DD299319A5 - Intronsequenzanalyseverfahren zum nachweis von benachbarten und entfernten genortallelen als haplotypen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis von mindestens einem Allel eines Genorts bereit und kann zur direkten Bestimmung des Haplotyps benutzt werden. Das Verfahren umfasst die Amplifizierung genomischer DNA mit einem Primerpaar, welches eine Introsequenz überspannt und eine DNA-Sequenz definiert, die sich in genetischer Kopplung mit einem nachzuweisenden Gen befindet. Die Primer-definierte DNA-Sequenz enthält eine genügend große Anzahl von Intronsequenznukleotiden, um das Allel zu charakterisieren. Die genomische DNA wird amplifiziert, um eine amplifizierte DNA-Sequenz zu erzeugen, welche charakteristisch ist für das Allel. Die amplifizierte DNA Sequenz wird analysiert, um die Anwesenheit einer genetischen Variation in der amplifizierten DNA-Sequenz nachzuweisen, wie z.B. eine Änderung in der Sequenzlänge, das Hinzukommen oder den Verlust einer Restriktionsstelle oder die Substitution eines Nukleotids. Die Variation ist charakteristisch für das nachzuweisende Allel und kann dazu verwendet werden, um entfernte Allele nachzuweisen. Kits, welche ein oder mehrere der in dem Verfahren verwendeten Reagenzien enthalten, sind ebenfalls beschrieben.{Intron; Sequenzanalyse; DNA; Allel; Nukleotid; genetische Variation; Restriktionsstelle; Primerpaar}

Description

Intronsequenzanalyseverfahren zum Nachwels von benachbarten und entfernten Genort-Allelen als Haplotypen Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Allelen und Haplotypen und Reagenzien dafür. Zum Teil auf eine Anzahl neuer analytischer Techniken zurückzuführen, hates einen bemerkenswerten Zuwachs in der Kenntnis

genetischer Information gegeben, insbesondere bei Menschen. AIIeIe Varianten von Genorten sind mit bösartigen und nichtbösartigen, durch ein oder mehrere Gene verursachte Krankheiten korreliert worden. Durch ein Gen verursachte Krankheiten,bei denen das defekte Gen identifiziert worden ist, schließen beispielsweise die DuChennische Muskeldystrophie,

Sichelzellenanämie, Lesch-Nyhan-Syndrom, Hämophilie, ß-Thalassämie, zystische Fibröse, polyzystische Nierenkrankheit, ADA-Mangel, α-1-Antitrypsinmangel, Wilm's Tumor und Retlnoblastom ein. Andere Krankheiten, von denen man glaubt, daß sie

durch ein Gen verursacht werden, und bei denen das Gen nicht identifiziert ist, schließen die geistige Unterentwicklung beimfragilen X-Chromosom („fragile X mental retardation") und Chorea Huntington ein.

Gene, die mit Krankheiten assoziiert sind, die durch mehrere Gene verursacht werden, wie z. B. Diabetes, Darmkrebs und

vorzeitige Coronararteriosklerose, sind ebenfalls identifiziert worden.

Außer zur Identifizierung von Individuen, die Träger genetischer Krankheiten sind oder bei denen ein erhöhtes Risiko dafür

besteht, ist der Nachweis von Allelvarianten eines Genortes beim Menschen für Organtransplantationen, in der Gerichtsmedizin,bei strittiger Vaterschaft und für eine Anzahl anderer Zwecke verwendet worden. Bei kommerziell wichtigen Pflanzen und Tierensind Gene nicht nur analysiert, sondern auch mit gentechnischen Methoden verändert und In andere Organismen eingeführtworden.

Eine Anzahl von Techniken zum Nachweis alleler Varianten von Genorten sind angewendet worden, einschließlich der Analyse

von polymorphen Mustern von Restriktionsfragmentlängen (RFLP), der Verwendung von Oligonukleotid-Sonden und

DNA-Amplifizierungsmethoden. Eine der kompliziertesten Gruppen von allelen Varianten, der Haupthistokompatibilitätskomplex

(MHC) ist ausführlich studiert worden. Die Probleme, denen man begegnet beim Versuch den HLA-Typus eines Individuums zubestimmen, sind exemplarisch für Probleme, denen man bei der Charakterisierung anderer Genorte begegnet.

Der Haupthlstokompatibilitätskomplex ist ein Cluster von Genen, die ein Gebiet auf dem kurzen Arm von Chromosom 6

einnehmen. Dieser Komplex, bezeichnet als humaner Leukozytenantigenkomplex (HLA), umfaßt mindestens 50 Genorte. Zum

Zweck der HLA-Gewebebestimmung sind zwei Hauptklassen von Genorten identifiziert. Die Genorte der KlasseΊ codieren für Transplantationsantigene und werden mit A, B und C bezeichnet. Die Genorte der Klasse Il (DRA, DRB, DQA1, DQB, DPA und DPB) codieren für Produkte, welche die Immunantwort kontrollieren. Alle Genorte der Klasse Il mit Ausnahme des DRA-Genorts

sind polymorph. Das bedeutet, die Sequenz des DRa-Anttgenpolypeptids ist invariant.

HLA-Bestimmungen werden in Vaterschaftsbestimmungen, in Tests für Transplantationskompatibilität, in der Gerichtsmedizin,

bei der Behandlung mit Blutbestandteilen, bei anthropologischen Studien und in Korrelationsuntersuchungen bezüglich der

Assoziation mit einer Krankheit um damit die Krankheit zu diagnostizieren oder die Anfälligkeit dafür vorherzusagen, verwendet. Aufgrund der Möglichkeit, durch HLA Individuen zu unterscheiden und der Notwendigkeit, bei einer Transplantation den

passenden HLA-Typus auszuwählen, sind analytische Methoden gesucht worden, um die AIIeIe der Genorte, die mit dem

Komplex assoziiert sind, unzweideutig zu charakterisieren. Gegenwärtig ist die DNA-Bestimmung unter Verwendung von RFLP

und Oligonukleotidsonden zur Bestimmung von Klasse Il Genort-Allelen verwendet worden. AIIeIe von Genorten der Klasse Iund Genorten der Klasse Il DR und DQ werden typischerweise durch serologische Methoden bestimmt. Die AIIeIe des Klasse-Il-

DP-Genorts werden durch das sogenannte „primed lymphocyte typing (PLT)" bestimmt. Jede der Methoden zur HLA-Analyse hat Nachteile. Serologische Methoden erfordern Standardseren, die nicht allgemein

erhältlich sind und ständig ergänzt werden müssen. Außerdem basiert die serologische Bestimmung auf der Reaktion der

HLA-Genprodukte in der Probe mit den Antikörpern des Serumreagenzes. Die Antikörper erkennen die Expressionsprodukte der HLA-Gene auf der Oberfläche von Zellkern-enthaltenden Zellen. Die Bestimmung eines fetalen HLA-Typus durch serologische Methoden kann schwierig sein aufgrund mangelnder Reifung der exprimierten Antigene in fetalen Blutzellen. Die Bestimmung mit Oligonukleotidsonden kann in zwei Tagen durchgeführt werden und ist weiter verbessert worden durch die

kürzliche Verwendung der Amplifizierung durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Bestimmung mit Oligonukteotidenauf der Basis von PCR ist bei Klasse Il Genorten durchgeführt worden. Das .primed lymphocyte typing" erfordert 5 bis 10 Tagebis zum Abschluß und beinhaltet die Verwendung einer Zellkultur mit all ihren Schwierigkeiten und inhärenter Variabilität.

Die RFLP-Analyse ist zeitraubend; sie erfordert ungefähr 5 bis 7 Tage bis zum Abschluß. Die Analyse der Fragmentmuster ist

komplex. Außerdem erfordert die Technik die Vorwendung markierter Proben. Die am häufigsten verwendete Markierung, ³²P, hat wohlbekannte Nachteile, die mit der Verwendung von Radionukliden verknüpft sind. Eine schnelle verläßliche Methode zur Analyse eines Genorts ist äußerst wünschenswert.

Das US-Patent Nr.4683195 beschreibt ein Verfahren zur Amplifizierung, zum Nachweis und/oder zum Klonieren von Nukleinsäuresequenzen. Die Methode umfaßt die Behandlung getrennter komplementärer DNA-Stränge mit zwei Oligonukleotid-Primem, die Verlängerung der Primer, um die komplementären Verlängerungsprodukte zu bilden, die als Matrizen zur Synthese der gewünschten Nukleinsäuresequenz dienen, und den Nachweis der amplifizierten Sequenz. Diese Methode wird üblicherweise als Polymerase-Kettenreaktions-Sequenzamplifizierungsmethode oder PCR bezeichnet. Variationen der Methode sind im US-Patent Nr.4683194 beschrieben. Die Polymerasen-Kettenreaktions-Sequenzamplifizierungsmethode ist ebenfalls beschrieben bei Saiki et al., Science, Band 230, Seite 1350 bis 1354 (1985) und Scharf et al., Science, Band 324, Seite 163 bis 166 (1986).

US-Patent Nr. 4 582788 beschreibt eine Methode zur HLA-Bestimmung, die auf dem Restriktionslängenpolymorphismus (RFLP) beruht, und die dabei verwendeten cDNA-Sonden. Die Methode wird so ausgeführt, daß man die HLA-DNA eines Individuums mit einer Restriktions-Endonuklease in Fragmente spaltet, die ein polymorphes Fragmentmuster erzeugen, mit dem Fragmentgemisch das sogenannte genomische Blotting-Verfahren durchführt, wobei man eine markierte cDNA-Sonde verwendet, die komplementär zu einer HLA-DNA-Sequenz ist, die am Polymorphismus beteiligt ist, und das aus dem genomischen Blotting-Verfahren resultierende Muster mit einem Standard vergleicht. Genort-spezifische Sonden für Genorte der Klasse Il (DQ) werden ebenfalls beschrieben. Kogan et al., New Engl. J. Med., Band 317, Seite 985 bis 990 (1987) beschreibt ein verbessertesPCR-Sequenzamplifizierungsverfahren, das eine hitzestabile Polymerase (Taq Polymerase) und Amplifikation bei hoher Temperatur verwendet. Die in dem Verfahren verwendeten stringenten Bedingungen ergeben genügend hohe Replikationstreue, um die Analyse der amplifizierten DNA zu erlauben, indem die Länne der DNA-Sequenz durch visuelle Beobachtung eines mit Ethidiumbromid angefärbten Gels bestimmt wird. Das Verfahren wurde angewandt, um mit Hämophilie A assoziierte DNA zu analysieren, bei der zusätzliche hintereinander angeordnete Wiederholungen einer DNA-Sequenz mit der Krankheit assoziiert sind und die amplifizierten Sequenzen wesentlich langer sind als die Sequenzen, die nicht mit der Krankheit assoziiert sind.

Simons und Erlich, Seiten 952 bis 958 in: Immunology of HLA, Band 1: Springer-Verlag, New York (1989), fassen wechselseitige RFLP-Sequenzbeziehungen an den DPA- und DPB-Genorten zuammen. RFLP Fragmentmuster, die im Southern Blotting-Verfahren mit markierten Sonden analysiert wurden, lieferten unterschiedliche Muster für DPw1-5-Allele und die korrespondierenden DPBI-Allelsoquenzon, charakterisierten zwei subtypische Muster für DPw2 und DPw4 und identifizierten neue DPw-AIIeIe.

Simons et al., Seite 959-1023 in: Immunology of HLA, Band 1: Springer-Verlag, New York (1989) faßten die Restriktionslängenpolymorphismen von HLA-Sequenzen der Klasse-Il-Genorte zusammen, wie sie beim 10th International Workshop Southern Blot Analysis bestimmt wurden. Es wurde gezeigt, daß die Southern Blot Analyse zur Bestimmung der Hauptklassen von HLA-Genorten geeignet ist.

Eine Reihe von drei Artikeln (Rommens et al., Science Band 245, Seiten 1059-1065 [1989], Riordan et al., Science Band 245, Seiten 1066-1072 [1989) und Kerem et al., Science Band 245, Seiten 1073-1079 (1989]) berichten über eine neue Methode zur Genanalyse, genannt „jumping", die benutzt wurde, um den Ort des CF-Gens, die Sequenz des CF-Gens und den Defekt in dem Gen bzw. seinen Prozentanteil in der von der Krankheit betroffenen Bevölkerung zu identifizieren.

Di Lelia et al., The Lancet i: Seiten 497-499 (1988) beschreibt ein Screening-Verfahren zum Nachweis der zwei Hauptallele, die verantwortlich sind für Phenylketonurie bei Kaukasiern nordeuropäischer Abstammung. Die Mutationen, lokalisiert etwa im Zentrum von Exon 12 und an der Verbindungsstelle von Exon 12 mit der intervenierenden Sequenz 12, werden nachgewiesen durch PCR-Amplifizierung einer 245bp langen Region von Exon 12 und flankierender intervenierender Sequenzen. Die amplif izierte Sequenz umfaßt beide Mutationen und wird analysiert unter Verwendung von Sonden, die spezifisch sind für jedes der AIIeIe (ohne vorherige elektrophoretisch^ Trennung).

Dicker et al., BioTechniques, Band 7, Seiten 830-837 (1989) und Mardis et al., BioTechniques, Band 7, Seiten 840-850 (1989) berichten über automatisierte Techniken zur DNA-Sequenzierung, insbesondere von Sequenzen, die mit dem PCR-Verfahren erzeugt wurden.

Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zum Nachweis von mindestens einem AIIeI eines Genortes und kann zur direkten Bestimmung des Haplotyps verwendet werden. Das Verfahren umfaßt die Amplifizierung genomischer DNA mit einem Primerpaar, das eine Intronsequenz überspannt und eine DNA-Sequenz, diu sich in genetischer Kopplung mit einem nachzuweisenden AIIeI befindet, definiert. Die Primer-definierte DNA-Sequenz enthält eine genügend große Anzahl von Nukleotiden der Intronsequenz, um das AIIeI zu charakterisieren. Die genomische DNA wird amplifiziert, um eine amplifizierte DNA-Sequenz zu erzeugen, die charakteristisch ist für das AIIeI. Die amplifizierte DNA-Sequenz wird analysiert, um die Anwesenheit einer genetischen Variation in der amplifizierten DNA-Sequenz nachzuweisen, wie z. B. eine Änderung der Länge der Sequenz, das Hinzukommen oder den Verlust einer Restriktionsstelle oder die Substitution eines Nukleotids. Die Variation ist charakteristisch für das nachzuweisende AIIeI.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß Inkonsequenzen genetische Variationen enthalten, die charakteristisch sind für benachbarte und entfernte AIIeIe auf demselben Chromosom. Insbesondere können DNA-Sequenzen, die eine genügend große Anzahl von Nukleotiden der Intronsequenz enthalten, zur direkten Bestimmung des Haplotyps benutzt werden. Das Verfahren kann zum Nachweis von Allelen an Genorten bei jedem eukaryotischem Organismus verwendet werden. Von besonderem Interesse sind Genorte, die mit bösartigen und nicht bösartigen Krankheiten, die von einem oder mehreren Genen verändert werden, assoziiert sind, und die Identifizierung von individuellen Organismen oder Arten bei Pflanzen und Tieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren dazu benutzt, den HLA-Alleltypus und Haplotyp zu bestimmen. Ausrüstungen, die ein oder mehrere der in dem Verfahren verwendeten Reagenzien umfassen, werden ebenfalls beschrieben. Die vorliegende Erfindung schafft ein Verfahren zum Nachweis von Allelen und Haplotypen durch die Analyse von Intronsequenzvariationen. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß die Amplifikation von Intronsequenzen, die in einem Kopplungsungleichgewicht mit benachbarten und entfernten Genorten stehen, dazu benutzt werden kann, um Adele dieser Genorte nachzuweisen. Das vorliegende Verfahren liefert Haplotypen als direktes Ergebnis der

Intron-bestimmenden Analyse, wenn ein einzelner individueller Organismus untersucht wird. Das Verfahren ist besonders

nützlich bei Menschen, aber es ist generell für alle Eukaryoten anwendbar und wird vorzugsweise dazu benutzt, Pflanzen- und

Tierarten zu analysieren. Das Verfahren umfaßt die Amplifizierung genetischer DNA mit einem Primerpaar, das eine Intronsequenz überspannt und eine DNA-Sequenz, die sich in genetischer Kopplung mit dem nachzuweisenden AIIeI befindet, definiert. Die Primerstellen sind in

konservierten Regionen in den Introns oder Exons, die an die zu amplifizierende Intronsequenz angrenzen, lokalisiert. Die

Primer-definierte DNA-Sequenz enthält eine genügend große Anzahl von Nukleotiden der Intronsequenz, um das AIIeI zu

charakterisieren. Die amplifizierte DNA-Sequenz wird analysiert, um die Anwesenheit einer genetischen Variation nachzuweisen,

wie z. B. eine Änderung in der Länge der Sequenz, das Hinzukommen oder den Verlust einer Restriktionsstelle oder die

Substitution eines Nukleotids. Die Intronsequenzen liefern genetische Variationen, welche zusätzlich zu den in den Exon-Sequenzen gefundenen zur weiteren Unterscheidung der Proben-DNA führen, und damit zusätzliche Information über den individuellen Organismus liefern. Diese Information ist besonders wertvoll zur Identifizierung von Individuen, wie z. B. in Vaterschaftsbestimmungen oder in der Gerichtsmedizin. Die Information ist auch wertvoll bei jeder anderen Anwendung, wo Heterozygoter (zwei verschiedene AIIeIe)

von Homozygoten (zwei Kopien eines AIIeIs) unterschieden werden müssen.

Spezieller liefert die vorliegende Erfindung Informationen, welche die Intronvariation betrifft. Unter Verwendung der Methoden

und Reagenzien dieser Erfindung sind zwei Typen von Intronvariationen gefunden worden, die mit Genorten assoziiert sind. Dererste ist die Allel-assoziierte Intronvariation. Das bedeutet, das Muster der Intronvariation ist assoziiert mit dem Alleltyp an einementfernten Genort. Der zweite Variationstyp ist assoziiert mit entfernten Allelen (Haplotypen). Das heißt, die Variation istanwesend in individuellen Organismen mit demselben Genotyp am primären Genort. Unterschiede können auftreten zwischen

Sequenzen derselben benachbarten und entfernten Genorttypen. Die auf ein Individuum beschränkte Variation ist jedoch

ungebräuchlich.

Weiterhin wird eine amplifizierte DNA-Sequenz, die genügend Intronsequenzen enthält, abhängig von dem in der Probe

vorhandenen AIIeI variieren. Das bedeutet, die Introns enthalten genetische Variationen (z. B. Längenpolymorphismen aufgrund

von Insertionen und/oder Deletionen und Änderungen der Anzahl oder Orte von Restriktionsstellen), die mit dem besonderen

AIIeI des Genorts und mit den Allelen an entfernten Genorten assoziiert sind. Die Reagenzien, die beider Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden, werden ebenfalls beschrieben. Die Reagenzien können in Form einer Ausrüstung zur Verfügung gestellt werden, welche ein oder mehrere der im Verfahren

verwendeten Reagenzien enthält.

Definitionen: Der Ausdruck „Allel", wie er hier benutzt wird, bedeutet eine genetische Variation, die mit einer codierenden Region assoziiert

ist; d. h. eine alternative Form des Gens.

Der Ausdruck „Kopplung", wie er hier benutzt wird, bezieht sich auf den Grad, in dem Regionen genomischer DNA gemeinsam

vererbt werden. Regionen auf verschiedenen Chromosomen weisen keine Kopplung auf und werden in 50% der Fälle zusammenvererbt. Benachbarte Gene, die immer gemeinsam vererbt werden, weisen 100% Kopplung auf.

Der Ausdruck „Kopplungsungleichgewicht", wie er hier benutzt wird, bezieht sich auf das gemeinsame Auftreten von zwei Allelen auf gekoppelten Genorten, so daß die Frequenz des gemeinsamen Auftretens der AIIeIe größer ist als aufgrund der

getrennten Frequenzen des Auftretens jedes AIIeIs zu erwarten wäre. Von Allelen, die zusammen mit Frequenzen auftreten, dieaufgrund ihrer getrennten Frequenzen zu erwarten sind, sagt man, sie seien im „Kopplungsgleichgewicht".

Der Ausdruck „Haplotyp", wie er hier verwendet wird, bezeichnetem Gebiet genomischer DNA auf einem Chromosom, welches

von Rekombinationsstellen begrenzt wird, so daß die Genorte innerhalb einer haplotypischen Region üblicherweise als Einheitvererbt werden. Jedoch können gelegentlich genetische Umlagerungen innerhalb eines Haplotyps auftreten. Somit ist der

Ausdruck „Haplotyp" ein funktioneller Ausdruck, der sich auf das Auftreten gekoppelter Genorte auf dem Chromosom bezieht. Der Ausdruck „Intron", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf untranslatierte DNA-Sequenzen zwischen Exons, zusammen

mit untranslatierten Regionen in 5'- und 3'-Position, die mit einem Genort assoziiert sind. Zusätzlich wird der Ausdruck benutzt in

Beziehung auf die Füllsequenzen zwischen Genorten (intergene Füllsequenzen), die nicht mit einer codierender; Region

assoziiert sind und umgangssprachlich als „Müll" bezeichnet werden. Während sich auf diesem Fachgebiet der Ausdruck„Intron" üblicherweise nur auf untranslatierte Sequenzen zwischen Exons bezieht, wurde diese erweiterte Definition aufgrunddes Fehlens eines auf diesem Gebiet allgemein anerkannten Ausdrucks, der alle Nicht-Exon-Sequenzen umfaßt, erforderlich.

Eine „intervenierende Sequenz", wie hier verwendet, ist ein Intron, welches zwischen zwei Exons innerhalb eines Gens lokalisiert

ist. Der Ausdruck umfaßt nicht mit dem Genort assoziierte nicht-codierende Sequenzen, die sich stromabwärts undstromaufwärts befinden.

Der Ausdruck „amplifizierte DNA-Sequenz", wie hier verwendet, bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die Kopien eines Teils einer DNA-Sequenz und ihrer komplementären Sequenz sind, wobei die Kopien in der Nukleotidsequenz der Original-DNA-Sequenz

und deren Komplementärsequenz entsprechen.

Der Ausdruck „Komplement", wie hier benutzt, bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die komplementär zu einer bestimmten DNA-Sequenz ist. Der Ausdruck „Prlmerstelle", wie hier benutzt, bezieht sich auf das Gebiet der Ziel-DNA, mit dem ein Primer hybridisiert. Der Ausdruck „Primerpaar", wie hier verwendet, bezeichnet einen Satz von Primern, welcher einen 5-stromaufwärts-Primer, der mit

dem 5'-Ende der zu am,)lifizierenden DNA-Sequenz hybridisiert und einen 3'-stromabwärts-Primer, der mit dem Komplementdes 3'-Endes der zu amplifizierenden Sequenz hybridisiert, umfaßt.

Der Ausdruck „Exon-Iimitierte Primer", wie hier verwendet, bezeichnet ein Primerpaar, dessen Primersich innerhalboder knapp

außerhalb eines Exons in einem konservierten Teil des Introns befinden, wobei die Primer eine DNA-Sequenz amplifizieren, dieein Exon oder einen Teil davon und nicht mehr als eine kleine, über das Exon hinausreichende Region der oder des benachbarten

Introns enthält. Der Ausdruck „Intron-überspannende Primer", wie hier verwendet, bezeichnet ein Primerpaar, das mindestens einen Teil eines Introns amplifiziert, wobei die amplifizierte Intronregion Sequenzen enthält, die nicht konserviert sind. Die Intron·

überspannenden Primer können sich in konservierten Regionen des Introns oder in benachbarten stromaufwärts und/oderstromabwärts liegenden Exon-Sequenzen befinden.

Der Ausdruck „Gonort", wie hier verwendet, bezeichnet die Region genomischer DNA, die das Gen enthält, welches für ein Protein codiert, einschließlich aller stromaufwärts oder stromabwärts transkribierten nicht-codierenden Regionen und assoziierter regulatorischer Regionen. Deshalb ist ein HLA Genort diejenige Region genomischer DNA, welche das Gen einschließt, das für ein HLA Genprodukt codiert.

Der Ausdruck „benachbarter Genort", wie hier verwendet, bezieht sich entweder auf (1) den Genort, an dem sich eine DNA-Sequenz befindet, oder (2) den nächsten stromaufwärts oder stromabwärts gelegenen Genort für Intron-DNA-Sequenzen, die nicht mit einem Genort assoziiert sind.

Der Ausdruck „entfernter Genort", wie hier verwendet, bezieht sich auf entweder (1) einen Genort, der sich stromaufwärts pder stromabwärts von dem Genort befindet, an dem eine DNA-Sequenz lokalisiert ist oder (2) für Inkonsequenzen, die nicht mit einem Genort assoziiert sind, einen Genort, der sich stromaufwärts oder stromabwärts von demjenigen Genort befindet, der sich am nächsten stromaufwärts oder stromabwärts zur Inkonsequenz befindet.

