ES2205471T3 - Formacion de geles polisacaridos ionicos dependiente del ph y controlada por la temperatura. - Google Patents

Formacion de geles polisacaridos ionicos dependiente del ph y controlada por la temperatura.

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ES2205471T3 ES98914751T ES98914751T ES2205471T3 ES 2205471 T3 ES2205471 T3 ES 2205471T3 ES 98914751 T ES98914751 T ES 98914751T ES 98914751 T ES98914751 T ES 98914751T ES 2205471 T3 ES2205471 T3 ES 2205471T3
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Abstract

La presente invención se refiere, por una parte a la formación, tributaria del pH, y con temperatura controlada, de geles de polisacárido iónico tales como sistemas acuosos de quitosano/organofosfato, y por otra parte un procedimiento de preparación de tales geles. Mientras que las soluciones acuosas de quitosano son sistemas de gelificación tributaria del pH, la adición de sal dibásica de monofosfato de poliol o de azúcar a soluciones acuosas de quitosano lleva a una gelificación tributaria del pH que, además, se produce a temperatura controlada. En particular, se añade, a razón de 0 a 20% de la masa de las sales de organofosfatos sólidos, y se disuelven a baja temperatura (10ºC) en soluciones acuosas de ácido de quitosano a 0.5 - 4,0%. Las soluciones acuosas de quitosano/organofosfato son inicialmente almacenadas a baja temperatura (4ºC), y gelificadas por endotermia en una gama de temperaturas de 30 a 60ºC. A temperatura deseada de gelificación, estas soluciones acuosas de quitosano/organofosfato se transforman rápidamente en geles. Esta gelificación puede producirse ex vivo en cualquier receptor o molde, o in situ en animales u hombres (in vivo) para llenar un defecto o una cavidad tisular.

Description

Formación de geles polisacáridos iónicos dependiente del pH y controlada por la temperatura.
Antecedentes de la invención (a)Campo de la invención
La presente invención se refiere a la formación dependiente del pH y controlada por la temperatura, de geles polisacáridos iónicos, como sistemas acuosos chitosano/fosfato orgánico, y a los métodos de preparación de los mismos.
(b)Descripción de la técnica anterior
Chitosano es un polímero barato comercializado derivado de materiales de quitina o poli(N-acettil-glucosamina). Chitosano está compuesto principalmente por unidades de D-glucosamina que se generan por la N-desacetilación catalizada de quitina, un biopolímero insoluble extraído de las conchas duras de animales marinos vivos (pescados, crustáceos, langostinos, cangrejos...) o sintetizado por organismos naturales (zigomicetos, hongos...). Se espera que chitosano tenga unas buenas propiedades viscoelásticas y tiene una compatibilidad adecuada con los tejidos y una capacidad de biodegradación que le hace ideal para su uso en implantes bioactivos y reabsorbibles. También se sabe que las cadenas de poli-D-glucosamina se pueden unir a un gran número de moléculas de proteoglicanos y coexisten con fibras colágenas para formar geles acuosos. Se cree que la función de los proteoglicanos en el gel es retener agua y aportar la viscoelasticidad apropiada. Se espera que las matrices extracelulares resultantes matrices ofrezcan entomos compatibles para la proliferación ulular y formación de tejidos, en especial en las células de la piel, ligamentos, hueso y cartílagos. En consecuencia, chitosano es; un foco de gran interés como material de entramado o soporte de tejidos artificiales de bioingeniería.
Además, los derivados de quitina y chitosano parcialmente acetilado han sido objeto de una importante investigación en busca de sustancias terapéuticas o materiales implantables. La biocompatibilidad de los materiales que contienen chitosano se ha evaluado específicamente en sangre, heridas y hueso. También se han estudiado las actividades inmunológicas y genotóxicas de varios materiales que contienen chitosano, además de sus efectos estimuladores sobre la acción de los macrófagos.
Chitosano y sus derivados ha sido muy estudiado en sistemas de administración de fármacos a través de geles (Ohya Y. y cols. (1993) J. Microencapsulation, 10(1):1-9). Se propuso que la administración de péptidos con chitosano se efectuase por vía nasal. Para el uso con fármacos, se propusieron vehículos coloidales catiónicos procedentes de sistemas chitosano-policaprolactona. Asimismo, se ha propuesto el uso para la curación de heridas y dispositivos reconstructivos en forma de dispositivos elaborados con chitosano para las heridas abiertas o corneales, tejidos periodontales y piel. Chitosano se evaluó especialmente en hueso y duramadre, y como hemostático.
El atropamiento de materiales biológicos vivos (células, enzimas, etc...) se ha investigado también con distintos productos de chitosano, aunque casi en todos los casos las células vivas se han quedado encapsuladas dentro de microesferas de alginato/chitosano. Se ha propuesto la encapsulación de los condorcitos (las células del cartílago) dentro de cuentas de alginato cálcico/chitosano.
La formación del gel de chitosano a través de polifosfatos se promueve por las células encapsuladoras de tejidos como el nervioso o el musculoesquelético. En general, chitosano se cargó con suspensiones celulares en un medio ácido/acuoso, y la mezcla resultante se añadió a una solución de tripentafosfatos pentadisódicos tamponada para formar las cuentas y cápsulas de células cargadas con chitosano. El atropamiento de las células nerviosas dentro de cuentas de chitosano convertidas en gel con polifosfatos ha provocado una buena disponibilidad celular pero una tasa baja de proliferación (Zielinski B.A. y cols. (1994) Biomaterials, 15(13):1049-1056). No se propusieron materiales grandes o específicos con forma tridimensional (Zielinski B.A. y cols. (1994) Biomaterials, 15(13):1049-1056). Asimismo, se ha propuesto el uso de cápsulas de polisacárido para atrapar células fisiológicamente activas corno los islotes de Langerhans (Patente de los EE.UU. N° 4.391.909). Por último, se formó una retícula de chitosanolclorhidrato de ciisplatino y se propuso como sistema de administración de fármacos.
Los derivados de chitosano se han incorporado en varias composiciones de vehículos o formulaciones de fármacos. También se han propuesto materiales con chitosano usados para el relleno de heridas o para productos anticonceptivos (Patentes de los EE.UU. N° 4.956.350 y 4.474.769). De nuevo, se han descrito los geles de chitosano como soporte para biomateriales vivos para inmovilización y encapsulación, como células, bacterias y hongos (Patente de los EE.UU. N° 4.647.536). Los sistemas de administración de fármacos para oftalmología elaborados con chitosano también se han propuesto para la gelificación y formación in situ (Patente de los EE.UU. N° 5.422.116).
En la Patente de los EE.UU. N° 4.659.700, se prepararon geles de chitosano a partir de sistemas de glicerollácido/agua como vehículos biodegradables para la administración de fármacos. Se ha descrito que los geles de chitosano resultantes se mantienen bastante estables, manteniendo intacta su forma tridimensional durante largos periodos y en una amplia gama de temperaturas, en particular entre 4°C y 40°C. Los geles y materiales similares se procesaron disolviendo un 1,0% a un 4,0% p/v de chitosano dentro de soluciones de ácido-agua-glicerol en las que se usaron preferentemente ácido acético, fórmico o propiónico, usándose preferentemente proporciones de un 10%-90% de glicerol, neutralizando posteriormente con bases líquidas como hidróxido sódico, amónico y potásico o vapores de amoniaco. El pH de los materiales de gel chitosano-glicerol resultante tiene un pH en tomo a 7,0. Después de la neutralización, la mezcla resultante se vuelve gel tras reposar, siendo estos geles aparentemente el resultado de la interacción de chitosano, glicerol y agua. No se ha descrito que quede glicerol o agua libres de forma evidente. No obstante, obsérvese que estos geles de forma tridimensional de chitosano-glicerol sólo se producirán cuando la solución se haya neutralizado previamente con una base. Un gel tridimensional de una pieza se puede moldear fácilmente, así como en membranas de tipo gel. Quedan por establecerse la función del componente glicerol y las interacciones chitosano-glicerol.
También se ha propuesto en la Patente de los EE.UU. N° 5.587.175 el uso de geles formados in situ con polisacáridos iónicos. Se puede usar una composición como dispositivo médico para la administración de fármacos, la aplicación de un agente diagnóstico o la prevención de las adherencias en el postoperatorio, y está compuesta por un vehículo líquido acuoso que es capaz de formar el gel in situ. Incluye al menos un polisacárido fónico, al menos un polímero formador de película y un medicamento o producto farmacéutico, agua, y opcionalmente, un contraión capaz de gelificar el polisacárido fónico (Patente de los EE.UU. N° 5.587.175). Sin embargo, la formación del gel se consigue por la interacción entre el polisacárido fónico y el polímero formador de película, o por la reticulación del polisacárido fónico inducida por el contraión. Otras mezclas formadoras de geles in situ se basan en una composición de polioxialquileno (Patente de los EE.UU. N° 4.185.618) o una mezcla de polioxialquileno/pollisacárido (Patente de los EE.UU. N° 5.126.141) o una mezcla de alginato/catión in situ (Patentes de los EE.UU. N° 4.185.618 y 5.266.326).
Sería muy deseable disponer de un gel polisacárido dependiente del pH y controlado por la temperatura que se pudiera usar para encapsular las células y materiales celulares a la vez que conservan su actividad biológica.
