CZ357696A3 - Biologically active conjugates and composition containing thereof - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká aktivních derivátů polyethylenglykolu a příbuzných hydrofilnich polymerů a způsobů jejich syntézy pro použití při modifikaci charakteristik povrchů a molekul. Vynález se také týká polypeptidů, které byly kovalentně navázány k takovým aktivním derivátům a způsobů pro jejich výrobu.

Dosavadní stav techniky

Pólyethylenglykol (PEG) byl studován pro použití ve farmaceutikách, umělých implantech a jiných aplikacích, kdy je biokompatibi1 i ta důležitá. Byly navrženy různé deriváty PEG, které mají aktivní skupinu pro umožnění, aby PEG byl připojen k farmaceutikám a implantům a k molekulám a povrchům obecně. Například byly navrženy PEG deriváty pro kopulaci PEG k povrchům pro řízení smáčení, statické nanášení, a připojení jiných typů molekul k povrchu, zahrnujících proteiny nebo proteinové zbytky.

PEG deriváty byly také navrženy pro afinitní dělení, například, enzymů od buněčné hmoty. V afinitním dělení PEG deriváty zahrnují funkční skupinu pro reverzibilní kopulaci k enzymu, který je obsažen v buněčné hmotě. PEG a enzymový konjugát se odděluje od buněčné hmoty a pak se enzym odděluje od PEG derivátu, je-li to Žádoucí.

V ještě dalších příkladech, kopulace PEG derivátů (PEGylace) je žádoucí pro překonání obtíží objevujících se při klinickém použití biologicky aktivních molekul. Zveřejněná

PCT přihláška č. WO 92/16221.například uvádí, že bylo.nalezeno mnoho potenciálně terapeutických proteinů s krátkým poločasem životnosti v krevním seru. Z větší části je clearence proteinů ze sera prováděn přes ledviny. Systémové zavedení relativně velkých množství proteinů, zejména těch, které jsou cizí pro lidský systém, může být zvýšena k imunogenickým reakcím, což mezi jinými problémy může vést k rychlému odstranění proteinu z těla přes tvorbu imunitních komplexů. Pro jiné proteiny je problémům s rozpustností a agregací také zabráněno optimální formulací proteinu.

PEGylace snižuje rychlost clearence z krevního proudu zvýšením zjevné molekulové hmotnosti molekuly. Až do určité velikosti je rychlost glomerulární filtrace proteinů nepřímo úměrná velikosti proteinu. Schopnost PEGylace snižovat clearence proto obecně není .funkcí množství PEG skupin,, které jsou připojeny k proteinu, ale celkové molekulové hmotnosti., zníěňěného proteinu. Snížená clearence může vést_; ke ^zvýšené _ účinnosti proti ne-PEGylovanému materiálu. Viz.například Conforti a spol., Pharm.Research Commun, sv. 19,, str: 287 (1987) a Katre a spol., Pr.oc . Nati. Acad. Sc i. USA sv. 84, s.tr. 1487 (1987).

Navíc PEGylace může snižovat proteinovou agregaci (Suzuki a spol.', Biochem./Biophys. Acta, sv. 788, str, 248 (1984)), měnit proteinovou ímuňogenicitu (Abuchowski a spol.,

J.Biol.Chem., sv. 252, str. 3582 (1977) a zvyšovat proteinovou rozpustnost jak je například popsáno v PCT ppublíkaci č. WO 92/16221. ...... - PEGylace proteinů ilustruje některé problémy, které byly spojen s připojením PEG k povrchům a molekulám. Převážná, většina PEGylačních činidel reaguje s volnými primárními aminoskupinamí polypeptidů. Většina z těchto volných aminů jsou epsilon aminoskupiny lysinových aminokyselinových zbytků. Typické proteiny vykazují velký počet lysinu. V souladu s tím, se často objevuje náhodné připojení násobných PEG molekul vedoucí ke ztrátě proteinové aktivity.

Navíc, je-li PEGylovaný protein zamýšlen pro terapeutické použití, směs více druhů, která vzniká z použití nespecifické | PEGylace vede k obtížím při přípravě produktu s ί reprodukovatelnými a charakteristickými vlastnostmi. Tato nespecifická PEGylace činí obtížným hodnotit terapeutika a poskytnout informaci o účinnosti a dávkováni. Místné selektivní PEGylace takových proteinů by mohla vést k reprodukovatelně modifikovaným materiálům, které získaly žádoucí atributy PEGylace bez ztráty aktivity.

I

Α»

Existuje také potřeba reprodukovatelně vytvářených koplexů dvou nebo více spojených bioaktivních molekul nebo r sloučenin. V některých případech podání multimérních komplexů, které obsahují více než jeden biologicky aktivní polypeptid, nebo léčivo, vede k synergickým přínosům. Například komplex., obsahující dva nebo více identických polypeptidů mohou mít podstatně zvýšenou afinitu pro ligand nebo aktivní místo, ke kterému se váže vzhledem k monomernímu polypeptidů. Alternativně, komplex, obsahující (1) bioaktivní*protein, který projevuje svůj účinek na určitém místě vtěle a (2) molekulu, která může přímo řídit komplex ke specifickému

ň.

’ místu, může představovat velký přínos.

i

Existuje také potřeba hydrolyticky stabilních aktivovaných polymerů, které tvoří vazby, které jsou hydrolyticky stabilní. Jinak v určitých případech může být reaktivní skupina učiněna neaktivní před tím, než proběhne žádoucí reakce nebo konjugát vytvořený po reakci má krátký poločas Životnosti ve vodném mediu, jako je krev nebo plasma.

Například Zalipsky, US patent č. 5122614, popisuje, Že PEG molekuly aktivované s oxykarbonyl-N-dikarboximidovou funkční skupinou, která může být připojena za vodných, bázických podmínek urethanovým navázáním k aminové skupině polypeptidu. Aktivovaný PEG-N-sukcinimidkarbonát je uváděn jako tvořící stabilní, k hydrolýze rezistentní urethanová navázání s aminoskupinami. Aminoskupina je uváděna jako

A reaktivnější při bázických pH asi 8,0 až 9,5 a reaktivita ostře klesá při nižších pH. Hydro.lýza nekopulovaného PEG derivátu však také ostře stoupá při pH 8,0 až 9,5. Zalipsky vylučuje problém zvýšení rychlosti reakce nekopulovaného PEG derivátu s vodou použitím, přebytku PEG.derivátu,k navázání .k. proteinu. Použitím přebytku. PEG derivátu je dostatečné, reaktivní aminomísta navázána k PEG pro modif.ika.ci proteinu pře.d' tím, . než se PEG derivát hydrolyzuj e..a stane nereaktivním.

Zalipskeho metoda je adekvátní nespecifickému připojeni lysínové frakce proteinu.k PEG. derivátu na aktivním..místě, na PEG. Jestliže rychlost hydrolýzy PEG derivátu je.značnápak je problematické poskytnout připojení na více než jednom aktivním místě PEG molekuly, protože pouhý přebytek nezpomalý rychlost hydrolýzy.

Například lineární pEG s aktivními místy na každém konci bude připojen k proteinu na jednom konci ale reaktivní místo * na druhém konci může reagovat s vodou za vzniku relativně · i ψ Si' nereaktivní hydroxylové skupiny místo PEG spojení dvou proteinových skupin. Podobný problém vzniká, je-li žádoucí kopulovat molekulu k povrchu PEG spojovacího činidla, protože PEG je nejprve připojen k povrchu nebo se kopuluje k molekule a opačný konec PEG derivátu musí zůstat aktivní pro následující reakci. Jestliže je hydrolýza problémem, pak se opačný konec typicky stává inaktivovaným.

Zalipsky US patent č. 5122614 také popisuje některé jiné PEG deriváty z předchozích patentů.

PEG-sukcinoyl-N-hydroxysukcinimidester je uváděn jako tvořící esterová spojení, která mají omezenou stabilitu ve vodném ,[h, * mediu. PEG-kyanurchlorid je uváděn jako toxický a je i

* nespecifický pro reakci s jednotlivými funkčními skupinami na ·'· « proteinu, což vede k inaktivaci proteinu. PEG-fenylkarbonát je uváděn jako produkující toxické hydrofobní fenolové zbytky, které mají afinitu pro proteiny. PEG aktivovaný karbonyIdiimidazo1em je uváděn jako příliš pomalý v reakci s proteinovými funěními skupinami, vyžadující delší reakční doby pro získání vyhovující modifikace proteinu. Ϊ”

Ještě další PEG deriváty byly navrženy pro připojení k funkčním skupinám jiným než je epsilon aminoskupína lysinu. Maleimid je například specifický pro cystein sulfhydryl ale maleímidová funkčnost je podrobena hydrolýze.

V souladu s tím existuje potřeba Činidel a metod pro reprodukovatelně vytvářené komplexy, jejichž části jsou připojeny k neantigenickým, vysoce rozpustným, biologicky inertním molekulám. Předložený vynález uspokojuje potřebu , hydrolyticky stabilních činidel, která vytvářejí hydrolyticky * stabilní konjugáty.

i

Podstata vvnálezu , . .

Předložený vynález se týká biologicky aktivních konjugátu, obsahujících biologicky aktivní molekulu, mající reaktivní thiolovou skupinu a nepeptidický polymer, mající aktivní sulfonovou skupinu, která tvoři vazbu s reaktivní thiolovou skupinou. Biologicky aktivní molekula muže být syntetická, přirozeně se vyskytující nebo modifikovaná přirozeně se vyskytující molekula. Molekula, vykazující požadovanou biologickou aktivitu může být modifikována, aby obsahovala reaktivní thiolovou skupinu.

Zvláště vhodné biologicky aktivní molekuly zahrnují inhibitory faktoru tumorové nekrozy (TNF), interleukín-1 receptoř antagonisty (IL-lra), CR1, exon šesti peptidů PDGF, a interleukin-2 (IL-2) inhibitory a receptory (IL-2r).

Polymer podle předloženého vynálezu obsahuje alespoň jednu aktivní sulfonovou skupinu a má vzorec P-SO2-C-C*-, kde P je polymer a C* je reaktivní místo pro spojení se thiolovou skupinou. Vazba mezi thiolem a aktivovaným sulfonem:je na C^# a může být představena vzorcem F-SO2^_C-C*S-R, kde R je biologicky aktivní molekula. Vhodné aktivované sulfonové skupiny zahrnují, například, vinylsulfon a chlorethylsulfon. Různé polymery mohou být aktivovány pro použití ve všech provedeních předloženého vynálezu, zahrnujících ve vodě rozpustné polymery jako je polyethylenglykol (PEG) a příbuzné hydrofilní polymery.

Předložený vynález také poskytuje metody použití sulfon-aktivovaných polymerů pro přípravu výše diskutovaných biologicky aktivních konj-ugátů. Met-oda zahrnuje -stupně:

(a) reakce biologicky aktivní molekuly, mající reaktivní thiolovou skupinu s nepeptidickým polymerem, majícím aktivní sulfonovou skupinu za tvorby konjugátu; a (b) izolaci konjugátu.

Farmaceutické kompozice, obsahující konjugáty, jsou také v rozsahu vynálezu.

Předložený vynález se dále týká sulfon-aktivovaných polymerů použitelných pro kopulaci k různým molekulám, sloučeninám a povrchům. Aktivovaná sulfonová skupina je stejná jak je diskutována výše. Zvláště použitelné aktivované polymery zahrnují bifunkční PEG deriváty aktivované sulfonovou t skupinou na jednom místě na PEG molekule a na NHS-esteru nebo * maleimidové funkčnosti na jiném místě.

'|b

V předloženém vynálezu jsou dále zahrnuty v podstatě Čištěné biologicky aktivní sloučeniny, mající vzore Rí-X-R², nazývané činka, kde alespoň jeden z Ri nebo R2 je biologicky aktivní molekula, která si udržuje svoji biologickou aktivitu, když je. částí molekuly. Biologicky aktivní molekula má reaktivní thiolovou skupinu, která tvoří spojení s Michael akceptorovou skupinou na nepeptidickém polymeru. Biologicky akivní molekuly vhodné pro použití v předloženém vynálezu zahrnují ty, které jsou uvedeny výše. Vhodné Michael akceptor skupiny například zahrnují vinylsulfon a maleimid. Polymery, které mohou být aktivovány s Michael akceptor funkčními skupinami zahrnují polymery rozpustné ve vodě uvedené výše.

Ri a R2 mohou být stejné nebo rozdílné skupiny. Jestliže jsou R skupiny stejné, je sloučenina homočinková; jestliže R skupiny jsou odlišné je sloučenina heteročinková. Zvláště t vhodné homočinky zahrnují například PEG-spojené TNF inhibitory

I a PEG-spojené IL-lra's. Vhodné heteročinky zahrnujί, například, ty, které jsou vytvořeny z IL-2r-a a IL-2r-p, heteročinky, které inhíbuj í klasickou dráhu systému komplementu a heteročinky vytvořené z IL-lra a exon 6 PDGF.

Metody přípravy činkových sloučenin jsou v rozsahu vynálezu. Metody přípravy činek R1-X-R2 zahrnují stupně:

(a) reakce X s Ri a R2 za vzniku R1-X-R2; a (b) čištění Ri-X-Rz.

Stupeň (a) ve výše uvedených metodách přípravy činek muže zahrnovat následující stupně:

chránění jedné reaktivní skupiny X za vzniku chráněné skupiny’na X; } reakci X, majícího chráněnou skupinu s Ri za vzniku Ri-X;

i deprotekci chráněné skupiny na X a reakci Ri-X s R2 za vzniku Ri-X-R2Alternativně nebo navíc může stupeň (a) dále zahrnovat následující stupně: 't reakci přebytku X’s Ri za vzniku R.i-Χ a reakci Ri-X s R2 za vzniku Ri-X-Rz.

Farmaceutické kompozice, obsahující v podstatě čištěné sloučeniny R1-X-R2 jsou také v rozsahu vynálezu.

t

Podrobný popis

Předložený vynález poskytuje biologicky aktivní konjugáty obsahúj.ící (1) biologicky aktivní molekulu,. maj ící reaktivní thiolovou skupinu a‘(2) nepeptidický polymer, mající aktivní sulfonovou skupinu, která tvoří spojení s thiolovou skupinou biologicky aktivní molekuly.

Konjugát, znamená komplex, který je vytvořen spojením biologicky aktivní molekuly, mající aktivní thiolovou skupinu, k nepeptidickému polymeru, majícímu aktivní sulfonovou skupinu, přes vazbu mezi thiolem a sulfonem. Jak je uvedeno výše jsou konjugáty podle předloženého vynálezu biologicky aktivní.

Biologicky aktivní znamená schopný působit biologický efekt, in vitro nebo in vivo. Biologicky aktivní molekula zahrnuje, ale není tak omezena, jakoukoliv sloučeninu, která může vyvolat biologický efekt při interakci s biologickou molekulou nebo s biologickým systémem jako je buňka nebo organismus. Cesty demonstrace biologické aktivity zahrnují, ale nejsou tak omezeny, in vitrp- bioeseje, z nichž mnohé jsou známé v oboru. Například.je možno měřit biologickou aktivitu inhibitorů faktoru tumorové nekrozy (TNF) stanovením, zda se inhibitory vážou k TNF nebo zda inhibitory blokují TNF-zprostredkovanou lýzi určitých buněk. Posledně uvedený bioesej je uveden ve zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 901 13673.9, která je zde zahrnuty specificky jako odkaz.,, ^K I

Biologicky aktivní molekuly zahrnují, ale nejsou tak omezeny, farraaceutika, vitaminy, živiny, nukleové kyseliny, aminokyseliny, polypeptidy enzymové ko-faktory, steroidy, , 'b karbohydráty, organické druhy jako je heparin, činidla, obsahující kovy, receptor agonisté, receptor antagonisté, , vazebné proteiny, receptory nebo části receptorů, extracelulární matricové proteiny, buněčné povrchové molekuly, antigeny, hapteny, cílové skupiny a chelatační činidla.

Všechny zde zahrnuté odkazy zahrnují všechny formy receptorů, pokud jich existuje víc než jedna.

I i Polypeptidy a proteiny se zde používají synonymně a znamenají jakoukoliv sloučeninu, která má v podstatě proteinový charakter. Nicméně může polypeptidická skupina obsahovat některé nepeptidické prvky. Například glykosylované polypeptidy nebo·synteticky modifikované proteiny jsou zahrnuty v této definici. Cílové skupiny mohou řídit sloučeninu k lokaci v biologickém sysytému. Vazebné proteiny a receptory mohou být popsány svojí afinitou pro určitý ligand.

Mnoho z polypeptidu použitelných v předloženém vynálezu je uvedeno ve zveřejněné PCT publikaci č. WO 92/16221, specificky zde zahrnuté jako odkaz. Tyto proteiny jsou dobře známé v oboru. Zvláště použitelné polypeptidy jsou TNF vazebné proteiny, nazývané také TNF inhibitory. TNF vazebný protein je zde definován tak, že znamená protein, který váže TNF.

Jedním TNF vazebným proteinem (TNFbp) je extracelulární část p55 TNF receptorů nebo TNF receptor I. In vivo je extracelulární část receptoru ztracena a cirkuluje v krevním proudu jako 30 kDa glykosylovaný protein, který se váže k TNF. Tento vazebný protein je také označován jako TNFbp-Ι nebo 30 kDa TNFbp. Čištění a aminokyselinové a nukleokyselinové sekvence tohoto TNF vazebného proteinu jsou uvedeny ve. . ____ zveřejněné evropské patentové přihlášce č. 90 113 673x9, která je zde zahrnuta jako odkaz:.

