DD285114B5

DD285114B5 - Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikoerper gegen die humane Cu/Zn-Superoxiddismutase (Cu/Zn-SOD)

Info

Publication number: DD285114B5
Application number: DD32978588A
Authority: DD
Inventors: Sigbert Dr Sc Med Jahn; Roland Dr Sc Med Grunow; Tomas Prof Sc Med Porstmann; Roselotte Wietschke; Elke Effenberger; Baehr Ruediger Prof Dr Sc Von
Original assignee: Bereich Medizin Charite Der Hu
Priority date: 1988-12-08
Filing date: 1988-12-08
Publication date: 1994-05-19

Description

Littlefield, Science, 145,1964,709) kultiviert. Damit konnten nicht fusionierte Zellen der permanenten Myelomiinie eliminiert und, orfindungsgemäß, Hybridzellen selektioniert werden, die Antikörper gegen humane C'.i/Zn-SOD produzieren. Die Detektion spezifischer Zellkulturen erfolgte im ELISA. Primärzellinion mit spezifischer Antikörper-Produktion wurden nach dem Grenzverdünnungsprinzip (C.Taswell; J. Immunol. 126,1981,1614) kloniert und subkloniert, bis mit statistischer Sicherheit Hybridoma erhalten wurden, dio äußerst stabil und rr.it bisher nicht beschriebener, hoher Effizienz monoklonal Antikörper gegen humane Cu/Zn COD sezernieren. Diese Hybridoma wurden als H-CB-SOD bezeichnet. Etabliert wurden die Hybridoma-Klone H-CB-S0D1 bis H-CB-S0D11. Diese 11 Hybridoma sind in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstitutes für Molekularbiologie der AdW der DDR, Berlin-Buch, unter den Nummern ZIM-0384 bis ZIM-0394 registriert. Bei den beschriebenen Hybridoma handelt es sich um Zellinion mit hoher Produktivität (nur wenige vergleichbare Daten aus dom internationalen Schrifttum sind bekannt). Die Hybridomzellkulturen eignen sich für die Massenproduktion von mAk in vitro und in vivo.

Erstmalig ist es gelungen, in den beschriebenen Hybridomalinien mAk zu produzieren, die verschiedene Epitope der humanen Cu/Zn-SOD erkennen. Die überraschend hohe Antigen-Bindungsaffinität erlaubt den Einsatz der mAk zu diagnostischen und biotechnologischen Zwecken.

Es liegen experimentelle Erfahrungen bei der Bearbeitung der Hybridoma im Airlift-Bioreaktor (Kulturvolumen 50I) in vitro sowie der Ascitasproduktion in pristanbehandetten Balb/c-Mäusen in vivo vor. Auf dieso Weise wurden aus den beschriebenen Hybridomkulturen die monoklonalen Antikörper CB-SOD1 bis CB-SOD11 in großen Mengen gewonnen. Durch verschiedene Verfahren lassen sich die mAk bis zu einem hohen Reinheitsgrad anreichern. Für die Entwicklung bestimmter Testverfahren können die Ak mit Enzymen (z. B. Peroxidase) markiert werden. Sie können außerdem zur Anwendung bei Trennverfahren (positive Affinitätschromatographie) an bestimmte Trägermaterialien gekoppelt werden.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Über einen Zeitraum von 6 Monaten werden 5 Mäuse mit jeweils 50Mg gereinigter Rekombination-Cu/Zn-SOD (GRÜNTHAL-AG) in komplettem Freund'schen Adjuvans immunisiert. Die Boosterungen erfolgen alle 6 Wochen. Nach der letzten Immunisierung mit 150 Mg Antigen intravenös werden pro Tier etwa 2 χ 10⁸ Milzzellen isoliert. Diese werden durch Polyethylenglykol 1500 (unter Zusatz von 6% DMSO) mit 2 χ 10⁷ Myelomzellen P3X63 Ag8.653 fusioniert. Nach entsprechenden Waschsnhritten werden die Zellen in 96-well-Flachboden-Zellkulturplatten mit 10^s Milzzellen in 150μΙ pro well ausplattiert. Als Zellzuchtmedium wird RPM11640, ergJnzt durch 10% hitzeinaktiviertes FKS verwendet. Am nächsten Tag werden pro well 50μΙ 4fach konzentriertes HAT-Selektionsmedium zugesetzt. Nach ca. 14 Tagen werden die Primärkulturen mit einem spezifischen ELISA hinsichtlich der Produktion spezifischer Antikörper gegen humane Cu/Zn-SOD geprüft. Nach dem angegebenen Verfahren können bis zu 20% der Primärkulturon spezifische Antikörper produzieren. Die positiven Primärkulturen werden auf Maus-Peritonealmakrophagen (10⁴ pro well) nach dem Grenzverdüi-nungsverfehren kloniert und rekloniert. Auf diese Weise werden monoklonal Zellinien mit spezifischer Antikörperproduktion gegen humane Cu/Zn-SOD erhalten.