Sería muy deseable disponer de un gel polisacárido de este tipo que mantuviera su estado sólido o en gel a una temperatura fisiológica de 37°C.
Resumen de la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un gel polisacárido dependiente del pH y controlado por la temperatura que pueda usarse para encapsular células y material celular a la vez que conservan su actividad biológica.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un gel polisacárido que retenga su estado sólido o en gel a una temperatura fisiológica de 37°C.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para la preparación de dicho gel polisacárido.
De acuerdo con la presente invención se proporciona un gel basado en un polisacárido que contiene:
a) un 0,1 a 5,0% en peso de chitosano o un derivado de chitosano; y
b) un 1,0 a 20% en peso de una sal de polialcohol o azúcar que se selecciona entre el grupo formado por una sal de monofosfato dibásico, sal de monosulfato y una sal del ácido monocarboxílico de polialcohol o azúcar;
en el cual dicho gel se induje y mantiene estable dentro de un intervalo de temperatura entre 20 a 70°C y se adapta para formarse o convertirse en gel in situ dentro de un tejido, órgano o cavidad de un animal o el hombre.
La sal puede ser cualquiera de las siguientes o en cualquiera de las siguientes combinaciones:
a) Una sal de monofosfato dibásico que se selecciona entre el grupo formado por glicerol, que incluye sales glicerol-2-fosfato, sn-glicerol 3-fosfato y L-glicerol-3-fosfato;
b) una sal de monofosfato dibásico y dicho polialcohol que se selecciona entre el grupo formado por histidinol, acetol, dietilestilbestrol, indol-glicerol, sorbitol, ribitol, xilitol, arabinitol, eritritol, inositol, manitol, glucitol y una mezcla de los mismos;
c) una sal de monofosfato dibásico y dicho azúcar que se selecciona entre el grupo formado por fructosa, galactosa, ribosa, glucosa, xilosa, ramnulosa, sorbosa, eritrulosa, desoxi-ribosa, cetosa, manosa, arabinosa, fuculosa, fructopiranosa, cetoglucosa, sedoheptulosa, trehalosa, tagatosa, sacarosa, alosa, treosa, xilulosa, hexosa, metiltio-ribosa, metiltio-desoxi-ribulosa, y una mezcla de los mismos;
d) una sal de monofosfato dibásico y dicho polialcohol que se selecciona entre el grupo formado por palmitoil-glicerol, linoleoil-glicerol, oleoil-glicerol, arachidonoil-glicerol, y una mezcla de los mismos; y
e) una sal glicerofosfato que se selecciona entre el grupo formado por glicerofosfato disódico, glicerofosfato dipotásico, glicerofosfato cálcico, glicerofosfato de bario y glicerofosfato de estroncio.
Un gel preferido de, acuerdo con una realización de la presente invención que se selecciona entre el grupo formado por chitosano-\beta-glicerofosfato, chitosano-\alpha-glicerofosfato, chitosano-glucosa-1-glicerofosfato, y chitosano-fructosa-6-glicerofosfato.
Dentro de dicho gel polisacárido se pueden incorporar aditivos en partículas sólidas o hidrosolubles antes de la formación del gel.
Los fármacos, polipéptidos o productos farmacéuticos no vivos pueden incorporarse dentro de dicho gel polisacárido antes de la formación del gel.
Los microorganismos y células vegetales, animales y humanas vivos también se pueden encapsular dentro de dicho gel polisacárido antes de la formación del gel.
El gel se puede formar in situ en los territorios subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular o dentro de tejido conjuntivo biológico, defectos óseos, fracturas, cavidades articulares, conductos o cavidades corporales, fondos de saco oculares o tumores sólidos.
El gel de la presente invención puede usarse como vehículo para administrar productos farmacéuticos in situ.
De acuerdo con la presente invención también se proporciona un método para producir una solución de gel polisacárido de la presente invención que consiste en los pasos de:
a) disolver un chitosano o un derivado de chitosano dentro de una solución acuosa de un ácido con un pH aproximadamente de 2,0 a 5,0 para obtener una composición acuosa de polisacárido que tiene una concentración de un 0,1% a un 5,0% en peso de un chitosano o de un derivado de chitosano;
b) disolver un 1,0% a un 20% en peso de una sal de polialcohol o azúcar, en el cual dicha sal se selecciona entre el grupo formado por sal de monofosfato dibásico, sal de monosulfato y una sal del ácido monocarboxílico, en dicha composición acuosa de polisacárido del paso a) para obtener una solución de gel polisacárido, en la cual dicto gel polisacárido tiene una concentración de un 0,1% a un 5,0% en peso de chitosano o un derivado de chitosano, y una concentración de un 1,0% a un 20% en peso de una sal de un polialcohol o azúcar, y un pH aproximadamente de 6,4 a 7,4.
Este método puede contener, además, un paso c) después de un paso b),
c) calentando dicha solución de gel polisacárido a una temperatura de solidificación que varía entre 20°C y 80°C hasta la formación de un gel polisacárido.
a la solución de gel polisacárido obtenida en un paso b) se puede añadir un producto farmacéutico.
El método puede contener además un paso i) después de un paso b), i) dispensar para la formación del gel la solución de gel polisacárido dentro de un receptor deseado, ya sea en un molde o dentro de un tejido, órgano o cavidad corporal.
La solución acuosa de un ácido puede prepararse a partir de ácidos orgánicos o inorgánicos que se seleccionan entre el grupo formado por ácido acético, ácido ascórbico, ácido salicílico, ácido fosfórico, ácido clorhídrico, ácido propiónico, ácido fórmico, y una mezcla de los mismos.
La solución de gel polisacárido puede mantenerse en una forma estable líquida no gelificada a una temperatura que varía aproximadamente de 0°C a aproximadamente 20°C.
La temperatura de solidificación varía aproximadamente de 37°C a aproximadamente 60°C, preferiblemente en tomo a 37°C.
El peso molecular de chitosano varía aproximadamente de 10.000 a 2.000.000.
El gel polisacárido puede hacerse térmicamente irreversible o térmicamente reversible ajustando el pH del gel polisacárido, de forma que el pH de dicha solución de gel polisacárido sea >6,9 que el pH de dicha solución de gel polisacárido sea <6,9.
Pueden añadirse a la solución de gel polisacárido obtenida en un paso b) aditivos de partículas sólidas.
La solución de gel polisacárido puede introducirse dentro de un cuerpo animal o humano por inyección o administración endoscópica, y forma el gel in situ a una temperatura de aproximadamente 37°C.
De acuerdo con la presente invención también se proporciona el uso de un gel polisacárido para producir materiales degradables biocompatibles para el uso en cosméticos, farmacología, medicina y/o cirugía.
El gel puede incorporarse solo o formando parte de dispositivos implantables o implantes para usarlo en la reparación, reconstrucción o sustitución de tejidos u órganos, ya sea en animales o en el hombre.
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El gel puede usarse solo o formando parte de sistemas de administración de fármacos implantables, transdérmicos o dermatológicos.
El gel puede usarse solo o formando parte de implantes oftalmológicos o sistemas de administración de fármacos.
El gel puede usarse para producir matrices artificiales con células para la aplicación a materiales de ingeniería y cultivo de materiales híbridos de bioingeniería y equivalentes de tejidos.
Las células cargadas pueden seleccionarse entre el grupo formado por condrocitos (cartílago articular), fibrocondrocitos (menisco), fibroblastos ligamentosos (ligamento), fibroblastos cutáneos (piel), tenocitos (tendones), miofibroblastos (músculo), células germinales mesenquimatosas y queratinocitos (piel).
Las células cargadas de gel y los productos derivados se destinan al cultivo y diseño de ingeniería de cartílago articular artificial y tejidos y órganos cartilaginosos, tanto para aplicaciones quirúrgicas como de estudios de laboratorio.
Las células cargadas de gel y productos derivados se destinan al procesamiento y diseño de ingeniería de sustitutos artificiales vivos de ligamentos, tendones, piel, hueso, músculos y cualquier órgano metabólico, ya sea para aplicaciones en cirugía o para estudios de laboratorio.
Las células cargadas de gel y productos derivados son para la aplicación como sustitutos vivos para la sustitución de cartílagos articulares, fibrocartílagos, órganos cartilaginosos, ligamentos, tendones, tejidos óseos o piel.
Las células cargadas de hidrogel son para la formación del gel in situ para inducir la formación ectópica de tejidos similares al fibrocartílago o cartílago.
De acuerdo con la presente invención también se proporciona el uso de gel polisacárido cargado para la aplicación como biomateriales inyectables o implantables que actúan como soporte, vehículo, dispositivos para reconstrucción o sustitutos para la formación in situ de tejidos similares a hueso, fibrocartílago o cartílago en una localización fisiológica de un animal o del hombre.
La solución de gel polisacárido puede usarse para producir un gel derivado o hidrogel al 1) incorporar y disolver al menos un polímero complementario dentro de dicha solución de gel polisacárido, y 2) permitiendo que dicho polisacárido y polímero complementario interaccionen durante un periodo de tiempo suficiente para volverse en un gel tridimensional transparente dentro de un intervalo de temperatura entre 20°C y 60°C.
