ES2192060T5 - Ensayo de bioluminiscencia para agonistas o antagonistas de un receptor acoplado al calcio. - Google Patents
Ensayo de bioluminiscencia para agonistas o antagonistas de un receptor acoplado al calcio. Download PDFInfo
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Abstract
Método diagnóstico y/o dosificación de un agonista y/o antagonista del receptor acoplado al calcio o un canal acoplado al calcio o cualquier otra proteína acoplada al calcio, que consta de los siguientes pasos: disposición de un agonista y/o antagonista en un soporte sólido, incubación de una o más célula(s) que expresan la apoaecuorina o cualquier proteína relacionada y el denominado receptor acoplado al calcio con coelenteracina o cualquier otro cofactor de una proteína sensible al calcio con el fin de reconstituir una aecuorina activa por la(s) denominadas(s) célula(s), - adición de una o más de las denominadas células al denominado soporte sólido y - medición de la luz emitida por la(s) denominada(s) célula(s).
Description
Ensayo de bioluminiscencia para agonistas o
antagonistas de un receptor acoplado al calcio.
La presente invención se refiere a un método y
dispositivo de dosificación y/o diagnóstico por
high-throughput screening (HTS = cribado a
gran escala) de un agonista y/o antagonista de un receptor acoplado
al calcio y el agonista y/o antagonista del denominado receptor
acoplado al calcio identificado por el denominado método y
dispositivo.
Muchos receptores acoplados a proteína G (GPCR)
desencadenan, después de la unión a un agonista, un aumento pasajero
de la concentración intracelular de calcio. Esta estimulación actúa
de mensajero secundario interno y es un importante modulador de
numerosos mecanismos fisiológicos (revisado por Rink (1990), Tsunoda
(1993) y por Santella & Carafoli (1997)). Por tanto, se puede
usar la medición de la concentración intracelular de calcio en
células que expresan un GPCR para controlar la eficacia de
activación de un GPCR por diversos componentes de los que se sabe, o
sospecha, son un ligando de este GPCR.
La activación de otros receptores, como los
canales iónicos, puede también inducir una concentración
intracelular de calcio.
Las variaciones en la concentración de calcio se
pueden detectar por diversos medios y métodos, como el uso de
colorantes fluorescentes (por ejemplo: fura-2,
fluo-3, fluo-4 e
indo-1).
Sin embargo, los colorantes sensibles al
Ca^{++} tienen limitaciones. La activación de los colorantes con
un haz de excitación precisa de instrumentos complicados y caros y
limita el uso de material de plástico como las placas de
microtitulación.
Otro método para medir la concentración de
calcio intracelular es el empleo de líneas celulares que expresan
excesivamente un GPCR y apoaecuorina, según describe Sheu et
al. (1993). En este sistema, las células que expresan
apoaecuorina se incuban con coelenteracina, que es el cofactor de la
aecuorina. Durante esta incubación, la coelenteracina penetra en la
célula y se conjuga con la apoaecuorina para formar aecuorina, que
es la forma activa del enzima. Incubando las células con un agonista
del GPCR, aumenta la concentración intracelular de calcio. Este
aumento estimula la actividad catalítica de aecuorina, que oxida la
coelenteracina y produce apoaecuorina, coelenteramida, CO_{2} y
luz. Una vez emitido el fotón, el complejo tiene que disociarse y la
apoaecuorina recombinarse con una nueva molécula de coelenterazina
para volver a emitir luz. En este sistema, por tanto, la medición de
la emisión de luz después de la adición del agonista refleja su
capacidad para activar el GPCR y aumentar, con ello, la
concentración intracelular de calcio. Dado que la luz sólo se emite
durante 20 a 30 segundos después de la activación del GPCR, el
registro de la luz emitida debe realizarse durante escasos segundos
después de la adición de agonista a las células. Esta señal tipo
relámpago se debe al hecho de que (1) el aumento de calcio
intracelular disparado por GPCR es sólo pasajero y (2) como ya se ha
mencionado anteriormente, después de la oxidación de coelenteracina,
la apoaecuorina tiene que recombinarse con la coelenterazina para
ser de nuevo capaz de emitir luz.