Der Ausdruck „Genort-spezifischer Primer", wie hier verwendet, bezeichnet einen Primer, der spezifisch mit einem Teil des angegebenen Genorts oder seinem komplementären Strang hybridisiert, mindestens für ein AIIeI des Genorts, und unter den bei der Amplifizierungsmethode verwendeten Bedingungen nicht mit anderen DNA-Sequenzen hybridisiert. Die Ausdrücke „Endonuklease" und „Restriktionsendonuklease", wie hier verwendet, beziehen sich auf ein Enzym, das doppelsträngige DNA mit einer bestimmten Nukleotldsequenz schneidet. Die Spezifitäten zahlreicher Endonukleasen sind wohlbekannt und können in einer Anzahl von Publikationen gefunden werden, z. B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual von Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory 1982.

Der Ausdruck „Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus" (oder RFLP), wie hier verwenden bezieht sich auf Unterschiede in den DNA Nukleotidsequenzen, die Fragmente verschiedener Länge erzeugen, wenn sie von einer Restriktionsendonuklease gespalten werden.

Der Ausdruck „Primer-definierte Längenpolymorphismen" (oder PDLP), wie hier verwendet, bezieht sich auf Unterschiede in der Länge amplifizierter DNA-Sequenzen, die zurückzuführen sind auf Insertion oder Deletion in der Intronregion des in der amplifizierten DNA-Sequenz enthaltenen Genorts.

Der Ausdruck „HLA-DNA", wie hier verwendet, bezeichnet DNA, welche die Gene, die für HLA-Antigene codieren, enthält. HLA-DNA wird in allen Zellkern-enthaltenden menschlichen Zellen gefunden. Primer:

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Amplifikatlon ausgewählter Intronregionen genomischer DNA. Die Methodologie wird erleichtert durch die Verwendung von Primern, die selektiv DNA amplif izieren, die mit einem oder mehreren Allelen eines interessierenden Genorts assoziiert sind und nicht mit anderen Genorten.

Ein Genort-spezifisches Primerpaar enthält einen δ'-strumaufwärts-Primer, welcher das 5'-Ende der amplifizierten Sequenz durch Hybridisierung mit dem 5'-Ende der zu amplifizierenden Zielsequenz definiert, und einen 3'-stromabwärts-Primer, der dar· 3'-Ende der amplifizierten Sequenz durch Hybridisierung mit dem Komplement des 3'-Endes der zu amplifizierenden DNA-Sequenz definiert. Die Primer in dem Primerpaar hybridisieren unter den erfindungsgemäßen Bedingungen nicht mit DNA von anderen Genorten.

Jeder Primer des Genort-spezifischen Primerpaars hybridisiert mit mindestens einem AIIeI des zu amplifizierenden Genorts oder seinem Komplement. Ein Primerpaar kann für jedes AIIeI eines ausgewählten Genorts hergestellt werden, wobei das Primerpaar nur DNA des ausgewählten Genorts amplifiziert. Auf diese Weise können Kombinationen von Primerpaaren dazu verwendet werden, um genomische DNA eines besonderen Genorts zu amplifizieren, unabhängig davon, welches AIIeI in einer Probe vorhanden ist. Vorzugsweise amplifiziert das Primerpaar DNA von mindestens zwei, noch bevorzugter mehr als zwei Allelen eines Genorts. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Primerstellen konserviert und amplifizieren so alle Haplotypen. Jedoch werden Primerpaare oder Kombinationen davon, die sich spezifisch an die AIIeIe, die am häufigsten in einer speziellen Populationsgruppe vorkommen, binden, ebenfalls in Betracht gezogen.

Oie amplifizierte DNA-Sequenz, die durch die Primer definiert wird, enthält eine genügende Anzahl von Nukleotiden der Inkonsequenz, um zwischen mindestens zwei Allelen eines benachbarten Genorts zu unterscheiden und, vorzugsweise, um das AIIeI des Genorts zu identifizieren, welches in der Probe vorhanden ist. Für einige Zwecke kann die Sequenz auch so ausgewählt werden, daß sie genügend genetische Variationen enthält, um zwischen individuellen Organismen mit demselben AIIeI oder zwischen Haplotypen zu unterscheiden

Länge der Sequenz:

Die Länge der amplifizierten Sequenz, die erforderlich ist, um genügend genetische Variabilität zu enthalten, um damit die Unterscheidung zwischen allen Allelen eines Genorts zu ermöglichen, steht in direktem Verhältnis zum Ausmaß des Polymorphismus des Genorts (der Anzahl der AIIeIe). Das bedeutet, wenn die Anzahl der AIIeIe des untersuchten Genorts wächst, wächst auch die Größe einer amplifizierten Sequenz, die genügend genetische Variationen enthält, um jedes AIIeI zu identifizieren. Bei einer speziellen Pooulationsgruppe können ein oder mehrere der identifizierten AIIeIe für irgendeinen gegebenen Genort bei dieser Gruppe fehlen und brauchen bei der Bestimmung einer Sequenz, welche genügend Variabilität für diese Gruppe enthält, nicht berücksichtigt zu werden. Bequemerweise werden die Primerpaare jedoch so ausgewählt, daß sie eine DNA-Sequenz amplifizieren, welche ausreicht, um zwischen allen identifizierten Allelen des untersuchten Genorts zu unterscheiden. Dieselben Überlegungen treffen zu, wenn ein Haplotyp bestimmt wird.

Beispielsweise ist der am geringsten polymorphe HLA-Genort DPA, welcher gegenwärtig vier identifizierte AIIeIe aufweist. Für diesen Genort enthält ein Primerpaar, welches nur einen Teil des variablen Exons, das für die Allervariation codiert, amplifiziert, genügend genetische Variabilität, um zwischen den Allelen zu unterscheiden, wenn die Primerstellen sich in einer geeigneten Region des variablen Exons befinden. Exonlimitierte Primer können dazu verwendet werden, um eine amplifizierte Sequenz zu Produkten zu erzeugen, die nur ungefähr 200 Nukleotide (nt) enthält. Wächst jedoch die Anzahl der AIIeIe des Genorts, so muß die Anzahl der genetischen Variationen in der Sequenz zunehmen, um alle AIIeIe zu unterscheiden. Die Addition von invarianten Exon-Sequenzen liefert keine zusätzliche genetische Variation. Wenn ungefähr acht oder mehr AIIeIe zu unterscheiden sind, wie beispielsweise für den DQA1 Genort und noch variablere Genorte, sollten sich die amplifizierten Sequenzen auf mindestens ein Intron im Genort erstrecken, vorzugsweise auf ein Intron, welches benachbart zu dem variablen Exon ist.

Darüber hinaus werden, wenn AIIeIo des Genorts existieren, die sich nur durch ein einzelnes Basenpaar im variablen Exon unterscheiden, Intronsequenzen in den amplifizierten Sequenzen eingeschlossen, um genügend Variabilität zur Unterscheidung der Adele zu eryeben. Beispielsweise differieren beim DQA1 Genort (mit gegenwärtig acht identifizierten Allelen) und beim DPB Genort (mit 24 Allelen) die AIIeIe DQA1.1/1.2 (jetzt als DQA1/0101/0102 bezeichnet) und DPB2.1/4.2 (jetzt als DPB0201/0402 bezeichnet) in einem einzigen Basenpaar. Um diese AIIeIe zu unterscheiden sind amplifizierte Sequenzen erforderlich, die eine Inironsequenzregion einschließen. Ungefähr 300 bis 500 Nukleotide sind ausreichend, abhängig vom Ort der Sequenz. Das bedeutet, 300 bis 500 Nukleotide, die hauptsächlich Intronsequenznukleotide umfassen, die sich genüpend nahe am variablen Exon befinden, sind ausreichend.

Bei Genorten mit noch umfangreicheren Polymorphismen (wie z.B. DQB mit gegenwärtig 14 identifizierten Allelen, DPB mit gegenwärtig 24 identifizierten Allelen, DRB mit 34 gegenwärtig identifizierten Allelen und jedem Genort der Klasse I) müssen die amplifizierten Sequenzen größer sein, um genügend Variabilität zu liefern, um zwischen allen Allelen zu unterscheiden. Eine amplifizierte Sequenz, die mindestens ungefähr 0,5 Kilobasen (Kb), vorzugsweise mindestens ungefähr 1 Kb, am bevorzugtesten mindestens ungefähr 1,5Kb enthält, liefert im allgemeinen eine genügend große Anzahl vco Restriktionsstellen für Genorte mit ausgedehnten Polymorphismen. Die amplifizierten Sequenzen, die zur Charakterisierung von in hohem Grad hochpolymorphen Genorten verwendet werden, haben im allgemeinen eine Länge von ungefähr 800 bis ungefähr 2 000 Nukleotiden (nt), vorzugsweise ungefähr 1000 bis ungefähr 1800 Nukleotiden.

Wenn Informationen über einen Haplotypus, betreffend entfernte AIIeIe, gewünscht wird, haben die Sequenzen im allgemeinen eine Länge von ungefähr 1000 bis ungefähr 2000 Nukleotiden. Längere Sequenzen sind erforderlich, wenn die amplifizierte Sequenz hochko- servierte Regionen umfaßt, wie z. B. Exons oder hochkonservierte Intronregionen, beispielsweise Promotoren, Operatoren una andere regulatorische DNA-Regionen. Längere amplifizierte Sequenzen (enthaltend mehr Intronnukleotidsequenzen) sind auch erforderlich, wenn die Distanz zwischen den amplifizierten Sequenzen und dem nachzuweisenden AIIeI wächst.

Hochkonservierte Regionen, die in der amplifizierten DNA-Sequenz enthalten sind, wie z. B. Exon-Sequenzon oder hochkonservierte Intronsequenzen (z. B. Promotoren, Enhancer oder andere regulatorische Regionen) können wenig oder keine genetischen Variationen liefern. Deshalb tragen solche Regionen nicht oder nur minimal zu den genetischen Variationen bei, die in der amplifizierten DNA-Sequenz vorhanden sind. Wenn solche Regionen in der amplifizierten DNA-Sequenz enthalten sind, können im Vergleich zu einer amplifizierten DNA-Sequenz derselben Länge, die nur Intronsequenzen enthält, zusätzliche Nukleotide erforderlich sein, um genügend genetische Variationen zu umfassen, um damit die AIIeIe zu unterscheiden. Ort der amplifizierten DNA-Sequenz

Die amplifizierte DNA-Sequenz befindet sich in einer Region genomischer DNA, welche genetische Variationen enthält, die sich in genetischer Kopplung mit dem nachzuweisenden AIIeI befindet. Vorzugsweise befindet sich die Sequenz in einer Intronsequenz, die benachbart zu einem Exon des Genorts ist. Noch bevorzugter enthält die amplifizierte Sequenz eine intervenierende Sequenz, die benachbart zu einem Exon ist, welches für die Allelvariabilität codiert, die mit dem Genort assoziiert ist (ein variables Exon). Die Sequenz enthält vorzugsweise mindestens einen Teil von einem der Introns, die benachbart zu einem variablen Exon liegen und kann ein Teil des variablen Exons enthalten. Wenn zusätzliche Sequenzinformation erforderlich ist, umfaßt die amplifizierte DNA-Sequenz vorzugsweise ein variables Exon und alle oder einen Teil der beiden benachbarten Intronsequenzen.

Als Alternative kann sich die amplifizierte Sequenz in einem Intron befinden, welches nicht an ein Exon des Genorts angrenzt. Solche Introns sind in den das Gen stromaufwärts oder stromabwärts flankierenden Regionen oder sogar in einer intervenierenden Sequenz in einom anderen Genort, welcher sich im Kopplungsungleichgewicht mit dem nachzuweisenden AIIeI befindet, lokalisiert.

Für manche Genorte mögen genomische DNA-Sequenzen nicht verfügbar sein. Wenn nur cDNA-Sequenzen verfügbar sind, und Stellen für Introns innerhalb der Sequenz nicht identifiziert sind, werden Primer in Abständen von ungefähr 200 Nukleotiden ausgewählt und dazu benutzt, genomische DNA zu amplifizieren. Wenn die amplifizierte Sequenz ungefähr 200 Nukleotide enthält, verlegt man die Stelle des ersten Primers ungefähr 200 Nukleotide zu einnr Seite der zweiten Primerstelle hin und die Amplifizierung wird wiederholt bis entweder (1) eine amplifizierte DNA-Sequenz, die größer als erwartet ist, erzeugt wird, oder (2) keine amplifizierte DNA-Sequenz erzeugt wird. In jedem Fall ist der Ort einer Intronsequenz bestimmt worden. Dieselbe Methodologie kann verwendet werden, wenn nur die Sequenz einer Markerstelle verfügbar ist, welche in hohem Grad mit dem Genort gekoppelt ist, wie es bei vielen mit vererbten Krankheiten assoziierten Genen der Fall ist.

Wenn die amplifizierte DNA-Sequenz nicht das ganze Intron oder einen Teil davon enthält, welches benachbart zu dem/den Exon(s) ist, muß die Sequenz auch einer zweiten Forderung genügen. Die amplifizierte Sequenz muß sich nahe genug an dem/den variablen Exon(s) befinden, um Rekombination und den Verlust des Kopplungsungleichgewichts zwischen der amplifizierten Sequenz und dem/den variablen Exon(s) auszuschließen. Dieser Forderung wird genügt, wenn sich die Regionen der genomischen DNA innerhalb ungefähr 5Kb, vorzugsweise innerhalb 4Kb, am bevorzugtesten innerhalb 2Kb, von den variablen Exon(s) befinden. Die amplifizierte Sequenz kann sich außerhalb des Genorts befinden, aber sie ist vorzugsweise innerhalb des Genorts.

Vorzugsweise enthält bei jedem Primerpaar die amplifizierte DNA-Sequenz, die durch die Primer definiert wird, mindestens 200 Nukleotide und bevorzugter mindestens 400 Nukleotide einer intervenierenden Sequenz, die benachbart ist zu dem/den variablen Exon(s). Obwohl das variable Exon üblicherweise weniger Variationen in einer gegebenen Anzahl von Nukleotiden ergibt als eine benachbarte intervenierende Sequenz, liefert jede dieser Variationen Allel-relevante Information. Deshalb bietet der Einschluß eines variablen Exons einen Vorteil.

Da die PCR-Methodologie dazu benutzt werden kann, um Sequenzen von mehreren Kb zu amplifizieren, können die Primer so lokalisiert werden, daß zusätzliche Exons oder intervenierende Sequenzen in der amplifizierten Sequenz enthalten sind. Natürlich wird durch die erhöhte Größe der amplifizierten DNA-Sequenz die Wahrscheinlichkeit eines Fehlers bei der Replikation vergrößert, so daß die Addition von invarianten Regionen einige Nachteile mit sich bringt. Jedoch ist es weniger wahrscheinlich, daß sich diese Nachteile auf eine Analyse, die auf der Länge der Sequenz oder des RFLP-Fragmentmusters basiert, auswirken, als auf eine Analyse, die auf der Sequenzierung des Amplifizierungsprodukts beruht. Bei besondei an Allelen, speziell solchen mit sehr ähnlichen Exon-Sequenzen, können amplifiziei *.e Sequenzen, die größer als ungefähr 1 oder 1,5 Kb sind, nötig sein, um zwischen allen Allelen eines speziellen Genorts zu unterscheiden.

Die Enden der amplifizierten DNA-Sequenz werden durch das bei der Amplification verwendete Primerpaar definiert. Jede Primersequenz muß einer konservierten Region der genomischen DNA-Sequenz entsprechen. Deshalb wird der Ort der amplifizierten Sequenz in gewissem Ausmaß von der Notwendigkeit diktiert sein, die Primer in konservierten Regionen zu lokalisieren. Wenn genügend Intronsequenz-Informatlon zur Bestimmung konservierter Intronregionen nicht verfügbar ist, können die Primer in konservierten Teilen der Exons lokalisiert und dazu verwendet werden, Intronsequenzen zwischen diesen Exons zu amplifizieren.

Wenn an geeigneten Stellen gelegene konservierte Sequenzen nicht nur bei diesem Genort vorkommen, kann ein zweiter Primer, der innerhalb der amplifizierten Sequenz, welche durch das erste Primerpaar erzeugt wurde, lokalisiert ist, dazu benutzt werden, um eine amplifizierte DNA-Sequenz zu liefern, die spezifisch für den Genort Ist. Mindestens einer der Primor des zweiten Primerpaars befindet sich In einer konservierten Region der amplifizierten DNA-Sequenz, die durch das erste Primerpaar definiert wird. Das zweite Primerpaar wird nach der Amplifikatlon mit dem ersten Primerpaar benutzt, um einen Teil der amplifizierten DNA-Sequenz, welche das erste Primerpaar erzeugt hat, zu amplifizieren.

Es gibt drei H lupttypen genetischer Variationen, die nachgewiesen und zur Identifizierung eines AIIeIs benutzt werden können. Diese Variationen sind, in der Reihenfolge der Einfachheit des Nachweises, (1) eine Änderung in der Länge der Sequenz, (2) eine Änderung in Anwesenheit oder Ort von mindestens einer Restriktionsstelle und (3) die Substitution eines oder einiger weniger Nukleotide, welche nicht in einer Änderung einer Restriktionsstelle resultiert. Andere Variationen innerhalb der amplifizierten DNA-Sequenz sind ebenfalls nachweisbar.

Es gibt drei Arten von Techniken, die zum Nachweis der Variationen benutzt werden können. Die erste ist das Sequenzieren der amplifizierten DNA-Sequenz. Sequenzieren ist die zeitraubendste und auch die aufschlußreichste analytische Methode, da sie jede Art genetischer Variationen in der amplifizierten Sequenz nachweist. Die zweite analytische Methode verwendet AIIeI-spezifische Oligonukleotide oder Sequenz-spezifische Oligonukleotide (ASO- oder SSO-Sonden). Die Sonden können einzelne Nukleotidveränderungan nachweisen, die in irgendeiner der Arten von genetischer Variation resultieren, so lange die exakte Sequenz der variablen Stelle bekannt ist. Eine dritte analytische Methode weist Sequenzen verschiedener Länge nach (z. B. aufgrund einer Insertion oder Deletion oder einer Änderung des Orts einer Restriktionsstelle) und/oder eine unterschiedliche Anzahl von Sequenzen (aufgrund entweder des Hinzukommens oder des Verlusts von Restriktionsstellen). Eine bevorzugte Nachweismethode ist die Gel- oder Kapillarelektrophorese. Um Änderungen in den Längen von Fragmenten oder der Anzahl von Fragmenten aufgrund von Änderungen von Restriktionsstellen nachzuweisen, muß die amplifizierte Sequenz mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease in Fragmente gespalten werden, bevor die Analyse des Fragmentlängenmusters durchgeführt werden kann.

Die erste genetische Variation ist eine Differenz in der Länge der durch die Primer definierten amplifizierten DNA-Sequenz, hier als Primer-definierter Längenpolymorphismus (PDLP) bezeichnet, wobei dieser Längenunterschied zwischen mindestens zwei Allelen des Genorts unterscheidet. Die PDLPs resultieren aus Insertionen oder Deletionen von großen Strecken (im Vergleich zur Gesamtlänge der amplifizierten DNA-Sequenz) von DNA in dem Teil der Intronsequenz, die durch das Primerpaar definiert ist. Um PDLPs nachzuweisen, ist die amplifizierte DNA-Sequenz in einer Region lokalisiert, die Insertionen oder Deletionen einer Größe enthält, die durch die gewählte Methode nachweisbar ist. Die amplifizierte DNA-Sequenz sollte eine Länge haben, die eine optimale Auflösung der Längendifferenzen ergibt. Bei der Elektrophorese ergeben DNA-Sequenzen mit einer Länge von ungefähr 300 bis 500 Basen eine optimale Auflösung der Längendifferenzen. Nukleotidsequenzen, deren Längen um bis zu nur 3 Nukleotiden, vorzugsweise 25 bis 50 Nukleotiden, differieren, können unterschieden werden. Jedoch sind auch bis zu 800 bis 2000 Nukleotide lange Sequenzen, die um mindestens ungefähr 50 Nukleotid-Längen differieren, ebenfalls leicht unterscheidbar. Die Gel-Elektrophorese und die Kapillarelektrophorese haben ähnliche Grenzen der Auflösung. Vorzugsweise sind die Längendifferenzen zwischen amplifizierten DNA-Sequenzen mindestens 10, bevorzugt 20, am bevorzugteste- 50 oder mehr, Nukleotide zwischen den Allelen. Vorzugsweise ist die amplifizierte DNA-Sequenz zwischen 300 und 1000 Nukleotide lang und enthält Längendifferenzen von mindestens 3, vorzugsweise 10 oder mehr Nukleotiden.

Vorzugsweise ist die amplifizierte Sequenz in einem Gebiet lokalisiert, welches für PDLP Sequenzen liefert, die die meisten oder alle AIIeIe eines Genorts unterscheiden. Ein Beispiel der Identifizierung von fünf der acht DQAI-AIIeIe auf der Basis von PDLP ist detailliert in den Beispielen beschrieben.

Wenn die nachzuweisende Variation eine Änderung in einer Restriktionsstelle ist, enthi.1t die amplifizierte DNA-Sequenz notwendigerweise mindestens eine Restriktionsstelle, die (1) in einem AIIeI anwesend ist und nicht in einem anderen, (2) offensichtlich in einer verschiedenen Position in der Sequenz von mindestens zwei Allelen lokalisiert ist, oder (3) Kombinationen davon. Die amplifizierte Sequenz wird vorzugsweise so lokalisiert sein, daß die Spaltung durch die Restriktionsendonuklease Fragmente von nachweisbar verschiedenen Längen anstatt zweier oder mehrerer Fragmente von ungefähr derselben Länge erzeugt.

Zum Nachweis von Alleldifferenzen durch ASO- oder SSO-Sonden enthält die amplifizierte DNA-Sequenz eine Region von ungefähr 200 bis 400 Nukleotiden, die in einem oder mehreren Allelen anwesend ist und in einem oder mehreren anderen Allelen nicht anwesend ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die Sequenz eine durch eine Sonde nachzuweisende Region, die nur auf einem AIIeI des Genorts anwesend ist. Jedoch können auch Kombinationen von Sonden, die mit einigen Allelen reagieren und nicht mit anderen, verwendet werden, um die AIIeIe zu charakterisieren. Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird in Betracht gezogen, daß die Verwendung von mehr als einer amplifizierten DNA-Sequenz und/oder die Verwendung von mehr als einer analytischen Methode pro amplifizierter DNA-Sequenz bei sehr stark polymorphen Genorten, insbesondere bei Genorten, bei denen die AIIeIe in einzelnen Nukleotidsubstitutionen differieren, die nicht nur auf diesem AIIeI vorkommen, oder wenn die Information bezüglich entfernter AIIeIe (Haplotypen) gewünscht wird, erforderlich sein kann. Insbesondere kann es nötig sein, eine PDLP-Analyse mit einer RFLP-Analyse zu kombinieren, zwei oder mehr amplifizierte DNA-Sequenzen, die in verschiedenen Positionen lokalisiert sind, zu verwenden, oder eine einzelne amplifizierte DNA-Sequenz mit einer Vielzahl von Endonukleasen zu spalten, um alle AIIeIe von einigen Genorten zu unterscheiden. Diese Kombinationen sollen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung eingeschlossen sein. Beispielsweise werden in der Analyse der Haplotypen dos DQA1-Genorts, die in den Beispielen beschrieben ist, PDLP- und RFLP-Analysen unter Verwendung von DNA-Fragmentgemischen von drei verschiedenen Enzymen benutzt, um die acht AIIeIe und 20 der 32 Haplotypen des Genorts zu unterscheiden.

LSnge und Sequenzhomologie von Pri.nern

Jeder Genort-spezifische Primer enthält eine Anzahl von Nukleotlden, welche unter den Bedingungen, die bei dar Hybridisierung benutzt werden, ausreichen, um ein AIIeI des zu ampliflzlerenden Genorts zu hybridisieren und keine Hybridisierung mit Allelen anderer Genorte ergeben. Diu Spezifität des Primers wächst mit der Anzahl der Nukleotide in sein»' Sequenz unter Bedingungen, welche dieselbe Stringenz liefern. Deshalb sind längere Primer wünschenswert. Bei Sequenzen mit weniger als 15 Nukleotiden Ist es weniger sicher, daß sie spezifisch für einen bestimmten Genort sind. Das heißt, bei Sequenzen mit weniger als 15 Nucleotiden ist es im umgekehrten Verhältnis zur Länge der Nukleotidsequenz wahrscheinlich, daß sie in einem Teil der DNA anwesend sind, der mit anderen Genorten assoziiert ist, Insbesondere mit Genorten mit einem anderen gemeinsamen Ursprung oder mit einem evolutionsmäßig nahe verwandten Ursprung.

