéndose el valor de 100% en ausencia de
inhibidor.
La Figura 9 es una ilustración gráfica de los
resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de
la proteína de AHAS de Arabidopsis de tipo salvaje y la
proteína Met124Ile mutante de AHAS mutante de Arabidopsis en
ausencia y en presencia de concentraciones crecientes de imazetapir
(herbicida PURSUIT®) y sulfometironmetilo (herbicida OUST). El eje Y
representa el % de actividad de la enzima mutante, midiéndose el
valor de 100% en ausencia de inhibidor.
La Figura 10 es una ilustración gráfica de los
resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de
la proteína de AHAS de Arabidopsis de tipo salvaje y la
proteína Met124Ile de AHAS mutante de Arabidopsis en ausencia
y en presencia de concentraciones crecientes de imazetapir
(herbicida PURSUIT®) y sulfometuronmetilo (herbicida OUST®). El eje
Y representa el % de actividad de la enzima mutante, midiéndose el
valor de 100% en ausencia de inhibidor.
La Figura 11 es una ilustración gráfica de los
resultados de ensayos in vitro de la actividad enzimática de
la proteína de AHAS de Arabidopsis de tipo salvaje y la
proteína Arg199Glu de AHAS mutante de Arabidopsis en ausencia
y en presencia de concentraciones crecientes de imazetapir
(herbicida PURSUIT®) y sulfometuronmetilo (herbicida OUST®).. El eje
Y representa el % de actividad de la enzima mutante, midiéndose el
valor de 100% en ausencia de inhibidor.
La Figura 12 es una ilustración gráfica de un
vector de DNA usado para transformación de plantas, que contiene el
gen nptII (que codifica la resistencia a la canamicina) bajo el
control del promotor 35S y un gen de AHAS (de tipo salvaje o
variante) bajo el control del promotor de AHAS de
Arabidopsis.
La Figura 13 es una fotografía que ilustra el
desarrollo de la raíz de plantas de tabaco transformadas con el gen
de AHAS de Arabidopsis que contiene la mutación de Met124Ile
o Arg19Glu y un control no transformado. Las plantas crecieron
durante 18 días después de su paso a un medio que contenía
imazetapir 0,25 \muM.
La Figura 14 es una fotografía que presenta
plantas de tabaco transformadas con el gen de AHAS de
Arabidopsis que contiene la mutación de Met124Ile, Met124His
o Arg199Glu y un control no transformado, sobre las que se había
proyectado dos veces la cuantía del campo (100 g/ha) de
imazetapir.
La Figura 15 es una fotografía que muestra los
resultados de ensayos de germinación realizados en presencia del
herbicida CL 299.263 (imazamox), que se realizaron sobre semillas
cosechadas de transformantes da plantas de tabaco primarias que se
habían transformado con el gen de AHAS de Arabidoposis que
contiene la mutación Met124Ile, Met 124His o Arg199Glu.
La presente invención proporciona un
procedimiento de modelado basado en la estructura para la producción
de proteína variante de AHAS resistente a herbicidas basados en
imidazolinona y/o sulfonilurea: El procedimiento incluye:
- (a)
- alinear una proteína de AHAS diana sobre un molde de piruvato oxidasa para derivar la estructura tridimensional de la proteína de AHAS diana;
- (b)
- modelar uno o más herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea en la estructura tridimensional para localizar una bolsa de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea en la proteína de la AHAS diana;
- (c)
- seleccionar como diana para la mutación al menos una posición de aminoácido en la proteína de AHAS diana, en la que la mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la bolsa de unión;
- (d)
- mutar DNA que codifica la proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mutación en la posición; y
- (e)
- expresar el DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la AHAS variante que contiene la mutación en la posición.
El procedimiento puede incluir además:
- (f)
- expresar DNA que codifica la proteína de AHAS de tipo salvaje paralelamente en una segunda célula;
- (g)
- purificar las proteínas de AHAS de tipo salvaje y de la variante de las células;
- (h)
- ensayar las proteínas de AHAS de tipo salvaje y la variante en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato en ausencia y presencia del herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea;
- (i)
- repetir las etapas (c)-(h), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (e) se usa como el DNA que codifica AHAS en la etapa (c) hasta que se identifica una proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene
- (i)
- en ausencia del herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea,
- (a)
- una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa, o
- (b)
- una actividad catalítica en combinación con una proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;
- en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y
- (ii)
- una actividad catalítica que es más resistente al mencionado herbicida basado en imidazolina y/o sulfonilurea que la HAAS de tipo salvaje.
También se proporciona un procedimiento
alternativo de modelado basado en la estructura para la producción
de una proteína variante resistente a un herbicida basado en
imidazolinona y/o sulfonilurea. Este procedimiento
incluye:
incluye:
- (a)
- alinear una proteína de AHAS diana en un primer molde de AHAS derivado de un polipéptido que tiene la secuencia de la Figura 1 o un equivalente funcional de él para derivar la estructura tridimensional de la proteína de AHAS diana;
- (b)
- modelar uno o más herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea en la estructura tridimensional para localizar una bolsa de unión de un herbicida basado en imidazolina y/o sulfonilurea en la proteína de AHAS diana;
- (c)
- seleccionar como diana para una mutación, al menos una posición del aminoácido en la proteína de AHAS diana, en la que la mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la bolsa de unión;
- (d)
- mutar el DNA que codifica la proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mutación en la posición, y
- (e)
- expresar el DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la AHAS variante que contiene la mutación en la posición.
Este procedimiento puede incluir además:
- (f)
- expresar DNA que codifica la proteína de AHAS de tipo salvaje paralelamente en una segunda célula;
- (g)
- purificar la proteínas de AHAS de tipo salvaje y la variante de las células;
- (h)
- ensayar la proteína de AHAS de tipo salvaje y la variante en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato en ausencia y presencia del herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea;
- (i)
- repetir las etapas (c)-(h), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (e) se usa como el DNA que codifica la variante de AHAS en la etapa (c) hasta que se identifica una primera proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene
- (i)
- en ausencia de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea
- (a)
- una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa, o
- (b)
- una actividad catalítica en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;
- en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y
- (ii)
- una actividad catalítica que es más resistente a al menos el mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje.
En otra realización alternativa, el
procedimiento incluye
- (a)
- alinear una proteína de AHAS diana en un primer molde de AHAS que tiene una bolsa identificada de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea y que tiene la secuencia de la Figura 1 o un equivalente funcional de ella para derivar la estructura tridimensional de la proteína de AHAS diana;
- (b)
- seleccionar como diana para una mutación, al menos una posición de aminoácido en la proteína de AHAS diana, en la que la mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la bolsa de unión;
- (c)
- mutar el DNA que codifica la proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mutación en la posición, y
- (d)
- expresar el DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la AHAS variante que contiene la mutación en la posición.
El procedimiento puede incluir además:
- (e)
- expresar DNA que codifica la proteína de AHAS diana de tipo salvaje paralelamente en una segunda célula;
- (f)
- purificar la proteína de AHAS de tipo salvaje y la variante de las células;
- (g)
- ensayar la proteína de AHAS de tipo salvaje y la variante en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato, en ausencia y en presencia del herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, y
- (h)
- repetir las etapas (b)-(g), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (d) se usa como el DNA que codifica la AHAS en la etapa (b) hasta que se identifica una proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene
- (i)
- en ausencia de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea,
- (a)
- una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa, o
- (b)
- una actividad catalítica en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;
- en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y
- (ii)
- una actividad catalítica que es más resistente a al menos el herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje.
En realizaciones preferentes de los
procedimientos mencionados, la actividad catalítica en ausencia del
herbicida es como mínimo de aproximadamente 5% y, muy
preferiblemente, es de más de aproximadamente 20% de la actividad
catalítica de la AHAS de tipo salvaje. Cuando el herbicida es un
herbicida de imidazolinona, la proteína variante de AHAS resistente
al herbicida tiene, preferiblemente:
- (i)
- una actividad catalítica en ausencia del herbicida de más de aproximadamente 20% de la actividad catalítica de la AHAS de tipo salvaje;
- (ii)
- una actividad catalítica que es relativamente más resistente a la presencia de herbicidas de imidazolinona en comparación con AHAS de tipo salvaje, y
- (iii)
- una actividad catalítica que es relativamente más sensible a la presencia de herbicidas de sulfonilurea en comparación con herbicidas de imidazolinona.
La presente invención proporciona además DNA
aislado que codifica proteínas variantes de acetohidroxiácido
sintasa, proteínas variantes que comprenden una proteína de AHAS
modificada por
(i) sustitución de al menos un resto de
aminoácido diferente de un resto de aminoácido de la secuencia de la
Figura 1 seleccionado entre M53, R128, F135 y cualquier combinación
de cualquier de los anteriores.
En este sistema de numeración el resto nº. 12
corresponde al término amino putativo de la proteína madura, esto
es, después de la eliminación de un péptido que apunta la diana de
cloroplasto.
Las modificaciones anteriores están dirigidas a
alterar la capacidad de un herbicida basado en imidazolinona y/o
sulfonilurea para inhibir la actividad enzimática de la proteína. En
una realización preferente, el DNA aislado codifica una variante de
AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o
sulfinilurea. También se proporcionan vectores de DNA que comprenden
DNA que codifica estas variantes de AHAS, las propias proteínas de
AHAS variantes, y células, crecidas in vivo o en cultivos de
células, que expresan las variantes de AHAS o comprenden estos
vectores.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento para conferir resistencia a un
herbicida basado en imidazolinona y/ sulfonilurea en una célula o en
unas células y, en particular, una célula o unas células de plantas,
como puede ser en una semilla. Se muta un gen de AHAS,
preferiblemente el gen de AHAS de Arabidopsis thaliana, para
alterar la capacidad de un herbicida basado en imidazolinona y/o
sulfonilurea de inhibir la actividad enzimática de la AHAS. El gen
mutante se clona en un vector de expresión compatible y el gen se
transfiere a una célula sensible a un herbicida basado en
imidazolinona y/o sulfonilurea en condiciones bajo las cuales se
expresa a niveles suficientes para conferir a la célula resistencia
a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea.
También se contemplan procedimientos para el
control de malas hierbas, en los que se trata un cultivo que
contiene un gen de AHAS resistente a un herbicida basado en
imidazolinona y/o sulfonilurea de acuerdo con la presente invención,
con una cantidad efectiva del herbicida para controlar las malas
hierbas.
La presente invención abarca el diseño racional
o el modelado molecular basado en la estructura de versiones
modificadas de la enzima AHAS y AHAS que inhiben herbicidas basados
en imidazolinona y/o sulfonilurea. Estas enzimas modificadas
(proteínas variantes de AHAS) son resistentes a la acción de
herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea. La presente
invención abarca también DNAs que codifican estas variantes,
vectores que incluyen estos DNAs, las proteínas variantes de AHAS y
células que expresan estas variantes. Adicionalmente se proporcionan
procedimientos para producir resistencia a herbicidas basados en
imidazolidinona y/o sulfonilurea en plantas por expresión de estas
variantes y procedimientos de control de las malas hierbas. El DNA y
las variantes de AHAS de la presente invención se descubrieron en
estudios basados en el modelado molecular de la estructura de las
AHAS.
Las variantes de AHAS resistentes a herbicidas
basados en imidazolinona y/o sulfonilurea de acuerdo con la presente
invención son útiles por conferir resistencia a herbicidas basados
en imidazolinina y/o sulfonilurea en plantas y se pueden diseñar con
el modelo de POX.