El polímero complementario es un polisacárido hidrosoluble no iónico o una celulosa hidroxialquilo.
Para los fines de la presente invención se definen a continuación los siguientes términos y expresiones.
El término "solución de gel polisacárido" tiene como objetivo referirse a una solución de polisacárido en una forma líquida estable no gelificada a una temperatura que varía aproximadamente de 0°C a aproximadamente 15°C que puede convertirse en gel o cambiarse a un estado de gel cuando se calienta a la temperatura de gelificación.
El término "la temperatura de gelificación" tiene como objetivo referirse a cualquier temperatura que varía aproximadamente de 20°C a aproximadamente 80°C, preferiblemente entre 37°C a aproximadamente 60°C, y más preferiblemente a una temperatura fisiológica de 37°C.
La expresión "sales de polialcoholes o azúcares" tiene como objetivo referirse a sales monofosfato dibásico; sales monosulfato y sales del ácido monocarboxílico de polialcoholes o azúcares.
La presente invención incluye un método para formar diferentes materiales de gel, siendo esos materiales moldeados (adaptados a las formas necesarias en cada caso, en tubos, membranas, películas...) o destinados para formarse in situ dentro de un entorno biológico (llenado de defectos de tejidos).
En una realización preferida, la solución acuosa de chitosano/fosfato orgánico tiene un pH por encima del pKa de chitosano y se vuelve en un gel sólido tras la estimulación térmica. Este gel polisacárido puede usarse como un vehículo para fármacos o sistemas de administración de productos terapéuticos no vivos, como materiales de sustitución para tejidos y órganos y como producto encapsulante para células o microorganismos vivos. Las matrices de gel chitosano/fosfato orgánico se forman rápidamente en temperaturas entre 30°C y 60°C. Los sistemas acuosos chitosano/fosfato orgánico son para usarse como materiales de relleno inyectables, para inyección y para la formación del gel in situ para el relleno y reparación de defectos de tejidos.
Las sales formadas a base de glicerol-2-fosfato, glicerol-3-fosfato y glucosa-1-fosfato son las sales reveladas preferidas de acuerdo con la presente invención.
Los geles de chitosano/polialcohol- o azúcar-fosfato y chitosano/polialcohol- o azúcar-sulfato se pueden aplicar en la cirugía reconstructiva, para regeneración y para administración de fármacos. Proporcionan geles poliméricos bioerosionables térmicamente reversibles o con componentes biológicamente bien conocidos y compatibles para una amplia variedad de aplicaciones médicas y biotecnológicas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra la ocurrencia de la transición sol a gel (formación del gel) controlada por la temperatura dependiente del pH de la solución acuosa de chitosano/glicerofosfato caracterizada por la concentración de chitosano (% en peso), la concentración de glicerofosfato (% en peso) y el pH de la solución acuosa de chitosano/glicerofosfato; la Figura 2 ilustra el diagrama Sol/Gel de los sistemas chitosano/glicenofosfato presentados como una relación entre el contenido molar de glicerofosfato y la relación del contenido molar de glicerofosfato y el contenido molar de unidades de glucosamina;
La Figura 3 ilustra la transición de Sol a Gel (formación del gel) inducida por calor y seguida frente a la temperatura por la medición reológica del módulo y los parámetros de viscosidad;
La Figura 4 ilustra las microestructuras de los geles de chitosano/glicerofosfato formados in vitro tal como se ven con el microscopio electrónico de barrido en las muestras de gel que se han liofilizado a -30°C durante 8 horas; y la Figura 5 ilustra las soluciones de chitosano/glicerofosfato que se inyectan en conejos por vía subcutánea e intraarticular en las patas o por vía subcutánea en el torso, dejadas gelificar in situ a temperatura corporal.
Descripción detallada de la invención
Chitosano se disuelve en soluciones acuosas de ácido para obtener soluciones acuosas transparentes de chitosano que tienen un pH dentro de un intervalo de 4,3 a 5,6. Las soluciones de chitosano se pueden esterilizar por filtración o en autoclave de vapor y se guardan a una temperatura positiva baja (4°C). El componente fosfato orgánico se añade a la solución de chitosano, preferiblemente a una temperatura positiva baja (4°C), y después la mezcla acuosa de chitosano/fosfato orgánico se convierte en gel por el efecto térmico, por un mecanismo endotérmico, dentro de un intervalo de temperatura entre 30°C y 60°C. Una vez formados, los geles resultantes de chitosano/fosfato orgánico son térmicamente estables cuando se calientan hasta 180°C (en autoclave), en particular en un medio de cultivo celular. La bioencapsulación dentro de un gel de chitosano/fosfato orgánico se obtiene incorporando las células vivas dentro de una solución acuosa de chitosano/fosfato orgánico a una temperatura baja (4°C) antes de que gelifique. Y después se eleva la temperatura de la mezcla resultante de chitosano/fosfato orgánico/células y se mantiene a 37°C, donde la formación del gel se produce en 1 hora aprox. Los sulfatos orgánicos o sales del ácido monocarboxílico de polialcoholes o azúcares tienen una función similar que los fosfatos orgánicos.
Chitosano y sus derivados son materiales relativamente baratos y están comercializados, representando un grupo atractivo de polímeros biocompatibles y degradables. Tienen propiedades en sólido o en solución que se pueden modificar cambiando su composición química o características fisicoquímicas. Se ha demostrado que el grado de desacetilación y el peso molecular influyen en gran medida en las propiedades de la solución, su capacidad de degradación enzimática y en su actividad biológica. Por ejemplo, se han propuesto modificaciones químicas para neutralizar o modificar las cadenas de chitosano incorporando ácido carboxílico, acetato, ácido glutámico o grupos carboximetilo o sulfato. La reticulación química (anhídrido, glutaraldehído, glutamato succinamida-PEG...) de las macromoléculas de chitosano inducen los enlaces covalentes para crear redes ramificadas o injertadas.
La formación del gel de chitosano y sus derivados por métodos físicos se puede obtener con distintas técnicas:
a) la neutralización (NaOH, KOH, NH_{4}OH...), que induce la formación de enlaces hidrógeno entre las cadenas de chitosano;
b) la formación de complejos iónicos con aniones divalentes (borato, molibdato, polifosfato, sales sulfato y macromoléculas sulfatadas....) que induce interacciones electrostáticas puras;
c) la formación de complejos con surfactantes aniónicos (sulfato sódico alquilo...) que induce interacciones electrostáticas y e interacciones hidrofóbicas surfactante-surfactante.
De acuerdo con la presente invención se propone un nuevo mecanismo para la formación del gel que combina la formación de enlaces hidrógeno, interacciones electrostáticas e interacciones hidrofóbicas chitosano-chitosano. Sólo se puede conseguir a través de interacciones complejas entre las macromoléculas de chitosano, las moléculas de agua y las sales monofosfato dibásicas de polialcoholes o azúcares.
Se añaden frecuentemente polialcoholes a las composiciones para mejorar las propiedades del gel. Actualmente se usan sorbitol y manitol como agentes potenciadores de la tonicidad. Se propone el uso de glicerol y polietilenglicol como plastificantes. Los polialcoholes (-ol: glicerol, sorbitol...) y azúcares (-osa: fructosa, glucosa: galactosa...) se usaron como agentes termoestabilizantes para proteínas en solución (Back J.F. y cols. (1979) Biochemistry, 18(23):5191-5196). Dependiendo de las moléculas seleccionadas, se encontró que construían o rompían la estructura acuosa, creando la formación de enlaces hidrógeno, interacciones electrostáticas o hidrofóbicas y transiciones endotérmicas presentes (Back J. F. y cols. (1979) Biochemistry, 18 (23):5191-5196). Los polialcoholes y azúcares estabilizan las proteínas frente a la desnaturalización por calor a través de su efecto estructurante y el refuerzo de las interacciones hidrofóbicas.
La sal beta-glicerofosfato disódico o la sal cálcica, o la sal glicerol-2-fosfato disódico o la sal cálcica son moléculas bien estudiadas en biología. Se considera como un sustrato de la fosfatasa alcalina (AL). Glicerofosfato es muy usado como suplemento en los medios de cultivo celulares para cultivo de células aisladas de tejidos muisculoesqueléticos y se ha demostrado que induce o mantiene la síntesis de los componentes específicos de la matriz cuando se administra a las células de hueso o cartílago en el cultivo (Chung C.-H. y cols. (1992) Calcif. Tissue Int., 51:305-311; Bellows C.G. y cols. (1992) Bone and Mineral, 17: 15-29). La formación del gel de chitosano ocurrirá con glicerofosfato de cualquier grado o pureza mientras que la encapsulación de productos biológicos vivos requerirá un glicerofosfato comprobado en cultivos celulares. El alfa-glicerofosfato disódico o su sal cálcica, o el glicerol 3- fosfato disódico o su sal cálcica, también es una sal orgánica de importancia biológica (Chung C.-H. y cols. (1992) Calcif. Tissue int., 51:305-311). Las sales glicerofosfato precipitan a partir de ácidos glicerofosfóricos que se obtienen por hidrólisis de lecitina, una molécula biológica bien conocida, y los fosfátidos de huevos, soja y pescado. Los ácidos glicerofosfóricos se encuentran en dos estructuras isoméricas, alfa y beta, en las cuales el ácido glicerofosfórico beta es óptimamente inactivo y el ácido glicerofosfórico alfa es óptimamente activo. El ácido glicerofosfórico es un compuesto fisiológicamente activo que está implicado en el catabolismo de los hidratos de carbono. También se encontró que la glicerofosfato deshidrogenasa tenía actividad en los tejidos nerviosos, mientras que se ha descrito que el glicerofosfato acelera la velocidad de eliminación del azul de metileno en los nervios del cobaya. Las interacciones del ácido alfa-glicerofosfórico con el ácido pirúvico mediante reacciones de oxidación-reducción producen ácido láctico en extractos de músculo fresco. Actualmente, el ácido glicerofosfórico se encuentra en forma de sales disódicas, cálcicas, magnésicas, dipotásicas, de estroncio y de bario, que tienen una carácter básico relativamente fuerte. Ambas sales alfa- y beta- de glicerofosfatos son fuentes baratas y fácilmente accesibles de sales orgánicas de monofosfatos dibásicos entre las sales fosfato de polialcohol o azúcar.
