ES2222466T3 - Uso de flavanolignanos para la preparacion de medicamentos con actividad antiproliferativa en utero, ovario y mama. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE FLAVANOLIGNANOS TALES COMO SILIMARINA, SILIBINA, SILIDIANINA, SILICRISTINA, MEZCLAS DE LOS MISMOS, EXTRACTOS Y FORMULACIONES QUE LOS CONTIENEN, EN LA TERAPIA (Y PROFILAXIS) DE TUMORES DE UTERO, OVARIO Y MAMA. ESTOS FLAVANOLIGNANOS YA HAN SIDO UTILIZADOS EN TERAPEUTICA PARA EL TRATAMIENTO DE HEPATOPATIAS DE DIFERENTE ORIGEN, Y HAN DEMOSTRADO SORPRENDENTEMENTE UNA DESTACABLE AFINIDAD POR LOS RECEPTORES DE ESTROGENOS DE TIPO II Y UNA ACTIVIDAD ANTIPROLIFERATIVA SOBRE LINEAS CELULARES TUMORALES DE UTERO, OVARIO Y MAMA.

Description

Uso de flavanolignanos para la preparación de medicamentos con actividad antiproliferativa en útero, ovario y mama.

La presente invención se refiere al uso de flavanolignanos, solos o combinados con agentes quimioterapéuticos conocidos, para la preparación de medicamentos para la terapia y profilaxis de tumores de útero, ovario y mama.

Recientemente se ha descubierto que algunos flavonoides tienen actividad antitumoral (Verna, Cancer Research 48, 5754, 1988) y actividad quimioprofiláctica en algunos tumores (Cassady, J. Nat. Prod. 53, 23, 1990). Particularmente la quercitina, un flavonoide que casi es ubicuo en las plantas, ha demostrado cierta actividad inhibidora sobre la proliferación de células leucémicas humanas (Larocca, Br. J. of Haematology 75, 489, 1990) y sobre otras líneas celulares (Scambia, Br. J. Cancer 62, 942, 1990 - Int. J. Cancer 46, 1112, 1990 - Cancer Chemother. Pharmacol. 28, 255, 1991 - Gynecologic Oncology 45, 13, 1992) además de actividad sinérgica con los quimioterapéuticos habituales. Aunque el mecanismo de tal acción inhibidora sobre la proliferación es desconocido, parece estar relacionado con la interacción de este flavonoide con los receptores estrogénicos tipo II (Markaverich, J. Steroid Biochem. 30, 71, 1988). Estos receptores, descritos por primera vez por Clark (J. Biol. Chem. 253, 7630, 1978) en el útero de las ratas, son diferentes de los receptores estrogénicos reales (RE) ya que están presentes en mayor concentración y tienen una constante de disociación-afinidad para el estradiol inferior (K_{D}: 10-20 nM) a la de los receptores estrogénicos (K_{D}: 0,2-1 nM).

Ahora se ha descubierto sorprendentemente que los flavanolignanos, entre los que está la silimarina, ampliamente usada ya en la terapia para el tratamiento de hepatopatías de diverso origen, y cuyos tres principales componentes se conocen bajo los nombres de silibina, silidianina, silicristina y dehidrosilibina y tienen las estructuras mostradas a continuación:

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tienen alta afinidad por los receptores estrogénicos de tipo II y una actividad antiproliferativa muy marcada sobre líneas celulares tumorales de útero, ovario y mama resistentes a cisplatino y adriamicina. Para comprobar el efecto antiproliferativo de los flavanolignanos, las curvas de crecimiento de diferentes líneas celulares que derivan de diversos tumores humanos han sido examinadas en presencia de los compuestos y se ha evaluado su capacidad para interactuar con los EBS tipo II en muestras de carcinoma de ovario.

La determinación de la unión al receptor estrogénico se llevó a cabo sobre células de tumores ováricos o tumores de otros órganos, cultivadas en monocapas que usan como medio el Medio Modificado de Dulbecco enriquecido con suero bovino y con 200 unidades/mL de penicilina. Las células usadas para las pruebas se trataron con tripsina todas las semanas y se colocaron en una placa a una densidad de 8\times10^{-4}/mL y se incubaron a 37ºC bajo aire atmosférico que contenía un 5% de CO_{2} y humedad. Para el control de la actividad antiproliferativa de los productos, las células se colocaron en pocillos (Falcon 3046, Becton Dickinson NY) en una concentración de 4\times10^{4}/mL. Después de 24 horas el medio fue sustituido por un medio nuevo y se añadieron los flavanolignanos disueltos en etanol puro. Los controles fueron tratados en las mismas condiciones experimentales sólo con el vehículo en ausencia del principio activo. El tratamiento descrito anteriormente se repitió a intervalos de 24 horas durante las 72 horas del tiempo de la prueba. La inhibición de la proliferación celular se evaluó mediante contaje directo de las células, comparando el crecimiento de los controles frente al de las muestras tratadas.

Para la dosis de los receptores, las células se incubaron después de 24 horas con cantidades crecientes de estradiol tritiado (E2-^{3}H 40Ci/mmol, Amershan UK) solas o en presencia de 100 partes de dietilestilbestrol a 4ºC durante 2,5 horas.

Al final del tiempo de incubación, las células se lavaron rápidamente con sustrato nuevo y se incubaron durante 30 minutos con NaOH 1M. La radiactividad se midió mediante un detector de centelleo y la especificidad de unión se calculó a partir de la diferencia entre las preparaciones que contienen o no dietilestilbestrol. Los resultados se expresaron como el número de sitios de unión por célula, de acuerdo con los procedimientos convencionales de la bibliografía (Raneletti, 1988).

La inhibición sobre la proliferación celular se evaluó mediante contaje directo de las células, comparando el crecimiento de los controles frente al de las tratadas.

Los resultados sobre diferentes líneas celulares se reflejan en la figura 1 y en las tablas I y V. En particular, la figura 1 muestra la actividad antiproliferativa de la silibina sobre A2780 WT, una línea celular de carcinoma ovárico RE negativo y tipo II positivo.

Los resultados son el promedio de dos experimentos llevados a cabo por triplicado. Las desviaciones estándar son inferiores al 10%.

La actividad antiproliferativa es dependiente de dosis. La tabla I refleja los datos relativos a la silibina usada en concentraciones de 0,01 \muM a 20 \muM en la proliferación celular; la silibina ejerce un efecto antiproliferativo dependiente de dosis sobre las diferentes líneas celulares, incluyendo aquéllas resistentes a quimioterapéuticos (MCF-7 ADRr, A2780 CIS) con una CI_{50} de 4,8 a 24 \muM.

TABLA I Efecto antiproliferativo de la silibina sobre diferentes líneas celulares estabilizadas

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Para un estudio más detallado de la actividad antiproliferativa de la silibina, se estudió el efecto de esta sustancia sobre el ciclo celular de A2780 WT. Como se muestra en la tabla II, el análisis citofluorimétrico revela que la silibina produce una disminución del porcentaje de células en fase S y un ligero aumento de aquéllas en fase G0/G1.

TABLA II Efecto de la silibina sobre la distribución de A2780 WT en diferentes fases del ciclo celular

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En base a estos resultados, se probó cualquier aumento de la silibina sobre el efecto de algunos quimioterapéuticos, particularmente el cisplatino (CIS) y la adriamicina (ADR). Como se refleja en la tabla III, cuando se usa la silibina en combinación con CIS, se observa un efecto sinérgico inhibidor del crecimiento, comparado con las dosis correspondientes de los medicamentos solos.

Si se usa silibina en combinación con ADR (tabla IV) se obtienen resultados similares.

Para comprobar si dicho efecto de la combinación de silibina con adriamicina o cisplatino es debida a una acción sinérgica o aditiva, se analizaron los datos con el procedimiento isobólico de Berenbau (Adv. Cancer Res. 25, 269, 1981). El índice de combinación resultante fue inferior a 1 tanto en las líneas celulares de origen (A2780 WT, tabla III) como en las resistentes (MCF-7 ADRr, tabla IV), lo que prueba que la combinación de los dos medicamentos ejerce una actividad antiproliferativa sinérgica.

TABLA III Efecto antiproliferativo sinérgico de la combinación CIS-silibina sobre la línea celular A2780 WT

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TABLA IV Efecto antiproliferativo sinérgico de la combinación de ADR y silibina sobre la línea MCF-7 ADRr

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La actividad antiproliferativa de la silibina y sus análogos se observó no sólo en líneas celulares estabilizadas sino también sobre cultivos primarios de tumores humanos. Una pluralidad de los flavanolignanos probados tienen un comportamiento similar. En la tabla V, se reflejan los datos relativos a la silibina, silidianina, silimarina y dehidrosilibina. Las formas diastereoméricas de la silibina e isosilibina también son activas en estas pruebas.