Las técnicas de modelado molecular (y en
particular, el modelado de homología de proteínas) pueden
proporcionar una comprensión de la estructura y la actividad de una
proteína dada. El modelo estructural de una proteína se puede
determinar directamente a partir de datos experimentales tales como
cristalografía de rayos X, indirectamente por modelado de la
homología o una característica similar, o mediante combinación de
ambos procedimientos (véase White y otros, Annu. Rev. Biophys.
Biomol. Struct., 23:349, 1994). La elucidación de la estructura
tridimensional de AHAS proporciona una base para el desarrollo de un
esquema racional de la mutación de restos de aminoácidos
particulares dentro de la AHAS que confieren al polipéptido
resistencia a los herbicidas.
El modelado molecular de la estructura de AHAS
de Zea Mays, usando como molde la estructura cristalina
obtenida por rayos X de la piruvato oxidasa (POX) afín de
Lactobacillus plantarum proporciona un modelo tridimensional
de la estructura de AHAS que es útil para el diseño de variantes de
AHAS resistentes a herbicidas o AHAS que inhiben herbicidas. Este
procedimiento de modelado aprovecha el hecho de que AHAS y POX
comparten varias características bioquímicas y que pueden derivarse
de un gen ancestral común (Chang y otros, J. Bacteriol. 170:3937,
1988).
Se describe detalladamente más adelante la
derivación de un modelo usando gráficos y alineamientos moleculares
interactivos. La estructura tridimensional de AHAS que resulta de
este procedimiento predice la organización espacial aproximada del
sitio activo de la enzima y del sitio o bolsa de unión de
inhibidores tales como herbicidas, entre los que están incluidos los
herbicidas de imidazolinona, aunque no únicamente. El modelo se
afina luego y se reinterpreta basándose en estudios bioquímicos que
también se describen más adelante.
El modelado de la homología de proteínas
requiere el alineamiento de la secuencia primaria de la proteína en
estudio con una segunda proteína cuya estructura cristalina es
conocida. Para el modelado de la homología de AHAS se escogió la
piruvato oxidasa (POX) porque la POX y la AHAS comparten varias
características bioquímicas. Por ejemplo, ambas, AHAS y POX,
comparten aspectos de los mecanismos de la reacción enzimática, así
como requerimientos en cuanto a cofactor y metal. En ambas enzimas,
para la actividad enzimática se requieren pirofosfato de tiamina
(TPP), dinucleótido de flavina adenina (FAD) y un catión divalente.
El FAD media una reacción rédox durante la catálisis en la POX pero,
presumiblemente, tiene sólo una función estructural en la AHAS, que
posiblemente es resto vestigio de la evolución de la evolución de
AHAS desde POX. Ambas enzimas utilizan piruvato como sustrato y
forman pirofosfato de hidroxietiltiamina como intermedio de reacción
estable (Schloss, J.V. y otros, en Biosynthesis of branched chain
amino acids, Barak, Z.J.M., Chipman, D.M., Schloss, J.V. (eds.)
VCH Publishers, Weinheim, Alemania, 1999).
Adicionalmente, la actividad de AHAS está
presente en proteínas quiméricas de POX-AHAS que
constan de la mitad N-terminal de POX y la mitad
C-terminal de AHAS, y hay un grado pequeño de
actividad de AHAS exhibido por la propia POX. AHAS y POX también
presentan propiedades similares en solución (Risse, B. y otros,
Protein Science, 1: 1699 y 1710, 1992; Singh, B.K. y Schmitt, G.K.
(1989), FEBS Letters, 258: 113; Singh, B.K. y otros (1989), en
Prospects for Amino Acid Biosynyhesis Inhibitors in Crop
Protection and Pharmaceutical Chemistry, (Lopping, L.G. y otros,
eds., HCPC Monograph p- 87). Al aumentar la concentración de
proteína, tanto la POX como la AHAS experimentan transiciones
escalonadas de monómeros a dímeros y tetrámeros. Los aumentos de la
concentración de FAD inducen también órdenes más altos del conjunto
subunidad. La forma tetrámera de ambas proteínas es muy estable al
calor y la desnaturalización química.
Además, la estructura cristalina de POX de
Lactobacillus planarum ha sido resuelta por Muller y otros,
Science 259:965, 1993. Los autores de la presente invención
encontraron que, en parte sobre la base del grado de homología
física, bioquímica y genética entre AHAS y POX, se puede usar la
estructura cristalina de POX obtenida por rayos X como punto
estructural de partida para el modelado de la homología de la
estructura de AHAS.
Sin embargo, las secuencias de AHADS y POX de
L. plantarum no eran suficientemente similares para un
alineamiento completamente computarizado. Globalmente, sólo
aproximadamente 20% de los átomos son idénticos, mientras que
aproximadamente 50% de los restos son de clase similar (esto es,
ácidos, básicos, aromáticos, etc.). Sin embargo, si se comparan las
secuencias respecto a las clasificaciones de restos hidrófilos e
hidrófobos, casan más de 500 de los 600 aminoácidos. Las
predicciones de la estructura secundaria de AHAS (Holley y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:152, 1989) revelaron una fuerte
similitud con la estructura secundaria real de POX. Para casi el 70%
de los restos, la estructura secundaria de AHAS predicha casa con la
de POX.
Los monómeros de POX están constituidos por tres
dominios, teniendo todos ellos una hoja \beta central, paralela
con pasos superiores que están constituidos por hélices \alpha y
unos lazos grandes. (Muller y otros, Science, 259:965, 1993). La
topología de las hojas difiere entre los dominios, esto es, en los
dominios primero y tercero, las cadenas están unidas
a la hoja \beta en la secuencia 2-1-3-4-6-5, mientras que en la hoja \beta del segundo dominio, la secuencia lee 3-2-1-4-5-6.
a la hoja \beta en la secuencia 2-1-3-4-6-5, mientras que en la hoja \beta del segundo dominio, la secuencia lee 3-2-1-4-5-6.
Los alineamientos generados con ordenador
estaban basados en la predicción de la estructura secundaria y la
homología de secuencia. Se usó el procedimiento convencional de
alineamiento de secuencia pareada descrito por Needleman y Wunch, J.
Mol. Biol., 48:443, 1970. Se alinearon dos secuencias para maximizar
la puntuación del alineamiento. La puntuación de alineamiento
(puntuación de la homología) es la suma de puntuaciones de todos los
pares de restos alineados más una sanción opcional por la
introducción de brechas en el alineamiento. La puntuación del
alineamiento de un par de restos es un valor entero tabulado. El
sistema de puntuación de la homología está basado en la observación
de la frecuencia de la divergencia entre un par dado de restos. (MO
Dayhoff, RM Schwartz y BC Orcutt, Atlas of Protein Sequence and
Sructure, vol. 5, supl. 3, págs. 345-362, 1978).
Los alineamientos se afinaron más mediante
brechas de redisposición de manera que se conservaran estructuras
secundarias regulares continuas. Las sustituciones de aminoácidos
generadas por evaluación de esquemas de probable alineamiento se
compararon mediante gráficos moleculares interactivos. Se escogieron
los alineamientos con las sustituciones más conservadoras con
respecto a la funcionalidad particular de los aminoácidos dentro de
un sitio dado. En la Figura 2 se representa el alineamiento final de
los aminoácidos de POX y AHAS. Se identificaron conjuntos
conservados de restos, en particular para el sitio de unión de TPP y
para partes del sitio de unión de FAD. El alineamiento reveló una
gran similitud entre AHAS y POX para el primer dominio, para la
mayoría de las partes del segundo dominio y para aproximadamente la
mitad del tercer dominio. Se esperaba que la mayoría de las regiones
que se alinearon malamente y pueden plegar de forma diferente en POX
y AHAS estuviera en la superficie de la proteína y no estuviera
implicada en el cofactor de unión del inhibidor. La predicción de
los sitios de mutación no está afectada sustancialmente por pequeños
desplazamientos en el alineamiento.
La mayoría de los restos de unión de TPP está
altamente conservados entre POX y AHAS (por ejemplo,
P48-G49-G50). En algunos casos, los
restos que estaban próximos a TPP difieren entre POX y AHAS pero
permanecen dentro de una región que está altamente conservada (por
ejemplo, restos 90-110). Por otra parte, el sitio de
unión de FAD parecía menos conservado. Aunque algunos sitios de
unión de FAD estaban fuertemente conservados, (por ejemplo,
D325-I326-D327-P328),
otros se diferenciaban claramente entre AHAS y POX (por ejemplo, los
restos en el lazo de las posiciones 278 a 285 no son homólogos). Un
análisis detallado reveló que, al menos para algunos de los sitios
de contacto menos conservados, las interacciones estaban mediadas
por el espinazo del polipéptido más bien que por las cadenas
laterales. Por tanto, la conservación se requería sólo para el
pliegue del polipéptido y no se requería para la secuencia de
aminoácidos (por ejemplo, el espinazo de los restos
258-263 une la cadena de robitol de FAD). La mitad
de los sitios de unión de la adenina y la isoaloxazina se diferencia
claramente.
Después de alinear la estructura primaria, se
construyó un modelo de homología por transposición de secuencias de
aminoácidos de AHAS en la estructura del molde de POX. Se
construyeron coordenadas por defecto escalonadamente usando moldes
de aminoácidos para completar cadenas laterales indefinidas. Se usó
la investigación de bancos de datos y la minimización energética de
partes pequeñas de la molécula para completar las conformaciones de
regiones indefinidas de lazo. Los cofactores TPP y FAD se modelaron
en sus bolsas de unión. Este modelo se sometió a una minimización
completa de energía a 5000 ciclos. Todo el modelado con ordenador se
realizó en una estación de trabajo IRIS Indigo Elan R4000 de
Silicon Graphics Co. El modelado interactivo y la minimización de
energía se realizaron usando Quanta/CHERMm 4.0 de Molecular
Simulationes Inc. Durante esta etapa, la conformación era estable,
lo que indicaba que no se habían presentado interacciones
fuertemente desfavorecidas tales como, por ejemplo, contactos
próximos a van der Waals. Los resultados se presentan
esquemáticamente en la Figura 3.
La inspección de la estructura de AHAS modelada
descrita antes reveló que la mayor parte de la proteína se pliega
con un espinazo que es energéticamente razonable, siendo accesible
al disolvente la mayor parte de las cadenas laterales hidrófilas. La
superficie de las hojas \beta es suave y acomoda las regiones de
paso por encima que están unidas a las hojas.
Se generó un modelo para AHAS dímera por
duplicación de coordenadas de la AHAS monómera de energía minimizada
y sobreponiendo las dos copias en dos unidades de POX usando pares
de coordenadas de C\alpha según se define en el esquema de
alineamiento. La cadena de polipéptido de AHAS se pliega entre
dominios plegados similarmente compuestos por un núcleo de hoja
\beta paralela de seis cadenas rodeado de "lazos" largos y
hélices \alpha. Dos unidades están unidas de manera que el primer
dominio de una subunidad está muy próximo a los dominios 2 y 3 de la
otra subunidad que unen el cofactor. Entre las subunidades queda en
este sitio un espacio lleno de disolvente. Esta bolsa, que queda
delimitada por la confluencia de los tres dominios, es el sitio de
entrada propuesto para el sustrato. También es el sitio de unión
propuesto para herbicidas basados en imidazolinona y/o
sulfonilurea.