Tento, zveřejněný odkaz: také uvádí rekombinantní produkci glykosylovaných a deglykosylovaných forem tohoto TNF inhibitoru. Ačkoliv aktuální molekulová hmotnost deglykosylované formy tohoto inhibitoru je přibližně .1.8_; kDa, výraz 30 kDa TNF inhibitor zahrnuje glykosylované a deglykosylované formy.

Jak jsou., zde použity, výrazy- přirozeně -se -vyskytuj ící nativní a původního typu jsou synonymni.

Evropská patentová přihláška č. 90 113 673.9, zahrnutá zde jako odkaz, také obsahuje čištění a aminokyselinové a nukleokyselinové sekvence jiného THF inhibitoru nazývaného 40 kDa TNF inhibitor, Je také nazýván TNFbp-II a tento inhibitor ve své přirozeně se vyskytující formě, je glykosylovaná extracelulární část p75 nebo p85 TNF receptoru. Evropská patentová přihláška č. 90 112 673.9 také popisuje rekombinantní produkci glykosylovaných a deglykosylovaných forem tohoto 40 kDa inhibitoru. Nukleo- a aminokyselinové sekvence nativního 40 kDa TNF inhibitoru jsou uvedeny v tomto zzveřejněném odkazu. Ačkoliv molekulová hmotnost deglykosylované formy není 40 kDa, jak glykosylované tak deglykosylované formy tohoto TNFbp jsou označovány jako 40 kDa TNF inhibitor.

Evropská patentová přihláška č. 90 112 673.9 zahrnutá zde jako odkaz, dále uvádí rekombinantní produkci dvou TNF inhibitorů, které jsou částmi plné délky 40 kDa vazebného_;, proteinu. Tyto dva zeslabení se nazývají deltaSl a delta53 TNF inhibitory. Aminokyselinové a nukleokyselinové sekvence delta51 a delta 53 inhibitorů jsou uvedeny v tomto zveřejněném odkazu. >

Další .zvláště výhodné polypeptidy zahrnují interleukin-l receptorově antagoisty (IL-lra), jak je popsáno v US patentu č. 5075222, zahrnutém zde jako odkaz, inzulínu podobné růstový faktor vázající proteiny (IGFbp), CTLA4, a exon šest z destiček získaného růstového faktoru (PDGF), gliový příbuzný neutrofní faktor (GDNF), ciliární neutrofní faktor (CNTF), interleukin-4 receptor C'IL-4r), a inhibitory, a interleukin-1 receptor (IL-2r). Nukleové kyseliny, kódující přirozeně se vyskytující IL-lra a způsob exprese proteinu v E.coli jsou uvedeny v US patentu č. 5075222 Hannuma a spol..

Charakteristiky IL-2 receptorů a CR1, nukleové kyseliny, které je kódují a způsoby jejich přípravy jsou popsány ve zveřejněné PCT publikaci č. WO 92/16221, specificky zde zahrnuté jako odkaz.

Biologicky aktivní molekuly připojené k polymerům v konjugátech podle předloženého vynálezu mají reaktivní thiolovou skupinu před vytvořením vazby. Reaktivní thiolová skupina znamená -SH skupinu schopnou reakce s aktivovanými polymery jak je zde popsáno.

Příkladem reaktivního thiolu je -SH aminokyseliny cysteinu. Mnoho proteinů nemá volné cysteiny (cysteiny nezahrnuté v disulfidových vazbách) nebo jakoukoliv jinou reaktivní thiolskupinu. Navíc cysteinový thiol nemusí být vhodný pro navázání k polymeru, protože thiol není nezbytný pro biologickou aktivitu.. Navíc, proteiny musí být pro aktivitu složeny do určité konformace. V aktivní konformaci může'být cystein neschopný reakce se sulfonem protože, je. přítomen ve vnitřku proteinu. Navíc i dostupný cysteinový thiol, který není nezbytný pro. aktivi tu. může být nevhodným místem pro tvorbu navázání kpol.ymeru. Aminokyseliny , nepodstatné, pro aktivitu jsou nazývány neesenciální. Neesenciální cysteiny mohou být v nevhodných konjugačních místech, protože cysteinová poloha vzhledem k aktivnímu místu vede k inaktivaci polymeru po konjugaci k polymeru.. Podobně jako proteiny, mají mnohé jiné biologicky aktivní molekuly reaktivní thioly, které z důvodu podobných důvodům uvedeným výše, nejsou vhodné pro konjugaci k polymeru nebo neobsahují -žádnou reaktivní thiolovou skupinu-.

V souladu s tím se předložený vynález týká zavedení reaktivních thiolových skupin do biologicky aktivní molekuly, je-li to nezbytné'nebo Žádoucí. Thiolové skupiny mohou být také zavedeny do neaktivní molekuly za tvorby biologicky aktivní molekuly pokud vazba thiol-sulfon nezničí požadovanou aktivitu.

Reaktivní thiolové skupiny mohou být zavedeny chemickými způsoby dobře známými v oboru. Chemická modifikace může být použita s polypeptidy nebo nepeptidickými molekulami a zahrnuje zavedení samotného thiolu nebo jako části větší skupiny, například cysteinového zbytku, do molekuly. Příklad chemického zavedení thiolu je uveden v práci Jue-a R. a spol., Biochemistry, 17, str. 5399-5406 (1978). Může být také generován volný cystein v polypeptidu chemickou redukcí cyst inu s např. DTT.

Polypeptidy, které jsou modifikovány tak, aby obsahovaly aminokyselinový zbytek v poloze kde tento není přítomen v nativním proteinu před modifikaci se nazývají mutein. Pro vytvoření cysteinových muteinů mohou být neesenciální aminokyseliny nahrazeny cysteinem.nebo cysteinový zbytek muže být přidán k polypeptidu. Potenciální místa pro zavedení nenativního cysteinu zahrnují glykosylační místa a N nebo C

Mí konec polypeptidu. Mutace lysinu na cystein je také vhodná protože lysinové zbytky jsou často nacházeny na povrchu . proteinu v jeho aktivní konformaci. Navíc může odborník v oboru použít jakoukoliv informaci o vazebném nebo aktivním místě polypeptidu při výběru možných mutačních míst.

Odborník v oboru může také použít dobře známé rekombinantní DNA techniky pro vytvoření cystein muteinů. Může měnit nukleovou kyselinu, kódující nativní polypeptid pro kódování muteinu standardní místně řízenou mutagenezí.

Příklady standardních mutagenezních technik viz Kunkel T.A., Proč.Nat.Acad.Sci., sv. 82, str. 488-492 (1985) a Kunkel T.A.

a spol., Methods Enzymol., sv. 154, str. 367-382 (1982), obě práce jsou zde zahrnuty jako odkaz. Alternativně je možno chemicky syntetizovat nukleovou kyselinu, kódující mutein technikami, které jsou v oboru dobře známé. Mohou být použity přístroje pro syntézu DNA a jsou například dostupné od Applied Biosysteras (Foster City, CA). Nukleová kyselina, kódující požadovaný mutein může být exprimována v mnoha expresních systémech, zahrnujících živočišné, hmyzí a bakteriální systémy.

I

Jestliže je mutein rekombinantně produkován v bakteriálním expresním systému, provádějí se následující' stupně:

1) Vytvoří se nukleová kyselina, kódující požadovaný mutein, místně řízenou mutagenezí nukleové kyseliny, kódující nativní polypeptid;

2) nukleová kyselina, kódující požadovaný mutein je exprimována v bakteriálním expresním systému; ___________ ......

3) mutein se izoluje z bakterií a čistí;

4) jestliže není správně složen, mutein' se znovu skládá za přítomnosti cysteinu nebo jiné sulfhydryl obsahující' sloučeniny;

5) znovusložený mutein se izoluje a čistí; '

6) čištěný a znovu složený cílový mutein se zpracuje s mírným redukčním činidlem;

7) reakční směs se dialyzuje za nepřítomnosti kyslíku. .

Jak je uvedeno výše, muže být mutein izolován z reakční směsi před konjugací s polymerem, ale není to nezby-tné. Redukční činidlo používané ve stupni 6 je dithiotbreitol (DTT) nebo tris-(karboxyethylfosfin) (”TCEP). TCEP se používá proto, že nemusí být odstraňován před konjugací s thiol-specifickým PEG činidlem. Viz Burns J.A. a spol., »>··*

J.Org.Chem., sv, 56, č. 8, str. 2648-2650 (1991).

Po vytvoření muteinu může odborník v oboru mutein zkoumat v bioeseji a porovnávat aktivitu muteinu vzhledem k nativnímu polypeptidů. Jak je plně diskutováno dále, i když je relativní aktivita muteinu snížena, konjugát vytvořený z muteinu může být zvláště vhodný. Například může konjugát mít zvýšenou rozpustnost, sníženou antigenicitu nebo imunogenicitu nebo redukovanou dobu clearence v biologickém systému vzhledem k nekonjugované molekule. Taková zlepšení ve farmaceutické účinnosti biologicky aktivní molekuly mohou zvýšit hodnotu molekuly v různých terapeutických aplikacích. Zvýšená rozpustnost může také zlepšit hodnotu molekuly pro in vitro diagnostické aplikace.

Tabulka 1 uvádí seznam muteinú IL-lra, které byly produkovány. Příprava a čištění IL-lra muteinů jsou uvedeny v PCT patentové publikaci č. WO 92/16221, specificky zde zahrnuté jako odkaz. Číslování zbytků je založeno na posloupnosti uvedené v této publikované přihlášce s 0 označující adici aminokyselina na N-konci; c označuje cystein a s ozmačuje šeřin. Například c0sil6 označuje cystein inzertovaný na N konec a serin inzertovaný do polohy 116. Nativní IL-lra má volné cysteinové zbytky v polohách 66, 69, 116 a 122.

Tabulka 1

Muteiny IL-lra cOslló cO c 8 4 s 116 c6 c8s116 c9sl16 c 141 s 116 c8 c9 cl41

Tabulka 2 představuje muteiny 30 kDa TNF inhibitoru, které byly také připraveny. Nativní 30 kDa TNF inhibitor, na rozdíl od IL-lra, nemá žádné volné cysteinové zbytky. Tyto muteiny byly připraveny jak je uvedeno v publikované PCT přihlášce č. WO 92/16221, specificky zde zahrnuté jako odkaz a číslování je založeno na aminokyselinové sekvenci tam uvedené.

Tabulka 2

Muteiny 30	kDa	TNF inhibitoru
cl05	30kDa	TNF	inhbitor
cl	30kDa	TNF	inhibitor
cl4	30kDa	TNF	inhibitor
clil	30kDa	TNF	inhibitor
c 161	30kDa	TNF	inhibi tor
	Muteiny a	jiné polypeptidy podle předloženého vynálezu

zahrnují allelické variace v proteinové sekvenci a podstatně . ekvivalentní proteiny) Podstatné ekvivalentní znamenávykazující velmi vysoký stupeň homologie aminokyselinových zbyktú.(viz obecně M.Dayhoff, Atlas of Protein SEquence and Structure, sv.5, str. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., práce je zde specificky zahrnuta jako odkaz), jakož i vykazující srovnatelnou biologickou aktivitu. V rozsahu vynálezu jsou zahrnuty i zeslabené formy nativního polypeptidu nebo muteinu, které si v podstatě uchovávají biologickou aktivitu nativního polypeptidu nebo muteinu.

Konjugáty. podle předloženého vynálezu obsahují, navíc k biologicky aktivním molekulám, majícím reaktivní thiolskupiny, nepeptidické polymerní deriváty, mající aktivní sulfonové skupiny. Nepeptidické znamená mající méně než 50 % hmotn.

α-aminokyselinových zbytků.

Polymerní část polymerního derivátu může být, například, polyethylenglykol (PEG), polypropylenglykol (PPG), polyoxyethylovaný glycerol (POG) a po 1yoxyethylované polyoly, polyvinylalkohol (PVA) a jiné polyalkylenoxidy, polyoxyethylovaný sorbitol nebo polyoxyethylovaná glukóza. Polymer může být homopolymer, náhodný nebo blokový polymer, terpolymer na bázi výše uvedených monomerů, s přímým řetězcem nebo rozvětveným, substituovaný nebo nesubstituovaný pokud má alespoň jednu aktivní sulfonovou skupinu. Polymerní část může být jakékoliv délky nebo molekulové hmotnosti ale tytocharakteristiky budou ovlivňovat biologické vlastnosti. Polymerové průměrné molekulové hmotnosti vhodné pro snížení rychlosto clearence ve farmaceutických aplikacích jsou v rozmezí 2000 až 35000 daltonú. Navíc, jsou-li dvě skupiny připojeny k polymeru, na každém konci jedna, délka polymeru může ovlivnit účinnou vzdálenost a jiné prostorové vztahy mezi dvěma skupinami. Odborník v oboru tak může měnit délku polymeru pro optimalizaci nebo získání' požadované biologické aktivity. Je-li polymer PEG s přímým řetězcem, zvláště vhodné délky polymerů představované (Z)_n, kde Z je monomerní. j edno.tka polymeru, zahrnují n v rozmezí 50 až 500. V určitých provedeních předloženého vynálezu je n větší než 6 a výhodně větší než 10.

+

Monomethoxypolyethylenglykol je zde označován jako mPEG. Výraz PEG znamená jakékoliv z mnoha kondenzačních polymerů ethylenglykolu. PEG je také znám jako polyoxyethylen, polyethylenoxid, polyglykol a polyetherglykol, PEG může být také připraven jako kopolymery ethylenoxidu a mnoha jiných monomerů. Pro mnoho biologických nebo biotechnických aplikací bude používán v podstatě lineární, viny1 sulfonem aktivovaný

PEG. s přímým řetězcem, který je v podstatě nesubstituovaný s výjimkou vinylsulfonu.

PEG je vhodný pro biologické aplikace z mnoha důvodů. PEG je typicky čirý, bezbarvý, nezapáchá, rozpustný ve vodě, stalý za tepla, inertní k mnoha chamickým činidlům a není toxický. PEGylace může zlepšír farmakokinetickou účinnost molekuly zvýšením zjevné molekulové hmotnosti molekuly. Zvýšení zjevné molekulové hmotnosti redukuje rychlost clearence z těla po subkutánním nebo systémovém podání. V mnoha případech PEGylace může zvyšovat antigenicitu a imunogenicitu. Dále může PEGylace zvyšovat rozpustnnost biologicky aktivní molekuly.

Polymerní deriváty podle předloženého vynálezu mají aktivní sulfonové skupiny. Aktivní sulfon znamená sulfonovou skupinu, ke které je navázána douuhlíkóvá skupina,' mající reaktivní místo pro thiol-specifickou kopulaci ke druhému uhlíku ze'sulfonové skupiny při pH asi 9 nebo menším. Příklady aktivních sulfonů zahrnují, ale nejsou tak omezeny, ·’?vinylsulfon a aktivovaný ethylsulfon. Příkladem aktivního ethylsulfonu je -SO2-CH2-CH2-Z, kde Z je halogen nebo jiná, odštěpí telná skupina schopná substituce thiolem za vzniku., sulfon-thiolového spojení -SO2-CH2-CH2-R, kde R představuje biologicky aktivní molekulu. Sulfon-aktivovaný polymer může být dále substituován, pokud thiol-specifická reaktivita na druhém uhlíku je zachována při pH asi 9 nebo méně.

Sulfon-aktivované polymery podle předloženého vynálezu mohou být syntetizováhy_v alespoň čtyřech stupních..,Stručně,. . první stupeň je zvýšení reaktivity místa na polyme.ru, typicky na koncové skupině, například aktivací nebo substitucí. Druhý stupeň je vazba síry přímo k atomu uhlíku v polymeru ve formě, která muže být převedena na ethylsulfon nebo ethylsulfonový derivát, mající podobné reaktivní vlastnosti. Ve třetím stupni se síra oxiduje na sulfon. Ve čtvrtém'stupni je aktivován druhý uhlík ze sulfonové skupiny.

Syntéza sulfon-aktivovaného polymeru je popsána podrobněji dále za použití syntézy sulfon-aktivovaného PEG jako příkladu. První stupeň je hydroxylová aktivace hydroxylové skupiny v PEG. Výraz hydroxylová aktivace by zde měl být interpretován jako znamenající substituci jakož i esterifikaci a jiné metody hydroxylové aktivace. Typicky v hydroxylové aktivaci reaguje kyselina nebo derivát kyseliny jako je halogenid kyseliny .s PEG za vzniku reaktivního esteru, ve kterém jsou PEG a kyselá skupina spojeny přes esterovou vazbu.· Kyselá skupina je obecně reaktivnější než hydroxylová skupina. Typicky jsou estery sulfonátové, karboxylátové a fosfátové estery.

Halogenidy sulfonylkyselin, které jsou vhodné pro použití ve vynálezu zahrnují, ale nejsou tak omezeny, například methansulfonylchlorid (známý také jako mesyIchlorid) a p-toluensulfonylchlorid (zna^ také jako tosylchlorid) Methansulfonátové estery jsou někdy označovány jako mesyláty.

