DK175245B1 - Fremgangsmåde til isolering og rensning af granulocyt kolonistimulerende faktor (G-CSF) fra en mikroorganisme, der producerer rekombinant G-CSF - Google Patents

Description

i DK 175245 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til isolering og rensning af granulocyt kolonistimulerende faktor ("G-CSF") fra en mikroorganisme, der rekombinant producerer G-CSF.

5 Det ifølge opfindelsen isolerede og rensede G-CSF, især human G-CSF (hG-CSF) eller bovin G-CSF (bG-CSF) kan anvendes til behandling eller forhindring af infektioner hos dyr. Kilden til G-CSF er afledt af genteknologisk behandlede prokaryotiske eller eukaryotiske værtsceller 10 med indhold af rekombinante plasmid eller virale DNA vektorer, der bærer det humane eller bovine G-CSF gen, eller genteknologisk fremstillede varianter af humane eller bovine G-CSF gener eller syntetiske humane eller bovine G-CSF gener.

15 Infektioner hos dyr fører til tab på milliarder af dollars hvert år i kød- og mejeribranchen. Selv om man nu bruger behandling med antibiotika til infektioner hos dyr med et vist held, er der stadig store tab.

Eksempler på sådanne infektioner er yverbetændelse hos køer og transportfeber hos kvæg.

KVÆG

A. Yverbetændelse

Det mest kostbare problem i forbindelse med mal-25 kekvæg nu om dage er yverbetændelse. Yverbetændelse er defineret som en inflammation i yveret. Den kan angribe ethvert pattedyr, f.eks. køer, får og geder, men yverbetændelse hos køer har størst økonomisk betydning. Yverbetændelse af denne type er en infektion i yveret 30 hos drøvtyggere såsom køer, hovedsagelig forårsaget af grampositive og gramnegative bakterier og især hos køer, der tilhører grupper med kraftig mælkeproduktion. Bakterieinfektionen fører til en inflammation i yver-

I DK 175245 B1 I

I 2 I

I kirtlerne, (dvs. selve yveret og patterne). Sygdommen I

I er meget besværlig og er af betydelig økonomisk vigtig- I

I hed, da det sygdomsfremkaldende middel let overføres I

I fra det ene dyr til det andet under malkningen. Visse ' I

I 5 af de vigtigste patogene mikroorganismer, der forårsa- I

I ger yverbetændelse hos kvæg, er Staphylococcus aureus, I

I Streptococcus aqalactiae, Streptococcus uberis. Strep- I

I tococcus dysqalactiae, Escherichia coll, Aerobacter ae- I

I rogenes, Klebsiella pneumoniae og Pseudomonas aerugino- I

I sa. Se endvidere Bovine Mastitis, udqivet af Glenys I

io — I

Bloomfield, V&O Publications 1987, til hvis indhold vi

I herved refererer som en del af denne ansøgning. Disse I

I mikroorganismer trænger ind i yveret gennem kanalen i I

I patterne og forårsager en inflammation af det mælkepro- I

I ducerende væv under dannelse af arvæv, der efter dan- I

I 15 nelse kan medføre en permanent reduktion i koens mælke- I

I produktion. En infektion kan også ændre sammensætnin- I

I gen, mængden, udseendet og kvaliteten af mælken. I

I Der findes en række former og typer for yverbe- I

I tændelse hos kvæg af forskellig grad af alvor og med I

I 20 forskellige symptomer, deriblandt de følgende: I

I (1) Yverinfektion: Indtrængen i yverhulrummet af I

I mikroorganismer, der mangedobles inde i kirtlen og for- I

I årsger betændelse; I

I (2) Ikke-klinisk eller subklinisk yverbetændel- , I

I se: En form for yverbetændelse, hvor der ikke ses nogen I

I 25 I

I ophovning af kirtlen eller kan observeres abnormalite- ,

I ter ved mælken, selv om ændringer i mælken kan påvises I

I ved specielle prøver. Denne type yverbetændelse er I

I langt den mest dominerende og fører til det største to- I

I taltab i de fleste kvæghjorde. Den betegnes oftest som I

I 30 "skjult” yverbetændelse; I

I (3) Klinisk yverbetændelse: En form for yverbe- I

I tændelse, hvor man kan iagttage den abnorme tilstand i I I

3 DK 175245 B1 yveret og udskillelsen derfra. Mild klinisk yverbetæn-delse fører til ændringer i mælken såsom flager, klumper og et vandet eller usædvanlig udseende. Yveret er hverken særlig varmt eller følsomt, men der kan være 5 tegn på, at det er ophovnet. Alvorlig klinisk yverbe-tændelse begynder pludselig med en ophovning af den inficerede fjerdedel, der er varm, hård og følsom. Mælken synes unormal og mælkeproduktionen falder. Udover den lokale virkning på yveret sker det nogen gange, at koen 10 selv bliver syg. Der er tegn på feber, hurtig puls, nedtrykthed, svaghed og tab af appetit. Kombinationen af disse symptomer betegnes ofte som akut systemisk yverbetændelse, da ikke blot yveret men hele dyret er påvirket; og 15 (4) Kronisk yverbetændelse: En form for yverbe- tændelse forårsaget af en vedvarende yverinfektion, der hovedparten af tiden forekommer på ikke-klinisk form, men fra tid til anden kan udvikle sig til en aktiv klinisk form. Efter disse "udbrud" vil den ikke-kliniske 20 form sædvanligvis igen forekomme midlertidigt. (Se alment Current Concepts of Bovine Mastitis, udgivet af the National Mastitis Council, Inc., 2. udgave 1978, side 5).

Yverbetændelse giver stadig mejeriindustrien 25 store tab. Yverbetændelse påvirker det økonomiske udbytte af en kvæghjord på en række måder, både direkte og indirekte, deriblandt: (1) tab af mælkeproduktion; (2) en højere frasortering af inficerede køer; (3) en formindsket værdi af mælken; (4) kasseret mælk efter 30 behandling med antibiotika; (5) udgift til dyrlæge (antibiotika og dyrlægebesøg); og (6) dødsfald. (Bovine Mastitis, Gienys Bloomfield, se ovenfor, side 33). Et overslag over de årlige udgifter giver for U.S.A en milliard dollars i mælk alene. Udgifter til behandling 35 og frasortering hæver dette overslag over totale udgifter til mellem 1½ og 2 milliarder dollars pr. år i