La superficie interior de la mencionada bolsa de
unión está perfilada por los cofactores. El tiazol de TPP está
situado en el fondo de la bolsa. El dominio 3 contribuye a la
superficie interior de la bolsa con una hélice \alpha corta que
dirige su eje hacia el pirofosfato del TPP, compensando las cargas
de fosfato con su momento dipolar. Esta hélice crítica, que comienza
con G498, un resto "paso" en contacto próximo con TPP y que
termina en G498, contiene tres sitios de mutación conocidos para la
resistencia a la sulfonilurea: V500, W503 y F507. (Véanse patentes
U.S. nº. 5.013.659, nº. 5.141.870 y nº. 5.378.824). En el dominio 1,
el lazo definido como P48-S52 (entre la
\beta-cadena 2 y la
\alpha-hélice 2) se enfrenta a W503, una mutación
en la que confiere resistencia a imidazolinonas. Los restos Y47 a
G50 también están en contacto con TPP. Este lazo es adyacente a
P184-Q189, otro paso, que conecta la última cadena
de la hoja \beta del dominio 1 con una cadena \beta que conecta
con el dominio 2. Dentro de la bolsa, cerca de su entrada, hay una
región alargada del dominio 1 que interacciona con una extensión
complementaria del dominio 2. Los restos 125-129 y
133-137 del dominio 1 y los restos
304-313 del dominio 2 están en la superficie de la
bolsa. Un paso constituido por T96-G100 está entre
el lazo 125-129 y TPP. En el extremo opuesto de la
bolsa hay otra extensión del dominio 3 y dos regiones del dominio 2
que alinean la bolsa de unión. Los restos 572, 575, 582 y 583 del
dominio 3 delimitan la superficie de la bolsa en un lado. La parte
restante del interior de la superficie de la bolsa está delimitada
por FAD y por un lazo, L278-G282, que tiene contacto
con el anillo de isoaloxazina de FAD.
Se puso imazetapir, la imidazolinona activa de
PURSUIT®, en su sitio de unión propuesto usando un gráfico molecular
interactivo (Figura 4) y el soporte lógico descrito antes (Figura
4). Se escogió K185 como un "anclaje" para interaccionar con la
carga del grupo carboxilo. La unidad NH-CO de
imidazolinona se situó para formar uniones de hidrógeno a G50 y A51.
Esto puso el sustituto metilo de imazetapir próximo a V500 en el
espinazo de la hélice \alpha pequeña. Posiblemente, el grupo
isopropilo está unido a restos hidrófobos de los aminoácidos en la
región de los restos 125-135 que contribuyen a la
superficie interior de la bolsa. Muy probablemente, el anillo de
piridina está "intercalado" entre A134 o F135, F507 y W503.
W503 también interactúa con el sistema anular de la
imidazolinona.
De manera similar, los herbicidas de
sulfonilurea se modelaron en un sitio que se solapaba en parte con
el sitio de unión de imidazolinona descrito. El solapamiento de los
sitios de unión de la sulfonilurea y la imdazolinona era consistente
con experimentos de unión con competición y con los datos mutantes
establecidos, lo que revela que la misma mutación en el maíz, W503L,
puede conferir resistencia a ambos herbicidas. En estos modelos, la
mayoría de los sitios de mutación conocidos que confieren
resistencia a herbicidas de sulfonilurea, esto es, G50, A51, K185,
V500, W503, F507, está en contacto íntimo con los herbicidas unidos.
P126 y A51 son requeridos para mantener en su sitio la cadena
lateral de K185 generando un poro hidrófobo. S582, un sitio para
resistencia específica a la imidazolinona, está alejado de la región
de unión y está situado en le región en la que la homología es tan
baja que es de esperar un cambio del pliegue. Aparentemente, el
sitio de unión de FAD tiene una homología baja entre AHAS y POX en
esta región; S582 es un resto que confiere resistencia en el maíz y
S582 y sus restos adyacentes están en contacto íntimo con la bolsa
del sitio activo. Se propone que FAD y la región del lazo que
abarca los restos 278 a 285 se separen ligeramente del tercer
dominio (hacia abajo en la Figura 4) y que un lazo que contiene S582
se pliegue al espacio entre la hélice en las posiciones 499 a 507 y
el lazo en las posiciones 278 a 285. D305, otro sitio de resistencia
conocido, está próximo a FAD y modula la interacción entre los
dominios 1 y 2. M280 puede estar implicado en situar la hélice en
las posiciones 498 a 507 o directamente en unir un inhibidor. M280 y
D305 podrían también estar implicados directamente en unir un
inhibidor si los dominios 1 y 2 se acercaran entre sí ligeramente
más próximos.
Los restos de aminoácidos específicos están
indicados precisamente como sitios para la introducción de
mutaciones en la secuencia primaria de AHAS. Estos aminoácidos se
seleccionan sobre la base de su posición en la que, si se modifica
la posición ese aminoácido, habrá una alteración resultante (esto
es, una caída) de la afinidad del herbicida a la bolsa de unión. No
es necesario que la posición de mutación resida en la bolsa de
unión, puesto que restos de aminoácidos fuera de la propia bolsa
pueden alterar la carga o la configuración de la bolsa. La selección
de sitios diana para mutación se consigue usando modelos moleculares
como se ha descrito antes. Por ejemplo, de acuerdo con el modelo
anterior, se sitúa arginina de la posición 128 (designada R128 en la
Figura 1 usando el código de letra individual para los aminoácidos)
cerca de la entrada a la bolsa de unión al sustrato y la bolsa de
unión al herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea y tiene
un grado alto de libertad de conformación que permite que participe
en el transporte de herbicidas cargados a la bolsa de unión. Por
tanto, este resto se sustituye por alanina para eliminar su carga y
su cadena lateral hidrófoba larga. La mutación resultante se designa
R128A.
Las mutaciones pueden comprender sustituciones
simples que reemplazan la secuencia de tipo salvaje con cualquier
otro aminoácido. Alternativamente, las mutaciones pueden comprender
supresiones o adiciones de uno o varios aminoácidos, preferiblemente
hasta 5 aminoácidos, en un sitio dado. La secuencia añadida puede
comprender una secuencia de aminoácidos que se sabe que existe en
otra proteína, o puede comprender una secuencia completamente
sintética. Además, en un polipéptido individual se pueden introducir
más de un aminoácido y/o más de un tipo de mutación.
El DNA que codifica AHAS se puede manipular de
manera que se introduzcan las mutaciones deseadas. La mutagénesis se
realiza usando procedimientos que son convencionales en la técnica
según se describe, por ejemplo, por Higuchi, R., Recombinant
PCR, en PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications, Innis M.A. y otros, eds., Academic Press. Págs.
177-183, 1990.
La secuencia de AHAS mutada o variante se clona
en un vector de expresión de DNA (véase, por ejemplo, Ejemplo 3) y
se expresa en una célula adecuada tal como, por ejemplo, E.
coli. Preferiblemente, el DNA que codifica AHAS se une a un
elemento regulador de transcripción y la AHAS variante se expresa
como parte de una proteína de fusión, por ejemplo,
glutationa-S-transferasa, para
facilitar la purificación (véase el Ejemplo 3 más adelante.) La AHAS
variante se purifica luego por cromatografía de afinidad o por
cualquier otro procedimiento conocido en la técnica.
"Purificación" de un polipéptido de AHAS se refiere al
aislamiento del polipéptido de AHAS en una forma que permite medir
su actividad enzimática sin interferencias de otros componentes de
la célula en la que se expresa el polipéptido.
La AHAS purificada se puede ensayar en cuanto a
una o varias de las propiedades siguientes:
(a) actividad específica o catalítica para
la conversión de piruvato en acetolactato (expresada como
unidades/mg de AHAS pura, definiéndose una unidad de actividad como
1 \mumol de acetolactato producido/hora), o para la condensación
de piruvato y 2-cetobutirato para formar
acetohidroxibutirato (expresada como unidades/mg de AHAS pura,
definiéndose una unidad de actividad como 1 \mumol de
acetohidroxibutirato producido/hora;
(b) nivel de inhibición por un herbicida
basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, por ejemplo, imidazolinona
(expresada como IC_{50}, la concentración a la que se inhibe el
50% de la actividad de la enzima), y
(c) selectividad de la resistencia al
herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea frente a otros
herbicidas. El índice de selectividad se define como la resistencia
al plegado del mutante a imidazolinonas en relación a la enzima de
tipo salvaje dividida por la resistencia al plegado del mismo
mutante a otros herbicidas también en relación a la del tipo
salvaje. La resistencia al plegado a un herbicida en relación a la
enzima de tipo salvaje se expresa como la IC_{50} de la variante
dividida por la IC_{50} del tipo salvaje. Por tanto, el índice de
selectividad (S.I.) se representa por la ecuación siguiente:
S.I. =
\frac{IC_{50} de \ la \ variante \ para \ el \ herbicida \
A/IC_{50} \ del \ tipo \ salvaje \ para \ el \ herbicida \
A}{IC_{50} \ de \ la \ variante \ para \ el \ herbicida \ B/IC_{50}
\ del \ tipo \ salvaje \ para \ el \ herbicida \
B}
Los sistemas de ensayo adecuados para hacer
estas determinaciones incluyen aunque no únicamente, los descritos
detalladamente en el siguiente Ejemplo 4.
Las propiedades enzimáticas de polipéptidos de
AHAS variantes se comparan con las de AHAS de tipo salvaje.
Preferiblemente, una mutación dada da por resultado un polipéptido
de AHAS variante que retiene in vitro la actividad enzimática
hacia piruvato o piruvato y 2-cetobutirato, esto
es, la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación
de piruvato y 2-cetobutirato para formar
acetohidroxibutirato (y por ello se espera que sea biológicamente
activa in vivo), mientras que tiene una actividad catalítica
que es relativamente más resistente al (los) herbicida(s)
seleccionado(s) que la de AHAS de tipo salvaje.
Preferiblemente, la AHAS variante exhibe:
(i) en ausencia del herbicida basado en
imidazolinona y/o sulfonilurea presente como mínimo,
- (a)
- sola, una actividad catalítica suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa; o
- (b)
- en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a herbicidas también expresada en la célula, que puede ser la misma proteína variante de AHAS o una diferente, una actividad catalítica suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa,
- en la que la célula requiere la actividad de AHAS para su viabilidad, y
(ii) una actividad catalítica que es más
resistente al herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea
presente como mínimo que la AHAS de tipo salvaje,
y que es relativamente más resistente al (los)
herbicida(s) basado(s) en imidazolinona y/o
sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje.
Por tanto, una proteína cualquiera variante
específica de AHAS no necesita tener la actividad catalítica total
necesaria para mantener la viabilidad de la célula, sino que debe
tener alguna actividad catalítica en una cuantía, sola o en
combinación con la actividad catalítica de copias adicionales de la
misma variante de AHAS y/o la actividad catalítica de otra(s)
proteína(s) variante(s) de AHAS, suficiente para
mantener la viabilidad de una célula que requiere la actividad de
AHAS para su viabilidad. Por ejemplo, la actividad catalítica se
puede aumentar a niveles mínimos aceptables en la célula,
introduciendo en la célula múltiples copias de un gen que codifica
una variante o introduciendo el gen que además incluye un promotor
relativamente fuerte para intensificar la producción de la
variante.
Más resistente significa que la actividad
catalítica de la variante es disminuida por el (los)
herbicida(s) basado(s) en imidazolinona y/o
sulfonilurea, si disminuye, en un grado menor que el grado en que es
disminuida por el (los) herbicida(s) basado(s) en
diazolinona y/o sulfonilurea la actividad catalítica de AHAS de tipo
salvaje. Una variante preferida de AHAS más resistente retiene la
actividad catalítica suficiente para mantener la viabilidad de una
célula, una planta o un organismo en el que la misma concentración
del (los) mismo(s) herbicida(s) basados(s) en
imidazolinona y/o sulfonilurea no retendría suficiente actividad
catalítica para mantener la viabilidad de la célula, la planta o el
organismo.
