DD216923A5

DD216923A5 - Verfahren zur herstellung eines peptids

Info

Publication number: DD216923A5
Application number: DD83253375A
Authority: DD
Inventors: Jean E F Rivier; Walker W Jun Vale
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1982-07-26
Filing date: 1983-07-25
Publication date: 1985-01-02
Also published as: ES8505335A1; IE831582L; NO832671L; IL69098A0; MX7312E; NZ204692A; PT77067A; GR78886B; DK328183D0; ES524370A0; DE3376115D1; KR840005710A; JPS5946253A; PT77067B; EP0100218B1; AU558402B2; IE55580B1; CA1263500A; ATE33252T1; AU1637183A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden mit Wirkung als GnRH-Antagonisten fuer die Anwendung als Arzneimittel bei Saeugetieren einschliesslich des Menschen. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung solcher Peptide, die die Sekretion von Gonadotropinen durch die Hypophyse und die Freisetzung von Steroiden durch die Keimdruesen inhibieren, wobei bei Verabreichung einer wirksamen Dosis die Ovulation weiblicher Saeugetiereier und/oder die Freisetzung von Steroiden durch die Keimdruesen verhindert wird. Die erfindungsgemaessen Peptide haben die StrukturX-b-D-2NAL-R2-D-Trp-Ser-R5-R6-R7-Arg-Pro-R10,worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit maximal 7 Kohlenstoffatomen ist; R2 ist Cl-D-Phe, F-D-Phe, NO2-D-Phe, Cl2-D-Phe oder Br-D-Phe; R5 ist Tyr oder Cl-Phe; R6 ist 4-NH2-D-Phe oder D-Arg; R7 ist Leu oder N2Me-Leu, und R10 ist Gly-NH2, NHCH2CH3 oder D-Ala-NH2.

Description

Berlin» den 1,3#1984 253 375/2 62 695/18/39

Verfahren zur Herstellung eines Peptids Anwendung sgeb.ietf der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, insbesondere GnRH*-Antagonisten, die die Freisetzung von Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren, einschließlich Menschen,inhibieren* sowie Methoden zur Verhinderung der Oyulation und/oder Inhibierung der Freisetzung von Steroiden, Speziell bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Peptide, die die Funktion der Keimdrüsen und die Freisetzung der Steroidhormone Progesteron und Testosteron inhibieren»

Charakteristik der bekannten technischen LjBsjuingjen

Die Hypophyse ist mit einem Stiel an der·als Hypothalamus bezeichneten Region in der Hirnbasis befestigt * Speziell werden von der Hypophyse das follikolotrope Hormon (FSH) und das luteogene Hormon (LH), die zusammen manchmal als Gonadox_; tropine oder gonadotrope Hormone bezeichnet werden, freige-"setzt. Diese Hormone regulieren zusammen die Funktion-der Keimdrüsen zur Erzeugung von Testosteron in den Hoden und Progesteron und Estrogen in den Eierstöcken und regulieren ferner die Produktion und Reifung von Keimzellen«

Die Freisetzung eines Hormons durch die Hypophysenvorder« lappen erfordert gewöhnlich die vorhergehende Freisetzung einer anderen Klasse von Hormonen_s di© vom Hypothalamus erzeugt werden. Eines der Hypothalamus^Hormone wirkt als Fak-

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ζ'* ' " ·

tor» der di© Freisetzung d&r gonadotropin Hormon©» speziell LHj auslöst. Dieses Hormon wird, hier als GnRH bezeichnete Andere Bezeichnungsweisen sind LH+-RH und LRF_e GnRH wurde isoliert und als Decapeptid der folgenden Struktur erkannt:

P"-Glu»His-Trp»Se r»-Ty r»GlywLeu^Arg^P ro^Gly'wNHg«.

Peptid© sind Verbindungen» die zwei oder mehr Aminosäuren enthalten, in denen die Carboxygruppe der ©inen^Aminosäure an die Aminogruppe der anderen Aminosäure gebunden ist« Die oben angegebene'Formel für GnRH entspricht der konventionellen Forraeldarstellung von Peptiden« bsi der die Aminogruppe links und die Carboxygruppe rechts erscheint,, Die Stellung des Aminosäurerestes wird angegeben^ indem die Aminosäure« reste von links naoh rechts numeriert werden* Im Falle von GnRH ist die Hydroxygruppe der Carboxygrupp© des Glycine durch die Amlnogrupp© (Νί-L·) substituiert« Die Abkürzungen der einzelnen Amino©äurereste in der obigen Formel sind kon«· ventioneil und sind vom Trivialnamen def jeweiligen Aminosäure abgeleitet* So bedeutet p«Glu Pyroglutasninsäurej, His Histidine Trp Tryptophan, Ser Serin* Tyr Tyrosin^ GIy Glycin_e Leu Leucin« Arg Arginin^ Pro Prolin,, Phe Phenylalanin und AIa Alanin» Dies© sowie Valin, Isoleucin» Threonin« Lysin, Asparaginsäure, Asparagin,-.Glutamin«. Cystein,/Methionin« Phenylalanin und Prolin werden als gewöhnliche, natürlich vorkommende öder von Eiweißen abgeleitet© Aminosäuren bezeichnet. Mit Ausnahme von Glycin haben die Aminosäuren der Peptide der Erfindung L»Konfiguration« wenn nichts anderes angegeben ist«