Jeder Primer enthält vorzugsweise mindesten.« ungefähr 15 Nukleotide, bevorzugter mindestens ungefähr 20 Nukleotide. Der Primer geht vorzugsweise nicht über ungefähr 30 Nukleotide, noch bevorzugter nicht über ungefähr 25 Nukleotide hinaus. Am bevorzugtesten haben die Primer zwischen ungefähr 20 und ungefähr 25 Nukleotide.

Eine Anzahl bevorzugter Primer wird hier beschrieben. Jeder dieser Primer hybridisiert mit mindestens ungefähr 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der vorgegebenen Region der Allelstnuenz. Bei vielen der Primer ist die Sequenz nicht identisch für alle der anderen AIIeIe des Genorts. Für jeden dieser Primer gibt es zusätzliche bevorzugte Primer mit Sequenzen, die den Sequenzen der homologen Region von anderen Allelen des Genorts oder deren Komplementen entsprechen.

Wenn zwei Sätze von Primerpaaren nacheinander benutzt werden, wobei das zweite Primerpaar das Produkt des ersten Primerpaars amplifiziert, können die Primer dieselbe Größe haben wie diejenigen, die Mr die erste Amplifizierung benutzt wurden. Jedoch können auch kleinere Primer bei der zweiten Amplifizierung benutzt werdqn und liefern die erforderliche Spezifität. Diese kleineren Primer können, wenn gewünscht, Allel-spezifisch ausgewählt werden. Die Primer des zweiten Primerpaars können 15 oder weniger, vorzugsweise 8 bis 12, bevorzugter 8 bis 10, Nukleotide haben. Wenn zwei Sätze von Primerpaaren verwendet werden, um zwei amplifizierte Sequenzen zu erzeugen, wird die zweite amplifizierte DNA-Sequenz in der nachfolgenden Analyse der genetischen Variation verwendet und muß die Forderungen erfüllen, die oben für die amplifizierte DNA-Sequenz diskutiert wurden.

Die Primer haben vorzugsweise eine Nukleotidsequenz, die identisch ist mit einem Teil der zu amplifizierenden DNA-Sequenz oder ihrem Komplement. Jedoch kann auch oin Primer mit zwei Nukleotiden, die sich von der Ziel-DNA-Sequenz oder ihrem Komplement unterscheiden, verwendet werden. Nukleotide, die nicht identisch sind mit der Sequenz oder ihrem Komplement, sind vorzugsweise nicht am 3'-Ende des Primers lokalisiert. Das 3'-Ende des Primers hat vorzugsweise mindestens zwei, bevorzugter drei oder mehr Nukleotide, die komplementär sind zu der Sequenz, an die der Primer bindet. Nukleotide, die nicht identisch sind mit der zu amplifizierenden Sequenz oder ihrem Komplement sind in der Primersequenz vorzugsweise nicht benachbart. Noch bevorzugter sind nicht-komplementäre Nukleotide in der Primersequenz durch mindestens drei, noch bevorzugter mindestens fünf Nukleotide getrennt. Die Primer sollten eine Schmelztemperatur (T_m) von ungefähr 55 bis 75⁰C haben. Vorzugswelse beträgt die Schmelztemperatur ungefähr 60°C bis ungefähr 65°C, um stringente Amplifizierungsbedingungen zu erleichtern.

Die Primer können hergestellt werden durch Verwendung einer Anzahl von Methoden wie z. B. die Phosphotriester- oder Phosphodiestermethoden oder automatisierte Ausführungsformen davon. Die Phosphodiester- und Phosphotriestermethodqn sind beschrieben in Cruthers, Science, Band 230, Seiten 281-285 (1985); Brown et al., Meth. Enzymol., Band 68, Seite 109 (1979); und Nrang et al., Meth. Enzymol., Band 68, Seite 90 (1979). Bei einer der automatisierten Methoden werden Diethylphosphoramidite, die wie von Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22, Seiten 1859-1962 (1981) beschrieben, synthetisiert werden, als Ausgangsmaterial verwendet. Ein Verfahren zur Synthese « on Primer-Oligonukleotidsequenzen auf einem modifizierten festen Träger wird in der US-Patentschrift Nr.4458066 beschrieben.

Beispielhafte Primersequenzen zur Analyse von Klasse I und Klasse Il HLA Genorten, Rinderleukozytenantigenen und zystischer Fibröse worden unten beschrieben.

Amplifizierung

Die Genort-spezifischen Primer werden in einem Amplifizierungsverfahren verwendet, um eine genügend große Menge DNA für die Analysemethode zu erzeugen. Zur Erzeugung von RFLP Fragmentmustern oder PDLP-Mustern, die durch Elektrophorese analysiert werden, sind ungefähr 1 bis ungefähr 500ng DNA erforderlich. Eine bevorzugte Amplifizierur.ns;iethode ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). PCR-Amplifizierungsmethoden sind beschrieben in den US-Patentsch.if<en Nr.4683195 und 4683194; Saiki et al., Science, Band 230, Seiten 1350-1354 (1985); Schärfet al., Science, Band 324, Seite 163-166 (1986); Kogan et al., New England J. Med., Band 317, Seiten 985-990 (1987) und Saiki, Gyllensten und Erlich, The Polymerase Chain Reaction in Genome Analysis: A Practical Approach, Herausg. Davies, Seiten 141-152 (1988) I. R. L. Press, Oxford.

Vor der Amplifikation wird eine Probe der DNA des individuellen Organismus erhalten. Alle Zellkern-enthaltenden Zellen enthalten genomische DNA und sind deshalb potentielle Quellen für die erforderliche DNA. Bei höheren Tieren werden üblicherweise eher periphere Blutzellen als Gewebeproben verwendet. Bereits 0,01 bis 0,05ml peripheres Blut liefert genügend DNA zur Amplifizierung. Haar, Samen und Gewebe können ebenfalls als Proben verwendet werden. Im Fall der Föten-Analyse, können Placenta-Zellen oder fötale Zellen, die im Fruchtwasser vorhanden sind, verwendet werden. Die DNA wird aus den Zellkern-enthaltenden Zellen unter Bedingungen isoliert, die den DNA-Abbau minimieren. Üblicherweise beinhaltet die Isolation den Verdau der Zellen mit einer Protease, die DNA nicht angreift, bei einer Temperatur und einem pH, welche die Wahrscheinlichkeit von DNase-Aktivität reduzieren. Bei peripheren Blutzellen ist die Lyse der Zellen mit einer hypotonischen Lösung (Wasser) ausreichend, um die DNA freizusetzen.

Die DNA-Isolierung aus Zellkern-enthaltenden Zellen wird beschrieben von Kan et al., N. Engl. J. Med., Band 297, Selten 1080-1084 (1977); Kan et al., Nature, Band 251, Seiten 392 bis 393 (1974); und Kan et al., PNAS, Band 75, Seiten 5631-5635 (1978). Extraktionsverfahren für Proben, wie z.B. Blut, Samen, Haarfollikel, Schleimhautepithel und anderen Quellen genomischer DNA sind wohlbekannt. Bei Pflanzenzellen setzt die Verdauung der Zellen mit Cellulase die DNA frei. Danach wird die DNA wie oben beschrieben gereinigt.

Die extrahierte DNA kann durch Dialyse, Chromatographie und andere bekannte Methoden zur Reinigung von Polynukleotiden

vor der Amplifizierung gereinigt werden. Üblicherweise wird die DNA vor der Amplifizierung nicht gereinigt.

Die amplifizierte DNA-Sequenz wird erzeugt durch Verwendung des Teils der DNA und ihres Komplements, welcher vom Primerpaar als Templat (Matrize) gebunden wird. Als erster Schritt des Verfahrens werden die DNA-Stränge in Einzelstrang-DNA aufgetrennt. Diese Strangtrennung kann durch eine Reihe von Methoden, welche physikalische oder chemische Mittel

einschließen, erreicht werden. Eine bevorzugte Methode ist die physikalische Methode zur Trennung der Stränge durch Erhitzen der DNA, bis sie im wesentlichen (ungefähr zu 93%) denaturiert Ist. Die Hitze-Denaturierung geschieht bei Temperaturen von ungefähr 80"C bis 105⁰C für Zeiten von ungefähr 16 bis 30 Sekunden. Üblicherwelse Ist das Erhitzen der DNA auf eine Temperatur von 90 bis 93⁰C für ungefähr 30 Sekunden bis ungefähr 1 Minute ausreichend.

Das oder die erzeugten Primer-Verlängerungsprodukte sind komplementär zu der Primer-definierten Region der DNA und hybridisieren damit, um einen Doppelstrang von Strängen gleicher Länge zu bilden. Die Doppelstränge der Verlängerungsstruktur und ihre Matrizen werden dann in Einzelstrang-DNA getrennt. Wenn die komplementären Stränge der Doppelstränge getrennt sind, sind die Stränge bereit, um als Matrize für den nächsten Synthesezyklus von weiteren DNA; Strängen verwendet zu werden.

Jeder der Syntheseschritte kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die geeignet sind zur DNA-Amplifizierung. Im allgemeinen wird dor Amplifizierungsschritt in einer gepufferten wäßrigen Lösung, vorzugsweise bei einem pH von ungefähr 7 bis ungefähr 9, bevorzugter bei ungefähr pH8 durchgeführt. Ein geeigneter Ampliflzierungspuffer enthält TrIs-HCI als Puffer in einem Konzentrationsbereich von ungefähr 10 bis ungefähr 10OmM. Der Puffer enthält auch ein einwertiges Salz, vorzugsweise bei einer Konzentration von mindestens ungefähr 1OmM und nicht mehr als ungefähr 6OmM. Bevorzugte einwertige Salze sind KCI, NaCI und (NH₄)ISO₄. Der Puffer enthält auch Magnesiumchlorid mit einer Konzentration von ungefähr 5 bis 6OmM. Andere Puffersysteme, wie z. B. Hepes oder Glycin-NaOH und Kaliumphosphatpuffer können verwendet werden. Üblicherwelse beträgt das Gesamtvolumen der Reaktionsmischung der Amplifizierung ungefähr 50 bis 100 μΙ.

Vorzugsweise wird für genomische DNA ein molarer Überschuß von ungefähr 10^e: 1 PrIm ar !Matrize des Primerpaars zum Puffer zugegeben, der die getrennten DNA-Matrizenstränge enthält. Ein großer molarer Überschuß der Primer verbessert die Effizienz des Amplifizierungsprozeßes. Im allgemeinen werden ungefähr 100 bis 150ng von jedem Primer zugegeben. Die Deoxyribonukleotid-Triphosphate, dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden zur Amplifizierungsmlschung ebenfalls In einer Menge zugegeben, die ausreicht, um die amplifizierten DNA-Sequenzen zu erzeugen. Vorzugsweise sind die dNTPs in einer Konzentration von ungefähr 0,75 bis 4,OmM anwesend, bevorzugter ungefähr 2,OmM. Die resultierende Lösung wird auf ungefähr 90 bis 93⁰C für ungefähr 30 Sekunden bis ungefähr 1 Minute erhitzt, um die DNA-Strange zu trennen. Nach dieser Erhitzungszeit wird die Lösung auf die Temperatur zur Amplifizierung abgekühlt.

Nach der Trennung der DNA-Stränge läßt man die Primer mit den Strängen verschmelzen. Die Verschmelztemperatur variiert mit der Länge und dem GC-Gehalt der Primer. Diese Variablen werden durch die T_m eines jeden Primers reflektiert. Beispielhafte erfindungsgemäße HLA DQA1 Primer, wie unten beschrieben, erfordern Temperaturen von ungefähr 55°C. Die beispielhaften erfindungsgemäßen HLA Klasse I Primer verlangen etwas höhere Temperaturen von ungefähr 62 bis ungefähr 68⁰C. Der Reaktionsschritt zur Verlängerung wird nach dem Verschmelzen der Primer mit der genomischon DNA durchgeführt. Ein geeignetes Reagenz zur Induktion oder zur Katalyse der Primerverlängerungsreaktion wird zur Amplifizierungsmischung entweder vor oder nach der Strangtrennung (Denaturierung) zugegeben, abhängig von der Stabilität des Reagenzes unter den Denaturierungsbedingungen. Die DNm .Synthesereaktion läßt man unterden Im Stand derTechnikwohlbekannten Bedingungen ablaufen. Diese Synthesereaktion (Primerverlängerung) kann in einem Bereich von Raumtemperatur bis zu einer Temperatur, oberhalb welcher die Polymerase nicht mehr effizient arbeitet, ablaufen. Erhöhung der Amplifizierungstemperatur erhöht die Stringenz der Reaktion. Wie schon vorher festgestellt, sind stringente Bedingungen notwendig, um sicherzustellen, daß die amplifizierte Sequenz und die Sequenz der DNA-Matrize dieselbe Nukleotidsequenz enthalten, da die Substitution von Nukleotiden die Restriktionsstellen oder die Sonden-Bindungsstellen in einer amplifizierten Sequenz ändern kann. Das induzierende Reagenz kann jede Verbindung oder jedes System sein, welches die Synthese von Primerverlängerungsprodukten erleichtert, vorzugsweise Enzyme. Geeignete Enzyme für diesen Zweck umfassen DNA-Polymerasen (wie z. B. E. coli DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I₁T4 DNA Polymerase), reverse Transcriptase und andere Enzyme (einschließlich hitzestabiler Polymerasen), welche in geeigneter Weise die Kombination der Nukleotide zur Bildung der Primerverlängerungsprodukte erleichtern. Besonders bevorzugt sind Taq-Polymerase oder andere hitzestabile Polymerasen, welche die DNA-Synthese bei erhöhten Temperaturen erleichtern (ungefähr 60 bis 9O⁰C). Die Taq-Polymerase wird z.B. beschrieben bei Chien et al., J.Bacteriol., Band 127, Seiten 1550-1557 (1976). Wenn der Verlängerungsschritt bei ungefähr 72⁰C durchgeführt wird, ist etwa 1 Minute zur Vervielfältigung von jeweils 1000 Basen der Ziel-DNA nötig. »

Die Synthese der amplifizierten Sequenz wird am 3'-Ende eines jeden Primers Initiiert und schreitet in Richtung des 5'-Endes der Matrize, entlang des DNA-Stranges fort, bis die Synthese abbricht, wobei DNA-Sequenzen verschiedener Länge erzeugt werden. Der neue synthetisierte Strang und sein Komplementärstrang bilden ein doppelstränglges Molekül, welches in den nachfolgenden Schritten des Verfahrens benutzt wird. Im nächsten Schritt werden die Stränge des doppelsträngigen Moleküls getrennt (denaturiert), wie oben beschrieben, um Einzelstrangmoleküle zu liefern.

Neue DNA wird auf den einzelsträngigen Matrizenmolekülen synthetisiert. Zusätzliche Polymerase, Nukleotide und Primer können, wenn nötig, zugefügt werden, um die Reaktion unter den oben beschriebenen Bedingungen fortschreiten zu lassen. Nach diesem Schritt besteht die Hälfte des Verlängerungsprodukts aus der amplifizierten Sequenz, die an die zwei Primer gebunden ist. Die Schritte der Strangtrennung und der Synthese des Verlängerungsprodukts können so oft wiederholt werden wie nötig, um die gewünschte Menge an amplifizierter DNA-Sequenz zu erzeugen. Die Menge der erzeugten amplifizierten Sequenz wächst exponentiell an. Üblicherweise sind ungefähr 25 bis 30 Zyklen ausreichend, um eine zur Analyse geeignete Menge an amplifizierter DNA-Sequenz zu erzeugen.

Die Amplifizierungsmethode kann schrittweise durchgeführt werden, wobei nach jedem Schritt neue Reagenzien zugefügt werden, oder simultan, wobei alle Reagenzien im Anfangsschritt hinzugefügt werden, oder zum Teil schrittweise und zum Teil simultan, wobei frisches Reagenz nach einer bestimmten Anzahl von Schritten zugefügt wird. Die Reaktionsmischung zur Amplifizierung kann zusätzlich zur genomischen Proben-DNA die vier Nukleotide, das Primerpaar in einem molaren Überschuß und das induzierende Reagenz, z. B. Taq-Polymerase, enthalten.

Jeder Schritt des Verfahrens geschieht der Reihe nach, trotz der anfänglichen Anwesenheit aller Reagenzien. Zusätzliche Materialien können hinzugefügt werden, wenn nötig. Üblicherweise wird die Polymerase nicht ergänzt, wenn eine hitzestabile Polymerase verwendet wird. Nach einer geeigneten Anzahl von Zyklen, um die gewünschte Menge der amplifizierten Sequenz zu erzeugen, kann die Reaktion gestoppt werden durch Inaktivierung der Enzyme, Trennung der Komponenten der Reaktion oder Beenden der thermischen Zyklen.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfaßt die Amplifizlerung die Verwendung eines zweiten Primerpaares, um eine zweite Amplifizierung nach der ersten Amplifizierung durchzuführen. Das zweite Primerpaar definiert eino DNA-Sequenz, die Teil der ersten amplifizierten Sequenz ist. Das heißt/ mindestens einer der Primer des zweiten Primerpaares definiert ein Ende der zweiten amplifizierten Sequenz, welches sich Innerhalb der Enden der ersten amplifizierten Sequenz befindet. Auf diese Weise hilft die Verwendung des zweiten Prlmerpaares sicherzustellen, daß jegliche amplif izierte Sequenz, die in der zweiten Amplif izierungsreaktion erzeugt wird, spezifisch Ist für den untersuchten Genort. Das bedeutet, daß es bei Nicht-Zielsequenzen, welche von einem Genort-spezlfischen Paar kopiert werden können, unwahrscheinlich ist, daß sie Sequenzen enthalten, die mit einem zweiten Genort-spezifischen Primerpaar hybridisieren, welches innerhalb der ersten amplifizierteh Sequenz lokalisiert ist.

In einer weiteren Ausführungsform ist das zweite Primerpaar spezifisch für ein AIIeI des Genorts. Auf diese Weise zeigt der Nachweis der Anwesenheit einer zweiten amplifizierten Sequenz an, daß das AIIeI in der Probe anwesend ist. Die Anwesenheit einer zweiten emplifizierten Sequenz kann festgestellt werden, indem man die Menge an DNA am Anfang und am Ende der zweiten Amplifizierungsreaktion bestimmt. Methoden zur Mengenbestimmung von DNA sind wohlbekannt und umfassen die Bestimmung der optischen Dichte bei 260nm (OD_2n) und vorzugsweise zusätzlich die Bestimmung des Verhältnisses der optischen Dichte bei 260 nm zur optischen Dichte bei 280 nm (OD₂eo/OD_2N), um die Menge an DNA im.Verglelch zum Protein in der Probe zu bestimmen.

Die Mischung für den ersten Amplifizierungoschritt wird vorzugsweise nur genügend Primer für eine begrenzte Anzahl von Primerverlängerungszyklen enthalten, z. B. weniger als 16, vorzugsweise ungefähr 10 bis 1,2 Zyklen, so daß die Menge der amplifizierten Sequenz, die durch das Verfahren produziert wird, ausreicht für die zweite Amplifizierung, aber die Feststellung, ob mit dem zweiten Primer eine Amplifizierung stattgefunden hat, nicht beeinträchtigt. Als Alternative kann die Amplifizierungsreaktion für weitere Zyklen fortgesetzt und die Mischung dann in Aliquots aufgeteilt werden, um angemessene Mengen an DNA für eine oder mehrere sekundäre Amplifizierungsreakiionen zu liefern. Ungefähr 100 bis 150ng eines jeden Primers des zweiten Primerpaars werden zur Amplifizierungs-Reaktionsmischung zugefügt. Der zweite Satz von Primern wird vorzugsweise nach den Anfangszyklen mit dem ersten Primerpaar hinzugefügt. Die Menge des ersten Primerpaars kann im Vergleich zum zweiten Primerpaar begrenzt werden, so daß nach dem Zufügen des zweiten Paares im wesentlichen alle amplifizierten Sequenzen vom zweiten Paar erzeugt werden.

Wie oben festgestellt, kann eine DNA Mengenbestimmung durchgeführt werden um festzustellen, ob im zweiten Amplifizierungsschritt eine amplifizierte Sequenz erzeugt wurde. Wenn Protein in der Reaktionsmischung die Mengenbestimmung beeinträchtigt (üblicherweise aufgrund der Anwesenheit von Polymerase) kann dio Reaktionsmischung gereinigt werden, z.B. durch Verwendung eines 100000-MW-Ausschlußfilters. Solche Filter sind im Handel erhältlich von Millipore und von Centricon.

Analyse der amplifizierten DNA-Sequenz

Wie oben erörtert, hängt die verwendete Methode zur Analyse der amplifizierten DNA-Sequenz zwecks Charakterisierung des oder der AIIeIe, die in der Proben-DNA anwesend sind, von der genetischen Variation in der Sequenz ab. Wenn die Unterschiede zwischen Allelen primerdefinierte Längenpolymorphismen einschließen, werden die amplifizierten Sequenzen aufgrund ihrer Länge getrennt, vorzugsweise unter Verwendung von Gel- oder Kapillarelektrophorese. Wenn zur Analyse die Hybridisierung mit Sonden verwendet wird, läßt man die amplifizierten Sequenzen mit markierten Sonden reagieren. Wenn die Analyse auf RFLP-Fragmentmustern basiert, werden die amplifizierten Sequenzen mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen in Fragmente gespalten, um ein Fragmentgemisch zu erzeugen, und die resultierenden Fragmente werden aufgrund ihrer Länge getrennt, vorzugsweise unter Verwendung von Gel- oder Kapillarelektrophorese. Wenn die einzige Variation innerhalb der amplifizierten Sequenz eine Sequenzvariation ist, die nicht zu einer Längenveränderung oder einer Änderung einer Restriktionsstelle führt und ungeeignet ist für den Nachweis durch eine Sonde, werden die amplifizierten DNA-Sequenzen sequenziert

Verfahren für jeden Schritt der verschiedenen analytischen Methoden sind wohlbekannt und werden im folgenden beschrieben.

Herstellung von RFLP-Fragmentmustern Restriktionsendonukleasen

Eine Restriktionsendonuklease ist ein Enzym, das DNA an einer bestimmten Nukleotidsequenz, genannt Restriktionsstelle, hydrolytisch^paltet oder schneidet. Sowohl Endonukleasen, die glatte DNA-Fragmente (die Hydrolyse der Phosphordiesterbindungen auf beiden DNA-Strängen geschieht an derselben Stelle) als auch Endonukleasen, die Fragmente mit cohäsiven Enden erzeugen (die Hydrolysestellen auf den Strängen sind durch ein paar Nukleotide voneinander getrennt), können verwendet werden.

Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich aus einer Anzahl von Quellen, einschließlich Sigma Pharmaceuticals, Bethesda Research Labs, Boehringer-Mannheim und Pharmacia. Wie oben erörtert, spaltet eine Restriktionsendonuklease, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, eine erfindungsgemäß amplifizierte DNA-Sequenz, um ein Fragmentgemisch zu produzieren, welches einen Satz von Fragmenten mit unterschiedlichen Fragmentlängen enthält. Insbesondere differieren die Fragmente für ein AIIeI eines Genorts in der Größe von Fragmenten anderer AIIeIe des Genorts. Die Muster, die durch Trennung und Sichtbarmachung der Fragmente einer Vielzahl solcher Fragmentgemische erzeugt werden, sind ausreichend, um jedes AIIeI des Genorts zu unterscheiden. Insbesondere werden die Endonukleasen so gewählt, daß durch die Verwendung mehrerer Fragmentgemische der amplifizierten Sequenz, vorzugsweise weniger als fünf, besonders bevorzugt zweier oder dreier Fragmentgemische, die AIIeIe eines Genorts unterschieden werden können.

Bei der Auswahl einer Endonuklease ist es wichtig, die Anzahl der Fragmente zu berücksichtigen, die für die amplifizierten Sequenzen der verschiedenen AIIeIe eines Genorts erzeugt werden. Insbesondere muß eine ausreichende Anzahl von Fragmenten erzeugt werden, um zwischen den Allelen zu unterscheiden und, wenn notwendig, dio Bestimmung der Individualität zu ermöglichen. Jedoch darf die Anzahl der Fragmente nicht so groß oder die Größenverteilung nicht so ähnlich sein, daß ein Fragmentmuster erzeugt wird, welches durch die spezielle Nachweismethode nicht unterscheidbar ist von dem anderer Haplotypen. Vorzugsweise haben die Fragmente für jedes AIIeI unterschiedliche Größen. Das heißt, für jedes von einer

Endonuklease erzeugte Fragmentgemisch einer speziellen amplifizlerten Sequenz differieren die Fragmente eines AIIeIs in der Größe vorzugsweise von den Fragmenten für jedes andere AIIeI des Genorts um mindestens 10, vorzugsweise 20, besonders bevorzugt 30, am bevorzugtesten 50 oder mehr Nukleotide.