TABLA V Efecto de los distintos flavanolignanos sobre el crecimiento de células A2780 WT

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Es más, estos flavanolignanos evidenciaron inhibir in vivo la proliferación celular, para lo que se midió el tamaño de los tumores implantados en ratones desnudos atímicos, de acuerdo con las condiciones convencionales de la bibliografía. El tratamiento de los animales a dosis de 1 a 100 mg/Kg demostró una marcada regresión de los tumores estudiados hasta su desaparición en un alto porcentaje de los individuos. Los productos en el hombre probaron tener una actividad en tumores de ovario, mama y útero superior a la de medicamentos conocidos, como el Tamoxifeno.

La silidianina, la dehidrosilibina y las dos formas diastereoméricas de la silibina mostraron una actividad particularmente marcada. En las pruebas in vitro los flavanolignanos se han usado como tales, mientras que en las pruebas in vivo se han usado complejos con fosfolípidos, descritos en el documento EP-A-0209038.

De acuerdo con la invención, los flavanolignanos se pueden administrar de forma oral o intravenosa: para la vía oral, los fosfolípidos naturales o sintéticos demostraron ser particularmente útiles como vehículos, ya que forman los complejos liposolubles estables arriba citados con dichos compuestos; también como glicéridos líquidos semisintéticos que contienen triglicéridos de ácidos grasos de cadena media o análogos que pueden aumentar la biodisponibilidad de los compuestos aislados, de sus mezclas naturales o de los extractos que los contienen.

La dosis de flavanolignanos en el hombre oscila entre 50 y 1500 mg/día, principalmente administrados por vía oral.

La invención también se refiere a las composiciones que contienen los flavanolignanos de la silimarina y un agente antitumoral en forma de combinaciones para el uso simultáneo, secuencial o separado en la terapia antitumoral.

Los siguientes ejemplos ilustran más detalladamente la invención.

Ejemplo 1 Cápsulas de gelatina duras que contienen el complejo de la silibina con la fosfatidilcolina de soja

Composición:
complejo silibina-fosfatidilcolina de soja	300 mg
carboximetilcelulosa sódica	16 mg
talco	6 mg
estearato magnésico	3 mg

Ejemplo 2 Cápsulas de gelatina blandas que contienen dehidrosilibina

Composición:
Dehidrosilibina	250 mg
glicéridos líquidos semisintéticos	300 mg
aceite vegetal parcialmente hidrogenado	49 mg
lecitina de soja	1 mg

Ejemplo 3 Cápsulas de gelatina duras que contienen el complejo de la silimarina con los fosfolípidos naturales de soja

Composición:
complejo silimarina-fosfolípidos naturales de soja	360 mg
carboximetilcelulosa sódica	21 mg
talco	6 mg
estearato magnésico	3 mg

Ejemplo 4 Cápsulas de gelatina duras que contienen el complejo de la silidianina con la fosfatidilcolina de soja

Composición:
complejo silidianina-fosfatidilcolina de soja	200 mg
carboximetilcelulosa sódica	10 mg
talco	3 mg
estearato magnésico	2 mg

Claims (4)

1. El uso de los flavanolignanos seleccionados entre silimarina, silibina, silidianina, silicristina, dehidrosilibina, mezclas de las mismas o extractos que las contienen, para la preparación de medicamentos con actividad antagonista sobre los receptores estrogénicos tipo II y actividad antiproliferativa.

2. El uso de complejos de fosfolípidos y flavanolignanos seleccionados entre silimarina, silibina, silidianina, silicristina, dehidrosilibina, mezclas de las mismas o extractos que las contienen, para la preparación de medicamentos con actividad antagonista sobre los receptores estrogénicos tipo II y actividad antiproliferativa.

3. Composiciones farmacéuticas para la administración oral con actividad antagonista sobre los receptores estrogénicos tipo II y actividad antiproliferativa, que contienen como principio activo los flavanolignanos seleccionados entre silimarina, silibina, silidianina, silicristina, dehidrosilibina, mezclas de las mismas o extractos que las contienen, opcionalmente en forma de complejos con fosfolípidos, en combinación con agentes antitumorales.

4. Composiciones de acuerdo con la reivindicación 3, que contienen como vehículos glicéridos líquidos semisintéticos de ácidos grasos de cadena media.