DD202695A5 - Verfahren zur herstellung neuer peptide - Google Patents

Abstract

Verbindungen, die als Antagonisten der antidiuretischen Aktivitaet von Arginin-Vasopressin wirken. Die Verbindungen fallen unter die Formel, in der bedeuten: X Tyr-X'; Tyr D- oder L-; X' Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl oder Butyl; W Pro oder Delta hoch 3-Pro; und Z L- oder D-Arg. Verbindungen, in denen X D-Tyr (X') und X' H oder X D-Phe, D-Val, D-Leu, D-Ile, D-Arg, D-Norvalin, D-Norleucin, D-Cyclohexylalanin, D-alpha-aminobuttersaeure, D-Threonin oder D-Methionin; W Pro und Z D- oder L-Arg bedeuten, wirken ebenfalls als Antagonisten der antidiuretischen Aktivitaet von Arginin-Vasopressin. Verwandte Verbindungen, in welchen X' H, Methyl oder Ethyl; W Pro und Val in der 4-Stellung durch Gln ersetzt ist, besitzen antivasopressorische Aktivitaet gegen Arginin-Vasopressin.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue Peptide, die der antidiuretischen und/oder vasopressorischen Wirkung von Arginin-Vasopressin in vivo entgegenwirken.

Stand der Technik:

Versuche zur Entwicklung klinisch brauchbarer synthetischer Antagonisten der in vivo antidiuretischen und/oder vasopressorischen Reaktionen auf Arginin-Vasopressin, dem antidiuretischen Hormon (ADH) haben zur Synthese und pharmakologischen Bewertung von hunderten von Analoga der neurohypophysischen Peptide Oxytocin und Vasopressin geführt.

Über Analoga, die vas-opressorischen in vivo-Reaktionen auf ADH wirksam entgegenwirken können, haben berichtet: Dyckes et al., J. Med. Chem., Vol. 17 (1974), S. 250; Manning et al., J. Med. Chem. Vol.20 (1977) S. 1228; Bankowski et al., J. Med. Chem., Vol. 21 (1978) S. 850; Kruszynski et al., J. Med. Chem., Vol. 23 (1980) S. 364 und Lowbridge et al., J. Med. Chem., Vol. 21 )1978) S. 313.

Kruszynski et al. haben berichtet, daß [l-(ß-Mercapto-ß, ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-(O-methyl)-tyrosinj -arginin-vasopressin und (l-ß-Mercapto-ßjß-cyclopentamethylenpropionsäure)-arginin-vasopressin starke vasopressorische Antagonisten sind, die auch eine sehr schwache antidiuretisehe Wirkung haben.

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Manning et al. (1977) beschrieben die Synthese von Jl-Deaminopenicillainin, 4-vaiin, S-D-argininJ-vasopressin und Lowbridge et al. die Synthese von £l-(3-Mercapto-ß,ß~ cyclopentamethylenpropionsäure), 4-valin, 8-D-arginin] -vasopressin. Diese beiden Verbindungen haben geringe antidiuretische Wirkung und sind starke Antagonisten der vasopressorischen Reaktion auf AVP.

über Analoga von Vasopressin und Oxytocin, die den antidiuretischen Reaktionen auf ADH entgegenwirken, haben berichtet: Chan et al., Science, Vol. 161 (1968) S. 280 und J. Pharmacol. Exp. Ther., Vol. 174 (.1970) S. 541 und Vol. 196 (1976), S. 746; Nestor et al., J-. Med. .Chem. , · VoI. 18 (1975), S. 1022 und Larsson et al., J. Med. Chem., Vol. (1978) S. 746. Keine der in diesen Artikeln genannten Verbindungen sind pharmakologisch oder klinisch als antidiuretische Antagonisten geeignet.

Die Synthese und Bewertung der Vasopressin-Analoga, denen verethertes Tyrosin in 2-Stellung, Valin in 4-Stellung und D- oder L-Arg in 8-Stellung eingearbeitet sind, welche der antidiuretischen Wirkung von ADH in vivo entgegenwirken, ist beschrieben von Sawyer et al., Science, Vol. 212 (1981) S. 4.9 und Manning et al., J. Med. Chem., Vol. 24 (1981) S. 701.

Synthetische Vasopressine sind in folgenden US-PSen offenbart: 3 371 080, 3 415 805, 3 418 307, 3 454 549, 3 497 und 4 148 787. Aus der US-PS 3 371 080 ist zu entnehmen, daß 2-Phenylalanin-8-ornithin-vasopressin eine den natürlichen Vasopress-inen gleiche vasokonstrxktive Wirkung, aber eine geringe antidiuretische Aktivität besitzt. Die in den übrigen üS-PSen offenbarten synthetischen Vasopressine haben hohe oder relativ spezifische antidiuretische Aktivität.

Synthetische Modifikationen von Oxytocin sind in den ÜS-PSen 3 691 147 und 3 700 652 beschrieben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, pharmakologisch und klinisch wirksame Antagbnisten der antidiuretxschen Wirkung von Arginin-Vasopressin zu schaffen. Die Antagonisten gegen die antidiuretische Wirkung von ADH sollen in vivo wirksam sein. Die Ahtagonisten der vasopressori- ' sehen Wirkung von ADH sollen geringe antidiuretische Aktivität besitzen. Darüber hinaus soll ein Verfahren zur Antagonisierung der in vivo-Reaktion eines Tieres auf die antidiuretische Wirkung eines antidiuretischen Hormons sowie ein Verfahren zur Antagonisierung der in vivo vasopressorischen Reaktion eines Tieres auf ein vasopressorisches Hormon geschaffen werden.

Die Lösung der Aufgabe ist in den Ansprüchen 1, 18 und 26 angegeben. Die Unteransprüche haben bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zum Gegenstand. .

Zusammenfassung der Erfindung:

Die Erfindung betrifft neue Antagonisten der antidiuretischen Wirkung von ADH, welche Verbindungen der nachstehenden allgemeinen Formel sind:

12.- 3

5 6 7 8 9

CH₂~CO-Tyr(X^ Phe-Val-Asn-Cy-W-Z-Gly-NH.

,CH₂-CH

in der bedeuten X' Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl oder Butyl; Tyr D- oder L-, W Pro oder ij-Pro und Z L- oder D-Arg.

Die Erfindung bezieht sich ferner auf Antagonisten der ADH-Aktivität von Arginin-Vasopressin der nachstehenden allgemeinen Formel:

123 4 56 789 . CH₂-CO-X-Phe-Val-Asn-Cy-Pro-Z-Gly-NH₂

CH₂-CH

y\

'CH₂-CHj S

- ta - !,uyfu«

in der bedeuten X D-Phe, D-VaI, D-Leu, DtIIe, D-Arg, D-Norvalin, D~Norleucin, D-Cyclohexylalanin, D-o^-Aminobuttersäure, D-Threonin oder D-Methionin und Z D- oder L-Arg.

Die Erfindung schließt ferner ein Verfahren zur Antagonisierung der in vivo-Reaktion auf ADH ein, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer der vorstehenden Verbindungen, im Gemisch mit einem physiologisch und pharmazeutisch annehmbaren Träger, an ein in Behandlung befindliches Tier in einer Menge, die ausreicht, der antidiuretischen Reaktion auf ADH entgegenzuwirken.

Durch die Erfindung sind ferner Antagonisten der vasopressorischen Wirkung von ADH geschaffen worden; es sind Verbindungen der nachstehenden allgemeinen Formel

,' 1 2 3456789

CH_o-C0-Tyr(X^-Phe-Gln-Asn-Cy-Pro-Z-Gly-MH.

CH₂-Ch'

CH₀ J⁴

.2

in der bedeuten: X' H, Methyl oder Ethyl und Z L- oder D-Arg. .

Diese Verbindungen können in vivo zur Antagonisierung

einer vasopressorischen Reaktion auf ein vasopressorisches Hormon in einem in Behandlung stehenden Tier verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Figuren:

Fig. 1 zeigt Urin-Osmolalitäten, als Funktion der Zeit, von Ratten, die intraperitoneal mit einer Verbindung dieser Erfindung behandelt worden sind.

Fig. 2 zeigt die Urinausscheidung, als Funktion der Zeit, von Ratten, die mit einer Verbindung nach der Erfindung behandelt worden sind.

In einzelne gehende Beschreibung:

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind Derivate von Arginin-Vasopressin (AVP). Die Aminosäuren liegen in der L-Form vor, wenn nicht anders angegeben. Die Bedeutung der Abkürzungen ist nachstehend aufgeführt:

dAVP, 1-Deamino-arginin-vasopressin; dPAVP, £l-Deaminopenicilliaminj-arginin-vasopressin; d(CH₂J₅AVP, [I-(ß-Mercapto-ß, ß-cyciopentamethylenpropionsäure)J -arginin-vasopressin; dVDAVP, 1-Deamino 0-valin, SHD-argininJ-vasopressin; dPVDAVP, fl-Deamino-penicillamin, 4-valin, 8-D-argininJ-vasopressin; d(CH₂)cVDAVP, fl~(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 4-valin, 8-D-argininJ-vasopressin; dTyr(Me)AVP, y.-Deamino^2-(O-methyl)-tyrosinj-arginin-vasopressin; dPTyr (Me)AVP fl-Deaminopenicillamin, 2-(O-methyl)tyrosin^ -arginin-»

-«- £OÖHU3 I

vasopressin; d(CH₂)₅Tyr(Me)VDAVP, [l- (ßrMercapto-ß^-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-O-Methy!tyrosin, 4-valin, S-D-argininJ-vasopressin; d (CH₂) ,-Tyr (Et) VDAVP, £l-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure) , 2-0-ethyltyrosin, 4-valin, 8-D-arginin] -vasopressin; d(CH-)₅Tyr(Me)VAVP, \l-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-(O-methyl) tyrosin, 4-valinJ-ärginin-vasopressin; d (CH₀) j. Tyr(Et)VAVP, ^!-(ß-Mercapto-ß^-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-0-ethyltyrosin, 4-valin]J-arginin-vasopressin; d(CH₂)₅Tyr(i-Pr)VDAVP, [l-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-(O-isopropyl)tyrosin, 4-valin, 8-D-argininJ-vasopressin; d(CH₂)₅Tyr(n-Pr)-VDAVP, [l-(ß-Mercapto-ß,ßcyclopentamethylenpropionsäure), 2-(O-n-propyl)tyrosin, 4-valin, 8-D-argininJ-vasopressin; d(CH₂)cTyr(i-Pr)VAVP, £l-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-(0-isopropyl)-tyrosin, 4-valinJ-arginin-vasopressin; d(CHp)cTyr(n-Pr)VAVP, £l-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure ), 2-(O-n-propyl)tyrosin, 4-valinJ-argininvasopressin; und d (CH₉) _Tyr (Et) V<Ä -Pro AVP, [Ί-(ß-Mercaptoß^-cyclopentamethylenproprionsäure) , 2-(O-ethyI) tyrosin, 4-valin, 7·*· (3 ,4-dehydroprolin) J-arginin-vasopressin; d (CH₂) ^" Tyr VDAVP, I^L-ß-Mercapto-ß^-cyclpeiitamethylen-propionsäure) ,. 2-D-tyrosin, 4-valin, 8-D-arginin-vasopressin; d(CH₃J₅ D-Tyr VAVP, £l-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2- D-tyrosin, 4-valinJ -arginin-vasopressin; d(CH₂)₅~D-Phe