Beispiel 2

Die Monierten Zellinien mit spezifischer Antikörperproduktion gegen humane Cu/Zn-SOD werden in RPM11640 Kulturmedium, ergänzt durch 10% fetales Kälberserum, gezüchtet in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO₂-AnIeM. Durch schrittweise Adaptation lassen sich diese Zellen auch in Medien mit 2-5% FKS-Anteil züchten. Die Zellen werden in Zellkulturflaschen vermehrt. Mi» Verdünnungsraten von bis zu 1:10 kann das Kulturvolumen expandiert werden. Die Massenproduktion der Antikörper erfolgt in Rollerflaschen und anschließend im Airlift-Bioreaktor mit 50 Litern Volumen. Eine Beschreibung der In-vitro-Zellkultureigenschaften der Hybridoma erfolgt in Tabelle 1.

Beispiel 3

In Zellkulturflaschen (Volumen 275ml; NUNCLON, Kamstrup, Dänemark) werden die monoklonalen Hybridoma auf eine Zellmenge von (10⁷-2,5 χ 10⁷) gezüchtet. Die Zellen werden abzentrifugiert und in phosphatgepufferter isotonischer Kochsalzlösung resuspendiert. Je 1 ml Suspension mit einer bestimmten (optimierten) Zellzahl wird Balb/c-Mäusen intraperitoneal applizlert, die 8 Tage zuvor mit 1 ml Pristan behandelt worden waren. Nach 5-14 Tagen zeigt die Bauchschwellung den Beginn der Ascitesproduktion. Die Hybridomklone unterscheiden sich hinsichtlich optimaler Bedingungen und Effektivität in der In-vivo-Gewinnung von mAk gegen humane Cu/Zn-SOD (Tabelle 2). Die Reinigung der monoklonalen Antikörper erfolgt nach bekannten Verfahren.

Beispiel 4

Nach dem beschriebenen Schema werden Hybridomzellinien mit Antikörperproduktion gegen mindestens 3 verschiedene Epitope der Cu/Zn-SOD gewonnen, die mit CB-SOD1 bis CB-SOD11 bezeichnet werden. Die Antikörper reagieren mit hoher Affinität mit den entsprechenden Epitopen auf dem Molekül der humanen Cu/Zn-SOD.

Tabelle 1: Maus-Hybridoma mit Antikörperproduktion gegen humane Cu/Zn-SOD

Hybridom	Verdopplungszeit	mAk-Produktion in vitro
	(Std.)	pgper 24 Std. per
		10"Zellen
HCB-SOD1	15	154
H-CB-S0D2	18	133
H-CB-S0D3	22	80
H-CB-S0D4	28	34
H-CB-S0D5	28	62
H-CB-SOMO	36	168
H-CB-SOD11	34	141

Tabelle 2: Produktion muriner monoklonaler Antikörper gegen humane Cu/Zn-SOD in vivo (Ascitesflüssigkeit) Hybridom Ig-Konzentration in Ascites- Flüssigkeit (mg/ml)

H-CB-SOD1 iÖ

H-CB-SOD 2 20

H-CB-S0D3 40

H-CB-S0D4 12

H-CB-SOD 5 30

H-CB-SOD10 10

H-CB-SOD11 20

Tabelle 3: Murine monoklonaie Antikörper gegen humane Cu/Zn-SOD

Antikörper Ig-Subklasse Bindungsaffinität (l/Mol)