Preferiblemente, la actividad catalítica en
ausencia de herbicida(s) basado(s) en imidazolinona
y/o sulfonilurea es como mínimo de aproximadamente 5% y, muy
preferiblemente, es de más de aproximadamente 20% de la actividad
catalítica de la AHAS de tipo salvaje en ausencia de
herbicida(s) basado(s) en diazolinona y/o
sulfonilurea. Las variantes de AHAS muy preferidas son más
resistentes a herbicidas de imidazolinona que otros herbicidas tales
como los herbicidas basados en sulfonilurea, aunque en algunas
aplicaciones ni son necesarias ni preferidas.
En el caso de una AHAS variante resistente a
imidazolinona, se prefiere que la proteína de la variante de AHAS
tenga:
(i) una actividad catalítica en ausencia
del mencionado herbicida de más de aproximadamente 20% de la
actividad catalítica de la mencionada AHAS de tipo salvaje;
(ii) una actividad catalítica que es
relativamente más resistente a la presencia de herbicidas de
imidazolinona en comparación con la de AHAS de tipo salvaje, y
(iii) una actividad catalítica que es
relativamente más sensible en presencia de herbicidas de
sulfonilurea en comparación con la de herbicidas de imidazolinona.
La mayoría de variantes de AHAS muy preferidas resistentes a
herbicidas presentan una actividad específica mínima de
aproximadamente 20 unidades/mg, una inhibición mínima o ninguna
inhibición por la imidazolinona y un índice de selectividad que
varía de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 3000 en relación a
otros herbicidas.
Sin que ello suponga un condicionamiento
teórico, se cree que la aplicación sistemática e iterativa de este
procedimiento para proteína de AHAS de tipo salvaje y otras AHAS
diana dará por resultado la producción de variantes de AHAS que
tienen las propiedades deseadas de una alta actividad enzimática
según se ha explicado antes y resistencia a una clase o varias
clases de herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea. Por
ejemplo, la mutación de una secuencia de AHAS de tipo salvaje en una
posición particular a un aminoácido dado puede dar por resultado un
mutante que exhibe un grado alto de resistencia a herbicidas basados
en imidazolinona y/o sulfonilurea, pero que tiene una pérdida
significativa de actividad enzimática a piruvato y
2-cetobutirato. En una segunda aplicación del
procedimiento anterior, el polipéptido de AHAS de partida o diana
sería luego esta variante (en vez de la AHAS de tipo salvaje). El
diseño racional implica luego la sustitución de otros aminoácidos en
la posición originalmente mutada y/o la adición o supresión de
aminoácidos en puntos o intervalos seleccionados en espera de que se
retenga la resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o
sulfonilurea pero que se mantenga un nivel más alto de actividad
enzimática.
El diseño racional basado en la estructura de
proteínas de AHAS resistentes a herbicidas basados en imidazolinona
y/o sulfonilurea ofrece muchas ventajas sobre otros enfoques que
descansan en mutagénesis al azar y selección. Por ejemplo, cuando la
sustitución de un aminoácido particular con otro requiere la
sustitución de más de un nucleótido en el codón, la probabilidad de
que esto se produzca al azar es tan baja, que es impracticable. A
diferencia, se pueden realizar fácilmente incluso cambios dobles o
triples en la secuencia de nucleótido dentro del codón cuando lo
sugieren criterios de diseño racional. Por ejemplo, una mutación
diseñada racionalmente para conferir resistencia selectiva a
imidazolinona requiere un cambio de arginina a glutamato. La
arginina es codificada por CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG, mientras
que el glutamato es codificado por GAA y GAG. Puesto que ninguno de
los codones de la arginina comienza con GA, esta mutación requeriría
una doble sustitución de nucleótidos adyacentes que se produciría
tan raramente usando mutagénesis al azar que sería impredecible e
irrepetible con un cierto éxito. Aunque la frecuencia de mutación se
puede aumentar durante la mutagénesis al azar, las alteraciones de
la secuencia tendrían una probabilidad igual de que se presentaran
en el gen de AHAS, en ausencia de una anterior dirección al sitio de
las mutaciones. Esto aumenta la probabilidad de obtener una mutación
irrelevante que interfiere con la actividad enzimática.
Análogamente, sería raro, usando mutagénesis al azar, encontrar una
mutación por sustitución, supresión o sustitución/supresión de
múltiples aminoácidos que confiriera resistencia a herbicidas
basados en imidazolinona y/o sulfonilurea a la vez que se mantiene
la actividad catalítica. Serían también improbables, usando un
enfoque de mutagénesis al azar, mutaciones por supresión que
confirieran resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o
sulfonilurea. Sería necesario que las supresiones estuvieran
limitadas a regiones pequeñas y tendrían que presentarse en
tripletes de manera que retuvieran el marco de lectura de AHAS con
el fin de retener la actividad
enzimática.
enzimática.
Sin embargo, con un criterio racional basado en
la estructura, las mutaciones por sustitución y/o supresión de
aminoácidos se logran fácilmente y se apuntan como dianas con
precisión. Además, diferentes mutagenes usados en la mutagénesis al
azar crean tipos específicos de mutaciones. Por ejemplo, la azida
sódica crea mutaciones por sustitución puntual en plantas, mientras
que la radiación tiende a crear supresiones. Consecuentemente,
tendrían que emplearse dos protocolos de mutagénesis para obtener
una combinación múltiple de sustitución/supresión.
Finalmente, el presente procedimiento basado en
la estructura para el diseño racional de variantes de AHAS
resistentes a herbicidas permite la mejora iterativa de mutaciones
de resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o
sulfonilurea, una etapa que no es facilitada por la mutagénesis al
azar. La identificación de un sitio de mutación para resistencia a
herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea por mutagénesis
al azar puede ofrecer un valor pequeño, si ofrece alguno, para guiar
más mejoras en las características del mutante. El presente enfoque
basado en la estructura, por otra parte, permite implantar mejoras
basadas en la posición, el medio y la función de la posición de
aminoácidos en el modelo estructural.
El procedimiento de mejora iterativa también
permite la manipulación independiente de tres propiedades
importantes de AHAS: nivel de resistencia, selectividad de la
resistencia y eficiencia catalítica. Por ejemplo, se pueden diseñar
de forma predictiva mutaciones compensatorias. Si una mutación
particular tiene un efecto perjudicial sobre la actividad de una
enzima, para restaurar la actividad se puede usar una segunda
mutación compensatoria. Por ejemplo, se puede compensar
introduciendo una segunda mutación, un cambio de la carga neta
dentro de un dominio cuando se introduce o se pierde un resto
cargado debido a una mutación. La predicción de la posición y el
tipo de resto(s) a introducir, suprimir o sustituir en un
segundo sitio con el fin de restablecer la actividad enzimática
requiere el conocimiento de las relaciones de
estructura-función derivadas de un modelo tal como
el descrito aquí.
La presente invención abarca también moléculas
de DNA aisladas que codifican polipéptidos de AHAS variantes
resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea.
Los genes que codifican polipéptidos de AHAS de acuerdo con la
presente invención pueden derivar de cualquier especie y
preferiblemente de especies de plantas, y las mutaciones que
confieren resistencia a los herbicidas basados en imidazolinona y/o
sulfonilurea se pueden introducir en posiciones equivalentes dentro
de cualquiera de estos genes de AHAS. La equivalencia de una
posición de codón dada en diferentes genes de AHAS es función de la
conservación de la secuencia primaria de aminoácidos y su proteína
y la retención de la estructura tridimensional similar. Por ejemplo,
la Figura 5 ilustra el alto grado de homología de secuencia entre
polipéptidos de AHAS derivados de diferentes especies de plantas.
Estos polipéptidos de AHAS presentan como mínimo de aproximadamente
60% a aproximadamente 70% de homología global. Sin que eso
signifique un condicionamiento teórico, se cree que la conformación
de la cadena de polipéptido se conservará también en las regiones
del polipéptido que tienen una secuencia altamente conservada. Así,
es posible usar una secuencia que codifica AHAS de una especie para
modelado molecular para introducir previsiblemente mutaciones en un
gen de AHAS de una segunda especie para ensayo inicial y mejora
iterativa y, finalmente, para introducir mutaciones optimizadas en
AHAS derivada de una tercera especie de planta para expresión en una
planta transgénica.
En una serie de realizaciones, estos DNAs de
AHAS codifican variantes de un polipéptido de AHAS y preferiblemente
del polipéptido de AHAS de maíz de la Figura 1, en la que el
polipéptido es modifica por sustitución o supresión de restos de
aminoácidos.
La presente invención abarca DNA y las
correspondientes secuencia de RNA, así como secuencias de sentido y
antisentido. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican
polipéptidos de AHAS pueden estar flanqueadas por secuencias
reguladoras naturales de AHAS, o pueden estar asociadas con
secuencias heterólogas, incluidos promotores, agentes de
intensificación, elementos de respuesta, secuencias de señalización,
secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificadoras
de 5'- y 3'-, etc. Además, los ácidos nucleicos se pueden modificar
para alterar la estabilidad, la solubilidad. La afinidad y la
especifidad. Por ejemplo, se pueden metilar selectivamente AHAS
variantes que codifican secuencias. Las secuencias de ácidos
nucleicos de la presente invención también se pueden modificar con
una marca capaz de proporcionar una señal detectable, directa o
indirectamente. Entre los ejemplos de marcadores están incluidos
radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina, etc.
La invención proporciona también vectores que
comprenden ácidos nucleicos que codifican variantes de AHAS. Se han
descrito numerosos vectores, incluidos vectores de plásmidos y de
hongos para expresión en una variedad de huéspedes eucarióticos y
procarióticos. Los vectores pueden incluir también ventajosamente un
promotor operativamente unido a la porción que codifica AHAS. La
AHAS codificada puede expresarse usando cualesquier vectores
adecuados y células huésped, por procedimientos descritos o citados
aquí o conocidos por los expertos en la técnica relevante. Entre los
ejemplos de vectores adecuados están incluidos, aunque no
limitativamente, vectores basados en pBIN, vectores pBluescript y
vectores pGEM.
La presente invención también abarca
polipéptidos de AHAS variantes resistentes a ambos herbicidas o
fragmentos peptídicos de ellos. Como se ha explicado antes, los
polipéptidos de AHAS variantes pueden derivar del polipéptido
principal de maíz representado en la Figura 1 o de cualquier planta
o polipéptido microbiano de AHAS, preferiblemente cualquier
polipéptido de AHAS de plantas. Los polipéptidos se pueden modificar
más mediante, por ejemplo, fosforilación, sulfatación, acilación,
glicosilación u otras modificaciones de proteínas. Los polipéptidos
se pueden aislar de plantas o de organismos heterólogos o células
(incluidas, aunque no únicamente, células de bacterias, levaduras,
insectos, plantas y de mamífero) en los que se ha introducido y
expresado el gen que codifica un polipéptido de AHAS variante.
Además, los polipéptidos de AHAS se pueden modificar con un marcador
capaz de proporcionar una señal detectable, directa o
indirectamente, incluidos radioisótopos, compuestos fluorescentes,
etc.
La presente invención abarca células
transgénicas, incluidas, aunque no únicamente, semillas, organismos
y plantas en las que se han introducido genes que codifican
variantes de AHAS resistentes a herbicidas basados en imidazolinona
y/o sulfonilurea. En la Tabla 1 se dan ejemplos no limitativos de
plantas receptoras adecuadas.
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La expresión de los polipéptidos de AHAS
variante en plantas transgénicas confiere un nivel de resistencia
alto a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea,
incluido imazetapir (PURSUIT®), permitiendo el uso de estos
herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea durante el
cultivo de las plantas transgénicas.