Es ist bekannt, daß. der Ersatz von Glycin in der'6-Stellung von GnRH durch D-Aminosäuren ein Peptidmaterial liefert» das

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im Vergleich zu GnRH eine 1*- bis 35fach größere Wirksamkeit zur Auslösung der Freisetzung von LH und anderen Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren hat«

!<„ U_# Prasad et al_#, J. Med» Chenu, Bd_# 19, 492 (1976) stellen fest, daß eine größere Wirksamkeit auch durch Substitution der 3«Position durch 3~(Naphth~l<~yl)«Ala eneicht wird* Der Freisetzungseffekt wird erreicht* wenn das GnRH-Analoge einem Säugetier intravenös, subcutan, intramuskulär, oral, Intranasal oder intravaginal verabreicht wird«

Es ist weiterhin bekannt, daß die Substitution von His durch verschiedene Aminosäuren (oder die Abspaltung von His) in 2«Position des GnRH-Decapeptids zu Analogen fuhrt, die eine Inhibierungswirkung auf die Freisetzung von LH und anderen Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren ausüben«

Unter bestimmten Umständen möchte man die Ovulation bei weiblichen Säugetieren verhindern» Die Verabreichung von GnRH-Analogen, die Antagonisten der normalen GnRH«Funktion sind, wurde zur Verhinderung der Ovulation angewendet* Aus diesem Grunde werden GnRH«Analoge, die Antagonisten des GnRH sind, als potentielle Kontrazeptiva oder Mittel zur Regulierung der Empfängnisperiode untersucht« Solche Antagonisten erweisen sich auch zur Regulierung der Sekretion von Gonadotropinen bei männlichen Säugetieren als brauchbar und können als männliche Kontrazeptiva verwendet werden«

Ziel der Erfindung '

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer Peptide_# die starke Antagonisten des endogenen GnRH sind und die

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Sekretion von LH und die Freisetzung von Steroiden durch die Ganaden von Säugetieren verhindern*

des

D@r Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde^ neue Peptid© mit den gewünschten Eigenschaften und Verfahren zu ihrer Herbst ellung aufzufinden«

Erfindungsgemäß werden Peptide zur Verfügung gestellt® die di© Freisetzung von Gonadotropins« in Säugetieren« ein*» schließlich Menschen^ inhibieren'» sowie Methoders zur Inhibit rung der Freisetzung von Steroiden durch die Gonaden männlicher und weiblicher Säugetiere« Die verbesserten GnRBwAnalogen sind GnRH«Antagonisten und haben ©in® Inhi« bitionswirkung auf die Reproduktionsprozess® von Säugetieren« Diese Analogen können zur Inhibierung der Produktion von Gonadotropins^ und, Sexualhormonen unter verschiedenen Um» ständen verwendet werden, z» B* bei vorzeitiger Pub®trtät_$ hormonabhängiger ,Ne'oplasie, Dlsmenorrhoe und Endometriose*

Allgemein wurden entsprechend der vorliegenden Erfindung Peptid© synthetisiert» di© die Sekretion von Gonadotropinen durch die Hypophyse von Säugetieren,, einschließlich Menschen,, und/oder die Freisetzung von Steroiden durch di© Gonaden stark inhibieren* Diese Peptide sind Analo§e von GnRH₈ in denen die !«Position durch B-(Naphth»2«yl)«D«»alanin (im folgenden B«°D«2NAL) substituiert ist, di® 3«Position durch D-Trp substituiert ist> die 6*-Position und auch die ^«Position substituiert ist» Der Substituent in !«Position kann

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so modifiziert sein« daß seine alpha-Aminogruppe eine Acylgruppe enthält, wie Formyl; Acetyl» Acryloyl, Vinylacetyl oder Benzoyl, wobei Acetyl (Ac) und Acryloyl (Acr) bevorzugt werden« In 2-Position ist vorzugsweise modifiziertes D-Phe vorhanden, das durch spezifische Modifizierung im ßenzenring eine erhöhte Antagonisctenwirkung hervorruft« Substitution eines Wasserstoffatoms erfolgt vorzugsweise in para- oder 4-Stellung> und der Substituent ist Chlor, Fluor, Brom oder Nitro, wobei Chlor und Fluor bevorzugt werden» Doppelsubstitutionen erfolgen vorzugsweise in 3« und 4"Stellung, z, B« 3,4-Cl₂«D~Phe« In 6-Poeition wird 4»NH₂~D»-Phe oder D-Arg eingesetzt« Die Substitutionen in 5-, 7- und 1Opposition sind fakultativ« Wenn Cl-Phβ in 5-Position eingesetzt wird« ist das Cl vorzugsweise in der ortho·· oder 2-Stellung vorhanden«^

Da diese Peptide f ochwirksam zur Inhibierung der LH-Freisetzung sind, wert en sie oft als GnRH-Antagonisten bezeichnet· Die Peptideiinhibleren die Ovulation weiblicher Säugetiere, wenn sie in sehr geringen Dosen während des Prooeetrus verabreicht werden und bewirken auch die Resorption befruchteter Eier, wenn sie kurz nach der Empfängnis verabreicht werden« Diese Peptide sind auch fQr die kontrazeptive Behandlung männlicher Säugetiere wirksam«

Die Peptide der vorliegenden Erfindung werden genauer durch die folgende Formel dargestellt: ^

X-ß-.D-2NAL-R²-0-.Trp-Ser«R⁵«R⁶-R⁷-Arg-.Pro-R^:L0,

worin X Wasserstoff oder eine Acy!gruppe mit maximal 7 Kohlenstoffatomen ist; R² ist Cl-D-Phe, F-D-Phei NOg-Ö-Phe,

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Cl««D«Phe oder Br-D«*Phe ι R⁵ ist Tyr oder Cl«Phe; R^S ist

7 SO

D-Arg oder ^NHg^D^Phei R ist Leu od®r N«e£M©«Leuj R ist GIy-NH₂V NHCH₂CH₃ oder D

Mit S-O-NAL wird das D«Isom©r von Alanin bezeichnet«' das am ß-Kohlenstoffatom durch Naphthyl substituiert istν was auch als 3-D-NAL bezeichnet werden kann«, Vorzugsweise wird di© Bezeichnung ß~D*-2NAL verwendete di® anzeigtv daß das ß«Kph» lenstoffatom rait Naphthalen in der 2«Stellung der Ringstruktur verknöpft-ist»

Die Peptide der vorliegenden Erfindung können, durch klassi·» sehe Lösungesynthese oder durch eine Festpha©@nt@chnik unter Verwendung eines chlormethylierten Harze®« ®ines Methyl« benzhydrylaminharzes (MBHA) oder eines Benzhydrylaminharzes (BHA) dargestellt werden« Die Festphasensynthese wird so durchgeführt, daß die Aminosäuren schrittweise an die Kette angeknüpft werden^ nach dem Verfahren» das detailliert in dem US-PS 4*211*693 beschrieben ist» Wie aus der Literatur allgemein bekannt ist_Ä werden Ser* Tyr, Arg und His sowie fakultativ Trp vorzugsweise mit Schutzgrupp@n an den Seiten«"· ketten versehen, bevor sie mit der auf dem Harz aufzubauen« den Kette gekoppelt werden« Diese Methode liefert ein voll mit Schutzgruppen versehenes intermediäres Peptidharz»

Die Intermediärprodukte der Erfindung können durch folgende Formel dargestellt werden:

Xß PrO-X⁶V

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worin X eine c^-Amino-Schutzgruppe ist, wie sie in der Literatur als geeignet für die schrittweise Synthese von Polypeptiden bekannt ist« Wenn X in dem gewünschten Peptid eine bestimmte Acylgruppe ist, kann diese Gruppe auch als Schutzgruppe verwendet werden» Als X können folgende Klassen von oL -Amino-Schutzgruppen verwendet werden; 1« Acyl-Schutzgruppen wie Formyl (For), Trifluoracetyl, Phthaloyl» p-Toluensulfonyl (Tos), Benzoyl (Bz),Benzensulfonyl, o-Nitro-phenylsulfenyl (Nps), Tritylsulfenyl, o*-Nitrophenoxyacetyl, Acryloyl (Acr>, Chloracetyl, Acetyl (Ac) und ^-Chlor-butyryl; 2, aromatische Schutzgruppen vom Urethan-Typ» z, B_# Benzyloxycarbonyl (Z) und substituiertes Benzyloxyca rbonyl, wie p-Chlor-benzyloxycarbonyl, p-Nitro-Benzyloxycarbonyl, p-Brom-benzyloxycarbonyl und p-Methoxy-benzyloxycarbonyl; 3# aliphatische Urethan-Schutzgruppen, wie tert-Butoxycarbonyl (Boc), Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropoxycarbonylt Ethoxycarbonyl und Allyloxycarbonyl; * A₄, Cycloalkyl-Schu'tzgruppen vom Urethantyp, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; 5# Schutzgruppen vom Thiourethan-Typ, wie Phenylthiocarbonyl; 6· Alkylschutzgruppen, wie Allyl (AIy), Triphenylmethyl (trityl) und Benzyl (BzI); 7_# Trialkylsilangruppen, wie, Trimethylsilan. Wenn X Wasserstoff ist, ist die bevorzugte «^-Amino-Schutzgruppe Boc,