•f

Toluensulfonátové estery jsou někdy označované jako tosyláty.

V substitučním typu hydroxylové aktivace je celá skupina na PEG nahrazena reaktivnější skupinou, typicky halogenidem.

Například thionylchlorid může reagovat s PEG za vzniku reaktivnjěšího chlorem substituovaného PEG.

*

Je-li PEG výchozím materiálem, je typicky reakční produkt prvního stupně ester nebo halogenem substiuovaný PEG.

Ve druhém stupni je ester nebo halogen nahrazen alkoholem, který obsahuje reaktivní thiol připojený k ethylové skupině, thiolethanolovou skupinu. Thiolethanol je příklad vhodného alkoholu. V tomto stupni je síra ve thiolu navázána přímo k uhlíku na polymeru.

Dále ve třetím stupni se síra oxiduje na sulfon. Vhodná oxidační činidla například zahrnují peroxid vodíku, boritan sodný, nebo peroxykyseliny.

Vě čtvrtém stupni se aktivuje hydroxylové skupina alkoholu použitého ve stupni dvě. Tento stupeň je podobný prvnímu stupni v reakční sekvenci. Substituce je typicky halogenem za vzniku halogenethylové skupiny nebo jejího derivátu, majícího reaktivní místo na druhém atomu uhlíku odstraněném ze sulfonové skupiny. Typicky bude druhý uhlík na ethylové skupině aktivován chloridovým nebo bromidovým halogenem. Hydroxylové aktivace by měla poskytnout místo podobné reaktivity jako' je sulfonátový ester. Vhodná činidla jsou, například kyseliny, halogenidy kyselin a jiné drive uvedené při diskusi o prvním stupni reakce. Thionylchlorid je zvláště vhodný pro substituci hydroxylové skupiny atomem chloru.

Výsledný polymerní aktivovaný ethylsulfon je stabilní, izolovatelný a vhodný pro thiolselektivní kopulační reakce.

PEG chlorethylsulfon je stabilní ve vodě při pH asi 7 nebo menším, ale přesto muže výhodně být použit pro thiol-selektivní kopulační reakce při podmínkách bázického pH až alespoň asi pH 9. Při pH nad 9 je thiolová selektivita potlačena a sulfonová skupina se stává o něco reaktivnější a aminoskupinami. Vazba vytvořená po reakci s thiolem je také hydrolyticky stabilnější.

V pátém stupni, který může být přidán k syntéze reaguje aktivovaný ethylsulfon s bází za vzniku PEG vinylsulfonu nebo některého z jeho aktivních derivátů pro thiol-selektivní kopulaci. Vhodné báze zahrnují, například, hydroxid sodný nebo triethylamin. Podobně jako aktivované ethylsul'fony, je vinylsulfon hydrolyticky stabilní, izolovatelný, thiol-selektivní a tvoří hydrolyticky stabilní vazby při reakci s thiolem.

Jak je zde použito hydrolyticky stabilní znamená že vazba mezi polymerem a sulfonovou skupinou a mezi sulfon-thiolem po konjugaci nereaguje s vodou při pH menším než asi 11 po alespoň tři dny. Hydrolytická stabilita je žádoucí, protože je-li rychlost hydrolýzy podstatná, může polymer být deaktivován před tím, než proběhne reakce mezi polymerem a thiolem biologicky aktivní molekulou.

ΛJak je uvedeno výše, například lineární PEG s aktivními ' ' · .t místy na každém konci se bude připojovat k proteinu na jednom konci, ale, je-li rychlost hydrolýzy podstatná, bude reagovat s vodou na jednom konci pro začepičkování s relativně nereaktivní hydroxylovou skupinou, spíše než vytvoření činkové molekulární struktury s připojenými proteiny nebo/ jinými žádoucími skupinami na každém konci. Podobný problém vzniká při kopulaci molekuly k povrchu u PEG spojovacího činidla, protože PEG je nejprve připojen k povrchu nebo » , kopulován k molekule a protilehlý konec PEG derivátu musí zůstat aktivní pro následující reakci. Jestliže je hydrolýza problémem, pak se protilehlý konec typicky stane inaktivovaným.

Alternativně, sulfon-aktivované deriváty mohou být připraveny připojením spojovacího činidla, majícího sulfonovou skupinu k PEG (nebo jinému polymeru) aktivovanému s jinou funkční skupinou. Například amino aktivovaný PEG může reagovat za vhodných podmínek při pH asi 9 nebo méně, s malou molekulou, která má sukeinimidy1ovou aktivní esterovou skupinu na jednom konci a vinylsulfonovou na druhém konci. Amino-aktivovaný PEG tvoří stabilní spojení se sukcinimidyl esterem.' Výsledný PEG je aktivován s vinylsulfonem na konci a je hydrolyticky stabilni: PEG-NH-OC-CH2-CH2-SOzCH=CH₂.

Podobně aktivovaného PEG je možno dosáhnout reakcí amin-reaktivního PEG jako je sukcinimidyl aktivní ester PEG, PEG-COz-NHS, s malou molekulou, která má aminoskupinu na jednom konci a viny 1sulfonylskupinu na druhém konci.

PEG chlorethylsulfon a PEG vinylsulfon byly připraveny jak je uvedeno v příkladu 1. Thiol-selekťi vní reaktivita PEG vinylsulfonu a chlorethylsulfonu je uvedena v příkladu 2. Hyďrolytická stabilita Spojení polymer-sulfon u dvou sloučenin je uvedena v příkladu 3. Hydrolytická stabilita spojení mezi thiolem a sulfonem je uvedena v příkladu 16.

Jestliže polymer nemá hydroxylovou skupinu, může tato být adována chemickými metodami dobre'v oboru známými před provedením stupňů popsaných výše. Aktivované polymerní deriváty podle předloženého vynálezu mohou mít více než jednu reaktivní skupinu. Deriváty mohou být monofunkční, bifukční nebo multifunkční. Reaktivní skupiny mohou být stejné (homofunkční) nebo odlišné (heterofunkční) pokud zde je “ alespoň jedna aktivní sulfonová skupina..

Dva zvláště vhodné homobifunkční deriváty jsou PEG-bis-chlorsulfon a PEG-bis-vinylsulfon. Odborník v oboru může syntetizovat tyto molekuly za použití¹ PEG, majícího hydroxylové skupiny na každém konci jako výchozího materiálu a pak obecnou metodou uvedenou výše.

Mohou být také syntetizovány heterobifunkční deriváty.

Dva zvláště vhodné heterobifunkční deriváty zahrnují například lineární PEG s bud vinylsulfonem nebo maleimidem na jednom konci a N-hydroxysukcinimidesterem (NHS-ester) na druhém konci. NHS-ester je amin-specifický. PEG, mající NHS-ester na jednom konci a aktivovanou sulfonovou skupinu na druhém,může být připojen jak k lysinovému tak cysteinovému zbytku. Je možno dosáhnout stabilního aminového spojení, umožňujícího hydrolyticky stabilnímu nezreagovanému sulfonu, aby byl dostupný pro následující reakci s thiolem. Tyto dva heterobifunkční PEG deriváty byly syntetizovány jak je popsáno v příkladech 5 a 6. Jestliže se heterobifunkční činidlo maleimid NHS-ester vyrobí za použití PEG s přímým řetězcem, představovaným (Z)n, kde Z je monomerní jednotka, je n větší než 6 a výhodn větší než 10.

Jiné aktivní skupiny pro heterofunkční sulfon-aktivované PEG mohou být vybrány ze mnoha různých sloučenin. Pro biologické a biotechnické aplikace by substituenty typicky měly být vybrány z reaktivních skupin typicky používaných v PEG chemii pro aktivaci PEG jako jsou aldehydy, trifluorethylsulfonáty (někdy nazývané tresyláty), n-hydroxylsukciimid ester, kyanurchlorid, kyanurfluorid, acylazid, p-dia2obenzylová skupina,

3-(p-diazofenyloxy)-2-hydroxypropyloxyskupina a jiné.

Příklady aktivních skupin jiných než sulfon jsou uvedeny v práci Davise a spol., US patent č. 4179337; LEE-a a spol.,

US patent č. 4296097 a 4430260; Iwasaki a spol., 4670417;

Katre a spol., US patent č. 4766106, 4917888 a 4931554;

Nadagawa a spol. US patent č. 4791192; Nitecki a' spol., US patent č. .4902502 a 5089261; Saifer US patent č. 5080891; Zalipsky US patent č. 5122614; Shadle a spol., US patent č. 5153265; Ehee a spol. US patent č. 5162430; zveřejněná evropská patentová přihláška č. 0247860; a PCT mezinárodni Přihlášky č. US 86/01252; GB 8901261; GB 89/01262; GB 89/01263; US 90/03252; US 90/06843; US 91/06103; US 92/00432 a US 92/02047 jejich obsahy jsou zde zahrnuty jako odkaz.

Například trifunkční derivát je glycerolový řetězec, ke kterému jsou připojeny.tři vinylsulfon PEG skupiny. Tato molekula může být znázorněna vzorcem:

PEG-SO₂~CH=CH₂

PEG-SO₂-CH=CH₂

.......' ' peg;SÓ2-ch=ch₂ . .. X

Tento derivát byl připraven jak. je popsáno-v pří kladu*·!^.

*

Jiným příkladem multi funkčního derivátu je hvězdicová molekula. Hvězdicové molekuly jsou obecně popsány v Merrillově US patentu č. 5.171264, zahrnutém zde jako odkaz. Hvězdicové molekuly mají jádrovou strukturu, ke které je připojeno mnoho PEG řetězců nebo ramen Sulfonové skupiny mohou být použity pro poskytnutí aktivní, funkční skupiny na konci PEG řetězce, rozprostírající se z jádra a jako spojení pro připojení „ _funkční skupiny nebo. jiné skupiny k ramenům-hvězdicové molekuly.

Odborníkům v oboru by mělo být zřejmé, že aktivované polymery diskutované výše by mohly být použity pro uskutečnění mnoha různých substituentú a kombinací substituentu.

Jak je uvedeno výše, jsou konjugáty podle předloženého vynálezu vytvořeny reakcí thiol-obsahujících biologicky aktivních molekul se sulfon-aktivovanými polymery. Spojení mezi thiol-reaktivní skupinou a sulfon-aktivovaným polymerem je kovalentní vazba.

Obecně metoda pro přípravu konjugátů podle předloženého vynálezu zahrnuje následující stupně:

(1) volbu požadované biologicky aktivní molekuly a stanovení, zda molekula vakazuje volnou thiolovou skupinu prostředky známými v oboru.Viz například Allen G., Sequencing of Proteins and Peptides, str. 153-54, v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Work, T.S., a Burdon E.H. , vyd. (1972), zahrnuto jako odkaz. Jestliže molekula má volný thiol, pokračuje se stupněm 3. Jestliže molekula nemá

A volný thiol, postupuje se podle stupně 2.

(2) Jestliže v molekule neexistuje žádný volný thiol, přidá se thiol jak je popsáno výše. Po přídavku thíolu se provede bioesej pro stanovení, je-li zachována požadovaná biologická aktivita nebo část biologické aktivity.

(3) Syntetizuje se požadovaný sulfon-aktivovaný polymer jak popsáno výše.

(4) Aktivovaný polymer reaguje s molekulovou, mající volný thiol.

(5) Reakční produkt se izoluje za použití chromtografických technik dobře známých v oboru. Pro proteinové konjugáty viz například Scopes R., Protein PurifÍcation, Cantor C.R. vyd.,

Springer-Verlag, New York (1982). Pro neproteinové molekuly viz např. Still W.C. a spol., J.Org.Chem., 43, str. 2923-2925 (1978). Jestliže se nevytváří žádný konjugát, aduje se thiol k jinému místu biologicky aktivní molekuly a opakují se stupně (4) a (5).

(6) Stanoví se biologická aktivita vytvořeného konjugátu za použití relevantního bioeseje.

Odborník v oboru může přidat nebo vypustit .některé stupně. Například by odborník v oboru nemusel zkoušet bioaktivitu ve stupni 2 nebo by mohl předpokládat biologickou aktivitu po PEGylaci podle předchozích pokusů. Odborník v oboru může také přidat stupeň měnění velikosti, délky nebo molekulové hmotnosti linkeru pro optimalizací nebo udělení biologické aktivity. .....

Byly.připraveny některé konjugáty. 30kDa TNFbp cl05 mutein popsaný výše byl konjugováh s PEG vinyl sulfonam*jak je popsáno v příkladu 10. Příklad 8 ukazuje, že nativní- PE-Hra, který obsahuje čtyři volné cysteiny, reaguje za podobných podmínek. c84 IL-lra mutein reaguje také dobře. Příklad 13 ukazuje konjugaci.tří 30kDa TNF inhibitorových muteinú ke třem PEG řetězcům navázaným ke glycerolovému základnímu řetězci.

Konjugáty podle předloženého vynálezu mohou být použity pro různé účely, zahrnující, ale neomezující se tak, in-vitro diagnostické eseje a přípravu farmaceutických kompozic.. Mnoho z konjugátů podle předloženého vynálezu má alespoň jednu, z následujících charakteristik vzhledem k nekonjugované molekule: . .

(1) zvýšenou rozpustnost, ve vodném roztoku;

(2) redukovanou antigenicitu nebo imunogenicitu;

(3) redukovanou rychlost clearence po subkutánním nebo systémovém podání díky zvýšení zjevné molekulové hmotnosti.

Zvláště vhodné jsou farmaceutické přípravky konjugátu, obsahujících IL-lra. Il-lra, samotný nebo v kombinaci se 30kDa TNF vazebným proteinem, může být použit pro léčení arthritis, zánětlivé střevní choroby, septického šoku, ischemického poškození, reperfuzního poškození, osteoporozy, astma,

I inzulínového diabetů, myelogenní a jiných, leukémií, psoriasy, syndromu respiračního stresu dospělce, kachecie/anorexie a pulmonární fibrozy.

’ Sa

Konjugáty, obsahující TNF vazebné proteiny (TNFbp) isou také zvláště vhodné. Takové konjugáty mohou být použity pro léčení TNF-zprostředkovaných chorob jako je syndrom respiračního stresu dospělce, pulmonární fibroza, artritis, septický šok, zánětlivá střevní choroba, skleróza multiplex, odmítání transplantátu a hemorrhagické trauma.

%

Biologicky aktivní konjugáty podle předloženého vynálezu mohou dále obsahovat nebiologicky aktivní skupiny.

Předložený vynález také zahrnuje v podstatě čištěné sloučeniny, mající vzorec R1-X-R2 kde alespoň jeden z Ri a R2 je biologicky aktivní molekula, mající reaktivní thiolovou skupinu, která tvoří kovalentní vazbu s X, Michael akceptor-aktivovaný polymer. V předloženém vynálezu se R1-X-R2 zachovává biologickou aktivitu Rt nebo R2. Molekuly,, mající vzorec R1-X-R2 jsou zde označovány jako činkové molekuly.

Jak je uvedeno výše jsou sloučeniny podle předloženého vynálezu v podstatě čištěné. V podstatě čištěné jak je zde tento výraz použit, znamená homogenní kompozici”. Homogenní kompozice obsahuje molekuly R1-X-R2 a je v podstatě prostá sloučenin, které (1) se liší od složení Ri R2, nebo (2) jsou spolu spojeny více než jedním aktivovaným polymerem. Homogenní kompozice může obsahovat molekuly R1-X-R2, které se lisí v délce X'. Pro polymery se přímým řetězcem, představovaným (Z)_n, kde Z je monomerní jednotka, n je větší než 6 a výhodné větší než 10. Pro homogenní kompozici Ri a R2 nemusí být připojeny k X ve stejném místě na X nebo ve stejném místě kterékoliv-R skupiny.

X je nepeptidický polymer, mající' první reaktivní skupinu a druhou reaktivní skupinu. Reaktivní skupina je skupina schopná reakce s R. Alespoň jedna reaktivní skupina na X je akceptor,Michae1-typu. Výraz reaktivní skupina a funkční skupina se zde používá synonymně. Výrazy Michael akceptor a akceptor Michael typu se zde také používají synonymně. Polymery vhodné pro použití v předloženém vynálezu jsou také diskutovány výše a zahrnují, například, PEG, POG a PVA. .

Michael akceptory jsou funkční skupiny náchylné k Michaelově adici. Michaelova adice zahrnuje nukleofilní atak na.elektrofi lni centrum, které je připojeno k pí systému, majícímu elektronegativní atom. Příklady pí systémů, majících elektronegativní atom zahrnují sulfoxid, sulfonyl, karbonyl a heterocyklické aromáty. Nukleofil aduje k elektrofilnímu centru.Nukleofi 1 se aduje k elektrofilnímu centru.

Michaelův akceptor může být představován vzorcem:

Ει

II

3- 2 // kde E je elektronegativní atom. Adice probíhá v poloze 4 za vzniku

Ei

Nu -!/

ji kde Nu představuje, nukleofil nyní'navázaný k atomu v poloze 4 Funkční skupiny Michael' akceptoru zahrnují, ale nejsou tak omezeny, maleimid a vinylsulfon. Aktivovaný polymer, ze kterého se vytvoří činka, může ale nemusí obsahovat vinylsulfonové druhy Michael akceptoru. Aktivované polymery podle předloženého vynálezu zahrnují PEG, mající dvě nebo více Michael akceptor skupin, zahrnujících například PEG-bis-vinylsulfon a PEG-bis-maleimid PEG-bis-vinylsulfon byl připraven jak je popsáno v příkladu 7 PEG-bis-maleimid byl připraven jak je popsáno v PCT publikaci č. WO 92/16221, zahrnuté zde jako odkaz.

Alespoň jeden z Ri a S2 je biologicky aktivní před kopulací k X nebo k X-R. Biologicky aktivní má stejnou definici jak je uvedeno výše. Jak je uvedeno výše zahrnuje biologicky aktivní molekula, ale není tak omezena, -vazebné proteiny a cílové skupiny. Jak Ri tak R2 mohou být biologicky aktivní, ale není to nezbytné. V některých případech, mají-li Rl a R2 afinitu pro stejný ligand, může činka mít.větší afinitu pro ligand než Rt nebo R2 samotný. Zveřejněná PCT publikace č. WO 92/16221 uvádí, Že homočinka, obsahující dvě molekuly 30kDa TNFbp spojený s PEG polymerem je lepší při inhibici cytotoxicity TNF v in vitro esejích než samotná molekula 30kDa. V některých případech může Ri být molekula, která řídí sloučeninu R1-X-R2 k určitému místu v „biologickém systému a R2 muže mít afinitu pro ligand v této lokaci. Alternativně může být pouze jeden z Rt a Ri biologicky aktivní ve sloučenině R1-X-R2. Nebiologicky aktivní skupina~může-.býtpovrchooyá nebo jakákoliv jiná biologicky inertní molekula nebo sloučenina.

V„.předloženém vynálezu .má biologicky aktivní R„skupina . reaktivní thiolovou^- skupinu.' Biologicky aktivní~R’ skupina.můž'e být syntetická molekula. Jak je zde použit, znamená výraz . syntetická molekula.molekulu, ke které byla přidána reaktivní thiolová skupina. Syntetické molekuly zahrnují, například, muteiny, obsahující nenativní.cysteiny. Thiolová skupina reaguje s akceptorem Michael-typu v polymeru za vzniku kovalentní vazby.

Po vytvoření této kovalentní vazby si biologicky aktivní molekula zachovává svoji biologickou aktivitu. R skupina si udržuje svoji biologickou aktivitu v rozsahu vynálezu, jestliže, po reakci s aktivovaným polymerem, má alespoň jednu , desetinu biologické aktivity, kterou měla před reakcí s polymerem, výhodně alespoň 40 % a výhodněji alespoň 60 X.

Obecně metoda pro výrobu činek zahrnuje:

(1) volbu R skupiny, umožňující požadovanou biologickou aktivitu, například proteinu jako je faktor tumorové nekrozy (TNFbp).

(2) Měření aktivity za použití relevantní bioeseje.

(3) Stanovení počtu volných sulfhydry 1ových skupin, například, cysteinových zbytků nezahrnutých v disulfidové vazbě, obecně za použití známých metod v oboru. Jednu z takových metod popisuje Allen G., Sequencing of proteíns and peptides, str. 153-54, v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Work T.S. a Burdon R.H., vyd. (1972). Jestliže zde nejsou žádné volné cysteiny, postupuje se podle stupně 4(a). Je-li zde jeden volný cystein, nebo pouze jeden dostupný pro PEGylační činidlo, postupuje se podle reakčního stupně 4(c). Jestliže protein má více než jeden volný cystein, postupuje se podle stupně 5.

(4) Je-li R polypeptid a neexistuje žádný volný cystein:

(a) Vytvoří se mutein inzertováním cysteinu nebo nahrazením necysteinového zbytku cysteinem. Vhodná mutační místa zahrnují N nebo C terminální konce proteinu, glykosylační místa nebo lysinové zbytky. Muteiny mohou být vyrobeny rutinně, jak je uvedeno výše, chemickou syntézou nebo rekombinantní technologií. Alternativně se chemicky přidá thiolová skupina.

(b) Měří se aktivita a porovná s aktivitou naměřenou ve stupni 2. ) »

Cc) Jestliže si mutein udržuje aktivitu naměřenou ve stupni 2, reaguje mutein s polymerem, jako je PEG, majícím jedinou sulfhydryl-preferovanou reaktivní skupinu. Jestliže se mutein váže k mono-reaktivnímu PEG (stává se PEGy1 ováným), měří se aktivita a porovná se s aktivitou naměřenou ve stupni 2. Jestliže si PEGylovaný mutein udržuje aktivitu naměřenou ve stupni 2, reaguje nePEGylovaný mutein s PEG, majícím dva thiol-specifické Michael akceptory, jako je bis-maleimid, pro vytvoření činkovým molekul. Opakuje se bioesej pro potvrzení, že si^:činky zachovávají biologickou aktivitu.

Jestliže odborník v oboru žádá,, aby Ria R2 byly odlišné, bis-reaktivní polymerní skupina může být ponechána reagovat v sérii s Ri a Rz. Před reakcí polymeru s Ri, je jedna ze dvou funkčních skupin polymeru blokována nebo chráněna způsoby známými v chemickém oboru za vzniku chráněné skupiny na X. Viz například Greene T.W. a spol., Protective Groups in Organic Synthesis;· John Wiley and Sons, lne. (1991), práce je zahrnuta, zde j ako. odkaz.-V tomto.kontextu chráněný znamená.funkční skupinu, která není dostupná pro reakci. Jestliže X mající chráněnou skupinu reaguje s Ri, vznikne Ri-X a ne R1-X-R1. Po vytvoření Ri-X se před .reakcí, s-R2 odstraní, blokuj ící. nebo. chránící, skupina.. . Deprotekce. znamená- , «že. chránící', skupina · je odstraněna nebo je funkční, skupina·, jinak dostupná-pro. reakci. ' '

Alternativně mohou být vytvořeny heteročinky reakcí Ri s přebytkem bis-aktivovaného polymeru pro posílení tvorby Ri-X. Po reakci se Ri-X oddělí z reakční směsi za použití chromatografických technik dobře známých v oboru, zahrnujících například iontovýměnn.o.u.. chromatograf.i i. . Rt-X. pak, reaguje s <Rz za vzniku Ri-X-R2.

(d) Jestliže si mutein vytvořený ve stupni 4(a) nebo PEGylovaný mutein vytvořený ve stupni 4(c) nezachovává podstatné biologickou aktivitu, vyjde se z nativního proteinu, vytvoří se jiný mutein a opakují se stupně 4(b) a 4(c). Dále muže být délka nebo molekulová hmotnost polymeru X změněna pro optimalizaci nebo udělení biologické aktivity.

(5) U proteinů s více než jedním volným cysteinem se provede monoPEGylace, bioesej a reakce s bifunkčním PEGylačním činidlem. Jestliže se utvoří vyšší uspořádané struktury, tj. více než dva proteiny jsoU PEG-napojeny, oddělí se činky chromatografickými metodami známými v oboru. Jestliže je separace nežádoucí z jakéhokoliv důvodu, vypustí se nebo nahradí volný cystein jinou aminokyselinou a postupuje se podle stupně 4(b).

(6) U neproteinových biologicky aktivních R skupin se použijí volné sulfhydrylové skupiny pro připojení k polymeru X. Je-li to nezbytné nebo žádoucí přidají se k molekule volné sulfhydrylové skupiny.

Odborník v oboru by měl být schopen modifikovat, přidat nebo vynechat určité stupně. Například by mohl zvolit reakci $ aktivních proteinů s bifunkčním-PEG a přeskočit monoPEGy lačfií íl stupeň. A?

Byly připraveny některé činkové molekuly podle předloženého vynálezu. Publikovaná PCT přihláška č. WO 92/16221, která je zde zahrnuta jako odkaz, uvádí přípravu následujících činek za použití bis-maleimido-PEG: 30kDa TNF inhibitor homočínky, IL-2 inhibitor heteročinka, heteročinky, které inhibují klasickou dráhu komplementového systému a I

IL-lra a PDGF heteročinky.

Mohou být připraveny farmaceutické kompozice, obsahující mnohé konjugátú nebo.sloučenin (kolektivně konjugáty) podle předloženého vynálezu. Tyto konjugáty mohou být ve ______________ farmaceuticky přijatelném nosiči a tvořit farmaceutické kompozice podle předloženého vynálezu. Výraz farmaceuticky přijatelný nosič jak je zde použit, znamená netoxické, obecně inertní vehikulum pro aktivní složku, které nepůsobí nežádoucím způsobem na složku nebo pacienta, kterému je kompozice podávána. Vhodná vehikula nebo nosiče mohou být nalezeny ve stabdardních farmaceutických učebnicích, například , v REmington's Pharmaceutical Sciences, 16. vyd., Mack

Publisbing Co., Easton, PA (1980), zahrnuté zde jako odkaz.

Takové nosiče zahrnují, například vodné roztoky jako jsou hydrogenuhličitanové pufry, fosfátové pufry, Ringerúv roztok a fyziologický salinický roztok. Dále může nosič obsahovat jiné farmaceuticky přijatelné přísady pro modifikaci nebo udržování ť*.

pH, osmolarity, viskozity, čirosti, barvy, sterility; rychlosti disoluce nebo vůně formulace.

Farmaceutické kompozice mohou být připravena metodami známými, v oboru., zahrnujícími například' jednoduché místění ' A činidel. Odborník v. oboru bude vědět, že volba farmaceutického nosiče a vhodné přípravy-kompozice závisí na zamýšleném .. Λ použití a způsobu podání.

.· V jednom provedení se uvažuje o tom, že nosič a konjugát tvoří fyziologicky kompatibilní, pomalu uvolňující formulaci.

Primární rozpouštědlo v takovém nosiči může mít bud vodný nebo nevodný charakter. Navíc, může nosič obsahovat farmakologicky přijatelné přísady pro modifikaci nebo u.držení.,..pH, „osmolarity.,. , viskozity, čirosti, barvy, sterility, rychlosti disoluce nebo vůně formulace. Podobně může.nosič obsahovat ještě další farmakologicky přijatelné přísady pro modifikaci nebo zachování stability, rychlosti disoluce, uvolnění nebo absorpce konjugátu. Takové přísady jsou substance obvykle a běžné používané pro formulaci dávek pro parenterální podání bud v jednotkové dávkové nebo multidávkové formě.

Jakmile se farmaceutická kompozice připraví, může být uchovávána ve sterilních lahvičkách jako roztok, suspenze, gel, emulze, pevný nebo dehydratovaný nebo lyofi 1izovaný prášek. Takové formulace mohou být uchovávány bud ve formě připravené pro použití nebo vyžadující rekonstituci bezprostředně před podáním. Preferované uchovávání takových formulací je při teplotě alespoň tak nízké jako jsou 4 °C a výhodné při -70 °C. Je také preferováno, Ze se takové formulace, obsahující konjugáty uchovávají a podávají při pH blízkém fyziologickému. Předpokládá se, že podávání ve formulaci při vysokém pH (tj.vyšším než 8) nebo při nízkém pH (tj. nižším než S) není žádoucí. .¾ &

&

Způsob podání formulací, obsahujících konjugáty pro systémové podání může· být subkutánní, intramuškulární, . ..

intravenozní, orální, intranasální nebo vaginálním nebo rektálním čípkem. Výhodný způsob podání formulací, ’· alji obsahujících konjugáty pro lokální podání je intraartikulár;ní, intratracheální nebo instilací nebo inhalací do respiračního traktu. Dále může být žádoucí podávat konjugáty ke specifickým částem Zažívacího traktu bud orálním podáním konjugátú ve vhodné formulaci nebo zařízením.

V dalším vhodném způsobu ošetření· osteoporozy a jiných chorob ztráty kostní dřeně se podává počáteční intravenozní injekce bolusu TNF inhibitor konjugátu a IL-1 inhibitor konjugátu následovaná kontinuální intravenozní infuzí TNF inhibitor konjugátu a IL-1 inhibitor konjugátu. Pro orální podáni je konjugát enkapsulován. Enkapsulovaný konjugát může být formulován s nebo·bez farmaceutických nosičů obvykle používaných pro kompoundování pevných dávkových forem.

Výhodně je kapsle vytvořena tak, že účinná část přípravku je uvolňována v bodě gastrointestináiního traktu, kde je maximalizována biovyužitelnost a minimalizována pre-systémová degradace. Mohou být obsaženy další přísady pro usnadnění absorpce konjugátu. Ředidla, příchutě, nízkotající vosky, rostlinné oleje, lubrikanty, suspendační činidla, činidla pro rozpad tablet a pojivá mohou být také použity.

Bez ohledu na způsob podání je specifická dávka vypočtena podle přibližné tělesné hmotnosti pacienta. Jiné faktory .při stanovení vhodné dávky mohou zahrnovat chorobu nebo. stav, které jsou ošetřovány nebo je prováděna jejich prevence,· způsob podání, věk, pohlaví a .medikální stav pacienta. V některých, provedení ch j sou. dávka, a podání navr.ženy-.pro . . vytvoření předem zvoleného koncentračního rozmezí konjugátu v. pacientově*krevním proudu.. Například^jse předpokládáv .že? zachování oběhových koncentrací TNF inhibitoru a IL-U. inhibitoru menších než 0,01 ng na ml v .plasmě nemusí být účinné složení; zatímco prodloužené .'udržování, oběhové; hlad iny.' v přebytku 10. pg na ml má. nežádoucí vedlejší:.účinky..’- DaLší. zlepšení výpočtů nezbytných pro stanovení vhodné dávky pro- léčení pro každý z výše uvedených přípravků, je v rukou odborníka v oboru a je možno,je provést bez experimentů, zejména vzhledem ke zde popsaným informacím o dávkách a esejích. Tyto dávky mohou být stanoveny použitím uznávaných esejů pro stanovení dávek použitých ve spojení s údaji o vhodné dávce-odezvě.

Mělo by být .uvedeno, že zde popsané konjugátové formulace mohou být použity pro veterinární jakož i humánní aplikace a že výraz pacient by neměl být vykládán omezujícím způsobem.

V případě veterinárních aplikací by dávkové rozmezí mělo být stejné jak je specifikováno výše.

Následující příklady jsou ilustrativní a neomezují nijak rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Syntéza

Reakční stupně mohou být stručné ilustrovány následovně:

(1) PEG-OH + CH3SO2CI -> PEG-OSO2CH3 (2) PEG-OSO2CH3 + HSCH2CH2OH -> PEG-SCIkCHxOH (3) PEG-SCH₂CH^OH + H2O -> PEG-SO2CH₂CHapH (4) PEG-SO2CH2CHJ.OH + SOCI 2 -> PEG-SO2CH2CH1CI ...

(5) PEG-SO₂CH₂CHiCl + NaOH -> PEG-SO₂CH=CHt + HCI

Každá z výše uvedených reakci je dále podrobněji popsána.

Reakce 1

Reakce 1 představuje přípravu methansulf ony lesťeru polyethylenglykolu, který může být označen jako methansulfonát nebo mesylát polyethylenglykolu. Tosylát a halogenidy mohou být připraveny podobnými postupy, o kterých se předpokládá, že budou zjevné odborníkům v oboru.

Pro přípravu mesylátu se dvacetpět gramů PEG o molekulové hmotnosti 3400 suší azeotropní destilací -ve 150 ml toluenu. Přibližně polovina toluenu se oddestiluje při sušení PEG. čtyřicet ml suchého dichlormethanu se přidá k toluenu a PEG roztoku a následuje ochlazení na ledové lázni. K ochlazenému roztoku se přidá 1,23 ml destilovaného methansulfonylchloridu, což je hmotnostní ekvivalent 1,6 vzhledem k PEG hydroxylskupinám a 2,66 ml suchého triethylaminu, což je hmotnostní ekvivalent 1,3 vzhledem k PEG hydroxylskupinám. Hmotnostní ekvivalent jak je zde použít může být míněn jako kombinovaná hmotnost a vztahuje se ke hmotnosti sloučeniny, která bude reagovat se hmotnostním ekvivalentem PEG hydroxylových skupin.

Reakce se necháprobíhat přes noc a během této doby se ohřeje na teplotu místnosti. Filtrací se odstraní vysrážený triethylamoniumhydrochlorid. Potom se objem zmenší na 20 ml na rotační odparce. Mesylát se vysráží přídavkem 100 ml studeného suchého ethyletheru. Analýza podle nukleární magnetická rezonance (NMR) ukazuje 100% konverzi hydroxylových skupin na mesylátové skupiny.

Reakce 2

- Reakce ^představuje tvorbu polyethyTěnglýko1 ' «...

merkaptoethanolu reakcí mesylátu s merkaptoethanolem.:xReakce způsobí odstranění methansulfonátového radikálu z PEG?·. Síra v merkaptoet.hanolovém radikálu, se připojí přímo k uhl.íku v.« základním řetězci uhlík-uhlík PEG.

Dvacet gramů mesylátu z reakce 1 se rozpustí ve 150^ml destilované vody. Roztok mesylátu a. vody se ochladí ponořením do ledové lázně. K ochlazenému roztoku se přidá 2,37 ml. merkaptoethanolu, což jsou 3 hmotnostní ekvivalenty vzhledem k PEG hydroxylovým skupinám. Přidá se také 16,86 ml 2N NaOH báze. Reakční směs se refluxuje 3 hodiny, což znamená, že páry stoupající ze zahřáté reakce byly kontinuálně kondenzovány a ponechány téci zpět do reakční smési.