La solicitud de patente
EP-0341477 ilustra la expresión de la fotoproteína
de la medusa, la aecuorina, en un sistema celular de mamífero
clonando el gen pAQ440 que dirige específicamente la biosíntesis de
la aecuorina a un plásmido vector que expresa un sistema celular de
mamíferos, sometiendo el plásmido resultante a una transfección y
produciendo la fotoproteína aecuorina en células de mamíferos.
La patente US-5,422,266 describe
un gen que codifica para la proteína apoaecuorina incluida en un
vector capaz de expresar la apoaecuorina en E. coli.
La patente US-5,714,666 describe
líneas celulares de mamíferos o animales transgénicos que expresan
la apoaecuorina y un receptor implicado en la modulación del calcio
intracelular. Este documento describe también un método para medir
el calcio intracelular que incluye la adición de cofactores de la
coelenteracina a las denominadas células de mamíferos que expresan
apoaecuorina y la medición de la fotoemisión en donde la emisión de
fotones es indicativa de la concentración de calcio
intracelular.
No obstante, los métodos del estado de la
técnica requieren, en primer lugar, la extensión de células de una
línea celular de mamíferos que expresa apoaecuorina a un soporte
sólido (por ejemplo, una placa de 96 pocillos); en segundo lugar, la
adición del cofactor de la coelenteracina a las células y la
incubación para reconstituir una aecuorina funcional; en tercer
lugar, la preparación del agente que afecta a un receptor implicado
en la modulación de la concentración de calcio intracelular y,
finalmente, la medición de la fotoemisión.
Además, como ya se ha dicho anteriormente, la
luz sólo se emite durante 20 a 30 segundos después de la activación
de la GPCR. Por ello, el registro de la luz emitida debe realizarse
durante escasos segundos después de la adición del agonista a las
células.
Boie Y y colaboradores (Boie et al., Eur.
J. Pharmacol. 340:227-241, 1997) utilizaron un
ensayo de luminiscencia de aecuorina en células HEK 293 que expresan
el receptor EP1 de prostanoides de rata (una GPCR). Las células
transfectadas se cargaron por incubación con coelenterazina y la
emisión de luz se midió utilizando un luminómetro durante 30
segundos tras lo cual se añadió Tritón X-100 para
solubilizar las células y la emisión de luz se midió de nuevo para
otros 10 segundos. Sin embargo, el método no permite el
mantenimiento de las células durante un periodo de tiempo sostenido
necesario para un escrutinio de alto rendimiento.
Por tanto, los métodos usados en el estado de la
técnica no son adecuados para una detección basada en
high-throughput screening, para el que
normalmente se precisa(n) luminómetro(s) así como el
empleo de placas de microtitulación para el análisis de miles de
compuestos.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar métodos y medios, que no presenten los inconvenientes
del estado de la técnica, para detectar sustancias biológicamente
activas, en especial agonistas y/o antagonistas de receptores
acoplados a calcio.
Uno de los objetivos principales de la presente
invención es proporcionar métodos y medios que permitan la detección
de sustancias biológicamente activas a gran escala, que puedan
adaptarse a recipientes específicos como las placas de
microtitulación sin tener que modificar el dispositivo de
high-throughput screening.
Otro de los objetivos de la presente invención
es proporcionar un método sencillo y no costoso de fácil
automatización.