X let Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für den Indöl«Stick« stoff« wie Formyl oder Benzyl; bei vielen Synthesen ist ein Schutz von Trp jedoch nicht erforderlich»

X iet Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die alkohol!-

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sehe Hydroxygruppe von Ser« Dafür wird Acetyl_a Benzoyl,_s Tetrahydropyranyl« tert^Butyl» Trityl, Benzyl oder 2Vo^ chlor-benzyl gewählt* Benzyl wird bevorzugt*

X ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenol!·» sehe Hydroxygruppe von Tyr* Dafür wird Tetrahydropyranyl^ tert-Butyl, Trityl, Benzyl* Benzyloxycarbonyl* Φ-Brora-benzyloxycarbonyl oder 2_f6*Oichlor»*benzyl gewählt* 2^6wDichlor«» benzyl wird bevorzugt«

5 ' ' ' · - '

X ist eine Schutzgruppe für die Stickstoffatome von Arg» Dafür wird Nitro, Tos» Benzyloxycarbonyl^ Adamantyloxy« carbonyl oder Boc gewählt» X kann auch Wasserstoff seinv d« h/i daß sich an den Stickstoffatomen der Seitenkette von Arginin keine Schutzgruppe befindet* Tos wird bevorzugt«

X ist eine der folgenden Gruppen: Gly-0«CH₂«(Trägerharz)j 0-.CH₂-(Trägerharz); D~Ala-0~CH₂«(Trägerharz)j Gly«NH-(Trä^ gerharz); D»Ala-NH-»( Trägerharz); sowie OH» Ester» Amid oder Hydrazld von GIy oder D-AIa oder direkte Bindung an Pro»

Das Kriterium für die Wahl der Seitenkettenschutzgruppen X -X besteht darin» daß die Schutzgruppe gegenüber dem Reagens stabil sein muß, das unter den Reaktionsbedingungen für die /!spaltung der «£w\mino«Schutzgrupp®n bei jedem Syn~ theseschritt gewählt wird« Die Schutzgruppe darf nicht unter den Kupplungsbedingungen abgespalten werden und muß nach Abschluß der Synthese der gewünschten Aminosäuresequenz unter Reaktionsbedingungen abspaItbar sein/ die die Peptidkette nicht verändern»

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Wenn die Gruppe X Gly-O-CHg-^Trägerharz), D^Ala-0«CH₂««(Trägerharz) oder 0~CH₂*«(Trägerharz) ist^ ist der Esterteil einer der vielen funktioneilen Gruppen des Polystyren^Trägerharzes dargestellt« Wenn die Gruppe X^ Gly-NH·»(Träger*» harz) oder D~Ala«-NH»(Trägerharz) ist^ so ist GIy oder D-AIa über eine Amidbindung an ein BHA-Harz oder ein MBAHwHarz gebunden*

Wenn X beispielsweise in der Endformel vorhanden ist» kann es als X -Schutzgruppe für die Ot -Aminogruppe von,D-NAL benutzt werden, indem es vor der Kupplung dieser letzten Aminosäure an die Peptidkette zugegeben wird» Vorzugsweise wird jedoch eine Reaktion an dem Peptid an dem Harz durchgeführt (nach Entblockung der o£-Aminogruppen während die Gruppen an der Seitenkette geschützt bleiben), z« B, durch Reaktion mit Essigsäure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (OCC) oder vorzugsweise mit Acetanhydrid oder durch eine andere geeignete aus der Literatur bekannte Reaktion»

Von einem chlormethylierten Trägerharz kann das voll geschützte Peptid auf bekannte Weise durch Ammonolyse abgespalten werden» so daß das voll geschützte Amid-Zwischenprodukt erhalten wird« Abspaltung der Schutzgruppen des Peptide sowie die Abspaltung des Peptide von einem Benzhydrylaminharz kann bei 0 ⁰C mit Flußsäure (HF) erfolgen. Vor der Behandlung mit HF wird dem Peptid vorzugsweise Anisol zugesetzt« Nach dem Entfernen der HF unter Vakuum wird das abgespaltene, von Schutzgruppen befreite Peptid zweckmäßig mit Ether behandelt, dekantiert, in verdünnter Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert·

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Die Reinigung des Peptide erfolgt durch Ionenaustausch« Chromatographie an einer CMO-Säule und anschließend® Ver·» teilungschromatographie mit dem Eluttonssystem Butanol/0,1 N Essigsäure (Volumenverhältnis 1:1) an einer Kolonne mit Sephädex G-25 oder durch Hochdruck^Flüssigkeitschromatographxe in bekannter Weise»