I DK 175245 B1 I

I 4 I

I U.S.A, og dette er kun virkningen af yverbetændelse på I

I 5% af malkekvæg i verden. (Current Concepts of Bovine I

I Mastitis, se ovenfor, side 7). Tallene for hele verden I

I kan kun være et overslag, men ekstrapolation fra I

I 5 U.S.D.A giver et tab over hele verden, der overskrider I

I 20 milliarder dollars om året. I

I Effektive forbindelser til anvendelse ved be- I

I handling eller forhindring af yverbetændelse hos kvæg I

I bør give følgende resultater: (1) hovedparten eller al- I

I 10 le de ovennævnte patogener bør kunne påvirkes af for- I

I bindeisen, når de findes i mælk eller andre yvervæsker; I

I (2) den terapeutiske virkning bør være temmelig hurtig; I

I (3) der bør ikke forekomme nogen signifikant irritation I

I af yveret eller patterne hos koen, hverken af den akti- I

I 15 ve forbindelse eller af andre ingredienser i præpara- I

I tet; og (4) den aktive forbindelse bør ikke findes i I

I mælken i en tidsperiode, der meget overskrider den tid, I

der kræves for den terapeutiske virkning for at opnå et I

I minimal tab af mælk, idet denne må bortkastes, så længe I

I 20 en fremmed forbindelse er til stede deri. Der findes I

I andre krav på et sådant præparat til behandling af I

I yverbetændelse hos kvæg, men de ovenfor nævnte fire I

I kriterier hører til de vigtigste. I

I Behandling med antibiotika har været en vigtig I

25 del af strategien for kontrol af yverbetændelse. I ta- I

I bel 1 opregnes en række antibiotika, der anvendes til I

I behandling af yverbetændelse: I

DK 175245 B1 5

Tabel 1

Antibakterielle midler benyttet ved behandling _af yverbetændelse_ 5 Klasse Forbindelse 1. 3-lactamantibiotika

Penicilliner Ampicillin

Cloxacillin

Hetacillin 10 Nafcillin

Penicillin G (benzylpenicillin) Procainpenicillin 15 Cephalosporiner Cefoperazon **

Cefuroxim *

Cefalonium *

Cefapirin Cefoxazol * 20 Cefracetril * 2. AminoqlycosIdantibiotika Framycetin

Neomycin

Novobiocin 25 Streptomycin 3. Macrolidantibiotlka Erythromycin 4. Tetracycliner Chlortetracyclin 30 Oxytetracyclin

5. Polypeptidantibiotika Polymyxin B

* Første generation; ** tredje generation 35 Bovine Mastitis, se ovenfor, side 70.

I DK 175245 B1 I

I I

I Antibiotisk behandling af yverbetændelse foreta- I

I ges sædvanligvis ved hjælp af infusioner i yveret, en- I

I ten hos køer der giver mælk, når man påviser klinisk I

I yverbetændelse, eller når de bliver golde (goldkotera- I

I 5 pi). (Bovine Mastitis, se ovenfor, side 69). Når en al- I

I vorlig klinisk tilstand er til stede, må antibiotika I

I indgives parenteralt (fusioner i yveret er ineffektive, I

I da mælkekanalerne er blokeret). (Se ovenfor samme- I

I steds). I

10 Det tidligere håb om, at antibiotika ville give I

en fuldstændig kontrol over sygdommen, er ikke blevet I

H opfyldt. Ingen af de ovenfor nævnte antibiotika, der I

I indtil nu er blevet benyttet, har været fuldstændigt I

tilfredsstillende. Man har derudover fundet, at det I

I 15 ville være meget ønskværdigt at erstatte antibiotikabe- I

I handling med behandling med ikke antibiotiske kemote- I

rapeutiske forbindelser af følgende grunde: I

(1) Antibiotika, der er effektive i humanmedici- I

nen, bør ikke anvendes i verinærmedicinen, så der ikke 20 opbygges resistens i bakteriestammer, der er involveret I i menneskesygdomme; I (2) Antibiotika bør reserveres for sådanne syg- I domme for hvilke kemoterapeutiske aktive forbindelser H ikke findes, idet det er blevet bevist, at bakterie- 25 stammer opbygger resistens mod et antibiotikum efter en I langvarig brug af et sådant antibiotikum; og (3) Staphylococcus aureus, en af de ovenfor I nævnte patogener, har allerede opbygget resistens mod hovedparten af de antibiotika, der anvendes ved behand- I 30 ling af yverbetændelse hos kvæg.

En sådan fremgangsmåde til behandling med en ik- I ke antibiotisk kemoterapeutisk forbindelse., beskri- I ves i US patentskrift nr. 4.610.993, der omhandler en I fremgangsmåde til behandling af dyr for kvægyverbetæn- I 35 delse med en effektiv mængde af i det mindste én I pyridin-N-oxid disulfidforbindelse. En anden fremgangs- 7 DK 175245 B1 måde, af samme opfindere, beskrives i US patentskrift nr. 4.401.666, der omhandler en fremgangsmåde til behandling af dyr for kvægyverbetændelse med en effektiv mængde af i det mindste et metalsalt af pyridin-2-5 thion-N-oxid.

Trods disse mange offentliggjorte fremgangsmåder er det stadig meget vigtig at finde økonomisk forsvarlige fremgangsmåder, der anvender ikke antibiotiske forbindelser, der i det væsentlige ville overvinde ulem-10 perne ved antibiotika som anvendt indtil nu og alligevel ville være effektive ved behandling og forhindring af yverbetændelse.

B. Transportfeber 15 En anden almindelig sygdom der påvirker slagte kvægsindustrien, er transportfeber (respiratorisk sygdom hos kvæg). Respiratoriske sygdomme er stadig den vigtigste årsag til tab på grund af sygdom hos slagtekvæg. I en årelang undersøgelse af sygdomme hos 407.000 20 årgamle slagtedyr under opfodring var sygdomme i åndedrætsorganerne ansvarlige for ca. 3/4 af de kliniske diagnoser og ca. 2/3 af diagnoserne efter dødsfald.

Betegnelsen "transportfeber" benyttes til at beskrive det kompleks af respiratoriske sygdomme, man 25 ser hos kvæg der er 6 måneder gammmelt eller ældre efter transport, enten til græsning eller andre fodersteder. Belastningen i forbindelse med afvænning, kastrering, fjernelse af horn, faste, trængsel, udsættelse for infektioner, ændringer i diæten, voldsomme 30 ændringer i omgivelsernes temperatur og andre belastende faktorer kombineret med virale bakterielle mycopla-smale og/eller chlamydiale infektioner bidrager til transportfeberkomplekset. Hvis man blander kalve fra forskellige gårde og/eller salgssteder, er risikoen for 35 infektioner endnu større. Blandinger af forskellige populationer kan være en mere vigtig faktor, der dispone-

