JPH0420300A - 核酸ハイブリツド形成アツセイ用固体支持体 - Google Patents
核酸ハイブリツド形成アツセイ用固体支持体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
（本発明の背景）
本願発明は一般的には％足のポリヌクレオチド配列検出
用の核酸ハイブリッドアッセイの分野に関するものであ
り、−層詳細には、活性化したオリゴヌクレオチドを固
体支持体として利用できるポリマー被覆ビーズに共有的
に結合させる組成物およびその方法に関するものである
。 核酸ハイブリッド形成は核酸の特定の配列を同定するだ
めの既知方法である。ノ）イブリッド形成は補体核酸ス
トランド間の塩基対に基づいている。 本釦核酸を適当な緩衝溶液中でインキュベートするとき
、補体塩基配列は対に外って二本鎖の安定７′、：分子
が形成される。このような対形成の存在または不存在Ｇ
（：当該技術分野でｉ記載された幾つかのｙ、＞なる方
法で検出することができる。 多くの公知のハイプリント形成アッセイは多数の工程に
関係している。例えばデュン（Ｄｕｎｎ、）等、Ｃｅ１
ｌ １２：２３−３６ （１９７７）（本明細：、！
）に引用する）が記載したハイブリッド形成技術では、
ザンドイッチタイプのアッセイは、「標的」核酸と固体
支持体上に固定された［捕獲」核酸プローブ間の第１の
ハイブリッド形成および典型的には放射性［１位元糸で
標識されだ１シグナル」核酸ブじ−ブと固定された標的
核酸の別の領域間の第２のハイブリッド形成からなって
いる。次いで、シクナルブローブのハイブリッド形成は
、例えばオー トラジオグラフィーで検出することがで
きる。 ランキ（Ｒａｎｋｉ ）等の米国特許４，４８６，５３
９および米国特許４−．５６３，４１９ （両特許は
共に本明細書に引用する）は、−重鎖核酸を固体キャリ
アに固定した核酸と放射性同位元召ピで標識した核酸と
をハイブリッド形成させる前に、核酸を一本鎖にする工
程が必要であるザンドイツチタイプのアッセイをｄ記載
している。 キャリコ（Ｃａｒｒｉｃｏ）等の米国ｌ特許４．．Ｂ
Ｏ６，５４６およびキャリコ等のヨーロッパ！侍許出願
８６１１２８９９．９（共に不明）清書に引用する）は
、ナイロンの表面上にアミジン基を導入するためにナイ
ロン支持体をアルキル化剤で処理することを記載してい
る。誘導さノ′［たナイロン表面６、−重鎖核酸を非共
有的に結合する能力を有している。次いで、非共有的に
結合した核酸をプＩ−］−ブとして使用して溶液中の特
定の標的核酸を栓用する。 ハンガー（Ｈｕｎ、ｇｅ ｒ ）等、Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉ。 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６５ ： ４５〜５５（１９８
７） ：ハンガー等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ １５６：２８６〜２９９（１９８６
）；ハンガー等、ヨーロッパ特許出願８４１０９４８５
．７（全て本明細書に引用する）は、ザブピコグラム量
の補体ＤＮＡを検出するザザンプロット法において、切
断されたゲノムＤＮＡを（ＮＮ ５ｉ化している塩化シ
アヌルで活性化し）こセ／Ｌロース紙の醍用を記載して
いる。ピアギオニ（Ｂｉａｇｉｏ旧）等、Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ ８９：６１６
（１９７８８不明ｉ、聞書に引用する） ｒＪ、塩化シ
アヌルを使用するＤＮＡ−セルロスのヤ３合方法を自記
載しており、そしてその際ＤＮＡセルピースはアンイニ
テイークロマトグラフイ法で使用される。 ヘルソベルグ（Ｈｒ・ｒ Ｚ ｂ ｅ ｒち）−ｆＧ”
＞ａ−ロツパ特♂ｌ出！ｌ’ｊｉ ０１７１１５υ（不
明細青に引用する）はデイソブスデイツクアソセイにお
いて固体支持体上にｉｌｆ；ｊ定したオリゴヌクレオチ
ドの使用全１．ピーしている。 リノ）マン（Ｌ ｉ ｔｐ＋ａ ｎ ） ＃の米国％
ｒＦ４，３９１，９０４（本明細（岩に引用する）は、
免疫学的対の１員が１−１１ ｆｔ；表１ｆｉに粘合し
ている試験片キットを記載してＩｏる。更に、ミラー（
：Ｍｉｌｌｅｒ）等、Ｃ１１ｎ−Ｃｈｃｍ。 ３０：１４６７〜１４７２（１９８４）およびプラタン
（Ｂｒｏｗｎ）等、Ｃｌ１ｎ、Ｃｂｅｍ、 ３０：１５
００〜１５０５（１９８５）（共に本明細書に引用する
）は固体７トリツクスとして抗体に結合したセルロース
スレッドを含有する分析試験室を記載しておシ、この寮
によ−って１つの試料から多数の試験結果を得ることが
できる。 （本発明の要約） 本！１１発明は核酸ハイブリッド形成アッセイで有用性
をイ１する新規な組成物および方法からなる。 本発明の１つの特徴に従って、活性化したオリゴヌクレ
オチドから人り、ポリマー被俊ビーズまたはそれに類似
する構造に共有的に結合することができる組成物が記載
される。好壕し２くば、同種三官能性試薬である塩化シ
アヌルでオリゴヌクレオチドを活性化する。ナイロン固
体支持体上に活性化した一十すゴヌクレオチドを共有的
に固定化する方法も不明細書に含まれる。 ポリマー被覆ビーズまだは同様な構造体に共有的に固定
化したオリゴヌクレオチドは核酸ブローブとして利用す
ることができ、そしてハイブリッド形成アッセイは特定
の標的核酸が複合生物学的試料中で検出されるように実
施することができる。 ビーズは、微憧滴定ウェル方式のような溶液、カラムの
ような通過方式、甘たはディツプスティック中で自由に
使用することができる。更に、ポリマー被捜ビーズ上に
固定されたオリゴヌクレオチドは同一または異なる核酸
配列であることができる。 ４願発明のビーズ固体支描体は、捕獲核酸配列が非共有
的に結合している既知の膜またはビーズ支持体を超える
次のような利点を有している。第１に、標的核酸配列の
捕獲率は５〜２５倍改善され、そして捕獲核酸配列の１
００％が補体配列とのハイブリッド形成に利用可能であ
る。第２に、固定された捕獲核酸前は見掛は上の表面積
に基づいて約２０倍増加させることができる。第３に、
製造がはるかに容易である。第４に、該ビーズは基本的
に固定化されだ捕獲核酸配列（オリゴヌクレオチド）を
有しており、９０℃を超える変性温度に１０分またはそ
れ以上耐えることができる。 最後に、多部位ディツプスティックを構築することがで
き、検出器具の小型化がもたらされる。これら利点の全
ては、例えばサンドイッチアッセイ方式を使用するとき
、より高い感受性の一因となる。 ディツプスティックも本願発明に含まれる。これらのデ
ィツプスティックは非多孔性固体支持体およびビーズま
たは上記で考移した類似構造体の結合手段からなる。更
に、種々の配列゛ま／ヒは特異性を有するオリゴヌクレ
オチドを有する多数のビズは多部位ディツプスティック
上に近接して整列させることができ、例えば細菌性およ
びウィルス性物を同定するために、たった１つの生物学
的標本で多数の病原体を検出できるインデイケータカー
ドをもたらす。 ディツプスティック方式でビーズまたは類似の構造体を
使用すると、必然的に２つの支持体間にサンドインチ状
に挾むかまたはその場に接着するか若しくは結合させな
ければならない膜支持体等に比べて、ビーズまたは類似
の構造体をディツプスティックに入れる圧力適合性が単
純なため、シグナル系の非特異的な背景値の有意な低下
が達成される。 本願発明の本質および利点は本明細書の残シの部分およ
び図面を参照して更に理解することができる。 （本発明の詳細な説明） 本願発明には核酸ハイブリッド形成アッセイに有用彦組
成物が金線れる。これらの組成物はジクロロトリアジン
オリゴヌクレオチドおよびポリマー被覆ビーズまたは類
似の構造体に共有結合した他の活性オリゴヌクレオチド
からなる。 更に、オリゴヌクレオチドをナイロン固体支持体、奸才
しくけビーズ上に共有的に固定する方法が含まれる。一
般に、これらの方法は、ナイロン固体支持体をアルキル
化剤で処理し、処理した固体支持体をアミン含有ポリマ
ーと反応させてポリマーで固体支持体を共有結合的に被
υし、オリゴヌクレオチドを単一官能性または多官能性
試薬、好捷しくけ同種三官能性試薬、塩化シアヌル（即
ち、２，４．６−）ジクロロトリアジン）で活性化し、
そして活性化したオリゴヌクレオチドとポリマー被覆固
体支持体を抱合させる７、Ｌ程からなる。 次いで、未反応アミンをアシル化で封鎖して固体支持体
表面に適当な表面負荷を与える。 用語「固体支持体」は溶液から溶液に移動可能であるか
またはオリゴヌクレオチドに基づくアッセイを実施する
構造体を形成する任意の表面を言い、そしてビーズ、膜
、微意滴定ウェル、ひも状物、プラスチック片まだは核
酸プローブを固定できる任意の表面が含まれる。 本明細書で使用されるように、「ビーズ」は核酸を共有
的に固定できる、プラスチック、セラミック、金属また
は重合物からなる任意のタイプの固体若しくは中空球体
、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似形
状を包含する。そのようなものとして、咳用語にはナイ
ロンひも状物（１個捷たは複数）も含オれる。好ましく
は、球形状であるナイロンビーズが本願組成物で使用さ
１〇− れ、このようなビーズの好ましい直径範囲は約０．０１
インチから約０５インチまで、更に好ましくは約０８０
６インチから約０，０９インチ（市販で入手可能な３／
３２インチのナイロンビーズに相当）まで、そして最も
好ましくは約０．０９インチ（市販で人手可能ｆｉ３／
３２インチのナイロンビーズに相当）である。史に、ナ
イロンビーズは研磨されていないかまたは研磨されてい
る場合、アルキル化剤で処理する前にざらざらにするこ
とが好ましい。 本願発明では、ナイロンビーズ（１個または複数）また
はナイロンの任意の組成物若しくは構造体はビーズを先
すアルキル化剤で処理して誘導（製漬）される。この方
法で使用さするアルキル化剤はナイロン中に存在するア
ミドと反応して反応性のイミデートエステルを形成する
。 好棟しいアルキル化剤にはジアルキルスルフェート、ア
ルキルｌ−ＩＪフレート、アルキルジフェニルスルホニ
ウム、アルキルハークロレートオｘｏ：好オしくはトリ
アルキルオキソ−ラム塩が含まれるが、これらに限定さ
ねない。後者には低級アルキル塩、トリエチルオキンニ
ウムおよびトリエチルオキソ−ニウム塩が含まれる。対
イオン塩はへキサクロロアンチモネート、ヘキザフルオ
ロホスフ工−１・訃よひテトラフルオロボーレートから
なるノ）１から選択することができ、最後に記載した対
イオンが好ましいが、他の対イオン塩も使用することが
でき、それらは当該技術分野の熟練者に明白であろう。 アルキル化剤の溶媒の選択は本願発明にとって重要であ
る。アルキル化中にナイロンを溶解しないかまたは粘着
性にしない溶媒を使用すべきである。１ジク［」「Ｊメ
タン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ
−メチル−ピロリドン等のようなＪト求核的有機溶媒が
適切な溶媒である。特に、Ｎ−メチル−ピロリドンが好
ましい。 次いで、得られたビーズ表面上のイミデートエステルを
適当な条件下でアミン含有ポリマーと反応させることに
よってアミジン残基が形成される。 任意の第一級ｊたけ第二級アミンを含有するポリマーを
使用してアミジン残基を形成させ、その結果ビーズの表
面上にポリマーを共有的に固定することができる。ポリ
（エチレン１′ミン）、ポリアリルアミンおよびポリビ
ニルアミンが好−ましい例である。活性化し／こナイト
１ンビーズにポリマーを抱合させる間にポリマーを溶解
するために使用さＪｌ、る好ましい溶媒はＮ−メチルー
ビ「］リドンである。。 ナイロンは部分的に加水分解して、アミン含有またはカ
ルボギシル含有ポリマーと反応し得る反応性アミンまた
はカルボキシル基を虫じぢせることもできる。同様に、
固体支持体の表面を被覆するカルボキシル部分は上記し
たものと同様な化学を使用してアミンを含有するポリマ
ーで被覆することができる。 更に、任意の第一級または第二級脂肪族または芳Ａ族ア
ミンを用いて誘導し得る他の任意のポリマーが本願発Ｉ
ＪＩＪには適当である。このようなポリマーの単位は直
接的重合化法結合またはカップリング剤連結によって一
緒に結合される。直接的重合化によって近接する単位内
の利用可能な化学的基または主要部分の相互結合がもた
らされる。例オーば、モノマー単位を酸化的交差結合に
よって重合化するために酸化酵素を使用することができ
る。 或幻：、二官能性または多官能性有機交差結合剤から誘
導されるカップリング剤は単位の適当な化学的基または
主要部分と結合することができる。この文脈で、用語［
カップリング剤」は結合後の結合基を意味し、用語１−
交差結合試薬」は結合前の結合化合物を意味する。 交差結合試薬は次の一般式をイイする：Ａ −−−−
−Ｒ１−−−−Ｅ 式中、反応性基Ａ、 ＢおよびＥは、水素、カルボン酸
基、酸ハライド、活性エステル、混合酸無水物、イミノ
エステル、第一級アミン、アルデヒド基、α−ハロメチ
ルカルボニル基、ヒドラジン基、アシルヒドラジド基、
アジド基、およびＮ−マレインイミド基からなる基から
独立して選択され、］４ その際Ａ、ＢおよびＥの少なくとも２つは水素以夕（の
基である。Ｒ（ｒＪ少なくとも２個の炭素の脂肪族基′
＋たけ少なくとも６個の炭素の芳香族若しくは５゛ｌ（
項ｉ：“ｄ基でちる。 Ａ、ＢおよびＥ ＶＣ類似する３個以上の反応性基をイ
）′する多官能性交差結合試薬も本願発明の範囲内であ
る。とれらの追加的な反応性基はＡ、ＢおよびＥの前記
定義から独立して選択される。 反応性基の選択は、結合すべきポリマー単位（モノマー
単位）の化学的基徒たは主要部分の選択によって決する
。化学的基せたは主要部分の各タイプは適当な反応性基
（１個まだは複数９と反応する。例えば、アミン基はカ
ルボン酸基、酸ハライド、活性エステル、混合酸無水物
、アシルイミダゾライド、Ｎ−（カルボニールオキシ）
イミド基、イミノエステル凍たはアルデヒド基と反応す
る。 酸化した１、２−ジオール基（ジアルデヒド）は第一級
アミン、ヒドラジン基、アジド寸たはアシルヒドラジド
基と反応する。カルボニル基は第一級アミン、 ヒドラ
ジン基またはアシルヒドラジド基と反応する。メルカプ
タン基はカルボン酸基、酸ハライド、活性エステル、混
合酸無水物、アシルイミダゾライドまたはＮ−（カルボ
ニルオキシ）イミドと反応する。炭素−水素結合はアジ
ドにトレン）と反応する。かくして、固体支持体は、多
数の活性化可能な第一級および第二級アミンを含有する
多官能性ポリマーを含む選択されたポリマーで被覆され
る。 下記光は、直接かまたはスペーサーアームを介してかの
いずれかによってポリマーを固体支持体に共有結合させ
るために本願発明で使用することができる反応のタイプ
を示すが、これらに限定されない。示されるとおり、ア
ミン含有ポリマーが好ましいが、チオールまたはカルボ
キシル基を含有する他のポリマーをウェルとして使用す
ることができる。 ビーズ ポリマー カップリング油能性：
官能性： 試薬： アミン アミン 塩化シアヌルアミン ＣＯＯカルボジイミド アミン −ＳＨ異種二官能性 ＣＯＯアミン カルボジイミド −ＯＨアミン 塩化シアヌル 次いで、ボ１１マー被覆固体支持体は上記したものと類
似または同一の化学を使用１〜で活性オリゴヌクレオチ
ドと抱合させる。本明細書で使用するとき、オリゴヌク
レオチドは長さが概ね１６乃至１００塩基である短い核
酸配列をごう。このようなオリゴヌクレオチドはハイブ
リッド形成アッセイで捕獲プローブとして使用すること
ができ、好ｔＬ、＜は市販で入手可能な方法および装置
を使用して化学的に合成することができる。例えば、１
６．０００ダルトン未満の分子量を有する１５から５０
塩基の間の短いプローブを製造するために固相ホスホラ
ミダイト法を使用することができる。 オリゴヌクレオチドの合成に関しては、カルザズ（Ｃａ
ｒｕｔｂｅｒｓ ） 智、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂ。 ｕｒ ５ｙｒｎｐ、 Ｑｕａｎｔ、、 Ｂｉｏｌｏ、４
７：４１１〜４］８（１９８２）； アダムス（Ａｄａ