Die Peptide der Erfindung sind in Dosen von unter 100 Mikrogramm je Kilogramm Körpergewicht wirksam zur Verhinderung der Ovulation weiblicher Ratten wirksam,, wenn sie gegen Mittag des Prodestrustages verabreicht werden« Für längere Unterdrückung der Ovulation kann eine höhere Dosierung im Bereich von 0,1 bis-etwa 2,5 Milligramm je Kilogramm Körper« gewicht erforderlich sein» Diese Antagonisten sind auch als Kontrazeptive wirksam, wenn sie männlichen Säugetieren auf reguläre Weis© verabreicht werden. Da dies© Verbindungen den Testosteronspiegel reduzieren (eine unerwünscht© Begleiterscheinung beim normalen, sexuell aktiven männlichen Tier)β kann es zweckmäßig sein* zusammen mit dem GnRH«Anta« gonisten Ersatzdosen von Testosteron zu verabreichen* Diese Antagoni'sten können auch zur Regulierung der Produktion von Gonadotropinen und Sexualsteroiden zu anderen als den oben angegebenen Zwecken verwendet werden»

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert«

Die in Tabelle I angegebenen Peptide mit der Formel

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2 ß 10

Ac-ß-D-2NAL«R -D-Trp-Ser-Tyr-R -Leu-Arg-Pro-R

werden nach dem oben angegebenen Festphasenverfahren dargestellt. ^J .

TABELLE I	R²	R⁶ -	R¹⁰	GIy-OCH₃
	4-F-D-Phe	D-Arg	GIy-NH₂	GIy-NHNH₂,
1	N	4-NH₂AD-Ph	e "
2	4-Cl-D-Phe	D-A rg	H
3	4-Cl-D-Phe	H	NHCH₂CH₃
4	4-N0₉-D-Phe	H	H
5	4«. Br-D- Ph e	M ' -	M ' <
6	4-F-D-Phe	M	D-AIa-NH₂
7	U	M	GIy-NH₂ (N*MeLeu⁷)
8	H	M	(2-Cl-Phe⁵)
9	M	H
10	H	H
11

Als Beispiel wird eine repräsentative Festphasensynthese des oben genannten Peptide Nr* 1, das als £Ac-ß~D-2NAL , 4~F-D-Phe , D-Trp , D-Arg J-GnRH bezeichnet wird» im folgenden beschrieben« Dieses Peptid hat die folgende Formel:

. ι·

Ac-ß-D^NAL^-F-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-NH_2#

Es wird ein BHA-Harz verwendet, und Boc-geechütztes GIy wird 2 Stunden in CH₂Cl₂ mit einem dreifachen Überschuß des Boc-Derivats und DCC als Aktivierung sin it t el an das Harz gebunden*

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Der Glycinrest wird über eine Amidbindung en den WA-Rest gebunden*

Nach der Kupplung jedes Aminosäurerestes erfolgt Waschen, Abspaltung der Schutzgruppe und Kupplung des nächsten Aminosäurerestes in einer automatischen Maschine nach d©m folgenden Schema, wobei mit etwa 5 g Harz begonnen wird,»

Schritt Reagenzien und Operationen Mg₁SChZg₁It^jQnIiT

1 Waschen mit CH₂Cl₂ 80 ml (2x) 3

2 Waschen mit Methanol (MaOH) 30 ml (2x) 3

3 Waschen mit CH₂Cl₂ 80 ml (3x) 3

4 50 % TFA plus 5 % Ethan«l*2~dithiol in CH₂Cl₂ 70 ml (2x) 10

5 Waschen mit CH₂Cl₂ 80 ml (2x) 3

6 TEA 12,5 % in CHgCl₂ 70 ml (2x) 5

7 Waschen mit MeOH 40 ml (2x) - 2

8 Wascher» mit CH₂Cl₂ 80 ml (3x) 3

9 Boc-Aminoesure (10 mMol) in 3O ml DMF oder CH₂Cl₂J je nach Löslichkeit der jeweiligen geschützten Aminosäure plus DCC (10 mMol)

in CH₂Cl₂ (Ix) 30-300

10 Waschen mit MeOH 40 ml (2x) 3

11 TEA 12,5 % in CH₂Cl₂ 70 ml (Ix) 3

12 i Waschen mit MeOH 30 ml (2x) * 3

13 Waschen mit CH₂Cl₂ 80 ml (2x) ^

¹ /

Nach Schritt 13 wird ein aliquoter Teil für eine Ninhydrin probe entnommen* 1st die Probe negativ» wird mit Schritt zum Kuppeln der nächsten Aminosäure f ortgefahren * Ist. die

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Probe positiv oder leicht positiv, werden die Schritte 9 bis 13 wiederholt»