La presente invención se refiere a un método de
diagnóstico y/o de dosificación por
high-throughput screening de un agonista y/o
un antagonista de un receptor "acoplado al calcio", que consta
de los siguientes pasos:
- -
- disposición de un agonista y/o antagonista (preferiblemente de una molécula) del citado receptor en un soporte sólido,
- -
- incubación de una o más célula(s)
que expresan la apoaecuorina y del citado receptor "acoplado al
calcio" con coelenteracina con el fin de reconstituir una
aecuorina activa por parte de la(s) denominada(s)
\hbox{célula(s),}
- -
- adición al citado soporte sólido de una o más de las denominadas células, donde las denominadas células son cargadas y mantenidas en una suspensión homogénea, y
- -
- medición de la luz emitida por la(s) denominada(s) célula(s).
Bajo el término receptor "acoplado al
calcio" se entiende cualquier receptor (como un receptor acoplado
a G o a un canal iónico) cuya activación (por un ión, una molécula
agonista o antagonista conocida o desconocida) puede incrementar la
concentración intracelular de calcio en la célula incluyendo el
denominado receptor, a ser posible en su membrana
citoplasmática.
La frase "disposición en un soporte sólido"
se refiere al paso de disponer el denominado compuesto en un
recipiente como una placa de microtitulación o cualquier otro
soporte sólido sin requerir fijación alguna (covalente o de otro
tipo) del denominado compuesto al denominado soporte sólido.
Como soporte sólido se recomienda una placa de
microtitulación, preferiblemente una placa de microtitulación de 96
pocillos.
Como célula que expresa la apoaecuorina y como
receptor acoplado al calcio se recomienda una célula que exprese un
receptor acoplado a G y tal vez una o más proteína(s) para
garantizar un acoplamiento del receptor al calcio.
Preferiblemente, la citada proteína se
selecciona del grupo consistente en una proteína G\alpha16 o
G\alpha15 natural, una proteína G quimérica resultante de una
fusión entre dos proteínas G diferentes o una proteína C\beta2
fosfolipásica.
Se recomienda efectuar la medición de la luz
emitida con uno o varios luminómetro(s), equipados, a ser
posible, con diversos dispensadores y cabezas de medición.
La presente invención se describirá con detalle
en los siguientes ejemplos no limitantes, haciendo referencia a las
figuras adjuntas.
Figura 1 Muestra una serie de curvas que
representan la intensidad de la luz emitida por células en función
del tiempo para cada uno de los 96 pocillos de la placa inyectados
con células que expresan el receptor CCR5, apoaecuorina y
G\alpha16. La escala es la misma en todas las gráficas. La señal
se registró durante 30 segundos. Las concentraciones del ligando van
aumentando desde la columna 1 a la 12. Todas las mediciones se
efectuaron por duplicado: filas A y B: el ligando es RANTES; filas C
y D: el ligando es MIP-1\alpha; filas E y F: el
ligando es MIP-1\beta; filas G y H: el ligando es
un derivado A de RANTES.
Figura 2 Representa la curva
dosis-respuesta de los diferentes agonistas del
receptor CCR5 que representa a RLU (integración de la luz emitida
durante 30 segundos) frente al logaritmo de la concentración final
del ligando.
Figura 3 Representa la curva
dosis-respuesta de diferentes agonistas del receptor
5HT-2B.
Figura 4 Representa la curva
dosis-respuesta de la luz emitida de células K562
que expresan CCR3 y aecuorina en respuesta a la activación del
receptor por eotaxina.
Figura 5 Representa las curvas
dosis-respuesta de las células que expresan
aecuorina y G\alpha16 y (A) el receptor de orexina 1 o (B) el
receptor de orexina 2.
Figura 6 Representa la curva
dosis-respuesta de los diferentes antagonistas del
receptor 5HT-2B.