I DK 175245 B1 I

I I

I rer for transportfeber, end belastninger, selv om syg- I

I dommen kan forekomme uden sammenblanding, og belastnin- I

ger sædvanligvis i dramatisk grad forværrer respira- I

I toriske sygdomme. Forsøg på at formindske belastningen I

I 5 ved afvænning, kastrering, fjernelse af horn etc. og I

forsøg på at akklimatisere kvæget til nye fodringstyper I

I dage eller uger før de bliver transporteret, er nogen I

I gange heldige (men kan ikke altid være økonomiske) i I

I forbindelse med reduktion af forekomsten af transport- I

I 10 feber. Vaccination mod nogle af de infektioner, der er I

I involveret i transportfeber, hjælper af og til, men I

I vacciner er kun tilgængelige og effektive på få af de I

I infektioner, man ved er involveret i sygdomskomplekset. I

I Det er almindeligt anerkendt, at den egentlige I

I 15 dødsårsag i de fleste tilfælde af transportfeber er en I

I bakteriel (sædvanligvis pasteurella) pneumoni. I

I Pasteurelle haemolytica, især type 1A, er den I

I mest almindelige bakterie isoleret fra tilfælde af re- I

I 20 spiratoriske sygdomme i Nordamerika. Forsøg på eksperi- I

I mentel reproduktion af bakteriel pneumoni hos kvæg lyk- I

kes sædvanligvis ikke uden kraftig belastning og en I

I forudgående beskadigelse af åndedrætsvej ene. Man mener I

I almindeligt, at vira, mycoplasma og/eller chlamydia un- I

I 25 der perioder med belastning oftest giver den første be- I

I skadigelse af respirationsvejen, der prædisponerer til I

I alvorlige bakterieinfektioner og sygdomme. I

I Et typisk udbrud af klinisk respiratorisk sygdom I

I begynder sædvanligvis indenfor nogle få timer eller da- I

I 30 ge efter, at kvæget er ankommet til fodringsstedet. Ny- I

I ligt transporteret kvæg med en vægt på 150-250 kg har I

I sædvanligvis en 20-80% morbilitet og en 1-10% mortali- I

I tet eller mere, for sygdomme i åndedrætsvejene. Når man I

I analyserer serum fra kvæget for en firedobling i mæng- I

I 35 den af antistoffer (serokonversion) og foretager mikro- I

biologiske isolationer fra åndedrætsvejene og sekreter I

9 DK 175245 B1 derfra, kan man identificere et utal ætiologiske årsager. Mange dyr, både de syge og de tilsyneladende sunde, kan påvises at være inficeret med ét eller flere infektiøse midler (sygdomme i åndedrætsvejene er sands-5 ynligvis sjældent forårsaget af blot ét infektiøst middel). Selv om det respiratoriske sygdomskompleks hos kvæg klinisk kan påvises på fodringsstedet efter dyrenes ankomst, starter infektionerne, der fører til de kliniske sygdomme sandsynligvis på salgsstederne, hvor 10 man først samler kvæg fra forskellige gårde. Se endvidere Bovine Respiratory Disease, Lona, R.w. Texas A & M University Press, 1984, til hvis indhold vi herved refererer, som en del af denne beskrivelse.

15 Svin

Respiratoriske sygdomme, især pneumoni, koster svineindustrien hundreder af millioner af dollars hvert år. Det er det største problem i vækstperioden og afslutningsperioden, der udgør halvdelen af grisens liv.

20 Blandt de almindeligste patogener, der er involveret i pneumoni kan man nævne Pasteurella multocida, Mycoplasma hyopneumonia, Haemophilus (Activobacillus) pleuropneumonia, Streptococcus suls, Salmonella cholersuis, Bordetella bronchlseptlca, pseudorabiesvirus og svine-25 influenzavirus.

Haemophilus Actinobacillus pleuropneumoniae er en vigtig årsag til pneumoni hos grise. Sygdommen findes over hele verden og er én af de økonomisk mest betydningsfulde svinesygdomme. Man anslog i 1985, at 30 sygdomme i ånd ed rætsvej ene hos svin havde givet et tab på 208 millioner dollars for producenterne. Pleuropneu-moni er den mest frygtede respiratoriske sygdom, da vacciner ikke kan forhindre infektioner eller forhindre forekomsten af kronisk inficerede sygdomsbærende dyr.

35 De økonomiske konsekvenser af et akut udbrud af pleuropneumoniae i en svineflok, der hidtil ikke har

I DK 175245 B1 I

I 10 I

I været syg, ses tydeligt, idet der er tab ved død fra I

I 0,4-24% og en morbilitet på 8,5-40%. Behandling af den I

I akutte sygdom har været baseret på anvendelse af anti- I

I biotika. Imidlertid er rutineanvendelsen af antibiotika I

I 5 under hurtig begrænsning på grund af omsorg for befolk- I

ningen og pres fra regeringen. I

I Detaljerede histomorfologiske og bakteriologiske I

undersøgelser af pleuropneumoni hos svin viser, at i) I

I tidligt i sygdommen vil et stort antal neutrofile loka- I

10 lisere sig på infektionsstedet; ii) der er en forbin- I

delse mellem evnen hos grisene til at begrænse infek- I

tionen til lungerne, hvorved bakteræmi forhindres og overlevelse og iii) en eksperimentel nedsættelse af an- tallet af cirkulerende neutrofile fører til alvorligere 15 sygdomstilfælde.

Heste

De første to uger efter fødslen (den neonatale periode) er en periode, hvor føl er udsat for alvorlige 20 sygdomme eller død på grund af infektioner (septikæmi).

Neonatal septikæmi giver betydeligt tab for hesteop- I drættere. På septikæmiske føl er antallet af neutrofile sædvanligvis meget lavt (neutropenia) og dette er en grund til dødeligheden på 60-75% i forbindelse med se- 25 psis hos neonatale føl.

I Et sekundært problem i forhold til gramnegativ sepsis såsom skader på knogler og led, enteritis, omp- halophlebitis, respiratoriske sygdomme og dårlig udvik- I ling giver også alvorlige tab for hesteopdrættere. Im- I 30 munoglobulinniveauer har ikke vist god korrelation med I beskyttelse mod infektion hos 20% af septikæmiske føl I med et dobbelt så stort niveau af igG som anbefalet (400 mg/dl). Selv med intensiv omsorg for et kritisk I sygt septisk føl er overlevelsen kun 25-40%. Man har I 35 påvist, at neutrofilfunktionen i betydelig grad er I reduceret hos føl med colostrumdeprivation. Dette i 11 DK 175245 B1 kombination med den ofte forekommende udvikling af neutropenia med sepsis hos neonatale føl er vigtige grunde til den høje dødelighed og måske til, at infektionen sætter ind.

5

Granulocyt kolonistimulerende faktor

Granulocyt kolonistimulerende faktor (G-CSF) er en af mange glycoprotein vækstfaktorer, kendt som kolonistimulerende faktorer (CSF'er), da de støtter proli-10 ferationen af hæmopoietiske stamfaderceller. G-CSF stimulerer proliferationen af specifikke knoglemarvs pre-cursorceller og deres differentiering til granulocyter.

Faktoren skelnes fra andre CSF’er ved dens evne til både at stimulere neutrofil granulocyt kolonidannelse i 15 halvfast agar og til at inducere terminal differentiering af musemyelomonocytiske leukæmiceller in vitro.