La solubilización de chitosano en soluciones acuosas requiere la protonización de los grupos amino de las cadenas de chitosano que reaccionan dentro de las soluciones acuosas de ácido que tienen un pH que varía entre 3,0 a 5,0. Cuando se solubiliza, chitosano se mantiene soluble hasta un pH aproximado de 6,2. La neutralización de las soluciones ácidas de chitosano con bases da lugar a un incremento del pH, así como de la protonización de los grupos amina. La neutralización de las soluciones ácidas de chitosano hasta un pH por encima del pKa de chitosano hasta aproximadamente 6,3-6,4 da lugar a la formación de intercadenas OH-HN y O-HN y enlaces de hidrógeno agua-chitosano que inducen una red tridimensional hidratada, un gel de chitosano. Con un pH por encima de 6,3-6,4, las soluciones de chitosano dan lugar sistemáticamente a geles de chitosano en un intervalo de temperatura normal (0-60°C). No obstante„ la mezcla de un fosfato orgánico con soluciones acuosas de chitosano aumenta el pH de las soluciones de chitosano/fosfato orgánico que se mantienen sin formar el gel y líquidas durante largos periodos de tiempo incluso a un pH por encima de 6,5, y hasta 7,2. Estas soluciones acuosas de chitosano/fosfato orgánico ahora neutras (pH 6,5-7,2) gelificarán cuando se estimulen a la temperatura adecuada. Por ejemplo, una solución de chitosano/fosfato orgánico que gelifica aproximadamente en 30 minutos a 37°C, necesita sólo unos 2 minutos a 60°C para formar un gel.
Se espera que el mecanismo de la formación del gel y sus características sean similares en todos los sistemas chitosano/ fosfato orgánico. Por tanto, la formación del gel de soluciones chitosano/\beta-glicerofosfato que se ha investigado con más detalle se consideran el ejemplo típico. Los resultados que indican la dependencia del pH y de la temperatura para la formación del gel con las soluciones de chitosano/\beta-glicerofosfato se resumen en los diagramas de sol-gel que se muestran en las Figuras 1 y 2. Además de la resistencia del gel, los experimentos reológicos representados en la Figura 3 muestran sin lugar a dudas que la formación del gel de soluciones chitosano/\beta-glicerofosfato se produce con calentamiento. Los cambios en el módulo que aparecen aproximadamente a 60°C son sintomáticos de la transición Sol a Gel y de la formación del gel. Esta temperatura para la formación del gel dependerá de las características de la solución y la velocidad de calentamiento (energía de activación requerida).
La estructura porosa de los geles de chitosano/\beta-glicerofosfato se ha demostrado por microscopio de barrido electrónico, como se muestra en la Figura 4. Los geles tienen una microestructura típica con cámaras en torno a 100 micras y poros en tomo a 10 micras. Su microestructura difiere de la observada en los geles de chitosano procesados por la neutralización simple en el cual había una arquitectura lamelar.
Otra característica importante se relaciona con la capacidad para inyectarlo y la formación in vivo de las soluciones del gel de chitosano/\beta-glicerofosfato. Las inyecciones y geles habituales se muestran en las Figuras 5A y 5B. La flecha negra de la Figura 5A muestra el gel formado in situ en la zona intraarticular de la rodilla entre el ligamento colateral y el tendón rotuliano. El otro gel se forma por vía subcutánea entre la piel y los músculos de la pata. La flecha negra de la Figura 5B muestra los geles formados por vía subcutánea in situ en la región del torso.
En los geles de chitosanolfosfato orgánico, los aniones de fosfato orgánico contribuyen a la reticulación de las cadenas macromoleculares de chitosano pero no en la misma forma que la reticulación iónica pura que se produce durante la formación del gel de chitosano con aniones divalentes inorgánicos como sulfato, oxalato, fosfato o polifosfato (pirofosfatos, metafosfatos o tripolifosfatos). Una solución acuosa de chitosano se vuelve gel instantáneamente en presencia de aniones inorgánicos divalentes e independientemente del pH de la solución. Además, la elevación de la temperatura constituye un factor desfavorable para la formación del gel en esta clase de sistemas. Por el contrario, la formación del gel con la solución de chitosano/fosfato orgánico depende de ambos, del pH final de la solución de chitosano/fosfato orgánico y de la temperatura. Una solución de chitosano/fosfato orgánico no puede formar el gel a cualquier temperatura mientras el pH se mantenga por debajo de 6,45, y tampoco se puede preparar una solución de chitosano/fosfato orgánico con un pH por encima de 6,45 a 20°C, sin que se forme inmediatamente el gel, ni almacenarse durante un tiempo mayor de 4°C sin que gelifique. A 37°C sólo la solución de chitosano/fosfato orgánicos con un pH por encima de 6,9 puede formar el gel más o menos rápidamente. Se cree que la presencia de moléculas de fosfato orgánico en las soluciones de chitosano afecta directamente a las interacciones electrostáticas, las interacciones hidrofóbicas y los enlaces de hidrógeno de las cadenas de chitosano. Por tanto, las principales interacciones implicadas en la formación de geles chitosano/fosfato orgánico se hacen esenciales: 1) formación de enlaces hidrógeno entre cadenas de chitosanolchitosano (CHITOSANO-CHITOSANO); 2) atracciones electrostáticas entre los grupos amonio de las cadenas macromoleculares de chitosano/fosfato orgánico y el grupo fosfato de las moléculas del fosfato orgánico (CHITOSANO-FOSFATO); 3) interacciones hidrofóbicas chitosano-chitosano inducidas por la acción de los componentes polialcohol o azúcar en las moléculas de agua. La acción estructurante de los componentes polialcohol en agua reduce las interacciones chitosano-agua y, por tanto, mejora las interacciones chitosano-chitosano. El aspecto no trivial de esta gelificación se origina esencialmente en estas últimas atracciones hidrológicas de chitosano inducidas por la mezcla polialcohol-agua que se potencian cuando aumenta la temperatura (formación del gel controlada por la temperatura). A unas temperaturas bajas, las fuertes interacciones chitosano-agua protegen a las macromoléculas de chitosano hidratadas para que no agreguen. La extracción al calentar de la vaina de las moléculas de agua favorece y refuerza las interacciones chitosano-chitosano, y por tanto induce la asociación de las macromoléculas. No obstante, la formación del gel nunca se producirá si las dos primeras atracciones (CHITOSANO-CHITOSANO Y CHITOSANO-FOSFATO) son plenamente inoperantes dentro de la solución de chitosanolfosfato orgánico, lo que explica la dependencia del pH que aún gobierna la formación del gel de sistemas de chitosano/fosfato orgánico controlada por la temperatura. Aunque estén presentes estas atracciones electrostáticas de CHITOSANO-FOSFATO, los grupos fosfato no pueden ser el único agente reticulante de las cadenas de chitosano debido al obstáculo que suponen las moléculas de esteárico no compatibles. Esta es la diferencia significativa entre este mecanismo para la formación del gel con la formación del gel de chitosano iónica pura por aniones divalentes fosfatos o polifosfatos. Una reticulación iónica pura no estará controlada ni estimulada por la temperatura.
Este tipo de formación del gel dependiente del pH y controlado por la temperatura se induce específicamente por la sal orgánica monofosfato dibásico en la solución de chitosano, aunque puede inducirse también por otras sales orgánicas como sales monosulfato de polialcoholes o azúcares; como polialcohol-sulfato o azúcar-sulfato, o sales del ácido monocarboxílico de polialcoholes o azúcares. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, se espera que una solución de chitosano/glucosa-1-sulfato gelifique igual que una solución de chitosano/glucosa-1 fosfato.
También es un objeto de la presente invención proporcionar una solución acuosa de chitosano/fosfato orgánico que pueda formarse y almacenarse a una temperatura baja (4°C) y transformarse a una temperatura fisiológica en un gel orgánico tridimensional estable de chitosano/fosfato orgánico. Incluye los componentes biocompatibles no tóxicos de entomos de mamíferos o el hombre con ambos componentes y procesos que tienen unos efectos bajos de toxicidad sobre los productos vivos conservando la viabilidad celular. El gel también proporciona buenos rendimientos mecánicos y de manejo durante largos periodos de tiempo a una temperatura fisiológica y en un medio acuoso fisiológico que contenga aminoácidos, iones y proteínas. Se pueden seleccionar también derivados de chitosano para procesar geles de chitosano/fosfato orgánico y contienen N,O-sustitutos de chitosano.