Polyethylenglykol merkaptoethanolovy produkt byl třikrát extrahován dichlormethanem za použiti vždy přibližně 25 ml dichlormethanu. Organické frakce byly spojeny a sušeny nad bezvodým síranem sodným. Objem byl snížen na 20 ml a produkt byl vysrážen přídavkem 150 ml studeného suchého etheru.

NMR analýza v ds-DMSO (dimethylsulfoxid) poskytla následující píky pro PEG-SCH2CH3OH: 2,57 ppm, triplet, “CH2-S-; 2,65 ppm, triplet, -S-CH2-; 3,5 ppm řetězcový singlet; a 4,76 ppm, triplet, -OH. Integrace píku pro -S-CH2indikuje 100% substituci.

Reakce 3

Reakce 3 představuje peroxidovou oxidaci polyethylenglykol merkaptoethanolového produktu pro konverzi síry, S, na sulfon, SO2. Produkován je PEG-p-hydroxysulfon.

Dvacet gramů PEG-SCH2CH3OH se rozpustí ve 30 ml 0,123M„ roztoku kyseliny wolframové a ochladí se na ledové lázni.

Roztok kyseliny wolframové byl připraven rozpuštěním kyseliny v roztoku hydroxidu sodného o pH 11;5. a pak úpravou pH na 5/,6 ledovou kyselinou octovou. Dvacet ml destilované vody a 2,8$ >1 ml 30% peroxidu vodíku, což je hmotnostní ekvivalent 2,5 ;

vzhledem k hydroxylovým skupinám, bylo přidáno k roztoku kyseliny wolframové a polyethylenglykol merkaptoethanolu a reakce byla ponechána ohřát přes noc na teplotu místnosti.

Oxidovaný produkt byl třikrát extrahován dichlormethanem vždy za použití 25 ml dichlormethanu. Ochlazené organické frakce byly promyty zředěným vodným hydrogenuhličitanem sodným a sušeny bezvodým síranem horečnatým. Objem byl redukován na 20 ml. PEG-p-hydroxysulfonový produkt byl vysrážen přídavkem studeného suchého ethyletheru.

NMR analýza v d$-DMSO ukazuje následující píky pra PEG-SCH2CH3OH: 3,25 ppm, triplet, -CH2-SO2-; 3,37 ppm triplet, -SO2-CH2-; 3,50ppm základní řetězec; 3,77ppm, triplet, -CH2OH; 5,04ppm, triplet, -CH2OH; 5,04ppm, triplet, -OH. Hydroxylový pík při 5,04 ppm indikuje 85% substituci. Nicméně pík při 3,37 ppm pro -SO2-CH2- indikuje 100% substituci a je považován za významněj ší.

Reakce 4

Reakce 4 představuje konečný stupeň syntézy, izolaci a charakterizaci polyethylenglykolchlorethylsulfonu.

Pro syntézu produktu se dvacet gramů PEG-SO2CH2CH3OH, PEG-p-hydroxysulfonu, rozpustí v 10 ml čerstvě destilovaného thíonylchloridu a roztok se refluxuje přes noc. Thionylchlorid se destiluje nad chinolinem..Přebytek thionylchloridu se . odstraní destilací..Padesát ml toluenu a.50 ml. dichlormethanu se přidá a odstraní destilací. .

Pro izolaci produktu se PEG chlorethylsulfon rozpustí)ve 20 ml dichlormethanu a vysráží se přídavkem 100 ml studeného., suchého ethyletheru. Sraženina se krystaluje ;z 50 ml ethylacetátu pro izolaciproduktu.

Pro charakterizaci produktu se použije nukleární magnetická rezonance. NMR analýza PEG-SO2CH2CH3CI v de-DMSO poskytuje následující píky: 3,50 ppm, řetězec; 3,64 ppm, triplet, -CH2SO2-; 3,80 ppm, triplet, -SO2-CH2-. Malý triplet hydroxylové nečistoty se obj evu j e. při 3,94 ppm. Výpočet procentické substituce byl obtížný pro toto' spektrum,·pro proximitu důležitých píku k velmi velkému řetězcovému píku.

Reakce 5·

Reakce 5 představuje konverzi polyethylenglykolchlorethylsulfonu z reakčního stupně 4 na polyethylenglykolvinylsulfon a izolaci a charakterizaci vinylsulfonového produktu.

PEG vinylsulfon byl snadněji připravítelný rozpuštěním pevného PEG chlorethylsulfonu v dichlormethanovém rozpouštědle s následujícím přídavkem dvou ekvivalentu NaOH báze. Roztok byl filtrován pro odstranění báze a rozpouštědlo bylo odstraněno pro izolaci konečného produktu PEG-SO2CH2=CH3, PEG vinylsulfonu.

PEG vinylsulfon byl charakterizován NMR analýzou v dfi-DMSO dimethylsulfoxidu. NMR analýza vykazuje následující píky: 3,50ppm, řetězec; 3,73ppm, triplet, -CH2-SO2-; 6,21 ppm triplet, =CH2; 6,97 ppm, dublet dubletu, -SO2-CH-. 6,97 ppi $ pík pro -SO2-CH- indikuje 84% substituci. 6,21 ppm pík pro , =CH2 indikuje 94% substituci. Titrace s merkaptoethanolem a 2,2'-dithiopyridinem. indikuje 95%« substituci.

*;4;

Příklad 2 .

.s

Thiol-selektivní reaktivita

Příklad 2 ukazuje, Ze PEG vinylsulfon a jeho prekurzor PEG chlorethylsulfon jsou významně reaktivnější s thiolskupinami (-SH) než s aminoskupinami (-NH2) nebo iminoskupinami (-NH-). Sloučeniny, obsahující thiolskupiny jsou organické sloučeniny, které se podobají alkoholům, které obsahují hydroxylovou skupinu -OH, s tím rozdílem, že ve thiolech je kyslík hydroxylové skupiny nahrazen sírou. Thioly jsou někdy₍nazývány také sulfhydryly nebo merkaptany. PEG vinylsulfon obsahuje vinylsulfonovou skupinu -SO2-CH=CH2. PEG chlorovaný sulfon obsahuje chlorethylsulfonovou skupinu -SO2CH2CH3CI. '

Selektivita pro thiol je důležitá v proteinové modifikaci protože znamená, že cysteinové jednotky (obsahující -SH) budou modifikovány za přítomnosti lysinových jednotek (obsahujících -NH2) a histidinových jednotek (obsahujících -NH-).

Selektivita PEG vinylsulfonu pro thioly znamená, že PEG může být selektivně připojen k cysteinovým jednotkám, což chrání proteinovou aktivitu pro specifické proteiny a řídí počet PEG molekul připojených k proteinu.

Relativní reaktivita PEG vinylsulfonu se thiolovými a minoskupinami byla stanovena měřením rychlosti reakce PEG vinylsulfonu a Ν-α-acetyllysinmethylesterem as merkaptoethanolem. Μ-α-acetyllysinmethylester je lysinový· model, obsahující .aminoskupinu.a je zkrácen jako Lys-NHi; Merkaptoethanol slouží 'jakao cysteinový model ,' obsahuj.ící thiolovou skupinu a je zkrácen jako Cys-SH. Relativním* reaktivita chlorethylsulfonu byla stanovena podobně. ^KTaťo . mo 1 ekula, může. s 1 oužit jako .chráněná forma vinylsulfonu, protože je stabilní, v kyselině , al e. konvertuje na PEG·. vinylsulfon po přídavku báze.

Reaktivita pro PEG vinylsulfonový a pro PEG chlorethylsulfonový prekurzor byla hodnocena při pH 8,0/pH 9,0 a pH 9,5. Pufry pro říízení pH byly 0,ÍM fosfát při pH 8,0 a O,1M boritan při pH 9,0 a při pH 9,5. Pro měření merkaptoethanolové reaktivity bylo k oběma pufr-úm přidáno- 5 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) pro zpomalení konverze thiolu na disulfid.

pro reakci PEG derivátů podle vynálezu s Lys-NH2., bylo přidáno 3 mM roztoku PEG derivátu za míchání k 0,3 mM Lys-NHz roztoku ve vhodném pufru pro každou ze tří hodnot bázického pH. Reakce byla sledována přídavkem fluorescaminu k reakčnímu roztoku pro získání fluorescentního derivátu z reakce se zbývajícími aminoskupinami. Stupeň monitorování byl proveden za přídavku 50 μΐ reakční směsi do 1,95 ml fosfátového pufru o pH 8,0 s následujícím přídavkem 1,0 ml roztoku fluorescaminu za intenzivního míchání. Roztok fluorescaminu obsahoval 0,3 mg fluorescaminu na ml acetonu.

Fluorescence byla měřena 10 minut po smíchání. Excitace byla při vlnové délce 390 nm. Světelná emise se objevila při 475 nm. Žádná reakce nebyla pozorována 24 hodin ani pro PEG vinylsulfon ani PEG chlorsulfon při pH 8,0. Při pH 9,5 byla reakce pomalá, ale po několika dnech zreagovaly všechny aminoskupiny.

Pro reakci PEG vinylsulfonového a PEG chlorsul f onovéhó^ prekurzoru s Cys-SH, byl přidán 2 mM,.roztok PEG derivátu k 0,2 mM roztoku Cys-SH ve· vhodném pufru pro- každou ze tří hodnot bázického pH. Reakce byla sledována přídavkem 4-dithiopyridinu ť

k reakčnímu roztoku. 4-Dithiopyrídinová sloučenina reaguje se * '•‘Λ

Cys-SH za vzniku 4-thiopyridonu, který absorbuje ultrafialové záření.

Monitorovací stupeň byl proveden přídavkem 50 μΐ reakční směsi k 0,95 ml 0,lM fosfátového pufru při pH 8,0, obsahujícího 5 mM EDTA, s následujícím přídavkem 2 mM

4-ⁱdi thiopyridinu ve stejném pufru.

Absorbance 4-thiopyridinu byla měřena při 324 nm. Jak PEG vinylsulfon tak PEG chlorethylsulfon vykazují reaktivitu vůči Cys-SH, s tím, že PEG vinylsulfon vykazuje větší reaktivitu.

Při ρΗ 9,0 reakce probíhá během dvou minut za použití vinylsulfonu a během 15 minut za použití chlorethylsulfonu. Nicméně byly tyto reakce příliš rychlé pro stanoveni přesných rychlostních konstant. Při pH 8,0 byly reakce příliš pomalé, ale ještě kompletní během jedné hodiny pro vinylsulfon a tří hbdin pro chlorethylsulfon. Konverze clorethylsulfonu na, vinylsulfon je významně pomalejší než reakce vinylsulfonu s Cys-SH. Tato reakční rychlost pro chlorethylsulfon s Cys-SH se jeví být závislá na rychlosti konverze chlorethylsulfonu na vinylsulfon. Přesto jsou tyto reakční rychlosti stále ještě příliš rychlé než je tomu pro reakci s Lys-NH2.

Výše uvedené kinetické studie demonstrují následující body. PEG vinylsulfon je mnohem reaktivnější se thiolovými skupinami než s aminoskupinamí, což indikuje, že připojení PEG vinylsulfonu k proteinu., obsahuj í címu:, jak . cysteinové. tak lysí nové skupiny, probíhá, p.rimárně .reakcú?s cysteinem.... .Pro to že. reaktivita s .amino skup i námi -j ^-podobná -jako s: im i no skup i námi/,'·· pak reaktivita histidinových podjednotek bude také mnohem menší než r.eakt i vi ta. s. cysteinovými... pod j ednotkami.;- Také.....

selek t i .v i ta; vůč i··.' thřo 1 skupinám,? j e. zdůrazněna: při: ni žé.í ch:... hodnotách;. pH, pro .PEG; chlore.thyl sul,fon- a. PEG^J .vinyl-suff oni. :i.. když reakce PEG chlorethylsulfonu jsou o-něco pomalejší.

Použitelnost mnoha PEG derivátů je omezena protože reagují rychle s vodou což je na závadu záměru připojit deriváty k molekulám a povrchům za'vodných podmínek. Následující příklad 3 ukazuje, že PEG vinylsulfon a PEG chlorethylsulfon jsou stabilní ve vodě.

·’ ?

Příklad 3

Hydrolytická stabilita

PEG.. vinylsulfon se rozpustí v těžké vodě, D2O deuterium oxidu a sleduje se NMR. Reakce se neobjevuje. Roztok peg chlorethylsulfonu produkuje PEG vinylsulfon v těžké vodě, která byla pufrována boritanem na pH 9,0. Monitorování pomocí NMR ukazuje, že PEG vinylsulfon, jakmile byl produkován, byl stabilní po tri dny v těžké vodě.

PEG chlorethylsulfon je stabilní ve vodě jakmile se roztok stane bázickým·, kdy přechází na vinylsulfon. Konverze na vinylsulfon byla demonstrována rozpuštěním PEG chlorethylsulfonu ve vodě při pH 7 a v boritanovém pufru při pH 9. PEG derivát se extrahuje do methylbnchloridu. Po odstranění methylenchloridu následuje NMR analýza,,-.která ukazuje, že PEG chlorethylsulfon je stabilní při neutrálním .pH, *

7,0 a reaguje s bází za vzniku PEG vinylsulfonu. .

Vinylsulfon je stabilní po několik dnů ve vodě i při... , bázickém pH. Extenzivní hydrolytická stabilita a ... thiol-specifická reaktivita PEG vinylsulfonu znamená, že PEG *** ’ΜΪ· /fc '-ÍS vinylsulfon a jeho prekurzory jsou vhodné pro modifikaci molekul a povrchů za vodných podmínek jak je uvedeno v následujícím příkladu 4.

Příklad 4

Konjugace k BSA

Proteinová modifikace byla demonstrována připojením PEG derivátu k hovězímu sérovému albuminu (bovine sérum albumin BSA) dvěma odlišnými metodami. BSA je protein. Nativní nemodofikovaný BSA obsahuje cystinové skupiny, které neobsahují thíolskupiny. Cysteinové jednotky jsou_;-považovány za disulfidové vazby, S-S.

V prvním provedení m-rEG (monomethoxy-PEG) vinyisuifon o molekulové hmotnosti 5000 reagoval s nemodifikovaným BSA po 24 hodin v O,1M boritanovém pufru při pH 9,5 při teplotě místnosti. Roztok obsahuje 1 mg BSA a 1 mg m-PEG vinylsulfonu o molekulové hmotnosti 5000 na ml roztoku. Výsledky z příkladu 2 modelové sloučeniny indikují, že lysinové podjednotky (a možné histidinóvé podjednotky) by mohly být modifikovány za těchto relativně bážických podmínek a za nepřítomnosti volných , thiolových skupin dostupných pro reakci. . ..

Připojení k lysinovým podjednotkám bylo demonstrováno dvěma způsoby.· První, chromatografie vylučující podle , y velikosti, ukazuje, že molekulová hmotnost proteinu byla , z zvýšena přibližně o 50 X což indikuj.e. připoj eni přibližně. 10

PEG-k proteinu. Druhá , fluorescaminová 'anaTýza'ukazuj e , že' 'tfý počet lysinových skupin v BSA molekule byl snížen přibližné na ;

deset. _y.

Ve druhé'metodě· byl· BSA zpracován;s tributylfosfřnem-pro . λ, redukci disulfidových S-S vazeb na thiolové skupiny, -SR, které jsou dostupné pro reakci. Modifikovaný BSA byl pak zpracován s PEG chlorethylsulfonem při pH 8,0 v Ο,ΙΜ, , fosfátovém pufru při teplotě místnosti po 1 h. Roztok obsahuje 1 mg modifikovaného BSA a 1 mg m-PEG chlorethylsulfonu o molekulové hmotnosti 5000 na ml roztoku. Výsledky ukazují, že lysinové skupiny byly nerreaktivní za těchto podmínek...

Thiolové skupiny však byly reaktivní. Připojení. PEG k proteinu bylo demonstrováno _v chromatografii vylučující podle velikosti, která ukazuje zvýšení molekulové hmotnosti proteinu o asi 25 %. Fluorescaminová analýza neindikuje žádné změny v počtu lysinových podjednotek v proteinu, což potvrzuje, že PEG připojení neprobíhá na lysinových podjednotkách, Substituce na thiolových skupinách tak byla potvrzena.

Příklad 5

Syntéza vinylsulfon NHS-ester heterobifunkčního PEG (3400) činidla

Stručně, v několika stupních byl syntetizován sukcinimidylester kyseliny

PEG(3400)-omega-vinylsulfon-a-propionové. Nejprve byl syntetizován ethylester kyseliny

PEG(3400)-omega-vinylsulfon-a-propionové. Zadruhé byl ethylester kovertován na omega-mesylátový derivát. Zatřetí byl mesylát použit pro přípravu omega-thioethanolového derivátu. Začtvrté byl thioethanolový derivát konvertován na omega-hydroxysulfon. Zápáté .byl hydroxysulfon převeden na omega-vinylsulfon. Poslední α-ethylester byl převeden na .

kyselinu α-propionovou v šestém stupni. Nakonec byla skupina kyseliny propionové převedena na sukcinimidylester. Podrobná • .»1?

syntéza je uvedena dále.

