DE69712043T2

DE69712043T2 - Verfahren zur herstellung von lysophosphatidylcholin

Info

Publication number: DE69712043T2
Application number: DE69712043T
Authority: DE
Inventors: W. Yesair
Original assignee: Biomolecular Products Inc
Current assignee: Biomolecular Products Inc
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1997-01-31
Publication date: 2002-10-02
Anticipated expiration: 2017-02-01
Also published as: EP0882136A1; ES2171887T3; WO1997028270A1; ATE216429T1; CN1210560A; CA2246056A1; CN1076398C; AU719509B2; PT882136E; NZ331483A; DE69712043D1; JP2000511766A; NO983520L; US5716814A; DK0882136T3; JP3690686B2; AU1844797A; IL125587A; NO983520D0; EP0882136B1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Phospholipidhydrolyse. Insbesondere betrifft diese Erfindung ein verbessertes Verfahren der Phospholipase A&sub2;-Hydrolyse von Phosphatidylcholin, um Lysophosphatidylcholin herzustellen. Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer Lipidmatrix, die Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure umfasst.

Hintergrund der Erfindung

Die enzymatische Umwandlung von Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin ist seit Anfang 1900 bekannt. Frühe Untersuchungen zum Abbau von Lecithin (Phosphatidylcholin) durch Schlangengiftextrakte zeigten, dass die Wirkung der Schlangengifthämolyse auf den Lecithinanteil der Zellmembran gerichtet ist. 1935 zeigte Hughes, dass die Hydrolyse eines unimolekularen Lecithinfilms zu Lysolecithin (Lysophosphatidycholin) von Faktoren wie pH, Temperatur und der Oberflächenkonzentration der Lecithinmoleküle abhängt. Das Packen der Lecthinmoleküle in eine unimolekulare Schicht verringerte die Hydrolyserate stark. Hanahan zeigte, dass ein etherlöslicher Komplex zwischen Phosphatidylcholin aus Ei und Phospholipase A&sub2; zur Freisetzung von ungesättigter Fettsäure und Lysophosphatidylcholin führte. Hydrolyse von Phosphatidylcholin durch Phospholipase A&sub2; wurde nicht beobachtet, wenn 95% Ethylalkohol, Chloroform oder Petroleumether als Lösungsmittel verwendet wurden. Experimente, die von Dawson durchgeführt und 1963 berichtet wurden, fanden ebenfalls, dass Phospholipase A&sub2; Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin und einem einzelnen Fettsäuremolekül hydrolysierte. Dawson fand heraus, dass die enzymatische Aktivität von der Anwesenheit von Calciumionen abhing, und dass die Zugabe von Ether oder Butanol die Aktivität von Phospholipase A&sub2; stimulierte. Das britische Patent 1,215,868 der Unilever Ltd. beschrieb eine weitere Modifikation der Hydrolyse von Phospholipid durch Phospholipase A&sub2;, wobei die Reaktion in Anwesenheit von Fett (Ölen) erfolgte.
Die im Stand der Technik offenbarten Verfahren zur Hydrolyse von Phosphatidylcholin weisen mehrere Unzulänglichkeiten auf, einschließlich unvollständiger Hydrolyse und Erzeugung unerwünschter Nebenprodukte in der Hydrolysereaktion. Die Mängel der Verfahren nach dem Stand der Technik sind gravierend, weil die Anwesenheit von unverbrauchtem Ausgangsmaterial oder unerwünschten Nebenprodukten eine nichtakzeptables Maß an Verunreinigungen im letztendlichen Reaktionsprodukt darstellt. Diese unerwünschten Bestandteile müssen vom Reaktionsprodukt entfernt werden, um das gewünschte Produkt, Lysophosphatidylcholin, zu erhalten, wodurch zusätzliche Reinigungsschritte notwendig werden.
Die oben beschriebenen Verfahren nach dem Stand der Technik liefern eine maximale Ausbeute an Lysophosphatidylcholin von ungefähr 70% des Ausgangsphosphatidylcholins. Dawson zeigte, dass die Zugabe von Ether notwendig war, um die Phospholipase A&sub2;-Aktivität bei der Hydrolyse von Phosphatidylcholin auf die maximale Ausbeute von ungefähr 60-70% zu stimulieren. Die maximale Ausbeute an Lysophosphatidylcholin wurde erhalten, wenn als Reaktionsmedium 8% Diethylether (Vol./Vol.) in wässrigem Puffer verwendet wurde; bei der Verwendung dieses Reaktionsmediums wurde ein Zwei-Phasen-System beobachtet. Dawson fand ebenfalls, dass 6% Butanol (Vol./Vol.) Diethylether in dem Reaktionsmedium ersetzen konnte, um die Ausbeute von Lysophosphatidylcholin zu erhöhen, aber Ethanol und Methylisobutylhexan für eine Erhöhung der Hydrolyse von Phosphatidylcholin unwirksam waren. Dawson folgerte, dass der stimulierende Effekt von Ether (oder Butanol) auf die Hydrolyse von Phosphatidylcholin wahrscheinlich auf der Oberflächenausdünnung der eng gepackten, an der Lipidgrenzfläche ausgerichteten Phosphatidylcholinmoleküle und einer Entfernung von hemmenden Fettsäurecarbonylgruppen von der Grenzfläche beruhte. Diese Schlußfolgerung wurde durch die Beobachtung gestützt, dass die Zugabe von Fettsäuren die enzymatische Hydrolyse von Phosphatidylcholin hemmte (Dawson). Hemmung der Reaktion durch zugegebene Fettsäure beruhte entweder auf der Hemmung der Entfernung der Fettsäure aus der Grenzfläche, oder auf der Ausbildung eines Kalziumion-Fettsäure Chelates, d. h. der Entfernung von für die Aktivität der Phospholipase A&sub2; erforderlichen Ca²&spplus;-Ionen. Dawson glaubte, dass die Entfernung der Kalziumionen die wahrscheinlichere Erklärung sei, da die weitere Zugabe von Ether zur Ausbildung zweier Phasen und zum Solubilisieren der zusätzlichen Fettsäure die Hydrolyse von Phosphatidylcholin nicht unterstützte, wohingegen durch eine zehnfache Erhöhung der Kalziumkonzentration die Hemmung teilweise aufgehoben wurde. Es wurde auch gezeigt, dass das aus Kobragift aufgereinigte Phospholipase A&sub2;-Enzym für die Hydrolyseaktivität auf die Anwesenheit von Kalziumionen angewiesen war. Das Erfordernis von Kalziumionen bei der Hydrolysereaktion durch Phospholipase A&sub2; und die Assoziation von Kalziumionen mit durch die Hydrolyse von Phosphatidylcholin freigesetzten Fettsäuren ist im Stand der Technik wohl bekannt (Novo Nordisk).
Der vorliegende Erfinder hat zuvor Verfahren zur Herstellung gemischter Lipidpartikel erfunden, die geeignet sind, einer Person Medikamente zu verabreichen und für diese leicht absorbierbare Kalorien bereit zu stellen (U.S.-Patente mit den Nummern. 4,874,795 und 5,314,921). Diese Verfahren beinhalten das Mischen von Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure in bestimmten molaren Verhältnissen. Obwohl sie einfach durchzuführen sind, verwenden diese früheren Verfahren teures, isoliertes, hochaufgereinigtes Lysophosphatidylcholin, wodurch sich die Kosten für das gemischte Lipidpartikelendprodukt erhöhen.