ｍｓ）等、Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｍ−Ｓｏｃ、、１０５
：６６１ （１９８３）（両方基本明細書に引用する）
参照。 特定の標的核酸用のオリゴヌクレオチドプロプを合成す
るとき、ヌクレオチド配列の選択によって試験の特異性
が決定される。例えば、幾つかの細菌性単離物から得た
ＤＮＡ配列を比較することによって、タイプ特異的かま
たは属特異的のいずれかである細菌性検出用配列を選択
することができる。ＤＮＡ領域および配列の比較は、市
販で入手可能なコンピュータープログラムを使用して達
成することができる。 本願発明で使用される好ましい捕獲オリゴヌクレオチド
は、長さが約２０から約１００塩基までの合成オリゴヌ
クレオチドである。スペーサー（リンカ−）アーム、即
ち他の化学的基に伸ひるかまたは結合し且つ好ましくは
約２から約１２個の炭素原子、更に好ましくは約６個の
炭素原子を含有する炭素鎖であって封鎖したアミノ基を
有する化学的部分は、慣用の化学を使用する合成中にオ
リゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシル基にカップリン
グさせることができる。第一級アミンは単一官能性また
は多官能性試薬に結合させるのに好寸しい基であり、ヘ
キシルアームを介して結合することが好ましい。第一級
アミンで終結している第一級スベーザーアーム結合用試
薬は市販で大手可能である。 本願発明で使用するのに適する出発物質はＰＣＴ８６１
０１２９０ ； Ｎｕｃｌ、 Ａｅｉｄｓ Ｒｅｓ、
１５： ３１３１（１９８７）： Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、 １５：２８９１ （１９８７）：およ
びＮｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １４ ニア９８
５ （１９８６）（全て本明細１．に引用する）に記載
されている。 好ましくは、 ＼ −Ｐ （ＣＨ２）ｎ （式中、 スペ サ ア ムとして、 ｎは２〜１２ （両者を含む）、好ましくは６であり、Ｘは−ＮＨ−ま
たは−ＮＨＣ：Ｏ（ＣＨ２）ＮＨ−１好ましくはＮＨ−
であり（式中、ｍは２〜１２（両者を含む）である）、
Ｙは４，６−ジクｒＩ−Ｉトリアジン（好ましい）また
はチオール（スルフヒドリル）反応性部分であり、そし
てＡは約９〜５０塩基の間、好ましくは約１５〜３０塩
基の間の範囲のオリゴヌクレオチドである）、のような
５′−末端構造を有する方すゴヌクレオチドを使用する
ことができ、結合には５′−ヒドロキシル基の修飾しか
必要でない。 或は、オリゴヌクレオチドは、封鎖されたアミン基を含
有するスペーサーアームを用いて３′末端で修飾するこ
とができる。これは抱合リボヌクレオチドを言イ１する
固体支持鉢土でＤＮＡ合成を行うことによって達成する
ことができる。１個（７）３’ −末端リボヌクレオチ
ドを含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは固体支持体か
ら除去後に得られる。これは求核性アミンを含有するス
ペーサアームを用いて、例えばりボヌクレオチドシスグ
リコールを過ヨウ素酸塩で酸化し、オリゴヌクレオチド
を例えばブタンジアミンで修飾するように処理してシッ
ク塩基を形成させ、そしてすトリウムボロヒドリドまた
はシアノボロヒドリドで処理してアミンの１つがその後
抱合されるように遊離の捷寸である、安定な還元シッフ
塩基誘導体を形成させることによって修飾することがで
きる。 次いで、選択されたオリゴヌクレオチドを単一官能性ま
だは多官能性試薬で活性化する。活性化したオリゴヌク
レオチドとは一般に、化学的化合物と反Ｉｒ；させ化学
的に活性にされたオリゴヌクレオチドを言う。本明細書
で使用するとき、活性化ｒｉ′Ｔ能とは化学的に反応性
になる潜在力を言う。多官ｉｌ二性試薬には同種三官能
性、異種三官能性、同種二官能性および異種二官能性試
薬が＠まれるが、これに限定されない。 活性化したオリゴヌクレオチドはその後の化学反応に従
ってポリマー被覆固体支持体に結合させることができる
。一般に、オリゴヌクレオチドがこの点でポリマーに共
有結合できる２つの態様がある。アミン末端オリゴヌク
レオチドは単一官能性寸たは多官能性試薬、例えば塩化
シアヌルで活性化させてアルキルアミノジクロロトリア
ジンを形成させることができ、従ってこれはアミン含有
ポリマーに反応性である。或は、ビーズ表面上のポリマ
ーは、試薬、好ましくは同種三官能性試薬塩化シアヌル
で活性化させることができ、従ってこれはアミン末端ま
たはアミン市来のオリゴヌクレオチドに反応性である。 塩化シアヌル、即ち同種三官能性試薬が好ましいが、他
の試薬を使用することができる。例えば、Ｎ−サクシン
イミジル−４−（ヨードアセトアミド）−ベンゾニー）
（ＳＩＡＢ） は異種二官能性試薬であり、ジザク
シンイミジルスベレートは同種二官能性試薬である。カ
ルボキシル基が関係している場合、異種二官能性試薬、
１−エチル−３（ジメチルアミンプロピル）−カルポジ
イシドを使用することができる。他の同様な単一官能性
および多官能性（異種多官能性および同種多官能性）試
薬が本願発明の方法での使用に含まれる。 本願発明に使用される化学によって、下記実施例１で示
されるように、オリゴヌクレオチドのプリンおよびピリ
ミジン塩基のいずれも（ＬＳ飾することなくオリゴヌク
レオチド上のアミン基の選択的活性化がもたらされる。 ビーズ表面上にアミン含イ〕ポリ−７−を配置しこのよ
うな表面上に活性化された捕獲オリゴヌクレオチドを共
有的に固定化することによって、ジアミン化合物、例え
ばヘキサンジアミンと比較して標的核酸の捕獲率脣たは
捕獲度を５〜２５倍増加させる。更に、ビーズ表面上の
生物学的材料の非ＩＰ！ｊ異的結合が実質的に減少する
。 好寸しい化学には塩化シアヌル（即ら、２，４゜６−
トリクロロトリアジン）が使用される。塩化シアヌル反
応の化学は次のとおりである。 式中、Ｒはオリゴヌクレオチドであり、好ましくは５′
−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドで示される構造の
ものである。 ５′−甘たけ３′−結合（ヘキシルアームラ介して）求
核性アミン部分（まだはピリミジン若しくはプリン塩基
に置換した内部アミノアルキル基）を有するオリゴヌク
レオチドを過剰の、好ましくは約５０から約２００倍の
、更に好ましくは１２５倍の結晶塩化シアヌルと好まし
くは１５〜５０℃、更に好ましくは１９〜２５℃で約３
０分から約６時間まで、更に好ましくは約１から約２時
間までの好ましい時間１都市機溶媒中で反応させる。 ひとたびオリゴヌクレオチドが塩化シアヌルで活性化さ
れると、チオール、ヒドロキシルまたはアミンのような
適当に配置された求核物を含有する分子に共有結合させ
ることができる。さらに具体的には、以下で省察する固
体支持体との共有結合に加えて、ジクロロトリアジンオ
リゴヌクレオチドを以下のものを含むがこれらに限定さ
れない多くの組成物に共有結合させるだめの求電子物と
して利用することができる：これらはタンパク質、例え
ば酵素、抗体、レクチン、および抗体を生じさせるため
に使用されるタンパク質担体；求核物由来のオリゴヌク
レオチド、例えば５′−または３′−アミノヘキシル末
端オリゴヌクレオチド；求核物含有ポリマー、例えばポ
リ（エチレンイミン）、ポリアリルアミンおよびポリビ
ニルアミン：求核物含有低分子濾化合物、例えば放射性
標識物、化学ルミネセンス標識物、蛍光標識物、着色標
識物および免疫原標識物等である。以下で考察されるよ
うにオリゴヌクレオチドを塩化シアヌルで活性化する方
法によってジクロロトリアジンオリゴヌクレオチドが形
成されるので、ジクロロトリアジンオリゴヌクレオチド
は本願発明に含まれる。 未反応塩化シアヌルは排除クロマトグラフィまたは限外
ろ過で除去することができ、ビーズおよび誘導されたオ
リゴヌクレオチドは一緒に混合しそして好ましくは２０
〜５０℃で１〜２４時間インキュベートして抱合される
。ビーズ表面上の残りの（未反応の）アミンは、無水コ
ハク酸のような試薬を用いてホウ酸ナトリウムのような
適当な塩基の存在下で好ましくはＮ−メチルピロリドン
中で封鎖しくキャップをかけ）で表面を核酸ハイブリッ
ド形成に適合性（陰性に荷電した）とすることができる
。このようなアミン封鎖はアシル化反応またはアミンと
活性エステルとの反応で生起し、非活性化部分がもたら
される。陽性、陰性または中性電荷をビーズ上に負荷で
きるように化学的に誘導する可能性がビーズ表面に存在
することは注目すべきである。 更に、４，６−ジクロロトリアジン部分はチオル反応性
置換基で置換することができ、好ましくはスペーサーア
ームが存在する。好ましいスベサーアームは５′−結合
求核性アミンに結合したチオール反応性置換基から誘導
され、上記式中Ｙがチオール反応性部分であることを除
いて上記で示した式と同一のものである。好ましいチオ
ル反応性部分はαハローアシルかまたはα、β不飽和カ
ルボニルのいずれかの反応基を有する。 最も好ましいチオール反応性部分はハロアセトアミドベ
ンゾイルおよび４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロ
ヘキサン−１−カルボニルカラナル群から選択される。 ポリマー構造がチオール（スルフヒドリル）含有部分で
誘導されている上記のポリマー構造を本願発明で使用す
ることができる。チオール含有部分の実際の構造は、チ
オール基（１測寸たけ複数）がチオール反応体部分との
反応に利用可能である限り、重要ではない。この場合の
チオールの化学は塩化シアヌルの化学に置き換えられる
。 本願発明には核酸ハイブリッド形成に有用性をイ４しそ
して非多孔性固体支持体およびビーズ結合手段からなる
ディツプスティックも含まれる。非多孔性固体支持体は
当該技術分野で既知であり、そして本願発明はディツプ
スティックにビーズを結合させることに関している。ビ
ーズ結合の１つの例はビーズが結合し得るディツプステ
ィックのη通仕（１測寸たは複数）の存在である。好ま
しくは複数の貫通孔を使用し孔の夕１周との圧力適合に
よってビーズに結合させる。例えば、貫通孔（くぼみ）
の外周がビーズの外周より僅かに小さい場合、ビーズが
適所に押し付けられるように上記の圧力適合が行われる
。 好ましいビーズは上記したとおりであり、上記したとお
シ、一定のビーズ当たり同一または異なる配列の活性化
オリゴヌクレオチドに直接にかまたはスペーサーアーム
によってのいずれかによって共有結合させることができ
る。 ディツプスティックはそれ自体の穴の各々に１つ以上、
好ましくは約２から１０までの、更に好甘しくはディツ
プスティックの１つの縁に沿って１列になって位置した
ビーズを有している。このようなディツプスティックは
インデイケータ−カドとして機能を果たすことができ、
その原種々の配列または特異性を有するオリゴヌクレオ
チドに共有結合した複式ビーズは多数部位ディツプステ
ィックに密接して配列させることができ、該ディツプス
ティックによって単一の生物学的試料中の多数の病原体
を検出することができる。特別のビーズは１つ以上の核
酸配列、例えば関連生物から得られる配列を有するオリ
ゴヌクレオチドを含有することができ、またはビーズは
一定の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドだけを含有
することができる。 病原性および非病原性体を含む多数の生物および細胞タ
イプはこの方法で種々の生物学的試料タイプから検出す
ることができる。生物には細菌およびウィルス並びに他
の微生物が含まれ、細胞タイプには、例えば、遺伝性疾
病および代謝障害に関連するものが含まれる。他の多く
の検出適用は当該技術分野の通常の技佃を有する者に明
白であろう。例えば、アクチノバシラスアクチノマイセ
テムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｒｎｃｏｍｉｔａｎｓ）、ノ（
クチロイデスジンジバリス（Ｂａｃｔｃｒｏｉｄｅｓ
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）。 バクテロイデスフオルシサス（ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、
バクテロイテスインターメデイウス（ｉｎｔｅｒｍｅｄ
ｉｕｓ ）、エイケネラ コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌ
ｌａＣＱＩ・ｒｏｄｅｎｓ ） 、フンバクプラム ヌ
クレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｕｍ ｎｕｃｌｅａ
ｔｕｍ）およびウオリネラレクタ（Ｗｏｌｊｎｅｌｌａ
ｒｅｃｔａ）のような歯周囲炎の原因細菌を同定する
ことができる。 本願発明は核酸ハイブリッド形成アッセイの点から記載
するが、これらディツプスティックの他の多くの使用が
可能であることは当該技術分野で通常の技佃を有する者
に明白であろう。リガンド対の任意の一員をディツプス
ティックのビーズに結合させることができ、次いでこの
ディツプスティックは対応するりガント員を同定するた
めに使用することができる。例えば、抗原または抗体は
上記したようにディツプスティック中のビーズに結合さ
せることができ、次いでそれらの対応する抗体才たは抗
原をそれぞれ同定することができよう。同様にして、ビ
チオンおよびストレプトアビジンを使用することができ
る。 更に、本願発明には核酸の検出方法も含まれ、その際ポ
リマー被覆ビーズからなシ、好ましくは活性化可能なア
ミン基を有し、活性化したオリゴヌクレオチドに共有的
に結合した組成物が適当な３〇− ハイブリッド形成東件下で標的核酸と接触させられ、そ
してハイブリッド形成しだ生成物が検出さｔｌろ。この
ような方法は上記し７たように、徴証滴定ウェル中、流
出カラム中、およびディツプスティックを使用して実施
することができる。 標的核酸は通常は、長さが約２０から約２０．０００１
での塩基対重たはヌクレオチドの平均長さを有するポリ
ヌクレオチドである。ハイブリッド形成の適当な条件と
は、塩基対の不適合が生じないでハイブリッド形成した
生成物が完全に塩基対になる厳密な条件を言う。 時別のハイブリッド形成技術は本発明には必要でなく、
当談技術分」の通常の技佃を有する者は種々のこのよう
な技術を理解するであろう。ハイブリッド形成技術は一
般的には、バーメス（Ｈａｍｃｓ） Ｂ、 Ｄ、等（編
）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ 、実用的な方法、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ％ニュ
ーヨーク（１９８５）に記載されている。ノ１イブリッ
ド形成技術では改良が為されるので、それら改良は本願
発明に容易に適用することができる。 サンドイッチアツセイを本願方法で好都合に使用するこ
とができ、その際検出すべき標的核酸は抽出されるかま
たは最初の試料中にあり、そしてビーズのような固体支
持鉢土でハイブリッド形成（即ち、相補的塩基の対合）
によって結合（捕獲）されて、該支持体の表面上に共イ
１的に固定化されたオリゴヌクレオナドプｒＪ−ブを捕
獲する。次いで、捕獲された核酸をシグナルオリゴヌク
レメチドフローブとハイブリッド形成させ、まだは変法
として、この工程υ二、例えばハイブリッド形成溶液中
にシグナルフ「１−ブを営めることによって標的の捕獲
と同時に行うことが一〇きる。シグナルゾ１７−ブは、
例えばビオチンで標識することができる。これによって
、サンドイッチアッセイを構成する捕獲オリゴヌクレオ
チドプローブ：標的核酸：シグナルオリゴヌクレオチド
プローブの［サンドイッチ」がもたらされる。次に、固
体支持体を洗浄してハイブリッド未形成材和を除去し、
次いで標識した核酸を標識物の検出可能な特性に従って
測定する。 種々の標識を、本発明によって利益を得るハイブリッド
アッセイで使用することができる。このような標識は、
標的配列とその相補的シグナル配列間の二重体検出用の
リポータ−として作用する。 不明細省で使用するリポータ−基は、測定または検出す