Los procedimientos para introducir genes
foráneos en plantas son conocidos en la técnica. Entre los ejemplos
no limitativos de tales procedimientos están incluidos infección por
Agrobacterium, bombardeo de partículas, tratamiento de
protoplastos con polietilenglicol (PEG), electroporación de
protoplastos, microinyección, macroinyección, inyección de siembra,
paso de un tubo de polen, incorporación de semilla seca, perforación
con láser y electroforesis. Estos procedimientos son descritos, por
ejemplo, por B. Jenes y otros, y S.W. Ritchie y otros, en
Transgenic Plants, vol. 1, Enginering and Utilization,
ed. S.D. Kung, R. Wu, Academic Press, Inc., Harcourt Brace
Jovanovich 1993; y L. Mannonen y otros, Critical Reviews in
Biotechnology, 14:287-310, 1994.
En una realización preferente, el DNA que
codifica una AHAS variante se clona en un vector de DNA que contiene
un gen de marcador de resistencia a antibióticos, y el
AHAS-DNA que contiene el plásmido se introduce en
Agrobacterium tumefaciens que contiene un plásmido de Ti.
Este "sistema de vector binario" se describe en por ejemplo, la
patente U.S. nº. 4.490.838 y por An y otros en Plant Mol. Biol.
Manual A3:1-19 (1988). El Agrobacterium
transformado se cocultiva luego con discos de hojas de la planta
receptora para posibilitar la infección y transformación de las
células de la planta. Las células transformadas de la planta se
cultivan luego en el medio de regeneración, que promueve la
formación de vástagos, primeramente en presencia del antibiótico
apropiado para seleccionar células transformadas, luego en presencia
de herbicida. En células de plantas transformadas satisfactoriamente
con DNA que codifica AHAS resistente a herbicidas basados en
imidazolinona y/o sulfonilurea, la formación de vástagos se produce
incluso en presencia de niveles de un herbicida basado en
inidazolinona y/o sulfonilurea que inhiben la formación de vástagos
de células no transformadas. Después de confirmar la presencia de
DNA de AHAS variante usando, por ejemplo, el análisis por reacción
en cadena de polimerasa (PCR), las plantas transformadas se
ensayaron en cuanto a su capacidad de resistir la aplicación por
proyección de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea
y en cuanto a su capacidad para la germinación de semillas y la
iniciación de la raíz y la proliferación en presencia de
herbicida.
Los procedimientos y las composiciones de
presente invención se pueden usar en el diseño racional basado en la
estructura de variantes de AHAS resistentes a herbicidas basados en
imidazolinona y/o sulfonilurea, que se pueden incorporar en plantas
para conferir a las plantas una resistencia selectiva a herbicidas
basados en imidazolinona y/o sulfonilurea.
Los genes de AHAS resistente a herbicidas
basados en imidazolinona y/o sulfonilurea se pueden transformar en
cultivos en copias individuales o múltiples para conferir
resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea.
La ingeniería genética de especies de cultivos con una sensibilidad
reducida a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea
puede:
(1) aumentar el espectro y la flexibilidad
de aplicación de herbicidas basados en imidazolinona y/o
sulfonilurea, ambientalmente benignos;
(2) intensificar el valor comercial de
estos herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea;
(3) reducir la presión de malas hierbas en
campos de cultivo por uso efectivo de herbicidas basados en
imidazolinona y/o sulfonilurea sobre las especies de cultivos
resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea y
aumentar correspondientemente los rendimientos de las cosechas;
(4) aumentar las ventas de semillas de
plantas resistentes a herbicidas basados en imidazolinona y/o
sulfonilurea;
(5) aumentar la resistencia a daños de
cultivos debidos a la aplicación de herbicidas basados en
imidazoliniona y/o sulfonilurea en una plantación anterior;
(6) disminuir la susceptibilidad a cambios
en las características de herbicidas basados en imidazoliniona y/o
sulfonilurea debidos a condiciones climáticas adversas, y
(7) aumentar la tolerancia a herbicidas
basados en imidazolinona y/o sulfonilurea aplicados no
homogéneamente o mal aplicados.
Por ejemplo, se pueden cultivar plantas que
contienen proteínas de variantes transgénicas de AHAS. El cultivo se
puede tratar con el herbicida basado en imidazolinona y/o
sulfonilurea al que es resistente la planta transgénica de variante
de AHAS en una cantidad efectiva para controlar las malas hierbas,
lo que da por resultado el control de las malas hierbas en el
cultivo sin afectar perjudicialmente al cultivo.
Los vectores de DNA descritos antes que
codifican variantes de AHAS resistentes a herbicidas basados en
diazolinona y/o sulfonilurea se pueden utilizar de manera que la
expresión de la variante de AHAS proporcione un marcador
seleccionable para la transformación de las células por el vector.
Las células receptoras en cuestión pueden estar en un cultivo o
in situ y los genes de las variantes de AHAS pueden usarse
solos o en combinación con otros marcadores seleccionables. El único
requerimiento es que la célula receptora sea sensible a los efectos
citotóxicos del herbicida cognado. Esta realización se aprovecha
ventajosamente del bajo coste y la carencia de toxicidad de los
herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea, y se puede
aplicar en cualquier sistema que requiera una transformación mediada
por DNA.
Para la mutagénesis se seleccionaron restos
situados en la proximidad del sitio de unión del herbicida basado en
diazolinona y/o sulfonilurea con el fin de diseñar un polipéptido
activo de AHAS con una capacidad disminuida de unión del herbicida
basado en diazolinona y/o sulfonilurea. Cada sitio de la superficie
de la bolsa se consideró en términos de interacciones potenciales
con otros restos de la bolsa, así como con cofactores y herbicidas
basados en diazolinona y/o sulfonilurea. Por ejemplo, se esperaba
que la adición de resto(s) cargado(s) positivamente
interfiriera con la distribución de la carga dentro del sitio de
unión, dando por resultado una pérdida de la afinidad de unión del
herbicida basado en diazolinona y/o sulfonilurea.
Se identificaron tres restos como las dianas más
útiles para la mutagénesis:
(1) se consideró que F135 interacciona
con el anillo de isoaloxazina de FAD y con el grupo aromático de los
herbicidas. De acuerdo con la estrategia de introducir restos más
cargados en la bolsa de unión, este resto se cambió a arginina.
(2) M53 tiene contacto con la hélice
498-507. Esta hélice contiene sitios de mutación
conocidos de resistencia a herbicidas y también está implicada en la
unión de TPP. Además, se creía que la sustitución del ácido
glutámico en la posición 53 favorece una interacción con K185,
reduciendo la afinidad de K158 para el grupo carboxilato de
imazetapir.
(3) R128 está situado cerca de la entrada
a la bolsa, donde se creía que estaba implicado en el transporte
inicial a la bolsa de unión de herbicidas basados en diazolinona y/o
sulfonilurea cargados. Este resto se cambió a alanina para eliminar
tanto su carga como su cadena lateral hidrófoba larga.
El gen de AHAS de Arabidopsis se insertó
en marco al extremo 3' de la región de codificación del gen de
glutationa S-transferasa en el vector
pGEX-2T (Pharmacia). La construcción del vector de
esta manera mantenía la secuencia de reconocimiento de seis
aminoácidos de trombina en la unión de la proteína de fusión
expresada glutationa-S-transferasa
(GST)/AHAS. La digestión de trombina de la mencionada proteína de
fusión expresada da por resultado una proteína de AHAS con una
posición de partida N-terminal en el extremo del
péptido de tránsito en un sitio de tratamiento del péptido de
tránsito putativo, con una glicina N-terminal
residual derivada del sitio de reconocimiento de trombina. El
terminal final amino de la proteína de AHAS escindida está
constituida por
Gly-Ser-Ser-Ile-Ser.
En el gen de AHAS en este vector se introdujeron mutaciones
dirigidas al sitio.
Se construyeron mutaciones dirigidas al sitio de
acuerdo con el procedimiento de PCR de Higuchi (Recombinant
PCR. En PCR Protocols: A Guide to Methods and
Applications, por MA Innis y otros, Academic Press, San Diego,
págs. 177-183, 1990). Se amplificaron dos productos
de PCR, cada uno de los cuales solapa el sitio de mutación. Los
cebadores de la región de solapamiento contenían la mutación. Los
fragmentos amplificados de PCR de solapamiento se combinaron,
desnaturalizaron y se dejó que se reanillaran conjuntamente,
produciéndose dos posibles productos heterodúplex que separan los
extremos 3'. Los extremos 3' separados se extendieron por Taq
DNA-polimerasa para producir un fragmento que era la
suma de los dos productos de PCR de solapamiento que contenían la
mutación deseada. Una posterior reamplificación de este fragmento
con sólo los dos cabadores "externos" dio por resultado el
enriquecimiento del producto de longitud entera. El producto que
contenía la mutación se reintrodujo en el gen de AHAS de
Arabidopsis en el vector pGEX-2T.
Células de E. coli (DH5\alpha)
transformadas con el vector pGEX-2T que contenía gen
de AHAS de tipo salvaje de maíz (designación del vector pAC751), el
mutante Ser653Asn de Arabidopsis o el mutante Ile401Phe de
Arabidopsis se dejaron crecer durante la noche en un caldo de
cultivo que contenía 50 \mug/ml de ampicilina. El cultivo nocturno
de E. coli se diluyó 1:10 en 1 l de LB, 50 \mug/ml de
ampicilina y 0,1% v/v de antiespumante A. El cultivo se incubó a
37ºC con sacudidas hasta que OD_{600} alcanzó aproximadamente el
valor 0,8. Se añadió isopropiltiogalactosa (IPTG) a un volumen final
de 1 mM y el cultivo se incubó durante 3 horas más.
Las células se cosecharon por centrifugación a
8.670 xg durante 10 min en una centrifugadora JA-10
y se pusieron nuevamente en suspensión en una centésima parte del
volumen original de cultivo en MTPBS (Na_{2}HPO_{4} 16 mM, NaCl
150 mM, pH 7,3). Se añadió Triton X-100 y lisozima a
una concentración final de 1% v/v y 100 \mug/ml, respectivamente.
Las células se incubaron a 30ºC durante 15 min, se enfriaron a 4ºC
sobre hielo y se lisaron por sonicación durante 7 segundos a nivel 7
con un disruptor de células Branson Sonifier equipado con una sonda
de micropunta. El extracto exento de células se centrifugó a 35.000
xg durante 10 min a 4ºC. Se decantó la sustancia sobrenadante y se
repitió la etapa de sonicación.
La purificación de las proteínas de fusión
expresadas se realizó según la modificación de Smith y Johson (Gene
67:31-40, 1988). El material sobrenadante se calentó
a temperatura ambiente y se hizo pasar a través de una columna de 2
ml de perlas de glutationa-agarosa (unión por
azufre, Sigma) equilibrada en MTPBS. La columna se lavó seguidamente
con MTPBS a temperatura ambiente hasta que la A_{280} del eluyente
casaba con la de MTPBS. La proteína de fusión se eluyó luego usando
una solución que contenía glutationa reducida 5 mM en Tris HCl 50
mM, pH 8,0.La proteína de fusión eluida se trató con aproximadamente
30 unidades NHD de trombina y se dializó frente a citrato 50 mM pH
6,5 y NaCl 150 mM.