La detección de las actividades agonistas por
medio de líneas celulares de mamíferos que expresan apoaecuorina y
un GPCR implica medir la luz emitida inmediatamente después de la
puesta en contacto de las células con el agonista potencial. Se
puede medir fácilmente a pequeña escala utilizando un luminómetro de
tubo simple. Sin embargo, hasta ahora, este sistema biológico no se
pudo aplicar a gran escala, ya que:
- (1)
- la necesidad de medir la luz inmediatamente después del contacto entre las células y el agonista a examinar obliga a usar un luminómetro equipado con un dispensador integrado. Por ejemplo, dada la breve duración de la emisión de luz, es imposible inyectar los fármacos en las células dispuestas en los 96 pocillos estando la placa fuera del luminómetro y registrar, a continuación, la luz emitida con la placa dentro del luminómetro. Incluso aunque se pudiera introducir la placa rápidamente (es decir, en menos de 15 segundos) dentro del luminómetro después de inyectar los fármacos a analizar, este aparato no permitiría medir la luz en los 96 pocillos antes de extinguirse la señal de relámpago de la aecuorina, ya que estos luminómetros no están equipados con 96 detectores.
- (2)
- Los luminómetros equipados con un dispensador integrado sólo permiten inyectar una solución en los 96 pocillos, siendo imposible la inyección de un fármaco diferente en cada pocillo. Además, el lavado del dispensador antes de cada medición, necesario para inyectar un nuevo fármaco en el siguiente pocillo, exige mucho tiempo y, por tanto, no es adecuado a gran escala. Los mismo ocurre con dispositivos equipados con 6 dispensadores (p. ej. "Microbeta®Jet" de EG&G Wallac) ya que los 6 dispensadores sólo descargan una sola solución.
La presente invención proporciona un método para
realizar un high-throughput screening de
fármacos ligados a GPCR utilizando líneas celulares de mamíferos que
expresan aecuorina y un GPCR con la ayuda de un luminómetro
convencional. Según este método, se disponen las soluciones, cuya
actividad (ant)agonista se va a examinar, en los 96 pocillos
de una placa. Se separan de la placa de cultivo (o se cosechan de
cultivos de suspensión) las células que expresan apoaecuorina y un
GPCR y se incuban con coelenteracina para reconstituir la aecuorina
activa. A continuación, se mantienen en suspensión con la ayuda de
un agitador magnético y se inyecta la suspensión de células, pocillo
por pocillo, en las soluciones del agonista potencial a examinar. Se
registra la luz emitida durante 1 (alternativamente hasta 30 o más)
segundo(s). Este método de inyectar la misma suspensión
celular en cada uno de los 96 pocillos evita tener que lavar el
dispensador entre mediciones y permite realizar en 15 minutos o
menos con un luminómetro de dispensador único 96 mediciones de la
luz emitida por la aecuorina inducida por el agonista.
Alternativamente, se pueden realizar 96 mediciones de la luz emitida
por la aecuorina inducida por el agonista en 2 minutos o menos con
un luminómetro equipado con 6 dispensadores y cabezas de medición
(p. ej., con el "Microbeta®Jet" de EG&G Wallac).
Este método permite, por ende, realizar un
high-throughput screening (10.000
muestras/día) con líneas celulares de mamíferos que expresan
apoaecuorina y un GPCR utilizando un luminómetro convencional. Esto
reduce el tiempo de cribado y la cantidad de fármacos necesarios
para cada medición.
Este sistema también permite realizar un cribado
funcional con muy pocas células (5000 o menos) por medición.
La inyección de las células en los pocillos que
contienen los agonistas no aumentó el valor de base de la medición
(hecho que se podría, por ejemplo, haber originado por ruptura
celular, liberándose moléculas de aecuorina al medio de cultivo, en
el que la concentración de calcio podría haber disparado la emisión
de luz de la aecuorina). Con este sistema de inyección celular se
obtuvo normalmente un coeficiente señal/ruido superior a 50.