ることができる物理的まンソは化学的特性を有する基で
ある。検出可能性は色の変化、ルミネセンス、蛍光また
は放射能のような特性によってもたらされる。または、
上記可能性はりガント認識部位として役立つリポータ−
基の能力によって提供される。任意のハブテンまたは抗
原化合物を適当な標識抗体と組み合わせて使用すること
ができる。 リポータ−基として１使な酵素は生として加水分解酵素
、特にホスファターゼ、エステラーゼ、ウレアーゼおよ
びグリコシダーゼ、才たは酸化還元酵素、特にペルオキ
シダーゼである。蛍光化合物にはフルオレセインおよび
その誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、
ウンベリフェロン等カ含゛まれる。化学発光物にはルシ
フェリン、ルミノールおよびオキセタンジオンが含まれ
る。 上記リストは完全でなく、そして標識の選択は必要々感
受性、プローブとの抱合の容易性、安定性要件および利
用可能な器具使用によって決まる。 上記記載および以下の実験の項は説明のためであって限
定しようとするものでないことを理解すべきである。多
くの変更および適用は、本開示の検討によって、当該技
術分野で通常の技洲な有する者に容易に明白でろろう。 以下の実験の項で、実施例１は塩化シアヌルを用いるア
ミンヘキシル末端オリゴヌクレオチドの選択的活性化を
記載する。実施ｙ＋＋ ２は固体支持体のハイブリッド
形成促進能に関して種々のジアミ／およびポリ（エチレ
ンイζ゛ン）から誘導されたナイロンビーズの比較を記
載する。実施例３は、不溶性比色基質を使用してハイブ
リッド形成を検出するサンドイッチアッセイにおけるオ
リゴヌクレオチド誘導ナイロンビーズの使用を記載する
。 実施例４は、標的を複合生物学的試ネ」中で検出するサ
ンドイッチアツセイにおけるオリゴヌクレ第チド誘導ナ
イロンビーズの使用を記載する。 実施例５は、標的を化学ルミネセンスによって検出する
ザンドイツチにおけるオリゴヌクレオチド誘導ナイ［」
ンビーズの使用を記載する。実施例６は、ディツプステ
ィックに固定したオリゴヌクＬ、−オチドＲＬ’＋ナイ
ロンビーズを使用した多部位検出バネルオたはカー ド
の形成を記載する。 以下の拐１」トよび方法の項は上記で要約した実施例１
〜６に関するものである。 材料 ＡｐＢ緩衝故ば０．１８Ｍ Ｎａｃ ｌ 、 ０．０
５Ｍ ）リスＭＣＩ ｐＨ＝＝ ７．６．５ ｍＭ Ｅ
ＤＴ Ａおよび０．５％トウィーン２０である。 ＴＭＮＺ緩衝液は０．０５Ｍ＋・リスｐＨ＝９．５．１
ｍＭＭｇＣＩ２．０．５ｒｎＭ ＺｎＣｌ２ である。 ＦＷ （フィルター洗浄液）は０．０９ Ｍ塩化ナトリ
ウム、５０ ｍＭ ｌ・リスｐＨ７，６，２５ｍＭＥＤ
ＴＡである。 ＳＤＳ／ＦＷはＦＷおよび０．１％ の硫酸ドデシルナ
トリウム（ＳＤＳ）である。 ＨＲＰ （西洋わさびペルオキシダーゼ）基質溶液は０
．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ６，５，０，２Ｍシん酸
すトリウム、０．５ ｍｇ／ｍｌ ′Ｔ：ある。 ４−メトキシ−１−ナフトール、０．０２ｍｇ／ｍ１３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンおよび０
．０１３５チ過酸化水紫。 ＡＰ（アルカリホスファターゼ）基質ｍ液ハＴＭＮＺ中
、１ｍＭ５−ブロモ−４−クロロインドイル−３−ホス
フェート、１ｍＭニドρブルーテトラゾリウムおよび０
．旧ｃ！Ｊ＋−ウィーン２ｏである。 溶菌丸・よびハイブリッド形成溶液は３Ｍ チオシアン
酸グアニジン、２１Ｎ−ラウロイルザルコンン（ザルコ
シル）、５０ｍＭ トリスｐＨ７，６，２５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ である。 ＣＡＰ緩衝液はＯ，１Ｍクエン酸すＩリウムｐＨ６，５
および０．２Ｍりん酸ナトリウムである。 アルカリホスファターゼ用蛍光基質ハ０．０２ｍＭ４−
メチル−ウンベリフェロンホスフェート、０．０５Ｍ）
リスｐｆＴ ＝ ９．５．１ ｍＭ Ｍｇ Ｃ１２，０
，５ｍＭ Ｚ ｎ Ｃ１２である。 アルカリホスファターゼ用化学ルミネセンス基質はルミ
ゲン（Ｌｕｍｉｇｅｎ） インコーホレーテッド（ミ
シガン州デトロイト）から予め調製したカクテルであっ
た。 オリゴヌクレオチド配列： Ｂｇｌ： ５’−ＸＣＡＡＴＡＣＴＣＧＴＡＴＣＧＣＣ
ＣＧＴＴＡＴＴＣ−３’Ａａ００４： ５’−ＸＡＣＣ
ＣＡＴＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧ−３’Ｂ
ｇＯ１６： ５′−ＸＴＡＣＴＣＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧ
ＴＴＡＴＴＣＣＣＧ−３’Ｅｋ００７： ５’−ＸＡＡ
ＡＡＧＴＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＣＴＴＣＣＣＴＴ−３’
ＰＡＯＯ５： ５’−ＸＧＡＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＡＣ
ＣＡ’ｌ’ＣＴＧＣＡＡＣｒ−３’ＰＡ５０５： ５’
−ＸＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＡＴＣＴ
Ｃ−３’ＵＰ９Ａ： ５′−ＸＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣ
ＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’ＵＰＯＯ７： ５′−ＸＧＴ
ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３′ポリ（エチレ
ンイミン）はポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ） （ペンシルバニア州つオーリントン）から購入
した。 Ｈ＋、”、ｊｉいたまたは磨いていないナイ「」ンビー
ズはプレシジョンボールカンパニー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏ
ｎ；３７ Ｂａｌｌ Ｃｏｍｐａｎｙ） （イリノイ州シカゴ）お
よびザフーバー グループ（Ｈｏｏｖｅｒ Ｇｒｏｕｐ
）（ミシガン州ソール）・セイントマリー）から購入し
た。 トリエチルオキソニウム テトラフルオロボレー川・、
ヘキサンジアミン、フェニレンジアミン、無水コハク酸
およびＮ−メチル−ピロリジノ／（Ｎ−メチル−ピロリ
ドン、ｍ〜ルビロールはアルドリッチケミカル（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ Ｃｈｅｒｎｉｃａｌ）（イリノイ州ミルウオ
ーキー）から購入した。 Ｎ−ザクシンイミジル４−（ヨードアセトアミド）−ベ
ンゾエート（ＳＩＡＢ）およびトウイーン２０はピアー
ス（ＰｉｅｒｃｅＸイリノイ州ロック７オード）から購
入した。 インオチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）ハコダッ
ク（Ｋｏｄａｋ） にューヨーク州ロチェスター）から
購入した。 ナイロン膜、二ｌ・ラン（Ｎｙｔｒａｎ商標）はシュラ
イヒヤーアンドシュエル（５ｃｈｌａｉｃｈｅｒ＆ ５
ｃｂｕｅｌ ｌ） にューハンプシャー州キーネ）から
購入した。 ジーおＪ：ひトリアミンＥＤＲ−１４８、ＥＤ−４００
、ＥＤ−６０００およびＴ−３０００テキサコ ケミカ
ルカンパニー（Ｔｅｘａｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）（テキザス州ヒユーストン）からの寄贈品
であった。 方法 オリゴヌクし／オチド合成ニ アクチッパシラス アクチノマイセテムコミタンス（Ａ
ａ）、バクテ［。！イデス ジンジバリス（Ｂｇ）、バ
クテロイデス インターメディウス（Ｂｉ）、エイケネ
ラ コロデンス（Ｅｋ ） 、フンバクテリウムヌクレ
アタム（Ｆｎ） 、ｉだはウォリネラ レクタ（Ｗｒ）
のいずれかの１６８−リポソームＲＮＡ の保護され
た領域または超可変領域に相補的なオリゴヌクレオチド
はＡＢＩ ３８０Ｂかまたはミリゲン（ＭＮ］、ｉｇｃ
ｎ）７５００自動ＤＮＡ合成機かのいずれかでホスホラ
ミダイト化学を使用して合成した。 オリゴヌクレオチドは販売渚が提供する標準的ホスホラ
ミダイトの化学′ま／こはＩ（−ホスホネートの化学を
使用して製造した。適切に封鎖されたｄＡ、ｄＧ２ｄＣ
およびＴホスホラミダイトはこれらの形態で市販で人手
可能であり、そして合成ヌクレオシドは適当な形態に容
易に変換することができる。オリゴヌクレオチドは標準
的方法を採用して精製した。５’−１−リチル基を有す
るオリゴヌクレオチドは、１２μｍ、３０ＯＡライニン
（Ｒａｉｎｊｎ）（マサチューセッツ州つオバーン）ダ
イナマックス（Ｄｙｎａｍａｘ） Ｃ−８４，２Ｘ２５
０ｍｍ逆相カラムを使用し、Ｏ，］ Ｎ Ｅｔ３ ＮＨ
＋０Ａｃ−１ｐＨ７，０中１５％〜５５チのＭ ｅ Ｃ
Ｎの勾配を使用して２０分間、ＨＰＬＣでクロマトグラ
フィーにかけた。脱トリチル化を実施１７たとき、オリ
ゴヌクレオチドはゲル排除クロマトグラフィーで更に精
製した。オリゴヌクレオチドの品質の分析的点検は、ア
ルカリ性ｐＨでＴｏｓｏ−Ｈａａｓ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ
カラムを用いそしてポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＰＡＧＥ）によって実施しだ。 ポリマー被覆ナイロンビーズの調製： 直径が３／３２インチの２５，０００個の非研磨ナイロ
ンビーズは、１００チの無水ｎ−メチル−ピロリジノン
１８００ｍｌ を含有するフラスコに入れ、周囲温度で
５分間混合した。ジクｏｏメタン中１モルのトリエチル
オキソニウム テトラフルオロボージー） ２００ｍ１
を加え、混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。次いで
、ビーズを傾潟し、１００チのｎ−メチル−ピロリジノ
ン５００ｍ１で４回素早く洗浄した。次に、ポリ（エチ
レンイミン）の３０％水溶液から調製した３チ（ｗ／ｖ
）の１０、ＯＯＯＭＷのポリ（エチレンイミン）から
なるｎ−メチル−ピロリドン溶液にビーズを移し、そし
て周囲温度で１２〜２４時間撹拌した。ビーズはｎ−メ
チル−ピロリドン２０００ｍ１．ＳＤＳ／ＦＷ１０００
ｍｌおよび最後に１０ Ｘ ２１Ｊツトルの蒸留水で洗
浄した。次に、ビーズを高真空下で４〜５時間熱を使用
しないで乾燥させた。ビーズのアミン含量はビシル（ｐ
ｉｃｙｒｌ）スルホン酸との反応で測定した。 塩化シアヌル誘導オリゴヌクレオチドの調製＝１０〜１
０００μｇ の ５′−アミン結合オリゴヌクレオチド
を、アルカリ性緩衝液（好ましくは、ｐＨ８，３〜８．
５ ）中１０チのｎ−メチル−ピロリドン中１９〜２５
℃で３０〜１２０分間過剰の再結晶塩化シアヌルと反応
させた。最終反応条件はｐＨ８，３の０１５Ｍホウ酸す
トリウム、２ｍｇ／ｍｌの再結晶塩化シアヌルおよび５
００μｇ／ｍｌの各アミンヘキシルオリゴヌクレオチド
からなっていた。 未反応塩化シアヌルは、Ｇ−５０セフアデツクス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ商標）（スウェーデン、ウプサラのＰｈａ
ｒｍａｃ ｉ ａ ）カラムでサイズ排除クロマトグラ
フィーによって除去した。 ヨードアセトアミドベンゾイル化したオリゴヌクレオチ
ドの調製： １００〜１０００／１ｇの５′−アミン結合オリゴヌク
レオチド（ＵＰ９Ａ）は、アルカリ性（好ましくはｐＨ
８，０） 緩衝液中１８〜２５℃で３０〜１２０分間
過剰のＮ−サクシンイミジル４−（ヨードアセトアミド
）−ベンゾエート（ＳＩＡＢ）と反応させた。未反応５
ＩＡＢは、Ｇ−５０セフアデツクス（スウェーデン、ウ
プサラのＰｌｌａｒｍａｃｊａ） カラムでサイズ排除
クロマトグラフィーによって除去＝４２ した。 オリゴヌクレオチド誘導ナイロンビーズの調製：塩化シ
アヌル誘導のオリゴヌクレオチド用に、土
用の核酸ハイブリッドアッセイの分野に関するものであ
り、−層詳細には、活性化したオリゴヌクレオチドを固
体支持体として利用できるポリマー被覆ビーズに共有的
に結合させる組成物およびその方法に関するものである
。 核酸ハイブリッド形成は核酸の特定の配列を同定するだ
めの既知方法である。ノ）イブリッド形成は補体核酸ス
トランド間の塩基対に基づいている。 本釦核酸を適当な緩衝溶液中でインキュベートするとき
、補体塩基配列は対に外って二本鎖の安定７′、：分子
が形成される。このような対形成の存在または不存在Ｇ
（：当該技術分野でｉ記載された幾つかのｙ、＞なる方
法で検出することができる。 多くの公知のハイプリント形成アッセイは多数の工程に
関係している。例えばデュン（Ｄｕｎｎ、）等、Ｃｅ１
ｌ １２：２３−３６ （１９７７）（本明細：、！
）に引用する）が記載したハイブリッド形成技術では、
ザンドイッチタイプのアッセイは、「標的」核酸と固体
支持体上に固定された［捕獲」核酸プローブ間の第１の
ハイブリッド形成および典型的には放射性［１位元糸で
標識されだ１シグナル」核酸ブじ−ブと固定された標的
核酸の別の領域間の第２のハイブリッド形成からなって
いる。次いで、シクナルブローブのハイブリッド形成は
、例えばオー トラジオグラフィーで検出することがで
きる。 ランキ（Ｒａｎｋｉ ）等の米国特許４，４８６，５３
９および米国特許４−．５６３，４１９ （両特許は
共に本明細書に引用する）は、−重鎖核酸を固体キャリ
アに固定した核酸と放射性同位元召ピで標識した核酸と
をハイブリッド形成させる前に、核酸を一本鎖にする工
程が必要であるザンドイツチタイプのアッセイをｄ記載
している。 キャリコ（Ｃａｒｒｉｃｏ）等の米国ｌ特許４．．Ｂ
Ｏ６，５４６およびキャリコ等のヨーロッパ！侍許出願
８６１１２８９９．９（共に不明）清書に引用する）は
、ナイロンの表面上にアミジン基を導入するためにナイ
ロン支持体をアルキル化剤で処理することを記載してい
る。誘導さノ′［たナイロン表面６、−重鎖核酸を非共
有的に結合する能力を有している。次いで、非共有的に
結合した核酸をプＩ−］−ブとして使用して溶液中の特
定の標的核酸を栓用する。 ハンガー（Ｈｕｎ、ｇｅ ｒ ）等、Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌ Ｂｉ。 ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６５ ： ４５〜５５（１９８
７） ：ハンガー等、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ １５６：２８６〜２９９（１９８６
）；ハンガー等、ヨーロッパ特許出願８４１０９４８５
．７（全て本明細書に引用する）は、ザブピコグラム量
の補体ＤＮＡを検出するザザンプロット法において、切
断されたゲノムＤＮＡを（ＮＮ ５ｉ化している塩化シ
アヌルで活性化し）こセ／Ｌロース紙の醍用を記載して
いる。ピアギオニ（Ｂｉａｇｉｏ旧）等、Ａｎａｌｙｔ
ｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ ８９：６１６
（１９７８８不明ｉ、聞書に引用する） ｒＪ、塩化シ
アヌルを使用するＤＮＡ−セルロスのヤ３合方法を自記
載しており、そしてその際ＤＮＡセルピースはアンイニ
テイークロマトグラフイ法で使用される。 ヘルソベルグ（Ｈｒ・ｒ Ｚ ｂ ｅ ｒち）−ｆＧ”
＞ａ−ロツパ特♂ｌ出！ｌ’ｊｉ ０１７１１５υ（不
明細青に引用する）はデイソブスデイツクアソセイにお
いて固体支持体上にｉｌｆ；ｊ定したオリゴヌクレオチ
ドの使用全１．ピーしている。 リノ）マン（Ｌ ｉ ｔｐ＋ａ ｎ ） ＃の米国％
ｒＦ４，３９１，９０４（本明細（岩に引用する）は、
免疫学的対の１員が１−１１ ｆｔ；表１ｆｉに粘合し
ている試験片キットを記載してＩｏる。更に、ミラー（
：Ｍｉｌｌｅｒ）等、Ｃ１１ｎ−Ｃｈｃｍ。 ３０：１４６７〜１４７２（１９８４）およびプラタン
（Ｂｒｏｗｎ）等、Ｃｌ１ｎ、Ｃｂｅｍ、 ３０：１５