La proteína de fusión se mantuvo en digestión
durante la noche a temperatura ambiente. Las muestras digeridas se
dializaron frente a MTPBS y se hicieron pasar dos veces a través de
una columna de glutationa-agarosa equilibrada en
MTPBS para eliminar la proteína glutationa transferasa liberada. Se
recogió la fracción de proteína que no se unió a la columna y se
concentró por ultrafiltración en un filtro YM10 (Amicon). La muestra
concentrada se cargó en una columna de filtración en gel Sephacryl
S-100 de 1,5 x 95 cm equilibrada en tampón de
filtración (HEPES 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,0). Se recogieron
fracciones de 2 ml a un caudal de 0,14 ml/min. La estabilidad de la
enzima se ensayó almacenando la enzima a 4ºC en gel de filtración
con la adición de 0,02% de azida sódica en presencia o ausencia de
pirofosfato de tiamina 2 mM y dinucleótido de flavina adenina (FAD)
100 \muM.
E. coli transformados con el plásmido
pAC751 que contenía gen de AHAS de tipo salvaje fusionado corriente
abajo y en marco con el gen de GST expresaron una proteína de 91 kD
cuando se indujeron con IPTG. La proteína de 91 kD tenía la masa
molecular predicha de una proteína de fusión de GST/AHAS (la suma de
26 kD y 65 kD, respectivamente). Cuando el extracto libre de células
de DH5\alpha/pAC751 se hizo pasar a través de gel de afinidad de
glutationa-agarosa, se lavó y se eluyó con la
glutationa libre, resultó una preparación enriquecida en la proteína
de 91 kD (Figura 6, carril C). El sitio de reconocimiento de
trombina de seis aminoácidos tratado por ingeniería en la unión de
GST y AHAS fue escindido con éxito por la trombina (Figura 6, carril
D). La preparación de la proteína de fusión escindida estaba
constituida por la proteína GST de 26 kD esperada y la proteína de
AHAS de maíz de 65 kD. La AHAS de maíz se purificó hasta
homogeneidad por una segunda pasada a través de la columna de
glutationa-agarosa al sustrato GST de afinidad y se
sometió a una etapa final de filtración en gel Sephacryl
S-100 para eliminar la trombina (Figura 6, carril
E). La proteína de 65 kD es reconocida en manchas western por un
anticuerpo monoclonal generado frente a un péptido de AHAS de
maíz.
La AHAS de tipo salvaje purificada se analizó
por espectrometría de masas por electroproyección y se determinó que
tenía una masa molecular de 64.996 daltons (datos no presentados).
La masa predicha, calculada a partir de la secuencia de aminoácidos
deducida del gen insertado en el vector pGEX-2T, es
de 65.058. La discrepancia de 0,096% entre la masa determinada
empíricamente y la predicha estaba dentro de la variabilidad de
ajuste del espectrómetro de masas. La estrecha proximidad de las dos
determinaciones de la masa sugiere que no había nucleótidos mal
incorporados durante la construcción del vector de expresión ni
cualesquiera modificaciones postranslacionales a la proteína que
causaran cambios grandes de la masa molecular. Además, la falta de
picos espúreos en la preparación de la enzima purificada indicaba
que la muestra estaba exenta de contaminación.
Las propiedades enzimáticas de AHAS de tipo
salvaje y de AHAS variante producidas en E. coli se midieron
por el procedimiento de Singh y otros modificado (Anal. Biochem.
171:173-179) como sigue
Se obtuvo una mezcla de reacción que contenía
tampón de ensayo 1X de AHAS (HEPES 50 mm pH 7,0, piruvato 100 mM,
MgCl_{2} 10 mM, pirofosfato de tiamina (TPP) 1 mM y dinucleótido
de flavina adenina (FAD) 50 \muM) por dilución de la enzima en
tampón de ensayo 1X de AHAS o por adición de enzima concentrada al
tampón de ensayo 1X de AHAS. Todos los ensayos que contenían
imazetapir y controles asociados contenían una concentración final
de 5% de DMSO debido a la adición de imazetapir a las mezclas de
ensayo como solución al 50% en DMSO. Los ensayos se realizaron en un
volumen final de 250 \mul a 37ºC en placas de microtitulación.
Después de dejar que la reacción transcurriera durante 60 min, se
midió colorimétricamente la acumulación de acetolactato como lo
describen Singh y otros, Anal. Biochem. 171:173-176,
1988.
La AHAS de maíz expresada y purificada de pAC751
como se describe en el Ejemplo 3 es activa en la conversión de
piruvato en acetolactato. La actividad total de la AHAS depende de
la presencia de los cofactores FAD y TPP en el medio de ensayo. No
se detectó actividad sólo cuando se añadió únicamente FAD al medio
de ensayo. La actividad de la enzima purificada con sólo TPP, o sin
cofactores, era inferior a 1% de la actividad detectada en presencia
de TPP y FAD. Normalmente, la AHAS presente en extractos en bruto de
plantas es muy lábil, en particular en ausencia de sustrato y
cofactores. A diferencia, la AHAS purificada del sistema de
expresión bacteriano no presentaba pérdida de la actividad
catalítica cuando se almacenó durante un mes a 4ºC en HEPES 50 mM
pH 7,0, NaCl 150 mM, 0,02% de NaN_{3} en presencia o ausencia de
FAD y TPP. Además, no eran visibles productos de degradación de
estas preparaciones almacenadas cuando se resolvieron en geles de
SDS-PAGE.
Las actividades específicas de AHAS de tipo
salvaje y las variantes M124E, R199A y F206R se presentan en la
siguiente Tabla 2. Determinada a partir del alineamiento de la
Figura 5, la mutación de M124E en AHAS de Arabidopsis es la
equivalente de la mutación M53E de maíz, la mutación de R199A en
Arabidopsis es la equivalente de la mutación de R128A de maíz
y la mutación de F206R en Arabidopsis es la equivalente de la
mutación de F135R de maíz. Las mutaciones diseñadas en el modelo
estructural de AHAS de maíz se usaron para identificar el aminoácido
equivalente en el gen de AHAS de Arabidopsis dicotiledónea y se
incorporaron y ensayaron en el gen de AHAS de Arabidopsis.
Esta translación e incorporación de mutaciones de herbicidas
diseñadas racionalmente en el gen de AHAS de Arabidopsis
dicotiledónea puede facilitar la evaluación de la resistencia a
herbicidas en plantas de una especie dicotiledónea.
La mutación de R199A mantiene un nivel alto de
actividad catalítica (Tabla 2) mientras que presenta un nivel
significativo de resistencia al imazetapir (Figura 7). Notablemente,
esta variante retiene una sensibilidad completa a sulfonilureas
(Figura 8). Así, la variante satisface los criterios de alta
actividad específica y resistencia selectiva a herbicidas. A
diferencia, la sustitución de M124E dio por resultado una
resistencia casi completa al imazetapir (Figura 7), pero también
presentaba una actividad catalítica severamente reducida (Tabla 2).
En cuanto a la resistencia a la imidazolinona, esta variante
presenta una mayor sensibilidad a la sulfonilurea, lo que sugiere
que este resto es un buen candidato para crear una mutación que
confiera resistencia selectiva. La sustitución de un aminoácido que
no sea el ácido glutámico puede ayudar a mantener la actividad
catalítica. La sustitución de F206R dio resultados similares con la
variante M124E, pero carecía de selectividad de la resistencia.
El cambio del resto 124 en AHAS de Met a Glu
como se ha descrito en el Ejemplo 4 confirió resistencia a la
imidazolinona, pero también redujo la actividad catalítica a 9,2%
del valor de la de tipo salvaje. El modelo de la estructura de AHAS
de maíz descrito antes sugería que Met53 (equivalente al resto
Met124 de Arabidopsis) interacciona con una serie de restos
hidrófobos en la cara de una hélice \alpha que deriva de una
subunidad separada pero que están próximos a Met 53. Así, la
interacción hidrófoba entre Met53 y los restos en la hélice puede
estabilizar tanto la asociación de subunidad/subunidad como la
conformación del sitio activo. Se creyó que la sustitución del
resto Met hidrófobo con un resto glutamato cargado muy probablemente
desestabiliza la interacción hidrófoba intersubunidades y da por
resultado una pérdida de actividad catalítica.
Sobre la base de este análisis de
estructura/función, la actividad de la enzima mutante Met124Glu
original de Arabidopsis (equivalente a Met53 Glu de maíz) se
mejoró luego iterativamente sustituyendo un aminoácido más hidrófobo
(Ile) en esta posición. La naturaleza hidrófoba de la cadena lateral
de Ile dio por resultado la restauración de la actividad a niveles
de la de tipo salvaje (la actividad específica de 102, equivalente a
102% de la actividad del tipo salvaje), pero la mayor masa de la
cadena lateral de Ile era todavía capaz de mantener un nivel
significativo de resistencia a la imidazolinona (Figura 9).
Comparativamente, la sustitución de un resto de
histidina en esta posición dio por resultado una variante de AHAS
que presentaba una actividad específica de 42,5, equivalente a 42,6%
de la actividad de la de tipo salvaje. Este mutante, sin embargo,
presentaba un grado alto de resistencia a PURSUIT® (Figura 10).
Otro ejemplo de afino iterativo usando los
procedimientos de la presente invención implica la variante
Arg128Ala. El modelo estructural de AHAS de maíz sugirió que el
resto Arg128, que reside en el labio de la bolsa de unión del
herbicida, contribuye a canalizar sustratos cargados y herbicidas a
la bolsa de unión del herbicida y al sitio activo. El resto Arg 128
está distante del resto de TPP, que une la molécula de piruvato
inicial en el mecanismo de reacción de AHAS, lo que explica por qué
la sustitución de Arg199 de AHAS de Arabidopsis (equivalente
a Arg128 de maíz) en alanina tenía un efecto pequeño sobre la
actividad catalítica de la enzima. El modelo estructural indicaba
además que se podía hacer más de un cambio radical en esta posición
para aumentar el nivel de resistencia a la vez que se mantenían
niveles altos de actividad catalítica. Sobre esta base, se hizo una
mejora iterativa de la mutación para sustituir el resto de arginina
cargado positivamente con un resto de glutamato cargado
negativamente. La enzima así mutada tenía niveles mejorados de
resistencia a PURSUIT®, mientras que se mantenían niveles altos de
actividad (actividad específica de 114, equivalente a 114% de
actividad de la de tipo salvaje). (Figura 11).
Un modelo estructural de la estructura
tridimensional de AHAS se construye con una secuencia de AHAS
monocotiledónea tal como la derivada de maíz, como se ha descrito
antes. Para introducir mutaciones en AHAS derivada de una especie
dicotiledónea tal como Arabidopsis, las secuencias de AHAS
derivada de la especie de monocotiledóneas y dicotiledóneas se
alinean usando los programas GAP y PILEUP (Genetics Computer Group,
575 Sequence Drive, Madison, WI 53711). Se determinan posiciones
equivalentes a partir del alineamiento generado con ordenador. Las
mutaciones se introducen luego en el gen de AHAS de dicotiledónea
según se ha descrito antes. Después de la expresión de la proteína
de AHAS mutante en E. coli y evaluación de propiedades
bioquímicas (esto es, actividad específica y resistencia a
herbicidas), el gen mutante se introduce en una planta dicotiledónea
por procedimientos de transformación de plantas como se ha descrito
antes.
Se usaron genes de variantes de AHAS diseñadas
racionalmente en vectores de expresión de E. coli como fuente
de fragmentos de restricción de DNA para reemplazar el fragmento de
restricción equivalente en un gen de AHAS de Arabidopsis.
Este gen está presente en un fragmento de DNA genómico de 5,5 kb que
también contiene el promotor de AHAS de Arabidopsis, la
secuencia terminal de AHAS de Arabidopsis y el DNA de los
flancos 5' y 3'. Después de haber secuenciado DNA a través de los
sitios de mutación para confirmar la presencia de la mutación
apropiada, el fragmento de 5,5 kb de cada plásmido se insertó en un
vector de transformación de plantas basado en pBIN (Mogen, Leiden,
Holanda). El vector de transformación de plantas contiene también el
gen de resistencia a la canamicina de neomicinfosfotransferasa II
(nptII) impulsado por el promotor del virus mosaico de coliflor 35S.