VDAVP/ Ql-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenproprionsäure), 2-D-phenylalanin, 4-valin, 8-D-argininl-vasopressin; d(CH₀)_

D-Phe VAVP, £l (ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure) , 2-D-phenylalanin, 4-valinJ -arginin-vasopressin; d(CH₂)_₅ J[GIy²J VAVP, [Ϊ- (ß-Mercapto-ß/ß-cyclopentamethylenpropions äure) , 2-glycin, 4-valin3-arginin-vasopressin; d(CH₂)₅- ^D-AIa²J VAVP, [l-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-D-alain, 4-valin^-arginin-vasopressin; d(CH₂)₅ ["D-VaI²J VAVP [l- (ß-Mercapto-ß, ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-D-valin, 4-valinj-argininvasopressin; d(CH₂)₅ [ü-Leu J VAVP, [Ί-(ß-Mercapto-ß,ßcyclopentaraethylenpropionsäure), 2-D-leucin, 4-valinj-argininvasopressin; d(CH₂)₅ [D-IIe²J VAVP, £l~(ß-Mercapto-ß,ßcyclopentamethylenpropionsäure), 2-D-isoleucin, 4-valin)-arginin-vasopressin; und d(CH₂)₅ jp-Arg J VAVP, £l-(ß-Mercapto-ß, ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-D-arginin, 4-valin]-arginin-vasopressin.

Di-s aktiven Peptide wurden durch Festphasen-Synthese hergestellt, wie beschrieben von; Bansov/sJci et «1. (1278), a.^.O; Merrifield, J. Am. Chem. Soc.,.Vol. 85 (1963)'S. 2149 und Biochemistry, Vol. 3 (1964) S-. 1385, -Manning, J. Am. Chem. Soc, Vol. 90 ) 1968) S. 1348; Manniig et al., J. Med. Chem., Vol. 19")1976) S, 3 76; Lowbridge et al., J. Med. Chem., Vol. 20 (1977) S. 1173; Manning et al., J. Med, Chem., Vol. 16 (1973) S. 975; Kruszynski et al. (1980), a.a.O., Sawyer 'et' al., (1981), a.a.O. oder Manning et al. (1981) a.a.O.

Peptide, die Δ -Pro in 7-Stel lung haben ^ wurden ebenfalls auf diese Weise hergestellt. Die Einarbeitung von h -Pro in Peptide ist beschrieben worden von Felix et al., J. Peptide Protein Res., VoI 10 (1977) S. 299 und Botos et al.* J. Med. Chem,, VoI 22 (1979) S. 926.

Die ersten Versuche einen Antagonismen der antidiuretischen Reaktion auf Arginin-Vasopressin (AVP) zu konstruieren, schließen die Synthese von (jL-Deaminopeniciilamin, 4-valin, 8-D-argininJ-vascpressin (dPVDAVP) durch Manning et al., (1977), a.a.O., und von fl~(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 4™valin, 8-D-argininJ-vasopressin (d (CH₂) j-VDAVP) , durch Lowbridge (1978), a.a.O., ein. Diese Analoga wurden aufgebaut durch Ersatz der beiden H-Atome am ß-C-Atom in der 1-Stellung des hochaktiven und selektiv antidiuretischen Peptids l~Deamino [4-valin, 8~D-arginin}-vasopressin (dVDAVP), Manning et al„, J. Med. ehem., Vol. 16 (1973) S. 975, durch zwei Methylgruppen bzw. eine Cyclopentane thy lengruppe. Diese Substituenten hatten sich bisher als wirksam erwiesen den außerordentlich stark oxytocischen Agonisten 1-Deaminooxytocin (dOT) in starke Antagonisten der oxytocischen Reaktion auf Oxytocin umzuwandeln, insbesondere fi-Deaminopenicillaminl-oxytocin (dPOT) und j*l~(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure}Jj-oxytocin (U(CH₂)J-OT). Siehe Hope et al., J. Biol«, ehem., Vol. 237 (1962) S. 1563, Schulz et al., J. Med. Chem., Vol. 9 (1966)

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S. 647 und Nestor et al., J. Med. Chem., Vol. 18 (1975), S. 284.

Überraschenderweise war weder dPVDAVP noch d(CH₂)- VDAVP ein Antagonist der antidiuretischen Reaktion auf AVP, obwohl sie 0,1 bzw. nur 0,0001 der antidiuretischen Aktivität von dVDAVP besitzen. Jede dieser Verbindungen war jedoch ein starker Antagonist der vasopressorischen Reaktion auf AVP, ausgedrückt in pA~. PA₂ ist der negative Zehnerlogarithmus der durchschnittlichen molaren Konzentrationen des Antagonisten, welche die spezifische biologische Reaktion auf 2x Einheiten eines Agonisten zur Höhe der Reaktion auf χ Einheiten des Agonisten zurückführen. dPVDAVP und d(CH₂)cVDAVP hatten Antivasopressorwerte pA₂ von 7,82 und 7,68.

Die Entdeckung dieser beiden Vasopressor-Antagonisten dPVDAVP und d(CH₂)₅VDAVP führte zur Erforschung der Wirkungen der Substitution von ß,ß-Dimethyl und ß,ß-Cyclopentamethylen in 1-Stel lung in anderen Analoga des AVP, insbesondere in Verbindung mit der Substitution von O-MethyItyrosin in 2-Stellung des hochaktiven antidiuretischen und vasopressorischen Antagonisten 1-Deamino-arginin-vasopressin (dAVP) in der Hoffnung ein antivasopressorisches Peptid zu erhalten,-das noch stärker und selektiver als dPVDAVP oder d(CH.,) ,VDAVP ist. Siehe Huguenin et al., HeIv. Chem.

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238409

Acta., Vol. 49 (1966) S. 695; Manning et al., J. Med. Chem., Vol. 19 (1976) S. 842 und Law et, al., J. Am. Chem. Soc, Vol. 82 (I960) S. 4579.

Die Entdeckung der antidiuretischen Antagonisten d ₃₅ Tyr(alk)VAVP, Sawyer et al., (1981), a.a.O., Manning et al., (1981) a.a.O., führte zur Synthese anderer in zwei-Stellung substituierter Analoga. Erhöhte anti-antidiuretische Wirkungen wurden an den verschiedenen O-Alkyl-D-TyrosinAnaloga gezeigt (Manning et al., in Peptides_f Structure, Function, Dan H. Rich und E. Gross, eds., Pierce Chemical Co (noch im Druck) und J. Med. Chem. (vorgelegt)). Die nicht-alkylierten D-tyrosin-Isomeren von d(Ch₂J₅VDAVP und d(CH₂)₅VAVP, das ist d(CH₂)₅D-Tyr-VDAVP und d(CH₂)₅D-Tyr~ VAVP erwiesen sich auch als anti-antidiuretisch. Versuche zur weiteren Erhöhung der anti-antidiuretischen Wirksamkeit und Selektivität haben zur Synthse von Analoga von d(CH₂)₅D-Tyr²VAVP und d(CH₃)₅D-Tyr²VDAVP geführt, die gemäß der Erfindung andere D-Aminosäuren anstelle von D-Tyrosin in Zwei-Stellung aufweisen.

Es war von Bankowski et al,. (1978), a.a.O., überraschend gefunden worden,daß von ^-DeaminopenicillaminJ-argininvasopressin (dPAVP) und ^l-Deaminopenicillamin^- (O-methyl) tyrosinj-arginin-vasopressin (dPTyr(Me)-AVP), dPAVP weniger stark war wie sowohl dPVDAVP als auch d(CH₂)eVDAVP, aber

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dPTyr(Me)AVP hatte einen Antivasopressor-Wert pA_? von 7,96 und war das wirksamste bekannte Antivasopressor-Peptid.

Der Effekt auf die antivasopressorische Stärke durch Kombinieren der β,β-Cyclopentamethylen- und O-MethyItyrosinSubstitutionen in dAVP wurde durch die Erfindung hervorgebracht unter Bereitstellung der Verbindung £l-(ß-Mercapto-β,β-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-(O-methyI)-tyrosin}-arginin-vasopressin (d(CH₂)₅Tyr(Me)AVP) der Formel

1 2 3456789

CH₂~CO-Tyr(Me)-Phe-Gln-Asn-Cy-Pro-Arg-Gly-NH₂

Diese Verbindung hatte sehr hohe antivasopressorische Wirksamkeit und sehr schwache antidiuretische Aktivität, wie das unmethylierte 2-Tyrosin-Derivat d(CH₂)₅AVP.

Die Verbindungen nach der Erfindung, die Aktivität als Antagonisten der antidiuretischen Aktivität von Arginin-Vasopressin haben, gehören zu der 4-Valin-8-arginin-vaso-

pressin-Reihe und fallen unter die Formel I

1 2 3456789 CH -CO-Tyr (X*) -Phe-Val-Asn-Cy-Pro-Z-Gly-NHj

. S

238409 1

in der Tyr D- oder L- ist und X' und Z sind:

X' Z

Me D-Arg

Et D-Arg

Me L-Arg

Et L-Arg

i-Pr D-Arg

n-Pr D-Arg

i-Pr L-Arg

n-Pr L-Arg

Bu L- oder D-Arg

Verbindungen von Formel II sind wie die vorstehende Formel I, jedoch steht anstelle von Pro in 7-Stellung Δ -Pro.

Die Verbindungen der Formel I sind mit einem bekannten Antagonisten der vasopressorischen Reaktionen auf ADH verwandt, nämlich dem ri-iß-Mercapto-ß/ß-cyclopentamethylenpropionsaure), 4-valin, 8-D-argininJ -vasopressin d(CH₂)₅VDAVP (Lowbridge et al. 1978). Obwohl kein Antagonist der antijdiuretischen Reaktionen auf ADH in vivo, war dieses Analoge ein Konkurrenz-Antagonist der Aktivation der renal-medularen Adenylat-Cyclase durch ADH in vitro (Butlen et al., Mol. Pharmacol., Vol. 14 (1978), S. 1006). Die Arbeit von Larsson et al. (1978), a.a.O., deutet auch die Möglichkeit der Chalky 1-tyrosin-Substitutionen an, um diesen Peptid-Typ in

•. * / Z"4-

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einen Antagonisten der antidiuretischen Reaktion in vivo umzuwandeIn.