００〜１５０５（１９８５）（共に本明細書に引用する
）は固体７トリツクスとして抗体に結合したセルロース
スレッドを含有する分析試験室を記載しておシ、この寮
によ−って１つの試料から多数の試験結果を得ることが
できる。 （本発明の要約） 本！１１発明は核酸ハイブリッド形成アッセイで有用性
をイ１する新規な組成物および方法からなる。 本発明の１つの特徴に従って、活性化したオリゴヌクレ
オチドから人り、ポリマー被俊ビーズまたはそれに類似
する構造に共有的に結合することができる組成物が記載
される。好壕し２くば、同種三官能性試薬である塩化シ
アヌルでオリゴヌクレオチドを活性化する。ナイロン固
体支持体上に活性化した一十すゴヌクレオチドを共有的
に固定化する方法も不明細書に含まれる。 ポリマー被覆ビーズまだは同様な構造体に共有的に固定
化したオリゴヌクレオチドは核酸ブローブとして利用す
ることができ、そしてハイブリッド形成アッセイは特定
の標的核酸が複合生物学的試料中で検出されるように実
施することができる。 ビーズは、微憧滴定ウェル方式のような溶液、カラムの
ような通過方式、甘たはディツプスティック中で自由に
使用することができる。更に、ポリマー被捜ビーズ上に
固定されたオリゴヌクレオチドは同一または異なる核酸
配列であることができる。 ４願発明のビーズ固体支描体は、捕獲核酸配列が非共有
的に結合している既知の膜またはビーズ支持体を超える
次のような利点を有している。第１に、標的核酸配列の
捕獲率は５〜２５倍改善され、そして捕獲核酸配列の１
００％が補体配列とのハイブリッド形成に利用可能であ
る。第２に、固定された捕獲核酸前は見掛は上の表面積
に基づいて約２０倍増加させることができる。第３に、
製造がはるかに容易である。第４に、該ビーズは基本的
に固定化されだ捕獲核酸配列（オリゴヌクレオチド）を
有しており、９０℃を超える変性温度に１０分またはそ
れ以上耐えることができる。 最後に、多部位ディツプスティックを構築することがで
き、検出器具の小型化がもたらされる。これら利点の全
ては、例えばサンドイッチアッセイ方式を使用するとき
、より高い感受性の一因となる。 ディツプスティックも本願発明に含まれる。これらのデ
ィツプスティックは非多孔性固体支持体およびビーズま
たは上記で考移した類似構造体の結合手段からなる。更
に、種々の配列゛ま／ヒは特異性を有するオリゴヌクレ
オチドを有する多数のビズは多部位ディツプスティック
上に近接して整列させることができ、例えば細菌性およ
びウィルス性物を同定するために、たった１つの生物学
的標本で多数の病原体を検出できるインデイケータカー
ドをもたらす。 ディツプスティック方式でビーズまたは類似の構造体を
使用すると、必然的に２つの支持体間にサンドインチ状
に挾むかまたはその場に接着するか若しくは結合させな
ければならない膜支持体等に比べて、ビーズまたは類似
の構造体をディツプスティックに入れる圧力適合性が単
純なため、シグナル系の非特異的な背景値の有意な低下
が達成される。 本願発明の本質および利点は本明細書の残シの部分およ
び図面を参照して更に理解することができる。 （本発明の詳細な説明） 本願発明には核酸ハイブリッド形成アッセイに有用彦組
成物が金線れる。これらの組成物はジクロロトリアジン
オリゴヌクレオチドおよびポリマー被覆ビーズまたは類
似の構造体に共有結合した他の活性オリゴヌクレオチド
からなる。 更に、オリゴヌクレオチドをナイロン固体支持体、奸才
しくけビーズ上に共有的に固定する方法が含まれる。一
般に、これらの方法は、ナイロン固体支持体をアルキル
化剤で処理し、処理した固体支持体をアミン含有ポリマ
ーと反応させてポリマーで固体支持体を共有結合的に被
υし、オリゴヌクレオチドを単一官能性または多官能性
試薬、好捷しくけ同種三官能性試薬、塩化シアヌル（即
ち、２，４．６−）ジクロロトリアジン）で活性化し、
そして活性化したオリゴヌクレオチドとポリマー被覆固
体支持体を抱合させる７、Ｌ程からなる。 次いで、未反応アミンをアシル化で封鎖して固体支持体
表面に適当な表面負荷を与える。 用語「固体支持体」は溶液から溶液に移動可能であるか
またはオリゴヌクレオチドに基づくアッセイを実施する
構造体を形成する任意の表面を言い、そしてビーズ、膜
、微意滴定ウェル、ひも状物、プラスチック片まだは核
酸プローブを固定できる任意の表面が含まれる。 本明細書で使用されるように、「ビーズ」は核酸を共有
的に固定できる、プラスチック、セラミック、金属また
は重合物からなる任意のタイプの固体若しくは中空球体
、ボール、ベアリング、シリンダー、または他の類似形
状を包含する。そのようなものとして、咳用語にはナイ
ロンひも状物（１個捷たは複数）も含オれる。好ましく
は、球形状であるナイロンビーズが本願組成物で使用さ
１〇− れ、このようなビーズの好ましい直径範囲は約０．０１
インチから約０５インチまで、更に好ましくは約０８０
６インチから約０，０９インチ（市販で入手可能な３／
３２インチのナイロンビーズに相当）まで、そして最も
好ましくは約０．０９インチ（市販で人手可能ｆｉ３／
３２インチのナイロンビーズに相当）である。史に、ナ
イロンビーズは研磨されていないかまたは研磨されてい
る場合、アルキル化剤で処理する前にざらざらにするこ
とが好ましい。 本願発明では、ナイロンビーズ（１個または複数）また
はナイロンの任意の組成物若しくは構造体はビーズを先
すアルキル化剤で処理して誘導（製漬）される。この方
法で使用さするアルキル化剤はナイロン中に存在するア
ミドと反応して反応性のイミデートエステルを形成する
。 好棟しいアルキル化剤にはジアルキルスルフェート、ア
ルキルｌ−ＩＪフレート、アルキルジフェニルスルホニ
ウム、アルキルハークロレートオｘｏ：好オしくはトリ
アルキルオキソ−ラム塩が含まれるが、これらに限定さ
ねない。後者には低級アルキル塩、トリエチルオキンニ
ウムおよびトリエチルオキソ−ニウム塩が含まれる。対
イオン塩はへキサクロロアンチモネート、ヘキザフルオ
ロホスフ工−１・訃よひテトラフルオロボーレートから
なるノ）１から選択することができ、最後に記載した対
イオンが好ましいが、他の対イオン塩も使用することが
でき、それらは当該技術分野の熟練者に明白であろう。 アルキル化剤の溶媒の選択は本願発明にとって重要であ
る。アルキル化中にナイロンを溶解しないかまたは粘着
性にしない溶媒を使用すべきである。１ジク［」「Ｊメ
タン、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、Ｎ
−メチル−ピロリドン等のようなＪト求核的有機溶媒が
適切な溶媒である。特に、Ｎ−メチル−ピロリドンが好
ましい。 次いで、得られたビーズ表面上のイミデートエステルを
適当な条件下でアミン含有ポリマーと反応させることに
よってアミジン残基が形成される。 任意の第一級ｊたけ第二級アミンを含有するポリマーを
使用してアミジン残基を形成させ、その結果ビーズの表
面上にポリマーを共有的に固定することができる。ポリ
（エチレン１′ミン）、ポリアリルアミンおよびポリビ
ニルアミンが好−ましい例である。活性化し／こナイト
１ンビーズにポリマーを抱合させる間にポリマーを溶解
するために使用さＪｌ、る好ましい溶媒はＮ−メチルー
ビ「］リドンである。。 ナイロンは部分的に加水分解して、アミン含有またはカ
ルボギシル含有ポリマーと反応し得る反応性アミンまた
はカルボキシル基を虫じぢせることもできる。同様に、
固体支持体の表面を被覆するカルボキシル部分は上記し
たものと同様な化学を使用してアミンを含有するポリマ
ーで被覆することができる。 更に、任意の第一級または第二級脂肪族または芳Ａ族ア
ミンを用いて誘導し得る他の任意のポリマーが本願発Ｉ
ＪＩＪには適当である。このようなポリマーの単位は直
接的重合化法結合またはカップリング剤連結によって一
緒に結合される。直接的重合化によって近接する単位内
の利用可能な化学的基または主要部分の相互結合がもた
らされる。例オーば、モノマー単位を酸化的交差結合に
よって重合化するために酸化酵素を使用することができ
る。 或幻：、二官能性または多官能性有機交差結合剤から誘
導されるカップリング剤は単位の適当な化学的基または
主要部分と結合することができる。この文脈で、用語［
カップリング剤」は結合後の結合基を意味し、用語１−
交差結合試薬」は結合前の結合化合物を意味する。 交差結合試薬は次の一般式をイイする：Ａ −−−−
−Ｒ１−−−−Ｅ 式中、反応性基Ａ、 ＢおよびＥは、水素、カルボン酸
基、酸ハライド、活性エステル、混合酸無水物、イミノ
エステル、第一級アミン、アルデヒド基、α−ハロメチ
ルカルボニル基、ヒドラジン基、アシルヒドラジド基、
アジド基、およびＮ−マレインイミド基からなる基から
独立して選択され、］４ その際Ａ、ＢおよびＥの少なくとも２つは水素以夕（の
基である。Ｒ（ｒＪ少なくとも２個の炭素の脂肪族基′
＋たけ少なくとも６個の炭素の芳香族若しくは５゛ｌ（
項ｉ：“ｄ基でちる。 Ａ、ＢおよびＥ ＶＣ類似する３個以上の反応性基をイ
）′する多官能性交差結合試薬も本願発明の範囲内であ
る。とれらの追加的な反応性基はＡ、ＢおよびＥの前記
定義から独立して選択される。 反応性基の選択は、結合すべきポリマー単位（モノマー
単位）の化学的基徒たは主要部分の選択によって決する
。化学的基せたは主要部分の各タイプは適当な反応性基
（１個まだは複数９と反応する。例えば、アミン基はカ
ルボン酸基、酸ハライド、活性エステル、混合酸無水物
、アシルイミダゾライド、Ｎ−（カルボニールオキシ）
イミド基、イミノエステル凍たはアルデヒド基と反応す
る。 酸化した１、２−ジオール基（ジアルデヒド）は第一級
アミン、ヒドラジン基、アジド寸たはアシルヒドラジド
基と反応する。カルボニル基は第一級アミン、 ヒドラ
ジン基またはアシルヒドラジド基と反応する。メルカプ
タン基はカルボン酸基、酸ハライド、活性エステル、混
合酸無水物、アシルイミダゾライドまたはＮ−（カルボ
ニルオキシ）イミドと反応する。炭素−水素結合はアジ
ドにトレン）と反応する。かくして、固体支持体は、多
数の活性化可能な第一級および第二級アミンを含有する
多官能性ポリマーを含む選択されたポリマーで被覆され
る。 下記光は、直接かまたはスペーサーアームを介してかの
いずれかによってポリマーを固体支持体に共有結合させ
るために本願発明で使用することができる反応のタイプ
を示すが、これらに限定されない。示されるとおり、ア
ミン含有ポリマーが好ましいが、チオールまたはカルボ
キシル基を含有する他のポリマーをウェルとして使用す
ることができる。 ビーズ ポリマー カップリング油能性：
官能性： 試薬： アミン アミン 塩化シアヌルアミン ＣＯＯカルボジイミド アミン −ＳＨ異種二官能性 ＣＯＯアミン カルボジイミド −ＯＨアミン 塩化シアヌル 次いで、ボ１１マー被覆固体支持体は上記したものと類
似または同一の化学を使用１〜で活性オリゴヌクレオチ
ドと抱合させる。本明細書で使用するとき、オリゴヌク
レオチドは長さが概ね１６乃至１００塩基である短い核
酸配列をごう。このようなオリゴヌクレオチドはハイブ
リッド形成アッセイで捕獲プローブとして使用すること
ができ、好ｔＬ、＜は市販で入手可能な方法および装置
を使用して化学的に合成することができる。例えば、１
６．０００ダルトン未満の分子量を有する１５から５０
塩基の間の短いプローブを製造するために固相ホスホラ
ミダイト法を使用することができる。 オリゴヌクレオチドの合成に関しては、カルザズ（Ｃａ
ｒｕｔｂｅｒｓ ） 智、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂ。 ｕｒ ５ｙｒｎｐ、 Ｑｕａｎｔ、、 Ｂｉｏｌｏ、４
７：４１１〜４］８（１９８２）； アダムス（Ａｄａ
ｍｓ）等、Ｊ、 Ａｍ、 Ｃｈｅｍ−Ｓｏｃ、、１０５
：６６１ （１９８３）（両方基本明細書に引用する）
参照。 特定の標的核酸用のオリゴヌクレオチドプロプを合成す
るとき、ヌクレオチド配列の選択によって試験の特異性
が決定される。例えば、幾つかの細菌性単離物から得た
ＤＮＡ配列を比較することによって、タイプ特異的かま
たは属特異的のいずれかである細菌性検出用配列を選択
することができる。ＤＮＡ領域および配列の比較は、市
販で入手可能なコンピュータープログラムを使用して達
成することができる。 本願発明で使用される好ましい捕獲オリゴヌクレオチド
は、長さが約２０から約１００塩基までの合成オリゴヌ
クレオチドである。スペーサー（リンカ−）アーム、即
ち他の化学的基に伸ひるかまたは結合し且つ好ましくは
約２から約１２個の炭素原子、更に好ましくは約６個の
炭素原子を含有する炭素鎖であって封鎖したアミノ基を
有する化学的部分は、慣用の化学を使用する合成中にオ
リゴヌクレオチドの５′−ヒドロキシル基にカップリン
グさせることができる。第一級アミンは単一官能性また
は多官能性試薬に結合させるのに好寸しい基であり、ヘ
キシルアームを介して結合することが好ましい。第一級
アミンで終結している第一級スベーザーアーム結合用試
薬は市販で大手可能である。 本願発明で使用するのに適する出発物質はＰＣＴ８６１
０１２９０ ； Ｎｕｃｌ、 Ａｅｉｄｓ Ｒｅｓ、
１５： ３１３１（１９８７）： Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１
ｄｓ Ｒｅｓ、 １５：２８９１ （１９８７）：およ
びＮｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １４ ニア９８
５ （１９８６）（全て本明細１．に引用する）に記載
されている。 好ましくは、 ＼ −Ｐ （ＣＨ２）ｎ （式中、 スペ サ ア ムとして、 ｎは２〜１２ （両者を含む）、好ましくは６であり、Ｘは−ＮＨ−ま
たは−ＮＨＣ：Ｏ（ＣＨ２）ＮＨ−１好ましくはＮＨ−
であり（式中、ｍは２〜１２（両者を含む）である）、
Ｙは４，６−ジクｒＩ−Ｉトリアジン（好ましい）また
はチオール（スルフヒドリル）反応性部分であり、そし
てＡは約９〜５０塩基の間、好ましくは約１５〜３０塩
基の間の範囲のオリゴヌクレオチドである）、のような
５′−末端構造を有する方すゴヌクレオチドを使用する
ことができ、結合には５′−ヒドロキシル基の修飾しか
必要でない。 或は、オリゴヌクレオチドは、封鎖されたアミン基を含
有するスペーサーアームを用いて３′末端で修飾するこ
とができる。これは抱合リボヌクレオチドを言イ１する
固体支持鉢土でＤＮＡ合成を行うことによって達成する
ことができる。１個（７）３’ −末端リボヌクレオチ
ドを含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドは固体支持体か
ら除去後に得られる。これは求核性アミンを含有するス
ペーサアームを用いて、例えばりボヌクレオチドシスグ
リコールを過ヨウ素酸塩で酸化し、オリゴヌクレオチド
を例えばブタンジアミンで修飾するように処理してシッ
ク塩基を形成させ、そしてすトリウムボロヒドリドまた
はシアノボロヒドリドで処理してアミンの１つがその後
抱合されるように遊離の捷寸である、安定な還元シッフ
塩基誘導体を形成させることによって修飾することがで
きる。 次いで、選択されたオリゴヌクレオチドを単一官能性ま
だは多官能性試薬で活性化する。活性化したオリゴヌク
レオチドとは一般に、化学的化合物と反Ｉｒ；させ化学
的に活性にされたオリゴヌクレオチドを言う。本明細書
で使用するとき、活性化ｒｉ′Ｔ能とは化学的に反応性
になる潜在力を言う。多官ｉｌ二性試薬には同種三官能
性、異種三官能性、同種二官能性および異種二官能性試
薬が＠まれるが、これに限定されない。 活性化したオリゴヌクレオチドはその後の化学反応に従
ってポリマー被覆固体支持体に結合させることができる
。一般に、オリゴヌクレオチドがこの点でポリマーに共
有結合できる２つの態様がある。アミン末端オリゴヌク
レオチドは単一官能性寸たは多官能性試薬、例えば塩化
シアヌルで活性化させてアルキルアミノジクロロトリア
ジンを形成させることができ、従ってこれはアミン含有
ポリマーに反応性である。或は、ビーズ表面上のポリマ
ーは、試薬、好ましくは同種三官能性試薬塩化シアヌル
で活性化させることができ、従ってこれはアミン末端ま