La expresión "fosfatos orgánicos (sal)" se refiere en este documento, sin limitaciones, a sales monofosfato dibásico de polialcoholes o azúcares, como sales polialcohol-fosfato dibásico o sales azúcar-fosfato dibásic. Los sulfatos orgánicos (sal) también se denominan en este documento sales monosulfato de polialcoholes o azúcares, como polialcohol-sales sulfato o azúcar-sales sulfato. Las sales fosfato orgánico preferido pueden ser las que se seleccionan entre sales monofosfato dibásico de glicerol, como las sales glicerol 2-fosfato, sn-glicerol 3 -fosfato y 1-glicerol-3-fosfato (alfa-glicerofosfato o beta-glicerofosfato), sales monofosfato dibásico de histidinol, acetol, dietilestilbestrol, indolglicerol, sorbitol, ribitol, xilitol, arabinitol, eritritol, inositol, manitol, glucitol, palmitoil-glicerol, linoleoil-glicerol, oleoil-glicerol o arachidonoil glicerol, y sales monofosfato dibásico de fructosa, galactosa, ribosa, glucosa, xilosa, ramnulosa, sorbosa, eritrulosa, desoxi-ribosa, cetosa, manosa, arabinosa, fuculosa, fructopiranosa, cetoglucosa, sedoheptulosa, trehalosa, tagatosa, sacarosa, alosa, treosa, xilulosa, hexosa, metiltio-ribosa o metiltio-desoxi-ribulosa. Otras sales mono de interés (sulfato, carboxilato) puede derivarse de los mismos polialcoholes o azúcares.
La expresión "glicerofosfato o glicerofosfato" se refiere en este documento a los isómeros alfa-glicerofosfato o beta-glicerofosfato. El alfa-glicerofosfato se denomina indistintamente como glicerol-3-fosfato (todos los enantiómeros ópticos), mientras que el beta-glicerofosfato se denomina también glicerol-2-fosfato.
La expresión "tridimensional" se refiere en este documento al hecho de que las soluciones poliméricas pueden ser simultáneamente un gel o convertirse en gel y moldearse con un molde en el cual la solución se ha vertido previamente. Los geles se pueden producir en vasos, platos o tubos de plástico o entre dos placas para obtener cualquiera de las formas esperadas.
La expresión "formación del gel in situ" se refiere en este documento a la formación de geles de chitosano/fosfato orgánico por inyección de la solución líquida de chitosano/glicerofosfato dentro de localizaciones específicas de mamíferos o el hombre, por ejemplo, cualquier tejido (músculos, hueso, ligamentos, cartílagos) y órganos. La formación del gel in situ permite llenar de forma completa y precisa los defectos de tejidos o cavidades corporales. La formación del gel de la mezcla chitosano/fosfato orgánico se induce con una temperatura fisiológica.
La expresión "formación endotérmica del gel" se refiere en este documento al mecanismo térmico de la solución de chitosano/fosfato orgánico que permite que la solución gelifique cuando reposa a la temperatura deseada. La inducción de las transiciones de sol a gel de los sistemas de chitosano/fosfato orgánico requiere energía, por ejemplo, mediante la temperatura.
La expresión "células o partículas celulares" se refiere en este documento a elementos biológicos vivos como células aisladas, dispersiones celulares, agregados celulares, esferoides celulares o células adheridas a microesferas sólidas, que se encapsulan dentro de geles chitosano/fosfato orgánico.
La expresión "formación in situ" se refiere en este documento al procedimiento de administración la solución líquida no gelificada de chitosano/fosfato orgánico en una localización corporal (p. ej., tejidos conjuntivos, conductos corporales, cavidades articulares, fracturas, defectos óseos...), e inducción y garantía dentro de esa zona corporal de la formación completa del gel con la solución de polisacárido a una temperatura fisiológica.
La formación de geles de chitosano/fosfato orgánico
La sal de fosfato orgánico seleccionada fue en este caso glicerofosfato, pero se alcanzaron resultados similares con otras sales de monofosfato dibásicos de polialcoholes o azúcares. Chitosano en su forma en polvo se disuelve en una solución acuosa de un ácido hasta la aparición de una solución transparente. La proporción de chitosano varía entre un 0,5% y un 5,0% p/v, preferentemente entre un 1,0% y un 3,0% p/v. El pH de la solución acuosa de chitosano oscila entre 4,5 y 5,5. Las soluciones acuosas de chitosano se pueden esterilizar por filtración con filtros estériles en línea (0,22 micrometros) o por autoclavado con vapor (120°C). La esterilización de los geles de chitosano/glicerofosfato no se pueden filtrar debido a su viscosidad, ni se pueden autodavar con vapor debido a su sensibilidad térmica, pero se puede efectuar por irradiación gamma o siguiendo procedimientos estrictamente estériles. Las soluciones acuosas de chitosano recién preparadas se almacenan preferiblemente a una temperatura positiva baja (4°C). El glicerofosfato en forma de polvo fino se añade a una solución acuosa de chitosano a una temperatura que varía entre 4 y 15°C, preferentemente 10°C, y se disuelve. Cuando se obtiene una solución acuosa transparente homogénea de chitosano/glicerofosfato con un pH que varía entre 6,5 y 7,2, dicha solución se vierte en el receptor deseado y se mantiene en la temperatura apropiada para formar el gel. También se puede usar el glicerofosfato en solución acuosa.
Dependiendo de su pH final, se espera que las soluciones de chitosano/glicerofosfato provoquen un gel térmicamente reversible o irreversible. Los geles reversibles surgen de soluciones de chitosano/glicerofosfato que tienen un pH entre 6,5 y 6,9, mientras que los geles irreversibles se originan en soluciones de chitosano/glicerofosfato que tienen un pH por encima de 6,9. La naturaleza del ácido usado para las soluciones ácidas de chitosano no influye fundamentalmente en la transición de sol a gel del sistema de chitosano/glicerofosfato. El pH final de la solución de chitosano/glicerofosfato depende del pH de la solución de agua/ácido, así como de las concentraciones de chitosano y glicerofosfato. Como chitosano y glicerofosfato son dos componentes alcalinos, tienden a aumentar el pH de la solución ácida en la cual se disuelven. Las concentraciones de chitosano y glicerofosfato pueden equilibrarse para alcanzar el pH apropiado de la solución de chitosano/glicerofosfato, a la vez que se tiene en cuenta el límite de solubilidad de ambos componentes, y en particular el de chitosano.
Geles monolíticos tridimensionales
La sal de fosfato orgánico seleccionada en este caso fue glicerofosfato, pero se alcanzaron resultados similares con otras sales de monofosfato dibásico, sales de monosulfato o sales de monocarboxilato de polialcoholes o azúcares. El receptor o molde relleno con la solución de chitosano/glicerofosfato se calienta a una temperatura que varía entre 30 y 60°C, preferentemente 37°C. La formación del gel de solución de chitosano/glicerofosfato a 37°C se puede efectuar dentro de una incubadora normal para cultivos celulares. La solución se mantiene en la temperatura deseada hasta que se vuelve gel después de un tiempo que oscila entre algunos días y una semana (a 30°C) o algunos minutos (a 60°C). A 37°C, la formación del gel de una solución de chitosano/glicerofosfato se produce en 1 hora aproximadamente. Una vez formado el gel tridimensional de chitosano/glicerofosfato, dicho gel se desmolda y se lava con agua destilada. Los geles de chitosano/glicerofosfato se mantienen estables y conservan su forma tridimensional incluso en una temperatura alta, 120°C (en autoclave).
Formación de los geles in situ
La sal de fosfato orgánico seleccionada en este caso fue glicerofosfato, pero se alcanzaron resultados similares con otras sales de monofosfato dibásico, sales monosulfato o monocarboxilato de polialcoholes o azúcares. La formación del gel in situ de la solución de chitosano/glicerofosfato puede efectuarse dispensando la solución con una jeringa hipodérmica. Si es necesario, la solución puede pregelificar (iniciar la formación térmica del gel) manteniendo la jeringuilla y la solución de chitosano/glicerofosfato en la temperatura deseada, idealmente 37°C, hasta que aparecen los primeros signos de formación del gel. La mezcla de chitosano/glicerofosfato lista para gelificar se utiliza directamente a continuación para rellenar los defectos de tejidos o cavidades y completar in situ la formación del gel (a 37°C). La inyección de soluciones de chitosano/glicerofosfato está limitada, no obstante, por la viscosidad de las soluciones que controla la capacidad de inyección o extrusión de las soluciones. Para la inyección de esta solución de gel, el material ideal es una aguja de un calibre 20 o menor. Las cavidades corporales y los defectos de tejidos actúan como receptores de la solución, pero el material líquido se mantiene en un entorno acuoso abierto. La adaptabilidad y capacidad de difusión de las soluciones de chitosano/glicerofosfato dependen de las propiedades de la solución y del material. El aumento de viscosidad provoca la formación in situ de geles más compactos y menos adaptables.