Das obige Schema wird für die Kupplung jeder Aminosäure des Peptids der Erfindung benutzt, nachdem die erste Aminosäure gebunden wurde« Für jede der verbleibenden Aminosäuren während der gesamten Synthese wird N"*Boc als Schutzgruppe verwendet* N*Boc~ß~D~2NAL wird nach einer bekannten Methode dargestellt, z. B, entsprechend der ausführlichen Beschreibung im US-PS Nr, 4.234.571 vom 18_# November 1980» Die Seitenkette von Arg wird mit Tos geschützt· Als Schutzgruppe für die Hydroxygruppe der Seitenkette von Ser wird OBzI verwendet, als Schutzgruppe for die Hydroxygruppe der Seit en«« kette von Tyr dient 2,6-Dichlor«-benzyl. Trp verbleibt ungeschützt» N^Boc-ß-D-^NAL wird als letzte Aminosäure einge« führt, Boc-Arg(Tos) und Boc-D-Trp, die in CH₂Cl₂ schlecht löslich sind, werden mit Hilfe von DMF-CH₂Cl₂~Gemischen gekuppelt.

Nach Abspaltung/ der &£. -Amino-Schutzgruppe am N-Ende erfolgt Acetylierung mit einem großen Oberschuß von Acetanhydrid in Dichlormethan* Die Abspaltung des Peptide vom Harz und die vollständige Abspaltung der Schutzgruppen der Seitenketten erfolgt sehr leicht bei O ⁰C mit HF* Vor der Behandlung mit HF wird Anisol als Spülmittel zugegeben· Nach der Entfernung der HF unter Vakuum wird das Harz mit 50%iger Essigsäure gewascben, und die Waschextrakte werden zu einem Rohpeptidpulver lyophilisiert,

Die Reinigung des Peptids erfolgt dann durch Ionenaustausch-

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Chromatographie an CMC (Whatman CM 32 mit einem Gradienten von 0,05 bis O₈3 M NH.OAc in 50 j 50 Methanol - Wasser) und anschließende Verteilungschromatographie in einer Gelfiltrationskolonne mit dem Elutionssystera Butanol * > Ό_#1 Ν Essigsäure (Volumenverhältnis 1 ; I)_-

Die Prüfung dee-Peptide-auf Homogenität erfolgt durch Dünn*» Schichtchromatographie und verschiedene Lösungsmittelsysteme sowie durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen und einer wäßrigen Triethylammoniumphosphat-» lösung plus Acetonitril« Die Aminosäureanalyse des gebildeten gereinigten Peptide stimmt mit der Formel für di© dargestellte Struktur überein und zeigt nahezu ganze Zahlen für jede Aminosäure in der Kette» Die optische Rotation wurde mit einem photoelektrischen Polarimeter zu #O_D = ««29° + 1 (c a 1, 50%ige Essigsäure) bestimmt,

' · « ...

Das Peptid wird in vitro und in vivo getestet« Der in*»vitro<Test erfolgt an zerkleinerten Ratt©nhypophysenzellen₈ die 4 Tage vor dem Test in Kultur gehalten wurden» Der nach der Zugabe der Peptide eingestellte LH»Spiegel wird durch einen spezifischen Radioimmuntest für Ratten-LH bestimmt. Die Kontrollplatten erhalten nur eine 3nanomolare Dosis GnRH; die Versuchsplatten erhalten eine Snanomolare Dosis GnRH plus eine Dosis von entweder dem vorgegebenen Standardanta~ gonisten(für Vergleichszwecke)_a d_# h* fAc-Dehydro«Pro , 4«F«-D-Phe _a D-Trp · 3-GnRH, oder dem Testpeptid in Konzentrationen zwischen 0,01, und lOnanomolar· Die LH^Menge, die von den nur mit GnRH behandelten Proben freigesetzt wird, wird mit der von den Proben, die mit GnRH plus Peptid be-»

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handelt wurden,,freigesetzten Menge verglichen.

Die Fähigkeit des Testpeptids, die Menge des durch 3nanomolares GnRH freigesetzten LH zu reduzieren, wird mit der des vorgegebenen Standardpeptids verglichen. Die Ergebnisse werden aus 3 bis 5 Dosen jedes Peptide nach dem statistischen Programm BIOPROG (aufgestellt von D. Rodbard NICHD) berechnet und als relative Wirksamkeit gegenüber dem vorgegebenen Standard ausgedrückt. Das Standardpeptid blockiert gewöhnlich 50 % des von GnRH freigesetzten LH bei einem Verhältnis von unter 0«! CAntagonistJ # ^ 1 CGnRH]