たはアミン市来のオリゴヌクレオチドに反応性である。 塩化シアヌル、即ち同種三官能性試薬が好ましいが、他
の試薬を使用することができる。例えば、Ｎ−サクシン
イミジル−４−（ヨードアセトアミド）−ベンゾニー）
（ＳＩＡＢ） は異種二官能性試薬であり、ジザク
シンイミジルスベレートは同種二官能性試薬である。カ
ルボキシル基が関係している場合、異種二官能性試薬、
１−エチル−３（ジメチルアミンプロピル）−カルポジ
イシドを使用することができる。他の同様な単一官能性
および多官能性（異種多官能性および同種多官能性）試
薬が本願発明の方法での使用に含まれる。 本願発明に使用される化学によって、下記実施例１で示
されるように、オリゴヌクレオチドのプリンおよびピリ
ミジン塩基のいずれも（ＬＳ飾することなくオリゴヌク
レオチド上のアミン基の選択的活性化がもたらされる。 ビーズ表面上にアミン含イ〕ポリ−７−を配置しこのよ
うな表面上に活性化された捕獲オリゴヌクレオチドを共
有的に固定化することによって、ジアミン化合物、例え
ばヘキサンジアミンと比較して標的核酸の捕獲率脣たは
捕獲度を５〜２５倍増加させる。更に、ビーズ表面上の
生物学的材料の非ＩＰ！ｊ異的結合が実質的に減少する
。 好寸しい化学には塩化シアヌル（即ら、２，４゜６−
トリクロロトリアジン）が使用される。塩化シアヌル反
応の化学は次のとおりである。 式中、Ｒはオリゴヌクレオチドであり、好ましくは５′
−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドで示される構造の
ものである。 ５′−甘たけ３′−結合（ヘキシルアームラ介して）求
核性アミン部分（まだはピリミジン若しくはプリン塩基
に置換した内部アミノアルキル基）を有するオリゴヌク
レオチドを過剰の、好ましくは約５０から約２００倍の
、更に好ましくは１２５倍の結晶塩化シアヌルと好まし
くは１５〜５０℃、更に好ましくは１９〜２５℃で約３
０分から約６時間まで、更に好ましくは約１から約２時
間までの好ましい時間１都市機溶媒中で反応させる。 ひとたびオリゴヌクレオチドが塩化シアヌルで活性化さ
れると、チオール、ヒドロキシルまたはアミンのような
適当に配置された求核物を含有する分子に共有結合させ
ることができる。さらに具体的には、以下で省察する固
体支持体との共有結合に加えて、ジクロロトリアジンオ
リゴヌクレオチドを以下のものを含むがこれらに限定さ
れない多くの組成物に共有結合させるだめの求電子物と
して利用することができる：これらはタンパク質、例え
ば酵素、抗体、レクチン、および抗体を生じさせるため
に使用されるタンパク質担体；求核物由来のオリゴヌク
レオチド、例えば５′−または３′−アミノヘキシル末
端オリゴヌクレオチド；求核物含有ポリマー、例えばポ
リ（エチレンイミン）、ポリアリルアミンおよびポリビ
ニルアミン：求核物含有低分子濾化合物、例えば放射性
標識物、化学ルミネセンス標識物、蛍光標識物、着色標
識物および免疫原標識物等である。以下で考察されるよ
うにオリゴヌクレオチドを塩化シアヌルで活性化する方
法によってジクロロトリアジンオリゴヌクレオチドが形
成されるので、ジクロロトリアジンオリゴヌクレオチド
は本願発明に含まれる。 未反応塩化シアヌルは排除クロマトグラフィまたは限外
ろ過で除去することができ、ビーズおよび誘導されたオ
リゴヌクレオチドは一緒に混合しそして好ましくは２０
〜５０℃で１〜２４時間インキュベートして抱合される
。ビーズ表面上の残りの（未反応の）アミンは、無水コ
ハク酸のような試薬を用いてホウ酸ナトリウムのような
適当な塩基の存在下で好ましくはＮ−メチルピロリドン
中で封鎖しくキャップをかけ）で表面を核酸ハイブリッ
ド形成に適合性（陰性に荷電した）とすることができる
。このようなアミン封鎖はアシル化反応またはアミンと
活性エステルとの反応で生起し、非活性化部分がもたら
される。陽性、陰性または中性電荷をビーズ上に負荷で
きるように化学的に誘導する可能性がビーズ表面に存在
することは注目すべきである。 更に、４，６−ジクロロトリアジン部分はチオル反応性
置換基で置換することができ、好ましくはスペーサーア
ームが存在する。好ましいスベサーアームは５′−結合
求核性アミンに結合したチオール反応性置換基から誘導
され、上記式中Ｙがチオール反応性部分であることを除
いて上記で示した式と同一のものである。好ましいチオ
ル反応性部分はαハローアシルかまたはα、β不飽和カ
ルボニルのいずれかの反応基を有する。 最も好ましいチオール反応性部分はハロアセトアミドベ
ンゾイルおよび４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロ
ヘキサン−１−カルボニルカラナル群から選択される。 ポリマー構造がチオール（スルフヒドリル）含有部分で
誘導されている上記のポリマー構造を本願発明で使用す
ることができる。チオール含有部分の実際の構造は、チ
オール基（１測寸たけ複数）がチオール反応体部分との
反応に利用可能である限り、重要ではない。この場合の
チオールの化学は塩化シアヌルの化学に置き換えられる
。 本願発明には核酸ハイブリッド形成に有用性をイ４しそ
して非多孔性固体支持体およびビーズ結合手段からなる
ディツプスティックも含まれる。非多孔性固体支持体は
当該技術分野で既知であり、そして本願発明はディツプ
スティックにビーズを結合させることに関している。ビ
ーズ結合の１つの例はビーズが結合し得るディツプステ
ィックのη通仕（１測寸たは複数）の存在である。好ま
しくは複数の貫通孔を使用し孔の夕１周との圧力適合に
よってビーズに結合させる。例えば、貫通孔（くぼみ）
の外周がビーズの外周より僅かに小さい場合、ビーズが
適所に押し付けられるように上記の圧力適合が行われる
。 好ましいビーズは上記したとおりであり、上記したとお
シ、一定のビーズ当たり同一または異なる配列の活性化
オリゴヌクレオチドに直接にかまたはスペーサーアーム
によってのいずれかによって共有結合させることができ
る。 ディツプスティックはそれ自体の穴の各々に１つ以上、
好ましくは約２から１０までの、更に好甘しくはディツ
プスティックの１つの縁に沿って１列になって位置した
ビーズを有している。このようなディツプスティックは
インデイケータ−カドとして機能を果たすことができ、
その原種々の配列または特異性を有するオリゴヌクレオ
チドに共有結合した複式ビーズは多数部位ディツプステ
ィックに密接して配列させることができ、該ディツプス
ティックによって単一の生物学的試料中の多数の病原体
を検出することができる。特別のビーズは１つ以上の核
酸配列、例えば関連生物から得られる配列を有するオリ
ゴヌクレオチドを含有することができ、またはビーズは
一定の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドだけを含有
することができる。 病原性および非病原性体を含む多数の生物および細胞タ
イプはこの方法で種々の生物学的試料タイプから検出す
ることができる。生物には細菌およびウィルス並びに他
の微生物が含まれ、細胞タイプには、例えば、遺伝性疾
病および代謝障害に関連するものが含まれる。他の多く
の検出適用は当該技術分野の通常の技佃を有する者に明
白であろう。例えば、アクチノバシラスアクチノマイセ
テムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａ
ｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｒｎｃｏｍｉｔａｎｓ）、ノ（
クチロイデスジンジバリス（Ｂａｃｔｃｒｏｉｄｅｓ
ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）。 バクテロイデスフオルシサス（ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、
バクテロイテスインターメデイウス（ｉｎｔｅｒｍｅｄ
ｉｕｓ ）、エイケネラ コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌ
ｌａＣＱＩ・ｒｏｄｅｎｓ ） 、フンバクプラム ヌ
クレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｕｍ ｎｕｃｌｅａ
ｔｕｍ）およびウオリネラレクタ（Ｗｏｌｊｎｅｌｌａ
ｒｅｃｔａ）のような歯周囲炎の原因細菌を同定する
ことができる。 本願発明は核酸ハイブリッド形成アッセイの点から記載
するが、これらディツプスティックの他の多くの使用が
可能であることは当該技術分野で通常の技佃を有する者
に明白であろう。リガンド対の任意の一員をディツプス
ティックのビーズに結合させることができ、次いでこの
ディツプスティックは対応するりガント員を同定するた
めに使用することができる。例えば、抗原または抗体は
上記したようにディツプスティック中のビーズに結合さ
せることができ、次いでそれらの対応する抗体才たは抗
原をそれぞれ同定することができよう。同様にして、ビ
チオンおよびストレプトアビジンを使用することができ
る。 更に、本願発明には核酸の検出方法も含まれ、その際ポ
リマー被覆ビーズからなシ、好ましくは活性化可能なア
ミン基を有し、活性化したオリゴヌクレオチドに共有的
に結合した組成物が適当な３〇− ハイブリッド形成東件下で標的核酸と接触させられ、そ
してハイブリッド形成しだ生成物が検出さｔｌろ。この
ような方法は上記し７たように、徴証滴定ウェル中、流
出カラム中、およびディツプスティックを使用して実施
することができる。 標的核酸は通常は、長さが約２０から約２０．０００１
での塩基対重たはヌクレオチドの平均長さを有するポリ
ヌクレオチドである。ハイブリッド形成の適当な条件と
は、塩基対の不適合が生じないでハイブリッド形成した
生成物が完全に塩基対になる厳密な条件を言う。 時別のハイブリッド形成技術は本発明には必要でなく、
当談技術分」の通常の技佃を有する者は種々のこのよう
な技術を理解するであろう。ハイブリッド形成技術は一
般的には、バーメス（Ｈａｍｃｓ） Ｂ、 Ｄ、等（編
）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ 、実用的な方法、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ％ニュ
ーヨーク（１９８５）に記載されている。ノ１イブリッ
ド形成技術では改良が為されるので、それら改良は本願
発明に容易に適用することができる。 サンドイッチアツセイを本願方法で好都合に使用するこ
とができ、その際検出すべき標的核酸は抽出されるかま
たは最初の試料中にあり、そしてビーズのような固体支
持鉢土でハイブリッド形成（即ち、相補的塩基の対合）
によって結合（捕獲）されて、該支持体の表面上に共イ
１的に固定化されたオリゴヌクレオナドプｒＪ−ブを捕
獲する。次いで、捕獲された核酸をシグナルオリゴヌク
レメチドフローブとハイブリッド形成させ、まだは変法
として、この工程υ二、例えばハイブリッド形成溶液中
にシグナルフ「１−ブを営めることによって標的の捕獲
と同時に行うことが一〇きる。シグナルゾ１７−ブは、
例えばビオチンで標識することができる。これによって
、サンドイッチアッセイを構成する捕獲オリゴヌクレオ
チドプローブ：標的核酸：シグナルオリゴヌクレオチド
プローブの［サンドイッチ」がもたらされる。次に、固
体支持体を洗浄してハイブリッド未形成材和を除去し、
次いで標識した核酸を標識物の検出可能な特性に従って
測定する。 種々の標識を、本発明によって利益を得るハイブリッド
アッセイで使用することができる。このような標識は、
標的配列とその相補的シグナル配列間の二重体検出用の
リポータ−として作用する。 不明細省で使用するリポータ−基は、測定または検出す
ることができる物理的まンソは化学的特性を有する基で
ある。検出可能性は色の変化、ルミネセンス、蛍光また
は放射能のような特性によってもたらされる。または、
上記可能性はりガント認識部位として役立つリポータ−
基の能力によって提供される。任意のハブテンまたは抗
原化合物を適当な標識抗体と組み合わせて使用すること
ができる。 リポータ−基として１使な酵素は生として加水分解酵素
、特にホスファターゼ、エステラーゼ、ウレアーゼおよ
びグリコシダーゼ、才たは酸化還元酵素、特にペルオキ
シダーゼである。蛍光化合物にはフルオレセインおよび
その誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、
ウンベリフェロン等カ含゛まれる。化学発光物にはルシ
フェリン、ルミノールおよびオキセタンジオンが含まれ
る。 上記リストは完全でなく、そして標識の選択は必要々感
受性、プローブとの抱合の容易性、安定性要件および利
用可能な器具使用によって決まる。 上記記載および以下の実験の項は説明のためであって限
定しようとするものでないことを理解すべきである。多
くの変更および適用は、本開示の検討によって、当該技
術分野で通常の技洲な有する者に容易に明白でろろう。 以下の実験の項で、実施例１は塩化シアヌルを用いるア
ミンヘキシル末端オリゴヌクレオチドの選択的活性化を
記載する。実施ｙ＋＋ ２は固体支持体のハイブリッド
形成促進能に関して種々のジアミ／およびポリ（エチレ
ンイζ゛ン）から誘導されたナイロンビーズの比較を記
載する。実施例３は、不溶性比色基質を使用してハイブ
リッド形成を検出するサンドイッチアッセイにおけるオ
リゴヌクレオチド誘導ナイロンビーズの使用を記載する
。 実施例４は、標的を複合生物学的試ネ」中で検出するサ
ンドイッチアツセイにおけるオリゴヌクレ第チド誘導ナ
イロンビーズの使用を記載する。 実施例５は、標的を化学ルミネセンスによって検出する
ザンドイツチにおけるオリゴヌクレオチド誘導ナイ［」
ンビーズの使用を記載する。実施例６は、ディツプステ
ィックに固定したオリゴヌクＬ、−オチドＲＬ’＋ナイ
ロンビーズを使用した多部位検出バネルオたはカー ド
の形成を記載する。 以下の拐１」トよび方法の項は上記で要約した実施例１
〜６に関するものである。 材料 ＡｐＢ緩衝故ば０．１８Ｍ Ｎａｃ ｌ 、 ０．０
５Ｍ ）リスＭＣＩ ｐＨ＝＝ ７．６．５ ｍＭ Ｅ
ＤＴ Ａおよび０．５％トウィーン２０である。 ＴＭＮＺ緩衝液は０．０５Ｍ＋・リスｐＨ＝９．５．１
ｍＭＭｇＣＩ２．０．５ｒｎＭ ＺｎＣｌ２ である。 ＦＷ （フィルター洗浄液）は０．０９ Ｍ塩化ナトリ
ウム、５０ ｍＭ ｌ・リスｐＨ７，６，２５ｍＭＥＤ
ＴＡである。 ＳＤＳ／ＦＷはＦＷおよび０．１％ の硫酸ドデシルナ
トリウム（ＳＤＳ）である。 ＨＲＰ （西洋わさびペルオキシダーゼ）基質溶液は０
．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ６，５，０，２Ｍシん酸
すトリウム、０．５ ｍｇ／ｍｌ ′Ｔ：ある。 ４−メトキシ−１−ナフトール、０．０２ｍｇ／ｍ１３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンおよび０
．０１３５チ過酸化水紫。 ＡＰ（アルカリホスファターゼ）基質ｍ液ハＴＭＮＺ中
、１ｍＭ５−ブロモ−４−クロロインドイル−３−ホス
フェート、１ｍＭニドρブルーテトラゾリウムおよび０
．旧ｃ！Ｊ＋−ウィーン２ｏである。 溶菌丸・よびハイブリッド形成溶液は３Ｍ チオシアン
酸グアニジン、２１Ｎ−ラウロイルザルコンン（ザルコ
シル）、５０ｍＭ トリスｐＨ７，６，２５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ である。 ＣＡＰ緩衝液はＯ，１Ｍクエン酸すＩリウムｐＨ６，５
および０．２Ｍりん酸ナトリウムである。 アルカリホスファターゼ用蛍光基質ハ０．０２ｍＭ４−
メチル−ウンベリフェロンホスフェート、０．０５Ｍ）
リスｐｆＴ ＝ ９．５．１ ｍＭ Ｍｇ Ｃ１２，０
，５ｍＭ Ｚ ｎ Ｃ１２である。 アルカリホスファターゼ用化学ルミネセンス基質はルミ
ゲン（Ｌｕｍｉｇｅｎ） インコーホレーテッド（ミ
シガン州デトロイト）から予め調製したカクテルであっ
た。 オリゴヌクレオチド配列： Ｂｇｌ： ５’−ＸＣＡＡＴＡＣＴＣＧＴＡＴＣＧＣＣ
ＣＧＴＴＡＴＴＣ−３’Ａａ００４： ５’−ＸＡＣＣ
ＣＡＴＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧＧ−３’Ｂ
ｇＯ１６： ５′−ＸＴＡＣＴＣＧＴＡＴＣＧＣＣＣＧ
ＴＴＡＴＴＣＣＣＧ−３’Ｅｋ００７： ５’−ＸＡＡ
ＡＡＧＴＧＧＴＡＴＴＡＧＣＡＣＴＴＣＣＣＴＴ−３’
ＰＡＯＯ５： ５’−ＸＧＡＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＡＣ
ＣＡ’ｌ’ＣＴＧＣＡＡＣｒ−３’ＰＡ５０５： ５’
−ＸＣＴＴＧＣＡＧＡＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＡＴＣＴ
Ｃ−３’ＵＰ９Ａ： ５′−ＸＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＣ
ＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’ＵＰＯＯ７： ５′−ＸＧＴ
ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ−３′ポリ（エチレ
ンイミン）はポリサイエンシズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ） （ペンシルバニア州つオーリントン）から購入
した。 Ｈ＋、”、ｊｉいたまたは磨いていないナイ「」ンビー
ズはプレシジョンボールカンパニー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏ
ｎ；３７ Ｂａｌｌ Ｃｏｍｐａｎｙ） （イリノイ州シカゴ）お
よびザフーバー グループ（Ｈｏｏｖｅｒ Ｇｒｏｕｐ
）（ミシガン州ソール）・セイントマリー）から購入し
た。 トリエチルオキソニウム テトラフルオロボレー川・、
ヘキサンジアミン、フェニレンジアミン、無水コハク酸
およびＮ−メチル−ピロリジノ／（Ｎ−メチル−ピロリ
ドン、ｍ〜ルビロールはアルドリッチケミカル（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ Ｃｈｅｒｎｉｃａｌ）（イリノイ州ミルウオ
ーキー）から購入した。 Ｎ−ザクシンイミジル４−（ヨードアセトアミド）−ベ
ンゾエート（ＳＩＡＢ）およびトウイーン２０はピアー
ス（ＰｉｅｒｃｅＸイリノイ州ロック７オード）から購
入した。 インオチオシアン酸グアニジン（ＧｕＳＣＮ）ハコダッ
ク（Ｋｏｄａｋ） にューヨーク州ロチェスター）から
購入した。 ナイロン膜、二ｌ・ラン（Ｎｙｔｒａｎ商標）はシュラ
イヒヤーアンドシュエル（５ｃｈｌａｉｃｈｅｒ＆ ５
ｃｂｕｅｌ ｌ） にューハンプシャー州キーネ）から
購入した。 ジーおＪ：ひトリアミンＥＤＲ−１４８、ＥＤ−４００
、ＥＤ−６０００およびＴ−３０００テキサコ ケミカ
ルカンパニー（Ｔｅｘａｃｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）（テキザス州ヒユーストン）からの寄贈品
であった。 方法 オリゴヌクし／オチド合成ニ アクチッパシラス アクチノマイセテムコミタンス（Ａ
ａ）、バクテ［。！イデス ジンジバリス（Ｂｇ）、バ
クテロイデス インターメディウス（Ｂｉ）、エイケネ
ラ コロデンス（Ｅｋ ） 、フンバクテリウムヌクレ
アタム（Ｆｎ） 、ｉだはウォリネラ レクタ（Ｗｒ）
のいずれかの１６８−リポソームＲＮＡ の保護され
た領域または超可変領域に相補的なオリゴヌクレオチド
はＡＢＩ ３８０Ｂかまたはミリゲン（ＭＮ］、ｉｇｃ
ｎ）７５００自動ＤＮＡ合成機かのいずれかでホスホラ
ミダイト化学を使用して合成した。 オリゴヌクレオチドは販売渚が提供する標準的ホスホラ
ミダイトの化学′ま／こはＩ（−ホスホネートの化学を
使用して製造した。適切に封鎖されたｄＡ、ｄＧ２ｄＣ
およびＴホスホラミダイトはこれらの形態で市販で人手
可能であり、そして合成ヌクレオシドは適当な形態に容
易に変換することができる。オリゴヌクレオチドは標準
的方法を採用して精製した。５’−１−リチル基を有す
るオリゴヌクレオチドは、１２μｍ、３０ＯＡライニン
（Ｒａｉｎｊｎ）（マサチューセッツ州つオバーン）ダ
イナマックス（Ｄｙｎａｍａｘ） Ｃ−８４，２Ｘ２５
０ｍｍ逆相カラムを使用し、Ｏ，］ Ｎ Ｅｔ３ ＮＨ
＋０Ａｃ−１ｐＨ７，０中１５％〜５５チのＭ ｅ Ｃ
Ｎの勾配を使用して２０分間、ＨＰＬＣでクロマトグラ
フィーにかけた。脱トリチル化を実施１７たとき、オリ
ゴヌクレオチドはゲル排除クロマトグラフィーで更に精
製した。オリゴヌクレオチドの品質の分析的点検は、ア
ルカリ性ｐＨでＴｏｓｏ−Ｈａａｓ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ
カラムを用いそしてポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ＰＡＧＥ）によって実施しだ。 ポリマー被覆ナイロンビーズの調製： 直径が３／３２インチの２５，０００個の非研磨ナイロ
ンビーズは、１００チの無水ｎ−メチル−ピロリジノン
１８００ｍｌ を含有するフラスコに入れ、周囲温度で
５分間混合した。ジクｏｏメタン中１モルのトリエチル
オキソニウム テトラフルオロボージー） ２００ｍ１
を加え、混合物を周囲温度で３０分間攪拌した。次いで
、ビーズを傾潟し、１００チのｎ−メチル−ピロリジノ
ン５００ｍ１で４回素早く洗浄した。次に、ポリ（エチ
レンイミン）の３０％水溶液から調製した３チ（ｗ／ｖ
）の１０、ＯＯＯＭＷのポリ（エチレンイミン）から
なるｎ−メチル−ピロリドン溶液にビーズを移し、そし
て周囲温度で１２〜２４時間撹拌した。ビーズはｎ−メ
チル−ピロリドン２０００ｍ１．ＳＤＳ／ＦＷ１０００
ｍｌおよび最後に１０ Ｘ ２１Ｊツトルの蒸留水で洗
浄した。次に、ビーズを高真空下で４〜５時間熱を使用
しないで乾燥させた。ビーズのアミン含量はビシル（ｐ
ｉｃｙｒｌ）スルホン酸との反応で測定した。 塩化シアヌル誘導オリゴヌクレオチドの調製＝１０〜１
０００μｇ の ５′−アミン結合オリゴヌクレオチド
を、アルカリ性緩衝液（好ましくは、ｐＨ８，３〜８．
５ ）中１０チのｎ−メチル−ピロリドン中１９〜２５
℃で３０〜１２０分間過剰の再結晶塩化シアヌルと反応
させた。最終反応条件はｐＨ８，３の０１５Ｍホウ酸す
トリウム、２ｍｇ／ｍｌの再結晶塩化シアヌルおよび５
００μｇ／ｍｌの各アミンヘキシルオリゴヌクレオチド
からなっていた。 未反応塩化シアヌルは、Ｇ−５０セフアデツクス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ商標）（スウェーデン、ウプサラのＰｈａ
ｒｍａｃ ｉ ａ ）カラムでサイズ排除クロマトグラ
フィーによって除去した。 ヨードアセトアミドベンゾイル化したオリゴヌクレオチ
ドの調製： １００〜１０００／１ｇの５′−アミン結合オリゴヌク
レオチド（ＵＰ９Ａ）は、アルカリ性（好ましくはｐＨ
８，０） 緩衝液中１８〜２５℃で３０〜１２０分間
過剰のＮ−サクシンイミジル４−（ヨードアセトアミド
）−ベンゾエート（ＳＩＡＢ）と反応させた。未反応５
ＩＡＢは、Ｇ−５０セフアデツクス（スウェーデン、ウ
プサラのＰｌｌａｒｍａｃｊａ） カラムでサイズ排除
クロマトグラフィーによって除去＝４２ した。 オリゴヌクレオチド誘導ナイロンビーズの調製：塩化シ
アヌル誘導のオリゴヌクレオチド用に、土
【尼したポリ
（エチレンイミン）被覆ナイロンビズなビーズの容１．
ｉ［に等しい容量の０，１Ｍホウ酸すｌ・リウノ−（Ｐ
Ｈ８，３） に４℃で入れた。次に、ＩＡ”Ａした塩
化シアヌル誘導のオリゴヌクレオチド全ビーズに加え、
そしてこの混合物を周囲温度（１９〜２３℃）で６０分
間激しく攪拌した。次に、ビーズを０．１Ｍホウ酸ナト
リウム（１）Ｉ−１８，３） で２回洗浄した。次い
で、無水コハク酸ｒよ、ビーズの容量の３倍容ｌの９０
％ Ｎ−メチルービ［Ｊリドン、１０チのＩＭホウ酸
ナトリウム（ｐＨ８，３）ｌｊｌｌ、０ｍｇ／ｍｌの濃
度で添加した。反応は周囲温ＩＷで１時間進行させた。 次に、ビーズを２５０ｍ１の１００％Ｎ−メチル−ビ！
コリトノで３回、蒸留水で２回、２５０ｍ１のＳＤＳ／
ＦＷで５回、次いで１リットルの蒸留水で４回洗浄した
１、ビーズは乾燥して−または２５ｍＭ ＥＤＴＡ中で
貯蔵した。１ビズ当たりの放射能は液体シンチレーショ
ン計数で測定した。 ヨードアセトアミドベンゾイル化オリゴヌクレオチド用
には、上記のポリ（エチレンイミン）被覆ナイロンビー
ズは、ビーズの容量と同じ量の０．１Ｍホウ酸すｌ・リ
ウムｐＨ８，３中に入れ、そしてイミノチオランを最終
容量が５ｍｇ／ｍｌになるように添加した。ビーズを周
囲温度で１時間反応させ、次いで４℃で０．１Ｍホウ酸
ナナトリウムｐＨ８，３よび１０ ｍＭ ＥＤＴＡで１
０回洗浄した。上記のチオール化したポリ（エチレンイ
ミン）被覆ナイロンビーズは、ビーズの容量と同し１１
の０．１Ｍホウ酸ナナトリウムｐＨ８，３および２ Ｓ
ｒｎＭ ＥＤＴＡ中に４℃で入れ／ζ。次に、精製し
たヨードアセトアミドベンゾイル化したオリゴヌクレオ
チドをビズに加え、この混合物を周囲温度（１９〜２３
℃）で４時間激しく攪拌した。次いで、ビーズを０．１
Ｍホウ酸ナトリウムおよび２５ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗
浄した後、ビーズ容量の３倍容量の、】：１容量 、１
七のＮ−メチル−ピロリドンおよび０．１Ｍホウ酸ナト
リウム（ｐＨ８，３）中１０ｒｎｇ／ｍｌのヨードアセ
トアミドと共にインキュベートした。 反応は周囲温度で１時間進行させた。次いで、ビズは、
２５０ｍ１の１００％Ｎ−メチル−ピロリドンで３回、
蒸留水で２回、２５０ｍ１のＳＤＳ／ＦＷで５回、次に
１リツトルの蒸留水で４回洗浄した。 ビーズは乾燥してまたは２ ＳｍＭ ＥＤＴＡ中で貯蔵
した。次いで、１ビーズ当たりの放射能を液体シンテレ
−ジョン計数で測定した。 膜固体支持体の調製： １６σ２片のニドラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ５
ｃｈｕｅ１１、ニューハンブシτ−州キーネ）は、ｐＨ
＝８．３の０．１ Ｍホウ酸ナトリウム中５ｒｎｇ／ｍ
ｌのイミノチオラン１０ｍ１ と共に周囲温度で３０分
間インキュベートシた。膜は上ｉ己のホウ酸ナトリウム
緩衝液で５回洗浄した。導入されたチオール基ｒ、ｒ５
．５−シｆオービス（２−二トロ安息香酸）を使用して
測５〆した。次いで、誘導された膜は０２８−２０円盤
に切断し、ぞしてＯ，ＩＭホＩ７酸ナナトリウム緩衝液
１回洗浄した。ＩＡＢ−オリゴヌクレオ−１−ドを上記
のようにして調製しそして上記膜円盤と混合した。３０
０個の膜円盤は、１．０ｍｇのＩＡＢ−オリゴヌクレオ
チドを含有する０、 １ Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液２
ｍｌに浸漬し、そして反応は暗所で１６時間一定速度で
攪拌し乍ら室温で進行させた。次に、円盤は０．１Ｍホ
ウ酸ナトリウム、ＳＤＳ／ＦＷで連続的に洗浄した。１
フイルタ一円盤当た。９１．２マイクログラムのＢｇ５
Ｂ オリゴヌクレオチドを結合させた。未反応チオール
基はＯ，］、 Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＴ（＝ ８．３
）中５０ｍｇ／ｍｌのヨードアセトアミドで封鎖した
。次いで、このフィルターを更にホウ酸ナトリウムおよ
びＳＤＳ／ＦＷで洗浄した。 細菌の溶解およびハイブリッド形成条件：バクテロイデ
ス ジンジバリス（Ｂｇ ）Ｉ Ｘ １０８個は溶菌溶
液１００μＬ中１９℃で溶解させた。次いで、細胞溶解
物は６５度の水浴中で１０分間加熱した。ビオチン化し
たプローブは最終濃度が１００ ｎ ｇ／ｍＬになるよ
うに溶解物溶液および希釈溶液（Ｇ ｕ Ｓ ＣＮ溶菌
溶液）に添加し、そして出発溶解物に関して５〜８５倍
の連続希釈を行った。 この溶液は、各オリゴヌクレオチド プローブ（捕獲プ
ローブ）０１μｇで共有的に固定された誘導ナイロンビ
ーズかまた（はニドランかのいずれかと共に周囲温度で
１時間緩やかに攪拌し乍らインキュベートした。次に、
固体支持体は溶菌およびハイブリッド形成溶液で１回、
ＦＷで１回、そしてＳＤＳ／ＦＷで１回洗浄した。スト
レプトアビジン／ＨＲＰ抱合物を添加して最終濃度をＳ
ＤＳ／ＦＷ中１マイクログラム／ｍｌ（ストレプトアビ
ジンに基づいて）にし、そして穏やかに攪拌し乍ら周囲
温度で１０〜１５分間インキュベートシだ。次に、ビー
ズおよびフィルターはＳＤＳ／ＦＷで３回、次いでＣＡ
Ｐ緩衝液で１回洗浄した。上記の４メトキシ−ナフトー
ル基質溶液を添加し、周囲温度で１５分間反応を進行さ
せた。次に、ビーズまだはフィルターはＳＤＳ／ＦＷで
１回、次いでＦ Ｖｖ’で１回洗浄し、そして暗所で空
気乾燥させた。ハイブリッド形成度はビーズ上に沈着さ
せた着色基質の密度と正比例関係にある。 実施例１ 実施例１はオリゴヌクレオチドの結合５′−アミンの塩
化シアヌルによる選択的修正および活性化を記載する。 オリゴヌクレオチドの誘導化は結合したアミンでだけ生
起することが示される。 ５′−アミノヘキシル末端を有するかまたは５′アミノ
ヘキシル末端を有さないかのいずれかである配列ＵＰ９
Ａは塩化シアヌルとの反応性に関して比較した。各タイ
プのオリゴヌクレオチド５０μｇは、０．１５Ｍホウ酸
ナトリウムｐＨ＝８．３およＵ ２ ｍ ｇ ／ｍ Ｉ
の塩化シアヌル（１００％のアセトニ１− ＩＪル中新
たに調製した貯蔵物５０ｍｇ／ｍｌから）を含有する４
００μｍ容量中で反応させた。反応は１９℃で３０分間
生起させた。次いで、反応混合物はＴＥＡ中５〜４５チ
のアセトニトリル勾配を使用してＣ−１８逆相ＨＰＬＣ
で分析した。各反応混合物および両タイプの出発オリゴ
ヌクレオチＰのクロマトグラフは図３に示す。 非末端オリゴヌクレオチド配列ＵＰ９ＡはパネルＡに示
し、９．０２５分でカラムから溶出し、一方アミン末端
オリゴヌクレオチド配列ＵＰ９Ａは９．２０５分で溶出
する（パネルＢ）。パネルＣのクロマトグラフは、オリ
ゴヌクレオチドが引き続いて９．００５分で溶出してｂ
るので、非末端オリゴヌクレオチド配列ＵＰ９Ａが塩化
シアヌルと反応しないことを示す。パネルＤでは、アミ
ン末端オリゴヌクレオチド配列ＵＰ９Ａが塩化シアヌル
と殆ど完結する葦で反応して、１１６分で、即ちＵＰ９
Ａアミン末端出発利料のほぼ２．５分後に溶出するジク
ロロトリアジン誘導体が生じる。このプロフィルは５′
−結合アミンを有するＵＰ９Ａだけが塩化シアヌルと反
応することを示しており、塩化シアヌルがアミンと選択
的に反応し、オリゴヌクレオチド中に存在する糖または
塩基のいずゎとも反応しないことをポしている。それ故
、５′−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドは塩化シア
ヌルで選択的に活性化され、プローブが固体支持体上の
５′末端でのみ固定化されることが示されンそ。 実施例２ 本実施例は幾つかのタイプのジアミンおよびボす（エチ
レンイミン）を有するナイロンビーズの誘導並びにそれ
に続く４．６−ジクロロトリアジン オリゴヌクレオチ
ドの結合を記載する。各ビーズのハイブリッド形成特性
の比較も記載する。 ヘキザンジアミン、シェフアミン（Ｊｅ ｆ ｆ ａｍ
ｉ ｎｅ ）ＥＤＲ１４８，１，４−フェニレンジアミ
ン、シェフアミンＴ３０００ まだはポリ（エチレンイ
ミン）かのいずれかを用いて、ポリマー被覆ビーズの製
造に関連して上記した方法を使用して２００のビーズバ
ッチを誘導した。各ジアミンまたはトリアミンビーズタ
イプは２００ナノモルから２マイクロモルの間のアミン
を旨有しておりそしてポリ（エチレンイミン）は概ね１
００ナノモルのアミンを含有していた。 次いで、各ビーズタイプは上記したようにして４．６−
ジク■」ロトリアジン活性化オリゴオヌクレオチド（Ｂ
ｇ５配列）と反応させた。次に、未反応アミンを上記し
たようにして無水コハク酸で封鎖し、そしで上記したよ
うにハイブリッド形成アッセイで試験した。フェニレン
ジアミン ピーズは標的核酸捕獲能を示さず、一方ジエ
フアミンＥＤＲ−１４８、Ｔ−３０００およびヘキサン
ジアミンタイプのビーズは核酸標的を捕獲したが、それ
はポリ（エチレン４ミン）ビーズより約２５倍低い割合