Stupeň i. 15,0 gramů kyseliny

PEG(3400)-omega-vinylsulfon-a-propionové, 75 ml bezvodého ethylalkoholu a 3 ml kyseliny sírové byly zahřívány pod refluxem 1 hodinu. Po ochlazení na. teplotu místnosti bylo přidáno 50 ml vody k reakční směsi a pro úpravu pH na hodnotu 7 byl použit hydrogenuhličitan sodný. Ethylalkohol .byl oddestilován za sníženého tlaku na rotační odparce při 55 °C po půl hodiny. Reakční produkt byl extrahován 60,. 50 a 40 ml dichlormethanu. Extrakt byl sušen bezvodým síranem hořečnatým, zahuštěn na 50 ml a přidán ke 400 ml studeného diethyletheru. Vysrážený produkt byl odfiltrován a sušen za sníženého tlaku. Výtěžek ethylesteru byl 13,1 gramů. NMR analýza vykazuje 49 % skupin ethylesteru kyseliny propionové a 51 % PEG-OH skupin.

Stupeň 2. Směs 13,0 gramů (0,0038 mol) ethylesterového derivátu vytvořeného ve stupni 1, 100 ml toluenu a 2,0 gramy BHT bylyazeotropicky sušeny během zahřívání pod refluxem.

Dále bylo přidáno při 5 °C 15 ml suchého dichlormethanu,_u Q,60 ml (0,0043 mol, 1,15 násobný přebytek) triethylaminu a 0,31 ml (0,0040 mol, l,07násobný přebytek) mesylchloridu a směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti pod atmosférou dusíku. Byly přidány 2 ml bezvodého ethylalkoholu a směs byla míchání 15 minut; Směs pak byla odfiltrována a asi 70 ml rozpouštědel bylo oddestilováno za sníženého tlaku za získání toluenového roztoku ethylesteru kyše 1iny?PEG-omega-mesylát-a-propionové. Stupeň 3. Dále bylo přidáno asi 40 ml (0,00375 mol) roztoku ethylesteru kyseliny PEG-omega-mesylát-a-propionové získaného ve stupni 2: 150 ml bezvvodého . ethylalkoholu., . 1,79 .0)1^,(0,0139. mol, 3,69násobný přebytek) merkaptoethanol.ua 0,45 gramů, (0,0011 mol, 3,0násobný přebytek).hydroxidu;sodného rozpuštěného ve 20 ml bezvodého ethylalkoholu. Směs byla, zahřívána 3 hodiny na 58 až 62 °C pod atmosférou dusíku... Po ochlazení na teplotu místnosti byla použita kyselina octová pro upravení pH na asi 6,5 a bylo oddes t i lováno 140 ml .. . ethylalkoholu za sníženého tlaku na rotační odparce při 55 °C za 40 minut. Po destilaci bylo ke zbytku přidáno 50 ml dichlormethanu. Výsledný roztok byl promyt destilovanou vodou a sušen bezvodým síranem horečnatým. Roztok byl pak zahuštěn na 30 ml a přidán ke 350 ml studeného diethyletheru. Vysrážený produkt byl odfiltrován a sušen za sníženého tlaku. Výtěžek thioethanolového derivátu byl 11,5 gramů. NMR analýza ukazuje %,thioethanolových skupin, 35 % skupin ethylesteru kyseliny propionové a 13 % PEG-OH skupin.

Stupeň 4 Dále byl připraven roztok 11,5 g PEG-omega-thioethanol-a-propionové kyseliny ve 12 ml destilované vody. Následovně byl také připraven roztok kyseliny wolframové: 0,14 gramů kyseliny wolframové, 12,0 ml destilované vody a 0,05 gramů hydroxidu sodného rozpuštěného v 6,0 ml vody bylo smíseno za vzniku roztoku o pH 11,5. K roztoku kyseliny wolframové byl přidán 10% roztok NaHzPCU pro upravení pH na 6,6. Pak bylo přidáno 12 ml roztoku ethylesteru k roztoku kyseliny wolframové o pH 6,6 a pH bylo opět upraveno na 6,6 0,lM NaOH. Bylo přidáno 1,l ml 30% peroxidu vodíku a reakční směs byla míchána 9 hodin, pH po reakci bylo 6,7. ÍM NaOH byl přidán pro úpravu pH na 7,2 a reakční směs byla míchána 1 hodinu. K reakční směsi bylo přidáno 5 gramů .is* chloridu sodného rozpuštěného ve 45 ml destilované vody.

Reakční produkt byl extrahován třikrát 50 ml dichlormethanu; Extrakt byl sušen; následovně ,síraném'hořečnatým: 10 gramů práškovaného síranu horečnatého- bylo přidáno k extraktu a síran hořečnatý byl po dvou hodinách odfiltrován. Extrakt _!7 sušený síranem horečnatým byl zahuštěn na 40 ml s přidáno 3.50 ml studeného diethyletheru. Vysrážený produkt byl odfiltrován a sušen za sníženého tlaku. Výtěžek bylo 9,7 gramů a produkt obsahuje podle NMR stanovení 50 % skupin hydroxysulfonových, % skupin ethylesteru kyseliny propionové a 11 % skupin PEG-OH.

Stupeň 5 Ke směsi 9,6 gramů (0,00271 mol) ethylesteru kyseliny PEG-omega-hydroxysulfon-a-propionové. syntetizovanému ve stupni 4, 50 ml dichlormethanu a 0,01 gramu (0,1 hmotn.% na PEG) BHT míchané při teplotě místnosti pod atmosférou dusíku bylo přidáno 3,00 ml (0,0215 mol, 3,97násobný přebytek) triethylaminu a 0,80 ml (0,010 mol, 3,81-násobný přebytek) mesylchloridu. Reakční směs byla míchána 15 minut, filtrována a žředěna se 150 ml dichlormethanu. Výsledná směs byla pak promyta 25 ml lM HC1, 25 ml 10% NaCl a 25 ml vody. Bylo přidáno malé množství NazHPOí pro úpravu pH vodné vrstvy· na 7. Reakční směs pak byla sušena síranem hořečnatým a zahuštěna na 40 ml. Získaný roztok byl přidán ke 400 ml studeného diethyletheru. Vysrážený produkt byl odfiltrován a sušen za sníženého tlaku za získání 9,1 g. NMR analýza ukazuje «·. následující funkčnosti: 43 % vinylsulfon, 16 % mesylát a 35 % ethylester kyseliny propionové.

Stupeň 6 K roztoku 9,0 gramů ethylesteru kyseliny. PEG-omega-vinylsulfon-a-propionové v 50 ml destilované v.ody byl přidán 1,0M NaOH pro upravení pH na 12,0 a roztok byl zpracován i , 5' hodiny při udržování: pH:mezi; 11, 9 a.í2,l. periodickým přidáváním l.OM.NaOH. Pak. bylo, pH..upraveno,;na 3,0 kysel inou. šťavelovou, k roztoku bylo .přidáno 5 gramú.,NaCl a reakční produkt byl třikrát extrahován 50 ml dichlormethanu. Extrakt byl sušen bezvodýnr sÍránem ?hořečnatýni; . zahuštěn na 30ml a přidán ke .350 . ml studenéhO^di-ethyPetheru.:,..Sraženina .'byla: odf i 1 trována. a sušena· za: sníženého . tlaku... Výtěžek'..byl: 6.,8. gramů. Funkční skupiny identifikované pomocí NMR analýzy·.-byly: vinylsulfon 40%, kyselina propionová 29 %, ethylester 4 kyseliny propionové 4 % a mesylát 17 %. Sraženina byla Čištěna iontovýménnou chromatografií přes DEAE Sepharose FF kolonu. Výtěžek po čištění byl 3,2 gramy a NMR analýza ukazuje 50 % skupin kyseliny propionové, 38 % vinylsulfonových skupin a 8 % -mesylátový.ch skupin. . , ._

Stupeň 7 Směs 3,0 gramů kyseliny

PEG-omega-vinylsulfon-a-propionové, 0,12gramú

N-hydroxysukcinimidu, 0,21 gramů DCC (dicyklohexylkarbodiimid) ve 20 ml dichlormethanu bylo mícháno přes noc při teplotě místnosti pod dusíkem. Reakční směs pak byla odfiltrována a přidána ke.250 ml studeného diethyletheru. Vysrážený produkt byl odfiltrován a sušen za sníženého tlaku za získání 2,90 gramů. NMR vykazuje následující skupiny: sukcinimid 50 %? 38 % vinylsulfon, 10 5» mesylát a 2 % hydroxysulfon.

Příklad 6

Syntéza maleimid, NHS-ester heterobifunkčního PEG(34Q0) činidla

Maleimid, NHS-ester PEG činidlo bylo syntetizováno ve dvou stupních. V prvním stupni byl syntetizován maleimido-PEG-OH. Specificky, 0,130 gramů maleímido-sukcinimidylpropionátu bylo rozpuštěno v 5 ml suchého dichlormethanu a ochlazeno na 0 ’C. Potom bylo přidáno 0,5 gramů PEG-monoaminu, připraveného jak popsáno dále a 2 kapky triethylaminu. Po 2 hodinách při teplotě místnosti indikuje TLC, že reakce je kompletní. TLC byla provedena za použití n-BuOH~ACOH.-H.2O;v .poměru. 4 :.l : 1. Reakční směs byla odpařena dosucha'a zbytek, byl rozpuštěn v 15 ml destilované vody. pH roztoku bylo upraveno na 3 použitím 15 ml 0,5M HCI a extrahováno 10 ml CH2CI2. Organická vrstva byla sušena nad_s rsíranem hořečnatým, filtrována, zahuštěna na 15 ml a nalita do 75 ml studeného etheru. Sraženina byla odfiltrována a sušena ve vakuu.. Výtěžek'byl 0,300 gramů. NMR analýza vykazuje 77 % maleimidoskupin a 100 % PEG-OH.

Ve druhém stupni byl maleiraido-PEG-OH konvertován na maleimid-PEG-NHS-ester. Směs 2 ml CH2CI2, 0,05 ml pyridinu (1. ekvivalent), 1 ml acetonitrilu a 0,266 gramů maleimido-PEG-OH byla míchána při teplotě místnosti pod dusíkem. K této směsi bylo přidáno 0,070 gramů (2,5 ekvivalentu)

Ν,Ν-disukciimidylkarbonátu a reakce ponechána přes noc.

Reakční .směs pak byla nalita do přibližně 50 ml studeného etheru, filtrována a sušena ve vakuu. NMR ukazuje nečistoty a produkt byl vysrážen podruhé s konečným výtěžkem 0,230 gramů.

PEG-monoamin použitý v prvním stupni výše byl připraven ve třech stupních následovně. Nejprve byl vytvořen PEG-mesylátový derivát. Z mesylátu byl vytvořen amin. Nakonec byl monoamin oddělen od nederivatizovaného PEG a diaminu.

Stupeň 1 PEG-3400 (120 gramů, 0,0714 ekvivalentů OH) byl rozpuštěn v 580 ml toluenu, azeotropicky sušen a pak.bylo přidáno 90 ml dichlormethanu, 1,80 ml triethylaminu (0,01.291 mol) a 0,83 ml mesylchloridu (0,01072 mol). Po reakci pres noc se oddestiluje 90 ml rozpouštědel z reakční směsi za . sníženého tlaku, smě se filtruje a pak se za sníženého tlaku oddestiluje 500. ml. toluenu. Zbytek se přidá k..800ml studeného· diethyletheru·. Vysrážený-produkt' s.e odfiltruje a. suší za sní Ženého.. tlaku. ..Výtěžek, byl 1.18 gramů-.a: substituce byla. 15 %.

Stupeň 2 11.8 gramů, mesylátu vytvořeného ve stupni. 1. a/ 80 gramů chloridu .amonného, bylo rozpuštěno, v .1600 ml. koncentrovaného, vodného NH4OH,,a .mícháno -při. teplotě místnosti- 44 .hodin,.

Reakční produkt byl extrahován 600, 400 a pak 200 ml ... dichlormethanu. Extrakt byl promyt 170 ml 2%. KOH a 170 ml vody, sušen síranem horečnatým, koncentrován na 200 ml a, přidán k 800 ml studeného diethyletheru. Vysrážený produkt byl odfiltrován a sušen za sníženého tlaku. Výtěžek byl 106 gramů a substituce byla 15,6 %. _t

Stupeň 3 45 gramů aminu vytvořeného ve stupni 2 bylo „ rozpuštěno v 9 1 vody a vloženo na SP-Sepharose PF (300 ml gelu ekvi1ibrovaného s 1000 ml pufru kyselina citronová-citrát lithný, 0,4%, pH 3,0 a pak proraytého vodou). SP-Sepharose FF je dostupný od Pharmacia, Uppsala, Švédsko. Nederivatizovaný PEG byl vymyt z kolony, vodou. Dále byl eluován PEG monoamin 800 ml 20 mM NaCl. pH eluátu bylo upraveno na 11 1M NaOH a PEG monoamin byl extrahován dichlormethanem, sušen síranem sodným a rozpouštědlo bylo oddestilováno. Výtěžek.byl 9 gramů.

Příklad 7

Syntéza PEG-α, íO -bis-vinylsulfonu

Syntéza 3400 a 20000 kDa PEG bis-vinylsulfonu byla provedena za použití PEG diolu a obecně podle výše popsané metody. PEG diol byl zakoupen od Fluka Chemical Corporation (Eonkonkoma, New York) nebo od Nippon Oil ans Fat (Tokyo, Japonsko).

Příklad.8

Pegylace IL-lra za použití PEG-20000-α, O -bis-vinylsulf onu.j.

IL-lra c84 mutein byl připraven., jak je uvedeno ve zveřejněné PCT přihlášce WO· 92/1622.1,. zahrnuté zde jako odkaz. Konjugace c84 muteinu nebo nativního (původní typ) IL-lra ,.za použití PEG-α,^-bis-vinylsulfonu (3400 nebo 20000 kDa) byla provedena při 25 ’C v citrátovém pufru, pH 6,75 - 7,5, v l'ml zkumavkách s měnícími se PEG a proteinovými koncentracemi. Při proteinové koncentraci 30 mg/ml byla za 18 hodin získána dobrá konverze na činkovou molekulu. Při koncentraci 0,94 mg/ml byly získány převážně monoadukty. Cinkové druhy se vytvářely většinou při proteinové koncentraci 100 mg/ml s 0,03 ekvivalenty PEG. Cinká může být čištěna za použití chromatografických technik jak je uvedeno v PCT publikaci č.

WO 92/16221, zahnuté zde. jako odkaz.

V dalších pokusech byl 0,lM Tris-HCl pufr, pH 8,5, obsahující 30 mg/ml původního' typu IL-lra zpracován s 0,53 molárním ekvivalentem 20 kDa PEG-bis-vinylsulfonu při 25 °C po 18 hodin. SDS PEGE analýza ukazuje konverzi jak na činku tak na monoadukt. Při proteinové koncentraci 3,1 mg/ml s 1 ⁷ molárním ekvivalentem PEG činidla byl pozorován pouze monoadukt.

Obecně reaguje c84 mutein snadněji s PEG činidlem než s původním typem molekuly. _ύ

Příklad 9

Bioaktivita IL-lra činky c84 činka generováná výše byla analyzována na svoji· receptor vazebnou afinitu ve srovnání s nePEGylováným rekombinantním IL-lra na myších EL-4-buňkách. za .použiti eseje uvedené v PCT zveřejněné. přihlášce č.„WO 92/16221, zahr.nuté. zde jako odkaz ; Výsledky.ukazují podobné ’vazebné-af ini ty mez i ' -ťtí dvěma molekulami. 'áx/ o· T

Příklad. 10

Pegylace TNFbp' cl05·. raute inu¹.·, s PEG-20000-α, ^-bis-vinyrsulfonem

... ...... ... .gí cl05 mutein TNFbp byl připraven jak je uvedeno v PCT. zveřejněné přihlášce WO 92/16221, zahrnuté zde jako odkaz,.

Alternativně cl05 mutein byl připraven následovně.

E.coli buňky, exprimující cl05 mutein byly sklizeny »' odstředěním. Buněčný kal byl upraven přibližně na obsah 40 % pevných látek.za mokra přídavkem čištěné vody. Směs pak byla · t

dále ředěna na stejný objem rozkládacím pufrem (50 mM tromethamin, 4 mM EDTA, pH 7,2) za získání suspenze s přibližně 20 % hmotnosti pevných látek za mokra. BuněČný‘kal prošel pětkrát přes vysokotlakový homogenizér, pracující přibližně při 8000 psi za získání buněčného homogenátu.

Homogenát byl ochlazen na méné než nebo na 10 ⁰C před každým průchodem homogenizírem. Homogenát byl odstředěn a pevná frakce, obsahující cí05 byla zachycena. Pevné látky byly zředěny a opět odstředěny za získání promytých inkluzních těles.

Promytá inkluzní tělesa byla pak rozpuštěna přídavkem 8M močoviny a 150 mM cysteinu v 50 mM TRIS, pH 9,5. Tato směs byla ponechána míchat po dvě hodiny před novým skládáním. Za těchto podmínek cl05 mutein byl denaturován a redukován.

Reduovaný denaturovaný cl05 mutein byl znovu složen ředěním s 1,1 M močoviny, 50 mM Tris za získání konečného znovu vytvořeného roztoku 200 pg/ml cl05 muteinu, 1,5 Μ * ...;·.·.

močoviny, 7,5 mM cysteinu, 50 mM Tris, pH 9,7. Znovu složená směs byla udržována při 6 až 10 °C po dva dny. účinnost

V znovusložení byla sledována pomocí·· HPLC s reverzní fází a.

kationtovýměnné HPLC.