Wegen der oben genannten Mängel im Stand der Technik besteht gegenwärtig ein Bedarf an Verfahren, mit denen Phosphatidylcholin effektiver in Lysophosphatidylcholin umgewandelt wird. Ein solches Verfahren würde zu einer effizienteren Verwendung von Phosphatidylcholin führen und weniger unerwünschte Nebenprodukte (wie Glycerophosphatidylcholin) und Verunreinigungen (wie unhydrolysiertes Phosphatidylcholin) des Reaktionsendproduktes ergeben. Die Verwendung eines Verfahrens, bei dem die Endprodukte in einer reineren Form vorliegen, würde zu beträchtlichen Kosteneinsparungen und zu einer beträchtlichen Zeitersparnis aufgrund einer geringeren Notwendigkeit zur Aufreinigung des Endproduktes führen. Es besteht auch ein Bedarf an einem vereinfachten Verfahren zur Herstellung gemischter Lipidpartikel, die Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure umfassen. Ein Verfahren, das Phosphatidylcholin als Ausgangsmaterial benutzt, würde die Notwendigkeit der Verwendung von aufgereinigtem Lysophosphatidylcholin als Ausgangsmaterial verringern, wodurch sich die Gesamtkosten für das gemischte Lipidpartikelendprodukt verringern.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin bereitzustellen, das effizienter ist als die Verfahren nach dem Stand der Technik. Beispielsweise erzielen Verfahren nach dem Stand der Technik zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin typischerweise nicht mehr als 60-70% wirksame Umwandlung des Phosphatidylcholin-Ausgangsmaterials. Die vorliegende Erfindung stellt in bevorzugten Ausführungsformen ein Verfahren bereit, wobei Phosphatidylcholin mit einem Ausnutzungsgrad von nahezu 100% in Lysophosphatidylcholin umgewandelt werden kann. Desweiteren führt die Hydrolyse von Phosphatidylcholin nach der vorliegenden Erfindung, wenn überhaupt, zur Entstehung geringer Mengen von unerwünschten Nebenprodukten. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das die Kosten zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin durch Umwandlung von Phosphatidylcholin mit einem Ausnutzungsgrad von nahezu 100% reduziert.
Die Erfindung beinhaltet Verbesserungen der enzymatischen Hydrolyse von Phosphatidylcholin. Gemäß der Erfindung erhöht die Kombination bestimmter Agenzien mit Phosphatidylcholin die Wirksamkeit der enzymatischen Hydrolyse von Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin und Fettsäure relativ zur Hydrolyse von Phosphatidylcholin ohne die Zugabe solcher Agenzien. Daher stellt die Erfindung verbesserte Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin bereit. Sie stellt auch verbesserte Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen bereit, die Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure enthalten. Die verbesserten Verfahren beinhalten die enzymatische Hydrolyse einer wässrigen Dispersion von Phosphatidylcholin und einem Agens, was die Hydrolyse von Phosphatidylcholin erhöht. Zur Bereitstellung biologisch bevorzugter Formen von Lysophosphatidylcholin entfernt das Enzym, das Phosphatidylcholin hydrolysiert, bevorzugterweise eine Fettsäure von der 2-Position des Phosphatidylcholin, wie zum Beispiel Phospholipase A&sub2;.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin bereitgestellt. Ein Agens und Phosphatidylcholin werden mit Wasser zusammengegeben, um im Wasser eine wässrige Dispersion einer Mischung aus dem Agens und Phosphatidylcholin zu bilden. Die wässrige Dispersion der Mischung wird mit Phospholipase A&sub2; in Kontakt gebracht, um eine Reaktionsmischung zu bilden, bevorzugterweise in Gegenwart von Kalziumionen. Das Agens kann Monoglycerid, Diglycerid, Polyglycerolfettsäureester, Saccharosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester oder Glycerin sein. In bestimmten Ausführungsformen ist das Phosphatidylcholin in der Mischung weniger als ungefähr 40 Gewichtsprozent der Mischung, und bevorzugterweise ungefähr 30 Gewichtsprozent der Mischung. In bestimmten Ausführungsformen beinhaltet das Verfahren weiterhin das Aufarbeiten des in der Reaktionsmischung gebildeten Lysophosphatidylcholins. Bevorzugterweise beinhaltet das Aufarbeiten des Lysophosphatidylcholins die Abtrennung des Lysophosphatidylcholins von einer Reaktionsmischungskomponente, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fettsäure, das Agens oder Fettsäure und das Agens umfasst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die letztgenannte Abtrennung die Extraktion mit Aceton. Die Erfindung stellt so ein Verfahren zur Abtrennung von Lysophosphatidylcholin von allen vorstehend genannten Komponenten bereit, so dass das resultierende Produkt, das im Wesentlichen rein ist, ohne weitere Aufreinigung verwendet werden kann. In allen vorstehenden Ausführungsformen ist das Agens bevorzugterweise Monoglycerid, am bevorzugtesten ein Monoglycerid, das eine Acylgruppe mit zwischen 8 und 22 Kohlenstoffatomen aufweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin bereitgestellt. Ein Agens, Phosphatidylcholin und ein organisches Lösungsmittel werden mit Wasser zusammengebracht, um im Wasser eine das organische Lösungsmittel enthaltende wässrige Dispersion einer Mischung des Agens und von Phosphatidylcholin zu bilden. Die wässrige Dispersion der Mischung wird mit Phospholipase A&sub2; kontaktiert, um eine Reaktionsmischung zu bilden, bevorzugterweise in Anwesenheit von Kalziumionen. Das Agens kann Monoglycerid, Diglycerid, Polyglycerolfettsäureester, Saccharosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester oder Glycerin sein. In bevorzugten Ausführungsformen ist das organische Lösungsmittel tertiärer Butylalkohol. In weiteren Ausführungsformen kann das organische Lösungsmittel Diethylether, eine Mischung aus Diethylether und Ethanol, wobei bevorzugterweise der Ethanol ungefähr 4% des gesamten organischen Lösungsmittels ausmacht, eine Mischung aus tertiärem Butylalkohol und. Ethanol, wobei bevorzugterweise der Ethanol ungefähr 4% des gesamten organischen Lösungsmittels ausmacht, oder Methylisobutylketon sein.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin bereitgestellt, bei denen ein Agens und Phosphatidylcholin mit Wasser in zusammengebracht werden, um im Wasser eine wässrige Dispersion auszubilden. Die wässrige Dispersion wird mit Phospholipase A&sub2; kontaktiert, um eine Reaktionsmischung auszubilden, wobei das Agens in einer wirksamen Menge vorliegt, um die Umwandlung von Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin in der Reaktionsmischung zu erhöhen, verglichen mit der Umwandlung von Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin in der Reaktionsmischung ohne das Agens. Bevorzugterweise liegt das Agens in einer Menge vor, die wirksam ist, um den Ausnutzungsgrad der Reaktion auf 80% oder mehr, bevorzugtererweise auf 90% oder mehr, noch bevorzugtererweise auf 95% oder mehr, oder am bevorzugtesten auf 99% oder mehr zu erhöhen. Bevorzugterweise ist das Agens ein Agens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Monoglycerid, Diglycerid, Polyglycerolfettsäureester, Saccharosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester oder Glycerin besteht.
Während praktisch jede Menge des bevorzugten Agens, Monoglycerid, die Hydrolyse von Phosphatidylcholin durch Phospholipase A&sub2; erhöhen wird, werden gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin bereitgestellt, bei denen das molare Verhältnis von Posphatidylcholin : Monoglycerid von ungefähr 1 : 1 bis ungefähr 1 : 5 beträgt. Bevorzugterweise beträgt das molare Verhältnis von Posphatidylcholin zu Monoglycerid ungefähr 1 : 3. Gemäß diesen Ausführungsformen der Erfindung verläuft die Hydrolyse von Phosphatidylcholin mit einem Ausnutzungsgrad von nahezu 100%.