であった。その結果は下記光に要約する。 ビーベ゛ タイプ： 検出下限 ツボニレ−・′ジアミン ４矢出標的無しＥＤＲ−１
４８５Ｘ ］ ０ イ固の糸用胞Ｔ−３０００２−５
Ｘ１０ 仏の細胞・−＼キ→ノンジアミン ２．
５Ｘ１０ 個の細胞ポリ（エチレンイミン） ２
ｘｔｏ６イＢ□！・１の細胞この結果は、ポリマー被覆
ビーズが標的核酸の捕獲において約２５倍以上有効であ
ったので、オリゴヌクレオチドの共有的同定化および標
的核酸の捕獲に最上の表面タイプをもたらすことを示し
ている。 実施例３ 実施例３は、標的核酸配列を結合させ、次いで比色測定
アッセイ方式を使用して検出するサンドイッチアッセイ
方式においてニドラン膜およびナイロンビーズから形成
された固体支持体を比較する。 アクチッパシラス アクチノマイセテムコミタンス（Ａ
ａ ）、バクテロイデス ジンジバリス［Ｂｇ）、バク
テロイデス インターメディウス（Ｂｉ ） 、エイケ
ネラ コロデンス（Ｅｃ）、フンバクテリウムヌクレア
タム（Ｆｎ）、およびウオリネラ レクタ（Ｗｒ）の１
×１０ 個の細胞を溶解するために３ＭのＧｎＳＣＮ溶
菌溶液を１００マイクロリツトル容意中１９℃で使用し
た。次いで、溶解物を６５℃で５分間加熱した。細菌性
１６ｓ ｒＲＮＡＡ （シグナルプローブ）の保護領域
に相補的なビチオン化２４−ｍ ｅ ｒオリゴヌクレオ
チドグローブを添加して最終濃度をｉｍｌ 当たり１０
０ナノグラムとした。 ビオチン化したシグナルオリゴヌクレオチドおよび１×
１０ 個のＡ ａ ％ Ｂ Ｉ ＸＥ ｋ、Ｆ ｎおよ
びｗｒの総細胞を含有する溶液で希釈液を使用して溶解
物の５倍連続希釈を行った。次いで、溶液は、０．１μ
ｇのＢｇｌ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（捕獲プ
ローブ）を共有的に固定しているニドラン円盤または２
個のナイロンビーズと共に周囲温度で３０分間インキュ
ベートした。固体支持体はＳＤＳ／ＦＷを用いて周囲温
度で洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌ のストレプトアビ
ジン／西洋わさびペルオキシダーゼ（ＳＡ／ＨＲＰ）抱
合物と共にＳＤＳ／ＦＷ中周囲温度で５分間インキュベ
ートした。次に、固体支持体をＳＤＳ／ＦＷ、ＦＷで洗
浄し、次いでペルオキシダーゼの存在は、フィルターケ
上記したＨＲＰ基質溶液と共にインキュベートして不溶
性生成物を形成させて測定した。 その結果は、３０分間のハイブリッド形成で、固体支持
体としてナイロンビーズを使用して２×１０”個の細胞
が検出され、一方二トラン固体支持体を使用して］、Ｘ
ｌ、０６個の細胞が検出されたことを示した。Ａａ 、
Ｂｉ、 ＥｋおよびＷｒ細胞は存在するがＢｇは存在
しない対照は発色せず、Ｂｇの捕獲が特異的であること
を示した。最もＨＲＰ不溶性の基質は＝１ラン膜上での
乾燥で消失し、一方ナイロンビーズでは消失は生起しな
かつたことも認められた。 実施例４ 実施例４は、標的核酸配列を結合させた後、全血を含有
する複合生物学的試料中で検出するサンドイッチアッセ
イ方式においてニドラン膜とナイロンビーズから形成さ
れる固体支持体を比較する。 ２５０マイクロリツトル容量中可視童の血ｇ、（概ね２
５マイクロリツトルの保存血液量）を含有するプラク試
料中に加えた１×１０ 個のバクテロイデスジンジバリ
ス（Ｂｇ）細胞を１９℃で溶解させるために３ＭのＧｎ
ＳＣＮ溶菌溶液を使用し、その後２つの同童物に分けた
。次いで、溶解物は６５℃で５分間加熱した。細菌性１
６ｓ ｒＲＮＡ （シグナルプローブ）の保護領域に相
補的なビオチン化２４−ｍａｒオリゴヌクレオチドを添
加して最終濃度をｉｍｌ 当たり１００ナノグラムとし
た。 溶解物の５倍連続希釈は、ビオチン化したシグナルオリ
ゴヌクレオチドおよび１０分の１０全血を含有する３Ｍ
のＧｕＳＣＮ溶菌およびハイブリッド形成溶液で希釈剤
を使用して実施した。次いで、溶液は、０．１μｇのＢ
ｇｌ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（捕獲プローブ
）を共有的に固定したニドラン円盤または２個のナイロ
ンビーズと共に周めｊ温度で３０分間インキュベートし
た。固体支持体はＳ Ｄ Ｓ ／ＦＷを用いて周囲温度
で洗浄した後、］ Ｏｎ ｇ、／ｍ ｌ のストレプト
アビジン／西洋わさびペルオキシダーゼ（ＳＡ／ＨＲＰ
）抱合物と共にＳＤＳ／ＦＷ中周囲温度で５分間インキ
ュベートした。次に、固体支持体をＳＤＳ／ＦＷ、ＦＷ
で洗浄し、次いでペルオキシダーゼの存在は、フィルタ
を上記のＨＲＰ基質溶液と共にインキュベ−１・して不
溶性生成物を形成させて測定した。 その結果は、３０分間のハイブリッド形成で、固体支持
体としてナイロンビーズを使用して８×１０５個の細胞
が検出され、−カートラン固体支持体を使用して４Ｘ１
０ 個のＭ胞が検出されたことを示した。更に重要なこ
とには、ニドランフイルターは溶解された血液生成物で
有意に染色され、一方ナイ０ンビーズは出発−の色を保
持していた１、 実施例５は、標的核酸配列を結合させ、その後化学ルミ
ネセンスアッセイ方式を使用して検出するサンドイッチ
アッセイ方式においてニドラン膜およびナイロンビーズ
から形成された固体支持体を比較する。 アクチッパシラス アクチノマイセデコミタンス（Ａａ
）、バクテロイデス ジンジバリスＣＢｇ）、バクテロ
イデス インターメディウス（Ｂｉ）、エイケ坏うコ「
」デンス（Ｂｃ）、フンバクテリウムヌクレアタム（、
Ｆｎ）およびウォルネラ レクタ（Ｗｒ）のｌＸ１０３
個の細胞を溶解するために３ＭのＧｎＳＣＮ溶菌溶液を
１００マイクロＩＪツトル容量中１９℃で使用した。次
いで、溶解物を６５℃で５分間加熱した。細菌性１６ｓ
ｒＲＮＡ （シグナルフ【Ｊ−ブ）の保穫領域に相補
的なビオチン化した２４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプ
ローブを添加して最終濃度を１ｍｌ当たり１００ナノグ
ラムとし７た。 ビオチン化したシグナルオリゴヌクレオチドおよび１×
１０ 個のＡ ａＳＢ ｉｘ Ｂ ｋｓ Ｆ ｎおよび
Ｗｒの総細胞を含有する３ＭのＧｕＳＣＮ溶菌およびハ
イブリッド形成溶液で希釈液を使用して溶解物の５倍連
続希釈を行った。次いで、溶液は、０．１μｇ （７）
Ｂｇｌ 特ＩＡ的オリゴヌクレオチドプローブ（捕獲
プローブ）を共有的に固定したニドラン円盤または２個
のナイロンビーズと共に周囲温度で３０分間インキュベ
ートした。固体支持体をＳＤＳ／ＦＷを用いて周囲温度
で洗浄し、続いて０．５％トウイーン２０．１ｍＭＭｇ
Ｃｌ ２．０．０１Ｍ ）リスＨＣＩ ｐＨ８，０（
ＡＰＲ）ｆ洗浄し、その後０．４μｇ／ｍｌ のストレ
プトアビジン／アルカリフォスファターゼ（ＳＡ／ＡＰ
）抱合物と共にＡＰＢ中周四周囲温度分間インキュベー
トした。固体支持体をＡＰＢＳＴＭＮＺで５回洗浄し、
その後アルカリ７オスフアターゼの存在は、５ｍｍＸ
４０ｍｍのポリプロピレン管中でニドランフイルターか
またはナイロンビーズかのどちらかを２００マイクロリ
ツトルのルミゲン（Ｌｕｍｒｇｅｎ）（ミシガン州デト
ロイトのＬｕｍｒｇｅｎ、Ｉｎｃ、より）と共にインキ
ュベートして測定した。その結果は下記表に示す。 化学ルミネセンスシグナル 細胞数： ニドラン固体支持休： ナイロンビーズ
１×１０ 目盛り外 目盛シ外２
Ｘ］、０７ １６００ 目盛り
外４Ｘ］０ １７５０ １６
５０８Ｘ１（Ｊ １７００
６８０１、ｆ３Ｘ１０ １６００
３２０３．２Ｘ１０ １８００
２６０６．４Ｘ１０ １８００
２１０対照 １７０ （］
２００それ故、この結果は、３０
分間のハイブリッド形成で、固体支持体としてナイロン
ビーズを使用して３Ｘ１０ 個の細胞が検出され、−カ
ニトラン固体支持体を使用して１×１０８個の細胞しか
検出されなかった。標的検出の低レベルでの上記の約１
０，０００倍の差異はニドシンフィルターに対するアル
カリ７オス７アターゼの非％１４的結合の重度のバック
グランドによるものであった。それ故、ナイロンビーズ
によって、化学ルミネセンスに基づくシグナル系を使用
するＢｇ １６ｓ ｒＲＮＡの高感度検出が可能になっ
た。 実施例６ 実施例６は、本明細書でティップスティックとして記載
した多−パネル検出組成物を形成させるために、非多孔
性プラスチックカードに固定した３／３２インチのナイ
τ」ンビーズの使用を記載する。 このようにし７て形成されたディツプスティック（また
はインデイケータ−カード）は１つの試料中の多数の病
原体の特異的な検出を可能にする多数の明確な部位を有
している。この実施例では、ＢｇおよびＥｋの特異的検
出が示される。 ６個の同一のディツプスティックを１組調製した。該デ
ィツプスティックの一般的配列は図１および２に示す。 各々がＵなる捕獲オリゴヌクレオチドを有する５個のビ
ーズを次の順序でティップスティックの左から右に入れ
だ： １ ： ＰＡＯＯ５（陽性対照） ２ ：ＡａＯ０４（Ａａ ｒＲＮＡの検出用）３ ：
Ｂｇ００２ （Ｂｇ ｒＲＮＡの検出用）４ ：
ＥｋＯ０７（Ｅｌ（ｒＲＮＡの検出用）５ ： ＰＡ
５０５ （陰性対照） 各ディツプスティックは、５００ｎ、ｇ／ｍｌのビオチ
ン化したＵＰ９ＡおよびＵＰＯＯ７，５ｎｇ／ｍｌのＰ
Ａ５０５並ひに １）ＩＸ１０８個の８ｇ細胞 ２）２に１０７個の８ｇ細胞 ３）ＩＸ１０８個のＥｌ（細胞 ４）２Ｘ１０７個のＥｋ細胞 ５）１１．０個の８ｇ細胞およびＩＸＩｄ３個のＥｋ細
胞６）２Ｘ１０８個の８ｇ細胞および２ Ｘ １０”個
のＥｋ細胞のいずれかを官有する上記の溶醒およびノ・
イブリッド形成溶液４００μｌ中で試験した。ディツプ
スティックは２ヘルツで一定速度で攪拌し乍ら次の溶液
で連続的に処理した二ノ何ブリッド形成溶液中１０分間
、ＳＤＳ、／ＦＷ中で２分間、ＳＡ／ＨＲＰ抱合物中で
５分間、ＳＤＳ／ＦＷ中で２分間、ＣＡＰ緩衝液中で２
分間、そしてその後４ＭＮ基質溶液中で１０分間発色さ
せた。その結果は下記光に記載する。 溶液：１２３４５６ ビーズ番号： １ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
＋十＋＋３ ＋十−１−−−＋→−十
４ −− −− ＋＋＋ ＋＋
＋表中、→−士は強い比色測定シグナルを示し、＋は中
間の比色測定シグナルを示し、−はシグナル無しを示す
。この結果はディツプスティックがＢｇおよびＥｋの存
在を特異的に検出できることを示している。
（エチレンイミン）被覆ナイロンビズなビーズの容１．
ｉ［に等しい容量の０，１Ｍホウ酸すｌ・リウノ−（Ｐ
Ｈ８，３） に４℃で入れた。次に、ＩＡ”Ａした塩
化シアヌル誘導のオリゴヌクレオチド全ビーズに加え、
そしてこの混合物を周囲温度（１９〜２３℃）で６０分
間激しく攪拌した。次に、ビーズを０．１Ｍホウ酸ナト
リウム（１）Ｉ−１８，３） で２回洗浄した。次い
で、無水コハク酸ｒよ、ビーズの容量の３倍容ｌの９０
％ Ｎ−メチルービ［Ｊリドン、１０チのＩＭホウ酸
ナトリウム（ｐＨ８，３）ｌｊｌｌ、０ｍｇ／ｍｌの濃
度で添加した。反応は周囲温ＩＷで１時間進行させた。 次に、ビーズを２５０ｍ１の１００％Ｎ−メチル−ビ！
コリトノで３回、蒸留水で２回、２５０ｍ１のＳＤＳ／
ＦＷで５回、次いで１リットルの蒸留水で４回洗浄した
１、ビーズは乾燥して−または２５ｍＭ ＥＤＴＡ中で
貯蔵した。１ビズ当たりの放射能は液体シンチレーショ
ン計数で測定した。 ヨードアセトアミドベンゾイル化オリゴヌクレオチド用
には、上記のポリ（エチレンイミン）被覆ナイロンビー
ズは、ビーズの容量と同じ量の０．１Ｍホウ酸すｌ・リ
ウムｐＨ８，３中に入れ、そしてイミノチオランを最終
容量が５ｍｇ／ｍｌになるように添加した。ビーズを周
囲温度で１時間反応させ、次いで４℃で０．１Ｍホウ酸
ナナトリウムｐＨ８，３よび１０ ｍＭ ＥＤＴＡで１
０回洗浄した。上記のチオール化したポリ（エチレンイ
ミン）被覆ナイロンビーズは、ビーズの容量と同し１１
の０．１Ｍホウ酸ナナトリウムｐＨ８，３および２ Ｓ
ｒｎＭ ＥＤＴＡ中に４℃で入れ／ζ。次に、精製し
たヨードアセトアミドベンゾイル化したオリゴヌクレオ
チドをビズに加え、この混合物を周囲温度（１９〜２３
℃）で４時間激しく攪拌した。次いで、ビーズを０．１
Ｍホウ酸ナトリウムおよび２５ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗
浄した後、ビーズ容量の３倍容量の、】：１容量 、１
七のＮ−メチル−ピロリドンおよび０．１Ｍホウ酸ナト
リウム（ｐＨ８，３）中１０ｒｎｇ／ｍｌのヨードアセ
トアミドと共にインキュベートした。 反応は周囲温度で１時間進行させた。次いで、ビズは、
２５０ｍ１の１００％Ｎ−メチル−ピロリドンで３回、
蒸留水で２回、２５０ｍ１のＳＤＳ／ＦＷで５回、次に
１リツトルの蒸留水で４回洗浄した。 ビーズは乾燥してまたは２ ＳｍＭ ＥＤＴＡ中で貯蔵
した。次いで、１ビーズ当たりの放射能を液体シンテレ
−ジョン計数で測定した。 膜固体支持体の調製： １６σ２片のニドラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ ５
ｃｈｕｅ１１、ニューハンブシτ−州キーネ）は、ｐＨ
＝８．３の０．１ Ｍホウ酸ナトリウム中５ｒｎｇ／ｍ
ｌのイミノチオラン１０ｍ１ と共に周囲温度で３０分
間インキュベートシた。膜は上ｉ己のホウ酸ナトリウム
緩衝液で５回洗浄した。導入されたチオール基ｒ、ｒ５
．５−シｆオービス（２−二トロ安息香酸）を使用して
測５〆した。次いで、誘導された膜は０２８−２０円盤
に切断し、ぞしてＯ，ＩＭホＩ７酸ナナトリウム緩衝液
１回洗浄した。ＩＡＢ−オリゴヌクレオ−１−ドを上記
のようにして調製しそして上記膜円盤と混合した。３０
０個の膜円盤は、１．０ｍｇのＩＡＢ−オリゴヌクレオ
チドを含有する０、 １ Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液２
ｍｌに浸漬し、そして反応は暗所で１６時間一定速度で
攪拌し乍ら室温で進行させた。次に、円盤は０．１Ｍホ
ウ酸ナトリウム、ＳＤＳ／ＦＷで連続的に洗浄した。１
フイルタ一円盤当た。９１．２マイクログラムのＢｇ５
Ｂ オリゴヌクレオチドを結合させた。未反応チオール
基はＯ，］、 Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＴ（＝ ８．３
）中５０ｍｇ／ｍｌのヨードアセトアミドで封鎖した
。次いで、このフィルターを更にホウ酸ナトリウムおよ
びＳＤＳ／ＦＷで洗浄した。 細菌の溶解およびハイブリッド形成条件：バクテロイデ
ス ジンジバリス（Ｂｇ ）Ｉ Ｘ １０８個は溶菌溶
液１００μＬ中１９℃で溶解させた。次いで、細胞溶解
物は６５度の水浴中で１０分間加熱した。ビオチン化し
たプローブは最終濃度が１００ ｎ ｇ／ｍＬになるよ
うに溶解物溶液および希釈溶液（Ｇ ｕ Ｓ ＣＮ溶菌
溶液）に添加し、そして出発溶解物に関して５〜８５倍
の連続希釈を行った。 この溶液は、各オリゴヌクレオチド プローブ（捕獲プ
ローブ）０１μｇで共有的に固定された誘導ナイロンビ
ーズかまた（はニドランかのいずれかと共に周囲温度で
１時間緩やかに攪拌し乍らインキュベートした。次に、
固体支持体は溶菌およびハイブリッド形成溶液で１回、
ＦＷで１回、そしてＳＤＳ／ＦＷで１回洗浄した。スト
レプトアビジン／ＨＲＰ抱合物を添加して最終濃度をＳ
ＤＳ／ＦＷ中１マイクログラム／ｍｌ（ストレプトアビ
ジンに基づいて）にし、そして穏やかに攪拌し乍ら周囲
温度で１０〜１５分間インキュベートシだ。次に、ビー
ズおよびフィルターはＳＤＳ／ＦＷで３回、次いでＣＡ
Ｐ緩衝液で１回洗浄した。上記の４メトキシ−ナフトー
ル基質溶液を添加し、周囲温度で１５分間反応を進行さ
せた。次に、ビーズまだはフィルターはＳＤＳ／ＦＷで
１回、次いでＦ Ｖｖ’で１回洗浄し、そして暗所で空
気乾燥させた。ハイブリッド形成度はビーズ上に沈着さ
せた着色基質の密度と正比例関係にある。 実施例１ 実施例１はオリゴヌクレオチドの結合５′−アミンの塩
化シアヌルによる選択的修正および活性化を記載する。 オリゴヌクレオチドの誘導化は結合したアミンでだけ生
起することが示される。 ５′−アミノヘキシル末端を有するかまたは５′アミノ
ヘキシル末端を有さないかのいずれかである配列ＵＰ９