El método conforme a la invención es adecuado
para realizar el análisis a gran escala de la estimulación de GPCR o
de otro receptor acoplado a calcio por agonistas conocidos o
potenciales mediante células que expresan el receptor y la
apoaecuorina. Estas células pueden expresar apoaecuorina en el
citoplasma, según describen Sheu et al. (1993) o Button y
Brownstein (1993), o pueden expresar apoaecuorina en la mitocondria,
añadiendo a la aecuorina una secuencia dirigida a las mitocondrias,
según las investigaciones de Stables et al. (1997), o en
cualquier otra parte de la célula. Estas células también pueden
expresar proteínas destinadas a asegurar el acoplamiento del
receptor expresado excesivamente al recorrido del calcio. Estas
serían las proteínas naturales G\alpha16 o G\alpha15 (Milligan
et al., 1996), proteínas G quiméricas resultantes de una
fusión entre dos proteínas G diferentes (Komatsuzaki et al.,
1997), C-\beta2-fosfolipásica
(Park et al., 1992) o cualquier otra proteína de
"acoplamiento universal". Una vez preparadas las células y
cargadas con coelenteracina, pueden usarse durante varias horas
(mínimo 9 horas). La carga en la coelenteracina y la intensidad de
la luz emitida por las células mientras dura la estimulación del
agonista son estables durante este periodo de tiempo.
Ejemplo
1
Se estableció una línea celular CHO que expresa
el receptor CCR-5 de la quimoquina, la proteína
acoplada a G\alpha16 y la apoaecuorina. Se cultivaron las células
en monocapa en medio F12 HAM que contenía un 10% de suero fetal
bovino (FBS). El día del experimento se eliminó el medio de cultivo
y se incubaron las células durante 5 min. a temperatura ambiente en
PBS-EDTA (solución salina de tampón fosfato sin
calcio y con un suplemento de 5 mM de EDTA). Se separaron las
células de un frasco de cultivo agitando la placa de cultivo con la
mano y pipeteando en sentido ascendente y descendente. Se
centrifugaron las células y se retiró el sobrenadante para eliminar
el EDTA; se resuspendió el sedimento en medio de cultivo F12 HAM sin
FBS y con un 0,1% de albúmina de suero bovino. Se efectuó el
recuento de células en una placa Thomas, se centrifugaron de nuevo y
se resuspendieron en medio de cultivo F12 HAM sin FBS y con un 0,1%
de albúmina sérica bovina a una concentración de 5 x 10^{6}
células/ml. Se añadió coelenteracina (o un derivado suyo, p. ej.
coelenteracinas f, h, n, cp o hcp, de Molecular Probes Inc.) (500
\muM en metanol) a la suspensión celular a una concentración final
de 5 \muM. A continuación se conservó la suspensión celular en la
oscuridad a temperatura ambiente durante 3 a 5 h, agitando cada 15 a
30 min. para mantener las células en suspensión.
Se preparó una serie de diluciones de ligandos
conocidos en medio de cultivo F12 HAM sin FBS y con un 0,1% de
albúmina sérica bovina y se dispusieron 50 \mul de cada una de
estas soluciones en los 96 pocillos de la placa. Se diluyó la
suspensión celular 5 veces con medio F12 HAM sin FBS y con 0,1% de
albúmina sérica bovina y se colocó en un recipiente de vidrio o de
plástico protegido de la luz envuelto en papel de aluminio. Se
incorporó una varilla de agitación magnética a baja velocidad (1 a 5
revoluciones por minuto) para mantener las células en suspensión
homogénea. Se insertó en la varilla de agitación magnética una
anilla para evitar el aplastamiento de las células y la subsiguiente
liberación de aecuorina en el medio de cultivo. Alternativamente,
puede utilizarse un frasco de cultivo equipado para cultivar células
en suspensión.