Granulocyt kolonistimulerende faktor er en kraftig stimulans for neutrofil proliferation og modning in vivo (Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 1987; 84: 20 2484-2488). G-CSF er også i stand til at inducere funktionel aktivering eller "priming" af modne neutrofile in vitro (Weisbart, R.H., Gasson, C.G., og D.W. Golde.

Annals of Internal Medicine 1989; 110:297-303). Man har vist, at G-CSF primer humane granulocyter og forstærker 25 frigivelsen af peroxid stimuleret af det kemotaktiske peptid, N-formylmethionyl-leucyl-phenalalanin (S.

Kitagawa,et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987; 144:1143-1146, og C.F. Nathan, Blood 1989; 74:301-306), og aktiverer human neutrofil IgA medieret fagocytosis 30 (Weisbart, R.H., et al., Nature 1988; 332: 647-649).

Neutrofile er kritiske komponenter i forsvarsmekanismen hos en vært mod bakterielle og fungale infektioner. G-CSF er i stand til at inducere en vækst i det absolutte tal af cirkulerende neutrofile og for-35 stærke den neutrofile funktion.

Man har beskrevet cDNA kloning og eksprimering af rekombinant human G-CSF og det er blevet bekræftet,

I DK 175245 B1 I

I 12 I

I at det rekombinante G-CSF opviser hovedparten, hvis ik- I I ke alle af de biologiske egenskaber af det oprindelige I I molekyle (Souza, L. et al. Science 232, 61-65 (1986)). I I Sekvensanalyse af cDNA og genomiske DNA kloner har til- I I 5 ladt opklaring af aminosyresekvensen og viser, at pro- I I teinet er 204 aminosyrer langt med en signalsekvens på I I 30 aminosyrer. Det færdige protein er 174 aminosyrer - I I langt og har ingen potentielle N-associerede glycosyle- I I ringssteder, men adskillige mulige steder for O-asso- I I 10 cieret glycosylering. I I Kloning og eksprimering af cDNA, der koder for I I human G-CSF, er blevet beskrevet af to grupper (Nagata, I I S. et al., Nature 319, 415-418 (1986); Souza, L.M. et I I al., Science 232, 61-65 (1986)). Den første meddelelse I I 15 om en G-CSF cDNA klon foreslog, at det færdige protein I I havde en længde på 177 aminosyrer. Forfatterne meddel- I I te, at de også havde identificeret en cDNA klon for G- I

CSF, der kodede for et protein, der manglede en stræk- I I ning på tre aminosyrer. Denne kortere form af G-CSF I I 20 cDNA eksprimerer den ventede G-CSF aktivitet. Den anden I I rapport beskriver en cDNA sekvens identisk med denne I I korte form og nævner ingen, andre varianter. Da disse I I forfattere bekræftede, at det korte cDNA eksprimerer I I G-CSF med den ventede profil af biologisk aktivitet, er I I 25 det muligt at dette er den vigtige form for G-CSF og at I I den længere form enten er en mindre betydelig splejs- I

ningsvariant eller er et kunstprodukt fra kloningen. I I Matsumoto et al., diskuterer i Infection and im- I I munity, bind 55, nr. 11, side 2715 (1987) den beskyt- I

30 tende virkning af human G-CSF på mikrobeinfektioner i I I neutropeniske mus. I I Følgende patentskrifter angår G-CSF: I

WO-A-8703689, Kirin/Amgen, beskriver hybridomaer der I I producerer monoklonale antistoffer specifikke for human I I 35 G-CSF og deres anvendelse ved rensning af G-CSF; I I WO-A-8702060, Biogen, beskriver human G-CSF agtige po- I

13 DK 175245 B1 lypeptider og fremgangsmåder til fremstilling af sådanne; U.S. patentskrift 4.810.643, Amgen, beskriver human G-CSF agtige polypeptider, sekvenser der koder for sådanne og fremgangsmåder til deres fremstilling; og 5 WO-A-8604605 og WO-A-8604506, begge Chugai Seiyaku Ka-bushiki Kaisha, beskriver et gen, der koder for human G-CSF og infektionsinhibitorer med indhold af human G-CSF.

WO-A-87 01132 anviser blandt andet rensning af hG-10 CSF eksprimeret i E. coli ved at lysere mikroorganismen, fracentrifugere uopløseligt materiale, ekstrahere med desoxycholat, solubilisere og oxidere dette hG-CSF ved brug af Sarkosyl og kobbersulfat og afsluttende rense ved ionbytterchromatografi.

15 Det er et mål for opfindelsen at tilvejebringe en forbedret fremgangsmåde til isolering og rensning af G-CSF fra en mikroorganisme, der rekombinant producerer G-CSF.

Det er nu uventet blevet fundet, at ovennævnte 20 rensning kan forbedres, hvis man efter tilsætning af Sarkosyl og kobbersulfat, men før den afsluttende ionbytterchromatografi fjerner det solubiliserende denatureringsmiddel fra G-CSF på en Dowex* kolonne.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge 25 opfindelsen ejendommelig ved, at man 1) lyserer mikroorganismen og skiller uopløseligt materiale med indhold af G-CSF fra opløseligt proteinholdigt materiale; 2) solu-biliserer og oxiderer G-CSF under tilstedeværelse af et solubiliserende denatureringsmiddel og et oxiderende 30 middel; 3) fjerner det solubiliserende denatureringsmiddel fra G-CSF; 4) underkaster G-CSF ionbytterchromatografi, og 5) udvinder det rensede G-CSF.

I DK 175245 B1 I

I I

I Foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden I

I ifølge opfindelsen fremgår af underkravene. I

I I det følgende beskrives de enkelte trin i frem- I

I gangsmåden ifølge opfindelsen mere detaljeret. I

I I

I Rensning af G-CSF I

I G-CSF produceres på uopløselig form i E. coll. I

Den nedenfor beskrevne rensningsfremgangsmåde blev ud- I

I viklet til sikring af et monomert oxideret produkt. Til I

I 10 opnåelse af dette solubiliserer man proteinet under I

I tilstedeværelse af et denaturerende middel og lader det I

oxidere under tilstedeværelse af det denaturerende mid- I

del. Derefter fjerner man det oxiderede protein fra det I

denaturerende middel og renser til homogenitet. Det I

I følgende beskriver fremgangsmåden til rensning af hu- I

I 15 man G-CSF, idet forskelle angående rensning af bovin G- I

I CSF bemærkes. I

I Cellelvserlnq I

Man kombinerer 350 g frossen cellepasta med 2-3 I

I 20 1 1 mM dithiothreitol (DTT) og dispergerer grun- I

I digt. Derefter lader man cellesuspensionen passere en I

I Gaulin homogenisator et tilstrækkelig antal gange I

I fil opnåelse af mere end 95% brud. Man afkøler opslæm- I

I

ningen til 5 ± 3 C før homogeniseringen og til under

Η I

25 18 C mellem hver passage af homogenisatoren. Derefter centrifugerer man homogeniseringsopslæmningen til ud- vindelse af bundfaldet, det indeholder over 95% af G- I CSF, der oprindelig fandtes i cellepastaen (brudblan- I dingen med bovin G-CSF indeholder ikke DDT).