Ein Durchschnittsfachmann kann leicht feststellen, ob eine Endonuklease RFLP-Fragmente mit unterscheidbaren Fragmentlängen erzeugt. Die Bestimmung kann experimentell durchgeführt werden durch Spalten einer amplifizlerten Sequenz eines jeden AIIeIs mit der ausgewählten Endonuklease auf die erfindungsgemäße Weise. Die Fragmentmuster können dann analysiert werden. Unterscheidbare Muster werden leicht zu identifizieren sein durch die Feststellung, ob der Vergleich von zwei oder mehr Fragmentmustern ausreichend ist, um charakteristische Differenzen zwischen den Mustern der AIIeIe aufzuzeigen. Die Anzahl der Fragmentgemische, die für eine besondere Analyse hergestellt werden müssen, wird von der gewünschten* Information und der speziellen Probe, die analysiert werden soll, abhängen. Da HLA-Analysen für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, die von Bestimmungen der Individualität In der Gerichtsmedizin und bei Feststellung der Vaterschaft bis zu Gewebebestimmung für Transplantationen reichen, soll der HLA-Komplex als Beispiel verwendet werden. Ein einzelnes Fragmentgemisch kann ausreichend sein, um festzustellen, daß ein Individuum nicht die Person sein kann, deren Blut am Ort eines Verbrechens gefunden wurde. Im allgemeinen jedoch, wenn die DNA-Proben sich nicht unterscheiden, wird die Verwendung von zwei bis drei Fragmentgemischen für jeden der zwei bis drei HLA-Genorte bei Anwendung zur Prüfung von Übereinstimmung (Gerichtsmedizin, Vaterschaft) ausreichend sein. Für eine komplette HLA-Bestimmung muß jeder Genort bestimmt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proben-HLA-DNA-Sequenzen in Aliquots aufgeteilt, die ähnliche Mengen an DNA pro Aliquot enthalten, und mit Primerpaaren (oder Kombinationen von Primerpaaren) amplifiziert, um amplifizierte DNA-Sequenzen für eine Anzahl von HLA-Genorten zu erzeugen. Jede Amplifizierungsmischung enthält nur Primerpaare für einen HLA-Genort. Die amplifizierten Sequenzen werden vorzugsweise gleichzeitig weiterbehandelt, so daß eine Anzahl von RFLP-Fragmentmustern aus enzymatischen Spaltungen von einer Probe erzeugt werden kann. Auf diese Weise kann der HLA-Typus für eine Anzahl von Allelen gleichzeitig bestimmt werden.

Als Alternative liefert die Herstellung einer Anzahl von RFLP-Fragmenten zusätzliche Vergleiche von Mustern, um Proben für gerichtsmedizinische oder Vaterschafts-Analysen zu unterscheiden, wo die Analyse von einem Genort häufig nicht ausreicht, um genügend Information zur Bestimmung zu liefern, wenn die Proben-DNA dasselbe AIIeI aufweist wie die DNA, mit der sie verglichen wird.

Erzeugung von RFLP-Fragmenten

Nach der Amplifizierung wird die ι mplifizierte DNA-Sequenz mit einer Endonuklease zusammengebracht, welche die amplifizierte DNA-Sequenz hydrolytisch an einer bestimmten Restriktionsstelle spaltet oder schneidet. Die Kombination der Endonuklease mit der amplifizierten DNA-Sequenz erzeugt ein Fragmentgemisch, welches einen Satz von Fragmenten mit unterscheidbarer Fragmentlänge enthält. Das US-Patent Nr.4582788 beschreibt eine HLA-Bestimmungsmethode, die auf dem Restriktionslängenpolymorphismus beruht (RFLP).

In einer bevorzugten Ausführungsform werden zwei oder mehr Aliquots der Amplifizierungsreaktionsmischung mit ungefähr gleichen Mengen an DNA pro Aliquot hergestellt.

Bequemerweise werden ungefähr S bis ungefähr ΙΟμΙ einer ΙΟΟ-μΙ-Reaktionsmischung für jedes Aliquot verwendet. Jedes Aliquot wird mit einer unterschiedlichen Nuklease kombiniert, um eine Vielzahl von Fragmentgemischen zu erzeugen. Auf diese Weise können durch Verwendung einer Anzahl von Endonukleasen für eine spezielle DNA-Sequenz genortspezifische Kombinationen von Nukleasen, die zur Unterscheidung einer Vielzahl von Allelen eines speziellen Genorts führen, leicht bestimmt werden. Nach der Herstellung der Fragmentgemische kann jedes der Fragmentgemische zur Bildung eines RFLP-Musters verwendet werden. Vorzugsweise können zwei oder mehr Fragmentgemische vor der Musterbildung vereinigt werden.

Als Alternative können zwei oder mehr Restriktionsendonukleasen dazu verwendet werden, ein einziges Fragmentgemisch zu erzeugen. Dieses Fragmentgemisch unterscheidet sich von einem, bei dem jedes Enzym getrennt verwendet wird und die resultierenden Fragmente anschließend vereinigt werden, da die Fragments, die von einem Enzym produziert werden, ein oder mehrere Restriktionsstellen einschließen können, die von dem anderen Enzym in der Mischung erkannt werden. Muster, die durch gleichzeitige Spaltung mit zwei oder mehr Enzymen erzeugt wei den, werden mehr Fragmente enthalten eis die vereinigten Produkte getrennter Spaltreaktionen, bei denen diese Enzyme verwendet wurden, und ihre Analyse wird komplexer sein.

Darüber hinaus können eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen verwendet werden, um zwei oder mehr amplifizierte DNA-Sequenzen zu spalten. Das heißt, für eine vollständigere Auflösung aller AIIeIe eines Genorts kann es wünschenswert sein, amplifizierte DNA-Sequenzen herzustellen, die zwei verschiedene Regionen umfassen. Die amplifizierten DNA-Sequenzen können kombiniert und mit mindestens einer Restriktionsendonuklease gespalten werden, um RFLP-Muster zu erzeugen.

Die Spaltung der amplifizierten DNA-Sequenz mit der Endonuklease kann in einer wäßrigen Lösung unter Bedingungen

ausgeführt werden, die die Endonuklease-Aktivität begünstigen. Üblicherweise ist die Lösung auf einen pH von ungefähr 6,5 bis 8 gepuffert. Gemäßigte Temperaturen, vorzugsweise ungefähr 20 bis ungefähr 45⁰C, besonders bevorzugt physiologische Temperaturen (25 bis 4O⁰C), werden verwendet. Restriktionsendonukleasen erfordern normalerweise Magnesiumionen und in einigen Fällen Co-Faktoren (ATP und S-Adenosylmethionin) oder andere Reagenzien für ihre Aktivität. Deshalb sind Quellen für solche Ionen, z. B. anorganische Magnesiumsalze und wenn nötig andere Reagenzien, in der Reaktionsmischung anwesend.

Geeignete Bedingungen werden vom Hersteller der Endonuklease beschrieben und variieren im allgemeinen insofern, als die Endonuklease Bedingungen mit hohem, mittlerem oder niedrigem Salzgehalt zur maximalen Aktivität braucht.

Die Menge an DNA in der Reaktionsmischung ist üblicherweise im Bereich von 1 bis 20Gew.-%. In den meisten Fällen liefern 5 bis 20pg Gesamt-DNA, die vollständig gespalten werden, eine ausreichende Probe zur Erzeugung von RFLP-Fragmenten. Ein Überschuß an Endonuklease, vorzugsweise 1 bis 5 Einheiten/pg DNA, wird verwendet.

Der Satz von Fragmenten in dem Fragmentgemisch wird vorzugsweise weiterbehandelt, um RFLP-Muster zu erzeugen, die dann analysiert werden. Wenn es gewünscht wird, kann das Fragmentgemisch vor der Weiterbehandlung durch Fällung und anschließende Resuspendierung gereinigt werden, wie beschrieben bei Kan et al., PNAS, Band 75, Seiten 5631-5635 (1978).

Nach der Herstellung werden die Fragmente durch wohlbekannte Methoden analysiert. Vorzugswelse werden die Fragmente unter Verwendung von Elektrophorese analysiert. Die Gel-Elektrophoresemethoden sind im Detail im tolgenden beschrieben. Kapillarelektrophoresemethoden können automatisiert werden (wie z. B. bei Verwendung des Modell 207 A analytischen Kapillarelektrophoresesystems von Applied Biosystems, Foster City, CA) und sind beschrieben in Chin et al., American Biotechnology Laboratory News Edition, Dezember 1989.

Elektrophoretlsche Trennung von DNA-Fragmenten

Elektrophorese ist die Trennung von DNA-Sequenzfragmenten, die in einem Trägermedium enthalten sind, nach Größe und Ladung enter dem Einfluß eines angelegten elektrischen Feldes. Gelblätter oder -platten, z. B. mit Agarose, Agarose-Acrylamid oder Polyacrylamid, werden üblicherweise für Gele zur Nukleotidgrößenbestimmung verwendet. Die Elektrophoresebedingungen beeinflussen den gewünschten Auflösungsgrad der Fragmente. Eine Auflösung, mit der Fragmente getrennt werden, die sich voneinander in der Größe durch bis zu nur 10 Nukleotiden unterscheiden, ist üblicherweise ausreichend. Vorzugsweise wird das Gel in der Lage sein, Fragmente aufzulösen, die sich durch 3 bis 5 Nukleotide unterscheiden. Jedoch ist es für manche Zwecke (wenn die Differenzen in der Sequenzlänge groß sind) möglich, daß eine Unterscheidung von Sequenzunterschieden von mindestens 100 Nukleotiden ausreichend empfindlich für die Analyse ist. Die Herstellung und Färbung von analytischen Gelen ist wohlbekannt. Beispielsweise ist ein 3% Nusieve 1 % Agarosegel, welches mit Ethidiumbromid gefärbt ist, beschrieben in Boerwinkle et al., PNAS, Band 86, Seiten 212-216 (1989). Der Nachweis von DNA in Polyacrylamidgelen mit Silberfärbung ist beschrieben in Goldman et al., Elektrophoresis, Band 3, Seiton 24-26 (1982); Marshall, Electrophoresis, Band 4, Seiten 269-272 (1983); Tegelstrom, Electrophoresis, Band 7, Seiten 226-229 (1987); und Allen et al., BioTochniques, Band 7, Seiten 736 bis 744 (1989). Die Methode, die von Allen et al. beschrieben wird, wobei rehydratisierbare, mit Silber gefärbte Polyacrylamitlgele mit einer großporigen ultradünnen Schicht verwendet werden, wird vorgezogen. Man kann Größenmarker auf domselben Gel mitlaufen lassen, was eine Abschätzung dor Größe der Restriktionsfragmente erlaubt. Ein Vergleich mit einer oder mehreren Kontrollproben kann zusätzlich zu oder anstelle der Verwendung von Größenmarkern durchgeführt werden. Die Größenmarker oder Kontrollproben werden üblicherweise auf eine oder auf beide Randspuren des Gels aufgetragen und vorzugsweise auch mindestens auf einer Zentralspur. Beim Ausführen der Elektrophorese werden die DNA-Fragmente an einem Ende der Gelplatte aufgetragen (allgemein „Ursprung" genannt), und die Fragmente trennen sich bei dem elektrisch geförderten Transport durch das Gel, wobei die Wanderungsgesohwindigkeit der kleinsten Fragmente vom Ursprung zum anderen Ende der Gelplatte (Anode) am größten ist. Mit einem Agaroseplattengel wird die Elektrophorese typischerweise für 30 bis 45 Minuten bei 100 Volt durchgeführt. Bei einem Polyacrylamidplattengel wird die Elektrophorese typischerweise für 45 bis 60 Minuten bei 200 bis 1200 Volt durchgeführt.

Nach der Elektrophorese wird das Gel für die Sichtbarmachung der Proben vorbereitet Die DNA-Fragmente können sichtbar gemacht werden durch Anfärben des Gels mit einem nukielnsäurespezifischen Farbstoff wie z.B. Ethidiumbromid oder vorzugsweise mit Silberfärbung, welche nicht spezifisch für DNA ist. Ethidiumbromidfärbting wird beschrieben in Boerwinkle et al., wie o'jZ-. angegeben. Silberfärbung wird beschrieben in Goldman et al., Marshall, Tegelstrom und Allen et al., ebenfalls alle wie oben angegeben.

Sonden

Allelspezifische Oligonukleotide oder Sonden werden verwendet, um DNA-Sequenzen zu identifizieren, die Regionen aufweisen, die mit der Sondensequenz hybridisieren. Die amplifizierten DNA-Sequenzen, welche durch einen Genort-spezifischen Primär definiert sind, können als Sonden in RFLP-Analysen, die genomische DNA verwenden, benutzt werden. Die US-Patentschrift Nr. 4 582788 beschreibt eine exemplarische HLA-Bestimmungsmethode, die auf der Analyse von RFLP-Mustern, erzeugt von genomischer DNA, beruht. Die Analyse verwendet cDNA-Sonden zur Analyse aufgetrennter DNA-Fragmente in einer Southern-Blot-Analyse. Wie in dem Patent festgestellt, sind komplementäre DNA-Sonden, die spezifisch sind für eine (Genort-spezifisch) oder mehrere (multi-Genort-spezifisch) bestimmte HLA-DNA-Sequenzen, die am Polymorphismus beteiligt sind, wesentliche Komponenten des Hybridisierungsschritts des Bestimmungsverfahrens (Spalte 6, Zeilen 3-7).

Die amplifizierten DNA-Sequenzen des erfindungsgemäßen Verfahrens können als Sonden in dem im Patent beschriebenen Verfahren oder in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um die Anwesenheit einer amplifizierten DNA-Sequenz eines speziellen AIIeIs nachzuweisen. Insbesondere kann eine amplifizierte DNA-Sequenz mit einem bekannten AIIeI hergestellt und als Sonde verwendet werden, um die Anwesenheit des AIIeIs in der Proben-DNA, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifiziert wurde, nachzuweisen.

Wenn eine Sonde dazu verwendet wird, AIIeIe in den erfindungsgemäß amplifizierten DNA-Sequenzen zu unterscheiden, hat die Sonde vorzugsweise jedoch eine relativ kurze Sequenz (im Vergleich zur Länge der amplifizierten DNA-Sequenz), was die Sequenzhomologie von anderen Allelen des Genorts mit der Sondensequenz minimiert. Das heißt, die Sonden werden einer Region der amplifizierten DNA-Sequenz entsprechen, welche die größte Anzahl an Nukleotidunterschieden im Vergleich zu den amplifizierten DNA-Sequenzen von anderen Allelen, die unter Verwendung dieses Primerpaares erzeugt werden, aufweist. Die Sonden können markiert werden mit einem nachweisbaren Atom, Radikal oder Liganden unter Verwendung bekannter Markierungstochniken. Üblicherweise werden radioaktive Markierungen, gewöhnlich "Phosphor, verwendet. Die Sonden können mit "Phosphor markiert werden durch „Nick-Translation" mit einem a-³²Phosphor-dNTP (Rigby et al., J. Mol. Biol. Band 113, Seite 237 [1977]), oder anderen verfügbaren Verfahren zur Herstellung der Genort-spezifischen Sonden für die Verwendung in den im Patent beschriebenen Verfahren. Die Sonden sind vorzugsweise markiert mit einem Enzym wie z. B. Wasserstoffperoxidase. Die Kopplung von Enzymmarkern mit Nukleotidsequenzen ist wohlbekannt. Die Analysemethode, die bekann? ist als „Southern Blotting" und von Southern, J. Mol. Biol., Band 98, Seiten 503-517 (1975) beschrieben wurde, ist eine Analysemethode, die auf der Verwendung von Sonden beruht. Beim Southern Blotting werden die DNA-Fragmente einer Elektrophorese unterworfen, dann auf einen Träger, der Nukleinsäure bindet, übertragen und fixiert und mit einer in geeigneter Weise markierten cDNA-Sonde hybridisiert. Die markierten Hybride werden durch Autoradiographie oder, vorzugsweise, durch Verwendung von Enzymmarkierung nachgewiesen.

Reagenzien und Bedingungen für das Blotting-Verfahren sind beschrieben bei Southern, siehe oben; Wahl et al., PNAS, Band 6, Seiten 3683-3687 (1979); Kan et al., PNAS, siehe oben; US-Patent Nr.4302 204 und Molecular Cloning: A Laboratory Manual von Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Wenn der Transfer beendet ist, wird das Papier vom Gel getrennt und getrocknet. Die Hybridisiorung (Verschmelzung) der aufgelösten Einzelstrang-DNA auf dem Papier mit einer Sonde wird durch

Inkubation des Papiers mit der Sonde unter Hybridisierungsbedingungen bewirkt. Siehe Southern, wie oben; Kan et al., PNAS, wie oben, und US-Patent Nr.4302204, Spalte 5, Zeile 8 und folgende. Komplementäre DNA-Sonden, die spezifisch sind für ein AIIeI, einen Genort (genortspezifisch) oder mehrere, sind wesentliche Komponenten im Hybridisierungsschritt des Bestimmungsverfahrens. Genortspezifische Sondon können hergestellt werden durch die Amplifizierungsmethoden für genortspezifische amplifizierte Sequenzen, wie oben beschrieben. Die Sondon werden durch Markierung, wie oben beschrieben, nachweisbar gemacht.

Der letzte Schritt im Southern-Blotting-Verfahren ist die Identifizierung markierter Hybride auf dem Papier (oder Gel, wenn die Hybridisierung in Lösung ausgeführt wird). Zum Nachweis der eine radioaktive Markierung enthaltenden Hybride kann Autoradiographie verwende* werden. Enzymatisch^ Markierungen werden durch die Verwendung eines Farbentwicklungssystems, welches spezifisch für das Enzym ist, nachgewiesen. Im allgemeinen spaltet das Enzym ein Substrat, wobei die Spaltung das Substrat veranlaßt, entweder Farbe zu entwickeln oder seine Farbe zu wechseln. Die Farbe kann visuell in natürlichem Licht wahrnehmbar oder ein Fluorochrom sein, das durch eine bekannte Wellenlänge von Licht angeregt wird,

Sequenzierung Genetische Variationen und amplifizierte DNA-Sequenzen, die eine Alleldifferenz in der Proben-DNA reflektieren, können auch

durch die Sequenzierung der amplifizierten DNA-Sequenzen nachgewiesen werden. Methoden zum Sequenzieren von

Oligonukleotidsequenzen sind wohlbekannt und sind beschrieben in, beispielsweise, Molecular Cloning: A Laboratory Manual

von Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. Gegenwärtig kann Sequenzieren durch Verwendung einer Anzahl im

Handel erhältlicher Instrumente automatisiert werden. , Aufgrund des Zeitaufwands, der gegenwärtig erforderlich ist, um Sequenzierungsinformationen zu erhalten, werden andere Analysemethoden, wie z. B. Gelelektrophorese der amplifizierten DNA-Sequenzen oder eines durch eine Restriktionsendonuklease erhaltenen Fragmentgemisches davon, für klinische Analysen vorgezogen. Ausrüstungen Wie oben erörtert, umfassen die Ausrüstungen dieser Erfindung eines oder mehrere der Reagentien, die in den oben

beschriebenen Verfahren verwendet werden. In einer Ausführungsform umfaßt die Ausrüstung mindestens eingenortspezifisches Primerpaar in einem geeigneten Behälter. Vorzugsweise enthält die Ausrüstung zwei oder mehrgenortspezifischer Primerpaare. In einer Ausführungsform sind die Primerpaare für verschiedene Genorte bestimmt undbefinden sich in getrennten Behältern. In einer anderen Ausführungsform sind die Primerpaare spezifisch für denselben Genort.

In dieser Ausführungsform werden die Primerpaare vorzugsweise im selben Behälter sein, wenn sie spezifisch sind für

verschiedene AIIeIe desselben Genorts und in verschiedenen Behältern, wenn sie spezifisch sind für verschiedene Teilederselben allelen Sequenz. Sätze von Primerpaaren, die nacheinanderverwendet werden, können in verschiedenen Behältern inderselben Ausrüstung bereitgestellt werden. Die Primer eines jeden Paares können sich in getrennten Behältern befinden,insbesondere, wenn ein Primer in jedem Satz von Primerpaaren verwendet wird. Jedoch wird jedes Paar vorzugsweise in einer

Konzentration bereitgestellt, welche die Verwendung der Primer bei den Konzentrationen erleichtert, die bei allen Amplifizierungsreaktionen, in denen es verwendet werden wird, erforderlich ist. Die Primer können in einem kleinen Volumen (z. B. 100 μΙ) einer geeigneten Lösung, wie z. B. sterilem Wasser oder Trispuffer,

bereitgestellt werden und können eingefroren werden. Als Alternative können die Primer an Luft getrocknet sein.

In einer weiteren Ausführungsform umfaß* die Ausrüstung in getrennten Behältern zwei oder mehr Endonukleasen, die in den

erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sine¹. Die Ausrüstung wird vorzugsweise eine genortspezifische Kombination von

Endonukleasen enthalten. Die Endonukleasen können in einer geeigneten Lösung, wie z. B. normalem Salz- oder

physiologischem Puffer mit 50% Glycerin (zur Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität), bereitgestellt werden.

Die Ausrüstung kann ein oder mehrere genortspezifische Primerpaare zusammen mit genortspezifischen Kombinationen von Endonukleasen enthalten und kann zusätzlich eine Kontrollprobe einschließen. Die Kontrollprobe kann eine amplifizierte DNA-Sequenz, definiert durch ein genortspezifisches Prlmerpaar, oder DNA mit einem bekannten HLA-Typus für einen

interessierenden Genort sein.

Zusätzliche Reagentien wie Amplifizierungspuffer, Verdau-Puffer, eine DNA-Polymerase und Nukleotidtriphosphate können

separat oder in der Ausrüstung bereitgestellt werden. Die Ausrüstung kann zusätzlich Reagentien zur Herstellung und Färbungeines Gels oder vorgefertigte Gele enthalten.

Analysen von beispielhaften Genorten werden im folgenden beschrieben. Analyse des HLA-Typus

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse genetischer Variation in einer amplifizierten DNA-Sequenz zur Bestimmung von Alleldifferenzen in der zu untersuchenden DNA kann zur Bestimmung des HLA-Typs verwendet werden. Primerpaare, die speziell genomische DNA amplifizieren, die mit einem HLA-Genort assoziiert ist, werden im folgenden im Detail beschrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform definieren die Primer eine DNA-Sequenz, die alle Exons enthält, welche für die allele Variabilität kodieren, die mit dem HLA-Genort assoziiert ist, zusammen mit mindestens einem Teil einer der benachbarten Intronsequenzen. Bei Klasse-I-Genorten sind die variablen Exons die zweiten und dritten Exons. Bei Klasse-Il-Genorten ist das variable Exon das zweite Exon. Die Primer sind vorzugsweise so lokalisiert, daß ein wesentlicher Teil der amplifizierten Sequenz Intronsequenzen entspricht.

Die Intronsequenzen liefern Restriktionsstellen, welche im Vergleich zu cDNA-Sequenzen zusätzliche Information über das Individuum liefern; z. B. den Haplotyp. Der Einfluß von Exons innerhalb der amplifizierten DNA-Sequenzen liefert nicht so viele genetische Variationen, die eine Unterscheidung zwischen Allelen ermöglichen, wie eine Intronsequenz derselben Länge, insbesondere bei konstanten Exons. Diese zusätzliche Intronsequenz-Information ist besonders wertvoll bei Vaterschaftsbestimmungen und in der Gerichtsmedizin. Sie ist ebenfalls wertvoll für Bestimmungen bei Transplantationen bezüglich Gewebeabstimmung, insofern als die variablen Längen der Intronsequenzen, die in der amplifizierten, von den Primern erzeugten Sequenz enthalten sind, es ermöglichen, eine Unterscheidung zwischen bestimmten Heterozygoten (zwei verschiedene Allele) und Homozygoten (zwei Kopien von einem AIIeI) zu treffen.

Alleldifferenzen in den DNA-Sequenzen von HLA-Genorten werden unten erläutert. Die Tabellen veranschaulichen die Sequenzhomologie verschiedener Adele und geben exemplarische Primer-Bindungsstellen an. Tabelle 1 veranschaulicht die Gegenüberstellung („Alignment") der Nukleotide der Klasse IA2, A3, Ax, A24, (früher als A9 bezeichnet), B 27, B58 (früher als B17 bezeichnet), C1, C2 und C3 Allelsequenzen in der intervenierenden Sequenz (IVS) I und III. (Die in den Tabellen und in der Beschreibung verwendeten Gensequenzen und deren Numerierung können in der Genbank und/oder den Sequenzdatenbanken der European Molecular Biological Laboratories [EMBL] gefunden werden.) Die unterstrichenen Nukleotido repräsentieren die Region der Sequenz, an die sich exemplarische genspezifische oder Klasse-l-spezifische Primer binden. Tabelle 2 veranschaulicht die Gegenüberstellung der Nukleotide in IVSI und Il der DQA3-(jetzt DQA1 0301), DQA1.2-(JeUt DQA1 0102) und DQA4.1-(jetzt DQA1 0501) AIIeIe des DQA1-Genorts (früher bezeichnet als DR4-, DR6- und DR3-Allele des DQA1-Genorts). Die unterstrichenen Nukleotide repräsentieren die Fleglonon der Sequenz, an die sich exemplarische DQA1 genortspezlfische Primer binden.