Praktisch ist jedes Monoglycerid für die Erhöhung der Hydrolyse von Phosphatidylcholin durch Phospholipase A&sub2; geeignet. Jedoch kann nach bevorzugten Ausführungsformen das in dieser Erfindung geeignete Monoglycerid eine Acylgruppe haben, die aus zwischen 8 und 22 Kohlenstoffatomen besteht. Es ist bevorzugt, dass die Acylgruppe des Monoglycerids ein- bis vierfach ungesättigt ist, d. h. Kohlenstoff-Kohlenstoff- Doppelbindungen hat. Daher ist es bevorzugt, dass das Monoglycerid in der Mischung eine Acylgruppe umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einer einfach ungesättigten Acylgruppe, einer zweifach ungesättigten Acylgruppe, einer dreifach ungesättigten Acylgruppe und einer vierfach ungesättigten Acylgruppe besteht. Am bevorzugtesten umfassen mehr als 50% des Monoglycerids in der Mischung eine Acylgruppe, die ausgewählt ist aus der vorstehend genannten Gruppe von Acylgruppen, die einfach, zweifach, dreifach oder vierfach ungesättigt sind. So können bestimmte Monoglyceride gemäß der Erfindung ausgewählt werden aufgrund der Fähigkeit der Monoglyceridmoleküle, die Phosphatidylcholinmoleküle für eine effiziente Hydrolyse von Phosphatidylcholin zu trennen, und desweiteren aufgrund der Länge und des Sättigungsgrades der Acylgruppe, die in nützlichen Endprodukten der Reaktion, wie den unten beschriebenen Lipidmatrixzusammensetzungen, erwünscht sein können.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung einer Lipidmatrixzusammensetzung bereitgestellt, die Lysophophatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure enthält. Phosphatidylcholin und Monoglycerid werden mit der Phospholipase A&sub2; kontaktiert und der resultierende Lipidkomplex aufgearbeitet, z. B. durch die Entfernung von Wasser. Falls gewünscht, kann Monoglycerid und/oder Fettsäure zu dem Lipidkomplex zugegeben werden, um ein bevorzugtes molares Verhältnis der Lipidkomplexkomponenten zu erhalten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann der Lipidkomplex ein molares Verhältnis von Lysophosphatidylcholin : der Summe aus Monoglycerid und Fettsäure zwischen ungefähr 1 : 4 und 1 : 12 haben. Bevorzugtererweise kann das Verhältnis von Lysophosphatidylcholin : der Summe aus Monoglycerid und Fettsäure zwischen ungefähr 1 : 5 und 1 : 6 betragen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Bestandteile des Lipidkomplexes in einem molaren Verhältnis von Lysophosphatidylcholin : Monoglycerid : Fettsäure zwischen 1 : 4 : 2 und 1 : 2 : 4 vorliegen. Am bevorzugtesten kann der Lipidkomplex aus Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure in einem molaren Verhältnis von Lysophosphatidylcholin : Monoglycerid : Fettsäure von 1 : 4 : 2, 1 : 3 : 3 oder 1 : 3 : 2 bestehen. In einer weiteren Ausführungsform kann das Verfahren zur Herstellung einer Lipidmatrix, die Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure enthält, die Verwendung eines von natürlichem Triglycerid abgeleiteten Monoglycerids beinhalten.
Gemäß einem noch weiteren Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin bereitgestellt, bei denen ein Agens und Phosphatidylcholin verreinigt werden, um eine Mischung aus dem Agens und Phosphatidylcholin zu bilden. Das Agens kann Monoglycerid, Diglycerid, Polyglycerolfettsäureester, Saccharosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester oder Glycerin sein. Die Mischung wird mit Wasser vereinigt, um in dem Wasser eine wässrige Dispersion der Mischung auszubilden. Diese Dispersion wird mit Phospholipase A&sub2; kontaktiert, um eine Reaktionsmischung auszubilden, bevorzugterweise in der Anwesenheit von Kalziumionen. Danach kann das Lysophosphatidylcholin aufgearbeitet werden.
Obwohl man nicht an irgendeine Theorie der Erfindung gebunden sein möchte, nimmt man an, dass gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren die lamellare Struktur von Phosphatidylcholin/Lysophosphatidylcholin/Wasser wie von Small beschrieben (J. Am. Oil Chemists' Soc., 45: 108-119, 1968) während der sequentiellen enzymatischen Hydrolyse von Phosphatidylcholin/Agens/Wasser zu Lysophosphatidylcholin/Agens/Fettsäure/Wasser beibehalten wird. Durch Bereitstellung eines Satzes an Reaktionsbedingungen, unter denen die lamellare Struktur beibehalten wird, wird die Wirksamkeit der Hydrolysereaktion gesteigert, weil Phosphatidylcholinmoleküle für das Enzym Phospholipase A&sub2; während des ganzen Reaktionsverlaufs zugänglich bleiben.
Diese und andere Aspekte und Ziele der Erfindung werden im Zusammenhang mit der ausführlichen Beschreibung der Erfindung im Detail beschrieben werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 stellt die Zusammensetzung der Phosphatidylcholin- Hydrolysereaktionsmischung ohne zugegebenes Monoolein über die Zeit dar.
Fig. 2 stellt die Zusammensetzung der Phosphatidylcholin- Hydrolysereaktionsmischung mit Monoolein, das in einem molaren Verhältnis von 1 : 3 zugegeben ist, über die Zeit dar.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin, welches das Kontaktieren von Phosphatidylcholin und einem Agens mit Phospholipase A&sub2; umfasst. Phospholipase A&sub2; wird bevorzugt, weil das durch Hydrolyse von Phosphatidylcholin an der 2-Position entstandene Lysophosphatidylcholin das biologisch bevorzugte Lysophosphatidylcholin ist (im Gegensatz zu durch Hydrolyse von Phosphatidylcholin an der 1-Position entstandenem Lysophosphatidylcholin). Optional kann das entstandene Lysophosphatidylcholin von dem zugegebenen Agens und/oder den Fettsäuren, die durch die Wirkung der Phospholipase A&sub2; auf Phosphatidylcholin freigesetzt werden, getrennt werden. Das Verfahren ermöglicht eine im wesentlichen vollständige Hydrolyse von Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin in einem einzigen Schritt. Falls erwünscht kann das Agens Monoglycerid sein und die resultierende Lipidmatrix aus Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäuren kann von der Phospholipase A&sub2;, Spuren nicht umgesetzten Phosphatidylcholins, Wasser, organischen Lösungsmitteln und jeglichen in der Reaktionsmischung vorhandenen Verunreinigungen getrennt werden.
Das Ausgangsmaterial für das Verfahren ist Phosphatidylcholin, ein Phospholipid, das aus einer polaren hydrophilen Kopfgruppe aus Cholin, Phosphat und Glycerin, das mit einer nicht-polaren hydrophoben Schwanzgruppe bestehend aus zwei Fettsäuremolekülen verknüpft is, zusammengesetzt ist. Phosphatidylcholin kann mit spezifischen Fettsäuregruppen oder mit einer Mischung aus verschiedenen Fettsäuregruppen erhalten werden. Zum Beispiel ist Phospholipon® 80 (American Lecithin, Oxford, CT) eine Mischung aus Phosphatidylcholinmolekülen, bei denen eine Vielzahl von Fettsäureacylgruppen mit der polaren Kopfgruppe verknüpft sind.
Wie hierin offenbart, wird eine Mischung aus Phosphatidylcholin und einem Agens und optional anderen Reaktionskomponenten durch Vereinigen dieser Reaktionskomponenten hergestellt. Der Begriff "Mischung" zeigt nur an, dass die Komponenten miteinander in Kontakt stehen. Beispielsweise kann die Mischung eine kolloidale Mischung aus Phosphatidylcholin und Agens sein; bei Vereinigung mit Wasser oder anderen wässrigen Lösungsmitteln kann man sagen, dass Kolloide einer Mischung aus Phosphatidylcholin und dem Agens in dem Wasser dispergiert sind. Die Mischung kann auch im Wasser nicht als kleine Partikel, sondern als größere kolloidale oder nicht-kolloidale Komplexe dispergiert sein. Man nimmt an, dass das Phosphatidylcholin und das Agens bi- oder mehrschichtige Strukturen ausbilden, obwohl die Erfindung durch diese Theorie nicht beschränkt ist. So sind Mischungen verschiedener physikalischer Form oder Struktur durch die Erfindung eingeschlossen, vorrausgesetzt dass die Mischung die Aktivität der Phospholipase A&sub2; bei der Umwandlung von Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin erhöht.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Agens und Phosphatidylcholin mit Wasser kombiniert, um eine wässrige Dispersion der Mischung aus Phosphatidylcholin und dem Agens auszubilden, und die Dispersion wird nachfolgend mit Phospholipase A&sub2; kontaktiert unter Bedingungen, die die Hydrolyse der Phosphatidylcholinmoleküle zulassen. Man nimmt an, dass das Phosphatidylcholin in Wasser oder praktisch in einem jeglichen wässrigen Lösungsmittel in dem Wasser oder dem wässrigen Lösungsmittel eine Dispersion ausbilden wird. Mit anderen Worten, "Wasser", wie hierin verwendet, soll Wasser und andere wässrige Puffer umfassen, die dazu geeignet sind, eine Dispersion der Mischung aus Phosphatidylcholin und dem Agens zu erzeugen. Wie oben erwähnt glaubt man, dass diese Dispersion eine lamellare (Bilayer- oder Multilayer-) Struktur umfassen wird, wobei die polaren Kopfgruppen des Phosphatidylcholins zu der Außenseite des Bilayers oder Multilayers hin orientiert sind. Man glaubt weiterhin, dass Phosphatidylcholin, wenn es mit einem erfindungsgemäßen Agens gemischt und erhitzt wird, ebenfalls eine Dispersion in dem wässrigen Lösungsmittel ausbilden und eine ähnliche lamellare Struktur beibehalten wird. Man glaubt, dass die Zugabe eines Agens verschiedene Zwecke erfüllt. Man glaubt erstens, dass die Moleküle des Agens die Phosphatidylcholinmoleküle trennen, um einen größeren Zugang zu dem Phosphatidylcholin durch Phospholipase A&sub2; zu erlauben, wodurch eine vollständige Hydrolyse zu Lysophosphatidylcholin ermöglicht wird. Man glaubt zweitens, dass die Zugabe des Agens die lamellare Struktur während der Hydrolysereaktion aufrecht erhält. Man glaubt drittens, dass die Zugabe des Agens die Fluidität des Phosphatidylcholin- Bilayers aufrecht erhält, um die Hydrolyse durch Phospholipase A&sub2; zu erhöhen. Daher wird jedes Agens, das eine oder mehrere der zuvor genannten Eigenschaften aufweist, für geeignet erachtet, zu Phosphatidylcholin hinzugegeben zu werden, um die Hydrolyse durch Phospholipase A&sub2; zu erleichtern. Es ist bevorzugt, dass das Agens ausgewählt wird aus der Gruppe, die aus Monoglycerid, Diglycerid, -Polyglycerolfettsäureester, Saccharosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester und Glycerin besteht. Am bevorzugtesten ist das Agens Monoglycerid.
Monoglycerid besteht aus einer Glycerinkopfgruppe, an die eine Fettsäureacylgruppe angehängt ist. Bevorzugte Monoglyceridacylgruppen, die bei der Erfindung nützlich sind, können einen Kohlenstoffatombereich von 8-22 aufweisen. Monoglyceridacylgruppen können gesättigt oder ungesättigt sein, bevorzugterweise mit 1 bis 4 Doppelbindungen in der Kohlenstoffkette. Die Monoglyceride können hochaufgereinigt sein oder in roher Form zugegeben werden, abhängig von den Bedürfnissen des Anwenders und der Toleranz gegenüber Verunreinigungen in der Reaktionsmischung. Monoglyceride, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, können eine Mischung aus Monoglyceridmolekülen mit unterschiedlichen Längen und unterschiedlichem Sättigungsgrad der Acylgruppen aufweisen, oder das Monoglycerid kann nur eine einzige Art von Acylgruppen aufweisen, z. B. Mono- Olein oder Mono-Palmitin. Beispiele für eine Mischung von Monoglyceriden, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, umfassen DimodanTM LSK und DimodanTM OK (Danisco Ingredients USA, Inc., New Century, KS).
Diglyceridmoleküle sind ebenfalls in dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich zum Verstärken der Hydrolyse von Phosphatidylcholin durch Phospholipase A&sub2;. Ein Diglyceridmolekül besteht aus einer Glycerinkopfgruppe, an die zwei Fettsäureacylgruppen geknüpft sind. Wie die Acylgruppe von Monoglycerid besitzen die Acylgruppen der Diglyceride bevorzugterweise Kohlenstoffkettenverknüpfungen von 8 bis 22 Kohlenstoffatomen und sind ein- bis vierfach ungesättigt. Wie bei dem Monoglycerid hängen die spezifischen Acylgruppen, Reinheit und Mischung der Diglyceridmoleküle, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, von den Erfordernissen des einzelnen Anwenders ab. Jede Kombination von oder Art der Diglyceridmoleküle wird von der Erfindung umfasst, sofern die Hydrolyse von Phosphatidylcholin gesteigert wird.
Andere Agenzien wie Polyglycerolfettsäureester, Sorbitanfettsäureester, Saccharosefettsäureester und Glycerin können ebenfalls die Hydrolyse von Phosphatidylcholin durch Trennung der Phosphatidylcholinmoleküle und Aufrechterhaltung einer lamellaren Struktur und Fluidität erhöhen. Solche Verbindungen sind in dem US-Patent mit der Nummer 4,849,132 beschrieben. Ein Polyglycerinfettsäureestermolekül besteht aus Mono-, Di- oder Polyestern von Fettsäuren mit 4-12 polymerisierten Glycerinmolekülen. Ein Sorbitanfettsäureestermolekül besteht aus Mono-, Di- oder Polyestern von Fettsäuren mit Sorbitol, Sorbitan und Sorbid. Ein Saccharosefettsäureestermolekül besteht aus Mono-, Di- oder Polyestern von Fettsäuren mit Saccharose. Wie die Acylgruppe des Monoglycerids haben die Fettsäuren/Acylgruppen von Polyglycerolfettsäureestern, Sorbitanfettsäureestern und Saccharosefettsäureester bevorzugterweise Kohlenstoffketten mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen und sind ein- bis vierfach ungesättigt. Wie oben hängen die spezifischen Acylgruppen, Reinheit und Mischung der Agensmoleküle, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, von den Bedürfnissen des einzelnen Anwenders ab.
Jedes einzelne Agens oder jede Mischung aus verschiedenen Agenzien, das/die die Hydrolyse von Phosphatidylcholin erhöht/erhöhen, wird für die Erfindung als nützlich betrachtet. Die vorgenannten Agenzien sind kommerziell von einer Vielzahl Quellen erhältlich.
Phosphatidylcholin wird hydrolysiert zu Lysophosphatidylcholin durch die Wirkung von Phospholipase A&sub2;, die die Esterbindung spaltet, welche die Fettsäuregruppe mit der 2- Position des Glycerins in der Kopfgruppe des Phosphatidylcholins verbindet. Phospholipase A&sub2; kann aus einer Vielzahl von Quellen aufgereinigt werden, oder sie kann aus kommerziellen Quellen bezogen werden (z. B. LecitaseTM 10L, Novo Nordisk, Dänemark). Man nimmt an, dass Phospholipase A&sub2; für die volle Aktivität die Anwesenheit von Kalziumionen in der Reaktionsmischung benötigt. Während in den kommerziellen Zubereitungen von Phospholipase A&sub2; typischerweise ein geringer Gehalt an Ca²&spplus;-Ionen vorhanden ist, so, dass die Phospholipase A&sub2; aktiv ist, ist die Zugabe von Ca²&spplus;-Ionen zur Reaktionsmischung für volle Aktivität bevorzugt. Man sollte beachten, dass Ca²&spplus;-Ionen aus der Reaktionsmischung durch Ionenbindung mit der Säuregruppe der Fettsäuren, die während der Hydrolyse aus Phosphatidylcholin freigesetzt werden, entzogen werden. Daher ist es bevorzugt, dass ausreichend Kalziumionen zu der Reaktionsmischung gegeben werden, um die volle Aktivität der Phospholipase A&sub2; aufrecht zu erhalten. In dieser Erfindung ist es am bevorzugtesten, dass der Anwender die Kalziumionenkonzentration ergänzt, um ein molares Verhältnis von Kalziumion : Phosphatidylcholin von mindestens 1 : 1 zu erzielen.
Der Fachmann wird erkennen, dass Kalziumionen durch andere Ionen ausgetauscht werden können, um die volle Aktivität des Enzyms Phospholipase A&sub2; aufrecht zu erhalten. Während nicht alle Ionen Ca²&spplus; in dieser Reaktion ersetzten können, kann die spezifische Art und Konzentration von Ionen, wie sie für die Aufrechterhaltung der Aktivität der Phospholipase A&sub2; angemessen ist, auf einfache Weise von dem Durchschnittsfachmann getestet werden.
Wie obenstehend offenbart, beinhaltet das Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin das Kontaktieren einer wässrigen Dispersion der Mischung aus Phosphatidylcholin und einem Agens mit Phospholipase A&sub2;. Man nimmt an, dass die wässrige Natur der Reaktionsmischung die Orientierung der polaren Anteile der Phosphatidylcholinmoleküle erleichtert, sodass eine lamellare Struktur ausgebildet wird. Man nimmt an, dass eine lamellare Struktur für die effiziente Hydrolyse von Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin durch Phospholipase A&sub2; bevorzugt ist. Daher wird erwogen, dass nicht-wässrige Mischungen von Phosphatidylcholin und einem Agens ebenso in dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können, falls solche nicht-wässrigen Mischungen das Phosphatidylcholin und die Agensmoleküle in einer lamellaren Struktur korrekt ausrichten, und falls die Spezifität der Hydrolyse durch Phospholipase A&sub2; erhalten bleibt.
Andere Reaktionsbedingungen, wie pH, Zeit und Temperatur, können variiert werden, um die optimale Hydrolyse von Phosphatidylcholin zu bewerkstelligen. Beispielsweise hat Phospholipase A&sub2; ein pH-Optimum von pH 8-9, das aufrecht erhalten werden sollte, um die maximale Enzymaktivität zu halten. Während des Fortschreitens der Reaktion kann sich der pH-Wert der Reaktionsmischung ändern, da Fettsäuren durch die Hydrolyse von Phosphatidylcholin freigesetzt werden. Eine solche pH-Änderung kann die Zugabe von Base erfordern, um den optimalen pH-Bereich von 8-9 beizubehalten. Jede Base, die den pH in den optimalen Bereich heben kann, ohne die Hydrolyse des Phosphatidylcholins zu stören, kann verwendet werden. Der Anmelder hat zu diesem Zweck erfolgreich wässriges Natriumhydroxid verwendet, jedoch können auch andere Zubereitungen von Natriumhydroxid oder andere Basen zu dem gleichen Zweck verwendet werden. Wenn die bestimmten verwendeten Reaktionsbedingungen zu einer Erhöhung des pH führen, dann wird erwogen werden, dass Säure zugegeben werden kann, um den optimalen pH aufrecht zu erhalten.
Die Hydrolyse von Phosphatidylcholin durch Phospholipase A&sub2; wird bei vielen Temperaturen erfolgen, aber es ist bevorzugt, dass die Reaktion bei der optimalen Temperatur für die enzymatische Aktivität (70-80ºC) durchgeführt wird. Eine solche Temperatur ist aus dem Grund bevorzugt, weil die Phosphatidylcholin/Agens-Bilayerstruktur flüssig aber doch kohärent sein wird, was den Zugang von Phospholipase A&sub2; zu den Phosphatidylcholinmolekülen erlaubt. Andere optimale Temperaturen können durch minimales Experimentieren vom Durchschnittsfachmann ermittelt werden, abhängig von der spezifischen, in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Reaktionsmischung.
Die Reaktionszeit kann von dem Anwender des Verfahrens so gewählt werden, wie sie passend ist, so lange wie die Hydrolyse des Phosphatidylcholins bis zu einem gewünschten Umfang erfolgt ist. Es ist bevorzugt, dass die Reaktion 1 bis 5 Tage, bevorzugtesterweise 2 Tage erfolgt.
Wie oben ausgeführt, nimmt man an, dass die Hydrolyse von Phosphatidylcholin am wirksamsten ist, wenn eine lamellare Struktur in der Reaktionsmischung aufrecht erhalten wird. Daher ist es bevorzugt, dass die Reaktionskomponenten in Mengen vereinigt werden, die eine lamellare Struktur während des gesamten Verlaufes der Reaktion aufrecht erhalten. Die Menge des verwendeten Phosphatidylcholins in dem erfindungsgemäßen Verfahren wird als Gewichtsprozent der gesamten Reaktionsmischung quantifiziert. Gewichtsprozent wird berechnet durch Division des Gewichtes einer einzelnen Reaktionskomponente dividiert durch die Summe der Gewichte aller Reaktionskomponenten.
Es ist bevorzugt, dass die Menge an Phosphatidylcholin in der Reaktionsmischung nicht mehr als 40 Gewichtsprozent der gesamten Reaktionsmischung ausmacht. Für Reaktionsmischungen, die mehr als etwa 40 Gewichtsprozent Phosphatidylcholin umfassen, werden sich wahrscheinlich in ein nicht-lamellares Zwei-Phasen-System auftrennen, das keine wirksame Hydrolyse des Phosphatidylcholins zuläßt. Am bevorzugtesten stellt das Phosphatidylcholin ungefähr 30 Gewichtsprozent der gesamten Reaktionsmischung dar.
Ein Agens kann der Mischung in einem jeglichen Gewichtsprozentanteil zugegeben werden, der die Hydrolyse von Phosphatidylcholin gegenüber der Hydrolyserate von Phosphatidylcholin durch Phospholipase A&sub2; allein steigert. Am bevorzugtesten ist das Agens Monoglycerid. Wenn es in der Reaktionsmischung vorhanden ist, wird praktisch jede Menge eines Monoglycerids die Hydrolyse von Phosphatidylcholin durch Phospholipase A&sub2; steigern. Bevorzugterweise ist das molare Verhältnis von Phosphatidylcholin : Monoglycerid 1 : 0,1-1 : 10. Um hohe Ausbeuten an Lysophosphatidylcholin zu erreichen, ist es bevorzugt, dass das molare Verhältnis von Phosphatidylcholin : Monoglycerid ungefähr 1 : 1-1 : 5 ist. Am bevorzugtesten beträgt das molare Verhältnis von Phosphatidylcholin : Monoglycerid ungefähr 1 : 3.
Die erwünschten Endprodukte der Reaktion von Phosphatidylcholin und Agens mit Phospholipase A&sub2; sind Lysophosphatidylcholin allein, eine Kombination aus Lysophosphatidylcholin und Fettsäure oder Agens, oder Lysophosphatidylcholin in Kombination mit Fettsäure und Agens. Insbesondere wenn das Agens Monoglycerid ist, ist ein bevorzugtes Endprodukt eine Lipidmatrix, die Phosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure umfasst. Der Nutzen dieser Lipidmatrix ist in den US-Patenten 4,874,795 und 5,314,921 offenbart worden.
Wo das Endprodukt eine Lipidmatrixzusammensetzung aus Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure ist, ist es bevorzugt, dass die Bestandteile der Lipidmatrix in dem molaren Verhältnis von Lysophosphatidylcholin : der Summe aus Monoglycerid und Fettsäure von etwa 1 : 3 bis 1 : 12 vorliegen. Am bevorzugtesten beträgt das molare Verhältnis von Lysophosphatidylcholin : der Summe aus Monoglycerid und Fettsäure etwa 1 : 5 bis 1 : 6. Es ist. auch bevorzugt, dass die einzelnen Komponenten der Lipidmatrix in besonderen molaren Verhältnissen zueinander vorliegen. So ist es bevorzugt, dass die molaren Verhältnisse von Lysophosphatidylcholin : Monoglycerid : Fettsäure 1 : 4 : 2-1 : 2 : 4 sind. Am bevorzugtesten sind die molaren Verhältnisse von Lysophosphatidylcholin : Monoglycerid : Fettsäure entweder 1 : 4 : 2, 1 : 3 : 3 oder 1 : 3 : 2.
Weitere Monoglyceride und Fettsäuren können zu der Lysophosphatidylcholin/Monoglycerid/Fettsäure-Mischung zugegeben und geschmolzen oder gemischt werden, um Stoffzusammensetzungen zu erhalten, wie sie in dem US-Patent mit der Nummer 4,874,795 definiert sind. Daher können Monoglycerid und/oder Fettsäure zu der Lipidmatrix hinzugegeben werden, falls gewünscht wird, die molaren Verhältnisse von Monoglycerid und/oder Fettsäure zu ändern, um ein gewünschtes Produkt zu erhalten.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Lipidmatrix ist, inter alia, nützlich für die Abgabe von Medikamenten. Falls erwünscht, kann eine pharmazeutische Zusammensetzung zu jeder Zeit zu der Reaktionsmischung zum Einschluß in die Lipidmatrix zugegeben werden, die die Integrität der pharmazeutischen Zusammensetzung nicht nachteilig beeinflusst. Bevorzugterweise wird die pharmazeutische Zusammensetzung nach Bildung der Lipidmatrix zugegeben.
Bevorzugterweise umfassen die hierin offenbarte Verfahren einen Schritt des Aufarbeitens des in der Reaktionsmischung gebildeten Lysophosphatidylcholins. Wie hierin gebraucht, bedeutet "Aufarbeiten" das Aufarbeiten des Lysophosphatidylcholins von einer oder mehreren Komponenten der Reaktionsmischung. Die wirkliche Form des Lysophosphatidylcholins kann variieren, d. h. das Lysophosphatidylcholin kann als Komplex mit anderen Komponenten der Reaktionsmischung aufgearbeitet werden. Zum Beispiel umfasst das Aufarbeiten des Lysophosphatidylcholins das Aufarbeiten eines Lipidkomplexes, der Lysophosphatidylcholin, Fettsäure und Agens enthält. Das Aufarbeiten von Lysophosphatidylcholin umfasst auch das Aufarbeiten von Lipidkomplexen, die Lysophosphatidylcholin und Agens oder Lysophosphatidylcholin und Fettsäure enthalten. Es ist nicht notwendig, dass das Lysophosphatidylcholin oder der Lysophosphatidylcholin enthaltende Lipidkomplex aufgereinigt ist, um als aufgearbeitet zu gelten. Daher kann das Lysophosphatidylcholin oder der Lysophosphatidylcholin enthaltende Komplex andere Bestandteile, die in der Reaktionsmischung vorhanden sind, wie Caz+ oder Phospholipase A&sub2;, enthalten. Jedoch ist das Lysophosphatidylcholin als "aufgearbeitetes" Lysophosphatidylcholin ausreichend von anderen Materialien isoliert, so dass es als Isolat von Lysophosphatidylcholin oder von einem Lysophosphatidylcholin enthaltenden Lipidkomplex nützlich ist. Das aufgearbeitete Lysophosphatidylcholin oder der aufgearbeitete Lysophosphatidylcholin enthaltende Komplex kann jedoch aufgereinigt werden, falls dies erwünscht ist.
Der Schritt des Aufarbeitens kann ein oder mehrere Verfahrensschritte beinhalten, wobei Lysophosphatidylcholin von einem oder mehreren Bestandteilen der Reaktionsmischung abgetrennt wird. Lysophosphatidylcholin kann somit von Fettsäure, Agens (z. B. Monoglycerid) oder Fettsäure und Agens abgetrennt werden. Die Abtrennung umfasst die Abtrennung des erwünschten Lysophosphatidylcholins oder Lysophosphatidylcholin enthaltenden Lipidkomplexes von der Reaktionsmischung ebenso wie die Abtrennung eines unerwünschten Reaktionsbestandteils von der Reaktionsmischung. Beispielsweise kann die Reaktionsmischung mit Aceton extrahiert werden, um vorzugsweise Lysophosphatidylcholin von anderen Reaktionsmischungskomponenten zu trennen, wie hierin beschrieben. In anderen Ausführungsformen, in denen eine Lipidmatrix umfassend Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure das gewünschte Endprodukt ist, können andere Reaktionskomponenten wie Phospholipase A&sub2;, Wasser, organische Lösungsmittel und Überschüsse an Monoglycerid oder Fettsäure von der Lipidmatrix abgetrennt werden. Alternativ kann Wasser von den anderen Reaktionsmischungsbestandteilen durch Erhitzen oder Trocknen der Reaktionsmischung, wie hierin beschrieben, abgetrennt werden. Andere Verfahren zur Abtrennung ausgewählter Produkte der enzymatischen. Hydrolyse von Phosphatidylcholin werden hierin bereitgestellt und noch weitere werden dem Durchschnittsfachmann bekannt sein.
Viele Verfahren, die den Durchschnittsfachleuten bekannt sind, werden für die Abtrennung von Lysophosphatidylcholin von anderen Reaktionskomponenten anwendbar sein basierend auf unterschiedlichen Löslichkeiten, Molekulargewichten, Molekulargrößen oder anderen Eigenschaften. Zum Beispiel kann Lysophosphatidylcholin von anderen Komponenten durch präparative Kieselsäuregel-Chromatographie abgetrennt werden. Bevorzugterweise kann Lysophosphatidylcholin durch Extraktion der Reaktionsmischung mit Aceton getrennt werden. Dieses Verfahren basiert auf der Unlöslichkeit von Phospholipiden in Aceton; Lysophosphatidylcholin präzipitiert als ein Feststoff, der einfach von den anderen Reaktionskomponenten aufzuarbeiten ist. Andere Trennverfahren werden den Durchschnittsfachleuten bekannt sein.
Zusammensetzungen, die Lysophosphatidylcholin alleine oder in Kombination mit Monoglycerid und/oder Fettsäuren enthalten, sind als Emulgatoren, Antioxidantien und oberflächenwirksame Substanzen in Kosmetika und dermatologischen Zubereitungen nützlich.
Wie oben offenbart, erwägen die Verfahren der Erfindung auch das Entfernen von Wasser und/oder anderen Lösungsmitteln aus der Reaktionsmischung, um die gewünschten Endprodukte aufzuarbeiten. Daher kann das Verfahren zur Herstellung jeglicher der vorstehenden Produkte das Entfernen von Wasser oder von Lösungsmitteln als Teil der, oder getrennt von den oben dargestellten Trennverfahren beinhalten.
Jegliches aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren zur Entfernung von Wasser, wässrigen Lösungsmitteln, oder Mischungen aus wässrigen und organischen Lösungsmitteln kann verwendet werden, solange die gewünschten Endprodukte der Hydrolysereaktion nicht nachteilig beeinflusst werden. Es ist bevorzugt, dass Verfahren angewandt werden, die in ihrem Maßstab auf die industrielle Produktion von Lysophosphatidylcholin oder Lipidmatrixzusammensetzungen abgestellt werden können. Zum Beispiel können Lösungsmittel von erwünschten Endprodukten entfernt werden durch Erhitzen, Lyophilisieren oder Sprühtrocknungsverfahren. Solche Verfahren können solange oder in einem solchen Umfang angewandt werden, um das Wasser oder die Lösungsmittelmischungen ganz oder teilweise, wie vom Anwender gewünscht, zu entfernen. Bevorzugterweise werden die Reaktionsprodukte erhitzt, um Wasser zu entfernen, wobei eine Paste aus Lysophosphatidylcholin oder Lipidmatrix erhalten wird.

Beispiele

Beispiel 1

Phospholipase A&sub2; wurde aus Naja naja siamenesis und Crotalus atrox gewonnen. Eine Stammlösung, die 2 mg/ml von jedem Enzym enthielt, wurde in 10 mM Boratpuffer pH 7.4, der 0,74 mM Ca&spplus;² enthielt, hergestellt. Es wurden Lipidmischungen in Hexan : Ethanol (95/5) hergestellt, die das Sojaphosphatidylcholin (Phospholipon, Nattermann Phospholipid GMBH, Chargennr. 60020; 250 ug/ml), 1-Palmitoyl-2-(1-[¹&sup4;C-oleoyl])-Phosphatidylcholin ( 800,000 dpm, vernachlässigbare Masse) und Monoolein [MO] (4,54 mg/ml), enthielten. Die molaren Verhältnisse von Phosphatidylcholin [PC] zu MO in den 6 Proben waren 1 : 0, 1 : 1, 1 : 2, 1 : 3, 1 : 4 und 1 : 5. Jede Probe in einem 1 ml "ReaktiVial" (Pierce, Rockford, IL) wurde unter N2 zur Trocknung gebracht. Borat/Ca&spplus;² Puffer, 0,01 M pH 7.4, wurde zugegeben, die Probe gevortext und anschließend für 10 min bei 47ºC in einem Branson Beschallungsapparat (Modell W-375), der mit einem Cuphorn ausgerüstet war, bei einer Energiestufe von 6-7, beschallt. Die Reaktionsmischung enthielt 250 ug PC und 4 ug von jeder Phospholipase A&sub2;- Zubereitung in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml Puffer. Monoolein war in den Proben in den oben genannten molaren Verhältnissen vorhanden. Die Proben wurden bei 30ºC in einem Schüttelbad inkubiert, wobei Aliquots für die Analyse entnommen wurden.
Nach der Anlayse von aus 10 ul Aliquots erhaltenen Radioaktivität, welche nach 5 Stunden entnommen wurden, war offensichtlich, dass die Lipide in allen Proben außer den 1 : 0 und 1 : 1 Proben nicht homogen verteilt waren, d. h. dass wir keine repräsentative Probe der Gefäßinhalte erhielten. Dies war auch aufgrund der Untersuchung der Proben offensichtlich, die aggregiertes, an der Wand der 1 : 2-Proben adhärierendes Lipid aufwiesen. Alle Reaktionsgefäße wurden erneut in dem Cuphorn-Beschallungsapparat beschallt und nach 24 Stunden nochmals untersucht. Mit Ausnahme der 1 : 2-Probe war das Aussehen der 1 : ≥ 3- Proben unverändert und die erhaltene Radioaktivität zeigte an, dass diese Proben immer noch nicht gleichmäßig dispergiert waren. Nach ungefähr 24 Stunden nach der Zugabe von Enzym zu den Reaktionsgefäßen wurden 100 ul Puffer zu jeder Probe zugegeben und jede Probe, erhitzt auf 50ºC, wurde 30 sec mit einem Branson-Beschallungsapparat (Modell W225) auf einer Energiestufe von 2-3 unter Verwendung einer Mikrospitze, die direkt in die Probe platziert wurde, beschallt. Dies dispergierte das Lipid in allen Proben, obwohl nachfolgend Koagulation und eine geringe erhaltene Radioaktivität in den Proben 1 : 4 und 1 : 5 beobachtet wurde. Sofort nach dieser direkten Beschallung wurde ein weiteres Aliquot Enzymlösung zu jeder Probe hinzugegeben und die Inkubation bei 30ºC wiederaufgenommen. Die entnommene Aliquotgröße für die Analyse wurde auf 20 ul erhöht. Nach einem Zeitablauf von 240 Stunden nach Zugabe von Enzym wurde die gesamte verbliebene Probe extrahiert und auf dieselbe Weise analysiert wie die Aliquots, die zu dazwischengelegenen Zeitpunkten entnommen worden waren.
Die für die Analyse entnommenen Aliquots wurden zu 0,6 ml CHCl&sub3; : Methanol (2 : 1) und 0,3 ml 2mM EGTA pH 5.25 in Wasser gegeben. Das organische Lösungsmittel enthielt 0.0417 mg/ml PC, 0,0417 mg/ml Lysophosphatidylcholin, 0,0417 mg/ml Oleinsäure [OA] und 0,0417 mg/ml MO, um Endträgerlipidmengen von 25 ug einer jeden Art pro Probe zu ergeben, die einer Dünnschichtchromatographie unterzogen werden sollte. Die Proben wurden gevortext und in einem Sorvall SS-34 Rotor bei 3000 · g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert, um organische und wässrige Phasen zu trennen. Die untere organische Phase wurde aus dem Gefäß mit einer Spritze entfernt und in ein kleines Teströhrchen gegeben und die Proben wurden unter N&sub2; getrocknet (die wässrige Phase trocknete ein und wurde in einem Szinitillationszähler auf Radioaktivität geprüft und war unter 1200 dpm von den möglichen verwendeten 800,000 dpm). Die Proben wurden in 60 ul 2 : 1 CHCl&sub3; : Methanol wieder aufgelöst und auf abwechselnden Spuren unter N&sub2; auf eine 20 · 20 Whatman LK5D (150 Å, Dicke 250 um) 19-Kanal markierte Kieselsäuregelplatte aufgetragen. Die Platte wurde in 60 : 40 : 1 Hexan : Diethylether : Essigsäure entwickelt. Das Lösungsmittel wurde an der Luft verdampft und die Platte 7 cm von der Unterkante markiert. Eine zweite Entwicklung in 60 : 40 : 1 CHCl&sub3; : Methanol : NH4OH wurde verwendet, um PC vom Startpunkt wegzubewegen und MO von PC wegzubewegen. Das radioaktiv markierte Produkt Oleinsäure ist deutlich über der 7 cm Front. Die Platte wurde getrocknet und die Verteilung der Radioaktivität in jeder Spur wurde mit einem Berthode Linear Analyser- Radioaktivitätsdetektor bestimmt. Diese Einheit ergibt eine offensichtliche Wirksamkeit von 7-9%. In einem Scheinexperiment wurde Enzym der Extraktionsmischung unmittelbar nach dem Aliquot der Inkubationsprobe zugegeben. Es erfolgte keine Hydrolyse des radioaktiv markierten PC, was zeigt, dass die Bedingungen in dem Extraktionsmedium die Expression der Phospholipaseaktivität während der Probenaufarbeitung ausschlossen.
Die Ergebnisse der Experimente sind unten in Tabelle 1 aufgetragen und graphisch in Fig. 1 und 2 dargestellt. Die Ergebnisse stimmen mit einer maximalen Umwandlung von Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin von etwa 70% ohne zugegebenes Monoglycerid (Verhältnis PC : MO = 1 : 0) überein, gemessen am Auftreten von radioaktiv markierter Oleinsäure, die von radioaktiv markiertem Phosphatidylcholin hydrolysiert wurde. Die Zugabe von Monoglycerid in jeglichem molaren Verhältnis erhöht die Menge an gebildetem Lysophosphatidylcholin, wie am Auftreten von radioaktiv markierter Oleinsäure gemessen. Es sollte auch beachtet werden, dass die Zugabe von Monoglycerid zu der Reaktionsmischung das Ansammeln von Nebenprodukten verringert, wodurch die Entstehung von Nebenprodukten bei allen molaren Verhältnissen von PC : MO bei Zeiten von bis zu und einschließlich 96 Stunden praktisch eliminiert wird. Sogar bei längeren Reaktionszeiten ist die Entstehung von Nebenprodukten verringert. Man nimmt an, dass das Nebenprodukt Glycerophosphatidylcholin ist. Studien, um den Anstieg der Lysophosphatidylcholinbildung in Gegenwart von Monoglycerid zu bestätigen, werden gegenwärtig unter Verwendung von Phosphatidylcholin, das eine markierte ¹&sup4;C-Cholin-Gruppe trägt, durchgeführt. Tabelle 1: Wirkung der Zugabe von Monoolein auf die enzymatische PLA&sub2;-Hydrolyse von Phosphatidylcholin
* nicht ausreichende Radioaktivität in den Aliquots für eine quantitative Analyse; ND nicht bestimmt