Znovu složená směs pak byla upravena na pH 5,0 přídavkem kyseliny octové a HCI. Znovu složená směs byla vložena na kationtovýměnnou kolonu (S-Sepharose, velké kuličky) předem ekvi1ibrovanou ve 25 mM octanu sodném, 65 mM NaCl, pH 5 při 4 °C. Po vložení byla kolona promyta stejným ekvi1ibračním pufrem. Kolona byla eluována s gradientem od 65 do 350 mM NaCl ve 25 mM octanu sodném, pH 5. cl05 mutein eluuje při asi 200 mM NaCl a byl shromážděn v jednom poolu.

Odebraný pool obsahující cl05 mutein byl zředěn s 1,5 objemy 5M.NaCl, 40 mM fosforečnanu sodného, upraven na pH 6 a vložen na hydrofobní interakční kolonu (Toyo Butyl 650 M

kolona), předem ekvi1ibrovanou ve í M NaCl, 20 mM fosforečnanu sodném pH 6. Na konci vkládání byla kolona promytá ekvi1ibračním pufrem. cl05 mutein byl eluován za použití osmi objemů kolony lineárně klesajícího solného gradientu od 3 M do 1 M NaCl ve 20 mM fosforečnanu sodném při pH 6. clOS muťein byl shromážděn v jednom poolu. Pool byl zahuštěn na přibližně 3 g/1 cl05 muteinu a pak diafiltrován proti 20 mM fosforečnanu sodnému, pH 6,0 dokud konečná vodivost nebyla menší než 4 mmho (přibližně šest objemů).

Diafiltrovaný pool byl vložen na vysokoúčinnou SP-Sepharose kolonu ekvi1ibrovanou ve 20 mM fosforečnanu sodného, pH 6,0. Po vložení byla kolona promyta dalším ekvi1ibračním pufrem a eluována kombinací pH/solný gradient od 20 mM fosforečnanu sodného, 50 mM NaCl, pH 6,0 do 20 mM fosforečnanu sodného, 50 mM NaCl, pH 6,5. cI05 mutein eluuje v pozdější polovině gradientu při asi 35 mM NaCl.clOS mutein' byl uchováván v tomto okamžiku zmrazený.

cl05 mutein reagoval s PEGylačním činidlem při molárních poměrech PEG.činidlo k proteinu 1:1, 2:1, 4:1, 1:2 a 0:1 (kontrola). Reakce byla. provedena ve 20 mM fosfátovém/20. mM acetátovém pufru při pH 7,5 po 15 hodin při 22 “C. Reakce byly také provedeny v 50 mM fosfátovém pufru, pH 7,5 nebo 8,5.

Procenta konverze na činkovou molekulu byla stanovena kationtovýměnnou HPLC přes MA7S kolonu. Procenta konverze jsou v rozmezí přibližně 40 až 60 %. Konverze na činkovou molekulu byla optimalizována přídavkem roztoku přibližně 50 mg/ml PEG činidla k proteinu při molárním poměru 0,50 až 0,65 PEG činidla k 1,0 TNFbp muteinu při pH 7,5 po 15 hodin při 22 °C. Jak stoupá poměr PEG k proteinu je upřednostňována produkce monoaduktu. Tvorba monoaduktu byla optimalizována za poměru

5:l PEG činidlo k proteinu.

Konjugáty byly čištěny chromatografií pres S-Sepharose HP-kolonu. Reakční směs byla upravena na pH 3,0 až 4,2 a . vložena na kolonu předem upravenou na stejné pH. Kolona byla promyta ekvi1ibračním pufrem a činka byla eluována za použití lineárního gradientu chloridu sodného a průtokové rychlosti

1,2 až 1,5 cm/min. Následující druhy byly eluovány z kolony v následujícím pořadí: 1) monosubstituovaný, 2) činka, 3) nePEGylovaný TNFbp mutein a 4) agregátovaný mutein.

Příklad 11

Bioaktivita TNFbp cl05. mutein činky cl05 Činky, které byly vytvořeny z PEG-bis-maleimidu jak je popsáno v PCT zveřejněné přihlášce č. WO 92/16221 nebo z<le popsáno, byly zjištěny jako 50 až lOOkrát účinnější než nePEGylovaný 30 kDa TNF inhibitor při srovnání v L929 eseji cytotoxicity jak-je uvedena, ve. WO 92/16221, a je zde zahrnuta jako odkaz.

Příklad 12

Příprava glyceryl-PEG-tris-vinylsulfonu

Glyceryl-PEG-α,β,β-triol (10000 kDa a 20000 kDa) byl převeden na vinylsulfonový derivát za použití obecných výše popsaných metod. Glyceryl-PEG-a.p.^-triol byl zakoupen od Uníum Carbide, Terrytown, New York. Glyceryl-PEG-α,β,^-triol mohl být syntetizován ethylenoxidovou polymeracíglycerolu v bázi.

Příklad 13

Syntéza TNFbp cl05 za použití glyceryl-PEG-tris-vinylsulfonu

Tri TNFbp cl05 muteiny byly konjugovány k PEG-tris-vinylsulfonu za získání trumbbell^H molekuly. Pokusy provedené v širokém rozmezí poměru PEG:protein ukazují, .že zvláště vhodný molární poměr pro konverzi na byl 0,25 až 0,35 PEG k 1 proteinu. V typickém experimentu byl cl05 mutein ve 20 mM fosfátovém, 20 mM acetátovém pufru, pH 7,5 vystaven .0,03 molárním ekvivalentům glyceryl-PEG-10000-α,β,^-triolu při 25 °C po 18 hodin. Analýza posledně uvedené reakční směsi kationtovýměnnou HPLC (BioRad MA7S kolona za eluce gradientem chloridu sodného) indikuje konverzi na trumbell ve 49% výtěžku a bisubstituci ve 34,9% výtěžku.

Příklad-14..

Syntéza IL-lra. trumbellu za použití glyceryl-PEG-tris-viny^sul f onu..

Roztok PEG.-10000-α, β tri s-v i nyl sulf onu. re ag ovádů se 20.

mg/ml původního typu. IL—1 ra. v. 0,1M- fosfátovém -pufru, při. následujících, poměrech* PEG/pro.te i n.:; 0,1.0 : 1; 0,25:1 ;.0,35:1; 0,45:1; 0,55:1; 0,65:1. Reakce byly inkubovány při 25 ⁰C po 72 hodin. SDS PAGE analýza ukazuje konverzi na mono, di a triaduktové produkty. Optimální konverze na triadukt byla pozorována připoměru PEG/protein 0,10:1. Reakční směs byla aplikována na S Sepharose vysokoúčinnou kolonu a eluována gradientem chloridu sodného.

Příklad IS

Syntéza cl05 TNFbp-PEG-IL-lra heteročinky

Roztok původního typu IL-lra v 0,ÍM fosfátovém pfru, pH

8,5 reagoval s 8 mg/ml

PEG-20000-bis-vinylsulfon-mono-cl05TNFbp aduktem při následujících molárních poměrech a koncentracích IL-lra: 55:1 (12,5 mg/ml); 85:1’ (18,75 mg/ml); 100:1 (25,0 mg/ml) a 150:1 (31,75 mg/ml). Po 72 hodinách byla podle SDS PAGE vytvořena heteročinka. Optimální konverze byla pozorována při poměru 1:100 monoaduktu k IL-lra. Heteročinka byla čištěna za použití S Sepharose vysokoúčinné kolony a eluce s gradientem chloridu sodného. ,

Příklad 16

Stabilita PEG-vinylsuifonpolypeptidových aduktů

Byla studována stabilita vazby mezi cl05 TNFbp muteinem a PEG-bis-vinyl-sulfoněm. Známá množství cl05 činky byla inkubována v PBS, pH 7,4 při 37 °C po jeden týden á byly odebírány vzorky pro analýzu SDS PAGE. V podstatě nebyl pozorován žádný rozklad clOS činky. Při pH 10 při 37 °C po 1 týden bylo pozorováno pouze 5.. až.. 1.0 % degradace konjugátu.

Příklad 17

TNFbp cl05 činka inhibuje aktivně indukovanou experimentální alergickou encefalomyelitis (EAE)

In vivo aktivita cl05 činky vyrobené s PEG-bis-vinylsulfonem byla demonstrována. EAE je myší model autoimunitní zánětlivé demyelinační choroby centrálního . nervového systému, který se často používá jako model pro lidský MS. Jak je popsáno dále, inhibuje cl05 činka EAE u krys.

Samice Lewis krys (150 až 200 g) byly zakoupeny od Charles River (Raleigh, NC) a ustájeny na alespoň jeden týden před započetím pokusu. Dostávaly potravu a vodu ad libitum a , í t byly ustájeny v prostorách se řízenou teplotou a světlem (12 h/den). V každém pokuse byla zvířata stejné stáří.

Aktivní indukce EAE

Krysy (obvykle šest na skupinu) byly anestetizovány se 2% isofluranu + O2 a imunizována v den 0 na tlapce levé zadní nohy 0,1 ml emulze, obsahující myelin bázický protein (MBP) v jedné z následujících dávek: 0, 1, 3, 10 nebo 30 pg (fragment Bachem Bioscience, PA). MBP byl rozpuštěn ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (FBS) a emulzifikován se stejným objemem kompletního Freudova adjuvans (CFA), obsahujícího 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Lab, MI). Kontrolní krysy dostaly 0,1 ml PBS/CFA emulze bez MPA do tlapky levé zadní nohy.

Klinické hodnocení EAE .

Hodnocení klinické choroby.-bylo provedeno na denní bázi.. za použití standardní stupnice hodnocení 0 až 5. Stručně, spektrum hodnocení bylo. 0 normální.,. 0,5, částečná, ztráta. tonu. ocasu,.'í kompletní ztráta tonu ocasu, 2 vláčení jedné zadní nohy, 3 paralý.za, obou zadních, noh., . 4-morbidita, a 5 smrt. Denní hmotnosti byly zaznamenávány pro jednotlivé krysy a hmotnostní, ztráta/přírůstek byly vyjádřeny ve vztahu k počáteční hmotnosti.

Vliv imunizace s MBP

Počáteční studie hodnotí klinickou sílu různých dávek MBP (0,1 až 30 pg/0,1 ml) v emulzi popsané výše u krysy. 0,1 a 0,3 pg MBP neprodukovaly žádné zjevné klinické znaky. 30 pg dávka MBP produkuje nejsilnější klinické znaky ve srovnání s 1 pg dávkou. Tento účinek byl vysoce signifikantní (p < 0,001, Mann-Whitney U-test).Obecné zvyšující se dávka (1 až 30 pg)

MBP produkuje klinické znaky častěji, například 1 pg MBP má průměrný + S.E.M nástup 14,88 + 0,42 (n= 9) ve srovnání se 12,35 + 0,16 (n=34; p <0,01) dnu pro 30 pg MBP dávku. Navíc byl pozorován dávkové závislý účinek MBP (1 až 30 pg) na ztrátu hmotnosti. Zvířata se spontánně zbavila klinických znaků během 5 až 7 dnu nástupu. Podání CFA samotného neprodukuje žádné klinické znaky, nicméně byla počáteční přechodná ztráta hmotnosti porovnána s neošetřenou kontrolou

Ve všech těchto studiích nebyly žádné významné rozdíly pří jakýchkoliv mbp dávkách pozorovány mezi skupinami se žádným léčivem (pouze MBP imunizovaná) a s dávkou vehikula (MBP imunizovány a podán PBS). Vehikulum tak nemá žádný vliv na sílu choroby (viz tabulka 3 a 4). Skupiny bez léčiva a s dávkou vehikula jsou popsány dále.

Léčba EAE

Různé .dávky TNF inhibitor činky (0,1 až 3 mg/kg) nebo vehikula (PBS) v.různých, časech byly podány subkutánní injekcí. Perioda léčení začala bud ihned po nebo devět dnú-po imunizaci s MBP a pokračovala 21 dnů po imunizaci. V každém pokuse dostaly kontrolní krysy PBS ve stejném počtu injekcí jako léčené skupiny pro zmítnění sekundárních účinků vyvolaných stresem. Skupina krys, které nedostaly žádné injekce po EAE indukci, a kontrolní bez léčiva byla také pozorována.

Vlivy léčení

Dávkování každý den Byly hodnoceny vlivy EAE denního dávkování TNF inhibitor činky na EAE, začínající v den imunizace po celkem 21 dnů. Cinkové koncentrace 0,1, 0,3, 1 nebo 3 mg/kg nemají žádné významné vlivy na klinické znaky ve skupinách lpg a 30 pg MBP. Nicméně významné zmírnění klinické choroby bylo pozorováno při dávce 3 με MPB pro všechny použité Činkové dávky.

Dávkování každý další den Vlivy 0,1, 0,3, 1 a 3 mg/kg dávek podávaných každý další den začínajících devátý den po imunizaci byly rovněž testovány. Jak je uvedeno tabulkách 3 a 4, významná inhibice klinických znaků se objevuje při dávkách 0,3 (p<0,008), 1,0 (p<0,001) a 3,0 mg/kg (p<0,002, Mann Whitney test, n=6) ve srovnání s vehíkulovými kontrolami za použití nejvyšší MBP dávky (30 pg/0,1 ml). Nebyly pozorovány žádné významné rozdíly mezi skupinami s vehikulem a kontrolními skupinami bez jakéhokoliv ošetření. Nejnižší dávka TNF inhibitor činky neměla významný vliv na klinické znaky.

Dávky činky 1,0 (p<0,1) a 3 mg/kg . (p<0,05, Mann Whitney. test) významně zeslabují klinické znaky produkované. 10 pg.MBP, I když 0,3 a 0,1 mg/kg činky zeslabují klinické, znaky., redukce nebyla podstatná. Činkové dávky 0,1 až 3. mg/kg.významně neinhibují klinické znaky indukované nižšími cávkam.iOíBP (í nebo. 3 pg) .

Ztráta hmo.tnosti, je důležitým: znakem¹ nástupu*. EAE.' Krysy imunizované se 3, 10 a 30 pg MBP, které dostaly cl05 činku (1 nebo 3 mg/kg) ztratily méně hmotnosti ve srovnání s vehikulovými skupinami.

Tabulka 3

Prevence aktivně inhibované EAE s TNF inhibitor činkou

Tabulka 3A až 3-F ..........

Vlivy činky na denní průměrné klinické hodnocení - 30 pg MBP

Tabulka JA

Léčení průměrné	0,25	1,00	bez 1,92	léčiva 2,67	1,83	0,83	0,166
klinické	+	+	±	+	+	+	+
hodnocení	0,18	0,50	0,52	0,44	0,53	0,44	0,10
dny	11	12	13	14	15	16	17
Tabulka 3B Léčení průměrné	0,17	0,75	vehikulum 1,83 2,50	2,08	1,00	0,25
klinické		+	+		+	+	+
	*·			*™
hodnocení	0,17	0,31	0,40	0,34	0,45	0,41	0,11
dny	11	12	13	14	15	16	17
Tabulka 3C Léčení průměrné	0,08	0,92	0,1 mg/kg činky 1,33 2,67 2,17	1,17	0,25
kl i ni cké.... ..	4-	+	+	+	+	+	+
·
hodnocení.	0,08'	0,35	0,21.	0,21	0,30	0,28	0,11
dny	11	12	13	14	15	16	17

Tabulka 3D
Léčení
průměrné	0,25	0,92
klini cké	+	+
hodnocení	0,17	0,27
dny	12	13

0,3 1,50	mg/kg činky	0,375
1,17	0,58
i	+		+
0,42	0,40	0, 15	0,14
14	15	16	17

Tabulka 3E

Léčení	1 mg/kg činky
průměrné	0,17 0,58 0,67 0,42	0,33	0,083
klinické	± i + +	T	+
hodnocení	0,17 0,20 0,17 '0,20	0,17	0,083
dny	12 13 14 15	16	17
Tabulka 3F
Léčení	3 mg/kg činky
průměrné	0,25 0,42 0,83 0,42	0,08	0,08	$
klinické	± i ± +		±
hodnocení	0,17 0,20 0,25 0,32	0,08	0,08
dny	12 13 14 15	16	17
Legenda k	tabulce:. Hodnocení denní	průměrné síly u.	krys
imunizovaných se 30 pg MBP a léčených bud TNF inhibitor činkou
každý další den se začátkemř9 dnů	po imunizaci. Vehikulová.·
skupina dostává PBS a skupina bez	léčiva	nedostává	Žážirié
injekce po EAE indukci..			V ΊΛ; ť
Tabulka 4
Inhibiční	účinky'TNF inhibitor Činky vyjádřené jako	plocha, pod
křivkou	*
Léčení	bez léčiva vehikulum	0,1	0,3 1	3 '
		mg/kg	mg/kg mg/kg mg/kg
klinická	8,07 7,83	7,88	4,3 1,63	1,53
obtížnost	±1,40 ±0,88	±0,83	±1,02 ±0,60 ±1,01
(plocha)
Legenda k	tabulce: Inhibiční účinky cl05	činky na klinickou

π sílu vyjádřené jako plocha pod křivkou (jednotky libovolné).