Tabele 3 veranschaulicht die Gegenüberstellung der Nukleotide in IVS I, Exon 2 und IVS Il von zwei Individuen, die das DQw1_v. AIIeI (hier als DQw 1_va und DQw 1»b für die oberen und unteren Sequenzen in der Tabelle bezeichnet), die DQw2- und DQw8-Allele des DQB1-Genorts aufweisen. Die in den DQw 1_vb-, DQw2- und DÜw8-Allelsequenzen angegebenen Nukleotide sind diejenigen, die sich von der OQw 1_va-Sequenz unterscheiden. Exon 2 beginnt bei Nukleotid 599 und endet bei Nukleotid 870 der DQw1_va-Allelsequenz. Die unterstrichenen Nukleotide repräsentieren die Regionen der Sequenz, an die sich exemplarische DQB1 genortspezifische Primer binden.

Tabelle 4 veranschaulicht die Gegenüberstellung der Nukleotide in IVS I, Exon 2 und IVS Il der DPB4.1-, DPB9-, New- und DPw3-Allelen dos DPBI-Genorts. Die in den DPB9-, New- und DPw3-Allelsequenzen angegebenen Nukleotide sind diejenigen, ate sich von der DPB4.1-Sequenz unterschieden. Exon 2 beginnt bei Nukleotid 7644 und endet bei Nukleotid 7907 der DPB4.1-Allelsequenz. Die unterstrichenen Nukleotide repräsentieren die Region der Sequenz, an die sich exemplarische DPB1 genortspezifische Primer binden.

Tabelle 1 Klasse I

Seq

GATTAGCMT.ATTGTX£GACCTACTGTATCAATAAAC T

38 AAAMGGAMCTGGTCTXn'ATGAGAATXrrcTAa^GGTOCTTTCAGACAA 38 GG

88 (^CTT^OCAGGTTTAMGAGAAMCTOCTGACIX^^ 88

B27 1 G^GCICACTCTCTGGCATCAAGTTC TCCGTG

Cl 138 AGGGO^AGCTX^CTGIXn-GGCAGCMGTTCCCC^TGGTOSAGrTrcCCTG

C2 138 T-

A2 1 MGCTTACTCTCTGGCACCAAAC TCCATGGGATGATTTTTCCTTCC TAG

B27 32 . ATCAGTTTCCCT .

Cl 188 TACAAGAGTCCAAGGGGAGAGGTAaCTGTCCTTT AT TTTGCTGGATGTAG C2 187

A2 50 AAGAGTCCAGGTGGACAGGTAA QGAGTGGGAGT CAGGGAGTC

B 27 44 ACACAAGA TCCAAGAGGAGAGGTAA GGAGT GAG AGGCAGGGAGTC

Cl 238 TTTAATATTACCT GAGGTAAGGTAA.GGC AAAGAGTGGG AGGCAGGGAGTC

C2 237 C- G

A2 98 CAGnCCAGGGACAGAGATTACGGGATAAAAAGTGAAAGGAGAGGGACG GGGXCAT

B27 91 CAGTT C^GGGACAGGGATTCCAGGAGGAGAAGTGAAGGGGAAGC GGG TGGGC

Cl 288 CAGTT CAGGGACGGGGATTCCAGGAGAAG TGAAGGGGAAG GGGCTGGGCG C2 288

A2 149 GOCGAG GGTTTCTCCCTTGTTTCT CAGACAGCTC TTGGGCCA A GAC

B27 141 GCCACIOGGG3TCIXrc<XTG3TTTX^^ GGAC

Cl 338 CAGCC TOGGGGTCIXnOCCTXXnTTOCACAGA(^GATCCTTGGCC AGGAC

C2 337 - - GG

-17- 299 Tabelle 1 (Fortsetzung) Klasse I Seq

A2 195 TCAQGGAGACATTGAGACAGAO: GCTTQGCACAGAAQCAGAGGGGTCAGGG

B27 191 TCAG3CAGACAGTGTGACAAAGAQGCT QGTGTAGGAGAAGAGGSATCAQG

Cl 388 TCAQGCACAaGTGTX^a\MGATQCTTQGTGTAC9GAGAAGAGGGATCAG C2 387 G

A2 246 CGAA GT02AGGG0C(XAGGCGTTGGCTCn^QGGTCIX^GG0G(XGAAGG

B27 241 ACGAACGT0CAAGQ0CCO3GGCG CGG TCTCAGGGTCTCAG3CTCCGAGAG Cl 438 ACGAA GTOCCAGGTOCOQGQCG GGGTTCIX^GGGTCTCAQGCTCEAAGGG

C2 438 -A

A2 296 CG3TCTATGGATKXX93AGTC(XAGanTGGGGATTOCOCMCr<^^ AGTT

A3 9 T A -

Ax 9 TG GC

A24 11 - - T ·

B27 291 OTrGTCKrATTGGQGAQQGGCACAGTTQGQG TTCCOCACTCOCACGAGTT Cl 488 QOCTCTOGCACTGGQGAGGOGOO^^

TCTTTTCTCCC TXnOCCMCETATCTAQGGTOCTTCrTCCTGGAT ACTCAC CTG C A G

C A GC AC C

TG-TCACTTCT TCIOCQUCCTATGTOGCXnXXrrTCTTCCAGGAT ACTCGT

T A

TG G

AA TCA - T

G GACGOGTCCCCATTTC CACIXXCATTGGGTGTCGGGT GTCTAGAGAAG C

GACGanxmj\ATTQCCAC^ TCT AGAAG C

AG C3 36 -ACCNN G

A2 449 CMTX^GTGTCGTCGCQGTXXCQGTTCTAAAGT OCGCACG

A3 164 T C

Ax 159 GCC C C

A24 161 A T

B27 442 CAATX^GTCTXXCXXXiGGTC(XAGTrCTAAAGT CCCCACG

Cl 635 CAATC^GCGTCTOGQCAGTCCajGTTCrAAAGTCCC CAGT

C2 637 C

C3 87 GG G

-18- 299 Tabelle 1 (Fortsetzung) Klasse I Seq

A2 489 CAOCCACXOGGACTCAGA TTCTOCOCAGAOGOCGAQGATQGC C

A3 204 TOGTGGAGAOCAGGC

Ax 199 TG

A24 201

B27 482 CACOCACOCGGACTCAGA ATCTCCTCAGAGGCCGAG ATGCG G

B58 52

Cl 675 CAOCCACCCGGACTCAGA TTCTOCCCAGACGCCGAG ATGCG G

C2 677 G

C3 127

1, EXDM

A2 532 GTCATGGCGCCCCGMXCTCCTOCTGCTACTCTC^^ A3 262 C C

Ax 242 C CGAC

A24 244 G C

B27 524 GTXCACQGOCOCCCGMCOCTOCTCCTOCT^^ B58 94 G

Cl 717 GTCATGCCQCCQCGMCCOCATOCranX^^ C2 719 C3 169 G

A2 574 TGCOCCTGACCCAGACCTGGGCGG

A3 305

Ax 285 C

A24 287 A

B27 567 TGGOCCTGAOCGAGAOCTGGGCTG

B58 137 C

Cl 760 TGGOCCTCACOGAGAOCTOGGCCT

C 2 762

C3 212 G

rvsi

CTGAGTGCGGGGTCGGG AGGGAAACG GCC TCTCT GGGGAGAAGCAACGGGOC G

C AC C GT

A TC T-G- G NG G CG

TCG C C G CG

GTGAGTGOGGGGICAGGCAGGGAAATG GCC TCTCT GGGGAGGAGCGAGGGGA CG

G- C

CTGACTGCGGGGTTGGG AGGGAAACG GCC TCT GOCGAGAGGMCGAGGTGCCCG

G G T T GG

A2 652 OCTGGC GGGGGCGCAGGACCOSGGMGQCGOC^XX&GAG

A3 383 GG C

Ax 357 C G T AG A

A24 367 A

B27 645 CAGGC GGGGGCGC^GGACCCGGGGAGOCGCGCOX^GGAG^

B58 215 TA

Cl 838 CCCGGC AGG CGCm;ACCCGGGa\GCCGa£AGGGAGGAGGGTCGG

C2 840 GG- AGC

C3 291 GGA G

A2	599
A3	329
Ax	309
A24	311
B27	591
B 58	161
Cl	784
C2	786
C3	236

-19- 299 Tabelle 1 (Fortsetzung) Klasse I Seq

A2 711 OCACrOCTOGTOCOCAG

A3 442 ~ G-C

Ax 417 TC CT

B27 703 (rOCTCCTOGCCCCCAG

Cl 895 OCOCTCCTCGCCCCCAG

C2 898 T '

IVS3

A2 1515 GTACX^GGGGCCAQGG3GCGOCriC(XTGATXXXrTGTAGATCTCO0SG^

Ax 1222 C ACA -

A24 1228 G

C2 1705 T G

C3 1155 - TG

A2 1574 ACMGGAGGGGAGAOUTTGGGAGCM^CTAGMTATCGCOCriCOCTCTGGT

A3 1303 C C GATT

Ax 1280 AA A T

A24 1287 C B27 1567 AOGAGMGAGGAGGAAMTXTtGATCAGOGCTAGMTGTCGXCIXIZCTTGAAT

Cl 1763 ACGAGGAGGGC^GGAAMTXXXHAT^GCGCTAG^TATGGOCCTCCCTGAAAT

A3 1356 T TTT - GA G

Ax 1333 T T

A24 1341 T

B27 1620 GSAGMTGC^TGAGTTTTCCTGAGTTTC

Cl 1816 GGAGAATGGGATGAGTTTTCCTGAGTTTC

A2 1678 CXCIGAGQTKXXZOZTGCICTCtGh (^CMTTAAGGGATAAAATCTCTGAAGGA

A3 1406 TG AA-G

Ax 1372 G- GG-

A24 1392 C

B27 1649 OXrrGAGGGOGCCXnxrnCTCTCT AGGACMITMGGGATXSACGTCTCTGAGGAA

Cl 1845 CTCTGAGGQXOOCICTXCTCTCT AQGACAATTAAQGGATGAAGTCCTTGAGGAA

C3 1295 G A

-20- 299 Tabelle 1 (Fortsetzung) Klasse I Seq

A2 1733 ATGAOGQG MGAaSATCXTXjGMTACTCATGAGTGGTTCOCTTTGACAC A3 1460 G TTGTG G

Ax 1426 ATGM GAG A24 1447 A C

B27 1704 ATGGAC<^KMGACAGTC0CrrAGMTACrcATX^G»3GTCC0CrriTGACCC B58 1278 Cl 1900 ATGGAQGGGMGACAGTOCCTCGMTACTCATX^^^ C2 1901

C3 1351 A

A2 1783 ACA^QGCAGCAGCCTTGGG COOG TGACTTTTOCTXnX^QGCCTTGTTUTCTGC

A3 1510 C GA G

Ax 1477 T C

A24 1497 C A

B27 1755 CTGCAGCAGCCTTGGGMGCG TGACTTTTOCTCTCAGGCCTTGTTCACAGC

B58 1329 T T

Cl 1951 CTTTGACCAClOCAGCAGCTGTQGTCAaxnO^ CTCIO\GGCCTTGTTCTCTGC

C2 1952

C3 1411

A2 1837 TC^CACTCMTXnraxnOCm^

A3 1560 C

/VX JL jZÖ v<. *"^i¥--—— ' —— ' \^

A24 1547 C

B27 1806 CTX^CACIO\GTGTGTTTOGGXTXnX^

Cl 2013 CTX^CGTTCMTGTCTTTGMQGTTTGATTOC^^

C3 1464 C

A2 1891 TQCACTCAGGTCAQGAOCaGMGTCQCTGTC^ TTTCCACGGMTAG

A3 1614 TC A

Ax 1567 T

A24 1600 A

B27 1860 TCCACTCAGAT(^QGAGCAGMGTOCCTGTTCCOCGCTCAGAGACt CGMCTTTCCMTGMTAG

Cl 2067 TOC^CTCAGGTX^QGAOCAGMGTOXTGTTOCTOCCICAGAGACrAGMCT^^

A2 1955 GAGATTATQC^QGTOCCTGTGTCC^GGCIOGTGTCI^^ A3 1664 —

Ax 1632 TT CT T

A24 1650 — A ATG

B27 1925 GAGAmTCOCAOgiOCCTXrcnXiaGGCT^ CTTCCCCA

Cl 2132 GAGATTATCC<^GGTGCCTX?IGTCCAG3CTG

Tabelle 1 (Fortsetzung) Klasse I Seq

A2 2014 TCa^GGTGIXXTUrOCATTCTCAAGA TAGOCACATGTGTGCrQGAGGAGTGTCOCATG

A3 1721 G GCT

Ax 1691 C T CA A GCT

A24 1706 G CA T

B27 1983 CECCAGGTGrra^GTCCATTCTC AOGCTTOGTC^CATCGGTGGTCCTAGGGTGTCCCATG

B58 1557 A

Cl 2191 (TCCAQGTCTGCTGTXrATTCTC AGGATGGTICACATCQ30QCTGTTGGAGTGTCGCAAG

C2 2192 A

C3 1642 G

A2 2073 ACAGATCGAAAATGOCTGAATGATCTGACTCT TCCTGACAG 2113

A3 1780 GC TT CT 1820

Ax 1750 GC TT TT C T 1791

A24 1765 G GCAAAA C T 1784

B27 2042 AGAGATCCAMCCGOCTGMTTTTCTGACIXriTCCrAT CAG 2083

B58 1616 1656

Cl 2250 AGACATAC^MOTGTCTGMTTTTCTGACTCTTCCCGT CAG 2290

C2 2251 G 2292

C3 1701 , 1741

Tabelle 2 DQA1 Seq

A3 1 GATCTCTGTC TAGAATGTCCTGTTCTGAGCCAGTCCTGAGAGGAAAGGAAGTATAATCAA

Al.2 1 G A

A4.llC G AACG

A3 61 TTTGTTATTAACTGATGAAAGAATTAAGTGAAAGATAAACCTTAGGAAGC AGAGGGAAGT

Al. 2 61 CA TCC

A4.1 61 GT CA

A3 121 TAA TCTATGACTAAGAAAGTTAAGTACTCTGATAACTCATTCATTCCTTCT

Al. 2 122 A CCTAA TC CAA

A4.1 122 ,A CCTAA C C A CA A

A3 172 TTTGTTCATTTACATT atttaatcacaagtctatgatgtgccaggctctcaggaaata'

Al.2 178 A TCCA

A4.1 178 A G T CG A

A3 230 GTGAAAATTGG CACGCGATATTCTGCCCTTGTGTAGCACACACCGTAGTGGGAAAG

Al. 2 236 AAT G TAG

A4.1 237 ACATT G TTA

A3 28 6 AA GTGCACTTTTAACCGGACAACTATCAACACGAAGCGGGGAGGAAGCAGGGG

Al.2 293 A T . CTA

A4.1 294 A C A C AT A T

A3 339 CTGGAAATGTCCACAGACTTTGCCAAA GACAAAGCCCATAATATCTGAAAGTCAG

Al.2 347 G AA TG T

A4.1 348 T GG TG G T

A3 394 TTTCTTC CATCATTTTGTGTATTAAGGTTCTTTATTCCCCTGTTCTCTGCCTTCCT

Al.2 403 G CT CTC

A4.1 403 CT TCAT GC CA

A3 450 GCTTGTCATCTTCACTCATCAGCTGACCATGTTGCCTCTTACGGTGTAAACTTGTACCAG

Al.2 459 C GT

A4.1 462 CC T .

Tabelle 2 (Fortsetzung) DQA1 Seq

A3 510 Al.2 519 A4.1 522

A3 567 Al.2.576 A4.1 579

A3 622 Al.2 631 A4.1 634

A3 679 Al.2 688 A4.1 688

A3 740 Al.2 749 A4.1 749

A3 789 Al.2 802 A4.1 798

TCTTATGGTCCCTCTGGGCAGTACAGCCATGAATTTGATGGAGACGAGGAGTTCTAT

TC CC TCC

C CC TC C

GTGGACCTGGAGAGGAAGGAGACTGTCTGGCAGTTGCCTCTGTTCCGCAGATTTA

C G G GA A A G

G TGT G TC A ACA

GAAGATTTGACCCGCAATTTGCACTGACAAACATCGCTGTGCTAAAACATAACTTGA G T GGG G G GC C

ACATCGTGATTAAACGCTCCAACTCTACCGCTGCTACCAATGGTATGTGTCCACCATTCTG

AA C

GTC A A

CCTTTCTTTAC TGATTTATCCCTTTATACCAAGTTTCATTATTTTCTTT

C TTAA A GC CC G C

CC CA

CCAAGAGGTCCCCAGATC

806 819 815

Tabelle 3 DQB1 Seq

1 MGCTTGTGCTaT^Cn^TGMTAMTGTUICTATXrrAGGACrcAGAGGT

03 TT A

51 GTAGG TiXTTTOCAACATAGAAGGGAGTGA A(XTCAAOGGG ACTTGGGA G

TT TT

C AC C TTT TA C CA AC GTGA CA C

AT AT C A

101 QGTAAATCTAQGCATGGGMQGMGGTATTTTACOCAGGGACCAAGAGAA C

151 TAOGOGTGTCAGMOSAGGOCAGGCTTMTTOCTGGAOCTATCTOGTCAT

G A G - A A A

G CG

201 TOCGTTGMCTCIO^GATTTATUTGGATMCTTTATCTCK^GGTATCC^

C C

G G

AG T T

251 GGAGOTCATGAAAMTGGGATTTCATGCGAGMCGOCCTGAT OCCTCTA

CA

Tabelle 3 (Fortsetzung) DQB1 Seq

C AT

CT CC

351 (^GGCTCACJ^Gr^GA^GGGCTTTCCTCCCITroCTG^^

CG A CC

C G CC C

401 C AGATTO^GMGOCCGCMAGMGGCGGGCAGAGCTGGGCAGAGCCGCC

CG CACCGG G -NNN

GC CGG G

451 GGGAGGATGCC^GGTCTOGAGCGCCAGGC^CJGGGCGGGCGGGMCTGGAG

CG TT

C AA

501 GT0GCG03GXGGTTOCACAGCTCCÄC<XI^

TGT G

551 GGGXGGGCGGGCTGGGGCC TGACTC^CCGGGCC<STGATfCCCCGCAGAG

A - GCA

GGGCCGGGGCC

601 GATTTCGTGTAGCAGTTTMGGGCATCTOT

651 GCGCCTGGGTCTTGTMCCAGACA^TOATMCCGAGAGGAGTACGCG^

G G AG . A AT T

GT A

701 GCITCGACAGCGAGGTGGGGGTCTACOGQGCG^

AT TTT

T .C

CC CA AA

OZ

801 GGCGGAGTTGGA (^CC<STGTC<^GA(^QWVCTACGAGGTOGQGTACCGCG

CG G CTACTA

A C T A CT A

-24- 299 Tabelle 3 (Fortsetzung) DQB1 Seq

851 CKAT0CTOCAGAQGAGAQGTGAGCnCGTOQCCariai3TGAQCGC A(XC

CCTCC GG -TTCGCC

CCT CC G G GCCT

901 TTGGOCGGGAOZOOGAGTCIOTCTGCCGGGAGGGCG ATGGGGGCGAGGTC

1001 OQGGGGTGGTOGGGGCAGGTGCATCGGAGGGGOSGGGACCTAGGGCAGAG

CGGT - C T A

1051 CAGGGGGA^GCAGAGTCGGOCAGGCTGOCT^^

G TA TG-T

A	ATC	G	A A	C A CCG	G CAA TTC GCGAA C C	- CTG C- AA
AA	-C C	HTG	AGCC	[TCATTOCAOCOCAGGGAAAGGAGGCGGCGG
G	-		03 .
:CAG1
C TT

C C C-T

1151 TATGCGTTTGXTOCTOGTGCCTTAOCTTCGCT

TA

1201 ca^GTGca^co^iciTcri^

A TT G C CG G

1251 ACGCAGCMGXOCACAGTOrGCATTCGCCGCA GGAAGCTT , 1292

T CG G T CTA A AGC CATG AGTGGGAAGCTT

Tabelle 4 DPBI Seq

DPB4.1 7546 GGGAAGATTTGGGAAGAATCGTTAATAT

DPB4.1 7574 TGAGAGAGAGAGGGAGAMGAOGATTAGATGAGAGTQGCGCCTQZGCTCATGTOCQOCa:

DPB4.1 7634 GTOCOOGCAGAGMTTAOCTTTTOCAGGGACGGaGGMTXOACGOTITTAATGGGACA DPB9 GGAT G GCA TT

New GGAT G GCA TT

BPB4.1 7694 (^GOXTTCCTCUAGAC^TACATCTAC^OCGG^

DPB9 T

New T

DPB4.1 7754 GTGGGGGAGTTGCOGQOGGTCACGGAGCrGGGQOGGGCTGCTGCGGAGTACTGGAACAGC DPB9 AAC

New AAC

DPB4.1 7814 aGMGGAC^TGCTGGAGGAGMGOGGGCAGTGXGGAC^GGATGTGCAGACACMCrAC DPB9 G GA

New C GA

DPw3 C GA

DPB4.1 7874 GAGCTGGGOGQXCCATGACQCTQCAGOGCq^ DPB9 AAGG

New AAGG

DPw3 AAGG

DPB4.1 7934 CGC^GQQCAGXOOGCGGGCCCGTGCCCAG

Primer für HLA-Genorte

Exemplarische HLA-genortspezi'ische Primer sind im folgenden aufgeführt. Jeder der Primer hybridisiert mit mindestens aufeinanderfolgenden Nukleotiden der ausgewählton Region der Allelsequenz. Die Bezeichnung eines exemplarischen bevorzugten Primers zusammen mit seiner Sequenz ist ebenfalls gezeigt. Bei vielen Primern ist die Sequenz für alle anderen AIIeIe des Genorts nicht identisch. Für jeden der folgenden bevorzugten Primer weisen zusätzliche bevorzugte Primer Sequenzen auf, die den Sequenzen aus der homologen Region von anderen Allelen des Genorts oder deren Komplementen entsprechen. In einer Ausführungsform werden Genorte der Klasse I amplifiziert durch Verwendung eines A-, B- oder C-genortspezifischen Primers zusammen mit einem Klasse-l-genortspezifischen Primer. Der Klasse I Primer hybridisiert bevorzugt mit IVS-lll-Sequenzei (oder deren Komplementen) oder, bevorzugter, mit IVS-I- Sequenzen (oder deren Komplementen). Der Ausdruck „Klasse-l-spezifischer Primer", wie hier verwendet, bedeutet, daß der Primer mit einer Allelsequenz (oder deren Komplement) für mindestens zwei verschiedene Genorte der Klasse I hybridisiert und unter den verwendeten Bedingungen nicht mit Allelsequenzen eines Klasse-Il-Genorts hybridisiert. Vorzugsweise hybridisiert der Klasse-I-Primer mit mindestens einem AIIeI von jedem der A-, B- und C-Genorte. Besonders bevorzugt hybridisiert der Klasse-I-Primer mit einer Vielzahl von, am bevorzugtesten mit allen, Klasse-I-Allel-Genorten oder deren Komplementen. Exemplarische Klasse-l-genortspezifische Primer sind ebenfalls im folgenden aufgeführt.