Encapsulación de órganos biológicos vivos con geles de hitosanolglicerofosfato
La sal de fosfato orgánico seleccionada en este caso fue glicerofosfato, pero se alcanzaron resultados similares con otras sales de monofosfato dibásico, sales monosulfato o sales monocarboxilato de polialcoholes o azúcares. Las células vivas o componentes celulares se prepararon usando las técnicas actuales de cultivo celular. Las células o componentes celulares se incorporaron y homogeneizaron a temperaturas positivas bajas, que variaron entre 4°C y 20°C, idealmente 20°C, en la solución acuosa de chitosano/glicerofosfato. Las células o componentes celulares cargados en las mezclas de chitosano/glicerofosfato se vertieron en los platos o pocillos deseados y se incubaron a 37°C. A las placas o pocillos que contenían las células o componentes celulares con los materiales chitosano/glicerofosfato se añadió un medio de cultivo celular mínimo o suplementado para mantener vivos y metabólicamente activos los materiales biológicos encapsulados vivos. El medio de cultivo celular se renovó cada 2 días después de la formación de los geles de chitosano/glicerofosfato.
La viabilidad de las células dentro de la solución y el gel se reduce potentemente por una osmolaridad anormal. Los sistemas de chitosano/glicerofosfato tienen osmolaridades cambiantes, dependiendo del componente glicerofosfato iónico. Cuanto mayor es el contenido de sales glicerofosfato, mayor es la osmolaridad de la solución y mayor es el deterioro de la viabilidad celular. La osmolaridad ideal de la bioencapsulación oscila en torno a 270 a 340 mOsmol/kg. La inyección y formación in situ del gel de los materiales de chitosano/glicerofosfato cargados con células vivas o componentes celulares se evaluaron de forma similar. Las células o componentes celulares se introducen a una temperatura positiva baja dentro de soluciones acuosas de chitosano/glicerofosfato antes de la inyección y formación del gel. Existe una relación directa entre el contenido de sal glicerol-. 2-fosfato disódico y la osmolaiidad. Para reducir este tipo de problemas con la osmolaridad, el pH final de la solución de chitosano/glicerofosfato se puede ajustar al valor deseado, manteniendo a la vez el contenido de glicerofosfato en el valor más bajo posible. No obstante, debe alcanzarse el límite bajo del contenido de glicerofosfato para el procesamiento de la formación del gel dependiente del pH y controlada por la temperatura.
Uso terapéutico y otros usos de los geles que contienen chitosano
Un gel de chitosano/fosfato orgánico o sulfato orgánico, como se ha descrito anteriormente, es un material ideal para sistemas de administración de fármacos. Como un vehículo formador de gel in situ, en el cual se incorpora una partícula sólida o aditivo hidrosoluble antes de la formación del gel, se puede administrar por vía tópica, directamente en el territorio corporal que se va a tratar o diagnosticar. Dentro de la composición del gel se pueden incorporar fármacos antibacterianos, antifúngicos, antiinflamatorios no esteroideos o esteroideos, anticancerosos, antifibróticos, antivíricos, antiglaucoma, mióticos y anticolinérgicos, antipsicóticos, antihistamínicos y descongestivos, anestésicos y antiparasitarios. De forma similar, los polipéptidos o productos farmacéuticos no vivos se pueden incorporar también en la composición o gel con fines de restauración, reconstrucción o regeneración.
Los microorganismos o las células vegetales, animales o humanas vivos se pueden atrapar de forma idéntica dentro del gel de polisacáridos introduciéndolos antes de la formación del gel. Los geles cargados de células o microorganismos pueden aplicarse para biotecnología en medicina o en otras áreas industriales. Los geles de chitosano que se forma in situ pueden introducirse por vía subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o dentro de tejidos conjuntivos biológicos, defectos óseos, fracturas, cavidades articulares, conductos o cavidades corporales, fondo de saco ocular, vasculaturas de tumores sólidos, etc...
La presente invención se entenderá más fácilmente consultando los siguientes ejemplos, que se incluyen sólo para ilustrar la invención pero que no limitan su ámbito de aplicación.
Ejemplo I Formación típica del gel de un sistema chitosano/fosfato orgánico
Experimento 1
El experimento típico se realizó disolviendo 0,2 g de chitosano en 10 ml de una solución acuosa de ácido acético (0,1 M). El pH de la solución de ácido acético se había ajustado previamente a 4,0 añadiendo gotas de una solución de hidróxido potásico (1 M). La solución de chitosano al 2% (p/v) así obtenida tenía un pH en tomo a 5,6. A continuación, se añadieron 0,800 g de sal glicerofosfato disódico pentahidrato, disolviéndose en la solución de chitosano a 10°C. El pH de la mezcla homogénea de líquidos resultante cambia a 7. Esta mezcla se introdujo en un vial de centelleo de vidrio en la incubadora a 37°C durante 2 horas, tiempo suficiente para conseguir el proceso de formación del gel a granel. El gel a granel resultante se sumergió en baños renovados de agua destilada para eliminar el exceso de la sal glicerofosfato.
Se consiguió un resultado similar cuando la sal glicerofosfato disódico (o sal glicerol-2-fosfato disódico) se remplazó con la sal alfa-glicerofosfato disódico (o sal glicerol-3-fosfato disódico).
Experimento 2
Se preparó una solución homogeneizada de chitosano/glicerofosfato como en el Experimento 1 y se dispuso en un cilindro doble de gel con un sándwich de placas de gel de vidrio con espacios intermedios de 1,6 mm, y el sistema se mantuvo en un horno a 37°C. La formación de una membrana de gel se alcanzó antes de 2 horas y la membrana se desmoldó del cilindro de gel.
Experimento 3
Se dispersaron 0,110 g de silica desgasificado en forma de partículas sólidas (AEROSIL) dentro de una solución preparada disolviendo 0,200 g de chitosano en 10 ml de una solución acuosa de ácido acético. A la dispersión de chitosano-silica se añadieron 0,800 g de sal glicerofosfato disódico pentahidrato. La composición resultante se introdujo en un vial de centelleo de vidrio en un baño de agua mantenido a 37°C. La formación del gel del componente chitosano/glicerofosfato se observó dentro de las 2 horas siguientes, y gel de chitosano/glicerofosfato incluía partículas sólidas de silica dispersadas.
Experimento 4
Se disolvieron 0,200 g de chitosano en una solución de ácido acético como en el Experimento 1. Se añadieron 1,239 g de glucosa-1-fosfato, sal disódica tetrahidrato, y se disolvieron hasta alcanzar una solución transparente de chitosano/glucosa-1-fosfato. Esta solución de chitosano/glucosa-1 fosfato se introdujo en un vial de centelleo de vidrio y se mantuvo a 37°C. La transición de Sol a Gel se produce a 37°C dentro de 3 horas. El gel a granel resultante se sumergió en baños renovados de agua destilada para eliminar el exceso de la sal glucosa fosfato.
El experimento se realizó como se describe en el Experimento 4 excepto porque los 1,239 g de la sal glucosa-1-fosfato se reemplazaron por 0,100 g de una sal dihidrato disódica de fructosa-6-fosfato.
Ejemplo II Efecto de la composición en el pH de la solución y ocurrencia de la formación del gel
Se preparó una solución madre ácida con Agua/Ácido acético para todos los experimentos. El pH de esta solución madre ácida se ajustó a 4,0. Se añadió chitosano de alto peso molecular (PM 2.000.000) en polvo y se disolvió en un volumen de la solución madre de ácido para producir las soluciones de chitosano con unas proporciones de chitosano que varían entre un 0,5% a un 2,0% p/v (Tabla 1). En la Tabla 1 se indica el pH medido para las distintas muestras.
TABLA 1
Soluciones acuosas de chitosano y niveles de pH
Concentración de chitosano (plv) 0,5 1,0 1,5 2,0
pH de la solución de chitosano 4,68 4,73 5,14 5,61
Se añadió glicerofosfato a las soluciones de chitosano y se indujo el aumento de pH. La Tabla 2 muestra el efecto de la concentración de glicerofosfato en diferentes soluciones de chitosano. La concentración de glicerofosfato oscila entre 0,065 y 0,300 mol/L. Las soluciones de chitosano/glicerofosfato en viales de vidrio se mantuvieron entre 60 y 37°C, y se apreció la formación del gel a granel y uniforme antes de 30 minutos a 60°C y 6 horas a 37°C (Tabla 2 y Figura 1). Los componentes chitosano y beta-glicerofosfato influyen por separado en el aumento de pH dentro de las soluciones acuosas y, en consecuencia, influyen en la transición de Sol a Gel. Al igual que sucede con los materiales disueltos, el pH inicial de la solución madre de agua/ácido acético también influye en la transición de Sol a Gel, pero este efecto potencial parece limitarse por la acción contraria de la solubilidad de chitosano que depende del pH de la solución.
TABLA 2
1
Ejemplo III Reversibilidad térmica de la formación de los sistemas de gel de chitosanolglicerofosfato
Se preparó una primera solución de chitosano/glicerofosfato a partir de 10 ml de una solución madre de agua/ácido acético de pH 4,0 añadiendo y disolviendo 0,200 g de chitosano y 0,800 g de la sal glicerofosfato disódico pentahidrato. La solución de chitosano/glicerofosfato resultante tiene un pH en tomo a 7,05 y se calienta hasta 60°C, donde gelifica rápidamente. El gel de chitosano/glicerofosfato se enfría a una temperatura en torno a 0-4°C, pero no se observa ninguna transición con el tiempo y el gel se mantiene estable a 4°C. Este gel de chitosano/glicerofosfato es térmicamente irreversible.