Beispiel 2

Phosphatidylcholin (Phospholipon® 80, geschätztes Molekulargewicht 785, American Lecithin, enthält ungefähr 80% Phosphatidylcholin) und Monoglyceride (DimodanTM LSK und DimodanTM OK, geschätztes Molekulargewicht 356, Danisco Ingredients) werden in einem molaren Verhältnis von Phosphatidylcholin : Monoglycerid von 1 : 1 bis 1 : 5 kombiniert. Das bevorzugte Verhältnis von Phosphatidylcholin : Monoglycerid ist 1 : 3. Diese Komponenten werden zusammengemischt und auf 70-80ºC erhitzt, um eine gleichmäßige Schmelze zu erhalten, d. h. ohne jegliche sichtbaren Schlieren. Danach wird ausreichend Wasser zugegeben, so dass das Phosphatidylcholin 30 Gewichtsprozent der gesamten Reaktionskomponenten ausmacht. Die Reaktionskomponenten werden gemischt und auf eine Reaktionstemperatur von 70-80ºC erhitzt, um eine einheitliche Konsistenz zu erhalten. Der pH wird eingestellt und mit wässrigem Natriumhydroxid bei ungefähr pH 8 bis 9 gehalten. LecitaseTM lOL, ein Phospholipase A&sub2;-Enzym (Novo Nordisk, Dänemark) wird zu etwa 2 ml pro kg Phospholipon® 80 zugegeben. Eine weitere Zugabe von Kalziumionen ist nicht notwendig, wahrscheinlich aufgrund der in der Enzymzubereitung enthaltenen Kalziumionen. Die Reaktionsbedingungen für Temperatur, Rühren und pH werden 2 Tage lang aufrecht erhalten, bis die Hydrolyse des Phosphatidylcholins vollständig ist. Nach vollständiger Hydrolyse wird das Wasser durch Hitze entfernt, um eine Paste zu erhalten.
Zusätzliches Monoglycerid und zusätzliche Fettsäure wird optional zu der Lysophosphatidylcholin/Monoglycerid/Fettsäurelipidmatrix zugegeben und unter Mischen zusammengeschmolzen gemäß dem obigen Verfahren, um Stoffzusammensetzungen wie in dem US-Patent mit der Nummer 4,874,975 definiert zu ergeben.
Um hochreines Lysophosphatidylcholin zu erhalten, werden die Endprodukte der Reaktion mit Aceton präzipitiert, das sowohl die Monoglyceride als auch die Fettsäuren von den oben beschriebenen Lysophosphatidylcholin/Monoglycerid/Fettsäure- Hydrolyseprodukten extrahiert. Nach der Zugabe von Aceton fällt Lysophosphatidylcholin aus der Lösung aus und kann durch jegliches Standard-Verfahren nach dem Stand der Technik aufgearbeitet werden.

Claims

1. Ein Verfahren zum Herstellen von Lysophosphatidylcholin umfassend:

Vereinigen eines Agens und Phosphatidylcholin mit Wasser, um in dem Wasser eine wässrige Dispersion einer Mischung des Agens und Phosphatidylcholin zu bilden, und

Kontaktieren der wässrigen Dispersion der Mischung mit Phospholipase A&sub2;, um eine Reaktionsmischung zu bilden, wobei das Agens ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Monoglyceride, Diglyceride, Polyglycerolfettsäureester, Saccharosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester und Glycerin.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend Aufarbeiten des in der Reaktionsmischung gebildeten Lysophosphatidylcholins.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Schritt des Aufarbeitens Abtrennen von Lysophosphatidylcholin von einem Reaktionsmischungsbestandteil umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fettsäure, das Agens, oder Fettsäure und das Agens umfasst.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Abtrennen von Lysophosphatidylcholin von Fettsäure und dem Agens Extraktion mittels Aceton umfasst.

5. Das Verfahren nach einem des vorangehenden Ansprüche, wobei das Agens Monoglycerid ist.

6. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Agens Monoglycerid mit einer Acylgruppe ist und die Acylgruppe zwischen 8 und 22 Kohlenstoffatomen aufweist.

7. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Dispersion der Mischung aus einem Agens und Phosphatidylcholin mit Phospholipase A&sub2; in Gegenwart von Calciumionen kontaktiert wird.

8. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Phosphatidylcholin in der Mischung weniger als etwa 40 Gewichtsprozent der Mischung, bevorzugter Weise etwa 30 Gewichtsprozent der Mischung ist.

9. Ein Verfahren zum Herstellen von Lysophosphatidylcholin umfassend:

Vereinigen eines Agens, Phosphatidylcholin und eines organischen Lösungsmittels mit. Wasser, um in dem Wasser eine das organische Lösungsmittel enthaltende wässrige Dispersion aus einer Mischung des Agens und Phosphatidylcholin zu bilden, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe, die Diethylether, tertiären Butylalkohol, Diethylether/Ethanol- Mischungen, Mischungen aus tertiärem Butylalkohol und Ethanol, und Methylisobutylketon umfasst, und

Kontaktieren der wässrigen Dispersion der Mischung mit Phospholipase A&sub2;, um eine Reaktionsmischung zu bilden, wobei das Agens ausgewählt ist aus der Gruppe, die Monoglyceride, Diglyceride, Polyglycerolfettsäureester, Saccharosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester und Glycerin umfasst.

10. Ein Verfahren zum Herstellen von Lysophosphatidylcholin umfassend:

Vereinigen von Phosphatidylcholin und Monoglycerid mit Wasser, um in dem Wasser eine wässrige Dispersion aus einer Mischung von Phosphatidylcholin und Monoglycerid zu bilden, wobei das Verhältnis von Phosphatidylcholin zu Monoglycerid von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 5, bevorzugter Weise 1 : 3 beträgt, und

Kontaktieren der wässrigen Dispersion der Mischung mit Phospholipase A&sub2;, um eine Reaktionsmischung zu bilden.

11. Ein Verfahren zum Herstellen einer Lysophosphatidylcholin Fettsäure umfassenden Zusammensetzung, umfassend:

Kontaktieren einer wässrigen Mischung aus Phosphatidylcholin und Monoglycerid mit Phospholipase A&sub2;, und

Aufarbeiten eines Lipidkomplexes, der Lysophosphatidylcholin, Monoglycerid und Fettsäure enthält.

12. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Schritt des Aufarbeitens des Lipidkomplexes Entfernen von Wasser umfasst.

13. Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei das molare Verhältnis von Lysophosphatidylcholin : Summe aus Monoglycerid und Fettsäure in der aufgearbeiteten Lipidkomplex-Zusammensetzung zwischen 1 : 3 und 1 : 12, bevorzugter Weise zwischen 1 : 5 und 1 : 6 beträgt.

14. Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei die aufgearbeitete Lipidkomplex- Zusammensetzung ein molares Verhältnis von Lysophosphatidylcholin : Monoglycerid : Fettsäure zwischen 1 : 4 : 2 und 1 : 2 : 4 aufweist, bevorzugter Weise ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend 1 : 4 : 2, 1 : 3 : 3 und 1 : 3 : 2.

15. Das Verfahren nach Anspruch 11 oder 14, wobei das Monoglycerid von natürlichem Triglycerid gewonnen ist.

16. Ein Verfahren zum Herstellen von Lysophosphatidylcholin umfassend:

Vereinigen eines Agens und Phosphatidylcholin mit Wasser, um in dem Wasser eine wässrige Dispersion einer Mischung aus dem Agens und Phosphatidylcholin zu bilden, und

Kontaktieren der wässrigen Dispersion der Mischung mit Phospholipase A&sub2;, um eine Reaktionsmischung zu bilden, wobei das Agens ausgewählt ist aus der Gruppe, die Monoglycerid, Diglycerid, Polyglycerolfettsäureester, Saccharosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester und Glycerol umfasst, und wobei das Agens in einer wirksamen Menge vorhanden ist, um die Umwandlung von Phosphatidylcholin in Lysophosphatidylcholin in der Reaktionsmischung zu verstärken verglichen mit der Umwandlung von Phosphatidylcholin zu Lysophosphatidylcholin in der Reaktionsmischung ohne das Agens.

17. Das Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Agens in einer wirksamen Menge vorhanden ist, um die Umwandlungseffizienz von Phosphatidylcholin in Lysophosphatidylcholin in der Reaktionsmischung auf 80% oder höher, bevorzugter Weise 90%, 95% oder 99% zu erhöhen.

18. Ein Verfahren zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin umfassend:

Vereinigen eines Agens und Phosphatidylcholin, um eine Mischung aus dem Agens und Phosphatidylcholin zu bilden, wobei das Agens ausgewählt ist aus der Gruppe, die Monoglycerid, Diglycerid, Polyglycerolfettsäureester, Saccharosefettsäureester, Sorbitanfettsäureester und Glycerol umfasst,

Vereinigen der Mischung mit Wasser, um in dem Wasser eine wässrige Dispersion der Mischung zu bilden, und