HLA-Primer

Genort-A-spezif Ische Primer Lokalisierung ImAIIeI: nt 1735-1757 von A 3 Bezeichnung: SGD009.AIVS3.R2NP Sequenz: CATGTGGCCATCTTGAGAATGGA Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

nt 1541-1564 von A 2 SGD006.AIVS3.R1NP GCCCGGGAGATCTACAGGCGATCA

nt 1533-1553vonA2

A 2.1

CGCCTCCCTGATCGCCTGTAG

nt 1667-1685 von A 2

A 2.2

CCAGAGAGTGACTCTGAGG

nt 1704-1717 von A 2 A 2.3 CACAATTAAGGGAT

Genort-B-spezlf Ische Primer Lokalisierung im Allel: nt 1108-1131 von B17 Bezeichnung: SGD007.BIVS3.R1NP Sequenz: TCCCCGGCGACCTATAGGAGATGG Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung;

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung: Sequenz: >

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

nt1582-1604vonB17 SGD010.BIVS3.R2NP CTAGGACCACCCATGTGACAGC

nt 500-528 von B 27

B2.1

ATCTCCTCAGACGCCGAGATGCGTCAC

nt545-566vonB27

B 2.2

CTCCTGCTGCTCTGGGGGGCAG

nt 1852-1876 von B 27

B 2.3

ACTTTACCTCCACTCAGATCAGGAG

nt 1945-1976 von B 27

B 2.4

CGTCCAGGCTGGTGTCTGGGTTCTGTGCCCCT

nt 2009-2031 von B27

B 2.5

CTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG

nt 2054-2079 von B 27

B 2.6

CGCCTGAATTTTCTGACTCTTCCCAT Genort-C-spezlflsche Primer Lokalisierung im Allel: nt 1182-1204 von C3 Bezeichnung: SGD008.CIVS3.R1NP Sequenz: ATCCCGGGAGATCTACAGGAGATG Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im Allel: Bezeichnung:

Sequenz:

nt 1665-1687 von C3 SGD011.CIVS3.R2NP AACAGCGCCCATGTGACCATCCT

nt 499-525 von C1

C2.1

CTGGGGAGGCGCCGCGTTGAGGATTCT

nt 642-674 von C1

C 2.2

CGTCTCCGCAGTCCCGGTTCTAAAGTTCCCAGT

nt 738-755vonC1

C 2.3

ATCCTCGTGCTCTCGGGA

nt 1970-1987 von C1 C 2.4 TGTGGTCAGGCTGCTGAC

Lokalisierung Im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

nt 2032-2051 von C1 C AAGGTTTGATTCCAGCTT

nt2180-2217vonC1

C

CCCCTTCCCCACCCCAQUTQTTCCTQTCCATTCTTCAGQA

nt 2222-2245 von C1

C

CACATGGGCGCTGTTGGAGTGTCG

"Jasse-l-Genort-spezlfische Primer

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

nt 599-620 von A SGD005.IIVS1.LNP GTGAGTGCGGGGTCGGGAGGGA

nt 489-506 von A

1.1

CACCCACCGGGACTCAGA

nt 574-595vonA2

1.2

TGGCCCTGACCCAGACCTGGGC

nt 691-711 von A

1.3

GAGGGTCGGGCGGGTCTCAGC

nt 1816-1831 von A

1.4

CTCTCAGGCCTTGTTC

nt1980-1923vonA2

1.5

CAGAAGTCGCTGTTCC

DQA1-Genort-spezifische Primer Lokalisierung im AIIeI: nt 23-41 von DOA

Bezeichnung: SGD001.DQA1.LNP Sequenz: TTCTGAGCCAGTCCTGAGA Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz:

nt 45-64 von DQA

DQA3E1a

TTGCCCTGACCACCGTGATG

nt 444-463 von DQA

DQA3E1D

CTTCCTGCTTGTCATCTTCA

nt 536-553 von DQA

DQA3E1C

CCATGAATTTGATGGAGA

nt 705-723 von DQA

DQA3E1d

ACCGCTGCTACCAATGGTA

nt 789-806 von DQA

SGD003.DQA1.RNP

CCAAGAGGTCCCCAGATC DRA-Genort-spezlflsche Primer Lokalisierung im AIIeI: nt49-68 von DRAHUMMHDRAM (1183 nt

sequence, Accession No. K01171) Bezeichnung: DRAE1

Sequenz: TCATCATAGCTGTG CTGATG

Lokalisierung im AIIeI: Bezeichnung:

Sequenz: Lokalisierung im AIIeI:

Bezeichnung: Sequenz:

nt98-118vonDRAHUMMHDRAM(1183nt sequence, Accession No. K01171) DRA 5Έ2 (5' indicates the primer is used as the 5'primer) AGAACATQTGATCATCCAGGC

nt 319-341 von DRA HUMMHDRAM (1183 nt sequence, Accession No. K01171) . -DRA3'E2 CCAACTATACTCCGATCACCAAT

DRB-Genort-spezlfische Primer Lokalisierung Im AIIeI: nt 79-101 von DRB HUMMHDRC (1153 nt

sequence, Accession No. K01171 j Bezeichnung: DRB E1

Sequenz: TGACAGTGACACTGATGGTGCTG Lokalisierung im AIIeI: nt 123-143 von DRB HUMMHDRC (1163 nt

sequence, Accession No. K01171) Bezeichnung: DRBB¹E 2

Sequenz: GGGGACACCCGACCACGTTTC Lokalisierung im AIIeI: nt 357-378 von DRB HUMMHDRC (1153 nt

sequence, Accession No. K01171) Bezeichnung: DRB3'E2

Sequenz: TGCAGACACAACTACGGGGTTG DQBI-Genort-spezlflsche Primer Lokalisierung im AIIeI: nt 509-532 DQB1 DQw 1_va Bezeichnung: DQB E1 Sequenz: TGGCTGAGGGCAGAGACTCTCCC Lokalisierung im AIIeI: nt 628-647 of DQB1 DQw1_va Bezeichnung: DQB 5Έ 2 Sequenz: TGCTACTTCACCAACGGGAC Lokalisierung im AIIeI: nt816-834ofDQB1 DQw 1»a Bezeichnung: DQB 3Έ 2 Sequenz: G G TGTG CACACAC AACTAC Lokalisierung im AIIeI: nt 124-152 of DQB1 DQw 1,a Bezeichnung: DQB6'IVS1a Sequenz: AGGTATTTTACCCAGGGACCAAGAGAT Lokalisierung im AIIeI: nt314-340ofDQB1DQw1_va Bezeichnung: DQB5'IVS1b Sequenz: ATGTAAAATCAGCCCGACTGCCTCTTC Lokalisierung im AIIeI: nt 1140-1166DQB1 DQw 1_va Bezeichnung: DQB3MVS2 Sequenz: GCCTCGTGCCTTATGCGTTTGCCTCCT DPB 1-Genort-spezifische Primer Lokalisierung im AIIeI: nt6116-6136vonDPB14.1 Bezeichnung: DPB E1 Sequenz: TGAGGTTAATAAACTGGAGAA Lokalisierung im AIIeI: nt 7604-7624 von DPB14.1 Bezeichnung: DPB5'IVS1 Sequenz: , GAGAGTGGCGCCTCCGCTCAT Lokalisierung im AIIeI: nt 7910-7929 von DPB 14.1 Bezeichnung: DPB3'IVS2 Sequenz: GAGTGAGGGCTTTGGGCCGG Primerpaare für HLA-Analysen Es ist klar geworden, daß für jedes Primerpaar der 5'-stromaufwärts-Primer mit dem 5'-Ende der zu amplifizierenden Sequenz

hybridisiert und der 3'-stromabwärts-Primer mit dem Komplement des 3'-Endes der Sequenz hybridisiert. Die Primeramplifizieren eine Sequenz zwischen den Regionen der DNA, an die sich die Primer binden, und deren Komplementärsequenzeinschließlich der Region, an die sich die Primer binden. Deshalb hängt für jeden der oben beschriebenen Primer die Bindung anden für HLA kodierenden Strang oder die Bindung an sein Komplement davon ab, ob der Primer in diesem speziellen Primerpaarals 5'-stromaufwärts-Primer oder als 3'-stromabwärts-Pr!mer fungiert.

In einer Ausführungsform umfaßt ein Klasse-l-genortspezlfisches Primerpaar einen Klasse-l-genortspezifischen Primer und

einen für den A-, B- oder C-Genort spezifischen Primer. Vorzugsweise ist der Klasse-l-genortspezifische Primer der 5'-stromaufwärts-Primer und hybridisiert mit einem Teil des Komplements der IVS I. In diesem Fall ist der genortspezifische Primervorzugsweise der 3'-stromabwärts-Primer und hybridisiert mit IVS III. Die Primerpaare amplifizieren eine Sequenz von ungefähr1,0 bis ungefähr 1,5 Kb.

In einer anderen Ausführungsform umfaßt das Primerpaar zwei genortspezifische Primer, welche eine DNA-Sequenz

amplifizieren, die nicht das oder die variablen Exons enthält. In einem Beispiel dieser Ausführungsform sind der3'-stromabwärts-Primer und der 5'-stromaufwärts-Primer Klasse-l-genortspezifische Primer, die mit IVS III und seinem

Komplement hybridisieren. In diesem Fall wird eine Sequenz von ungefähr 0,5Kb, welche der Intronsequenz entspricht,

amplifiziert.

Vorzugsweise werden eher genortspezifische Primer für einen speziellen Genort als für die HLA-Klasse für jeden Primer des Primerpaares verwendet. Aufgrund von Unterschieden in den Klasse-Il-Gensequenzen sind nur genortspezifische Primer, die

spezifisch für nur einen Genort sind, an der Amplifizierung der DRB-, DQA1-, DQB- und DPB-Genorte beteiligt. Deshalb ist beijedem der bevorzugten Klasse-Il-Genort-Primerpaare jeder Primer des Paares nur an der Amplifizierung des ausgewählten

Genorts und nicht irgendwelcher anderer Klasse-Il-Genorte beteiligt. Analytische Methoden

In einer Ausführungsform schließt die amplifizierte Sequenz genügend große Intronsequenzen ein, um Längenpolymorphismen zu enthalten. Die Primer-definierten Längenpolymorphismen (PDLPs) zeigen das HLA-Genortallel in der Probe an. Für einige HLA-Genorte erzeugt die Verwendung eines einzelnen Primerpaars Primer-definierte Längenpolymorphismen, die zwischen einigen der AIIeIe des Genorts unterscheiden. Für andere Genorte werden zwei oder mehr Primerpaare in getrennten Amplifizierungsschritten verwendet, um die AIIeIe zu unterscheiden. Für weitere Genorte wird die amplifizierte DNA-Sequenz mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen gespalten, um zwischen den Allelen zu unterscheiden. Die Primerdefinierten Längenpolymorphismen sind besonders nützlich in Screening-Verfahren.

In einer weiteren Ausführungsform liefert die Erfindung ein verbessertes Verfahren, welches PCR Amplifizierung einer genomischen HLA-DNA-Sequenz eines HLA Genorts verwendet. Nach der Amplifizierung wird die amplifizierte DNA-Sequenz mit mindestens einer Endonuklease kombiniert, um ein Fragmentgemisch zu erzeugen. Die Endonuklease spaltet die amplifizierte DNA-Sequenz in einen Satz von Fragmenten mit unterschiedlichen Fragmentlängen. Üblicherweise wird die amplifizierte DNA aufgeteilt und zwei oder mehr Endonukleasen-Fragmentgemische werden erzeugt. Die Fragmentgemische können getrennt oder kombiniert dazu verwendet werden, um RFLP-Muster zu erzeugen, die die Unterscheidung zwischen Individuen erlauben. Zusätzliche Fragmentgemische können hergestellt werden, um vergrößerte Spezif ität zu liefern und um damit sogar eng verwandte Individuen mit demselben HLA-Typ zu unterscheiden.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Anwesenheit eines bestimmten AIIeIs dadurch verifiziert werden, daß man ein zweistuf iges Amplifizierungsverfahren durchgeführt, in dem eine amplifizierte Sequenz, die von dem ersten Primerpaar erzeugt wurde, mit einem zweiten Primerpaar amplifiziert wird, welches sich an eine Sequenz innerhalb der ersten amplifizierten Sequenz bindet, und damit eine neue Sequenz definiert. Das erste Primerpaar kann für ein oder mehrere AIIeIe des HLA-Genorts spezifisch sein. Das zweite Primerpaar ist vorzugsweise für ein statt für mehrere AIIeIe des HLA-Genorts spezifisch. Die Anwesenheit einer amplifizierten Sequenz zeigt die Anwesenheit dieses AIIeIs an, was durch die Produktion charakteristischer RFLP-Muster Bestätigung findet.

Um RFLP-Muster zu analysieren, werden die Fragmente in dem Fragmentgemisch nach der Größe aufgetrennt und dann sichtbar gemacht. Im Falle der Bestimmung eines speziellen HLA-Genorts ist die Analyse darauf gerichtet, diejenigen zwei Allelsequenzen nachzuweisen, die diesen Genort eindeutig in jedem Individuum charakterisieren. Dies wird üblicherweise durchgeführt, indem die RFLP-Muster des Probenfragmentsgemischs mit einem Muster verglichen werden, welches von einer Kontrollprobe eines bekannten HLA-Alleltyps arzeugt wurde. Wenn die Methode jedoch für Vaterschaftsüberprüfungen oder in der Gerichtsmedizin verwendet wird, muß die Analyse keinen speziellen Genort oder Genorte identifizieren, sondern sie kann ausgeführt werden durch den Vergleich von einzelnen oder mehreren RFLP-Mustern eines Individuums mit denen eines anderen Individuums unter Verwendung derselben Restriktionsendonuklease und derselben Primer, um Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen den Mustern zu bestimmen.

Die Anzahl der Fragmentgemische, die für eine bestimmte Analyse herzustellen sind, wird von der gewünschten Information und der speziellen Probe, welche zu analysieren ist, abhängen. Beispielsweise kann ein Fragmentgemisch ausreichend sein, um festzustellen, daß ein Individuum nicht die Person sein kann, deren Blut am Ort eines Verbrechens gefunden wurde. Im allgemeinen wird die Verwendung von zwei oder drei Fragmentgemischen für jeden der zwei oder drei HLA-Genorte für die Anwendung bei Übereinstimmungsversuchen (Gerichtsmedizin, Vaterschaft) ausreichend sein. Zur vollständigen Bestimmung des HLA-Haplotyps, zum Beispiel für eine Transplantation, kann es nötig sein, zusätzliche Genorte zu analysieren. Wie oben beschrieben, können Kombinationen von Primerpaaren im Amplifizierungsverfahren verwendet werden, um einen bestimmten HLA-DNA-Genort zu amplifizieren, unabhängig von dem in der Probe vorhandenen AIIeI. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proben der HLA-DNA in Aliquote aufgeteilt, welche ähnliche Mengen von DNA enthalten, und mit Primerpaaren (oder Kombinationen von Primerpaaren) amplifiziort, um amplifizierte DNA-Sequenzen für zusätzliche HLA-Genorte zu erzeugen. Jede Amplifizierungsmischung enthält nur Primerpaare für einen HLA-Genort. Die amplifizierten Sequenzen werden vorzugsweise gleichzeitig weiterbehandelt, so daß eine Anzahl von durch Endonukleasen erzeugten RFLP-Fragmentmustern von einer Probe erzeugt werden kann. Auf diese Weise kann der HLA-Typ für eine Anzahl von Allelen gleichzeitig bestimmt werden. ·

Als Alternative liefert die Herstellung einer Anzahl von RFLP-Fragmentmustern zusätzliche Vergleiche von Mustern zur Unterscheidung von Proben in gerichtsmedizinischen und Vaterschaftsanalysen, wo die Analyse eines Genorts häufig nicht ausreicht, genügend Information für die Bestimmung zu liefern, ob die Proben-DNA dasselbe AIIeI hat wie die Vergleichsprobe. Die Verwendung von HLA-Typen in Vaterschaftstests oder Tests für Transplantationen und bei der Diagnose und Vorhersage von Krankheiten wird in Basic & Clinical Immunology, 3.Auflage (1980), Lange Medical Publications, Seiten 187-190, beschrieben. HLA-Bestimmungen fallen in zwei allgemeine Kategorien. Die erste betrifft die Übereinstimmung von DNA eines Individuums und einer Probe. Diese Kategorie schließt Bestimmungen in der Gerichtsmedizin und Vaterschaftstests ein. Für die Analyse der Kategorie 1 ist der spezielle HLA-Typ weniger wichtig als die Frage, ob die DNA der Individuen verwandt ist. Die zweite Kategorie ist die Gewebebestimmung, wie bei der Verwendung bei Transplantationen. In diesem Fall wird die Abstoßung des gespendeten Bluts oder Gewebes davon abhängen, ob der Empfänger und der Spender dieselben oder verschiedene Antigene expremieren. Dies steht im Gegensatz zu Analysen der ersten Kategorie, wo Unterschiede in entweder den Introns oder den Exons der HLA-DNA entscheidend sind.

Zur Anwendung in der Gerichtsmedizin werden die DNA-Probe de» mutmaßlichen Täters und DNA, die am Ort des Verbrechens gefunden wurde, gleichzeitig analysiert und verglichen, um zu beistimmen, ob die DNA vom selben Individuum stammt. Die Bestimmung schließt vorzugsweise die Analysen von mindestens drei Fragmentmustern der amplifizierten DNA des D0A1-Genorts und vorzugsweise auch des A-Genorts ein. Besonders bevorzugt schließt die Bestimmung auch die Analyse von mindestens drei Fragmentgemischen amplifizierter DNA eines zusätzlichen Genorts, z. B. des DPB-Genorts ein. Auf diese Weise erhält man eine ausreichende Wahrscheinlichkeit dafür, daß die Unterschiede zwischen den DNA-Proben feststellbar sind. Für Vaterschaftstests umfaßt die Analyse den Vergleich von DNA des Kindes, der Mutter und des mutmaßlichen Vaters, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, daß das Kind den obligaten DNA-Haplotyp des mutmaßlichen Vaters geerbt hat. Daß heißt, jede DNA-Sequenz des Kindes, welche nicht in der DNA der Mutter anwesend ist, muß vom mutmaßlichen Vater stammen können. Die Analyse von zwei oder drei Fragmentgemischen des DQA1-Genorts und vorzugsweise auch des A-Genorts ist

üblicherweise ausreichend. Bevorzugter schließt die Bestimmung auch die Analyse von Fragmentgemischen eines zusätzlichen Genorts, z. B. des DPB-Genorte, ein.

Für Bestimmungen des Gewebetyps für Übereinstimmungstests zur Transplantation, reicht oft die Analyse von drei Genorten (HLAA, B und DR) aus. Vorzugsweise schließt die endgültige Analyse auch den Vergle'ch zusätzlicher Genorte wie DQ und DP ein.

Erzeugung von RFLP-Fragmentmustern Die folgende Tabelle exemplarischer Fragmentlängenmuster demonstriert unterscheidende Muster. Wie In der Tabelle gezeigt,

spaltet beispielsweise Bsrl amplifizierte Sequenzen der A2-, A3- und A9-Allele, definiert durch die Primer SGD005.IIVS1 .LNP und

SGD009.AIVS3.R2NP, in Fragment-Sätze mit der folgenden Anzahl von Nukelotiden (740,691), (809,335,283) und (619,46?, 256,

93). Die Fragmentmuster zeigen deutlich auf, welches der drei A-AIIeIe anwesend ist. Die folgende Tabelle zeigt eine Anzahlexemplarischer Endonukleasen, welche unterschiedliche RFLP-Fragmentmuster für exemplarische A-Allelsequenzenerzeugen.

Tabelle 2 veranschaulicht den Satz von RFLP-Fragmenten, welcher durch Vc ondung der vorgesehenen Endonukleasen zur Analyse der drei A-Gonortallele bevorzugt wird. Für jede Endonuklease ist die Anzahl der Nukieotide jedes Fragments in einem

von der Endonuklease erzeugten Satz, aufgelistet. Der erste Teil der Tabelle zeigt die RLFP-Fragmeniiängen unter VerwendungderSGD009.AIVS3.R2NP und SGD005.IIVS1.LNP genannten Primer, welche die längere der zwei beispielhaften Sequenzenerzeugen. Der zweite Teil der Tabelle zeigt RFLP-Fragmentlängen unter Verwendung der SGD006.AIVS3.R1 NP und

SGD005.IIVS1 .-LNP genannten Primer, welche die kürzere der Sequenzen erzeugen. Der dritte Teil der Tabelle zeigt die Fragmentlängen einer DQA1 genortspezifischen amplifizierten Sequenz, definiert durch die Primer SGD001 .DQA1 .LNP und

SGD003.DQA1.RNP.

Wie in der Tabelle gezeigt, produziert jede der Endonukleasen ein charakteristisches RFLP-Fragmentmuster, mit dem leicht zu

unterscheiden ist, welcher der drei A-AIIeIe in der Probe anwesend ist.

Tabelle 5 RFLP Fragmentmuster

A-Lang

Bsrl	A2 A3 A9	809	740	691	619	462	335	283	256	80	93	f
CfM 01	A2 A3 A9	1055	786	473	399 399 399	245 247
Drall	A2 A3 A9	698	596	427	369	315	251 251 251	247	138
Fokl	A2 A3 A9	1004	728	515	248	225	213	151 151 151		72
Gsul	A2 A3 A9.	904	868	638	547	523	419	373	36	51
Hphl	A2 A3 A9	1040	643	419 419	375 373		239	218	163	138
Mboll	A2 A3 A9	1349	1011	893	194	165	143 143	132	115	138
Ppuml	A2 A3 A9	698	676	503	369	364	295	ro ro ro cn cn cn	242
Pssl	A2 A3 A9	695	596	427	366	315	295	ro ro ro cn cn cn	242

Bsrl A 2 691 254

A3 345 335 283

A9 619 256 93

CfM 01 A 2

A3

A9 Drall A 2

A3

A9

Fokl A 2

A3

A9 Gsul A2

A3

A9

Hphl A 2 A3 A9

Mboll A 2 A3 A9

Ppuml A 2

A3

A 9

Pssl A 2

A3

A 9

	315	295	251	210	138	143	129	51
			251	210		143	129	51
427	293		251	210		146	129
		248			151	36
			225	213	151
539	868				151
					61
904					59
		414	373	178
554	411		339
	414	375		177
	373		178

257	251	212	72	69
	251	210		66
	219	211	72
251			72
251		207	72	66
251	208

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Screening-Analyse für genetisch bedingte Krankheiten

Die Träger genetisch bedingter Krankheiten und die von der Krankheit Betroffenen können durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert werden. Abhängig von der Krankheit kann die Screening-Analyse dazu verwendet werden, um die Anwesenheit von einem oder mehreren mit der Krankheit assoziierten Allelen oder die Anwesenheit von mit der Krankheit assoziierten Haplotypen nachzuweisen. Darüber hinaus kann das Verfahren durch die Analyse von Haplotypen genetisch bedingte Krankheiten nachweisen, die nicht mit Variationen in kodierenden Regionen assoziiert sind, sondern in regulatorischen oder anderen nicht translatierten Regionen des Genorts gefunden werden. Das Screening-Verfahren wird im folgenden am Beispiel der Analyse von zystischer Fibröse (CF) erläutert.

Zystische Fibröse ist eine autosomal-rezessive Krankheit, die die Anwesenheit eines mutierten Gens auf jedem Chromosom erfordert. CF ist die häufigste genetisch bedingte Krankheit bei Kaukasiern, die einmal auf 2000 Lebendgeburten auftritt. Es wird geschätzt, daß einer von 40 Kaukasiern Träger für die Krankheit ist.

Kürzlich wurde über eine spezifische Deletion dreier benachbarter Basenpaare im offenen Leserahmen für das mutmaßliche CF-Gen, welche zum Verlust eines Phenylalaninrests an Position 508 des vorhergesagten 1480 Aminosäuren langen Polypeptide führt, berichtet (Kerem et al., Science 245:1073-1080 (1989)). Basierend auf der Haplotyp-Analyse, ist die Deletion möglicherweise für die meisten CF-Mutationen in nordeuropäischen Populationen (ungefähr 68%) verantwortlich. Von einer zweiten Mutation wird berichtet, daß sie in einigen südeuropäischen Populationen vorherrschend ist. Weitere Daten weisen darauf hin, daß mehrere andere Mutationen die Krankheit verursachen können.

Studien der Haplotypen von Eltern von CF-Patienten (die notwendigerweise einen normalen Haplotyp und einen krankheitsassoziierten Haplotyp aufweisen) wiesen darauf hin, daß es mindestens 178 mirdem CF-Genort assoziierte Haplotypen gibt. Von diesen Haplotypen sind 90 nur mit der Krankheit assoziiert, 78 werden nur bei normalen Individuen gefunden und 10 sind sowohl mit der Krankheit als auch mit normalen Individuen assoziiert (Kerem et al., siehe oben). Die Krankheit wird offensichtlich durch mehrere verschiedene Mutationen verursacht, von denen einige mit sehr niedriger Frequenz in der Population auftreten. Wie durch die Information bezüglich des Haplotyps demonstriert, gibt es mehr mit dem Genort assoziierte Haplotypen als es mutierte AIIeIe gibt, die für die Krankheit verantwortlich sind.