I 30 I Ekstraktion I Derefter dispergerer man det homogeniserede cen- I trifugebundfald i ca. 3 1 1% desoxycholat (DOC), 5 15 DK 175245 B1 mM DTT, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 9, og holder suspensionen under omrøring ved 15-20 C i 30-40 minutter, hvorefter man centrifugerer. (Dette DOC ekstraktions-trin benyttes ikke for bovin G-CSF). Man suspenderer 5 igen centrifugebundfaldet i ca. 3 1 koldt vand og centrifugerer igen. G-CSF genudvindes i centrifugebundfaldet med et totaludbytte på større end 80%. Som et alternativ til desoxycholat kan man benytte et andet galdesalt eller en ikke-ionisk detergent.

10

Solubilisering og oxidation

Det sidste centrifugebundfald fra de ovenfor nævnte ekstraktioner suspenderes i ca. 2,5 1 2%

Sarkosyl, 40 mM Tris (pH 8,0) og man lader det solubi-lisere ved 15-20°C i 30 minutter. Man tilsætter kobber-15 sulfat til en slutkoncentration på 40 pm, og lader blandingen henstå under omrøring i i det mindste 12 timer ved 15-20 C. Omtrent 70% af G-CSF oxideres til den korrekte monomere form under denne procedure. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Fjernelse af sarkosyl

Man centrifugerer den opnåede solubiliserede 2 proteinblanding til fjernelse af uopløseligt affald, 3

hvorefter man fortynder fire gange med 13,3 mM Tris, pH

4 7,7. Herefter tilsætter man ca. 2000 g Dowex bragt i 5 ligevægt i 20 mM Tris, pH 7,7. Dowex er en ionbytter- 6 7 harpiks. Se Dowex: Ion Exchange, The Dow Chemical Com 8 pany, Midland, MI (1988), til hvis indhold vi herved 9 refererer som en del af denne beskrivelse. Man benytter 10 med fordel Dowex 1X4 20-50 mesh type 1, der er en stærkt basisk anionbytterharpiks på chloridform. Denne 11 harpiks er en 4% tværbundet styrendivinylbenzen poly-mermatrix med kvaternære funktionelle ammoniumgrupper, ved hvilke ionbytningen sker. "Type 1" betyder, at ammoniumgruppen består af et nitrogenatom bundet til en I DK 175245 B1

I 16 I

I polymerisk benzylgruppe, der er fæstet til matrixen, og I

I tre methylgrupper. Meshstørrelsen måles som våd harpiks I

I på en U.S.A. standardsigte. Ammoniumgruppen er positivt I

ladet; denne funktionalitet vil udbytte den vedhæftede I

I 5 chloridion med andre negativt ladede ioniske specier i I

I en reversibel reaktion. Dowex 2 harpiks er en type II I

I harpiks, hvori én af methylgrupperne er erstattet af en I

I ethanolgruppe. I

I Type I I

I 10 r~“ —1+ I

I I f~\ fH3 Cl I I--\ Vchz-n-ch3

I ' X=J CH3 I

I 15 L. _ I

I Type II I

I 20 I

I ._. CH-j Π+ I

I > J \ I 3 Cl I

I 5--(' V CHj—N—CHy-CHiOH I

I ^ Λ=Λ '

I 25 I

I Type I og type II harpikser afviger først og fremmest I

I fra hinanden, hvad angår deres affinitet for hydroxid- I

I ionen i forhold til andre anioner og hvad angår deres I

I 30 kemiske stabilitet. Type II harpikser omdannes mere ef- I

I fektivt til hydroxidformen end type I harpikser, men I

I type I harpikser er i sig selv mere kemisk stabile, I

I især på hydroxidformen. I

17 DK 175245 B1

De kvaternære ammoniumionbytterharpikser er stærkt ioniserede og kan benyttes over hele pH området.

De er også i stand til reaktioner med saltspaltning, hvorved et neutralt salt omdannes til den tilsvarende 5 base.

Andre ionbytterharpikser med kraftige anionbyt-tende egenskaber og hvori ladningen ikke er tilgængelig for proteinerne af interesse er alternativer til anvendelse af Dowex.

Man lader denne blanding henstå under omrøring i 10 o det mindste i en time ved 15-20 C til fjernelse af sar-kosyl (N-lauroylsarcosin, natriumsalt) (Sigma) fra proteinopløsningen, hvorefter man frafiltrerer Dowex. Herved kan man udvinde mere end 80% af den korrekt oxiderede form af G-CSF. (Bovin G-CSF behandles ved 2-8°C i dette trin).

Anionbytterchromatoqrafi (dette trin benyttes ikke for bovin G-CSF).

Den opnåede proteinopløsning sættes på en DEAE-20 cellulose (Whatman DE-52 eller tilsvarende) kolonne bragt i ligevægt med 20 mM Tris, pH 7,7. Man vasker kolonnen med 20 mM Tris, pH 7,7, indtil absorbansen ved 280 nm af eluanten er omtrent nul. Derefter eluerer man G-CSF fra kolonnen med 20 mM Tris, 40 mM NaCl, pH 7,7.

25

Kationbytterchromatografi

Man tilpasser eluenten fra DEAE kolonnen til pH

5,4 med 50% eddikesyre og fortynder i det mindste to gange med 5 mM natriumacetat, pH 5,4. Denne opløsning sættes på en CM-Sepharose, hurtig gennemløbkolonne 30 bragt i ligevægt med 20 mM natriumacetat, pH 5,4. Efter påsætningen vasker man kolonnen med 20 mM natriumacetat, pH 5,4, indtil absorbansen ved 280 nm omtrent er nul. Derefter eluerer man G-CSF med 20 mM natriumace- I DK 175245 B1 I tat, 37,5 mM NaCl, pH 5,4. (Bovin G-CSF elueres væk fra kolonnen med 150 mM NaCl i samme puffer).

De følgende eksempler skal illustrere opfindel- 5 sen.

Eksempel 1 (Reference) I Gennemsøgning af et genomisk bibliotek for det bovine G-CSF gen.