Verbindungen der Formel II enthalten eine .Δ -Pro -Einheit, erdacht von Botos et al., a.a.O., um zur hohen antidiuretischen Aktivität bestimmter AVP-Analoga beizutragen.

Wie an intraperitonealer Verabreichung dieser Verbindungen nach der Erfindung an normal-wasserhaltigen, bei Bewußtsein befindlichen Ratten gezeigt, ist (O-Ethyl)-tyrosin-Substitution in 2-Stellung in Verbindungen der Formel I wirksamer als (O-Methyl)-tyrosin-Substitution. Die (O-Propyl)-tyrosin-Verbindungen der Formel I haben auch ausgesprochen starke anti-ADH-Aktivität. Eine 2-(0-Et)-tyrosin-Verbindung der Formel II jedoch ist die wirksamste Anti-ADH-Verbindung, die bis jetzt bewertet worden ist. Die 8-L-Arginin-Analoga sind stärker als die entsprechenden 8-D-Arginin-Analoga.

Es scheint, daß höhere Dosen von dfCH,)rTyr(Et)VAVP meist die antidiuretische Wirkung von endogenem ADH vollständig blockieren. Z.B. erhöht eine Dosis von 30yug/kg d(CH₂)₅Tyr (Et)VAVP den Urinstrom auf einen Mittelwert von 27 ml/kg pro Stunde während der zweiten Stunde nach der Injektion. Spontaner Urinfluß bei weiblichen Ratten mit gleichen Erbanlagen des Brattleboro-Stammes, die normalerweise überhaupt kein ADH ausscheiden, beläuft sich durchschnittlich auf

8409

32 ml/kg pro Stunde (Sawyer et al., Endocrinology, VoI 95 (1974), S. 140).

Die Bedeutung kleiner struktureller Änderungen wird durch den Befund angezeigt, daß die entsprechenden ß,ß-diethyl- und ß,ß-dimethy1-Analoga von d(CH₂)_&Tyr(Et)VAVP keine nachweisbare antagonistische Aktivität im intravenösen antidiuretischen Versuch bei Ratten ausüben. Die Anwesenheit des 4-Valins trägt auch zur antagonistischen Aktivität bei; Substitution einer 4-Glutamin-Einheit in d(CHg)₅Tyr(Et) VAVP resultiert im Verlust der antagonistischen Aktivität.

Verbindungen nach der Erfindung mit GIn in 4-Stellung, welche der vasopressorischen Reaktion von AVP entgegenwirken, sind bei pharmakologischen Studien über die Funktion von AVP im Regulieren des Blutdrucks unter normalen und pathophysiologischen Bedingungen geeignet.Klinische Anwendungen schließen die Verwendung als diagnostische und therapeutische antihypertensive Mittel ein. Für therapeutische Zwecke werden diese Verbindungen in gleicher Weise verwendet werden, wie das bekannte antihypertensive Arzneimittel Captopril (D. B. Case et al., "Progress in Cardiovascular Diseases", Vol. 21 (1978) S. 195).

Die Verbindungen der Formeln I und II sind sehr wirksame Antagonisten der antidiuretischen Reaktion auf ADH. Sie

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können daher bei pharmakologischen Studien über die Mitwirkung von ADH bei einer Vielzahl von pathologischen Zuständen, einschließlich der Wasserzurückhaltung, verwendet werden. Es wird ferner in Betracht gezogen, daß sie wirksame und spezifische Mittel zur Behandlung des Syndroms der unangemessenen Ausscheidung von ADH, das ist das Schwartz-Bartter-Syndrom oder SIADH, sein könnten. Dieses Syndrom kann eine Vielzahl von Krankheiten komplizieren, einschließlich Karzinoma, Lungenkrankheiten, intrakranielle Krankheiten und Kopfverletzungen (Bartter et al.. Am. J. Med., Vol. 42 (1967) S. 790).

Es ist nun gefunden worden, daß einige dfCH»)cVAVP-Derivate mit einer D-Aminosäure, die nicht Tyrosin ist und größer als Anilin ist, in 2-Stellung stärkere Antagonisten der antidiuretischen Wirkung von AVP sind als Verbindungen mit D- oder L-Tyrosin-Ethereinheiten oder einer D-Tyrosin-Einheit in der 2-Stellung von d(CH₂)₅VAVP oder d(CH₂)₅VDAVP.

Die bevorzugten Verbindungen dieser Erfindung sind solche, bei denen der Substituent in 8-Stellung Arg ist oder der Substituent in 2-Stellung D-Phe, D-VaI, D-Leu und D-IIe ist.

Wie durch intravenöse Verabreichung der Verbindungen nach der Erfindung an normal-wasserhaltige (normally-hydrated), bei Bewußtsein befindliche Ratten und an wasserhaltige, mit

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Ethanol betäubte Ratten, zeigen, haben Verbindungen mit D-Phe, D-VaI, D-Leu oder D-Ile-Substituenten in der 2» Stellung hohe pA₂~Werte und die wirksamen Dosen liegen nahe oder unter den niedrigsten bisher bekannten wirksamen Dosen.

Verbindungen mit D-Phe, D-VaI, D-Leu oder D-IIe in 2-Stellung und Arg in 8-Stellung sind auch reine antidiuretische Antagonisten, d.h. diese Verbindungen haben keinen vorübergehenden antidiuretischen Agonismus. Darüber hinaus sind diese Verbindungen in ihrer Aktivität stärker selektiv als bekannte Verbindungen vermöge von hohen Anti-ADH/Antivasopressor-Aktivitätsverhältnissen.

Die Verbindungen nach der Erfindung können im Gemisch mit üblichen Bindemitteln verwendet werden, d.h. mit physiologisch und pharmazeutisch akzeptablen organischen oder anorganischen Trägern, die für die parenterale oder enterale Verabreichung geeignet sind und nicht schädlich auf die aktiven Verbindungen einwirken.

Geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger sind z.B. Wasser, Salzlösungen, Alkohole, pflanzliche öle, PoIyethylenglycole, Gelatin, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat, Talkum, Kieselsäure, viskoses Parafin, Parfümöl, Fettsäure-Monoglyceride und -diglyceride, Pentaerythrit-

1*

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Fettsäureester, Hydroxy-Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon usw.. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert werden und wenn gewünscht mit Hilfsmitteln vermischt werden, z.B. mit Gleitmitteln, Preservativen, Stabilisatoren, Netzmittel, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Drucks, Puffern, färbenden, geschiqackgebenden und/oder aromatischen Substanzen und dergleichen, die mit den aktiven Verbindungen keine schädlichen Reaktionen eingehen.

Für parenterale oder intranasale Verabreichung sind Lösungen, vorzugsweise wäßrige Lösungen, sowie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, einschließlich Supositorien besonders geeignet. Ampullen sind praktische Einheitsdosen.

Die Verbindungen nach der Erfindung werden allgemein an Tiere verabreicht, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, an Säugetiere, z.B. Viehbestand, Haustiere, Menschen, Rindvieh, Katzen und Hunde. Eine diuretisch wirksame Tagesdosis der aktiven Verbindungen kann parenteral in einer einzigen Dosis oder in Teildosen über den Tag verteilt verabreicht werden.

Parenterale oder intranasale Verabreichung wird bevorzugt. Die anti-antidiuretischen Verbindungen dieser Erfindung sind für die Behandlung von Menschen, die an Wasserzurückhaltung irgendeiner Etiology leiden, besonders wertvoll.

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In diesem Fall können sie in im wesentlichen gleicher Weise wie die bekannten Verbindungen Oxytocin und Vase— pressin verabreicht werden, um ihre physiologische Wirkung zu erreichen.

Es ist einleuchtend, daß die jeweils bevorzugten Mengen aktiver Verbindungen, die zu verwenden sind, von der besonderen eingesetzten Verbindung, der besonderen Zusammensetzung des Präparats, der Verabreichungsart und dem besonderen Organismus, der behandelt wird, abhängen. Optimale Applikationsraten unter/in einem gegebenen Satz von Bedingungen kann vom Fachmann durch Anwendung üblicher Dosisbestimmungstests nach den oben genannten Richtlinien ermittelt werden.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen Bevorzugte antidiuretische Antagonisten nach der Erfindung sind [!-(ß-Mercapto-ßjß-cyclopentamethylen-propionsäure), 2-(Ö-ethyl) -tyrosin, -l-valin^-arginin-vasopressin, besonders bevorzugt die 8-L-Arginin-Verbindung. Ebenfalls bevorzugt ist eine entsprechende & -Pro -Verbindung.

Andere bevorzugte Verbindungen sind solche, in denen X D-Phe, D-VaI, D-rLeu oder D-IIe und Z L-Arg sind.Die D-IIe oder D-Phe-Verbindungen sind am meisten bevorzugt.

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Es wird angenommen, daß sich ein Fachmann die Erfindung unter Verwendung der vorstehenden Beschreibung ohne weitere Ausarbeitung in vollem Ausmaß zunutze machen kann. Die folgenden speziellen Ausführungsformen sind daher nur als zur Veranschaulichung dienend und nicht als Beschränkung der übrigen Beschreibung in irgendeiner Weise anzusehen. In den folgenden Beispielen sind die Temperaturangaben in C, unkorrigiert, gemacht. Wenn nicht anders angegeben sind Teile und Prozente auf Gewicht bezogen.

Das chlormethylierte Harz (Bio-Rad Bio-Beads SX-I) wurde nach dem Verfahren von Gisin, HeIv. Chim. Acta., Vol. 56 (1973)/ S. 1476 mit Boc-Gly verestert, bis 0,47 mmol/g und <-*0,64 mmol/g eingearbeitet waren. Aminosäurederivate, einschließlich Boc-Tyr(Me) (Rf (A) 0,7; Rf (B) 0,8) wurden von der Firma Bachern Inc., geliefert oder synthetisiert.

Triethylamin (TEA) und N-Methylmorphclin (NMM) wurden aus Ninhydrin destilliert.

Essigsäure, verwendet als das HCl-Essigsäure-Spaltprodukt, wurde unter Rückfluß mit Bortriacetat erhitzt und vom Reagenz abdestilliert. Dimethylformamid (DMF) wurde unter vermindertem Druck unmittelbar vor der Verwendung destilliert. Methanol wurde mit Magnesium-methoxid getrocknet und destilliert. Die anderen Lösungsmittel und Reagenzien

. - ** - £ ü O H U U . I

waren von analytischem Reinheitsgrad.

Die Dünnschicht-Chromatography (TLC) wurde mit SiO₃-GeI-Platten (0,25 mm, Brinkmann Silplate) unter Benutzung der folgenden Lösungsmittelsysteme durchgeführt: A. Cyclohexan-Chloroform-Essigsäure (2:8:1 v/v); B. Propan-1-ol-Ammoniak (34 %ig) (2:1 v/v); C. Ethanol (95 %ig)-Ammoniak (34 %ig) (3:1 v/v); D. Chloroform-Methanol (7:3 v/v);

E. Butan-1-ol-Essigsäure-Wasser (4:1:5 v/v, obere Phase);

F. Butan-1-ol-Essigsäure-Wasser-Pyridin (15:3:3:10 v/v). Die eingesetzten Mengen waren 10-50 yug. Die kleinste Länge des Chromatogramms war 10 cm. Chloroplatinat-Reagenz und Ioddampf wurden zur Entwicklung der Chromatogramme benutzt.

Die Aminosäureanalyse der Peptide wurde nach der Methode von Spackman et al., (Anal. Chem., Vol. 30 (1958), S. 1190) durchgeführt, bei welcher Peptidproben eines Gewichts von etwa 0,5 mg mit konstant siedender Chlorwasserstoffsäure (400yul) in evakuierten und abgedichteten Ampullen 18 Stunden bei 120° C hydrolysiert wurden. Die Analysen wurden unter Verwendung eines automatischen Aminosäure-Analysators von Beckman, Modell 121, durchgeführt. Die molaren Verhältnisse wurden auf GIy = 1.00 bezogen. Die Elementaranalysen wurden von den Galbraith Laboratories, Inc., Knoxville, Tenn. durchgeführt. Die Analysenergebnisse für die Elemente, angegeben mit den entsprechenden Symbolen, lagen innerhalb

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von - 0,4 % der theoretischen Werte. Optische Drehungen wurden mit einem Polarimeter von Bellingham Stanley, Ltd., Type pl gemessen.

Beispiel 1

ß-(S-Benzylmercapto)-ß,ß-cyclopentamethylen-propionyl-Tyr(Me)-Phe-Gln-Asn-Cys(BzI)-Pro-Arg(Tos)-GIy-NH₂.

(a) Kombination der Bodenkörper- und Lösungs-Methoden (319 mg, 0,26 mmol) Boc-Tyr (Me)-Phe-Gln-Asn~Cys (BzI) -Pro-Arg (Tos)-Gly-NH«, hergestellt nach dem Verfahren von Bankowski et al., J. Med. Chem., Vol. 21 (1976) S. 842, wurden in 6,5 ml TEA gelöst und bei Raumtemperatur 40 Minuten gerührt. Kalter Ether (20 ml) wurden zugefügt, um einen Niederschlag zu erzeugen, der abfiltriert und mit (5 χ 10 ml) Ether gewaschen wurde. Das Produkt wurde im Vakuum über Natriumhydroxid-Plätzchen getrocknet. Dieses Material (318,5 mg) wurde in 0,8 ml DMF, dem 10/Ul N-Methylmorpho1in zugegeben war, gelöst. Die resultierende Lösung hatte einen pH-Wert von 7-8, mit feuchtem pH-Papier bestimmt. Nachdem diese neutralisierte Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt worden war, wurde ihr eine Lösung von p-Nitrophenyl-ß-(S-benzyl-mercapto)-β,β-cyclopentamethylen-propionat (Nestor et al., J. Med. Chem. Vol. 18 (1975) S. 284) (445 mg, 1,155 mmol in 0,4 ml DMF) zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur ge-

rührt. Nach 72 Stunden langem Rühren wurde die TLC-Analyse, System D, durchgeführt, welche zeigte, daß das Reaktionsprodukt noch eine Spur des freien Octapeptid-amids enthielt. N-Hydroxybenzotriazol~Monohydrat (Konig et al., Chem. Ber., Vol. 103 (1970) S. 788}, (39,3 mg, 0,26 mraol) wurden zugefügt. Die Kupplung war innerhalb von 5 Stunden abgeschlossen. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit kaltem Ethylacetat (4 χ 10 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt(33 0 mg) wurde zweimal aus DMF-methanol wieder gefällt, um das Acylpeptid-araid zu erhalten. (295,2 mg, 77,3 %): Smp. 209-211⁰C;£cQ _ß ²⁴ = -43,6° (C 0,5, DMF); R_f(E) 0,45, R_f(F) 0,63 Anal. (C₇₃ H₉₄O₁₄S₃) C, H, N.

Aminosäureanalyse: Tyr 0,80; Phe 1,01; GIu 1,04; Asp 1,02; Cys(Bzl) 0,98; Pro 1,06; Arg 1,01; GIy 1,00; NH₃ 2,91.

(b) Totalsynthese am Harz

Boc-Tyr(Me)-Phe-Gln-Asn-Cys(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Gly-Harz (1,11 g, 0,4 mmol hergestellt aus Boc-Gly-Ha'rz unter Anwendung der Festphasen- oder Bodenkörper-Methode) wurden in das Acyloctapeptid-Harz (1,167 g, Gewichtszunahme 57 mg, 97,6 % der Theorie) in einem Zyklus von Deprotektion, Neutralisation und Kupplung mit p-Nitrophenyl-ß-(S-benzylmercapto)-ßjß-cyclopentamethylenpropionat umgewandelt (siehe Nestor a.a.O.). Das Harz wurde ammonolysiert

- -Sir -

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(Manning, J. Am. Chem. Soc, Vol. 90 (1968), S. 1348). Dann wurde das Produkt mit Dimethylformamid (DMF) extrahiert. Nachdem das Lösungsmittel im Vakuum verdampft war, wurde der Rückstand durch Zugabe von Wasser gefällt. Das Rohprodukt (410 mg) wurde zweimal aus DMF-Ethanol wieder gefällt, um das Acyloctapeptid zu erhalten (302 mg, 50,7 %, bezogen auf den Ausgangs-Glycingehalt des Harzes); Smp. 206-208⁰C (unzersetzt) ; R_f (E) 0,45, R_f (F) 0,63;[O²⁴ =

-43,1° (C 1, DMF). Analyse: (C₇₃H₉₄N₁₄S₃) ^c* ^H* ^N·

Aminosäureanalyse: Tyr 0,79; Phe 1,01; GIu 1,03; Asp 1,04; Cys (BzI) 0,97; Pro 1,03; Arg 0,99; GIy 1,00; NH₃ 2,95.

Beispiel 2

ß-(S-Benzylmercapto)-ß,ß-cyclopentamethylenpropiony1-Tyr (BzI)-Phe-Gln-Asn-Cys(BzI)-Pro-Arg(Tos)-GIy-NH₂. Boc-Tyr(BzI)-Phe-Gln-Asn-Cys(BzI)-Pro-Arg(Tos)Gly-Harz (1,46 g, 0,5 mmol) wurden in das Acyloctapeptid-Harz (1,55 g, Gewichtszunahme 70 mg, 95,9 % der Theorie) wie in Beispiel 1 umgewandelt, und zwar in einem Zyklus aus Deprotektion, Neutralisation und Kupplung mit p-Nitrophenyl-ß-(S-benzylmercapto)-β,β-cyclopentamethylenpropionat. Das Produkt, erhalten durch Ammonolyse des Harzes, wurde mit DMF extrahiert. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand durch Zugabe von

Wasser gefällt. Das Rohprodukt (723 mg) wurde aus DMF-Ethanol und DMF-2%iges wäßriges AcOH wieder gefällt. (488 mgj 62,4 %, bezogen auf den Ausgangs-Giy-Gehalt des Harzes); Srap. 183-185°C; R_f(E) 0_f38j R_f(D) 0,41;

= -32,9° (C 1 DMF). Analyse (C₇₉H₉₈N₁₄O₁₄S₃) C, H,

Aminosäureanalyse: Tyr 0,97; Phe 1,02; GIu 1,05; Asp 1,01; Cys (BZl) 0,98; Pro 1,04; Arg 0,98; GIy 1,00; NH₃.

Beispiel 3

[l-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-(0-methyl)tyrosin]arginin-vasopressin.

(a) Aus Nonapeptid-Amid

Eine Lösung des geschützten Nonapeptid-Amids, hergestellt wie in Beispiel 1 (170 mg, 0,114 mmol) in 400 ml Ammoniak (über Natrium getrocknet und redestilliert) wurde beim Siedepunkt mit Natrium, aus einer Stange des Metalls in einem Glasrohr mit enger Bohrung, gerührt, bis eine hellblaue Farbe 3 0 Sekunden in der Lösung aufrechterhalten blieb., (nach duVigneaud, J. Am. Chem. Soc, Vol. 76 (1959), S. 3115). Trockener Eisessig (0,4 ml) wurde zugegeben um die Farbe zu entfernen (to discharge the color). Die Lösung wurde verdampft. Die Lösung des Rückstandes in wäßriger Essigsäure (0,2 %ig; 800 ml) wurde mit einer 2M Ammonium-

- -se· -

238409 J

hydroxid-Lösung behandelt, um eine Lösung eines pH-Wertes von 7,5 zu erhalten. Dieser Lösung wurde unter Rühren allmählich eine Lösung von Kaliumferricyanid (0,01M, 11,4 ml) im Überschuß zugegeben (Hope et al., J. Biol. Chem., Vol. 237 (1962) S. 1563). Die gelbe Lösung wurde 90 Minuten und dann 1 Stunde mit einem Anionenaustauscherharζ (BioRad AG-3, Cl form, 10 g Naßgewicht) gerührt. Die Suspension wurde langsam durch ein Harzbett (80 g Naßgewicht) filtriert. Das Harzbett wurde mit 3 00 ml 0,2 %iger wäßriger Essigsäure gewaschen und Filtrat und Waschwasser wurden nach der Vereinigung lyophylisiert. Das resultierende Pulver (1386 mg) wurde an einer Sephadex G-15 Säule (110 χ 2,7 cm) entsalzt und mit wäßriger Essigsäure (50 %ig) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 ml/h eluiert nach der Technik von Manning et al., J. Chromatog., Vol. 38 (1968) S. 3 96. Das Eluat wurde fraktioniert und auf die Absorbanz von 280 nm überwacht. Die Fraktionen, die den Hauptpeak einschließen, wurden gesammelt und lyophylisiert. Der Rückstand (55,5 mg) wurde weiter der Gelfiltration an einer Sephadex G-15 Kolonne (100 χ 1,5 cm) unterworfen und mit wäßriger Essigsäure (0,2 M) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 2,5 ml/h eluiert. Das Peptid wurde in einem einzigen Peak eluiert (Absorbanz oder Extinktion 280 nm). Die Lyophilisierung der einschlägigen Fraktionen lieferten das Vasopressin-Analoge (4 9 mg, 37,3 %) R_f(E) 0,19; R_f (F) 0,3 0;£«J_D ²²-59,6 (cO,19, IM AcOH) .