Ein genetisches Screenlng-Programm (basierend auf der Amplifizierung von Exon-Regionen und Analyse der resultierenden amplifizierten DNA-Sequenzen mit Sonden, die spezifisch sind für jede der Mutationen, oder mit Enzymen, die RFLP-Muster erzeugen, die charakteristisch sind für jede Mutation) mag Jahre zur Entwicklung benötigen. Solche Tests würden von Nachweis und Charakterisierung jeder der Mutationen abhängen oder mindestens der Mutationen, die ungefähr 90 bis 95% oder mehr der Krankheitsfälle verursachen. Die Alternative ist, nur ungefähr 70 bis 80% der CF-assoziierten Gene nachzuweisen. Diese Alternative wird allgemein als nicht akzeptabel betrachtet und ist der Grund für erhebliche Besorgnis der wissenschaftlichen Fachwelt. Das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt direkt die mit dem Genort assoziierten Haplotypen und kann unter den gegenwärtig 178 als mit dem Genort der Krankheit assoziiert erkannten Haplotypen Haplotypen nachweisen. Weitere Haplotypen, die mit der Krankheit assoziiert sind, können leicht durch die schnelle Analyse von DNA zahlreicher CF-Patienten mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden. Darüber hinaus können irgendwelche Mutationen, die mit nicht kodierenden regulatorischen Regionen assoziiert sein können, ebenfalls durch dieses Verfahren nachgewiesen und durch das Screening-Verfahren identifiziert werden. Anstatt zu versuchen, jeden Defekt in einer kodierenden Region, welche die Krankheit verursacht, zu bestimmen und dann nachzuweisen, amplifiziert das erfindungsgemäße Verfahren Intronsequenzen, die mit dem Genort assoziiert sind, um allele und suballele Muster zu bestimmen. Im Gegensatz zur Verwendung von mutationsspezifischen Sonden, mit denen nur bekannte Sequenzdefekte nachgewiesen werden können, zeigen neue PDLP- und RFLP-Muster, die durch Intronsequenzen erzeugt werden, die Anwesenheit eines vorher unerkannten Haplotyps an.

Dieselbe Analyse kann bei Mutationen des Genorts für Phenylalanin-Hydroxylase, welche Phenylketonurie verursacht, und für Beta-Globin-Mutationen, die Beta-Thalassemie und Sichelzellenanämie verursachen, und für andere Genorte, von denen es bekannt ist, daß sie mit einer genetisch bedingten Krankheit assoziiert sind, durchgeführt werden. Darüber hinaus Ist weder die Kenntnis der Mutationsstelle noch der Stelle eines Krankheitsgens nötig, um krankheitsassoziierte Haplotypen zu bestimmen. Amplifizierte Intronsequenzen in den Regionen von ganz in der Nähe befindlichen flankierenden RFLP-Markern, wie sie bekannt sind für die Huntingtonsche Krankheit und viele andere vererbte Krankheiten, können genügend Information für ein Screening-Verfahren für mit der Krankheit assoziierte Haplotypen liefern. '

Muskeldystrophie (MD) ist eine mit dem Geschlecht verknüpfte Krankheit. Das krankheitsassoziierte Gen umfaßt eine 2,3 Millionen Basenpaare lange Sequenz, welche für ein 3685 Aminosäuren-Protein, Distrophin, kodiert. Eine Karte der Mutationen bei 128 von 134 Patienten mit Bekkerscher Muskeldystrophie und 160 Patienten mit Duchenne'scher Muskeldystrophie identifizierte 115 Deletionen und 13 Duplikationen in der Sequenz der kodierenden Region (Den Dünnen et al.. Am. J. Hum. Genet., Band 45, Seiten 835-847 [1989]). Obwohl die Krankheit mit einer großen Anzahl von Mutationen assoziiert ist, die in großem Umfang variieren, haben die Mutationen eine nicht statistische Verteilung in der Sequenz und sind in zwei Hauptmutationsgebieten („hot spots") (Den Dünnen et al., siehe oben) lokalisiert. Weiterhin wurde ein Ort häufiger Rekombination („recombination hot spot") innerhalb der Gensequenz identifiziert (Grimm et al., Am. J. Hum. Genet, Band 45, Seiten 368-372 (1989]).

Zur Analyse von MD werden vorzugsweise Haplotypen auf jeder Seite des bevorzugten Rekombinationsorts („hot spot") bestimmt. Primerpaare, die amplifizierte DNA-Sequenzen definieren, sind vorzugsweise in der Nähe, innerhalb ein bis 10 Kbp auf einer Seite des Rekombinationsortes („hot spots") lokalisiert. Außerdem sind aufgrund der erheblichen Größe des Gens die Primerpaare, welche amplifizierte DNA-Sequenzen definieren, vorzugsweise in der Nähe jedes Endes der Gensequenz lokalisiert und besonders bevorzugt auch an einer Stelle in der Mitte auf jeder Seite des bevorzugten Rekombinationspunktes („hot sport"). Auf diese Weise können mit der Krankheit assoziierte Haplotypen identifiziert werden.

Von anderen Krankheiten, Insbesondere malignen Tumoren, ist gezeigt worden, daß sie das Ergebnis eines vererbten rezessiven Gens zusammen mit einer somatischen Mutation des normalen Gens sind. Ein bösartiger Tumor, der auf einen solchen „Verlust der Heterogenität" zurückgeht, ist das Retinoblastom, ein Krebs in der Kindheit. Der Verlust des normalen Gens durch Mutation wurde demonstriert durch den Nachweis der Gegenwart einer Mutation in allen somatischen Zellen (damit einen Ursprung in der Keimzelle anzeigend) und den Nachweis einer zweiten Mutation in einigen somatischen Zellen (Scheffer et al., Am. J. Hum. Genet., Band 45, Seiten 252-260 [1989]). Die Krankheit kann nachgewiesen werden durch die Amplifizierung genomischer DNA-Sequenzen einer somatischen Zelle, die genügend Intronsequenznukleotide umfaßt. Die amplifizierten DNA-Sequenzen

enthalten vorzugsweise Inkonsequenzen, die In der Nähe von einem oder mehreren der von Scheffer et al. (oben) beschriebenen Marker lokalisiert sind. Vorzugsweise werden eine ampllfizierte DNA-Sequenz, die in der Nähe eines intragenen Markers lokalisiert ist, und eine amplifizierte DNA-Sequenz in der Nähe eines flankierenden Markers verwendet. Eine exemplarische Analyse für CFwird detailliert inden Beispielen beschrieben. Die Analyse von Genorten fürandere genetisch bedingte Krankheiten, die auf ein oder mehrere Gene zurückzuführen sind, kann auf ähnliche Weise durchgeführt werden. Wie die vorstehende Beschreibung zeigt, Ist das erfindungsgemäße Verfahren der Analyse von Inkonsequenzen allgemein anwendbar für den Nachwels jeder Art eines genetischen Merkmals. Andere Merkmale, die von einem oder mehreren Genen verursacht werden, können leicht durch die erfindungsgemäßen Verfahren analysiert werden. Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Analyseverfahren für alle eukaryotischen Zellen anwendbar und werden bevorzugt bei solchen von * Pflanzen und Tieren angewandt. Beispiele der Analyse von BoLA (Rinder-MHC-Determinanten) demonstrieren weiter die generelle Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Verfahren.

Diese Erfindung wird weiter erläutert durch die folgenden spezifischen, aber die Erfindung nicht beschränkenden Beispiele. Verfahren, die zur Umsetzung in die Praxis geeignet sind, werden in der Gegenwartsform beschrieben, und Verfahren, die im Labor ausgeführt worden sind, werden in der Vergangenheitsform beschrieben.

Beispiel 1 Gerichtsmedizinische Tests DNA, die aus pnripherem Blut des mutmaßlichen Täters eines Verbrechens extrahiert wurde, und DNA vom Blut, welches am Tatort gefunden wurde, werden analysiert, um zu bestimmen, ob die zwei DNA-Proben vom selben oder von verschiedenen Individuen stammen. Die extrahierte DNA aus jeder Probe wird dazu verwendet, für jede Probe ein Aliquot-Paar herzusteilen, wobei jedes Aliquot 1 pg Proben-DNA enthält. Jedes Aliquot eines Paares wird in einem Gesamtvolumen von 100 μΙ mit einem Primerpaar (1 pg eines

jeden Primers), dNTPs (2,SmM von jedem) und 2,5 Einheiten Taq-Polymeruoe in Amplifizierungspuffer (5OmM KCI; 1OmM

Tris-HCI, pH 8,0; 2,5 mM MgCI₂; 100 Mg/ml Gelatine) kombiniert, um 4 Amplifizlerung-Reaktionsmischungen herzustellen. Das

erste Primerpaar enthält die Primer SGD005.IIVS1.LNP und SGD009.AIVS3.R2NP (spezifisch für den Genort A). Das zweite

Primerpaar enthält die Primer SGD001 .DQA1.LNP und SGD003. DQA1 .RNP (DQA-Genort-spezifisch). Jeder Primer wird

synthetisiert unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 308 A DNA Synthesizers. Die

Amplifizierungsreaktionsmischungen werden VA (DNA des Verdächtigen, Genort-A-spezifische Primer), VD (DNA des Verdächtigen, Genort-DQA1 -spezifische Primer), TA (Tatort-DNA, Genort-A-spezifische Primer) und TD (Tatort-DNA, Genort- DQA1 -spezifische Primer) genannt. Jede Amplifizierungs-Reaktionsmischung wird 30 Sekunden lang auf 94⁰C erhitzt. Die Primer werden mit der Proben-DNA durch Abkühlen der Reaktionsmischungen auf 65⁰C für jede der Genort-A-spezifischen Amplifizierungsmlschungen und auf 55⁰C für

jede der Genort-DQAI-spezifischenAmplifizierungsmischungen und Aufrechterhalten der betreffenden Temperatur für1 Minute, verschmolzen. Der Primerverlängerungs-Schritt wird durchgeführt durch Erhitzen jeder der

Amplifizierungsmischungen auf 72⁰C für eine Minute. Der Zyklus von Denaturierung, Verschmelzen und Verlängerung wird

30mal für jede Amplifizierungsmischung wiederholt.

Jede Amplifizierungsmischung wird aliquotiert, um drei Restriktionsendonuklease-Spaltungsmischungen pro Amplifizierungsmischung zu erhalten. Die Reaktionsmischungen für den Genort A werden kombiniert mit den Endonukleasen Bsrl, CfM01 und Drall. Die DQA1 -Reaktionmischungen werden mit AIuI, Cvijl und Ddel kombiniert. Um jede Spaltungsmischung zu erzeugen, wird jedes der drei identischen Aliquote von 10pg jeder Amplizierungsmischung mit

5 Einheiten des betreffenden Enzyms 60 Minuten lang bei 37⁰C unter den vom Hersteller jeder Endonuklease empfohlenen

Bedingungen kombiniert. Nach der Spaltung werden die drei Spaltreaktionsmischungen für jede der Proben (VA, VD, TA und TD) vereinigt und der Elektrophorese auf einem 6,5%igen Polyacrylamid-Gel für 45 Minuten bei 100 V unterworfen. Nach der Elektrophorese wird das Gel mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Proben enthalten Fragmente der folgenden Längen: '

VA: 786,619,596,462,427,399,256,251,93,80

TA: 809,786,619,596,473,462,427,399,369,335,315,283,256,251,247,93,80 VD: 388,338,332,277,219,194,122,102,89,79,64,55 TD: 587,449,388,338,335,332,277,271,219,194,187,122,102,99,89,88,79,65,64,55

Die Analyse zeigt, daß das Blut vom Tatort und vom mutmaßlichen Täter nicht vom selben Individuum stammen. Das Blut vom Tatort enthält A3, A9.DQA1 0501, DQA1 0301 und das Blut des mutmaßlichen Täters enthält A9,A9,DQA1 0501, DQA1 0501.

Beispiel 2 Vaterschaftstests Gewebe der Zottenhaut wurde durch eine durch den Gebährmutterhals hindurch ausgeführte Biopsie eines 7 Wochen alten Fötus erhalten. Die Blutproben wurden durch Venenpunktion von der Mutter (M) und vom angenommenen Vater (AV) erhalten. DNA wurde aus der Zottenhautbiopsie und aus den Blutproben extrahiert. Die DNA wurde aus der Probe von M durch Verwendung eines nicht-ionischen Detergens (Tween 20) und Proteinase K extrahiert. DNA aus der Probe von V wurde durch

hypotonische Lyse extrahiert. Genauer wurden 100 μΙ Blut in PBS auf 1,5ml verdünnt und zentrifugiert, um den Leukozytenfilmzu entfernen. Nach zwei hypotonischen Lysis-Behandlungen mitderResuspension von Leukozytenzeilen in Wasser, wurden die

Pellets gewaschen, bis die rote Farbe verschwand. Die farblosen Pellets wurden in Wasser resuspendiert und 20 Minuten lang

gekocht. Fünf 10mm lange „Fronds" der Darmhaut wurden erhalten. Ein „Frond" wurde in 200μΙ Wasser eingetaucht. NaOHwurde bis zu einer Konzentration von 0,05 M zugegeben. Die Probe wurde 20 Minuten lang gekocht und dann mit HCIneutralisiert. Für keine der Proben wurde eine weitere Reinigung durchgeführt.

Die extrahierte DNA wurde zur Amplifizierung der Sequenzen, die mit den HLA-Genorten DQA1 und DPB1 assoziiert sind, der PCR-Reaktion unterworfen. Die verwendeten Primer waren: (1) als 5'-Primer für den DQA1-Genort der Primer SQD001 .DQA1 .LNP (DQA 5'IVSI) (entsprechend den Nukleotlden 23-39 der 0QA1 0301 Allelsequenz) und als 3'-Primer für den DQA1-Genort der Primer SGD003.DQA1.RNP (DQA 3¹IVS2, entsprechend dem Nukleotld 789-806 der DQA1 0301 Sequenz);

(2) als DPB Primer die Primer 5'IVS1 (Nukleotlde 7604-7624) und 3'IVS2 (Nukleotlde 7910 bis 7929). Die

Amplifizlerungsreaktionsmischungen bestanden aus: 150ng eines jeden Primers; 25 pg der zu testenden DNA; 1OmM TrIs HCI,

pH 8,3; 5OmM KCI; 1,5mM MgCI₂; 0,01 % (Gew./Vol.) Gelatine; 200μΜ dNTPs; Wasser bis zu einem Volumen von 100μΙ und2,5 Einheiten Taq-Polymerase.

Die Ampllfizierung wurde ausgeführt durch Erhitzen der Amplifizlerungsreaktionsmischung auf 94⁰C für 10 Minuten vor der Zugabe von Taq-Polymerase. Für DQA1 wurde die Ampllfizierung bei 94⁰C für 30 Sekunden durchgeführt, dann bei 55⁰C.

30 Sekunden lang, dann '< Minute lang bei 72⁰C für 30 Zyklen, abschließend für 10 Minuten bei 72⁰C. Für DPB wurde die

Amplifizierung durchgeführt bei 96⁰C für 30 Sekunden, dann 30 Sekunden lang bei 65⁰C und abschließend 10 Minuten lang bei Ein technisch zufriedenstellender Verlauf der Amplifizierung wurde bestätigt durch einen Gelelektrophoresetest, welcher die Anwesenheit doppelsträngiger DNA der erwarteten Größe in derAmplifizlerungsreaktlonsmischung zeigte. Das Testgel enthielt

2% Agarose in TBE (Tris-Borat-EDTA) Puffer; es wurde beladen mit 15μΙ der Amplifizierungsreaktionsmischung pro Spur und die

Elektrophorese wurde bei 200V für ungefähr 2 Stunden lang durchgeführt, bis der die Spur markierende Farbstoffe bis 7cm in

das 10cm lange Gel hineingewandert war.

Die amplifizierten DOA1- und DPB1 -Sequenzen wurden mit Restriktionsendonuklease gespalten, wobei Ddel und Mboll (8 bzw.

12 Einheiten bei 37⁰C für 3 Stunden) für DQA1 und RSaI und Fokl (8 bzw. 11 Einheiten bei 37⁰C über Nacht) für DPB1 in 0,5 bis 2 μΙder vom Lieferanten Pharmacia empfohlenen Enzympuffer mit 16-18 μΙ des amplifizierten Produkts verwendet wurden. Diegespaltene DNA wurde der Fragmentlänge nach durch Gelelektrophorese (3% Nusleve) aufgetrennt. Die RFLP-Muster wurdenunter UV-Licht nach Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid untersucht.

Die Analyse der Fragmentmuster wurde durchgeführt durch die Allelzuordnung der nicht-maternalen AIIeIe anhand der

erwarteten Fragmentgrößen, basierend auf den Sequenzen bekannter Endonukleaserestriktlonsstellen. Die Analyse des

Fragmentmusters zeigte, daß das obligate paternale DQAI-AIIeI DQA1 0102 und das DPB-AIIeI DPwI war. Die Fragmentmuster

waren konsistent mit der Annahme, daß AV der biologische Vater war.

Um die Wahrscheinlichkeit der wahren Vaterschaft zu berechnen, wurden die HLA-Typen zugeordnet. Die maternalen und AV DQA1 -Typen waren in Einklang mit denjenigen, die anhand der HLA-Klasse-Il-Gentypen, die durch serologische Tests mit

lymphocytentoxischen Antiseren bestimmt worden waren, vorhergesagt wurden.

Ausgehend vom Kopplungsgleichgewicht der AIIeIe der beiden HLA-Genorte ergab sich dio kombinierte Wahrscheinlichkeit für

eine nicht-Vaterschaft zu:

0,042 X 0,314 - 0,013

d.h., die Wahrscheinlichkeit der Vaterschaft ist (1 - 0,013) oder 98,7%.

Die relative Wahrscheinlichkeit der Vaterschaft ist so 74:75, d. h. die Wahrscheinlichkeit, daß AV nicht der biologische Vater ist, beträgt etwa 1 aus 75. Die Streitparteien entschlossen sich, diese Ergebnisse als Bestätigung der Vaterschaft des angenommenen Vaters für den Fötus zu betrachten.

Beispiel 3 Analyse des HLA-DQA1-Genorts Die drei Haplotypen des HLA-DQA1 -0102-Genorts wurden wie unten beschrieben analysiert. Diese Haplotypen sind DQA1 0102 DR15 Dw2; DQA1 0102 DR16 Dw 21; und DQA1 0102 DR13 Dw19. Die Unterscheidung zwischen den Haplotypen ist besonders

schwierig, da es nur einen Unterschied von einem Basenpaar zwischen den 0102-Allelen und den 0101- und 0103-Allelen gibt,wobei dieser Unterschied in DQA 1-Allelsequenzen nicht einzigartig ist.

Das verwendete Verfahren zur Amplifizierung 1st dasselbe wie das in Beispiel 1 beschriebene, mit der Ausnahme, daß zur Amplifizierung 30 Zyklen bei 94⁰C 30 Sekunden lang, bei 6O°C 30 Sekunden lang und bei 72⁰C 60 Sekunden lang verwendet

werden. Die Sequenzen der Primer waren: '

SGD 001— 5'TTCTGAGCCAGTCCTGAGA 3'; und SGD 003 —5' GATCTGGGGACCTCTTGG 3'.

Diese Primer hybridisieren mit Sequenzen ungefähr 50 Basenpaare stromaufwärts vom 5'-Ende des zweiten Exons und erzeugen amplifizierte DNA-Sequenzen im Bereich von 700 bis 800bp.

Nach der Amplifizierung wurden die amplifizierten DNA-Sequenzen der Elektrophorese auf einem 4%igen Polyacrylamidgel zur Bestimmung PDLP-Typus unterworfen. In diesem Fall wandern die amplifizierten DNA-Sequenzen für 0102 mit (den genauso langen) 0101-Allelen und eine nachfolgende Enzymspaltung ist notwendig, um sie zu unterscheiden. Die amplifizierten DNA-Sequenzen wurden gespalten unter Verwendung des Restriktionsenzyms AIuI (Bethesda Research Laboratories), welche DNA an der Sequenz AGCT spalten. Die Spaltung wurde durchgeführt durch Mischen von fünf Einheiten (1 μΙ) des Enzyms mit 10μ! der amplifizierten DNA-Sequenz (zwischen ungefähr 0,5 und 1 Mg DNA) im vom Hersteller gelieferten Enzympuffer gemäß Anweisung des Herstellers, um eine Spaltreaktionsmischung herzusteller·. Die Reaktionsmischung wurde dann zur vollständigen enzymatischen Spaltung zwei Stunden lang bei 37⁰C inkubiert.

Die Produkte der Spaltreaktion werden mit ungefähr 0,1 Mg „Leiter"-Nukleotidsequenzen (Nukleotidkontrollsequenzen, die bei einer Länge von 123bp beginnen und in Schritten von 123bp in der Länge zunehmen bis zu einer Endgröße von 5000bp; im Handel erhältlich von Bethesda Research Laboratories, Bethesda MD) gemischt und der Elektrophorese unter Verwendung eines 4%igen horizontalen ultradünnen Polyacrylamidgels (E-C Apparat, Clearwater FLA) unterworfen. Die Banden im Gel wurden sichtbar gemacht (angefärbt) unter Verwendung der Silberfärbungstechnik („Silver Stain") (Allen et al., BioTechniques, Band 7, Seiten 736-744 [1989]).

Drei unterschiedliche Fragmentmuster, die den drei Haplotypen entsprechen, wurden bei Verwendung von AIuI erzeugt. Die Muster {Größenangabe der Fragmente in Basenpaaren) waren:

1. DR15DQ6DW2; 120,350,370,480

2. DR13DQ6DW19: 120,330,350,480

3. DR16DQ6Dw21: 120,330.350

Das Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung eines 6,5%igen vertikalen Polyacrylamidgels und Ethidiumbromld als Farbstoff und ergab dieselben Ergebnisse. Jedoch waren die Fragmentmuster bei Verwendung von ultradünnen Gelen und Silberfärbung leichter unterscheidbar·

Dies erläutert beispielhaft die Analyse entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren. Unter Verwendung desselben Verfahrens wurden 20 der anderen 32 DR/DQ-Haplotypen für DQA1 identifiziert, wobei dasselbe Primerpaar und zwei zusätzliche Enzyme (Ddel und Mboll) verwendet wurden. Die PDLP-Gruppen und Fragmentmuster für jeden der DQA1 Haplotypen mit den drei Endonukleasen sind in Tabelle 6 gezeigt.

	DR	Dw	1	Dw	AIuI	41	0 i	ί	ro	JO		,-	370	3	iO	+	0	H	+		350	0	h	3	0 270 120 100	+	l·	+	30	2	+	+	+	0	_	0	0	T	+	+	+	- + +	+	1	0
	1	20			4 (	ι	(t)			)0									05 390 360 34	3:		0	3(	+			+	+	+	31	r -.			I 4-	+			+
PDLP	1	9																					+		+	3C			+				+
	14	2				"(+)																		+								+
0101	15	21				(+				+												+						+
	16	19		(t)				+
	13	18,24		105 390 360 3'
0102	13	18,25		3 4		I +	A.
	13	8.3
	8	DB2
	11	12																	0
0103	15	ΙΛΓ» 1 UDl				(t
	7	17			"1	41C
	7	11				480 4
	7	4(7)						-
0201	4	13.2(7)
	4	4(8)
	4	10(8)
	4	13.1(8)				I 4(
	4	14(8)
	4	ΚΤ2
0301	4	15		+
	4	23		T
	9	8.1
	8	8,2
	8	RSH
	3	3,24						3:
0401	3	3,25					0		0 270 120 100
	3	5
	11	5(9104)
	11	16
	14	DB6
0501	12	22
	16	8.3
	8
	DR
0601
PDLP
			3;
+ + +
2-

Ddel	PDLP	DR	Dw	1	Dw	650 450 4	+	520	420	0 390 2(	3(	0 150	+ +	+	O <	190		0 390 200 150	,0	H		•	{	+	)0
				20				I	400		1«		+	I		<				•	H	30 50	+
	1	9														H	π	+
0101	1				+					j ·	+				•	H	I
	14	2			j					+	I				)	h +		30 50
		21			I					+	I		•			h +
0102	15	19														ft
	16	18,24								•	+				•	I	+
	13	18,25								300					H)	r +
	13	8.3													t- +
0103	13	DB2							•
	8	12
	11	DBl
	15	17
0201	7	11
	7	4(7)
	7	13.2(7)										-
	4	4(8)								<
	4	10(8)
	4	13.1(8)
0301	4	14(8)	520						+		+
	4	KT2							+
	4	15
	4	23
	4	8.1									+
	9	8.2									+
0401	8	RSH					)0				+
	8	3,24								+
	3	3,25							•	+
	3	5
	3	5(9104)
0501	11	16
	11	DB6
	14	22							r
	12	8.3							h
0601	16
PDLP	8
	DR			45
						[·
		+
		j-
		ι
		400
	>0
	650 450 4

MboII	PDLP	DR	Dw	1	Dw	390 380 365 350 3;	+	35	3	0	+	+	+	+	35	360l3-	+	+	370	+	360	0	5	+	+	0	3:	305 250 180 1*	•	0	300	ι	ι	-	190	ί	)0	1<	170	0	+	+	)0	·	0	0	+
				20							+	•f			390 3ί								3'		+	0 365 350 3:	5	0		I	+	3(						ι:		+			305 250 180 U
	1	9		+													+				+
0101	1	2																						t
	14	21
	15	19															.
0102	16	18,24
	13	18,25				3ί
	13	8.3														3<												+ +
	13	DB2						\																			+ -j
0103	8	12
	11	DBl					χ
	15	17																				+ 1	ι;
	7	11
0201	7	4(7)
	7	13.2(7)																-
	4	4(8)
	4	10(8)												+
	4	13.1(8)
	4	14(8)
0301	4	KT2
	4	15
	4	23
	4	8.1
	9	8.2
	8	RSH
0401	8	3,24			-
	3	3,25
	3	5
	3	5(9104)	3ί
	11	16
0501	11	DB6
	14	22
	12	8.3		h ·+
	16
0601	8
PDLP	DR
	130
	0

Dieses Beispiel veranschaulicht die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Allelen und Haplotypen eines Genorts zu

unterscheiden. Insbesondere zeigt das Beispiel, daß die PDLP-Analyse fünf der acht AIIeIe stratifiziert. Diese drei

Restriktionsendonukleasespaltungen ermöglichen die Unterscheidung jedes der acht AIIeIe und vieler der 35 bekannten Haplotypen des Genorts. Bei Verwendung zusätzlicher Nukleasespaltungen bei dieser ampliflzierten DNA-Sequenz ist die Unterscheidung aller bekannter Haplotypen und die mögliche Identifizierung anderer vorher unbekannter Haplotypen zu

erwarten. Als Alternative Ist bei Verwendung derselben odor anderer Endonukleasespaltungen für eine andere amplifizierte

DNA-Sequenz in diesem Genort eine Unterscheidung der Haplotypen zu erwarten. Darüber hinaus kann die Analyse amplifizlerter DNA-Sequenzen am DRA-Genort in Richtung des Telomers und DQB In Richtung

des Zentromers, vorzugsweise zusammen mit Analyse eines zentralen Genorts, leicht alle Haplotypen dieser Regionunterscheiden.