Das oben beschriebene Peptid wurde auch zur Bestimmung der Wirksamkeit der Verhinderung der Ovulation bei weiblichen ,Ratten verwendet. Bei diesem Test wurde eine festgelegte Zahl geschlechtsreifer weiblicher Sprague-Dawley-Ratten, nämlich sechs, mit einem jeweiligen Körpergewicht von 225 bis 250 g gegen Mittag des Prooestrus-Tages mit einer Injektion von 10 ^jg Peptid in Maisöl behandelt. Der Prooestrus ist der Nachmittag vor dem Oestrus (Eisprung). Eine weitere Gruppe weiblicher Ratten, denen das Peptid nicht verabreicht wird, dient als Kontrolle, Dede der weiblichen Kontroll-Ratten hatte einen Eisprung zum Oestrus. Von den behandelten Ratten hatte keine einen Eisprung. Als Schlußfolgerung daraus wird das Peptid als deutlich wirksam zur Verhinderung des Eisprungs weiblicher Ratten bei sehr niedriger Dosierung angesehen, und das Peptid wird bei einer DqS¹Is von etwa 10 yjg als absolut wirksam angesehen. Zusätzlich erfolgen Tests mit niedrigeren Dosierungen^ Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengefaßt«

«. .16 -

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Die übrigen Peptid© Nr_e 2 bis 7 werden in ähnlicher Weise dargestellt und gereinigt« Nach der Aminosäureanalyse wird die Reinheit durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographi© mitverschiedenen Lösungsmittelsystemen bestätigt* Die invitro*-Testung in ähnlicher Weise ergibt die in der tabelle angegebene Wirksamkeit jeweils gegenüber dem Vorgegebenen Standardantagonisten«. Die in^vivo-Testung erfolgt mit verschiedenen Dosierungen» Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben»

Peptid Nr*	5	in~vitro~ Wirksamkeit*)	Dosis	in vivo Anzahl Ovulationen
1	6	0₄44	10	0/6
		5	0/8
		2,5	0/10
		1	0/8
		0,5	2/11
2	1,4	5	3/6
3	0,56	1	¹ o/io
		0,5	2/10
4	0*38	10	0/8
		5	0/7
		2*5	0/10
		1	0/4
		O₈S	6/6
O₄,20	5	4/1©
0,46	2,5 ·	9/10

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TABELLE II (Fortsetzung)

in vivo

Peptid Nr.	in-Vit ro- Wirksamkeit )	Dosis	Anzahl Ovulationen
7	0,63	0,5	1/10 7/10
8		1 0,5	0/5
9		1 0,5	0/7

relativ zu fAc-Dehydro-Pro¹, 4~F-D«Phe , D-Trp³* ⁶J-GnRH

Alle angegebenen Peptide blockieren bei geeigneter Konzentration vollständig die GnRH-induzierte LH-Sekretion in vitro, obwohl die meisten in vitro etwas geringer wirksam sind als der vorgegebene Standard; jedoch in vivo sind diese Peptide viel wirksamer«

Alle Peptide erweisen sich als wirksam zur Verhinderung der Ovulation weiblicher Säugetiere bei sehr niedrigen Dosierungen· Einige von ihnen sind mindestens zweimal so wirksam wie alle bisher bekannten und getesteten GnRH-Antagonisten.

Die Peptide der Erfindung werden oft in Form pharmazeutisch akzeptabler nichttoxischer Salze, ζ« B, Additionasalze mit Säuren, oder in Form von Metallkomplexen, z, B„ mit Zinki Barium, Calcium, Magnesium, Aluminium usw. (die als Additionssalze für diesen Zweck angesehen werden) oder als Korn-

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bination dieser beiden Formen verabreichte Beispiele für Additionssalze mit Säuren sind Hydröchlorid, Hydrobromid_e .Sulfat/Phosphat* '.Nitrat* Oxalate Fumarat, Gluconat, Tannat_s Maleat, Acetat,.Citrat, Benzoat, Succinat» Alginat _a Pamoat, Malat, Ascorbat, Tartrat usw« Wenn der aktive Bestandteil in Tablettenform verabreicht werden soll, kann die Tablette ein pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel sowie ein Bindemittel enthalten, z„ B₀ Tragant, Maisstärke oder Gelä« tine,· ein Auflösungsmittel, wi© Alginsäure; sowie ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat» Wird Verabreichung in flüssiger Form gewünscht » so können Süßmittel und/oder Geschmacksverbesserungsmittel als Teil des pharmazeutisch akzeptablen Lösungsmittels verwendet werden«, Intravenöse Verabreichung kann in physiologischer Kochsalzlösung» Phosphat-Pufferlösungen oder ähnlichem erfolgen*