Xl

- 34· -

238409 7

Aminosäureanalyse: Tyr 0,81; Phe 1,01; GIu 1,04; Asp 0,98; Pro 1,04; Arg 0,95; GIy 1,00; NH₃ 3,10.

Die Analyse nach Perameisensaureoxidation vor der Hydrolyse (nach Moore, J. Biol. Chem., Vol. 238 (1963)

S. 235) ergab ein Verhältnis von CyS(O₃H)-GIy von 1,03:1,00.

(b) Aus Acyloctapeptid

Die Behandlung des Acyloctapeptids (160 mg, 0,107 ramol) , wie in Beispiel 3 (a) beschrieben, ergab das Analoge (64 mg, 51,7 %), das von dem vorstehend beschriebenen Präparat TLC nicht unterscheidbar war: [VJ _β-59,1 (C 0,5, IM AcOH).

Aminosäureanalyse: Tyr 0,80; Phe 1,02; GIu 1,02; Asp 0,98; Pro 1,03; Arg 0,96; GIy 1,00; NH₃ 3,05. Die Analyse nach Perameisensaureoxidation vor der Hydrolyse ergab ein Verhältnis von CyS-(O₃H)-GIy von 1,02:1,00.

Beispiel 4

fl-fß-Mercapto-ß^-cyclopentamethylenpropionsäure)] argininvasopressin

Die Behandlung des Acyloctapeptids (173 mg, 0,111 mmol), wie in Beispiel 3 (a) beschrieben, ergab das Analoge (66 mg, 52,5 %) R_f(E) 0,19; R_f(F) 0,43.[*]_D ²³-58,7° (C 0,5, IM AcOH)

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Die Aminosäureanalyse ergab: Tyr 0,96; Phe 0,98; GIu 1,01; Asp 1,01; Pro 1,05; GIy 1,00; NH₃ 2,95. Pie Analyse nach Perameisensäureoxidation vor der Hydrolyse ergab ein Verhältnis von CyS(O₃H)-GIy von 1,01:1,00.

Beispiel 5

[l-iß-Mercapto-ß/ß-cyclopentamethylenpropionsaure), 2-(O-alkyl)tyrosin, 4-valinJ -(L- und D-)-arginin-vasopressin.

Verbindungen dieser Reihe wurden durch die Festphasensynthese, modifiziert wie von Manning et al., (J. Med. Chem., Vol. (1973) S. 975) und Kruszynski et al., (J. Med. Chem., Vol. 23 (1980), S. 364) beschrieben,hergestellt, um geschützte Zwischenprodukte für jedes Analoge zu erhalten. Die Verfahren von Bodanszky et al., (J. Am. Chem. Soc, Vol. 81 (1959) S. 5688 und J. Org. Chem., Vol. 39 (1974), S. 444), bei denen ein p-Nitrophenylester verwendet wird, erleichtert durch die Verwendung von Hydroxybenzotriazol (Konig et al., a.a.O.)/wurden für die Kupplung von ßr(S-benzylmercapto-ßfß-cyclopentamethylenpropionsaure) angewendet, gemäß Nestor, a.a.O., um die Ausgangsverbindungen zu erhalten. Jede Ausgangsverbindung wurde mit Natrium in flüssigem Ammoniak entblockiert (duVigneaud, a.a.O.). Die resultierenden Disulfhydryl-Verbindungen wurden mit Kaliumferricyanid oxidativ zyklisiert (Hope et al., a.a.O.). Die Analoga wurden entsalzt und durch Gelfiltration an Sephadex G-15 gereinigt, und zwar in zwei Stufen unter Verwendung

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von 50 %iger Essigsäure und 0,2M Essigsäure als Eluanten. Die Reinheit und die Identität jedes Analogs wurde durch Dünnschichtchromatographie in drei verschiedenen Lösungssystemen (Kruszynski et al._f J₈ Med. Chem„,Vol. 23 (1980), S. 364) und durch Aminosäurearialyse, wie oben, sichergestellt.

Boc-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro-D-Arg(Tos)-Gly-Harz Boc-Gly-Harz (1,562 g, 1,0 mmol von GIy) wurden sechs Zyklen der Entblockierung, Neutralisation und Kupplung unterworfen, um das geschützte Heptapeptidyl-Harz A zu erhalten (2,522 g, 1,0 mmol).

Boc-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Gly-Harz

Das geschützte Heptapeptidyl-Harz· B (2,522 g, 1,0 mmol) wurde aus 1,562 g (1,0 mmol) des Boc-Gly-Harzes unter Verwendung der Feststoffphasenmethode hergestellt.

Boc-Tyr(Me)-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro-D-Arg(Tos)-Gly-Harz

In einem Zyklus der Festphasen-Peptid-Synthese mit Boc-Tyr (Me) als der Carboxy-Komponente wurde Heptapeptidyl-Harz -A (1,261 g, 0,5 mmol) in das entsprechende tert.-Butyloxycarbonyloctapeptidyl-Harz· C umgewandelt (1,35 g, 0,5 mmo1).

238409 J

Boc-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro~D-Arg(Tos)-Gly-Harz

Das Heptapeptidyl-Harz A (1,261 g, 0,5 nunol) ergab das tert.-Butyloxycarbonyloctapeptidyl-Harz D (1,357 g, 0,5 nunol) in einem Zyklus der Festphasen-Peptidsynthse mit Boc-Tyr (Et) als Carboxy-Komponente.

Boc-Tyr(Me)-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Gly-Harz

Das Heptapeptidyl-Harz -B (1,261 g, 0,5 mmol) wurde in das geschützte Octapeptidyl-Harz E (1,35 g, 0,5 mmol) in einem Zyklus der Deprotektion, Neutralisation und Kupplung mit Boc-Tyr(Me) umgewandelt.

ß-(S-Benzylmercapto)-ßjß-cyclopentamethylenpropionyl-Tyr (Et)-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro-Arg(Tos)-Gly-Harz

Das Heptapeptidyl-Harz B (1,261 g, 0,5 mmol) wurde in das Acyloctapeptid-Harz (1,43 g, 0,5 mmol) in zwei Zyklen der Festphasen-Peptidsynthese umgewandelt, und zwar unter Be-* nutzung der Carboxy-Komponenten: Boc-Tyr(Et) und p-Nitrophenyl-ß-(S-benzylmercapto)-β,β-cyclopentamethylenpropionat.

Boc-Tyr(Me)-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro-D-Arg(Tos)-GIy-NH₂ Das geschützte Octapeptid-Harz -C (1,35 g, 0,5 mmol) wurde ammonolysiert und das Produkt mit warmem DMF extrahiert. Das Produkt wurde durch Zugabe von Wasser gefällt. Das Rohprodukt wurde aus DMF-Ethanol-Ethylether wieder gefällt,

• · ·/38·

238409 7

um das reine Produkt als weißes Pulver zu erhalten (0,581 g, 88,52 %, bezogen auf den Ausgangs-Gly-Gehalt des Harzes), Smp. 239-24 0⁰C;M_D ²⁴ = -14,9° (C = 1, DMF); R_f(E) 0,54, R_f(D) 0,73; Anal. (C₆₃H₈₅N₁₃O₁₄S₂) C, H, N.

Aminosaureahalyse: Tyr 1,02; Phe 0,98; VaI 1,02; Asp 1,00; Cys(BzI) 0,98; Pro 1,01; Arg 0,97; GIy 1,00; NH₃ 2,1.

Boc-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro-D-Arg(Tos)-₂ Die Behandlung des geschützten Octapeptid-Harzes D (1,357 g, 0,5 mmol) wie oben ergab das Boc-octapeptidamid (0,535 g, 80,69 % bezogen auf den Ausgangs-Gly-Gehalt des Harzes) Smp. 211-213° C;W_D ²⁴ = -16,4° (C =1, DMF); R_f(E) 0,61; R_f(D) 0,83; Anal. (C₆₄H₈₇N₁₃O₁₄S₂) C, H, N.

Aminosäureanalyse: Tyr 0,99; Phe 1,00; VaI 1,01; Asp 1,02; Cys(Bzl) 0,98; Pro 1,00; Arg 0,98; GIy 1,00; NH₃ 2,13.

Boc-Tyr(Me)-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro-Arg(Tos)-GIy-NH₂ Die Behandlung des geschützten Octapeptid-Harzes E (1,35 g, 0,5 mmol) v/ie oben ergab das entsprechende Boc-octapeptidamid (0,597 g, 90,96 %, bezogen auf Ausgangs-Gly-Gehalt des Harzes) . Smp. 216-217° C unzersetzt;£<*l _p ²⁴ » -34,82° (C = 1, DMF); R_f(E) 0,54; R_f(D) 0,73; Anal. (^c ₆3^H ₈₅ ^N ₁3°i4^S2⁾ C, H, N.

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Aminosäureanalyse: Tyr 0,99; Phe 1/00; VaI 1,02; Asp 1,01; Cys(BzI) 0,98; Pro 1,01; Arg 0,98; GIy 1,00; NH₃ 2,09.

ß-tS-Benzylmercapto-ß^-cyclopentamethylenpropionyl-Tyr(Et)-Phe-Val-Asn-Cys (BzI) -Pro-Arg.(Tos) -GIy-NH₂ Das geschützte Acyloctapeptid-Harz (1,43 g, 0,5 mmol) wurde ammonolysiert und das Produkt mit warmem DMF extrahiert. Das Produkt wurde durch Zugabe von Wasser gefällt. Das Rohprodukt wurde mit DMF-Ethanol-Ethylether wieder gefällt, um das reine Produkt zu erhalten. (0,490 g, 66,54 %, bezogen auf Ausgangs-Gly-Gehalt des Harzes) . Smp. 211-213° ΰ;Ε°Ο _D = -39,8° (C = 1, DMF); R_f(E) 0,59, R_f(D) 0,75; Anal. (C₇₄H₉₇N₁₃O₁₃S₃) C, H, N.