Dieselben Methoden sind leicht für andere Genorte anwendbar. Beispiel 4 Analyse des HLA DQA1 -Genorts Die DNA eines Individuums wird analysiert um festzustellen, welche der drei Haplotypen des HLA DQA1 0102-Genorts

anwesend sind. Die genomische DNA wird amplifizlert, wie in Beispiel 3 beschrieben. Jede der amplifizierten DNA Sequenzenwird sequenziert um die Haplotypen des Individuums zu identifizieren. Es wird gezeigt, daß das Individuum die Haplotypen

DR15DQ6Dw2;DR13DQtDw19hat. Das Verfahren bei der Herstellung des AIuI Fragmentgemisches wird wiederholt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Jedes der Spaltfragmente wird sequenziert. Es wird gezeigt, daß das Individuum die Haplotypen DR15 DQ6 Dw2; DR13 DQ6 Dw19 hat. Beispiel 5 DQAI-Allelspezifische-Amplifizierung Es wurden Primer synthetisiert, die sich spezifisch an die 0102- und 0301 -AIIeIe des DQA1 -Genorts binden. Der 5'-Primer war der SGD 001 -Primer, der in Beispiel 3 verwendet wurde. Die Sequenzen des 3'-Primers sind im folgenden aufgelistet.

0102 5'TTGCTGAACTCAGGCCACCs' 0301 5'TGCGGAACAGAGGCAACTG 3'

Die Amplifizierung wurde durchgeführt wie in Beispiel 3 unter Verwendung von 30 Zyklen einer Standard-(94°C. 60°C, 72⁰C) PCR-Reaktion. Die Matrizen-DNAs für Jedes der 0101 -, 0301- und 0501-Allele wurden getrennt amplifiziert. Wie durch Elektrophorese nachgewiesen wurde, amplifizierte der0102-Allel-spezifische Primer nur die Matrizen-0102-DNA und der 0301-Allel-spezifische Primer amplifizierte nur Matrizen-0301 -DNA. So war also jeder der Primer Allel-spezifisch.

Beispiel 6 Nachweis von zystischer Fibröse

Das in Beispiel 3 für die Amplifizierung verwendete Verfahren wird wiederholt. Die Sequenzen der Primer sind unten gezeigt. Die ersten zwei Primer sind stromaufwärts-Primer und der dritte ist ein stromabwärts-Primer. Die Primer amplifizieren eine DNA-Sequenz welche die ganze intervenierende Sequenz 1 umfaßt

5'CAG AGG TCG CCT CTG GA3'; 5'AAG GCC AGC GTT GTC TCCA3'; und 3'CCT CAA AAT TGG TCT GGT 5'.

Diese Primer hybridisieren mit dem Komplement der Sequenzen, c.'e bei nt 136-152 und nt 154-172 und bis nt 187-207 lokalisiert

sind. (Die Nukleotid-Nummern sind zu finden in Riordan et al., Science, Band 245, Seiten 1066-1072 [1989]).

Nach der Amplifizierung werden die amplifizierten DNA Sequenzen der Elektrophorese mit einem 4% Polyacrytamidgel

unterworfen, um dem PDLP-Typus zu bestimmen. Die amplifizierten DNA-Sequenzen werden getrennt gespalten unter

Verwendung der Restriktionsenzyme AIuI, Mn 11 und Rsal (Bethesda Research Laboratories). Die Spaltreaktion wird durchgeführt

wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Produkte der Spaltreaktion werden der Elektrophorese mit einem 4%igen horizontalenultradünnen Polyacrylamidgel unterworfen und mit Silberfärbung sichtbar gemacht, wie in Beispiel 3 beschrieben.

Es werden unterschiedliche Fragmentmuster, die den Krankheitsassoziierten und normalen Haplotypen entsprechen, erzeugt. Beispiel 7 Analyse der Rinder-HLA-Klasse I Rinder-HLA-Klasse-I-Allele und -Haplotypen werden auf dieselbe Art und Weise analysiert wie in Beispiel 3 beschrieben. Die Primer sind im folgenden aufgeführt: Rinderprimer (Klasse I HLA-Homologe) T_n, (⁰C)

5'-Primer: 5'TCC TGG TCC TGA CCG AGA 3' (62)

3'-Primer: 1)3'A TGT GCC TTT GGA GGG TCT 5' (62)

(für ein ungefähr 600 bp Produkt)

2) 3' GCC AAC AT GAT CCG CAT 5' (62)

(für ein ungefähr 900 bp Produkt)

Für die etwa 900bp lange Sequenz ist die PDLP-Analyse ausreichend, um die AIIeIe 1 und 3 (893 und 911 bp) zu unterscheiden. Fragmentgemische werden unter Verwendung von AIuI und Ddel wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Die folgenden Muster werden von der 900 bp Sequenz erzeugt.

AIIeI 1,Alul-Spaltung: 712,181 AIIeI 3, Alul-Spaltung: 430,300,181 AIIeI 1,Ddel-Spaltung: 445,201,182,28 Allel3,Ddel-Spaltung: 406,185,182,28,16

Die 600 bp lange Sequenz produziert ebenfalls unterscheidbare Fragmontmueter für diese AIIeIe. Jedoch sind diese Muster nicht so deutlich unterschiedlich wie die Muster, die durch die Spaltung der 900 bp Sequenz erzeugt werden.

Beispiel 8 Herstellung von Primern Jeder der folgenden Primer wird synthetisiert unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 308A DNA Synthesizers. HLA-Gonort-Prlmer Genort-A-spezlfische Primer SGD009.AIVS3.R2NP CATGTGGCCATCTTGAGAATGGA SGD006.AIVS3.R1 NP GCCCGGGAGATCTACAGGCGATCA A 2.1 CGCCTCCCTGATCGCCTGTAG A 2.2 CCAGAGAGTGACTCTGAGG A 2.3 CACAATTAAGGGAT Genort'B-spezifische Primer SGD007.BIVS3.R1NP TCCCCGGCGACCTATAGGAGATGG SGD010.BIVS3.R2NP CTAGGACCACCCATGTGACCAGC B 2.1 ATCTCCTCAGACGCCGAGATGCGTCAC B 2.2 CTCCTGCTGCTCTGGGGGGCAG B 2.3 ACTTTACCTCCACTCAGATCAGGAG B 2.4 CGTCCAGGCTGGTGTCTGGGTTCTGTGCCCCT B 2.5 CTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG B 2.6 CGCCTGAATTTTCTGACTCTTCCCAT Genort-C-spezlfische Primer SGD008.CIVS3.R1NP ATCCCGGGAGATCTACAGGAGATG SGD011.CIVS3.R2NP AACAGCGCCCATGTGACCATCCT C 2.1 CTGGGGAGGCGCCGCGTTGAGGATTCT C 2.2 CGTCTCCGCAGTCCCGGTTCTAAAGTTCCCAGT C 2.3 ATCCTCGTGCTCTCGGGA C 2.4 TGTGGTCAGGCTGCTGAC C 2.5 AAGGTTTGATTCCAGCTT C 2.6 CCCCTTCCCCACCCCAGGTGTTCCTGTCCATTCTTCAGGA C 2.7 CACATGGGCGCTGTTGGAGTGTCG Genort-Klasse-l-speilflsche Primer , SGD005.IIVS1 .LNP GTGAGTGCGGGGTCGGGAGGGA

1.1 CACCCACCGGGACTCAGA

1.2 TGGCCCTGACCCAGACCTGGGC

1.3 GAGGGTCGGGCGGGTCTCAGC

1.4 CTCTCAGGCCTTGTTC

1.5 CAGAAGTCGCTGTTCC

DQA 1-Genort-spezlf Ische Primer SGD001.DQA1.LNP TTCTGAGCCAGTCCTGAGA DQA3 E1 a TTGCCCTGACCACCGTGATG DQA3E1b CTTCCTGCTTGTCATCTTCA DQA3E1C CCATGAATTTGATGGAGA DQA3E1d ACCGCTGCTACCAATGGTA SGD003.DQA1 .RNP CCAAGAGGTCCCCAGATC

DRA-Genort-spezlfische Primer DRA E1 TCATCATAGCTRfGCTGATG DRA 5Έ 2 AGAACATGTGATCATCCAGGC DRA 3Έ 2 CCAACTATACTCCGATCACCAAT

DRB-Genort-spezlf frche Primer DRB E1 TGACAGTGACACTGATGGTGCTG DRB5Έ2 GGGGACACCCGACCACGTTTC DRB 3Έ 2 TGCAGACACAACTACGGGGTTG

DÜBI-Genort-spezlflsche Primer DQB E1 TGGCTGAGGGCAGAGACTCTCCC DQB 5Έ2 TGCTACTTCACCAACGGGAC DQB 3Έ 2 GGTGTGCACACACAACTAC DQB 5'IVS1 a AGGTATTTTACCCAGGGACCAAGAGAT DQB 5'IVS1 b ATGTAAAATCAGCCCGACTGCCTCTTC DQB 3'IVS2 GCCTCGTGCCTTATGCGTTTGCCTCCT

DPB i-Genort-spezifische Primer DPB E1 TGAGGTTAATAAACTGGAGAA DPB 5'IVS1 GAGAGTGGCGCCTCCGCTCAT DPB3'IVS2 GAGTGAGGGCTTTGGGCCGG

Claims (34)

1. Verfahren zum Nachweis mindestens eines AIIeIs eines Genorts, dadurch gekennzeichnet, daß es die Amplif izierung genomischer DNA mit einem Intron-überspannenden Primerpaar, welches eine DNA-Sequenz definiert, umfaßt, wobei die DNA-Sequenz sich in genetischer Kopplung mit dem Genort befindet und eine genügende Anzahl von Intronsequenznukleotiden enthält, um eine amplifizierte DNA-Sequenz zu erzeugen, die charakteristisch für das AIIeI ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierte DNA-Sequenz mindestens 300 Nucleotide einschließt, die Inkonsequenzen entsprechen,

3. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Inkonsequenz benachbart zu einem Exon, welches für das AIIeI codieri, befindet.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierte DNA-Sequenz charakteristisch ist für mindestens ein nicht-benachbartes AIIeI

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierte DNA-Sequenz charakteristisch istfürwenigstens ein benachbartes AIIeI und mindestansein nichtbenachbartes AIIeI.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die amplifizierte DNA-Sequenz mindestens 1000 Nukleotide enthält, die Inkonsequenzen entsprechen.

7. Verfahren zum Nachweis mindestens eines AIIeIs eines Genorts, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Amplifizierung genomischer DNA mit einem Intron-überspannenden Primerpaar, welches eine DNA-Sequenz definiert, wobei die DNA-Sequenz sich in genetischer Kopplung mit dem AIIeI befindet und eine genügende Anzahl von Intronsequenznukleotiden enthält, um eine amplifizierte DNA-Sequenz zu erzeugen, die charakteristisch ist für das AIIeI; und

b) Analyse der amplifizierten DNA-Sequenz, um die Anwesenheit einer genetischen Variation in der amplifizierten Sequenz nachzuweisen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Variation in der amplifizierten DNA-Sequenz eine Variation in der Länge der Primer-definierten amplifizierten DNA-Sequenz ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Variation in der amplifizierten DNA-Sequenz eine Änderung in der Anwesenheit von mindestens einer Restriktionsstelle in der Primer-definierten amplifizierten DNA-Sequenz ist.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Variation in der amplifizierten DNA-Sequenz eine Änderung in der Lokalisierung mindestens einer Restriktionsstelle in der Primer-definierten amplifizierten DN ^-Sequenz ist.

11. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung in der amplifizierten DNA-Sequenz die Substitution von mindestens einem Nukleotid in der Primer-definierten amplifizierten DNA-Sequenz ist.

12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Genort ein Haupthistokompatibilitätsort ist. '

13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das AIIeI mit einer auf ein Gen zurückzuführenden Krankheit assoziiert ist.

14. Verfdhren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die auf ein Gen zurückzuführende Krankheit zystische Fibröse ist.

15. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens 70% der Primer-definierten amplifizierten DNA-Sequenz Intronsequenzen entsprechen.

16. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Primerdefinierte amplifizierte DNA-Sequenz eine Länge von 300 bis 500 Nukleotiden hat.

17. Verfahren zur Herstellung von RFLP-Fragmenten für einen HLA Genort eines Individuums, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Amplifizierung genomischer HLA-DNA des Individuums mit einem Primerpaar, welches unter Bedingungen, die geeignet sind zur Produktion eineramplifizierten DNA-Sequenz spezifisch für den HLA Genort ist; und

b) Herstellung eines Fragmentgemisches durch Kombination der amplifizierten DNA-Sequenz mit mindestens einer Endonuklease, welche die amplifizierte DNA-Sequenz spaltet, um einen Satz von Fragmenten mit unterscheidbaren Fragmentlängen zu ergeben.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es als zusätzlichen Reaktionsschritt die Erzeugung von RFLP-Mustem aus dem Fragmentgemisch enthält.

19. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 17 und 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Primer eine DNA-Sequenz definieren, die alle Exons enthält, die für allele Variabilität, die mit dem HLA Genort assoziiert ist, codieren.

20. Verfahren zur Herstellung von RFLP-Fragmenten für einen HLA Genort eines Individuums, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Amplifizierung genomischer HLA-DNA des Individuums mit einem Primerpaar, welches unter Bedingungen, die geeignet sind zur Herstellung einer amplifizierten DNA-Sequenz, spezifisch ist für den HLA Genort, wobei die Primer eine DNA-Sequenz definieren, die alle Exons enthält, die für allele Variabilität, die mit dem HLA Genort assoziiert ist, codieren; und

b) Erzeugung eines Fragmentgemisches durch Kombinieren der amplifizierten DNA-Sequenz mit mindestens einer Endonuklease, die die amplifizierte DNA-Sequenz spaltet, um einen Satz von Fragmenten mit unterscheidbaren Fragmentlängen zu ergeben.

21. Verfahren zur Herstellung von RFLP-Mustern für einen HLA Genort eines Individuums, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Ampüfizierung von HLA-DNA des Individuums mit einem Primerpaar, welches unter Bedingungen, die geeignet sind, eine amplifizierte DNA-Sequenz zu erzeugen, spezifisch ist für den HLA Genort, wobei die Primer lokalisiert sind in der intervenierenden Sequenz I und in der intervenierenden Sequenz III, wenn der HLA Genort ein Klasse I Genort ist, und in der intervenierenden Sequenz I und der intervenierenden Sequenz II, wenn der Genort ein Klasse Il Genort ist;

b) Erzeugung eines Fraqmentgemisches durch Kombinieren der amplifizierten DNA-Sequenz mit mindestens einer Endonuklease, welche die amplifizierte DNA-Sequenz spaltet, um einen Satz von Fragmenten zu ergeben, die unterscheidbare Fragmentlängen haben; und

c) Erzeugung von RFLP Mustern aus dem Fragmentgemisch.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifizierung umfaßt:

a) Kombination eines HLA Genort-spezifischen Primerpaars mit HLA-DNA des genannten Individuums unter Hybridisierungsbedingungen für einen Zeitraum, der für jeden Primer im Primerpaar ausreicht, ein Verlängerungsprodukt zu produzieren, welches, wenn es von seinem Komplement getrennt ist, als Matrize zur Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen kann, um eine Mischung zu erzeugen;

b) Behandlung dergenannten Mischung unter denaturierenden Bedingungen, um die Primer von ihren Verlängerungsprodukten zu trennen;

c) Behandlung der Mischung mit dem HLA Genort-spezifischen Primerpaar, so daß ein Primerverlängerungsprodukt synthetisiert wird, wobei jede der Matrizen, welche in Schritt b) als Matrizen produziert werden, verwendet wird, was die Amplifizierung der HLA-DNA zum Ergebnis hat; und

d) Wiederholung der Schritte b) und c), um eine amplifizierte DNA-Sequenz zu erzeugen.

23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweites Primerpaar, welches spezifisch für den HLA Genort ist, ebenfalls zur Amplifizierung von HLA-DNA verwendet wird.

24. Verfahren nach Anspruch ^1, dadurch gekennzeichnet, daß die Erzeugung der RFLP-Fragmentmuster umfaßt:

a) Kombination der amplifizierten DNA-Sequenz mit mindestens einer Endonuklease, welche die amplifizierte DNA-Sequenz spaltet, um einen Satz von Fragmenten mit unterscheidbaren Fragmentlängen zu ergeben;

b) eine auf den unterschiedlichen Fragmentlängen beruhende Auftrennung der Fragmente zur Erzeugung getrennter Fragmente; und

c) Sichtbarmachung der getrennten Fragmente zur Erzeugung von RFLP-Fragmentmustem.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Fragmente durch Gelelektrophorese getrennt werden und unter Verwendung eines Nukleotid-spezifischen Farbstoffs sichtbar gemacht werden.

26. Verfahren zur Feststellung, ob die DNA in einer Probe von einem bestimmten Individuum stammt, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Amplifizierung der DNA des Individuums und der DNA der genannten Probe mit einem Primerpaar, welches unter geeigneten Bedingungen zur Erzeugung einer amplifizierten

DNA-Sequenz von diesem Individuum und von dieser Probe spezifisch ist für einen HLA Genort, wobei die Primer für einen HLA Klasse I Genort in den intervenierenden Sequenzen I und III und für einen Klasse Il Genort in den intervenierenden Sequenzen I und Il lokalisiert sind;

b) Kombination der amplif izierten DNA-Sequenz des Individuums und der amplif izierten DNA der Probe mit mindestens einer Endonuklease, welche die amplifizierte DNA-Sequenz in eine Vielzahl von Sequenzen ausreichend unterschiedlicher Länge spaltet, um zwischen Allelen des HLA Genorts zu unterscheiden, für einen Zeitraum, der ausreicht zur Spaltung der amplifizierten DNA zwecks Erzeugung eines Fragmentgemisches;

c) Vergleich der polymorphen Restriktionsfragmentlängenmuster, die durch das Fragmentgemisch des Individuums und von der Probe erzeugt wurden.

27. Verfahren zur Feststellung, ob ein Individuum der Vater eines Kindes ist, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

a) Amplifizierung der DNA des Individuums, der DNA des Kindes und der DNA der Mutter mit einem Primerpaar, welches unter geeigneten Bedingungen zur Erzeugung von amplifizierten DNA-Sequenzen spezifisch ist für einen HLA Genort, wobei die Primer lokalisiert sind in den intervenierenden Sequenzen I und III bei einem HLA Klasse I Genort und in den intervenierenden Sequenzen I und Il bei einem Klasse Il Genort;

b) Kombination der amplifizierten DNA-Sequenz des Individuums und der amplifizierten DNA-Probe des Kindes mit mindestens einer Endonuklease, welche die amplifizierte DNA-Sequenz in eine Vielzahl von Sequenzen mit ausreichend unterschiedlichen Längen spaltet, um zwischen den Allelen des HLA Genorts zu unterscheiden, zur Erzeugung eines Fragmentgemisches; und

c) Vergleich der polymorphen Restriktionsfragmentlängenmuster, welche erzeugt werden von einem Fragmentgemisch, das von dem Individuum, der Mutter des Kindes und dem Kind stammt.

28. Ein HLA Genort-spezifischer Primer, dadurch gekennzeichnet, daß er ausgewählt ist aus einem Klasse I Genort-spezifischen Primer, einem Klasse IA Genort-spezifischen Primer, einem Klasse IB Genort-spezifischen Primer und einem Klasse IC Genort-spezifischen Primer.

29. HLA Genort-spezifischer Primer nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß der Primer eine Sequenz besitzt, die mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden entspricht, die ausgewählt sind aus:

CATGTGGCCATCTTGAGAATGGA;

GCCCGGGAGATCTACAGGCGATCA; CGCCTCCCTGATCGCCTGTAG; CCAGAGAGTGACTCTGAGG; CACAATTAAGGGAT;
TCCCCGGCGACCTATAGGAGATGG; CTAGGACCACCCATGTGACCAGC; ATCTCCTCAGACGCCGAGATGCGTCAC;

CTCCTGCTGCTCTGGGGGGCAG; ACTTTACCTCCACTCAGATCAGGAG; CGTCCAGGCTGGTGTCTGGGTTCTGTGCCCCT;
CTGGTCACATGGGTGGTCCTAGG;
CGCCTGAATTTTCTGACTCTTCCCAT;

ATCCCGGGAGATCTACAGGAGATG; AACAGCGCCCATGTGACCATCCT; CTGGGGAGGCGCCGCGTTGAGGATTCT;
CGTCTCCGCAGTCCCGGTTCTAAAGTTCCCAGT;
ATCCTCGTGCTCTCGGGA; TGTGGTCAGGCTGCTGAC;
AAGGTTTGATTCCAGCTT;

CCCCTTCCCCACCCCAGGTGTTCCTGTCCATTCTTCAGGA; CACATGGGCGCTGTTGGAGTGTCG; GTGAGTGCGGGGTCGGGAGGGA; CACCCACCGGGACTCAGA; TGGCCCTGACCCAGACCTGGGC; GAGGGTCGGGCGGGTCTCAGC; CTCTCAGGCCTTGTTC;
CAGAAGTCGCTGTTCC; TTCTGAGCCAGTCCTGAGA;
TTGCCCTGACCACCGTGATG; CTTCCTGCTTGTCATCTTCA; CCATGAATTTGATGGAGA; ACCGCTGCTACCAATGGTA;
CCAAGAGGTCCCCAGATC; TCATCATAGCTGTGCTGATG;
AGAACATGTGATCATCCAGGC; CCAACTATACTCCGATCACCAAT; TGACAGTGACACTGATGGTGCTG; GGGGACACCCGACCACGTTTC; TGCAGACACAACTACGGGGTTG; TGGCTGAGGGCAGAGACTCTCCC; TGCTACTTCACCAACGGGAC; GGTGTGCACACACAACTAC;

AGGTATTTTACCCAGGGACCAAGAGAT;
ATGTAAAATCAGCCCGACTGCCTCTTC;
GCCTCGTGCCTTATGCGTTTGCCTCCT;

TGAGGTTAATAAACTGGAGAA; GAGAGTGGCGCCTCCGCTCAT; und GAGTGAGGGCTTTGGGCCGG.

30. Ein HLA Klasse I Genort-spezifisches Primerpaar.

31. Ein HLA Klasse Il Genort-spezifisches Intron-überspannendes Primerpaar.

32. DNA-Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch ein HLA Genort-spezifisches Primerpaar definiert ist.

33. Ausrüstung, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein HLA Genort-spezifisches Primerpaar in einem geeigneten Behälter enthält, wobei das HLA Genort-spezifische Primerpaar ausgewählt ist aus einem HLA Klasse I Genort-spezifischen Primerpaar und einem HLA Klasse Il Genort-spezifischen, Intron-überspannenden Primerpaar.

34. Ausrüstung nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich mindestens eine Endonuklease enthält, welche eine DNA-Sequenz, die definiert ist durch das HLA Genortspezifische Primerpaar, in eine Vielzahl von Sequenzen mit ausreichend unterschiedlichen Längen spaltet, um zwischen den Allelen des HLA Genorts zu unterscheiden.