Průměr+S.E.M. (n=6) byly stanoveny pro každou skupinu a statisticky porovnány proti vehíkulové skupině (Mann-Whitney test). Nebyly pozorovány žádné podstatné rozdíly mezi vehikulem a kontrolní skupinou bez léčiva. cl05 činka při 0,3, 1,0 a 3,0 mg/kg (podáno jak uvedeno výše) významně (**p<0,008, 0,001 a 0,002) redukuje klinické znaky.

Jak je uvedeno v tabulce 5, dávkování každý další den také redukuje trvání choroby měřeno počtem dnu během kterých byly pozorovány klinické znaky a průměr vypočtený pro danou skupinu krys.

Tabulka 5

Trvání choroby s dávkováním každý další den

TNF inhibitor činka mg/kg

MBOpg 30 5,33 10 4,33 3 2,50

1,83

0		o;	,1		0,3	1	3
0,21	5,50	+	0,34	4,50	±0,92	2,83+0,79*	2,16+0,60*
0,80	3,60	+	0,80	4,00	+0,51	3,33+0,49	1,83+0,70*
1,02	1,83	+	0,83	2,00	+0,81	3,16+0,74	0,83+0,54-
0,79	0,66	+	0,66	1,66	+0,61	1,33+0,49	0,66+0,42.

*p<0,05 *p<0,01

Jediné dávkování Jediná dávka bud 0,3 nebo 3 mg/kg činky podaná devět dnů po imunizaci· měla malý nebo žádný účinek na zeslabení MBP (1 až 30 pg)indukované klinické znaky při porovnání s vehikulovými kontrolami.

Podání TNF inhibitorové činky každý třetí den Cinká v množství 0,1 až 3 mg/kg nebo vehikulum byly podány ve dnech 9, 12, 15 a 18 po MBP-imunizaci. Jak je uvedeno v tabulce 6, významné zeslabení MBP (30 pg) indukovaných klinických znaků bylo pozorováno při cl05 činkových dávkách 0,3 (p<0,0S), 1,0 (p<0,01) a 3 mg/kg,(p<0,001 Mann-Whitney t-test). 0,1 mg/kg. dávka cl05 činky byla bez účinku ve srovnání s vehikulovou kontrolou.

MBP (10 pg) indukované klinické znaky byly redukovány 0,3, 1,0 a 3,0 mg/kg clOS činkových dávek. Nicméně významné (p<0,05 a 0,03) účinky byly pozorovány pouze při vyšších cl05 činkových dávkách. I když clOS činka (0,3 až 3 mg/kg) redukují klinické znaky produkované 3 pg MBP o přibližně 20 až 60 nebyly pozorované účinky významně odlišné od skupiny vehikulové kontroly.

Trvání choroby bylo obecně redukováno cl05 činkou. Například cl05 činka, při 1 a 3 mg/kg významně redukuje . trvání MBP (30 pg) zprostředkovaných znaku na 37,3 %, a 68,7 % (viz tabulka 10). Podobný trend byl také^- pozoeován za. použití . meziproduktové MBP (10 pg) dávky; ale ne při nejnižší;,;.,MBP dávce (tabulka 7).

Nástupy choroby ve skupinách 10 a 30 pg MBP byly vznamně (p<0,047; p<0,013; Mann Whitney U-test) zpomaleny'.u. těch zvířat, která byla léčena se 3 mg/kg clOS činky.

Ztráta hmotnosti spojená s EAE byla částečně .inhibována clOS činkou, zejména v dávkách 1 a 3 mg/kg. Redukce ztráty hmotnosti byla dávkově závislá. Tento účinek clOS Činky byl podobný nehledě na to, jaká byla použita dávka MBP.

Tabulka 6

Průměrná klinická síla vyjádřená jako plocha pro dávkování každý třetí den

Léčení	vehikulum	0,1	0,3	1,0	3,0
		mg/kg	mg/kg	mg/kg	mg/kg
průměrná	9,21	8,25	6,23	3,66	0,33
klinická	+0,64	+0,92	±1,37	±0,61	±0,17

síla (plocha)

Tabulka 7

Trvání choroby s dávkováním každý třetí den

TNF inhibitor činka mg/kg

MBPμg 0 0,1 0,3 1 3,..

5,83 + 0,44 4,83 + 0,30 4,16 ±0,70 3,66+0,61* 1,83+0,70** '4,66· + 0,42.5,16 +.0,40 4,00 +0,77 3,00±0,96 2,50+0,67*

4,00 + 0,67 3,50+0,62 3,00.±1,35 3,00+1,35 3,33+0,66 *p<0,05 **p<0,01

Příklad 18

Patologie centrálního nervového systému (CNS)

Účinky léčení clOS činkou syntetizovanou za použití PEG-bis-vinylsulfonu byly stanoveny na patologii CNS indukované imunizací s MBP (0, ‘10 nebo 30 pg). MBP imunizace (EAE indukce) byly provedeny jak je popsáno výše. cl05 činka v množství 0,3, 3 mg/kg nebo vehikulum byly podávány každý další den počínaje devátým dnem po MBP. Zvířata byla usrcena (pomocí CO2) 9.den, 14. nebo 20. po MBP-injekci. Mozek a mícha byly vyňaty z každé krysy a umístěny do 10% neutrálně pufrovaného formalinu. Po fixaci po alespoň 72 hodin byly provedeny řezy mozku v úrovni optického chiasmu kaudálního k. připojení hypofýzy a transverzních vláken mostu. Mícha byla rozřezána 4 až 6 příčnými řezy přes cervikální, thorakální a bederní Část. Sakrální segment z připojených kaudálních nervů byl umístěn podélně. Tkáně byly zpracovány umístěním do parafinu a vybarvením s hematoxylinem a eosinem.

Histologická hodnocení byla provedena bez znalosti o jak léčenou skupinu jde. Každé sklíčko bylo označeno číselným hodnocením od 1 ao 4 pro označení intenzity zánětu a demyelinace. Hodnotící kriteria byla následující: 1 = minimálně 1 až 2 cévy měly malé perivaskulární manžety zánětlivých buněk, 2= slabé, 3 nebo více cév mělo malé perivaskulární manžety zánětlivých buněk s malými pokud vůbec nějakými prodlouženími.zánětu do parenchymu, 3=.mírné, 3 nebo více cév mělo prominentní perivaskulární manžety zánětlivých buněk s mírným prodloužením zánětu do okolního parenchymu a 4= významné, většina cév má prominentní perivaskulární ..manžety zánětlivých buněk s intenzivním rozšířeným zahrnutím neuropilu do zánětlivého procesu.

Celková zánětlivá hodnocení byla stanovena pro každé ze zvířat pro každou CNS oblast. Průměr +SEM (standardní chyba průměru) hodnoty hodnocení byly vypočteny pro každou část CNS pro každý Časový bod a porovnány se zvířaty ošetřenými vehikulem.

Průměrné zánětové hodnocení bylo stanoveno pro každou CNS oblast přo každou skupinu zvířat a porovnána statisticky proti vehikulové kontrolní skupině (student-t-test). Tato hodnocení jsou uvedena v tabulkách 8 a 9.

. Nejsou zde významné histologické změny v CNS zvířt usmrcených 9.den po MBP injekci. Léze 14.den zahrnují minimální až významně smíšenou (mononukleární + některé neutrofily) obecně perivaskulární zánětlivou buněčnou infiltraci. V mozku má zánět sklon být umístěn do meningú, periventrikulárních ploch a cerebelárních bílých traktů, s mozkovým kmenem a cerebetálními bílými trakty nejhůře postiženými. V těchto lokacích se zánět často rozšiřuje z perivaskulárních ploch do okolního parenchymu a byla zde zřejmé demyelinace. V míše byly nejhůře postiženy bederní a křížová část. Byly postiženy jak šedá tak bílá hmota, opět s převládajícími perivaskulárními lézemi. Zánět přetrvává do 20.dne, nicméně v této době jsou vzácně viditelné neutrofily. Variabilita intenzity se objevuje u zvířat v každé skupině a většinou ve všech skupinách.

•Λι

Tabulky 8 a 9 demonstrují přítomnost cí5 činkou redukovaného stupně zánětu v různých regionech studovaného CNS. Nejdramatičtější’a nejvýznamnější· redukce v zánětech byla pozorována v míše, zejména v bederní a křížové oblasti. clOS činka má menší vliv na vyšší regiony CNS, cerebrum a cerebellum.

Tabulka 8

Zánětlivá hodnocení zvířat imunizovaných se 30 pg MBP a léčených s TNF inhibitor činkou

Mozková oblast	- 3 mg/kg	0,3 mg/kg	vehikulum
cerebrum	1,00+0,378	0,714+0,360	0,714+0,474
cerebellum	2,57+0,429	2,714+0,360	3,280+0,286
mícha cervikální	1,71+0,360	1,428+0,298*	2,420+0,202
thorakální mícha 1.	1,71+0,421	1,000+0,218*	2,280+0,421
bederní mícha	1,85+0,404	1,42+0,369	2,42+0-,298
křížová mícha	1,28+0,360	1,42±0,298	2,714+0,522
*P<0,05 (Studentův	t-test) histologie	(30 pg MBP dávka) •

Tabulka 9

Zánětlivá hodnocení zvířat imunizovaných.se 10 pg MBP a léčených s TNF inhibitor činkou

Mozková oblast	3 mg/kg	0,3 mg/kg ,	V , T vehikulum
cerebrum	0,28+0,18	0,42 +0,20	0,42	±0,29
cerebellum	1,42+0,29	2,28 +0,42	2,28	+0,35
mícha cervikální	0,85+0,34	1,42 +0,42	1,42	+0,20
thorakální mícha	0,85+0,14	1,57 +0,36	1,0	+0,.30
bederní mícha	0,71+0,28**	1,57+0,48	2,28	+0,28
křížová mícha	0,57+0,20**	l,57±0,48	2,28	+0,42

*p<0,01 histologie (10 pg MBP dávka)

Příklad 19 cl05 TNFbp činka chrání proti endotoxinové letalitě cl05 činka syntetizovaná za .použití PEG-bis-vinylsulfonu chrání Balb/c myš proti letální dávce endotoxinu. Myš byla

Μ *?

injektována itrapertoneálně se 30 mg/kg endotoxinu a íntravenozně s jediným podáním bud 0,1 ml PBS nebo 1 mg/kg činky v 0,1 ml PBS bud 1 hodinu nebo dvě hodiny po podání endotoxinu. Intravenózní podání 1 mg/kg činky 1 hodinu po injekci endotoxinu působí kompletní ochranu proti letalitě. Cinkové podání dvě hodiny po podání neposkytlo žádnou ochranu proti letálnímu endotoxinovému poškození.

cl05 činka také chrání Lewis krysy před letální dávkou endotoxinu. Krysy byly injektovány íntravenozně se 12,5 mg/kg endotoxinu. Krysy byly injektovány současně s endotoxinem a bud salinickým roztokem nebo cl05 činkou v dávkách bud 0,1, 0,5, 3,0 nebo 4,5 mg/kg. Srovnatelná ochrana proti letálnímu poškození byla dosažena pro všechny činkové dávky.

Ošetření jedinou dávkou činky 1,5 mg/kg clOS podané současně s 10 mg/kg dávkou endotoxinu chrání krysy proti hepatickým a metabolickým poruchám.. Hepatické a metabolické parametry byly hodnoceny 24 hodin po podání endotoxinu jak je uvedeno v tabulce 10.

Tabulka 10

Účinky léčení s clOS činkou (1,5 rag/kg) endotoxinem indukovaných abnormalit v biochemických parametrech

Parametr	kontrola+ vehikulum	endotoxin+ vehikulum	endotoxin+ cl05 činka
glukóza (mg/dl)	143+2	52±8	81+5*
SGPT1 (mu/ml)	47+6.	679+118	141+25* ..
dusík močoviny	19+1	88+2'	39+3*
v krvi (mg/dl)
kortikosteron	146+62	750+49	489±43*

• MM ¹ sérová.glutamín hroznová transaminasa (Sérum Glutamic Piruvic Transaminae

Hodnoty jsou průměr + standardní chyba pro 4 až-8 krysna skupinu.

* Významný rozdíl od endotoxinem ošetřené skupiny při p<0,05 (párovaný t test)

Je třeba chápat,. že. apl ikace poznatku předloženého ·., vynálezu na specifický expresní systém/nebo. PEGylační. činidlo li budou zá-ležet na schopnostech odborníků v oboru pochopit zde uvedené poznatky. Odborníkům v oboru bude také zřejmé, že je možno provést různé modifikace variace způsobu a produktů předloženého vynálezu. Tyto modifikace a variace jsou považovány za pokryté předloženým vynálezem.

Claims (31)

1. NÁROKY

   1. Biologicky aktivní konjugát, zahrnující biologicky aktivní molekulu vybranou ze skupiny, azhrnující IL-1. inhibitor, inhibitor faktoru tumorové nekrozy (TNF), CR1,

   RDGF receptor, IL-2 a exon 6 peptid PDGF, kde biologicky aktivní molekula má reaktivní thiolskupinu a nepeptidický polymer, mající aktivní sulfonovou skupinu tvořící vazbu s uvedenou thiolskupinou.
2. 2. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 1, kde uvedená aktivní sulfonskupina je vinylsulfon.
3. 3. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 1, kde uvedená aktivní sulfonskupina je chlorethylsulfon.
4. 4. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 1, kde uvedená biologicky aktivn molekula je TNF inhibitor vybraný ze skupinym zahrnující 30kDa TNF inhibitor, 40 kDaTNF inhibitor, ., ,_;i delta TNF inhibitor a delta53 TNF inhibitor.
5. 5. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 4, kde uvedený TNF inhibitor je 30kDa TNF inhibitor.
6. 6. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 4, kde uvedený TNF inhibitor je 40kDa TNF inhibitor.

   i i
7. 7. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 4, kde uvedený TNF _t inhibitor je deltaSl TNF inhibitor.
8. 8. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 4, kde uvedený TNF inhibitor je delta53 TNF inhibitor.
9. 9. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 1, kde uvedenou biologicky aktivní molekulou je interleukin-1 (IL—1) inhibitor.
10. 10. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 9, kde uvedený IL—1 inhibitor je interleukin-1 receptor antagonista (IL-lra).
11. 11. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 1, kde uvedený nepeptidický polymer má reaktivní NHS-ester navíc k uvedené aktivní sulfonové skupině.
12. 12. Biologicky aktivní konjugát podle nároku 11, kde uvedená aktivní sulfonová skupina je vinylsulfon.
13. 13. V podstatě čištěná sloučenina vzorce Ri-X-R²,, kde X zahrnuje nepeptidický polymer, mající první reaktrvní skupinu a druhou reaktivní skupinu, přičemž uvedenásprvní ·.·>

    reaktivní skupina je Michaelův akceptor;

    Ri zahenuje biologicky aktivní molekulu vybranou ze skupiny, . zahrnující IL—1 inhibitor, inhibitor faktoru tumorové nekrozy .-tý (TNF), CR1, PDGF receptor, IL—2 a exon 6 peptidu PDGF, má reaktivní thiolskupinu, uvedená biologicky aktivní molekula je kovalentné navázána k uvedenému nepeptidickému polymeru reakcí uvedené thiolskupiny s Michael akceptorem a uvedená biologicky aktivní molekula si zachovává svoji biologickou aktivitu po uvedené reakci a .

    R2 obsahuje biologicky aktivní molekulu nebo nebiologicky i’·· aktivní skupinu navázanou k uvedenému nepeptidickému polymeru reakcí s uvedenou druhou reaktivní skupinou.
14. 14. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 13, kde uvedený Michael akceptor je vinylsulfon.
15. 15. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 13, kde uvedená druhá reaktivní skupina je NHS-ester.
16. 16. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 13 nebo 15, kde uvedený Michael akceptor je maleimid.
17. 17. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 13, kde uvedený nepeptidický polymer má dva Michael akceptory.
18. 18. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 17, kde uvedené Michael akceptory jsou maleimid.

    F .
19. 19. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 17, kde uvedené Michaelovy akceptory jsou vinylsulfon.
20. 20. V podstatě čištěná sloučenina-podle nároku 17, kde jeden z uvedených Michael akceptorú je--vinylsulfon a druhý maleimid.
21. 21. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 13, kde uvedená biologicky aktivní molekula je TNF inhibitor.
22. 22. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 21, kde uvedenýTNFbp je 30kDa TNF inhibitor.
23. 23. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 21, kde uvedenýTNFbp je 40kDa TNF inhibitor.
24. 24. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 21, kde uvedenýTNFbp je delta51 TNF inhibitor.
25. 25. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 21, kde uvedenýTNFbp je delta53 TNF inhibitor. ^f
26. 26. V podstatě čištěná sloučenina podle nároku 13, kde uvedenou biologicky aktivní molekulou je IL-1 inhibitor.

    í
27. 27. V podstatě Čištěná sloučenina podle nároku 26, kde f , 'ί uvedeným IL-1 inhibitorem je IL-lra.
28. 28. Ve vodě rozpustný polymer, mající NHS-ester a maleimid.
29. 29. Ve vodě rozpustný polymer podle nároku 28, kde uvedený polymer je vybrán ze skupiny, zahrnující polyalkylenoxidy, polyoxyethylované polyoly a polyolefinické alkoholy.
30. 30. Farmaceutická kompozice, obsahující sloučeninu podle nároku 1 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
31. 31. Farmaceutická kompozice, obsahující sloučeninu podle nároku 13 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.