Aminosäureanalyse: Tyr 0,99; Phe 1,01; VaI 1,01; Asp 1,01; Cys(Bzl) 0,99; Pro 1,02; Arg 0,98; GIy 1,00; NH₃ 2,07.

ß-(S-Benzylmercapto)-β,β-cyclopentamethylenpropionyl-Tyr(Me)-Phe-Va1-Asn-Cys(BzI)-Pro-D-Arg(Tos)GIy-NH₂ Das wie oben beschrieben hergestellte tert-Butyloxycarbonylbctapeptid-amid (0,270 g, 0,206 mmol) wurde in TFA (3 ml) gelöst und 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Dann wurde kalter Ether zugegeben. Das ausgefällte Material wurde filtriert und mit Ether gewaschen (5 χ 10 ml). Das Produkt wurde in Vakuum über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Dieses Material (250 mg) wurde in DMF (0,8 ml)

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gelöst und der Lösung N-Methylmorpholin zugefügt, um eine Lösung eines pH-Wertes von 7 bis 8 zu erhalten (mit feuchtem pH-Papier bestimmt). Die neutralisierte Lösung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.Eine Lösung von p-Nitrophenyl-ß-iS-benzylmercapto-ßfß-cyclopentamethylenpropionat (0,135 g, 0,37 mmol) und N-Hydroxybenzotriazol-Monohydrat (57 mg, 0,37 mmol) in DMF (1,0 ml) wurden zugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und die Dünnschichtchromatographie (System E) zeigte, daß die Reaktion vollständig war. Methanol (80 ml) und Ether (20 ml) wurden unter lebhaftem Mischen zugefügt. Das gefällte Material wurde filtriert, mit einem Gemisch von Methanol und Ether (8:2) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt (270 mg) wurde aus DMF-Methanol wieder gefällt, um das Acylpeptid-Amid zu erhalten (263 mg, 75,2 %) ; Smp. 220-221° C;M _β ²⁴ = -25,7° (C = 1, DMF); R_f(E) 0,55; R_f(D) 0,83; Anal. (C₇₃H₉₅N₁₃O₁₃S₃) ^c* ^H# ^N·

Aminosäurenanalyse: Tyr 0,98; Phe 1,01; VaI 1.02; Asp 1,02; Cys(Bzl) 0,97; Pro 1,03; Arg 1,0, GIy 1,00; NH₃ 2,06.

ß-(S-Benzylmercapto-ß^-cyclopentamethylenpropxony1-Tyr(Et)-Phe-VaI-Asη-Cys(BzI)-Pro-D-Arg(Tos)-GIy-NH₂ Das tert.-Butyloxycarbonyloctapeptid-amid (0,398 g, 0,3 mmol) wurde entblockiert und mit p-nitrophenyl-ß-(S-benzylmercapto)-ß,ß-cyclopentamethylenpropionat (0,232 g, 0,6 mmol),

• · · /41*

Λ- 238403

wie oben beschrieben gekuppelt, um das Acylcctapeptid-Amid zu erhalten (0,361 g, 81,67 %), Smp. 222-224° C; C*] _D ²⁰ « -22,8° (C = 0,5 DMF); R_f(E) 0,5, R_f(D) 0,83; Anal. (C₇₄H₉₇N₁₃O₁₃S₃) C, H, N.

Aminosäureanalyse: Tyr 1,0; Phe 1,02; VaI 1,03; Asp 1,02; Cys(Bzl) 0,98; Pro 1,03; Arg 0,99, GIy 1,00; NH₃ 2,11.

ß-(S-Benzylmercapto)-ß,ß-cyclopentamethylenpropionyl-Tyr(Me)-Phe-Val-Asn-Cys(BzI)-Pro-Arg(Tos)-GIy-NH₃

Tert.-Butyloxycarbonyloctapeptid-amid (0,394 g, 0,3 mmol) V7urde entblockiert und mit p-Nitrophenyl-ß-(S-benzylmercapto)-ß,ß-cyclopentamethylenpropionat (0,232 g, 0,6 mmol) wie oben beschrieben gekuppelt, um das Acyloctapeptid-ämid zu erhalten (0,388 g, 88,65 %, Smp. 211-214° C-C⁰Op²¹ = -39,2° (C =1, DMF); R_f(E) 0,47; R_f(D) 0,85; Anal. (C₇₃H₉₅N₁₃O₁₃S₃) C, H, N.

Aminosäureanalyse: Tyr 0,99; Phe 1,02; VaI 1,03; Asp 1,01; (Cys(BzI) 0,99; Pro 1,02; Arg 0,99; GIy 1,00; NH₃ 2,04.

kl-iß-Mercapto-ß-ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-(O-ethy1)tyrosin, 4-valin}-arginin-vasopressin

Eine Lösung des geschützten Acylocta-peptid-amids (140 mg, 0,095 mmol) in 400 ml Ammoniak (getrocknet und über Natrium redestilliert) wurde gerührt und beim Siedepunkt mit Natrium

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aus einem Stab des Metalls, der in einem Glasrohr mit enger Bohrung enthalten war, behandelt, bis eine hellblaue Farbe in der Lösung 3 0 Sekunden bestehen blieb. Trockner Eisessig (0,4 ml) wurde zugefügt, um die Farbe zum Verschwinden zu bringen. Die Lösung wurde verdampft, während Stickstoff durch das Reaktionsgefäß geleitet wurde. Nach 5 Minuten wurde der Rückstand in wäßriger Essigsäure (10 %ig, 50 ml) gelöst und der Lösung 800 ml Wasser zugegeben. Die Lösung wurde mit 2M Ammoniumhydroxydlösung behandelt, so daß sie einen pH-Wert von 6,5 hatte. Ein Überschuß einer Lösung von Kalxumferricyanid (0,01 M, 16 ml), wurde allmählich unter Rühren zugegeben. Die gelbe Lösung wurde 10 Minuten weitergerührt und 10 Minuten mit einem Anionenaustauscherharz (Bio-Rad AG-3, Cl" form, 10 g Feuchtgewicht). Die Suspension wurde langsam durch ein Bett des Harzes (50 g Naßgewicht) filtriert. Nach dem Waschen des Harzbettes mit wäßriger Essigsäure (0,2 %ig, 200 ml) wurden Waschwässer und Filtrat nach Vereinigung lyophylisiert. Das resultierende Pulver (1|63 g) wurde an einer Sephadex G-15 Säule (110 χ 2,7 cm) durch EIuieren mit wäßriger Essigsäure (50 %) und einer Strömungsgeschwindigkeit von 5 mi/h entsalzt. Das Eluat wurde fraktioniert und auf Absorbanz 280 nm überwacht. Die Fraktionen, die den Hauptpeak enthielten, wurden gesammelt und lyophylisiert. Der Rückstand (28 mg) wurde der Gelfiltration an einer Sephadex G-15 Säule (100 χ 1,5 cm)

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unterworfen. Das Produkt wurde mit wäßriger Essigsäure (0/2 M) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 ml/h, eluiert. Das Peptid wurde bei einem einzigen Peak (Absorbanz 280,nm) eluiert. Die Lyophylisation der einschlägigen Fraktionen ergab das Vasopressin-Analoge (24 mg, 20,6 %) . TLC R_f(E) 0,31, R_f(F) 0,62;£*J_D = -65,1° (C = 0,2, IM AcOH).

Aminosäureanalyse: Tyr 1,00; Phe 1,01; VaI 1,01; Asp 1,01; Pro 1,01; Arg 1,00; GIy 1,00; NH₃ 1,97. Die Analyse nach Perameisensäureoxidation vor der Hydrolyse ergab ein Cys (O₃H)-Gly-Verhältnis von 1,01:1,00.

[!-(ß-Mercapto-ß^-cyclopentamethylenpropionsäure J, 2-(O-methyl) tyrosin, 4-valin, 8-D-arginin])-vasopressin Das Peptid-Zwischenprodukt (168 mg, 0,115 mmol) wurde mit Natrium in flüssigem Ammoniak reduziert, wieder oxidiert, deionisiert und wie oben beschrieben gereinigt, um 49, 5 mg des Produkts zu erhalten (35,5 %). R_f (E) 0,30; R_f(F) 0,61,-[Qt]₀ ²³ = -46,4° (C = 0,4, IM AcOH).

Aminosäureanalyse: Tyr 0,98; Phe 1,01; VaI 0,98; Asp 0,99; Pro 1,03; Arg 0,98; GIy 1,00; NH₃ 12,1. Die Analyse nach Perameisensäureoxidation vor der Hydrolyse ergab ein Verhältnis von CyS(O₃H)-GIy von 1,03:1,00.

[l-(ß~Mercapto-ß,ß-eyclopentamethylenpropionsaure), 2-(O-ethyl)tyrosin, 4-valin, 8-D-argininJ~vasopressin

Die Ausbeute an Analog von 167 mg (0,113 mmol) des Zwischenprodukts war 29 mg (20,9 %). R_f(E) 0,29* R_f(F) 0,57;/>3_D ²³ = -41.1° (C= 0,3, IM AcOH).

Aminosäureanalyse: Tyr 0,98; Phe 1,01; VaI 1,03; Asp 0,99; Pro 1,03; Arg 1,02; GIy 1,00; NH₃ 1,98. Die Analyse nach Peressigsäureoxidation vor Hydrolyse ergab ein Verhältnis von Cys (O₃H)-GIy von 1,01:1,00.

-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsaure), 2-(O-methyl)tyrosin, 4-valinJ-arginin-vasopressin.

Die Behandlung des Acyloctapeptids (174 mg, 0,119 mmol) wie oben ergab 51,5 mg des Produkts (35,6 %). R_f(E) 0,28, R_f(F) 0,60,-JPtJ₀ ²³ = -66,3° (C = 0,4, IM AcOH).

Aminosäureanalyse: Tyr 0,99; Phe 1,01; VaI 1,02; Asp 1,01; Pro 1,00; Arg 1,01; GIy 1,00; NH₃ 2,11. Die Analyse nach Perameisensäureoxidation vor der Hydrolyse ergab ein Verhältnis von CyS(O₃H)-GIy von 1,03:1,00.

238409

Beispiel 6

pL-tß-Mercapto-ß^-cyclopentamethylenpropionsäure) , 2-(O-ethyl) tyrosin, 4-valin, 7-(3 ,4-dehydroprolin^l arginin-vasopressin

Die Verbindung wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, unter Verwendung von Δ -Prolin anstelle von Prolin hergestellt.