I I dette eksempel benyttede man en cDNA klon, der I

H kodede for human G-CSF som beskrevet i US patentskrift I

I nr. 4.610.643 til at søge efter en genomisk klon, der I

I indeholdt et bovint G-CSF gen. Man udplattede et fag I

I 15 (Charon 28) bovint genomisk bibliotek fremstillet ved I

I fremgangsmåden ifølge Woychick, et al., Nucleic Acid I

I Research 10(22): 7197-7210 (1982) og opnået fra J. I

I Bloom og F. Rothman, på E. coli stamme K802 og gennem- I

I søgte dette under anvendelse af en haktranslateret son- I

I 20 de bestående af et humant G-CSF cDNA fragment isoleret I

I fra HgiAI-StuI. Man udplattede ca. 1,2 x 106 fager på I

I 12, 15 cm petriskåle, plakløftede og hybridiserede med I

I sonden under anvendelsen af fremgangsmåder beskrevet i I

I Maniatis et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual I

I 25 (1982)* Mar* kunne observere ialt 7 positive kloner. Tre I

I kloner, der gav det stærkeste signal ved autoradiografi I

I ved en anden gennemsøgning, blev dyrket ill kul- I

I turer og man fremstillede fag DNA som beskrevet i Ma- I

I niatis et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual I

I (1982). Dette DNA blev kortlagt ved restriktionsenzym- I

I 30 fordøjelse og Southern blotting under anvendelse af den I

I radiomærkede HgiAl-Stul sonde. Resultaterne af afbild- I

I ningen viste, at et BamHI fragment på ca, 3000 baser I

19 DK 175245 B1 indeholdt hele G-CSF regionen. DNA fra klon 2 blev fordøjet med BamHI til frigivelse af et ca. 3000 bp bovint G-CSF indeholdende fragment, der derefter blev underklonet i pUC9 og yderligere kortlagt ved restriktions-5 endonucleasefordøjeiser og Southern blotting.

En restriktionsendonucleasekortlægning (3,0 kb) af genomisk DNA med indhold af det bovine G-CSF gen ses i figur 1. Man bestemte sekvensen for hele den kodende region for færdig bovin G-CSF ved at underklone fragmenter i Ml 3 og sekvensopdele dem ved didesoxyfremgangsmåden: Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463 (1977). Man kunne bekræfte eller udstrække sekvenser ved at benytte interne primere fra de samme kloner. Man kunne udlede sekvensen for den kodende region ved direkte sammenligning med den humane genomiske 15 G-CSF sekvens (figur 3), og denne vises i figur 2a. Man antog, at splejsning og den aminoterminale bearbejdning af proteiner foregik på samme steder som ved human G-CSF. Denne DNA sekvens koder for et færdigt protein med samme længde som human G-CSF (174 aminosyrer) og 20 proteinerne er 82% homologe.

Eksempel 2

Konstruktion af syntetiske bovine G-CSF gener og eks- pression af bovin G-CSF (reference) .

25--

Dette eksempel angår præparering af fremstillede gener, der koder for bovin G-CSF og inkluderer kodoner til foretrukket anvendelse i E. coll samt eksprimering af bovin G-CSF.

30 Man tilrettelagde syntetiske gener, så de tillod

eksprimering af bovin granulocyt kolonistimulerende faktor (bG-CSF) i E. coll (bG-CSF dna (figur 4) og bG-CSF dna4 (figur 5-7)). bG-CSF har en længde på 174 aminosyrer og er 82% homolog til den humane form for G-CSF

I DK 175245 B1 I

I 20 I

I (174 aminosyrer). Det bovine protein indeholder fem I

I yderligere ladede rester (arg og glu) end hG-CSF og man I

mener derfor, at det er mere hydrofilt. I

I Generne bG-CSF dna (figur 4) og bG-CSF dna4 I

I 5 (figur 5-7) blev planlagt med maksimal tendens til E. I

I coll kodonforetrækkelse. Hvad angår genet bG-CSF, in- I

kluderede man ud over den kodende sekvens et initie- I

I rings ATG, et ribosombindingssted, to termineringskodo- I

ner, og et 5'-xbal og 3'-BamHl restriktionssted. Genet I

I bG-CSF dna4 blev endvidere konstrueret til et minimum I

I 10 af sekundære vekselvirkninger og tilstrækkelig mange I

unikke gennemskæringssteder, så man kunne samle under- I

I enhederne og manipulere genet. Man indførte unikke I

I BamHl og Pstl steder ved samme positioner, som man I

I fandt i hG-CSF genet og som er nævnt i US patentskrift I

I 15 nr. 4.810.643. Dette tillader dannelse af unikke I

I humane/bovine hybridgener og proteinprodukter derfra. I

I Genet blev konstrueret som to underenheder I

(underenhed I Xbal-Hindlll, og underenhed II I

I Hindlll-EcoRl) til kloning i sekvenserings/ekspressi- I

I 2o0nsve^^°rer (figur· 6). Underenhed I indeholder en kort I

I leader sekvens med en Xbal klonende ende og ribosombin- I

I dingsstedet (RBS). Underenhed II indeholder et par I

I overflødige stopkodoner samt den EcoRl klonende ende. I

I Kort fortalt benyttede man i det hele samme I

I fremgangsmåde som nævnt i Alton, et al., PCT publika- I

I 25tion nr. W083/04053, til hvis indhold vi herved refere- I

I rer som en del af denne ansøgning. Man konstruerede ge- I

I nerne, idet man foretog en første samling af komponen- I

I toligonucleotider (figur 5) til multiple komplekser som I

derefter blev samlet til to adskilte sektioner (figur I

I 306). Disse sektioner var konstrueret til nem mangfoldig- I

I gørelse og de kunne, når de blev fjernet fra mangfol- I

I diggørelsessystemet, blive samlet i rækkefølge eller I

I ved multipel fragmentligering i en passende ekspres- I

I sionsvektor. I

21 DK 175245 B1

Konstruktionen af sektionerne I og II illustreres i figurerne 5 og 6. Ved konstruktionen af sektion I samlede man, som vist i figurerne 5 og 6, 16 oligonu-cleotider til 8 duplexer. Disse 8 duplexer blev deref-5 ter ligeret til dannelse af sektion I. Man bør i forbindelse med figur 6 bemærke, at sektion I inkluderer en opstrøms xbal klæbende ende og en nedstrøms Hindlll klæbende ende, nyttig for ligering til mangfoldiggørelses- og ekspressionsvektorer samt for ligering til sektion II.

10

Sektion II blev konstrueret som vist i figurerne 5 og 6. Til denne konstruktion samlede man 16 oligonu-cleotider til 8 duplexer. Derefter ligerede man disse 8 duplexer til dannelse af sektion II, som afbildet i figur 6. Som det også ses i figur 6, inkluderer sektion 15 II en opstrøms Hindlll klæbende ende og en nedstrøms EcoRl klæbende ende, nyttig for ligering til mangfoldiggørelses- og ekspressionsvektorer samt til sektion I.