Se preparó una segunda solución de chitosano/glicerofosfato a partir de 10 ml de una solución madre de agua/ácido acético de pH 4,0, añadiendo y disolviendo 0,100 g de chitosano y 0,800 g de la sal pentahidrato de glicerofosfato disódico. La solución de chitosano/glicerofosfato tiene un pH en tomo a 6,78 y se calienta a 60°C para la formación del gel. El gel de chitosano/ glicerofosfato resultante se forma y se enfría a continuación a una temperatura en tomo a 0-4°C, y se observa la transición Gel a Sol después de un periodo de tiempo. El gel vuelve a la solución líquida a temperaturas positivas bajas, por ejemplo a 4°C. Cuando esta solución es recalienta a 60°C, aparece de nuevo el mecanismo contrario (transición Sol a Gel) y se vuelve a formar el gel. La transición Sol a Gel a Sol ese reproducible entre temperaturas de 4°C y 60°C. Este gel de chitosano/glicerofosfato es térmicamente reversible. Se determina que el término reversibilidad de la transición de Sol a Gel de los sistemas chitosano/glicerofosfato depende predominantemente del pH de la solución de chitosano/glicerofosfato. En la Tabla 3 se muestra un ejemplo de los cambios de pH y la reversibilidad observada. Las observaciones experimentales efectuadas sobre sistemas chitosano/glicerofosfato han demostrado que la reversibilidad térmica del mecanismo Sol a Gel cambia con el pH de las soluciones de chitosano/glicerofosfato en las proximidades de 6,9. La formación reversible del gel de la solución de chitosano/glicerofosfato se produce cuando el pH se encuentra entre 6,5 y 6,9. Se observó un resultado muy similar con otras sales de monofosfato dibásico de polialcoholes o azúcares como sales de glucosa-1-fosfato.
TABLA 3
Efecto del pH en la reversibilidad Sol a Gel con una concentración del 2,0% piv de chitosano
Concentración de GP (mol/l) 0,130 0,163 0,196 0,260
pH de la solución de chitosano-GP 6,78 6,87 6,97 7,05
Reversibilidad de Sol a Gel a 4°C Reversible, Reversible, Irreversible Irreversible
- 60°C Ciclo Ciclo
Ejemplo IV Formación in situ del gel de materiales chitosano/glicerofosfato
Los conejos adultos New-Zealand White se anestesiaron con la administración intravenosa de pentosorbital sódico (1 ml/kg) y se mantuvieron con anestesia durante 3 horas. Después de ese tiempo, se sacrificaron con una sobredosis de anestésico y los experimentos continuaron después de la muerte. El animal se mantuvo sobre la espalda y se afeitaron las zonas localizadas de las extremidades superiores y el torso. Se practicó una incisión en la piel para liberar las membranas fibrosas subcutáneas y el músculo de la extremidad.
Las soluciones de chitosanolglicerofosfato separaron con anterioridad, se introdujeron en jeringuillas hipodérmicas y se mantuvieron a una temperatura baja (4-10°C): La solución I tenía un 2,7% p/v de chitosano de bajo PM y un 9,0% p/v de glicerofosfato, mientras que la solución II tenía un 2,5% de chitosano de bajo PM y un 9,0% p/v de glicerofosfato. Las jeringuillas se equiparon con agujas de calibre 21. Las soluciones de chitosano/glicerofosfato no se prepararon ni mantuvieron en condiciones estériles estrictas, ya que lose experimentos con animales iban a desarrollarse en un plazo de tiempo aproximado de 4-5 horas. Un volumen (a) de 1,0-1,5 ml de la solución I se inyectó por vía subcutánea dentro de una membrana fibrosa, mientras que el segundo volumen (b) de 2,0 ml de la solución I se inyectó a través de la cápsula articular de la rodilla en la cavidad articular. Un volumen (c) de 1,0 ml de la solución II se inyectó por vía subcutánea en la región del torso. Todos los lugares de inyección se recuperaron con los tejidos escindidos cuando fue necesario. Se permitió la formación del gel in situ durante un periodo de 3 horas, y después las zonas se reabrieron o escindieron y se obtuvieron los geles formados in situ.
TABLA 4
Inyecciones y formación de geles in situ
[chitosano] % p/v Volume n Observaciones
Subcutáneo, patas 2,7 1,5 El gel se expande y se adapta a la superficie
del tejido.
Intraarticular, rodilla 2,7 2,0 El gel se expande y se adapta al perfil de
volumen articular.
Subcutáneo, torso 2,5 1,0 El gel no se expande y mantiene su forma
de gota.
Ejemplo V Encapsulación de células de mamífero
Se preparó una solución acuosa de chitosano al 2,5% plv tal como se ha descrito previamente. Una cantidad de 1,98 g de la solución de chitosano se mezcló con 0,18 g de la sal beta-glicerofosfato disódico, 0,4 ml del medio F12 de Eagle modificado por Dubelcco en el cual se dispersaron los condrocitos animales, y 0,2 ml de medio F12 de Eagle modificado por Dubelcco. Los condrocitos se aislaron de las superficies del cartílago del hombro de ternera y se recogieron en cultivos imonocapa primarios. El medio F12 de Eagle modificado por Dubelcco contiene dexametasona, ácido ascórbico y un 10% de suero fetal bovino. Todas las soluciones de chitosano y de chitosanol glicerol-2-fosfato y los procedimientos seguidos fueron estériles. Una vez vaciada la dispersión de los condrocitos en chitosano/glicerol-2 fosfato, se coloca en una incubadora a 37°C hasta la formación del gel. La formación del gel de sistema chitosano/glicerol-2-fosfato se observa en unas 2 horas. Las pruebas de viabilidad de estos geles de chitosano/glicerol-2-fosfato cargados con condrocitos indican un intervalo entre el 10% y el 70% de los condrocitos vivos. La encapsulación de microorganismos, células vegetales, animales o humanas dentro de geles de chitosano/glicerol-2-fosfato puede efectuarse con propiedades cambiantes, dependiendo de la viabilidad esperada.
Si bien la invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas de la misma, se entenderá que es capaz de sufrir nuevas modificaciones y esta solicitud tiene como objetivo cubrir cualquier variación, uso o adaptación de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo estas separaciones de la presente revelación como procedentes de la práctica conocida o habitual dentro del campo al que pertenece la invención y como tal se pueden aplicar las características esenciales establecidas anteriormente en este documento, y tal como se expresa en el ámbito de las reivindicaciones anexas.

Claims (44)

1. Un gel basado en un polisacárido que contiene:
a) un 0,1 a un 5,0% en peso de chitosano o un derivado de chitosano; y
b) un 1,0 a un 20% en peso de una sal de polialcohol o azúcar que se selecciona entre el grupo formado por una sal de monofosfato dibásico, una sal de monosulfato y una sal del ácido monocarboxílico de polialcohol o azúcar; en el cual dicho gel se induce y es estable dentro de un intervalo de temperatura entre 20ºC y 70ºC y se adapta para formarse o convertirse en gel in situ dentro de un tejido, órgano o cavidad de un animal o el hombre.
2. Un gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha sal es una sal de monofosfato dibásico de glicerol, que incluye sales glicerol-2-fosfato, sn-glicerol 3-fosfato y L-glicerol-3-fosfato.
3. Un gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha sal es una sal de monofosfato dibásico y dicho polialcohol se selecciona entre el grupo formado por histidinol, acetol, dietilestilbestrol, indol-glicerol, sorbitol, ribitol, xilitol, arabinitol, eritritol, inositol, manitol, glucitol y una mezcla de los mismos.
4. Un gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha sal es una sal de monofosfato dibásico y dicho azúcar se selecciona entre el grupo formado por fructosa, galactosa, ribosa, glucosa, xilosa, ramnulosa, sorbosa, eritrulosa, desoxi-ribosa, cetosa, manosa, arabinosa, fuculosa, fructopiranosa, cetoglucosa, sedoheptulosa, trehalosa, tagatosa, sacarosa, alosa, treosa, xilulosa, hexosa, metiltio-ribosa, metiltio-desoxi-ribulosa, y una mezcla de los mismos.
5. Un gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha sal es una sal de monofosfato dibásico y dicho polialcohol se selecciona entre el grupo formado por palmitoil-glicerol, linoleoil-glicerol, oleoil-glicerol, arachidonoil- glicerol, y una mezcla de los mismos.
6. Un gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicha composición de gel se selecciona entre el grupo formado por chitosano-\beta-glicerofosfato, chitosano-\alpha-glicerofosfato, chitosano-glucosa-1-glicerofosfato, y chitosano-fructosa-6-glicerofosfato.
7. Un gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual se incorporan aditivos en partículas sólidas o hidrosolubles dentro de dicho gel polisacárido antes de la formación del gel.
8. Un gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual se incorporan fármacos, polipéptidos o productos farmacéuticos no vivos dentro de dicho gel polisacárido antes de la formación del gel.