Beispiel 7

-(ß-Mercapto-ßfß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-substituiert, 4-valin, 7-prolinJ τ(L- und D-)-arginin-vasopressin

Verbindungen dieser Reihe wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben, hergestellt. Die Reinheit wurde durch Dünnschichtchromatographie an Silica-Gel in zwei Lösüngsmittelsystemen bestimmt: E. Butanol/Essigsäure/Wasser (BAW) (4:1:5) oder F. Butanol/Essigsäure/Wasser/Pyridin

(15:3:3:10). Die Ergebnisse waren:

X	Z	RfE	RfF
D-Tyr	L-Arg	FTT7	0,50
D-Phe	L-Arg	0,17	0,52
GIy	L-Arg	0,15	0,48
D-AIa	L-Arg	0,16	0,49
D-VaI	L-Arg	0,17	0,49
D-Leu	L-Arg	0,17	0,53
D-IIe	L-Arg	0,17	0,51
D-Arg	L-Arg	0,08	0,30
D-Phe	Dr-Arg	0,16	0,51

35 £ y

9

Beispiel 8

Der Antagonismus auf die vasopressorische Reaktion wurde in Übereinstimmung mit Dyckes et al., J. Med. Chem., Vol. 17 (1974) S, 969 bewertet. Die Werte sind als pA₂~ Werte ausgedrückt, definiert durch Schild et al., Br. J. Pharmacol., Vol. 2 (194 7) S. 189.

Die Aktivität als äntidiuretische Agonisten wurde durch intravenöse Injektion von den zu bewertenden Verbindungen in mit Ethanol anesthisierten, mit Wasser gespeisten Ratten bestimmt-, (in Übereinstimmung mit Sawyer et al., Endocrinology, Vol. 63 (19^8), S. 694).

Die antagonistischen Wirksamkeiten wurden bestimmt und ausgedrückt in "effektive Dosen" und pA^-Werten.Die "effektive Dosis" ist definiert als die Dosis ( in Nanomole pro kg), die die Reaktion, die bei 2x Einheiten des Agonisten, 20 Minuten nach der Gabe des Antagonisten injiziert, festgestellt wird, auf die Reaktion mit Ix Einheiten des Agonisten reduziert. Geschätzte in vivo- "pA₂"-Werte stellen die negativen Logarithmen der effektiven Dosen, dividiert durch das geschätzte Volumen der Verteilung (67 mL/kg)-dar. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.

.../Th

123456.78 9 Tabelle I: CHj-CO-X¹-Phe-Y-Asn-Cy-Pro-Z-Gly-NHj

R-C-R

i

Peptid

dAVP

dPÄVP

d (CHj)₅AVP

dVDAVP

dPVDAVP

d(CHjJ₅VDAVP dTyr(Me)AVP

dPTyr(Me)AVP

d (CH₂)₅Tyr(Me)AVP

(H)₂(CH₃) j (CHj)₅ (H)₂ (CH₃) ₂ (CHj)₅

^H2 (CH₃)j

(CHj)₅

X*

Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr

antivasopressorischer Wert

Gin Arg Agonist

Gin Arg 7.4 5 ± 0.11

Gin Arg 8.35 f 0.'99

VaI D-Arg 7.03 ± 0.11

VaI D-Arg 7.82 ± 0.05

VaI D-Arg 7.6 8 ± 0.05

Tyr(Me) Gin Arg Agonist Tyr(Me) Gin Arg 7.96 ± 0.05 Tyr(Me) Gin Arg 8.6 2 ± 0.03

antidiuretischer Vfert

XJ/mg ·.

1745 ±

42 +

0.033± 0.005 1230 ± 123 ± 0.10 ± 0.02 830 ± 3.5 ± 0.31 ± 0.07

3B4OS /

Die in Tabelle I zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß die Verbindungen nach der Erfindung, insbesondere £l-(ß-Mercapto-ßiß-cyclopentamethylenpropionsäure) , 8-arginin]]-vasopressin und [l-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-(O-methy1)tyrosin, 8-argininj-vasopressin die vasopressorische Reaktion auf Arginin-Vasopressin antagonisieren und auch eine deutliche Herabsetzung in der antidiuretischen Aktivität besitzen.

Beispiel 9

Jl-(ß-Mercapto-ß,ß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2- (O-alkyl) tyrosin, 4-valin, 8-(L- und D-) argininjvasopressin-Verbindungen, bewertet, wie in Beispiel 8, waren schwache antidiuretische Agonisten. Sie verursachten anfänglich eine submaximale Inhibierung des Urinflusses, die etwa 10 Minuten dauerte, woran sich eine Periode der Inhibierung der Reaktionen auf ADH anschloß, die 1 bis 3 Stunden dauerte, abhängig von der Dosis. Diese Inhibierung war reversibel, d.h. könnte durch Erhöhung der Dosis von ADH überwunden werden. Wiederholte Versuche gestatteten die Abschätzung der "effektiven Dosis" jedes Analogons, wobei die wirksame Dosis definiert ist als die Dosis, die die antidiuretische Reaktion auf 2x Einheiten ADH,injiziert 20 Minuten nach der Dosis des Antagonisten, auf die Reaktion auf Ix Einheiten, injiziert vor dem Antagonisten, herabsetzt. Die geschätzten wirksamen Dosen für die Analoga (in nmole/kg)

Hh

3840S

und antivasopressorische Aktivität sind in Tabelle II zus airanenge s te 111.

Während \1- (ß-Mercapto-ßyß-cyclopentainethy lenpropionsäure) , 2-(O-alkyl)tyrosin, 4-valin, 8-(L- und D-)arginin]-vasopressin-Verbindungen schwache antidiuretische Agonisten waren, die anfangs submaximale Inhibierung der Urinausscheidung für etwa 10 Minuten verursachten, gefolgt von einer Periode der Inhibierung der Reaktionen auf ADK, die etwa 1 bis 3 Stunden dauerte, hatten die bevorzugten Verbindungen nach der Erfindung, die in der folgenden Tabelle mit einem Stern versehen sind, keine antidiuretische agonistische Aktivität.

Tabelle II Anti-Antidiuretischer V7ert

Ahtlvasopressorischer Wert

	Verbinduna	ED	PA2 .	(4)	ED	PA2
	(CH2) 5 D-Tyr VAVP	nnole /Kg		(8)	r.mole /Kg
d	(CH2) D-Phe VAVP .	2.2 ±0.2	7.51±0.08		0.29Ϊ0.09	8.41+0.11(4)
d	(CH2)5[GIy2]VAVP	0.67+0.13*	8.07Ϊ0.09		0.58+0.04	8.06±0.03(4);
d	(CH2)5(D-AIa2]VAVP	Agonist	-	(4)	Agonist
d	(CH2)5[D-VaI2]VAVP	Agonist	-	(4)	177 ±31	5.79+0.08(4)
d	(CH2J5[D-LeU2JVAVP	2.3 +0.3 *	7.48+0.06	(4)	27 ±3	6.41+0.05(4)
d	(CH2J5 [D-IIe2] VAVP	1.2 ±0.3 *	7.7910.12		26 +5	6.45+0.09(4)
d	(CH2)5[D-Arg2]VAVP	0.70±0.0 *	7.98+0.05	(9)	8.2 ±1.4	6.94*0.08(5)
d	(CH2)5 D-Phe VDAVP	>90	<5.9	(4)	~ 260	/v 5.4
d	(CH2)5Tyr(Me)VDAVP	6.9 ±1.3	7.07+0.IQ	(4)	0.73	7.98 + 0.07(^
d	(CH0) cTyr (Et) VDAVP	15 ±3	6.68+0.11	0.23+0.05	8.44+0.07 (8)
d	5.7 ±0.5	7.10+0.08	0. 3-1 + 0.04	8.31 + 0.05 (8)

Verbindung

d(CH₂)₅Tyr(i-Pr)VDAVP

d(CH₂)₅Tyr(n-Pr)VDAVP d(CH₂)₅Tyr(Me)VAVP d (CH₂) ₅Tyr (Et)VAVP d(CH₂)₅Tyr{i-Pr)VAVP d(CH₂)₅Tyr(n-Pr)VAVP d(CH₂)₅-D-Tyr(Me)VAVP d(CK₂)₅-D-Tyr(Et)VAVP

d(CH,)--Tyr(Et)-V-

3 7

£*-Pro -AVP

Tabelle II (Fortsetzung)

Anti-antidiuretischer Wart

ED

pA.

8.5+0.07 6.88+0.07(4)

14+2 6.67+0.05(4)

3.1+0.4 7.35+0.06(4)

1.9 + 0.2 7.57 + 0.06 (4)

3.6+0.9 7.32+0.06 (6)

3.5+0.06 7.29+0.07(4)

1.2+0.3 7.77±0.07(6)

1.1+0.2 7.81±0.07(5)

1.5+0.3 Antivasopressorischer Vfert ED - pA₂

0.28+0.07 8.4.1+0.08 (8) 7.86+0.10 (8) 8.32+0.08 (4) 8.16 + 0.09 (4) 8.36 + 0.09 (4)

1.1+0.2

0.29+0.06

0.49+0.11

0.31+0.06

0.40+0.04

0.23±0.04

0.45-0.11

8.22 + 0.04 (4) 8.48±0.08(4) 8.22+O.12(4)

Die bevorzugten Verbindungen nach der Erfindung sind auch selektiver als die bekannten antidiuretischen Antagonisten mit Bezug auf antivasopressorische Stärke, wie durch die Verhältnisse von antivasopressorischer wirksamer Dosis zu anti-antidiuretischer wirksamer Dosis gezeigt.

Verbindungen

, Antivasopressorisch Anti-antidiuretisch

d(CH₂)₅ D-Tyr(Et) VAVP d(CH₂)₅ D-Phe VAVP d(CH₂)₅[p-Val²]VAVP d (CH₂) ₅ [D-LeU²J VAVP d (CH₂) [D-IIe²JVAVP

0,41

0,87

22

12

Beispiel 10

(a) Der Antagonismus von £l-(ß-Mercapto-ßjß-cyclopentamethylenpropionsäure), 2-(O-alkyl)tyrosin, 4-valin]-(L- und D-)-arginin-vasopressin-Verbindungen zu endogenem ADH wurde an der intraperitonealen Injizierung in unbetäubte Ratten ge ze igt. Der Urin· ,wurde 4 Stunden nach den Injektionen gesammelt.

Die Vferte in der folgenden Tabelle sind die Mittelwerte - SE der Ergebnisse, die an Gruppen von 4-6 Ratten erhalten wurden.*P<0,05 und **P4!0,005 sind für die Unterschiede zwischen dem Mittelwert, erhalten bei Ratten, die die Antagonisten erhalten haben, und den Mittelwerten, erhalten an Ratten, denen nur das Lösungsmittel injiziert wurde, gegeben. Die mittlere Kontroll-Urinvolumenrate für lösungsmittelinjizierte Ratten war 0,9 - 0,1 ml/kg/h und

384 O 9

die mittlere Osmolalität war 1544 ~ 85 mOsra/kg H₃O (n=32).