Skønt man kan benytte en hvilken som helst pas-20 sende vektor til at eksprimere dette DNA, kan man let konstruere ekspressionsplasmidet pCFM1156 ud fra et plasmid pCFM836, hvis konstruktion beskrives i offentliggjort EPO patentansøgning nr. 136.490 samt US patentskrift nr. 4710473, idet vi herved refererer til indholdet af begge som en del af denne ansøgning. Man gennemskærer først pCFM836 med Nde I, hvorefter man gør det stumpendet med Pol I til ødelæggelse af begge de eksisterende Nde I steder. Derefter fordøjer man vektoren med Cla I og Sac II til fjernelse af en eksisterende polylinker før ligering til en erstatningspolylin-ker. Denne erstatningspolylinker kan konstrueres ved fremgangsmåden ifølge Alton, et al., se ovenfor. Kontrol af ekspressionen i pCFM1156 plasmidet foregår ved hjælp af en λ PL promotor, der selv måske er under kon- I DK 175245 B1 I 22 trol af et CI857 repressorgen (såsom tilvejebringes i I E. coli stamme K12 Htrp eller FM5). PM5 ses beskrevet i I Burnette et al. BIO/TECHNOLOGY, bind 6, side 699 | (1988).

5 Sektion I blev først klonet i Ml 3 fra Xbal-

Hindlll og sekvensopdelt ved didesoxyfremgangsmåden ifølge Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:546 3 (1977). Sektion II blev klonet i Ml 3 fra

Hindlll-EcoRl og blev også sekvensopdelt ved didesoxy- fremgangsmåden. Man udskar sektion I af Ml3 fra xbal- 10

Hindlll og udskar sektion II af M13 fra Hindlll-EcoRl.

H Disse to fragmenter blev derefter ligeret med pCFM1156 skåret fra Xbal-EcoRl og transformeret i E. coli stamme FM5 (eller en anden passende E. coli værtstamme kendt af fagmanden) til opnåelse af pCFMH56bG-CSF.

15 Dette plasmid indeholder XpL promotor/operator- regionen og har et temperaturfølsomt replicon. Når man

dyrker E. coli stamme PM5 med indhold af pCPM1156bG-CSF

ved 28 C, opretholdes plasmidkopitallet på 10-20 H kopier/celle og transkription fra XpL promotoren regu-

H 2 0leres af en temperaturfølsom repressor. Vækst ved 42°C

fører til et større kopital og frigivelse af repressio- nen ved XpL promotoren. Rekombinant bovin G-CSF begyn- der at akkumuleres ved forhøjet temperaturer som et re- I sultat af aktivering af promotoren og plasmidamplifice- ring. Denne XpL promotor ligger netop opstrøms for ri-2 5 bosombindingsstedet og methionininitieringskodonet i I bovin G-CSF. Transkriptionsterminatoren, t-oop, ligger I netop nedstrøms for de to translationelle stopkodoner nær ved 3'-enden af genet. Stammer med indhold af plas- midet pCFM1156bG-CSF eksprimerer r-metbG-CSF som op til I 30 5% af det totale cellulære protein.

Til forøgelse af ekspressionen af bovin G-CSF

I klonede man det syntetiske gen ud af pCFMH56bG-CSF og ind i pCFM536 fra Xbal-Kpnl til opnåelse af pCFM536 23 DK 175245 B1 bG-CSFl. Denne konstruktion blev transformeret i FM5 og man eksprimerede her bovin G-CSF som op til 10% af det totale protein. Under anvendelse af oligonucleotidet 5 TTA ATA ATG ATC CCA TTA GGT CCT. GCA CGT TCT-, udførte man positionsrettet mutagenese (se eksempel 3 hvad angår fremgangsmåden) til ændring af kodonerne for prolin, leucin og glycin ved stillingerne 3, 4 og 5 10 fra CCG, CTC, GGC til CCA, TTA og GGT. Denne nye konstruktion pCFM536 bG-CSF2 blev transformeret i FM5 og med denne ekspression eksprimeres bovin G-CSF som op til 30% af det totale protein.

E. coli bovin G-CSF rensninq 15 1. Cellebrydning og sarkosylsolubilisering og oxidation

Man udvejede ca. 100 g cellepasta og suspenderede den i 2,5 1 vand. Cellerne blev dispergeret med en 20 passende blander, indtil de var fuldstændig dispergere-de. Man lod suspensionen passere et Gaulin homogeniseringsapparat fire gange ved 8000 psig, idet man holdt temperaturen under 18°C. Homogenatet blev centrifugeret i en Beckman J2-21 centrifuge under anvendelse af JA-10 25 rotoren med 10.000 o/m ved 4°C i 30 minutter.

Man fradekanterede og bortkastede supernatanten, hvorefter man igen suspenderede bundfaldet i 2,5 1 koldt vand og centrifugerede i en J2-21 centrifuge med JA-10 rotoren ved 10.000 o/m og 4°C i 30 minutter. Man fradekanterede og bortkastede supernatanten og suspenderede bundfaldet i 380 ml vand og 20 ml 1M Tris pH 8, 100 ml 10% sarkosyl, hvortil man satte 0,5 ml 1% kobbersulfat, pentahydrat. Denne blanding blev holdt under

I DK 175245 B1 I

I 24 I

I omrøring natten over ved stuetemperatur. Man centrifu- I

I gerer materialet i J2-21 centrifugen på JA-10 rotoren i I

I

30 minutter ved 10.000 o/m ved 4 C. Supernatanten blev I

I fradekanteret og opbevaret, men bundfaldet blev bort- I

I 5 kastet. I

I 2. Fjernelse af sarkosyl med Dowex. I

I Man satte ca. 500 ml koldt vand og 1 1 kold I

I 20 mM Tris pH Θ samt 400 g Dowex (bragt i ligevægt med I

I 20 mM Tris, pH 8) til supernatanten, hvorefter man I

I

holdt blandingen under omrøring ved 4 C i 90 minutter. I

I Opslæmningen blev filtreret gennem en søjle og man sam- I

I lede gennemløbet. Harpiksen blev vasket med 400 ml 20 I

I mM Tris pH 7,7 og denne vaskevæske blev sat til gennem- I

I 15 løbet til totalrumfang på 2,4 1. I

I 3. CM-Sepharose pH chromatografi med hurtigt gennem- I

I løb. I

I 20 Man . tilpassede pH for materialet til 5,4 under I

I anvendelse af 50% eddikesyre, hvorefter man centrifuge- I

I rede i J2-21 centrifugen på JA-10 rotoren med 10.000 I

I

o/m ved 4 C i 5 minutter. Supernatanten blev fradekan- I

teret og gemt, hvorimod bundfaldet blev bortkastet. Man I

I 25 satte supernatanten direkte på en 80 ml CM-Sepharose I

I ionbytterkolonne bragt i ligevægt i 20 mM natriumace- I

I tat, pH 5,4. Kolonnen blev vasket med 100 mM NaCl i ud- I

I gangspuffer og derefter elueret med 150 mM NaCl i ud- I

I gangspuffer. Man opnåede ca. 850 ml eluant med indhold I

I af bovin G-CSF. I

30 I

25 DK 175245 B1 4. Diafiltrering,

Man tilpassede elueringen fra CM-Sepharoseko-lonnen, der var 150 mM med hensyn til NaCl, til pH 3,5 5 med 0,1N HCl, hvorefter man diafiltrerede under anvendelse af et ultrafiltreringsudstyr med tangentiel strømning (Pellicon) forsynet med molekylvægt-10.000 membraner, mod 0,35 mM HCl-vand, pH 3,5. Slutrumfanget blev tilpasset, så indholdet af bovin G-CSF var 2 mg/ml.