La construcción final del vector se presenta en la Figura 12. Los
vectores que contienen genes de AHAS de Arabidopsis con
mutaciones de Met124Ile, Met124His y Arg199Glu (que corresponden a
mutaciones de Met53Ile, Met 53His y Atg128Glu en la secuencia de
AHAS de maíz según se presentado en la Figura 1) se marcaron pJK002,
pJK003 y pJK004, respectivamente.
Cada uno de estos vectores se transformó en la
cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (R&D Life
Technologies, Gaithersburg, MD) usando el procedimiento de
transformación descrito por An y otros, en Plant Mol. Biol. Manual
A3:1-19 (1988).
La transformación de discos de hojas de
Nicotinum tabacum cv Wisconsin 38 se realizó de conformidad
con lo descrito por Horsch y otros (Science
227:1229-1231, 1985) con ligeras modificaciones. Se
cortaron discos de hojas de plantas crecidas en condiciones
estériles y cocultivadas mantenidas de arriba- abajo en medio de
Murashige Skoog (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) durante
2-3 días a 25ºC en la oscuridad con cepas de
Agrobacterium tumefaciens que contenían los plásmidos pJK002,
pJK003 y pJK004. Los discos se transfirieron en seco y se pasaron a
medio de Murashige Skoog con vitaminas B5 que contenían 1 mg/ml de
benciladenina y 0,1 mg/l de ácido 1-naftilacético,
100 mg/l de canamicina y 500 mg/l de cefotaxima (todos obtenidos de
Sigma).
Inicialmente, los transformantes se
seleccionaron atendiendo a la resistencia a la canamicina conferida
por el gen nptII presente en el vector de transformación. Se
cortaron retoños derivados de los discos de hoja y se pusieron en
medio fresco de Murashige Skoog exento de hormonas que contenía
cefotaxima y canamicina.
Retoños resistentes a canamicina se pasaron a un
medio que contenía imazetapir 0,25 \muM. A esta concentración del
herbicida de imidazolinona, los retoños de tabaco no transformados
(que contenían AHAS de tipo salvaje endógena) no eran capaces de
iniciar la formación de raíz. A diferencia, en retoños de tabaco
transformados con cada uno de los genes de AHAS mutantes se observó
la iniciación de la raíz y el crecimiento. En la Figura 1 se
presentan las raíces desarrolladas en los retoños transformados con
los genes mutantes de Met124Ile y Arg199Glu junto con el tipo
salvaje. Además, las plantas transformadas con los genes mutantes de
Met124Ile y Arg199Glu eran resistentes a la proyección de dos veces
la cuantía de campo (100 g/Ha) de imazetapir (Figura 13). Las
configuraciones del crecimiento de la raíz en plantas transformadas
frente a las no transformadas en presencia de herbicida, así como el
comportamiento después de la proyección de herbicida sugieren que la
expresión de los genes de resistencia a herbicidas diseñados
racionalmente confiere resistencia a herbicidas in vivo.
Se aisló DNA genómico de plantas de tabaco
transformadas con AHAS y se verificó por análisis por PCR la
presencia de genes de variantes de AHAS de Arabidopsis. Las
diferencias entre las secuencias de nucleótidos del gen de AHAS de
Arabidopsis y los dos genes de AHAS de tabaco se explotaron
para diseñar cebadores por PCR que amplifican sólo el gen de
Arabidopis en un fondo de DNA genómico. Se detectaron los
genes diseñados racionalmente de resistencia a herbicidas, según lo
revelaba la amplificación de un fragmento de DNA del tamaño
apropiado, en la mayoría de plantas resistentes a herbicidas. No se
vio señal de PCR alguna de plantas de tabaco no transformadas.
Para controlar la segregación de genes de AHAS
diseñados racionalmente en plantas transformadas, se realizaron
ensayos de germinación. Las semillas se pusieron en medio de
Murashige-Skoop exento de hormona que contenía hasta
PURSUIT 2,5 \muM y canamicina 100 \muM. Los plantones
resultantes se puntuaron visualmente en cuanto a la resistencia o
susceptibilidad al herbicida.
\newpage
Puesto que las plantas de tabaco son diploides,
era de esperar que la progenie de plantas autopolinizadas segregara
3:1 resistentes:susceptibles, reflejando la existencia de 1 plantón
homozigótico para el gen de AHAS resistente, 2 plantones
heterozigóticos para el gen de AHAS resistente y 1 plantón que
carecería del gen de AHAS resistente.
Los resultados indican que los genes de AHAS
están segregando en la relación 3:1 esperada, lo que soporta la
conclusión de que la resistencia a herbicidas la confiere una copia
individual dominante de un gen de AHAS racionalmente diseñado.
Esto resultados indican que el diseño racional
de genes de AHAS resistentes a herbicidas se puede usar para
producir plantas que presentan un crecimiento resistente a
herbicidas in vivo.
Plantas de tabaco transformadas con genes de
AHAS diseñados racionalmente como se ha descrito en el Ejemplo 8
anterior se ensayaron en cuanto a resistencia por cruce a otro
herbicida, CL 299.263 (también conocido como imazamox). Los ensayos
de germinación se realizaron con semillas cosechadas de
transformantes primarios que contenían los genes variantes
Met124Ile, Met124His y Arg19Glude AHAS de Arabidopsis en
ausencia o presencia de CL 299.263 2,5 \muM (Figura 15). Esta
concentración del herbicida causa atrofia y blanqueo severos de
plantas de tabaco de tipo salvaje. Las plantas de tabaco
transformadas con el gen de AHAS Met124His presentaban el máximo
nivel de resistencia. (Figura 15). Los transformantes Arg199Glu
presentaban un nivel intermedio de resistencia, mientras que
Met124Ile presentaba una resistencia pequeña (Figura 15).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Kakefuda, Genichi
\hskip3.9cmOtt, Karl-Heinz
\hskip3.9cmKwagh, Jae-Gyu
\hskip3.9cmStockton, Gerald W.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: productos resistentes a herbicidas diseñados sobre la base de la estructura
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- CONSIGNATARIO: Darby & Darby
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 805 Third Avenue
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO: 10022-7513
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC - DOS/MS - DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release n° 1.0, Versión n° 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: ESTADOS UNIDOS 08/426.125
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 de abril de 1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Robinson, Joseph
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33.448
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 0646/0A674
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (212)- 527-7783
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (212)- 753-6237
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 236687
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 599 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 585 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: linear
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Lactobacillus plantarum
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 599 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: individual
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DE POLARIDAD OPUESTA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Zea mays
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 638 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Zea mays
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 638 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Zea mays
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 667 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 7:
\vskip0.500000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 664 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 671 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Arabidopsis thaliana
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 652 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brassica napus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID N°: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 637 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Brassica napus
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
Claims (50)
1. Un procedimiento para la
producción de una proteína de una variante de AHAS resistente a
herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea usando
información basada en la estructura, procedimiento que
comprende:
- (a)
- alinear una proteína de AHAS diana sobre un molde de ^{} piruvato oxidasa para derivar la estructura tridimensional de la mencionada proteína de AHAS diana;
- (b)
- modelar uno o más herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea en la estructura tridimensional para localizar una bolsa de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea en la mencionada proteína de AHAS diana;
- (c)
- seleccionar como diana para la mutación al menos una posición de aminoácido en la proteína de AHAS diana, en la que la mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la mencionada bolsa de unión;
- (d)
- mutar DNA que codifica la proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada; y
- (e)
- expresar el mencionado DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la mencionada AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada.
2. Un procedimiento según la
reivindicación 1, que además comprende:
- (f)
- expresar DNA que codifica la proteína de AHAS de tipo salvaje paralelamente en una segunda célula;
- (g)
- purificar las proteínas de la mencionada AHAS de tipo salvaje y de la mencionada AHAS variante de las mencionadas células,
- (h)
- ensayar las proteínas de la mencionada AHAS de tipo salvaje y de la mencionada AHAS variante cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato, en ausencia y presencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea; y
- (i)
- repetir las etapas (c)-(h), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (e) se usa como el DNA que codifica AHAS en la etapa (c) hasta que se identifica una proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene
- (i)
- en ausencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea,
- (a)
- una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa, o
- (b)
- una actividad catalítica en combinación con una proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa; en la que la mencionada célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y
- (ii)
- una actividad catalítica que es más resistente a un herbicida basado en imidazolina y/o sulfonilurea que la HAAS de tipo salvaje.
3. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 2, en el que la mencionada actividad catalítica
en ausencia de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea
es de más de 20% de la actividad catalítica de la mencionada AHAS de
tipo salvaje en ausencia de un herbicida basado en imidazolinona y/o
sulfonilurea.
4. Un procedimiento según se ha
definido en la reivindicación 3, el que el herbicida es un herbicida
basado en imidazolinona y/ sulfonilurea y la mencionada proteína de
la variante de AHAS resistente a herbicidas tiene:
- (i)
- una actividad catalítica en ausencia del mencionado herbicida de más de 20% de la actividad catalítica de la AHAS de tipo salvaje;
- (ii)
- una actividad catalítica que es más resistente a la presencia de herbicidas de imidazolinona en comparación con AHAS de tipo salvaje, y
- (iii)
- una actividad catalítica que es más sensible a la presencia de herbicidas de sulfonilurea en comparación con herbicidas de imidazolinona.
5. Un procedimiento según se ha
definido en la reivindicación 1, en el que la mencionada proteína de
AHAS diana se deriva de Arabidopsis thaiana.
6. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 1, en el que la mencionada primera célula
es
E. Coli.
E. Coli.
7. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 2, en el que las mencionadas primera célula y
segunda células son E. Coli.
8. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 1, en el que la mencionada proteína de AHAS
diana comprende una proteína que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 o
la secuencia de aminoácidos de una proteína de AHAS de otra
planta.
9. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 1, en el que la mencionada mutación es una
sustitución de al menos un resto de aminoácido diferente en un resto
de aminoácido de la secuencia de SEQ ID NO:1 seleccionado entre el
grupo constituido por F135, M53, R128 y un resto de aminoácido de
proteína de AHAS de otra planta en un aminoácido alineado con
cualquiera de los anteriores, y cualquier combinación de cualesquier
de los anteriores.
10. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 9, en el que la mencionada sustitución se
selecciona entre el grupo constituido por Met53Trp, Met53Glu,
Met53Ile, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg o una
combinación de cualesquier de los anteriores.
11. Un procedimiento para la producción de
una proteína de variante de AHAS resistente a herbicidas basados en
imidazolinona y/o sulfonilurea usando información basada en la
estructura, procedimiento que comprende:
- (a)
- alinear una proteína de AHAS diana en un primer molde de AHAS derivada de un polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO:º o la secuencia de aminoácidos de AHAS de otra planta para derivar la estructura tridimensional de la mencionada proteína de AHAS diana;
- (b)
- modelar uno o más herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea en la estructura tridimensional para localizar una bolsa de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea en la mencionada proteína de la AHAS diana;
- (c)
- seleccionar como diana para la mutación al menos una posición de aminoácido en la proteína de AHAS diana, en la que la mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la mencionada bolsa de unión;
- (d)
- mutar DNA que codifica la mencionada proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mutación en la posición mencionada; y
- (e)
- expresar el DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada.
12. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 11, que además comprende:
- (f)
- expresar DNA que codifica la proteína de AHAS de tipo salvaje paralelamente en una segunda célula;
- (g)
- purificar la proteína de AHAS de tipo salvaje mencionada y la proteína de AHAS variante mencionada de las células;
- (h)
- ensayar la proteína de AHAS de tipo salvaje mencionada y la proteína de AHAS variante mencionada en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato, en ausencia y presencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea;
- (i)
- repetir las etapas (c)-(h), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (e) se usa como el DNA que codifica la AHAS en la etapa (c) hasta que se identifica una primera proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene
- (i)
- en ausencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea
- (a)
- una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa, o
- (b)
- una actividad catalítica en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa; en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y
- (ii)
- una actividad catalítica que es más resistente a al menos el mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje.
13. Un procedimiento para la producción de
una proteína de variante de AHAS resistente a herbicidas basados en
imidazolinona y/o sulfonilurea usando información basada en la
estructura, procedimiento que comprende:
- (a)
- alinear una proteína de AHAS diana sobre un primer molde de AHAS que tiene una bolsa identificada de unión de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea y que tiene la secuencia de SEQ ID NO:1 para derivar la estructura tridimensional de la mencionada proteína de AHAS diana;
- (b)
- seleccionar como diana para la mutación al menos una posición de aminoácido en la mencionada proteína de AHAS diana, en la que la mencionada mutación altera la afinidad de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea para la mencionada bolsa de unión;
- (c)
- mutar DNA que codifica la mencionada proteína de AHAS diana para producir un DNA mutado que codifica una AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada; y
- (d)
- expresar el mencionada DNA mutado en una primera célula en condiciones en las que se produce la AHAS variante que contiene la mencionada mutación en la posición mencionada.
14. Un procedimiento según se ha
definido en la reivindicación 13, que además comprende:
- (e)
- expresar DNA que codifica la proteína de AHAS de tipo salvaje paralelamente en una segunda célula;
- (f)
- purificar la proteína de AHAS de tipo salvaje mencionada y la proteína de AHAS variante mencionada de las mencionadas células;
- (g)
- ensayar la proteína de AHAS de tipo salvaje mencionada y proteína de AHAS variante mencionada en cuanto a su actividad catalítica en la conversión de piruvato en acetolactato o en la condensación de piruvato y 2-cetobutirato para formar acetohidroxibutirato, en ausencia y presencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, y
- (h)
- repetir las etapas (c)-(h), en las que el DNA que codifica la variante de AHAS de la etapa (e) se usa como el DNA que codifica la variante de AHAS en la etapa (c) hasta que se identifica una primera proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea, que tiene
- (i)
- en ausencia del mencionado herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea
- (a)
- una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa, o
- (b)
- una actividad catalítica en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la mencionada célula, que puede ser la misma primera proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;
- en la que la célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y
- (ii)
- una actividad catalítica que es más resistente a al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje.
15. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 12 o 14, en el que la mencionada actividad
catalítica en ausencia de al menos el mencionado herbicida basado en
imidazolinona y/o sulfonilurea es de más de 20% de la actividad
catalítica de la mencionada AHAS de tipo salvaje.
16. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 15, en el que el mencionado herbicida es un
herbicida basado en imidazolinona y una primera proteína de una
primera variante de AHAS resistente a herbicida tiene:
- (i)
- una actividad catalítica en ausencia del mencionado herbicida de más de 20% de la actividad catalítica de la mencionada AHAS de tipo salvaje;
- (ii)
- una actividad catalítica que es más resistente a la presencia de herbicidas de imidazolinona en comparación con AHAS de tipo salvaje, y
- (iii)
- actividad catalítica que es más sensible a la presencia de herbicidas de sulfonilurea en comparación con herbicidas basados en imidazolinona.
17. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 16, en el que la mencionada proteína de AHAS
diana se deriva de Arabidopsis thaliana.
18. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 11 o 13, en el que la mencionada célula es
E. coli.
19. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 12 o 14, en el que las mencionadas células
primera y segunda son E. coli.
20. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 11 o 13, en el que la mencionada mutación es
una sustitución de al menos un resto de aminoácido diferente en un
resto de aminoácido de la secuencia de SEQ ID NO:1 seleccionado
entre el grupo constituido por F135, M53, R128 y un resto de
aminoácido de proteína de AHAS de otra planta en un aminoácido
alineado con cualquiera de los anteriores, y cualquier combinación
de cualesquier de los anteriores.
21. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 20, en el que la mencionada sustitución se
selecciona entre el grupo constituido por Met53Trp, Met53Glu,
Met53Ile, Met53His, Arg128Alq, Arg128Glu, Phe135Arg, un resto de
aminoácido de proteína de AHAS de otra planta en un aminoácido
alineado con cualquiera de los anteriores, o una combinación de
cualquiera de los anteriores.
22. Un DNA aislado que codifica una
proteína variante de acetohidroxiácido sintasa (AHAS), proteína
variante que comprende una proteína de AHAS modificada por
sustitución de al menos un resto de aminoácido diferente en un resto
de aminoácido de la secuencia de SEQ ID NO:1 seleccionado entre el
grupo constituido por M53, R128, F135 y cualquier combinación de
cualquiera de los anteriores.
23. DNA según se ha definido en la
reivindicación 22, en el que la mencionada modificación altera la
capacidad de un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea
de inhibir la actividad enzimática de la mencionada proteína.
24. DNA según se ha definido en la
reivindicación 23, en el que la mencionada proteína de AHAS deriva
de arabidopsis thaliana.
25. DNA según se ha definido en la
reivindicación 24, en el que la mencionada sustitución se selecciona
entre el grupo constituido por Met53Trp, Met53Glu, Met53Ile,
Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg, o una combinación de
cualquiera de los anteriores.
26. DNA según se ha definido en la
reivindicación 25, en el que la mencionada proteína de AHAS variante
tiene:
- (a)
- en ausencia de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sufonilurea que inhibe AHAS,
- (i)
- una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa; o
- (ii)
- una actividad catalítica en combinación con cualquier segunda proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la mencionada célula, que puede ser la misma proteína variante de AHAS mencionada o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;
- en la que la mencionada célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y
- (b)
- una actividad catalítica que es más resistente a al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje,
27. DNA según se ha definido en la
reivindicación 22, en el que la mencionada AHAS variante tiene más
de 20% de la actividad catalítica que la AHAS de tipo salvaje.
28. DNA según se ha definido en la
reivindicación 27, en el que la mencionada AHAS variante es más
resistente a herbicidas basados en imdazolinona que a herbicidas
basados en sulfonilurea.
29. Un vector de DNA que comprende la
secuencia de DNA de la reivindicación 22 unido operativamente a un
elemento regulador de transcripción.
30. Una célula que comprende una AHAS que
codifica una secuencia de DNA derivada de un vector de DNA según se
ha definido en la reivindicación 29, célula que se selecciona entre
el grupo constituido por células bacterianas, de hongos, plantas,
insectos y mamíferos.
31. Una célula según se ha definido en a
reivindicación 30, que comprende una célula de una planta.
32. Una semilla que comprende una célula
según se ha definido en la reivindicación 31.
33. Una proteína de AHAS variante que
comprende una proteína codificada por un DNA según se ha definido en
la reivindicación 22.
34. Una proteína de AHAS variante que
comprende una proteína de AHAS modificada por sustitución de al
menos un resto de un aminoácido diferente en un resto de aminoácido
de la secuencia de SEQ ID NO:1 seleccionado entre el grupo
constituido por M53, R128, F135, un resto de aminoácido de proteína
de AHAS de otra planta en un aminoácido alineado con cualquiera de
los anteriores, y cualquier combinación de cualesquier de los
anteriores.
35. Una proteína de AHAS variante según se
ha definido en la reivindicación 34, en la que la modificación
mencionada altera la capacidad de un herbicida basado en
imidazolinona y/ sulfonilurea de inhibir la actividad enzimática de
la mencionada proteína.
36. Una proteína de AHAS variante según se
ha definido en la reivindicación 35, en la que la mencionada
proteína de AHAS deriva de Arabidopsis thaliana.
37. Una proteína de AHAS variante según se
ha definido en la reivindicación 33, en la que la mencionada
sustitución se selecciona entre el grupo constituido por Met53Trp,
Met53Glu, Met53Ile, Met53His, Arg128Ala, Arg128Glu, Phe135Arg, o una
combinación de cualquiera de los anteriores.
38. Una proteína de AHAS variante según se
ha definido en la reivindicación 33, proteína variante de AHAS que
tiene:
- (a)
- en ausencia de al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sufonilurea que inhibe AHAS mencionado,
- (i)
- una actividad catalítica sola suficiente para mantener la viabilidad de una célula en la que se expresa; o
- (ii)
- una actividad catalítica en combinación con cualquier proteína variante de AHAS resistente a un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea también expresada en la mencionada célula, que puede ser la misma proteína variante de AHAS o una diferente, suficiente para mantener la viabilidad de la célula en la que se expresa;
- en la que la mencionada célula requiere actividad de la AHAS para la viabilidad, y
- (b)
- una actividad catalítica que es más resistente a al menos un herbicida basado en imidazolinona y/o sulfonilurea que la AHAS de tipo salvaje,
39. Una proteína de AHAS variante según se
ha definido en la reivindicación 33, en la que la AHAS variante
tiene más de 20% de la actividad catalítica de la AHAS de tipo
salvaje.
40. Un procedimiento para conferir en una
célula resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o
sulfonilurea, procedimiento que comprende:
- (a)
- clonar un DNA según se ha definido en la reivindicación 22 en un vector de expresión compatible, y
- (b)
- transoformar el mencionado DNA en la mencionada célula, en condiciones en las que el gen mencionado se expresa a niveles suficientes para conferior a la mencionada célula resistencia a herbicidas basados en imidazolinona y/o sulfonilurea.
41. Una célula preparada de acuerdo
con el procedimiento de la reivindicación 40.
42. Una planta que comprende una célula
según se ha definido en la reivindicación 41.
43. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 40, en el que el mencionado gen mutado codifica
un aminoácido diferente, al menos uno de las posiciones 53, 128, 135
o combinaciones de ellos.
44. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 43, en el que el mencionado gen de AHAS
comprende el gen de AHAS de Arabidopsis thaliana.
45. Un procedimiento según se ha
definido en la reivindicación 43, en el que la mencionada célula es
una célula de una planta.
46. Un procedimiento según se ha definido
en la reivindicación 45, en el que la mencionada célula es una
semilla.
\newpage
47. Un procedimiento para controlar malas
hierbas en un cultivo, procedimiento que comprende cultivar un campo
que incluye plantas resistentes a herbicidas basados en diazolinona
y/o sulfonilurea según se define en la reivindicación 42, y tratar
el mencionado cultivo con el mencionado herbicida basado en
imidazolinona y/o sulfonilurea.
48. Un procedimiento para controlar
malas hierbas en un cultivo, procedimiento que comprende cultivar un
campo que incluye plantas resistentes a herbicidas basados en
imidazolinona y/o sulfonilurea según se define en la reivindicación
42, y tratar el mencionado cultivo con la mencionada composición
herbicida basada en imidazolinona y/o sufonilurea que incluye el
mencionado herbicida.
49. Una célula transformada con un DNA
según se ha definido en la reivindicación 22, en la que el
mencionado DNA se expresa en la mencionada célula de manera que
confiere a la mencionada célula resistencia a herbicidas basados en
imidazolinona y/o sulfonilurea.
50. Una planta transformada con un DNA
según se ha definido en la reivindicación 23, en la que el
mencionado DNA se expresa en la mencionada célula de manera que
confiere a la mencionada planta resistencia a herbicidas basados en
imidazolinona y/o sulfonilurea.
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