Se utiliza el luminómetro de microplaca
MicroLumat-Plus de EG&G Wallec, que permite la
inyección y registro directo subsiguiente de la luz emitida en cada
uno de los 96 pocillos de la placa. Se introdujo el extremo del tubo
de entrada del dispensador en el fondo de la suspensión celular y se
lavó el dispensador con 3 veces el volumen muerto del aparato para
llenar todo el tubo y las bombas con la suspensión celular. Se
introdujo la placa de 96 pocillos con las soluciones de los
agonistas en el luminómetro. A continuación, se dispensaron en el
primer pocillo 50 \mul de la suspensión celular (es decir, 100.000
células) (a la velocidad de inyección más baja (0,4 s) para prevenir
la ruptura celular que podría liberar aecuorina en el medio de
cultivo) y se registró inmediatamente la luz emitida durante 30
segundos. Después de la lectura del primer pocillo, se inyectaron
las células en el siguiente pocillo y se registró la luz emitida,
etc. Para cada placa, se trazó una serie de curvas representando la
intensidad de la luz emitida en función del tiempo en cada pocillo
(figura 1). La intensidad de la luz emitida se integró durante 30
seg. utilizando un software Winglow suministrado con el luminómetro,
que genera para cada pocillo un valor representativo de la luz
emitida y, por ende, de la estimulación del receptor
CCR-5 por el agonista presente en el pocillo. Estos
valores pueden trazarse frente al logaritmo de la concentración de
ligando para generar una curva dosis-respuesta como
muestra la figura 2. Estos valores permiten determinar
dosis-respuestas semi-máximas
(EC_{50}) para cada ligando. Para generar estos datos, se
realizaron 288 mediciones en menos de 3 horas.
Ejemplo
2
Se estableció una línea celular CHO que expresa
el receptor 5HT-2B de serotonina, la proteína
acoplada a G\alpha16 y apoaecuorina. Las células se trataron de la
forma descrita en el ejemplo 1 y se dispensaron una vez diluidas
(100 \mul/pocillo, correspondiente a 50.000 células) en 100 \mul
de soluciones de agonistas conocidos de este receptor. La luz
emitida se registró durante 20 seg. en cada pocillo. Las curvas
dosis-respuesta obtenidas para diferentes agonistas
se muestran en la figura 3. Para generar estos datos, se realizaron
144 mediciones en menos de 1 hora.
Ejemplo
3
Se transfectaron células K562 que expresan el
receptor CCR3 de quimioquina con un plásmido para la expresión de
aecuorina y la proteína acoplada a G\alpha16. Se seleccionaron
células establemente transfectadas durante 2 semanas con el
antibiótico zeocina y se cultivaron en suspensión en medio de
cultivo DMEM conteniendo un 10% de FBS. Se centrifugaron y el
sedimento se utilizó de la forma descrita en el ejemplo 1 para
efectuar las mediciones de aecuorina. En la figura 4 se describe una
curva dosis-respuesta con eotaxina y
MCP-4 generada con este método.
Ejemplo
4
Se estableció una línea celular CHO que expresa
el receptor orexina 1 u orexina 2, la proteína acoplada a
G\alpha16 y apoaecuorina. Las células se trataron de la forma
descrita en el ejemplo 1 y se dispensaron una vez diluidas (100
\mul/pocillo, correspondiente a 25.000 células) en 50 \mul de
soluciones de agonistas conocidos de este receptor. La luz emitida
se registró durante 20 seg. en cada pocillo. La curva
dosis-respuesta obtenida con este método se muestra
en la figura 5A.
Ejemplo
5
Se estableció una línea celular CHO que expresa
el receptor CB1 canabinoide, la proteína acoplada a G\alpha16 y
apoaecuorina. Las células se trataron de la forma descrita en el
ejemplo 1 y se dispensaron una vez diluidas (100 \mul/pocillo,
correspondiente a 50.000 células) en 100 \mul de soluciones de un
agonista conocido de este receptor. La luz emitida se registró
durante 20 seg. en cada pocillo. La curva
dosis-respuesta obtenida con este método se muestra
en la figura 5B.