	Dosis ug/kg	Urinvolutren ml/kg per hr	Osmolalität raOsm/kg EJO
d (Ch2) 5Tyr (Ms)-	100	1,5 ± 0,3	1341 - 428
VDAVP	300	2,2 ± 0,4*	961 ± 204**
d (CH2) 5Tyr (Et)- VDAVP	30 100	2,8 ± 0,3** 9,5 ± 1,8**	. 640 ± 47* * 234 ± 25 * *
d (CH2) 5Tyr(Me)-	10	1,1 ± 0,5	1303^ 190
VAVP	30	3,4 ± 0,9*	514 ± 105* 4
d (CH2) 5Tyr (Et)-	10	7,4 ± 1,0**	316 i 38* 4
VAVP	30	13,3 ±2,5**	194 I 17*

(b) Die Reaktionen von intakten weiblichen Ratten eines Gewichtes von 200 bis 24 0 g auf xntraperitoneale Injektionen von d(CH₂)-Tyr(Et)VAVP wurde in einem Block-Design-Experiment bestimmt, in welchem jede Ratte Lösungsmittel und beide Dosen des ADH-Antagonisten erhielten. Die Injektionen wurden im Abstand von 2 Tagen gegeben. Die Ratten erhielten Wasser ad lib. . Die Injektionen wurden um 11 Uhr vormittags gegeben, wonach spontan ausgeschiedener Urin 4 Stunden lang . stündlich gesammelt wurde.

238409 I

In Fig. 1 ist die Osmolalitat des Urins als eine Funktion der Zeit wiedergegeben. Die Urin-Osmolalitäten der Kontrollversuche (Lösungsmittel-Injektionen) wurden wegen der Seltenheit der Urinausscheidung über Perioden von 2 Stunden gemittelt.

In Fig. 2 ist die Urinausscheidung als Funktion der Zeit gezeigt.

In beiden Figuren zeigen die vertikalen Linien durch die Punkte SE's an.

Beispiel 11

Es wurden Verbindungen, bei denen Tyrosin in der 2-Stellung von der D-Form (is of the D-series) und unverethert (X' ist H) ist, wie in den Beispielen 1 bis 5 hergestellt. Die Verbindung, in der Z L-Arg ist, ist als Antagonist der antidiuretischen Aktivität von Arginin-Vasopressin sehr aktiv.

Die vorstehenden Beispiele können mit ähnlichem Erfolg wiederholt werden, wenn man die in den Beispielen benutzten durch die allgemein oder speziell beschriebenen Reaktanten und/oder Arbeitsbedingungen dieser Erfindung ersetzt.

Aus der vorstehenden Beschreibung entnimmt der Fachmann die wesentlichen Merkmale dieser Erfindung kann zahlreiche Ände-

.../S5

rungen und Modifikationen zur Anpassung an die verschiedenen Anwendungszwecke und Bedingungen daran vornehmen, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Claims (18)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I

   1 234 56789 CHg-CO-X-Phe-Val-Asn-Cy-W-Z-Gly-NHg

   (OHl)₁

   in der bedeuten« X Tyr-X¹, D-Phe, D-VaI, D-Leu, D-IIe, D-Arg, D-Norvalin, D-Norleuoin, D-Cyclohexylalanin, D-oC-Aminobuttersäure, D-Threonin oder D-Methionin; Tyr D- oder L-1 W Pro oder ^ '-Proj Z D- oder L-Arg und, wenn X Tyr-X» 1st, ist W Δ^-Pro, und X» Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl oder Butyl darstellen, gekennzeichnet durch die Stufen

   a) Umsetzen des Boo-Gly-Harzes. nach der Festphasensynthesenmethode in sechs Cyclen aus Entblockieren, Neutralisieren und Kuppeln mit einer ausgewählten Aminosäure zu einem entsprechenden geschützten Heptapeptldylharz der Formel

   Boc-Phe-Val-Asn-Cy(Bzl)_TW-(D- oder L-) Arg(Tos)-GIy-Harz, worin W die gleiche Bedeutung wie in Formel I hat;

   b) Umsetzen des in Stufe a) erhaltenen geschützten Heptapeptidylharzes nach der Festphasen-Peptidsynthese in einem Zyklus aus Entblockieren, Neutralisieren und

   'S. - 60 584 18
2. 12.4.83

   Kuppeln mit Boc-X zu einem entsprechenden Tert-Butoxycarbonyl-octapeptidyl-Harz der Formel Boc-X-Phe-Val-Asn-Cy(BzI)-W-(D- oder L-)Arg(Tos)-GIy-H ar z,

   c) AmmonoIysieren des in Stufe b) erhaltenen geschützten Ootapeptidylharzes zu einem entsprechenden Boc-Ootapeptidamid der Formel

   Boc-X-Phe-Val-Asn-Oy (BzI)-W-(D- oder L-) Arg (Tos)-GIy-ISH₂, worin X die gleiche Bedeutung wie in Formel I hat;

   d) Umwandeln des in Stufe c) erhaltenen Boc-Ootapeptidamids zu einem entsprechenden ß-(S-Benzy!mercapto)-ß,ß-cyolopentamethylenpropionyl-octapeptid-amid der Formel

   OH₂CO-X-PhC-VaI-Cy(BzI)-W-(D- oder L-)Arg(Tos)-

   GIy-HH₂

   durch Kuppeln einer neutralisierten, entblockierten Lösung eines entsprechenden tei-t.-Butoxycarbonyl-octapeptidamids mit p-Nitrophenyl-ß-(S-benzylmeroapto)-ß,ß«cyclopentamethylen-propionat in Gegenwart von N-Hydroxybenzotriazol-Monohydrat und

   e) Eeduzieren eines entsprechenden, in Stufe d) erhaltenen ß-(S-Benzylmercapto)-ß_fß-cyolopentamethylenpropionylocta-

   4OS

   \ - 60 584 18
3. 12.4.83

   peptid-amids mit Natrium in flüssigem Ammoniak und oxydativer Cyclisierung einer resultierenden Disulfhydrylverbindung mit Kalium-ferricyanid.
4. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet daduroh, daß X Tyr-X¹; Q}yr L- oder D- und W Pro oder 2V~Pro ist,
5. 3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß X (O-Methyl)-tyrosin und Z Arginin ist»
6. 4. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet daduroh, daß X (O-Methyl)-tyrosin und Z (L- oder D-)-Arginin ist.
7. 5. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet daduroh, daß X (O-Ethyl)-tyrosin und Z (L- oder D-)-Arginin ist.
8. 6. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß X (O-Methyl)-D-tyrosin und Z (L- oder D-)-Arginin ist»
9. 7. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß X (O-Isopropyl)-tyrosin und Z (L- oder D~)-Arginin ist.
10. 8. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß X (O-n-Propyl)-tyrosin und Z (L- oder D-)-Arginin ist.
11. 9. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß X (O-Ethyl)-tyrosin, W 3,4-Dehydroprolin und Z Arginin ist,

    409 7

    *Κ _. 60
12. 12.4.33
13. 10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß X D-Phe, D-VaI, D-Leu, B-J-Ie, D-^rg, D-Norvalin, D-Norleuoin, D-Gyclohexylalanin, D-e£-Aminobuttersäure, D-Threonin oder D-Methionin| W Prolin und ZD- oder L-Arginin ist.

    11· Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß X D~Phe, D-VaI, D-Leu 's oder D-IIe ist·

    12· Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß Z L-Arginin ist.

    13· Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß X D-Phenylalanin und Z Arginin ist.
14. 14. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß X D-Valin und Z Arginin ist.
15. 15. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß X D-Leucin und Z Arginin ist·
16. 16. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet daduroh, daß X D-Isoleucin und Z Arginin ist·

    17· Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet daduroh, daß X D-Phenylalanin und Z D-Arginin ist·
17. 18. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung einer Verbindung der Jfonnel j_t in welcher X D-Tyr(H) und W Pro sind, gekennzeichnet durch die Stufen

    38409 7

    -53« 60 584 18
18. 12.4,83

    a) Umsetzen des Boc-Gly-Harzes nach der Festphasen-Synthesenmethode in sechs Oyclen aus Entblockieren, Neutralisieren und Kuppeln mit einer ausgewählten Aminosäure zu einem entsprechenden geschützten Heptapeptidyl-Harz der Formel Boc-Phe-Val-Asn-Cy(BzI)-Pro-Z(Tos)-Gly-Harz, worin Z die gleiche Bedeutung wie in Formel I hat}

    b) Umsetzen des in Stufe a) erhaltenen geschützten Heptapeptidyl-Harzes nach der Festphasen-Peptidsynthese in einem Cyclus aus Entblockieren, Neutralisieren und Kuppeln mit Boc-D-Tyr(H) zu einem entsprechenden tert»-Butoxycarbonyloctapeptidyl-Harz der Formel

    Bo c-D-Tyr (H) -Phe-Val-Asn-Cy (BzI) -Pro»Z (To s ) -Gly-Har ζ, worin Z die gleiche Bedeutung wie in Formel I hat;

    o) AmmonoIysieren des in Stufe b) erhaltenen gesohützten Ootapeptidylharzes zu einem entsprechenden Boc-ootapeptidylamid der Formel
    Boc-D-Tyr(H)-Phe-Val-Asn-Oy(BzI)-Pro-Z(Tos)Gly-NH₂ j

    d) Umwandeln des in Stufe c) erhaltenen Boc-octapeptidamids zu einem entsprechenden ß-(S-~benzylmercapto)-ß,ß-cyclopentamethylenpropionyl-OOtapeptidamid der Formel

    CH₂-00-D-Tyr(H)-Phe-Val-Asn-Oy(BzI)-Pro-Z(Tos)-

    -CH₂Ph

    238409 J

    60 584 18

    durch Kuppeln einer neutralisierten₉ entblockierten Lösung eines entsprechenden tert.-Butoxycarbonyl-octapeptidamids mit p-Nitrophenyl-ß-(S-benzylmercapto)--ß_>ßcyclopentamethylen-propionat in Gegenwart von U-Hydroxybenzotriazol-Monohydratj und

    e) Eeduzieren eines entsprechenden, in Stufe d) erhaltenen ß- (S-benaylmercapto ) -ß, ß-cyolopent amethylenpropionyl» octapeptid-amids mit Natrium in flüssigem Ammoniak und oxydatives Cyclisieren einer resultierenden Disulfhydrylverbindung mit Kaliumferricyanid·

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