10

Eksempel 3

Konstruktion af bovine G-CSF analoger (reference) 15 Dette eksempel angår anvendelsen af rekombinante fremgangsmåder til fremstilling af almene analoge til bovin G-CSF, hvori cystein på stilling 17 individuelt var erstattet med serin.

Man udførte positionsrettet mutagenese ifølge 20 Souza, et al., offentliggjort PCT ansøgning nr. W085/00817, 28. februar 1985 til hvis indhold vi herved referer som en del af denne ansøgning, under anvendelse af oligonucleotidet CTGCTGAAATCCCTCGAACAG.

E. Rensning af E. coll bovin G-CSF analog 25 1. Cellebrud og urinstofsolubilisering og oxidation.

Man udvejede ca. 100 g cellepasta og suspenderede det i 2,5 1 vand. Cellerne blev dispergeret med en passende blandeanordning, indtil de var fuldstændig 30 dispergeret, hvorefter man lod suspensionen passere en

Gaulin homogenisator fire gange ved 8000 psig, hvorved 0 man holdt temperaturen under 18 C. Homogenatet blev centrifugeret i J2-21 centrifugen på JA-10 rotoren ved 10.000 o/m ved 4°C i 30 minutter. Man fradekanterede og

I DK 175245 B1 I

I 26 I

I bortkastede supernatanten, suspenderede centrifuge- I

I bundfaldet i 2,5 liter koldt vand og centrifugerede i I

I J2-21 centrifugen under anvendelse af JA-10 rotoren ved I

I 10.000 o/m ved 4 C i 30 minutter. Supernatanten blev I

I 5 fradekanteret og bortkastet. Bundfaldet blev suspende- I

I ret i 120 ml vand og 40 ml 1M Tris, pH 8,5, til hvilket I

I man satte 640 ml 10M urinstof. Blandingen blev nu holdt I

I under omrøring 2-3 timer ved stuetemperatur og derefter I

I fortyndet 1:10 med 20 mM Tris pH 8,5. Blandingen blev I

I holdt under omrøring ved stuetemperatur natten over, og I

I man centrifugerede derefter materialet i Beckman J6-B I

I centrifugen med en JS 4,2 rotor ved '4200 o/m og 4°C i I

I 45 minutter. Supernatanten blev fradekanteret og opbe- I

I varet, hvorimod bundfaldet blev bortkastet. Supernatan- I

I ten blev tilpasset til pH 5,4 med 50% eddikesyre og man I

I 15 centrifugerede materialet i J6B under anvendelse af JS I

I 4,2 rotoren ved 4200 o/m og 4°C i 45 minutter. Superna- I

I tanten blev fradekanteret og benyttet, idet man satte I

I blandingen direkte på en 100 ml CM-Sepharose ionbytter- I

I kolonne bragt i ligevægt med 20 mM natriumacetat pH I

I 20 5,4. Kolonnen blev vasket med 100 mM NaCl i udgangspuf- I

I fer og derefter elueret med 150 mM NaCl i udgangspuf- I

I fer. Man kunne herved opsamle ca. 775 ml eluant med I

I indhold af bovin G-CSF. I

I 2. Diafiltrering. I

I 25 ' I

I Elueringsmaterialet, der var 150 mM med hensyn I

I til NaCl, fra CM-Sepharosekolonnen blev tilpasset til I

I pH 3,5 med 0,IN HCl og derefter diafiltreret under an- I

I vendelse af en ultrafiltreringsanordning med tangentiel I

I 30 strømning (Pellicon) forsynet med molekylvægt-10.000 I

I membraner, mod 0,35 mM HCl-vand, pH 3,5. Slut rumfanget I

I blev tilpasset til opnåelse af et indhold af bovin I

I G-CSF på 2 mg/ml. I

27 DK 175245 B1

Oversigt over tegninger til referenceeksempler

Figur 1 viser restriktionskortet for bovin G-CSF.

Figur 2a viser den kodende region for det færdige prote-5 in fra bovin G-CSF.

Figur 2b viser aminosyresekvensen for det færdige protein.

Figur 3 viser den genomiske sekvens for human G-CSF.

Figur 4 viser DNA sekvensen for et første bovint synte-10 tisk gen (bG-CSF dna) .

Figur 5 viser oligoer benyttet til at konstruere underenhederne fra et yderligere bovint syntetisk gen (bG-CSF dna4).

Figur 6 viser de to underenheder af det bovine G-CSF 15 syntetiske gen bG-CSF dna4.

Figur 7 viser de aminosyrer, der kodes for af det bovine i G-CSF syntetiske gen bG-CSF dna4. j 1

Claims (7)

1. Fremgangsmåde til isolering og rensning af gra- I I nulocyt kolonistimulerende faktor ("G-CSF") fra en mi- I I kroorganisme, der rekombinant producerer G-CSF, k e η - I I 5 det egnet ved, at man I I 1) lyserer mikroorganismen og skiller uopløseligt I I materiale med indhold af G-CSF fra opløseligt protein- I I holdigt materiale; I I 2) solubiliserer og oxiderer G-CSF under tilstede- I I 10 værelse af et solubiliserende denatureringsmiddel og et I I oxiderende middel; I I 3) fjerner det solubiliserende denatureringsmiddel I I fra G-CSF; I I 4) underkaster G-CSF ionbytterchromatografi, og I I 15 5) udvinder det rensede G-CSF. I

2. Fremgangsmåde ifølge krav l,kendeteg- I I net ved, at G-CSF er met*1 human granulocyt koloni- I I stimulerende faktor. I

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg- I I 20 n e t ved, at ionbytterchromatografien i trin 4) udfø- I I res som anionbytterchromatografi fulgt af kat- I I i onbyt terchromatograf i. I

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendeteg- I I net ved, at det solubiliserende denatureringsmiddel i I I 25 trin 2) er Sarkosyl. ' I

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1', kendeteg- I I net ved, at det oxiderende middel er CuS04. I

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendeteg- I I net ved, at det solubiliserende denatureringsmiddel I I 30 fjernes i trin 3) under brug af Dowex®. I 29 DK 175245 B1

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at G-CSF er hG-CSF, og at man efter trin 1) ekstraherer G-CSF materialet med desoxycholat. 5