Ａは塩化シアヌルとの反応性に関して比較した。各タイ
プのオリゴヌクレオチド５０μｇは、０．１５Ｍホウ酸
ナトリウムｐＨ＝８．３およＵ ２ ｍ ｇ ／ｍ Ｉ
の塩化シアヌル（１００％のアセトニ１− ＩＪル中新
たに調製した貯蔵物５０ｍｇ／ｍｌから）を含有する４
００μｍ容量中で反応させた。反応は１９℃で３０分間
生起させた。次いで、反応混合物はＴＥＡ中５〜４５チ
のアセトニトリル勾配を使用してＣ−１８逆相ＨＰＬＣ
で分析した。各反応混合物および両タイプの出発オリゴ
ヌクレオチＰのクロマトグラフは図３に示す。 非末端オリゴヌクレオチド配列ＵＰ９ＡはパネルＡに示
し、９．０２５分でカラムから溶出し、一方アミン末端
オリゴヌクレオチド配列ＵＰ９Ａは９．２０５分で溶出
する（パネルＢ）。パネルＣのクロマトグラフは、オリ
ゴヌクレオチドが引き続いて９．００５分で溶出してｂ
るので、非末端オリゴヌクレオチド配列ＵＰ９Ａが塩化
シアヌルと反応しないことを示す。パネルＤでは、アミ
ン末端オリゴヌクレオチド配列ＵＰ９Ａが塩化シアヌル
と殆ど完結する葦で反応して、１１６分で、即ちＵＰ９
Ａアミン末端出発利料のほぼ２．５分後に溶出するジク
ロロトリアジン誘導体が生じる。このプロフィルは５′
−結合アミンを有するＵＰ９Ａだけが塩化シアヌルと反
応することを示しており、塩化シアヌルがアミンと選択
的に反応し、オリゴヌクレオチド中に存在する糖または
塩基のいずゎとも反応しないことをポしている。それ故
、５′−アミノヘキシルオリゴヌクレオチドは塩化シア
ヌルで選択的に活性化され、プローブが固体支持体上の
５′末端でのみ固定化されることが示されンそ。 実施例２ 本実施例は幾つかのタイプのジアミンおよびボす（エチ
レンイミン）を有するナイロンビーズの誘導並びにそれ
に続く４．６−ジクロロトリアジン オリゴヌクレオチ
ドの結合を記載する。各ビーズのハイブリッド形成特性
の比較も記載する。 ヘキザンジアミン、シェフアミン（Ｊｅ ｆ ｆ ａｍ
ｉ ｎｅ ）ＥＤＲ１４８，１，４−フェニレンジアミ
ン、シェフアミンＴ３０００ まだはポリ（エチレンイ
ミン）かのいずれかを用いて、ポリマー被覆ビーズの製
造に関連して上記した方法を使用して２００のビーズバ
ッチを誘導した。各ジアミンまたはトリアミンビーズタ
イプは２００ナノモルから２マイクロモルの間のアミン
を旨有しておりそしてポリ（エチレンイミン）は概ね１
００ナノモルのアミンを含有していた。 次いで、各ビーズタイプは上記したようにして４．６−
ジク■」ロトリアジン活性化オリゴオヌクレオチド（Ｂ
ｇ５配列）と反応させた。次に、未反応アミンを上記し
たようにして無水コハク酸で封鎖し、そしで上記したよ
うにハイブリッド形成アッセイで試験した。フェニレン
ジアミン ピーズは標的核酸捕獲能を示さず、一方ジエ
フアミンＥＤＲ−１４８、Ｔ−３０００およびヘキサン
ジアミンタイプのビーズは核酸標的を捕獲したが、それ
はポリ（エチレン４ミン）ビーズより約２５倍低い割合
であった。その結果は下記光に要約する。 ビーベ゛ タイプ： 検出下限 ツボニレ−・′ジアミン ４矢出標的無しＥＤＲ−１
４８５Ｘ ］ ０ イ固の糸用胞Ｔ−３０００２−５
Ｘ１０ 仏の細胞・−＼キ→ノンジアミン ２．
５Ｘ１０ 個の細胞ポリ（エチレンイミン） ２
ｘｔｏ６イＢ□！・１の細胞この結果は、ポリマー被覆
ビーズが標的核酸の捕獲において約２５倍以上有効であ
ったので、オリゴヌクレオチドの共有的同定化および標
的核酸の捕獲に最上の表面タイプをもたらすことを示し
ている。 実施例３ 実施例３は、標的核酸配列を結合させ、次いで比色測定
アッセイ方式を使用して検出するサンドイッチアッセイ
方式においてニドラン膜およびナイロンビーズから形成
された固体支持体を比較する。 アクチッパシラス アクチノマイセテムコミタンス（Ａ
ａ ）、バクテロイデス ジンジバリス［Ｂｇ）、バク
テロイデス インターメディウス（Ｂｉ ） 、エイケ
ネラ コロデンス（Ｅｃ）、フンバクテリウムヌクレア
タム（Ｆｎ）、およびウオリネラ レクタ（Ｗｒ）の１
×１０ 個の細胞を溶解するために３ＭのＧｎＳＣＮ溶
菌溶液を１００マイクロリツトル容意中１９℃で使用し
た。次いで、溶解物を６５℃で５分間加熱した。細菌性
１６ｓ ｒＲＮＡＡ （シグナルプローブ）の保護領域
に相補的なビチオン化２４−ｍ ｅ ｒオリゴヌクレオ
チドグローブを添加して最終濃度をｉｍｌ 当たり１０
０ナノグラムとした。 ビオチン化したシグナルオリゴヌクレオチドおよび１×
１０ 個のＡ ａ ％ Ｂ Ｉ ＸＥ ｋ、Ｆ ｎおよ
びｗｒの総細胞を含有する溶液で希釈液を使用して溶解
物の５倍連続希釈を行った。次いで、溶液は、０．１μ
ｇのＢｇｌ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（捕獲プ
ローブ）を共有的に固定しているニドラン円盤または２
個のナイロンビーズと共に周囲温度で３０分間インキュ
ベートした。固体支持体はＳＤＳ／ＦＷを用いて周囲温
度で洗浄した後、１０ｎｇ／ｍｌ のストレプトアビ
ジン／西洋わさびペルオキシダーゼ（ＳＡ／ＨＲＰ）抱
合物と共にＳＤＳ／ＦＷ中周囲温度で５分間インキュベ
ートした。次に、固体支持体をＳＤＳ／ＦＷ、ＦＷで洗
浄し、次いでペルオキシダーゼの存在は、フィルターケ
上記したＨＲＰ基質溶液と共にインキュベートして不溶
性生成物を形成させて測定した。 その結果は、３０分間のハイブリッド形成で、固体支持
体としてナイロンビーズを使用して２×１０”個の細胞
が検出され、一方二トラン固体支持体を使用して］、Ｘ
ｌ、０６個の細胞が検出されたことを示した。Ａａ 、
Ｂｉ、 ＥｋおよびＷｒ細胞は存在するがＢｇは存在
しない対照は発色せず、Ｂｇの捕獲が特異的であること
を示した。最もＨＲＰ不溶性の基質は＝１ラン膜上での
乾燥で消失し、一方ナイロンビーズでは消失は生起しな
かつたことも認められた。 実施例４ 実施例４は、標的核酸配列を結合させた後、全血を含有
する複合生物学的試料中で検出するサンドイッチアッセ
イ方式においてニドラン膜とナイロンビーズから形成さ
れる固体支持体を比較する。 ２５０マイクロリツトル容量中可視童の血ｇ、（概ね２
５マイクロリツトルの保存血液量）を含有するプラク試
料中に加えた１×１０ 個のバクテロイデスジンジバリ
ス（Ｂｇ）細胞を１９℃で溶解させるために３ＭのＧｎ
ＳＣＮ溶菌溶液を使用し、その後２つの同童物に分けた
。次いで、溶解物は６５℃で５分間加熱した。細菌性１
６ｓ ｒＲＮＡ （シグナルプローブ）の保護領域に相
補的なビオチン化２４−ｍａｒオリゴヌクレオチドを添
加して最終濃度をｉｍｌ 当たり１００ナノグラムとし
た。 溶解物の５倍連続希釈は、ビオチン化したシグナルオリ
ゴヌクレオチドおよび１０分の１０全血を含有する３Ｍ
のＧｕＳＣＮ溶菌およびハイブリッド形成溶液で希釈剤
を使用して実施した。次いで、溶液は、０．１μｇのＢ
ｇｌ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（捕獲プローブ
）を共有的に固定したニドラン円盤または２個のナイロ
ンビーズと共に周めｊ温度で３０分間インキュベートし
た。固体支持体はＳ Ｄ Ｓ ／ＦＷを用いて周囲温度
で洗浄した後、］ Ｏｎ ｇ、／ｍ ｌ のストレプト
アビジン／西洋わさびペルオキシダーゼ（ＳＡ／ＨＲＰ
）抱合物と共にＳＤＳ／ＦＷ中周囲温度で５分間インキ
ュベートした。次に、固体支持体をＳＤＳ／ＦＷ、ＦＷ
で洗浄し、次いでペルオキシダーゼの存在は、フィルタ
を上記のＨＲＰ基質溶液と共にインキュベ−１・して不
溶性生成物を形成させて測定した。 その結果は、３０分間のハイブリッド形成で、固体支持
体としてナイロンビーズを使用して８×１０５個の細胞
が検出され、−カートラン固体支持体を使用して４Ｘ１
０ 個のＭ胞が検出されたことを示した。更に重要なこ
とには、ニドランフイルターは溶解された血液生成物で
有意に染色され、一方ナイ０ンビーズは出発−の色を保
持していた１、 実施例５は、標的核酸配列を結合させ、その後化学ルミ
ネセンスアッセイ方式を使用して検出するサンドイッチ
アッセイ方式においてニドラン膜およびナイロンビーズ
から形成された固体支持体を比較する。 アクチッパシラス アクチノマイセデコミタンス（Ａａ
）、バクテロイデス ジンジバリスＣＢｇ）、バクテロ
イデス インターメディウス（Ｂｉ）、エイケ坏うコ「
」デンス（Ｂｃ）、フンバクテリウムヌクレアタム（、
Ｆｎ）およびウォルネラ レクタ（Ｗｒ）のｌＸ１０３
個の細胞を溶解するために３ＭのＧｎＳＣＮ溶菌溶液を
１００マイクロＩＪツトル容量中１９℃で使用した。次
いで、溶解物を６５℃で５分間加熱した。細菌性１６ｓ
ｒＲＮＡ （シグナルフ【Ｊ−ブ）の保穫領域に相補
的なビオチン化した２４−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプ
ローブを添加して最終濃度を１ｍｌ当たり１００ナノグ
ラムとし７た。 ビオチン化したシグナルオリゴヌクレオチドおよび１×
１０ 個のＡ ａＳＢ ｉｘ Ｂ ｋｓ Ｆ ｎおよび
Ｗｒの総細胞を含有する３ＭのＧｕＳＣＮ溶菌およびハ
イブリッド形成溶液で希釈液を使用して溶解物の５倍連
続希釈を行った。次いで、溶液は、０．１μｇ （７）
Ｂｇｌ 特ＩＡ的オリゴヌクレオチドプローブ（捕獲
プローブ）を共有的に固定したニドラン円盤または２個
のナイロンビーズと共に周囲温度で３０分間インキュベ
ートした。固体支持体をＳＤＳ／ＦＷを用いて周囲温度
で洗浄し、続いて０．５％トウイーン２０．１ｍＭＭｇ
Ｃｌ ２．０．０１Ｍ ）リスＨＣＩ ｐＨ８，０（
ＡＰＲ）ｆ洗浄し、その後０．４μｇ／ｍｌ のストレ
プトアビジン／アルカリフォスファターゼ（ＳＡ／ＡＰ
）抱合物と共にＡＰＢ中周四周囲温度分間インキュベー
トした。固体支持体をＡＰＢＳＴＭＮＺで５回洗浄し、
その後アルカリ７オスフアターゼの存在は、５ｍｍＸ
４０ｍｍのポリプロピレン管中でニドランフイルターか
またはナイロンビーズかのどちらかを２００マイクロリ
ツトルのルミゲン（Ｌｕｍｒｇｅｎ）（ミシガン州デト
ロイトのＬｕｍｒｇｅｎ、Ｉｎｃ、より）と共にインキ
ュベートして測定した。その結果は下記表に示す。 化学ルミネセンスシグナル 細胞数： ニドラン固体支持休： ナイロンビーズ
１×１０ 目盛り外 目盛シ外２
Ｘ］、０７ １６００ 目盛り
外４Ｘ］０ １７５０ １６
５０８Ｘ１（Ｊ １７００
６８０１、ｆ３Ｘ１０ １６００
３２０３．２Ｘ１０ １８００
２６０６．４Ｘ１０ １８００
２１０対照 １７０ （］
２００それ故、この結果は、３０
分間のハイブリッド形成で、固体支持体としてナイロン
ビーズを使用して３Ｘ１０ 個の細胞が検出され、−カ
ニトラン固体支持体を使用して１×１０８個の細胞しか
検出されなかった。標的検出の低レベルでの上記の約１
０，０００倍の差異はニドシンフィルターに対するアル
カリ７オス７アターゼの非％１４的結合の重度のバック
グランドによるものであった。それ故、ナイロンビーズ
によって、化学ルミネセンスに基づくシグナル系を使用
するＢｇ １６ｓ ｒＲＮＡの高感度検出が可能になっ
た。 実施例６ 実施例６は、本明細書でティップスティックとして記載
した多−パネル検出組成物を形成させるために、非多孔
性プラスチックカードに固定した３／３２インチのナイ
τ」ンビーズの使用を記載する。 このようにし７て形成されたディツプスティック（また
はインデイケータ−カード）は１つの試料中の多数の病
原体の特異的な検出を可能にする多数の明確な部位を有
している。この実施例では、ＢｇおよびＥｋの特異的検
出が示される。 ６個の同一のディツプスティックを１組調製した。該デ
ィツプスティックの一般的配列は図１および２に示す。 各々がＵなる捕獲オリゴヌクレオチドを有する５個のビ
ーズを次の順序でティップスティックの左から右に入れ
だ： １ ： ＰＡＯＯ５（陽性対照） ２ ：ＡａＯ０４（Ａａ ｒＲＮＡの検出用）３ ：
Ｂｇ００２ （Ｂｇ ｒＲＮＡの検出用）４ ：
ＥｋＯ０７（Ｅｌ（ｒＲＮＡの検出用）５ ： ＰＡ
５０５ （陰性対照） 各ディツプスティックは、５００ｎ、ｇ／ｍｌのビオチ
ン化したＵＰ９ＡおよびＵＰＯＯ７，５ｎｇ／ｍｌのＰ
Ａ５０５並ひに １）ＩＸ１０８個の８ｇ細胞 ２）２に１０７個の８ｇ細胞 ３）ＩＸ１０８個のＥｌ（細胞 ４）２Ｘ１０７個のＥｋ細胞 ５）１１．０個の８ｇ細胞およびＩＸＩｄ３個のＥｋ細
胞６）２Ｘ１０８個の８ｇ細胞および２ Ｘ １０”個
のＥｋ細胞のいずれかを官有する上記の溶醒およびノ・
イブリッド形成溶液４００μｌ中で試験した。ディツプ
スティックは２ヘルツで一定速度で攪拌し乍ら次の溶液
で連続的に処理した二ノ何ブリッド形成溶液中１０分間
、ＳＤＳ、／ＦＷ中で２分間、ＳＡ／ＨＲＰ抱合物中で
５分間、ＳＤＳ／ＦＷ中で２分間、ＣＡＰ緩衝液中で２
分間、そしてその後４ＭＮ基質溶液中で１０分間発色さ
せた。その結果は下記光に記載する。 溶液：１２３４５６ ビーズ番号： １ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
＋十＋＋３ ＋十−１−−−＋→−十
４ −− −− ＋＋＋ ＋＋
＋表中、→−士は強い比色測定シグナルを示し、＋は中
間の比色測定シグナルを示し、−はシグナル無しを示す
。この結果はディツプスティックがＢｇおよびＥｋの存
在を特異的に検出できることを示している。
図１は本願発明のディツプスティックの１つの配列であ
り、 図２は歯周囲炎診断に使用できる多部位インデイケータ
ーカードであり、 図３は、塩化シアヌルがオリゴヌクレオチドの糖または
塩基とではなくて５′ −結合アミンと選択的に反応す
ることを示す高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＴ、
Ｃ）プロフィールである。
り、 図２は歯周囲炎診断に使用できる多部位インデイケータ
ーカードであり、 図３は、塩化シアヌルがオリゴヌクレオチドの糖または
塩基とではなくて５′ −結合アミンと選択的に反応す
ることを示す高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＴ、
Ｃ）プロフィールである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）ポリマー被覆ビーズと共有的に結合したオリゴヌク
レオチドからなる組成物。 ２）非多性孔固体支持体およびポリマー被覆ビーズ結合
用手段からなる核酸ハイブリッド形成アッセイ用ディッ
プスティック。 ３）少なくとも１個のくぼみを有する非多孔性固体支持
体からなる核酸ハイブリッド形成アツセイ用ディップス
ティック。 ４）少なくとも１個の貫通孔を有する非多孔性固体支持
体からなる核酸ハイブリッド形成アッセイ用ディップス
ティック。 ５）ジクロロトリアジンオリゴヌクレオチドからなる組
成物。 ６）ナイロン固体支持体をアルキル化剤で処理し； 処理した固体支持体をアミン含有ポリマーと反応させて
ポリマーで固体支持体を被覆させ；オリゴヌクレオチド
を同種官能性または異種官能性試薬で活性化させ； 活性化したオリゴヌクレオチドとポリマー被覆固体支持
体を抱合させ；そして 抱合後にポリマー被覆ビーズに封鎖剤を加えて未反応ア
ミンを非反応性にする、 ことからなるナイロン固体支持体上にオリゴヌクレオチ
ドを共有的に固定化する方法。 ７）オリゴヌクレオチドを塩化シアヌルで処理すること
からなるオリゴヌクレオチドの活性化方法。
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|---|---|---|---|
| US52244290A | 1990-05-11 | 1990-05-11 | |
| US522442 | 2000-03-09 |
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|---|---|
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Family
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Family Applications (1)
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