Para la medición de las actividades
antagonistas, se inyectaron células en series de diluciones de
antagonistas. En esta fase, se registró la luz emitida para
comprobar que los antagonistas potenciales carecían de actividad
agonista. Se incubaron las células con los antagonistas durante 30
minutos. A continuación, se inyectó una solución de agonista
(alfa-metil-5HT) del receptor
5HT-2B en las células y se registró inmediatamente
la luz emitida en cada pocillo. La luz emitida se trazó en función
del logaritmo de la concentración del antagonista para obtener la
gráfica mostrada. El resultado de las concentraciones crecientes de
antagonistas es una emisión decreciente de luz al añadir el
agonista. Entonces puede inyectarse un agonista de otro receptor
expresado por las células (normalmente ATP, actuando en los
receptores P2) en la mezcla de antagonista, células y agonistas para
controlar la existencia de aecuorina activa en las células hasta ese
momento del experimento. Por ejemplo, los compuestos citotóxicos que
aumentan la concentración de calcio intracelular pueden provocar que
la aecuorina consuma toda la coelenteracina presente en la célula.
Este tipo de compuesto citotóxico puede detectarse por la ausencia
de señal con la inyección de ATP (Fig. 6).
- Button, D. & Brownstein, M.,
Cell Calcium 14, págs. 663-671
(1993)
- Komatsuzaki, K. et al., FEBS
Lett. 406, págs. 165-170 (1997)
- Milligan, G. et al., TIPS 17,
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- Park, D. et al., J. Biol. Chem.
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- Rink, T.J., FEBS Lett. 268,
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- Santella, L. & Carafoli,
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- Sheu, Y.-A. et al., Analytical
Biochemistry 209, págs. 343-347
(1993)
- Stables, J. et al., Analytical
Biochemistry 252, págs. 115-126
(1997)
- Tsunoda, Y., Biochim. Biophys.
Acta 1154, págs. 105-156 (1993).
Claims (7)
1. Método diagnóstico y/o dosificación de un
agonista y/o antagonista del receptor acoplado al calcio o un canal
acoplado al calcio o cualquier otra proteína acoplada al calcio, que
consta de los siguientes pasos:
- -
- disposición de un agonista y/o antagonista en un soporte sólido,
- -
- incubación de una o más célula(s) que expresan la apoaecuorina o cualquier proteína relacionada y el denominado receptor acoplado al calcio con coelenteracina o cualquier otro cofactor de una proteína sensible al calcio con el fin de reconstituir una aecuorina activa por la(s) denominadas(s) célula(s), donde las denominadas células son cargadas y mantenidas en una suspensión homogénea,
- -
- adición de una o más de las denominadas células al denominado soporte sólido y
- -
- medición de la luz emitida por la(s) denominada(s) célula(s).
2. Método conforme a la reivindicación 1, en
donde el soporte sólido es una placa de microtitulación.
3. Método conforme a la reivindicación 2, que se
caracteriza porque la placa de microtitulación es una placa
de 96 pocillos o una placa de 384 pocillos o una placa de 1536
pocillos o cualquier otro formato.
4. Método conforme a una de las reivindicaciones
anteriores, que se caracteriza porque la célula expresa
aecuorina en el citoplasma o en las mitocondrias o en cualquier
parte de la célula.
5. Método conforme a una de las reivindicaciones
anteriores, que se caracteriza porque la célula que expresa
un receptor acoplado al calcio es una célula que expresa un receptor
acoplado a la proteína G endógena o recombinante y/o una célula que
expresa proteínas destinadas a garantizar el acoplamiento del
receptor analizado al calcio.
6. Método conforme a la reivindicación 5, en
donde la denominada proteína se selecciona del grupo consistente en
proteína G\alpha16 o G\alpha15 natural, proteína G quimérica
resultante de una fusión entre dos proteínas G diferentes, proteína
C\beta2 fosfolipásica o cualquier otra proteína o compuesto
químico acoplante.
7. Método conforme a una de las reivindicaciones
anteriores, que se caracteriza porque la medición de la luz
emitida se obtiene con uno o más luminómetro(s), mejorado, a
ser posible, con diversos dispensadores y cabezas de medición.
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