9. Un gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual se encapsulan microorganismos vivos, células vegetales, animal o humanas dentro de dicho gel polisacárido antes de la formación del gel.
10. Un gel de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual dicho gel se forma in situ por vía subcutánea, intraperitoneal, intramuscular o dentro de tejidos conjuntivos biológicos, defectos óseos, fracturas, cavidades articulares, conductos o cavidades corporales, fondos de saco ocular o tumores sólidos.
11. Un gel de acuerdo con la reivindicación 10, en el cual dicho gel es un vehículo formado por un producto farmacéutico para administrar dicho un producto farmacéutico in situ.
12. Un método para producir una solución de gel polisacárido de acuerdo con la reivindicación 1, que consiste en los pasos de:
a) disolver un chitosano o un derivado de chitosano dentro de una solución acuosa de un ácido de un pH entre 2,0 y 5,0 para obtener una composición acuosa de polisacárido que atiene una concentración de un 0,1% a un 5,0% en peso de un chitosano o de un derivado de chitosano;
b) disolver un 1,0% a un 20% en peso de una sal de polialcohol o azúcar, en el cual dicha sal se selecciona entre el grupo formado por sal de monofosfato dibásico, sal de monosulfato y una sal del ácido monocarboxílico, en dicha composición acuosa de polisacárido obtenida en un paso a) para obtener una solución de gel polisacárido, en el cual dicho gel polisacárido tiene una concentración de 0,1 a 5,0% en peso de un chitosano o un derivado de chitosano, y una concentración de 1,0 a 20% en peso de una sal de un polialcohol o azúcar, y tiene un pH entre 6,4 a 7,4.
13. El método de la reivindicación 12, que consiste además en paso c) después de un paso b),
c) calentando dicha solución de gel polisacárido a una temperatura de solidificación que varía entre 20ºC y 80ºC hasta la formación de un gel polisacárido.
14. El método de la reivindicación 12 ó 13, en el cual se añade un producto farmacéutico a la solución de gel polisacárido obtenida en un paso b).
15. El método de la reivindicación 13 ó 14, que consiste además en un paso i) después de un paso b),
i) dispensar para la formación del gel la solución de gel polisacárido dentro de un receptor deseado, ya sea en un molde o dentro de un tejido, órgano o cavidad corporal.
16. El método de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el cual dicha solución acuosa de un ácido puede prepararse a partir de ácidos orgánicos o inorgánicos que se seleccionan entre el grupo formado por ácido acético, ácido ascórbico, ácido salicílico, ácido fosfórico, ácido clorhídrico, ácido propiónico, ácido fórmico, y una mezcla de los mismos.
17. El método de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el cual dicha sal es una sal de monofosfato dibásico de glicerol, en el cual dicho glicerol se selecciona entre el grupo formado por sales glicerol-2-fosfato, sn-glicerol 3-fosfato y L-glicerol 3-fosfato.
18. El método de la reivindicación 17, en el cual dicha sal glicerofosfato se selecciona entre el grupo formado por glicerofosfato disódico, glicerofosfato dipotásico, glicerofosfato cálcico, glicerofosfato de bario y glicerofosfato de estroncio.
19. El método de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el cual dicha sal es una sal de monofosfato dibásico de un polialcohol, y dicho polialcohol se selecciona entre un grupo formado por histidinol, acetol, dietilestilbestrol, indolglicerol, sorbitol, ribitol, xilitol, arabinitol, eritritol, inositol, manitol, glucitol, y una mezcla de los mismos.
20. El método de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el cual dicha sal es una sal de monofosfato dibásico de un azúcar, y dicho azúcar se selecciona entre un grupo formado por fructosa, galactosa, ribosa, glucosa, xilosa, ramnulosa, sorbosa, eritrulosa, desoxi-ribosa, cetosa, manosa, arabinosa, fuculosa, fruCtopiranosa, cetoglucosa, sedoheptulosa, trehalosa, tagatosa, sacarosa, alosa, treosa, xilulosa, hexosa, metiltio-ribosa, metiltio-desoxi-ribulosa, y una métela de los mismos.
21. El método de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el cual dicha sal es una sal de monofosfato dibásico de un polialcohol; y dicho polialcohol se selecciona entre el grupo formado por palmitoil-glicerol, linoleoil-glicerol, oleoil- glicerol, araquidonoil-glicerol, y una mezcla de los mismos.
22. El método de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el cual dicha sal es una sal de monofosfato dibásico y dicho fosfato se selecciona entre el grupo formado por un fosfato disódico, fosfato dipotásico, fosfato cálcico, fosfato de bario y fosfato de estroncio.
23. El método de la reivindicación 12, en el cual dicha solución de gel polisacárido se mantiene en una forma estable líquida no gelificada a una 5 temperatura que varía aproximadamente de 0ºC a aproximadamente 20ºC.
24. El método de la reivindicación 13, en el cual dicha temperatura de solidificación varía entre 37ºC a 60ºC.
25. El método de la reivindicación 24, en el cual dicha temperatura de solidificación es aproximadamente de 37ºC.
26. El método de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el cual el peso molecular de chitosano varía entre 10.000 a 2.000.000.
27. El método de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el cual el gel polisacárido es térmicamente irreversible o reversible ajustando el pH del gel polisacárido.
28. El método de la reivindicación 27, en el cual el gel polisacárido es 15 térmicamente irreversible cuando el pH de dicha solución de gel polisacárido es >6,9.
29. El método de la reivindicación 27, en el cual el gel polisacárido es térmicamente reversible cuando el pH de dicha solución de gel polisacárido es <6,9.
30. El método de la reivindicación 12, 13 ó 14, en el cual se añaden aditivos sólidos en partículas a la solución de gel polisacárido obtenida en un paso b).
31. El método de la reivindicación 15, en el cual dicha solución de gel polisacárido se va a introducir dentro de un cuerpo animal o humano por inyección o administración endoscópica, y forma el gel in situ a una temperatura de aproximadamente 37ºC.
32. Uso del gel polisacárido de la reivindicación 1 para producir materiales degradables biocompatibles para el uso en cosméticos, farmacología, medicina y/o cirugía.
33. El uso de acuerdo con la reivindicación 32, en el cual el gel se incorpora solo o formando parte de dispositivos implantables o implantes para usarlo en la reparación, reconstrucción y/o sustitución de tejidos y/o órganos, ya sea en animales o en el hombre.
34. El uso de acuerdo con la reivindicación 32, en el cual el gel se va a usar solo o formando parte de sistemas de administración de fármacos implantables, transdérmicos o dermatológicos.
35. El uso de acuerdo con la reivindicación 32, en el cual el gel se va a usar solo o formando parte de implantes oftalmológicos o sistemas de administración de fármacos.
36. Uso del gel de acuerdo con la reivindicación 32 para producir matrices artificiales con células para la aplicación a materiales de ingeniería y cultivo de materiales híbridos de bioingeniería y equivalentes de tejidos.
37. El uso de acuerdo con la reivindicación 36, en el cual las células cargadas se seleccionan entre el grupo formado por condrocitos (cartílago articular), fibrocondrocitos (menisco), ligamento fibroblastos (ligamento), fibroblastos cutáneos (piel), tenocitos (tendones), miofibroblastos (músculo), células germinales mesenquimatosas y queratinocitos (piel).
38. El uso de acuerdo con la reivindicación 37, en el cual las células cargadas de gel y productos derivados se destinan al cultivo y diseño de ingeniería de cartílago articular artificial y tejidos y órganos cartilaginosos, tanto para aplicaciones quirúrgicas como de estudios de laboratorio.
39. El uso de acuerdo con la reivindicación 37, en el cual las células cargadas de gel y productos derivados se destinan al procesamiento y diseño de ingeniería de sustitutos artificiales vivos para ligamentos, tendones, piel, huesos, músculos y cualquier órgano metabólico, ya sea para aplicaciones en cirugía o para estudios de laboratorio.
40. El uso de acuerdo con la reivindicación 37, en el cual las células cargadas de gel y productos derivados. son para la aplicación como sustitutos vivos para la sustitución de cartílago articulares, fibrocartílagos, órganos cartilaginosos, ligamentos, tendones, tejidos, óseos o piel.
41. El uso de acuerdo con cualquiera las reivindicaciones 38 a 40, en el cual dichas células cargadas de hidrogel son para la formación del gel in situ para inducir la formación ectópica de tejidos similares al fibrocartílago o cartílago.
42. Uso de un gel polisacárido cargado como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para uso como biomateriales de gel inyectables o implantables que actúan como soporte, vehículo, dispositivos para reconstrucción o sustitutos para la formación in situ de tejidos similares a hueso, fibrocartílago o cartílago en una localización fisiológica de un animal o del hombre.
43. Un método para producir la solución de gel polisacárido obtenible de acuerdo con la reivindicación 12 para producir un gel derivado o hidrogel al 1) incorporar y disolver al menos un polímero complementario dentro de dicha solución de gel polisacárido, y 2) permitiendo que dicho polisacárido y polímero complementario interaccionen durante un periodo de tiempo suficiente para volverse en un gel tridimensional transparente dentro de un intervalo de temperatura entre 20ºC y 60ºC.
44. El método de acuerdo con la reivindicación 43, en el cual el polímero complementario es un polisacárido hidrosoluble no iónico o a una celulosa hidroxialquilo.
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