Die pharmazeutischen Zubereitungen enthalten gewöhnlich das Peptid in Verbindung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch akzeptablen Träger* Gewöhnlich beträgt die Dosierung zwi>» sehen 1 bis ca/ 100 g. Peptid je kg Körpergewicht des behandelten Subjekts bei intravenöser Verabreichung* Orale Dosierungen sind höher* Allgemein erfolgt die Behandlung von Subjekten mit diesen Peptiden ira ganzen in derselben Weise wie die klinische Behandlung mit anderen GnRH~Antagonist.en»

Diese Peptide können Säugetieren intravenös,, subeutan, intramuskulär* oral, intranasal oder intravaginal verabreicht werden» um eine Inhibierung der Fruchtbarkeit und/oder Kontrolle der Fruchtbarkeit zu erreichen, sowie zu Anwendungszwecken, die eine reversible Unterdrückung der Keimdrüsen-

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' . ' ι funktion erfordern, wie Behandlung von vorzeitiger Pubertät oder während einer Strahlen- oder Chemotherapie« Die wirksamen Dosierungen variieren mit der Anwendungsform und der Art des behandelten Säugetiers· Ein Beispiel einer typischen Dosierungsform ist eine physiologische Kochsalzlösung, die das Peptid enthält und die so verabreicht wird, daß eine Dosis zwischen ca* 0,1 bis 2,5 mg/kg Körpergewicht erreicht wird. Orale Verabreichung des Peptide kann sowohl in flüssiger Form als auch in fester Form erfolgen*

Obwohl die Erfindung bezüglich ihrer vorzugsweisen Verkörperungen beschrieben wurde, versteht es sich, daß Veränderungen und Modifizierungen, wie sie einem auf diesem Gebiet erfahrenen Mitarbeiter einleuchten, innerhalb des Bereiches der Erfindung liegen, welche in den nachfolgenden Ansprüchen spezifiziert wird« Beispielsweise können andere in der Literatur bekannte Substitutionen, die die Wirksamkeit der Peptide nicht deutlich verändern, in den Peptiden der Erfindung angewendet werden« So kann anstelle des für

10 R spezifizierten Restes GIy-OCH- oder GIy-OCH₂CH, oder GIy-NHNH₂ oder Sa^-NH₂ (Sar » Sarcosin) verwendet werden, die als gleichwertig angesehen werden*

i .

Dh Einzelheiten der Erfindung sind in den folgenden Ansprüchen dargelegt*

Claims

.·.- ' 1.3.1984

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2, Verfahren gemäß Punkt 1» gekennzeichnet dadurch» daß R 4*-Cl~D~Phe oder 4-F~D-Phe ist,

3. Verfahren gemäß Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R Leu ist,

4. Verfahren gemäß Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß R D-Arg ist,

' 5

5. Verfahren gemäß Punkt 4„ gekennzeichnet dadurch, daß R

Tyr ist.

6. Verfahren gemäß Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß X Ac ist,

7. Verfahren gemäß Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß X Acr ist,

8. Verfahren gemäß Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß X

4 '

ac und R D-Arg ist, .,

9. Verfahren gemäß Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß R*"

4-Cl-D-Phe ist.

1 4 5

X bis X und/oder Abspaltung von dem in X einbegriffenen Trägerharz und gegebenenfalls Umwandlung eines gebildeten Peptids in eines seiner nichttoxischen Salze.

1. Verfahren zur·Herstellung eines Peptids der folgenden Formel oder eines nichttoxischsn Salzes davon:

worin X Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit maximal

2
7 Kohlenstoffatomen ist; R ist Cl-D-Phe_s F-P-Phe-NO^-D-

^x Et *~

Pfoe, Cl₀-D-F¹H oder Br-D-Phe; R ist Tyr oder 2~Cl-D~Phe;

F ^£"' 7

R ist· 4NH₂'-0».Phe oder D-Arg; R ist Leu oder N^Me'-Leu; ¹R¹⁰¹ISt-GIy-NH₂, NHCH₂CH₃ oder D-AIa-NH₃, gekennzeichnet dadurch, dal? es folgende Schritte umfaßt:

(a) die Bildung einer Intermediarverbindung mit der Formel · · . . .

worin X Wasserstoff oder eine oL -Amino-Schutzgruppe ist; X" ist Wasserstoff oder.eine Schutzgruppe für die 'alkoholisehe Hydroxvgruppe von Ser; X ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die phenolische Hydroxygruppe von Tyr;

X ist Wasserstoff oder eine Schutzgruppe für die Stickstoffatome von Arg; X⁵ ist Gly-0«CH₂~(Trägerharz), 0-CH₂-(Trägerharz)/ D-Ala-O-CHg-CTrägerharz), Gly-NH-(Tröger« harz)^O-Ala-NH-(Trägerharz)_#.GIy-NH₂, NHCH₂CH₃ oder Ester, Atöide und Hydrazide von GIy oder D-AIa;

(b) dia Abspaltung von einer oder mehreren der Gruppen

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2 10.Verfahren gemäß Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß R 4-F-D-Phe ist.