CB-SOD1 IgGI 1,5 x10¹⁰ CB-SOD 2 IgGI 4,7 x10⁷ CB-SOD5 IgGI 1,2 X 10¹⁰

CB-SOD11 IgG! 1,0x10'°

Claims

Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die verschiedene Epitope der humanen Cu/Zn-Superoxiddismutase (Cu/Zn-SOD) mit unterschiedlicher Bindungsaffinität erkennen, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybridomzollinien H-CB-SOD1 (ZIM0384) bis H-CB-SOD11 (ZIM0394) eingesetzt werden.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper (mAk) gegen humane Cu/Zn-Superoxiddismutaso (Cu/Zn-SOD). Anwendungsbeispiele bestehen beim Einsatz der mAk zum Nachweis von Cu/Zn-SOD in menschlichen Körperflüssigkeiten (z. B. pränatale Diagnostik des M. Langdon-Down, der Trisomie 21) sowie der Möglichkeit der Reinigung von humaner Cu/Zn-SOD durch positive Affinitätschromatographie. Das Anwendungsgebiet der Erfindung ist die medizinische Diagnost'k.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Herstellung muriner monoklonaler Antikörper (mAk) ist als technisches Problem gelöst. Das Prinzip wurde erstmalig durch G. Köhler und C. Milstein publiziert (NATURE, 1975,256,495), die Ak-bildende Zellen aus der Milz immunisierter Mäuse mit Zellen einer permanent wachsenden Plasmozytomzellinie hybridisierten, Ak-produzierende Hybridoma erhielten und nach entsprechenden Klonierungsschritten monoklonale (vom einem Zell-Klon gebildete) Ak erhielten. Dieses biotechnologische Prinzip wird (modifiziert) bis heute breit angewendet. Auch die Anwendung des Verfahrens auf die Herstellung von murinen mAk gegen humane Cu/Zn-SOD ist bekannt (T. Porstmann, R.Wietschke, H. Schmechta, R. Grunow, B. Porstmann, R. Bleiber, M. Pergande, S.Stachat, R. von Baehr, Clin. Chim. Acta 171 [1988], 1-10; A.A. Khan, R. E. Warrington EP 279705). Die Cu/Zn-SOD schützt Zellen vor der Akkumulation toxischer Superoxidradikale (Oj"), indem sie die Reaktion O₂" + O₂" + 2H⁺-^H₂O₂ + O₂ katalysiert. Damit stellt die Cu/Zn-SOD ein Markerenzym für entzündliche Prozesse dar, an denen sie regulativ als Zellschutz mitwirkt (J.Fridovich: in Advances in Enzymology, ed. H. Rister, Vol.41,39-97,1974). Der Nachweis von Cu/Zn-SOD bei entzündlichen Reaktionen (z. B. Rheumatoider Arthritis) ist von diagnostischer Wertigkeit (H. Rister and K. Bauermeister: Klin. Wochenschr. 60,1982,561-565). Von besonderer klinisch-diagnostischer Bedeutung jodoch ist die Lokalisation des Gens für Cu/Zn-SOD auf Chromosom 21, das beirr M. Langdon-Down (Trisomie 21) in den Körperzellen dreimal vorliegt. Die somit verstärkte Genexpression führt zur Erhöhung der intrazellulären Cu/Zn-SOD-Konzentration und wird zum diagnostischen Nachweis der Erkrankung genutzt (P.Sinet; in: Altzheimer's Disease, Down's Syndrome and Aging. Ann. NY. Acad. Sei. 396,83-94,1982, New York, USA).

Zum Nachweis humaner Cu/Zn-SOD wurden bisher u.a. ELISA-Techniken genutzt, die ausschließlich auf polyklonalen anti-Cu/ Zn-SOD-Antiseren basieren (S. lizuko, N.Taniguchi, A. Makita; JNCI. 72,5,1984,1043-1048). Diese Testsysteme sind schwer 2U standardisieren und gewährleisten nicht die geforderte Sensitivität, wie sie zum Beispiel für den intrazellulären Nachweis von humaner Cu/Zn-SOD in intrauterinem Material gefordert wird.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, monoklonale Antikörper gegen humane Cu/Zn-SOD zum Einsatz für diagnostische Zwecke zu entwickeln.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung besteht in der Entwicklung eines Verfahrens zur effektiven Erzeugung von murinen Hybridomzellinien, von denen in anschließenden methodischen Schritten monoklonale Antikörper gegen Cu/Zn-SOD isoliert werden können. Die Hybridomzellen sollen in optimalem ökonomischen Aufwand-Nutzen-Verhältnis in vitro (bis zum Large-Scaling im Bioreaktor) und in vivo (Ascites-Flüssigkeit der Maus) kultivierbar sein und durch hohe Antikörper-Sekretionsleisturig die Reinigung begünstigen.

Die Aufgabe wurde derart gelöst, daß zunächst Mäuse vom Stamm Balb/c mit einem gereinigten Rekombinanton-Präparat der humanen Cu/Zn-SOD nach einem bestimmten, der Erfindung gemäßen Schema immunisiert werden. Als vorteilhaft erwies sich die Verwendung von 8-10 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen. Die Immunisierung erfolgte durch mehrmalige Applikation des Antigens. Dio besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Mäuse zunächst ca. alle 6 Wochen eine Dosis von 50μρ des gereinigten Rekombinanten-Cu/Zn-SOD-Materials in komplettem Freund'schen Adjuvans intraperitoneal über einen Zeitraum von 8-12 Monaten appliziert bekamen. Die letzte Immunisierung erfolgte erfindungsgemäß mit 1 GiKI50Mg des Antigens in Phosphatpuffer intravenös. Aus den Milzen derart hyperimmunisierter Mäuse wurde 5 Tage nach der letzten Immunisierung durch Gewebe-Homogenisierung eine Einzel-Zell-Suspension hergestellt.

Als Fusionspartner für diese Zellen wurden Maus-Myelomzellen der Linie P3X63 Ag 8/653 (J. KEARNEY et al., J. Immunol. 123, 1979,548) verwendet, die in RPM11640 Zellzuchtmedium, ergänzt mit 10% Fetalem Kälberseru;n (FKS), kultiviert wurden. Nach Mischen der Zellsuspensionen (Milzlymphozyten.Myelomzellen im Verhältnis 5:1) und ihrer Sedimentation erfolgte die Zellfusion durch PEG (50%) in Gegenwart von DMSO (6%). Anschließend wurden die Zellen in Subkulturen (mehrere Hundert pro Fusion zu je 200μΙ Volumen) aufgeteilt und in einem HAT-Selektionsmedium (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin;